instituto nacional de pesquisas da amazÔnia...
TRANSCRIPT
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E
BIOLOGIA EVOLUTIVA
Citogenética comparativa das variedades selvagens de acará-disco (Symphysodon
spp., Cichlidae, Perciformes) endêmicos da Amazônia: uma abordagem clássica e molecular dos cromossomos mitóticos e meióticos
MARIA CLAUDIA GROSS
MANAUS-AM
2009
ii
MARIA CLAUDIA GROSS
Citogenética comparativa das variedades selvagens de acará-disco (Symphysodon
spp., Cichlidae, Perciformes) endêmicos da Amazônia: uma abordagem clássica e molecular dos cromossomos mitóticos e meióticos
ORIENTADOR (A): Dra Eliana Feldberg
CO-ORIENTADOR: Dr Cesar Martins
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação do INPA como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Doutor em Genética, Conservação e
Biologia Evolutiva.
MANAUS-AM
2009
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Sinopse:
As três espécies do peixe ornamental acará-disco (Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi), endêmicas da bacia amazônica, foram estudadas mediante análise de citogenética clássica (coloração convencional, detecção da heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo) e molecular (hibridização fluorescente in situ com sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e retrotransposon Rex3) e análise do complexo sinaptonêmico. As análises evidenciam a ocorrência de rearranjos cromossômicos na evolução das espécies, bem como mostram que elementos transponíveis podem estar envolvidos com a formação da cadeia cromossômica meiótica. Palavras-chave: Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus, Symphysodon haraldi, FISH, complexo sinaptonêmico
Gross, Maria Claudia
Citogenética comparativa das variedades selvagens de acará-disco (Symphysodon spp., Cichlidae, Perciformes) endêmicos da Amazônia: uma abordagem clássica e molecular dos cromossomos mitóticos e meióticos.--- Manaus : [s.n.], 2009.XX, 137 f. : il.
Tese (doutorado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2009 Orientador : Eliana Feldberg Co-orientador: Cesar Martins Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
iv
Dedico esta tese aos meus pais
Lineu e Marilda, ao meu irmão
João Henrique e especialmente
ao meu esposo Carlos Henrique
Schneider.
v
“O homem que deseja ser cientista e à
ciência dedicar seu tempo e amor tem
pelo menos três certezas: a de que
morrerá um dia (como todo mundo), a de
que não ficará rico (como quase todo
mundo) e a de que se divertirá muito
(como pouca gente).”
Prof. Newton Freire-Maia
“Se fosse fácil achar o caminho das
pedras, tantas pedras no caminho não
seria ruim.”
Humberto Gessinger
vi
A realização deste projeto foi possível devido: Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva, do INPA.
Ao laboratório de Genética Animal do INPA, coordenação de Pesquisas
em Biologia Aquática (CPBA), onde a maior parte deste trabalho foi
desenvolvido, com financiamento proporcionado pelos Projetos de Pesquisas
Institucionais (PPIs), Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas
(PIPT/FAPEAM Nº 1749/08) e convênios entre estas agências e o Ministério de
Ciências e Tecnologia/Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (INCT ADAPTA, FAPEAM/CNPq Proc. Nº 573976/2008-2 e
MCT/CNPq/CT-Amazônia/CT-Energ 554057/2006-9).
Aos laboratórios de Genômica Integrativa de Microscopia Eltetrônica,
ambos sediados na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” -
Botucatu, onde análises da FISH e do do complexo sinaptonêmico foram
realizadas, com financiamento proporcionado pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 04/14766-6), Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq 501119/2005-1) e
Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES,
PROEQUI 1752/2008).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pela concessão da bolsa de estudo e a taxa de bancada (processo.
141868/2006-6) durante a realização deste trabalho.
vii
Agradecimentos Agradeço a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou
indiretamente possibilitaram a realização deste trabalho.
À minha eterna orientadora Dra. Eliana Feldberg, pelo exemplo de como
age uma excelente profissional. Além de conhecer como ninguém os ciclídeos
neotropicais e querer compartilhar este conhecimento, ela acolhe a todos de
braços abertos. Muito obrigada pelos inúmeros ensinamentos, apoio,
conselhos, atenção, críticas, sugestões, incentivo e amizade. Obrigada também
por me ensinar como se comporta um orientador, sempre pronta a sanar
dúvidas, ensinar, ler e reler rapidamente tudo que é necesssário para o bom
andamento do trabalho, sabendo dosar bom-humor e pulso-firme. Sem dúvida,
muito do meu crescimento profissional e pessoal devo à minha “mãe científica”.
Ao meu co-orientador Dr. Cesar Martins, que me proporcionou todo o
ensinamento acerca da FISH, pela amizade, discussões, críticas, sugestões e
também pelos momentos de descontração.
Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto por sua amizade, conselhos e incentivo,
mas principalmente por seus questionamentos incessantes, que me fizeram
buscar respostas a perguntas que eu nem imaginava que existissem!
Aos amigos do Laboratório de Genética Animal do INPA: Brenda, Cacá,
Carlos, Eduardo, Érica, Fernanda, Heidi, Leandra, Leila, Luciana, Natália,
Rodrigo, Valentim e todos os outros que já passaram por lá. Obrigada pelo
bate-papo (científico ou não), pelas críticas e sugestões, bem como pelo
convívio diário e festas. Vocês “confirmaram a hipótese” de que um ambiente
de trabalho produtivo nada tem a ver com a competitividade interna. Sem
dúvida, vocês sempre farão muita falta. Um obrigado especial aos amigos
Leandra, Carlos, Edu e Leilinha, que apesar de não serem admiradores natos
da meiose, sempre me ajudaram na interpretação de resultados e leitura de
manuscritos. Polacada, vocês são muito especiais.
Aos amigos do Laboratório de Genômica Integrativa, da UNESP-
Botucatu, especialmente ao Guilherme Targino Valente. Obrigada pelo
acolhimento e por todos os ensinamentos.
Aos meus amigos Leandra e Igor; Eduardo, Tahisa, Isabelle e Otto
simplesmente por fazerem parte da minha vida e tornarem o meu dia-a-dia
muito mais alegre. Resumindo, vocês fazem parte da minha família. Um
viii
obrigado especial à polaca (Leandra), que além de amiga e “cumadre”,
compartilhou todos os meus fracassos e conquistas científicas desde a época
da UEPG (2000), sabendo a hora de rir ou chorar junto e sempre buscando a
parte boa das situações até nas horas ruins.
Ao único membro da equipe Café com Leite (BADPI- mestrado 2004-
2006) que permaneceu em Manaus. Rodrigo, meu amigo, obrigada por não ter
abandonado o barco.
À Hercilia, Alessandra e Elci, secretárias da pós-graduação e do
GCBEV. Sem vocês a nossa vida seria muito mais difícil. Agradeço também
aos meus novos colegas da UFAM, do Instituto de Ciências Biológicas,
Departamento de Biologia, onde pretendo permanecer por uma longa data.
À minha sogra Edite Schneider e minhas cunhadas Silvia e Marielle. Um
obrigado especial à Marielle por ter me ensinado a dar os meus primeiros
passos no mundo da meiose.
Ao meu avô, tios, tias, primos e cunhada. Especialmente à tia Leila
(minha segunda mãe), que apesar de achar que “um dia” eu deveria voltar para
o Paraná, sempre apoiou e incentivou as minhas decisões, além de fornecer
muitas milhas da Varig e Tam para eu rever a família. Adoro vocês.
Ao MSc. Carlos Henrique Schneider, pelo exemplo profissional, por ser
extremamente crítico na revisão dos meus trabalhos, pela ajuda, apoio e
sugestões. E ao meu esposo Carlinho, obrigada por conseguir conviver
pacificamente com este clima de laboratório-casa, por acordar bem humorado
de madrugada para discutir dados que eu acho que vou esquecer até
amanhecer, por aguentar meus períodos de estresse (que não são poucos),
pelo companheirismo, amizade e amor incondicional. Você é imprescindível na
minha vida.
Aos meus pais Lineu e Marilda Delfrate Gross e ao meu irmão João
Henrique, que são meus exemplos de vida e me fizeram entender desde cedo
o sentido da palavra Família. Passei os melhores dias da minha vida com
vocês e, depois que vim “morar longe de casa”, valorizo muito mais cada
momento que passamos juntos. Pai, Mãe e Ike, sem o apoio e incentivo de
vocês eu não teria crescido pessoal e profissionalmente. Por isso esta
conquista é nossa! Amo vocês!
ix
A Deus, por só ter motivos para agradecer! Tudo valeu a pena! Como
disse o cientista Louis Pasteur: "Um pouco de ciência nos afasta de Deus.
Muito, nos aproxima".
x
RESUMO O gênero Symphysodon compreende três espécies endêmicas da bacia
amazônica, conhecidas popularmente como acarás-disco e muito apreciadas
na aquariofilia. Dentro da família Cichlidae, essas espécies apresentam o maior
número diploide já descrito, e para compreender os aspectos carioevolutivos
das mesmas, análises citogenéticas clássica e molecular (utilizando sondas de
DNAr 5S, DNAr 18S e retrotransposon Rex3) foram realizadas, assim como
análise do complexo sinaptonêmico. Foram utilizados 22 S. aequifasciatus (14
♂, oito ♀), 37 S. discus (15 ♂, 22 ♀) e 49 S. haraldi (21 ♂, 28 ♀).
Symphysodon aequifasciatus apresentou 50m-sm+6st-a+4mi, S. discus 50m-
sm+10st-a e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi. Uma cadeia cromossômica
multivalente, com número variável de elementos e até 20 bivalentes, foi
observada no diplóteno/diacinese de espermatócitos e oócitos de S.
aequifasciatus e S. haraldi. Em S. discus, 30 bivalentes foram detectados.
Análise do complexo sinaptonêmico sugere homologia entre elementos
formadores da cadeia, sendo verificada a presença de quiasmas ao longo de
sua extensão. As três espécies possuem região organizadora de nucléolo
múltipla, que variaram inter e intraespecíficamente, porém nunca mais que
duas marcações foram evidenciadas por célula metafásica. Variabilidade, intra
e interespecífica, também foi evidenciada nos sítios de DNAr 18S, sendo
observados de 2 a 5 por metáfase: Symphysodon aequifasciatus apresentou
dois padrões de distribuição, enquanto S. discus e S. haraldi mostraram quatro
padrões. Sítios de DNAr 18S também estiveram presentes, algumas vezes, na
cadeia meiótica das duas espécies portadoras. O DNAr 5S foi identificado no
par 10 de S. aequifasciatus, enquanto em S. discus e S. haraldi este sítio foi
evidenciado no par 18. Nos cromossomos meióticos das três espécies, os
sítios de DNAr 5S foram localizados em bivalentes típicos. Com relação à
localização do elemento Rex3, as três espécies apresentaram um padrão de
distribuição compartimentalizada em alguns cromossomos e com sinais tênues
de hibridização na região centromérica da maioria dos cromossomos. Tais
sinais foram coincidentes com a heterocromatina na maioria das vezes. A
somatória destes dados indica a ocorrência de inúmeros rearranjos
cromossômicos, acúmulo e movimentação de elementos repetitivos, bem como
heterocromatinização na carioevolução do gênero Symphysodon. A
xi
variabilidade dos sítios de DNAr 18S pode refletir a existência de translocações
envolvendo regiões heterocromáticas ricas em elementos transponíveis, que
teriam ocorrido independentemente em populações/espécies ancestrais de
Symphysodon. Em um dado momento estas populações/espécies teriam
formado híbridos, que formaram a cadeia cromossômica meiótica para que o
ajustamento sináptico entre os segmentos cromossômicos homólogos das
espécies parentais ocorresse. Estes híbridos seriam o que hoje reconhecemos
como S. aequifasciatus e S. haraldi, enquanto S. discus seria uma espécie
pura.
xii
ABSTRACT The genus Symphysodon comprises three endemic species of the Amazon
basin, commonly known as discus and highly prized by the aquarium trade.
Within the family Cichlidae, these species have the highest diploid number
described thus far. To understand the karyoevolutionary aspects of these
species, classic and molecular (5S rDNA, 18S rDNA and retrotransposon Rex3)
cytogenetic analyses were carried out, along with an analysis of the
synaptonemal complex. Sixteen specimens of S. aequifasciatus (eight ♂, eight
♀), 37 specimens of S. discus (15 ♂, 22 ♀) and 43 specimens of S. haraldi (15
♂, 28 ♀) were analyzed. Symphysodon aequifasciatus had 50m-sm+6st-a+4mi,
S. discus 50m-sm+10st-a and S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi. A multivalent
chromosomal chain with a variable number of elements and up to 10 bivalents
was found in the diplotene/diakinesis of sperm and oocyte cells in S.
aequifasciatus and S. haraldi. Analysis of synaptonemal complex suggests
homology among the elements that make up the chain, with the presence of
chiasms throughout its length. In S. discus thirty bivalents were detected in the
diplotene/diakinesis of sperm and oocyte cells. The three species have multiple
nucleolus organizer regions that vary in both inter-species and intra-species
terms. However, no more than two NOR sites were found per metaphasic cell.
Inter-species and intra-species variability was also found for the 18S rDNA
sites, with two to five sites per metaphase: Symphysodon aequifasciatus
exhibited two distribution patterns, whereas S. discus and S. haraldi exhibited
four patterns. 18S rDNA sites were also sometimes found in the meiotic chain of
the two species. 5S rDNA was identified in pair 10 in S. aequifasciatus, whereas
this site was identified in pair 18 in S. discus and S. haraldi. In the meiotic
chromosomes of the three species, 5S rDNA sites were located in typical
bivalents. Regarding the localization of Rex3, the three species exhibited a
compartmentalized distribution pattern in some chromosomes and tenuous sites
of hybridization in the centromeric region of the majority of chromosomes. Such
sites most often coincided with the heterochromatin. These data indicates the
occurrence of innumerous chromosome rearrangements, the accumulation and
displacement of repetitive elements and heterochromatinization in the karyo-
evolution of the genus Symphysodon. The variability in 18S rDNA sites may
reflect the existence of translocations involving heterochromatin regions rich in
xiii
transposable elements, which may have occurred independently in ancestral
populations/species of Symphysodon. At some point, these populations/species
may have formed hybrids, which formed a meiotic chromosome chain so that
synaptic adjustment could occur between the homologous chromosome
segments of the parent species. These hybrids may be what we recognize
today as S. aequifasciatus and S. haraldi, whereas S. discus may be a pure
species.
xiv
Sumário
I. Introdução Geral ............................................................................................ 1
I.1 Considerações sobre os acarás-disco ....................................................... 1
I.2 Aspectos citogenéticos dos acarás-disco .................................................. 5
I.3 Complexo sinaptonêmico em peixes neotropicais ..................................... 8
I.4 Citogenética molecular .............................................................................. 9
I.5 Objetivos .................................................................................................. 12
I.5.1 Geral ................................................................................................. 12
I.5.2 Específicos ........................................................................................ 12
II. Material e métodos ..................................................................................... 13
II.1 Material ................................................................................................... 13
II.2 Métodos .................................................................................................. 13
II.2.1 Indução de mitoses .......................................................................... 13
II.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos .............................................. 14
II.2.3 Preparação das lâminas com cromossomos mitóticos ..................... 15
II.2.4 Obtenção de cromossomos meióticos ............................................. 15
II.2.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos nos cromossomos
mitóticos e meióticos ................................................................................. 16
II.2.6 Detecção da heterocromatina constitutiva nos cromossomos
mitóticos e meióticos ................................................................................. 16
II.2.7 Hibridização fluorescente in situ (FISH) ........................................... 17
II.2.8 Microespalhamento para visualização do complexo sinaptonêmico 23
II.2.9 Análises cromossômicas .................................................................. 25
III. Resultados e discussão ............................................................................ 27
III.1.Artigo 1: Intrigante evidência de translocações em acarás-disco
(Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossômica meiótica
em vertebrados ............................................................................................. 28
III.1.1. Introdução ...................................................................................... 30
III.1.2. Material e métodos ......................................................................... 31
III.1.3. Resultados ..................................................................................... 33
xv
III.1.4. Discussão ....................................................................................... 40
III.2.Artigo 2: Análise citogenética comparativa das espécies do gênero
Symphysodon (Cichlidae): características cromossômicas de
retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal .......................... 46
III.2.1. Introdução ...................................................................................... 47
III. 2.2. Material e métodos ........................................................................ 48
III.2.3. Resultados ..................................................................................... 51
III.2.4. Discussão ....................................................................................... 59
III.3.Capítulo 3: Variabilidade intra e interespecífica do locus do DNAr 18S
entre acarás-disco Symphysodon: rearranjos cromossômicos ..................... 67
III.3.1. Introdução ...................................................................................... 68
III.3.2. Material e métodos ......................................................................... 69
III.3.3. Resultados ..................................................................................... 72
III.3.4. Discussão ....................................................................................... 79
III.4.Capítulo 4: Complexo sinaptonêmico em acarás-disco: cadeia
cromossômica meiótica ................................................................................ 84
III.4.1 Introdução ....................................................................................... 85
III.4.2. Material e Métodos ......................................................................... 86
III.4.3. Resultados ..................................................................................... 86
III.4.4. Discussão ....................................................................................... 90
IV. Conclusões Gerais ................................................................................... 94
V. Perspectivas futuras .................................................................................. 96
VI. Referência bibliográfica ........................................................................... 97
xvi
Lista de figuras
Introdução Figura 1: Classificações taxonômicas atualmente propostas para o gênero
Symphysodon. Note que a única espécie onde existe consenso na
nomenclatura é Symphysodon discus, conhecido na aquarifilia como disco
Heckel. ............................................................................................................................. 3
Figura 2: Mapa de distribuição dos acarás-disco na Amazônia. As cores no
mapa referem-se à coloração dos discos (marrom, azul e verde), com exceção
do vermelho, que se trata do disco heckel. O triângulo em preto representa a
cidade de Manaus, Amazonas (Modificado de Bleher, 2006). ............................... 4
Capítulo 1 Figura 1 – Espécies selvagens de Symphysodon analisadas, suas distribuições
geográficas na bacia Amazônica (modificado de Bleher, 2006) e os paleoarcos
de Caravari e Purus. a) Symphysodon aequifasciatus; b) S. discus; c) S.
haraldi; d) Mapa geográfico mostrando os locais de amostragem dos discos: a,
Tefé; b, Novo Airão; c, Manacapuru. ........................................................................ 32
Figura 2 – Células testiculares meióticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d,
g, j, m), S. haraldi (b, e, h, k, n) e S. discus (c, f, i, l, o) submetidas à coloração
convencional. (a-c) Leptóteno/Zigóteno. (d, e) Diplóteno mostrando uma cadeia
cromossômica em anel (cabeça de seta) e 20 bivalentes. A maioria dos
bivalentes apresenta dois quiasmas terminais (setas). (f) Diplóteno com 30
bivalentes, a maioria exibindo quiasmas terminais (seta). (g, h) Diacinese
mostrando uma cadeia cromossômica linear (cabeça de seta) e vários
bivalentes e univalentes. (i) Diacinese mostrando a separação precoce de
elementos de um bivalente (seta). (j, k) Metáfase I revelando a orientação em
zigzag dos cromossomos dentro da cadeia (cabeça de seta). (l) Metáfase I com
bivalentes alinhados na placa equatorial. (m-o) Metáfase II com n=30
cromossomos (barra: 10 μm). .................................................................................... 36
Figura 3 – Frequência das fórmulas meióticas nas células em diplóteno e
diacinese analisadas em Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi, mostrando
xvii
a barra de desvio padrão e números variáveis de bivalentes, elementos
formadores da cadeia e univalentes, provavelmente devido a uma
terminalização precoce de quiasmas. II = bivalente; C XX = cadeia
cromossômica com 20 elementos; C XIX = cadeia cromossômica com 19
elementos; C XVIII = cadeia cromossômica com 18 elementos; C XVII = cadeia
cromossômica com 17 elementos; C XVI = cadeia cromossômica com 16
elementos; C XV = cadeia cromossômica com 15 elementos; U = univalentes.
........................................................................................................................................ 37
Figura 4 - Células testiculares meióticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d,
g), S. haraldi (b, e, h) e S. discus (c, f, i) após bandamento C (a-c) e
impregnação por íon prata. (a-b) Diplóteno mostrando blocos heterocromáticos
(cabeça de seta) nos elementos cromossômicos formadores da cadeia e em
quase todos os bivalentes (seta). (c) Diplóteno com banda C positiva (seta) na
maioria dos bivalentes. (d-f) Núcleos interfásicos, revelando cinco, seis e quatro
nucléolos (cabeça de seta), respectivamente. (g) Diacinese com uma RON em
um grande bivalente. (h) Diacinese mostrando RONs (cabeças de seta) em um
elemento da cadeia cromossômica e em um bivalente de tamanho mediano
(seta). (i) Diacinese com uma RON em um bivalente de tamanho pequeno
(barra: 10 μm). .............................................................................................................. 38
Figura 5 - Representação esquemática da possível origem da cadeia
cromossômica das células meióticas de Symphysodon aequifasciatus e S.
haraldi (n representa os outros pares cromossômicos envolvidos na meiose
múltipla). (a) Translocações simples e heterozigotas envolvendo pequenos
segmentos de alguns pares cromossômicos. (b) Elementos cromossômicos
derivados de translocações. (c) Configuração meiótica da cadeia
cromossômica, causada por translocações múltiplas e seriadas. ....................... 39
Capítulo 2 Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe
(1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers Rex3
(a) e DNAr 5S (b) para as três espécies de Symphysodon (1 – S.
aequifasciatus; 2 – S. discus; 3 – S. haraldi). ......................................................... 53
xviii
Figura 2 – Cariótipos de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b) e S.
haraldi (c) submetidos a bandeamento C (barra de escala: 10 μm). .................. 54
Figura 3 – Localização física cromossômica do retrotransposon Rex3 (sítios
amarelos) nos cariótipos e células meióticas testiculares de Symphysodon
aequifasciatus (a, d, e), S. discus (b, f) e S. haraldi (c, g). a-c) Cariótipos. d)
Metáfase espermatogonial revelando marcações pericentroméricas de Rex3
em todos os cromossomos (seta); e-g) Diplóteno revelando sequências de
Rex3 na cadeia cromossômica (seta) e em bivalentes (cabeça de seta) (barra
10 μm)............................................................................................................................ 56
Figura 4 – Localização física cromossômica do DNAr 5S (sírios amarelos) nos
cariótipos e células testiculares meióticas de Symphysodon aequifasciatus (a,
d, g), S. discus (b, e) e S. haraldi (c, f). a-c) Cariótipos. d-f) Diplóteno revelando
sítios de DNAr 5S em bivalentes (seta). g) Metáfase de Symphysodon
aequifasciatus mostrando as sequências de Rex3 (sítios róseos) flanqueando
os genes RNAr 5S (sítios verdes). O mesmo padrão foi encontrado em S.
discus e S. haraldi (barra: 10 μm). ............................................................................ 58
Figura 5 – Idiograma comparativo de Symphysodon aequifasciatus (a), S.
discus (b), S. haraldi (c); em preto a heterocromatina
centromérica/pericentromérica com tênues marcações fluorescentes de Rex3,
claramente visualizada na maioria dos cromossomos; em amarelo, marcações
conspícuas mais acentuadas de Rex 3; em vermelho, os genes RNAr 5S co-
localizados com heterocromatina; em rosa, sequências desconhecidas de
heterocromatina. .......................................................................................................... 63
Capítulo 3 Figura 1 –Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe
(1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers DNAr
18S para as três espécies de Symphysodon (1 – S. aequifasciatus; 2 – S.
discus; 3 – S. haraldi). ................................................................................................. 73
xix
Figura 2 – Cariótipos em coloração convencional (a, b, c) e regiões
organizadoras de nucléolo reveladas por impregnação com nitrato de prata,
indicando todos os pares envolvidos (d, e, f) nas espécies Symphysodon
aequifasciatus (a, d), Symphysodon discus (b, e) and Symphysodon haraldi (c,
f). Somente um dos homólogos está representado porque todas as
combinações de Ag-RON envolvendo estes pares cromossômicos foram
encontradas (barra = 10 μm). .................................................................................... 75
Figura 3 – Padrões de distribuição dos sítios de DNAr 18S (sinais amarelos)
em cromossomos mitóticos de Symphysodon aequifasciatus (a-c); S. discus (d-
g); S. haraldi (h-k). Cariótipos (a, d, h) e em destaque (b, c, e, f, g, i, j, k) os
padrões variantes dos sítios ribossomais DNAr 18S para cada espécie (barra =
10 μm)............................................................................................................................ 77
Capítulo 4 Figura 1: Prófase I obtida por processo de microespalhamento de S.
aequifasciatus impregnada com nitrato de prata, em microscopia óptica. a)
Célula paquitênica tardia; b) seu esquema evidenciando a cadeia
cromossômica multivalente (seta e esquema em vermelho), 16 bivalentes em
emparelhamento completo (esquema em azul), 1 bivalente com assinapse na
região terminal (cabeça de seta e esquema em roxo) e bivalentes em
associação centromérica temporária (estrela e esquema em verde); c)
Diplóteno incompleto, evidenciando quiasmas na cadeia cromossômica em
anel (seta). Note que apesar do complexo sinaptonêmico estar se
desintegrando, os elementos laterais também podem ser evidenciados em
algumas porções (cabeça de seta). Para S. haraldi as mesmas configurações
meióticas foram encontradas (barra: 10 μm). ......................................................... 88
Figura 2: Prófase I obtida por processo de microespalhamento de S. haraldi
impregnada com nitrato de prata, em microscopia eletrônica de transmissão. a)
Paquíteno (1000x de aumento) com número de bivalentes e elementos
formadores da cadeia cromossômica não determinado. Os cinetocoros (cabeça
de seta) e regiões eletrodensas, provavelmente regiões de ancoragem na
membrana nuclear (seta), preservados em bivalentes típicos, com complexo
xx
sinaptonêmico distribuído ao longo de todo o comprimento. A região nucleolar
está evidenciada (nu). Note que ao longo de alguns elementos cromossômicos
o complexo sinaptonêmico apresenta coloração mais conspícua e podem estar
indicando regiões de heterocromatina diferenciada; b) Detalhe dos elementos
laterais do complexo sinaptonêmico e nódulos de recombinação (seta) ao longo
da cadeia cromossômica (5750 x de aumento). Para S. aequifasciatus as
mesmas configurações meióticas foram encontradas. ......................................... 89
xxi
Lista de tabelas
Introdução Tabela 1- Variação cariotípica descrita para as espécies de Symphysodon. ..... 6
Artigo 2 Tabela 1 – Padrão de dispersão cromossômica dos elementos Rex3 em
diferentes espécies de peixes. ......................................................................... 62
Tabela 2: Parâmetros físico-químicos medidos nos hábitats dos acarás-disco, a
1,5m de profundidade (Bleher, 2006). .............................................................. 62
Artigo 3 Tabela 1 – Pares cromossômicos de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e
S. haraldi mostrando os diferentes padrões (coluna) de distribuição do DNAr
18S (A, B – homólogos) e a frequência de cada padrão por espécie. ............. 78
xxii
Lista de abreviaturas
2n Número diploide
Ag-RON Região organizadora de nucléolo argenteofílica
AoRex3 Retroelemento da família Rex3 isolado de Astronotus ocellatus
Banda C Técnica de detecção da heterocromatina constitutiva
BLAST Ferramenta de busca e alinhamento de sequências (basic local
alignment research tool)
C Cadeia cromossômica meiótica
CS Complexo sinaptonêmico
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Desoxirribonucleotídeo
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
FISH Hibridização fluorescente in situ
FITC Fluoresceina isotiocianato (fluorescein isothiocyanate)
II Bivalente
mi Microcromossomo
m-sm Cromossomo meta-submetacêntrico
n Número haplóide
NCBI National Centre for Biotechnology Information
NTS Espaçador não transcrito (non-transcribed spacer)
PBD Tampão fosfato dextrano (phosphate-buffered dextran)
PCR Reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)
DNAr DNA ribossomal
pb Pares de bases
xxiii
Rex Retroelemento isolado primariamente de Xiphophorus
RNA Ácido ribonucléico
RNAr RNA ribossomal
RON Região organizadora de nucléolo
SDS Dodecil sulfato de sódio
SSC Solução salina de citrato padrão
st-a Cromossomo subtelo-acrocêntrico
Tampão C Tampão de acoplamento (coupling)
U Univalente
1
I. Introdução Geral
I.1 Considerações sobre os acarás-disco
A bacia amazônica é considerada a maior bacia hidrográfica do mundo e
abriga uma das maiores ictiofaunas continentais, sendo estimada a presença
de aproximadamente 3.000 espécies de peixes, dentre as quais muitas são
comercializadas como peixes ornamentais (Chao, 1993; Santos & Ferreira,
1999; Chao, 2001).
Um dos peixes de maior destaque na aquariofilia é o acará-disco,
facilmente reconhecido por sua forma discóide e por seu corpo comprimido
lateralmente, que apresenta um padrão de barras verticais distribuídas ao
longo do mesmo, sendo estes peixes endêmicos da bacia amazônica (Axelrod,
1978; Silva & Kotlar, 1980; Kullander, 1996). Além disso, os indivíduos
possuem apenas um orifício nasal de cada lado do focinho, boca protátil, lábios
grossos, raios anteriores das nadadeiras dorsal e anal e os primeiros raios da
ventral transformados em espinhos e linha lateral interrompida, características
morfológicas peculiares da família Cichlidae à qual pertence (Paxton &
Eschmeyer, 1995).
Os discos são peixes onívoros, que consomem preferencialmente
perifiton, detritos orgânicos, material vegetal e invertebrados aquáticos
pequenos. Estes peixes habitam preferencialmente lagos, florestas alagadas e
igarapés de águas calmas, repletos de galhos, troncos e raízes submersas.
Apresentam em média, na idade adulta, 20 cm de comprimento e não possuem
dimorfismo sexual evidente. Na natureza podem viver por aproximadamente
três anos e alcançam a maturidade reprodutiva em um ano. Os discos são
monogâmicos e despendem grande cuidado parental com ovos e alevinos,
sendo estes alimentados por uma secreção mucosa da pele dos pais. Além
disso, são os únicos ciclídeos neotropicais que formam agregações sociais de
mais de cem (100) indivíduos durante os períodos de águas baixas, o que pode
amenizar a predação, porém facilita o aumento da transmissão de doenças e
2
parasitas (Ferreira et al., 1998; Bleher, 2006; Ready et al., 2006; Bleher et al.,
2007; Crampton, 2008).
Os acarás-discos pertencem ao gênero Symphysodon (Cichlidae,
Perciformes), porém divergências quanto à taxonomia são comuns para este
grupo. Este táxon já foi considerado monoespecífico com subespécies,
diespecífico com subespécies e atualmente compreende três espécies, mas
não existe consenso com relação à nomenclatura dos grupos – Figura 1 (Silva
& Kotlar, 1980; Burgess, 1991; Mazerolli & Weiss, 1995; Kullander, 1996; 2003;
Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Ready et al. (2006) propuseram S.
discus para os indivíduos conhecidos como Heckel na aquariofilia, S.
aequifasciatus para os discos com coloração azul ou marrom e S. tarzoo para
os indivíduos verdes e provenientes da região oeste da Amazônia. Em
contrapartida, Bleher et al. (2007) propuseram que os indivíduos verdes com
pontos avermelhados pelo corpo, os quais são encontrados a oeste do arco do
Purus, sejam chamados de S. aequifasciatus; os azuis e marrons, distribuídos
da foz do Amazonas até o baixo rio Iça, de S. haraldi; e os discos Heckel,
encontrados nos rios Negro e Abacaxis, continuam sendo denominados de S.
discus (Figura 1). Apesar da nomenclatura divergente, a distinção entre as três
espécies sempre se baseia na coloração, no padrão de barras verticais e
pontos vermelhos ao longo do corpo, na distruição geográfica (Figura 2) e em
estudos moleculares envolvendo sequências de DNA mitocondrial e nucleares
(Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007).
Na aquariofilia, cruzamentos entre diferentes espécies/colorações são
utilizados para obtenção de diferentes padrões de tonalidades, cores, padrão
de listras e manchas ao longo do corpo. Estes indivíduos híbridos alcançam
valores exorbitantes na aquariofilia e, quando possível, alguns continuam
sendo utilizados como matrizes para a obtenção de novos variantes (Bleher,
2006). Contudo, a reprodução dos acarás-disco em cativeiro é obtida com base
em tentativas-erros, não considerando informações genéticas como
ferramentas para seleção dos indivíduos.
3
Heckel Azul Marrom
S. haraldi S. aequifasciatus
S. aequifasciatus S. tarzoo
S. discus
Bleher et al., 2007
Ready et al., 2006
Verde
Figura 1: Classificações taxonômicas atualmente propostas para o gênero Symphysodon. Note que a única espécie onde existe
consenso na nomenclatura é Symphysodon discus, conhecido na aquarifilia como disco Heckel.
4
Figura 2: Mapa de distribuição dos acarás-disco na Amazônia. As cores no mapa referem-se à coloração dos discos (marrom, azul
e verde), com exceção do vermelho, que se trata do disco heckel. O triângulo em preto representa a cidade de Manaus, Amazonas
(Modificado de Bleher, 2006).
5
I.2 Aspectos citogenéticos dos acarás-disco
Além de serem bastante apreciadas por aquaristas, as espécies do
gênero Symphysodon também despertam o interesse de citogeneticistas, uma
vez que as mesmas apresentam número diploide igual a 60 cromossomos
(maior número diploide já encontrado para a família Cichlidae), sendo a maioria
deles do tipo meta-submetacêntricos. Estas características corroboram a
posição derivada de Symphysodon nas árvores filogenéticas propostas até o
momento (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; Smith et al., 2008). São
consideradas características citogenéticas basais para Cichlidae, e também
para a ordem Perciformes, a presença de 2n=48 cromossomos acrocêntricos,
regiões organizadoras de nucléolo (RON) simples e presentes nos maiores
pares cromossômicos e blocos de heterocromatina (banda C) evidenciados na
região pericentromérica de todos os cromossomos (Thompson, 1979; Kornfield,
1984; Feldberg & Bertollo, 1985; Brum & Galetti Jr., 1997; Feldberg et al.,
2003).
Diferentes fórmulas cariotípicas já foram descritas para as espécies de
Symphysodon (tabela 1), sendo grande parte desta variabilidade cromossômica
intraespecífica creditada a divergências conceituais em relação a
microcromossomos, subjetividade na medida cromossômica, padrões
diferenciados de condensação de cromossomos e braços cromossômicos com
constrições secundárias que não se coravam com Giemsa em algumas
metáfases mitóticas (Gross, 2006). Quanto às regiões organizadoras de
nucléolo, variação intra e interespecífica é encontrada em Symphysodon.
Nascimento (2005) descreveu que S. haraldi (originalmente descrita na
publicação como S. aequifasciatus, considerando nomenclatura vigente da
época) do igarapé Croata (PA) apresentava RON simples, mas não mostrou
quais eram os pares portadores desta região. Regiões organizadoras de
nucléolo múltiplas foram evidenciadas em S. haraldi (pares 3, 5, 10, 11, 21 e
22) do rio Manacapuru (AM), S. discus (pares 18 e 24) da região de Barcelos
(AM) e S. aequifasciatus (pares 5, 10, 11, 15, 21, 22) do lago Bauna,
proximidades de Tefé (Amazonas) (Mesquita et al., 2008).
6
Tabela 1- Variação cariotípica descrita para as espécies de Symphysodon.
Espécies Fórmula cariotípica Local de coleta Referência
S. aequifasciatus 48m-sm + 8st-a + 4mi Tefé, Amazonas, Brasil Mesquita et al. (2008)
S. aequifasciatus 50m-sm + 6st-a + 4mi Tefé, Amazonas, Brasil Mesquita et al. (2008)
S. aequifasciatus 44m-sm + 16st-a ------- Ohno & Atkin (1966)
S. aequifasciatus 58m-sm + 2st-a Aquarista Thompson (1979)
S. aequifasciatus1 52m-sm + 8st-a Aquarista Takai et al. (2002)
S. discus 54m-sm + 6st-a Barcelos, Amazonas, Brasil Mesquita et al. (2008)
S. discus 50m-sm + 10st-a Barcelos, Amazonas, Brasil Mesquita et al. (2008)
S. haraldi 2 56m-sm + 4st-a Igarapé Croata, Pará, Brasil Nascimento (2005)
S. haraldi 52m-sm + 4st-a + 4mi Manacapuru, Amazonas, Brasil Mesquita et al. (2008)
Abreviaturas: a, acrocêntrico; m, metacêntrico; mi, microcromossomo; sm, submetacêntrico; st, subtelocêntrico.
Classificação das espécies de acordo com Bleher et al. (2007). 1Espécie descrita originalmente como
Symphysodon aequifasciata axelrodi; 2espécie descrita originalmente como S. aequifasciatus.
7
Com relação à heterocromatina, esta sempre foi observada na região
pericentromérica de quase todos os cromossomos mitóticos das três espécies
de Symphysodon, além de blocos heterocromáticos nas regiões proximais de
ambos os braços, ou mesmo ocupando braços cromossômicos inteiros, e
muitas vezes intercalando as RONs, o que sugere um processo de
heterocromatinização e/ou acúmulo de heterocromatina gradual no gênero
(Takai et al., 2002; Nascimento, 2005; Gross, 2006; Mesquita et al., 2008).
Numa análise meiótica efetuada nas espécies Symphysodon discus e
Symphysodon haraldi (originalmente descrita na publicação como S.
aequifasciatus, devido à nomenclatura vigente), Gross (2006) encontrou
durante a prófase I, a existência de uma cadeia cromossômica multivalente
apenas em S. haraldi, enquanto S. discus não apresentou a cadeia
cromossômica, estando seus cromossomos organizados em 30 bivalentes.
Cadeia cromossômica, tal como a observada nas células profásicas I de
S. haraldi, é um fato inusitado para peixes, principalmente os neotropicais,
sendo descrita apenas em algumas espécies de plantas, de invertebrados,
como Heteropternis obscurella e de outros vertebrados, como anuros e
ornitorincos. Várias explicações tem sido propostas para esclarecer a origem
desta configuração meiótica multivalente, de acordo com o observado para
cada organismo. Em Heteropternis obscurella parece ocorrer uma associação
terminal de cromossomos não homólogos na meiose I por meio de interações
entre grandes regiões terminais banda-C positivas (John & King, 1982). No
mamífero ornitorrinco as cadeias cromossômicas foram evidenciadas apenas
em machos, sendo formadas, provavelmente, por meio de rearranjos entre
cromossomos sexuais ancestrais e autossomos (Carrel, 2004). Já nos anuros
Physalaemus petersi e Eleutherodactylus binotatus, a configuração multivalente
observada durante a meiose I foi resultante de heterozigosidade para múltiplas
translocações recíprocas (Lourenço et al., 2000; Siqueira-Jr et al., 2004). A
origem da cadeia cromossômica meiótica de S. haraldi não foi totalmente
elucidada, requerendo uma análise mais detalhada do comportamento
cromossômico meiótico de todas as espécies de Symphysodon, incluindo S.
aequifasciatus cujos dados meióticos ainda não foram descritos.
8
I.3 Complexo sinaptonêmico em peixes neotropicais
Análises meióticas mais refinadas, como a análise do complexo
sinaptonêmico, também podem ajudar a compreender a diversidade dos
organismos. O complexo sinaptonêmico é uma estrutura especializada e
responsável pela sinapse ou emparelhamento dos cromossomos homólogos
durante a meiose, e ocorre na maioria dos organismos diploides durante o
processo de formação dos gametas. Esta estrutura auxilia na compreensão dos
eventos evolutivos que ocorreram na especiação dos táxons, como
identificação de níveis de ploidia observados pela formação de bivalente,
trivalente, tetravalente, etc.; fusões cêntricas e translocações com a formação
de figuras meióticas múltiplas; inversões e duplicações com a visualização de
alças de inversão nas fases mais iniciais da prófase I (Moses et al., 1982;
Zhang et al., 1992; Siqueira Jr et al., 2004).
Em peixes neotropicais, o complexo sinaptonêmico tem sido utilizado na
análise de cromossomos sexuais, do comportamento de cromossomos
supernumerários na meiose e na piscicultura, para se verificar os efeitos
meióticos da formação de híbridos. Os primeiros resultados utilizando esta
técnica foram os de Dias (1995) e Dias et al. (1998), que analisando Astyanax
scabripinnis e Prochilodus lineatus (ambos Characiformes), constataram que o
único cromossomo supranumerário de Astyanax scabripinnis comportava-se
como um univalente na meiose, enquanto os supernumerários (zero a sete
cromossomos) de Prochilodus lineatus associavam-se como bivalentes,
trivalentes e tetravalentes, evidenciando uma possível homologia entre eles.
Para compreender o comportamento cromossômico de Hoplias
malabaricus, que apresenta sistema sexual múltiplo (2n=36+X1X1X2X2 em
fêmeas e 2n=36+X1X2Y em machos), Bertollo & Mestriner (1998) analisaram a
meiose e o complexo sinaptonêmico dessa espécie. Por meio destas análises,
confirmou-se que nos machos os autossomos emparelhavam-se perfeitamente
e que os cromossomos sexuais formavam um trivalente na meiose I e tinham
uma segregação regular na anáfase I e anáfase II.
O comportamento de cromossomos supernumerários em meiose
também foi estudado por Portela-Castro et al. (2001). Estes autores
9
encontraram de um a dois supernumerários em células somáticas de machos
de Moenkhausia sanctaefilomenae (Characidae), os quais nunca foram
observados nas fêmeas. Ao analisar o complexo sinaptonêmico, verificou-se
que durante a prófase I estes cromossomos apresentavam-se, na maioria das
vezes, como pequenos bivalentes, o que poderia favorecer a sua transmissão e
manutenção durante a evolução cromossômica da espécie.
Além disso, a análise do complexo sinaptonêmico apresentou-se como
uma boa ferramenta na piscicultura neotropical. Santos et al. (2002) utilizaram
esta técnica para demonstrar que o peixe tambacu, híbrido artificial de pacu
(Piaractus mesopotamicus - macho) com tambaqui (Colossoma macropomum -
fêmea) (Characiformes), possui uma meiose atípica, o que garante que a
produção artificial destes híbridos não ocasione um processo de introgressão
em relação às espécies parentais, não havendo assim o risco de extinção
dessas espécies.
I.4 Citogenética molecular
A análise dos cromossomos mitóticos e meióticos, condensados ou
distendidos é fundamental para a avaliação da diversidade genética e evolução
cariotípica de um grupo, porém alguns rearranjos podem passar despercebidos
quando empregadas apenas técnicas clássicas. Para sanar este problema, a
citogenética molecular surgiu para complementar os estudos por meio da
identificação de sequências de DNA específicas no cromossomo, consistindo
basicamente no pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA com
uma seqüência de nucleotídeos complementar, situado na célula alvo (Artoni et
al., 2000; Guerra, 2004).
Na citogenética de peixes, a hibridização fluorescente in situ (FISH) tem
se revelado como importante ferramenta por permitir novas interpretações da
diversidade cariotípica, em particular sobre a origem de cromossomos sexuais
e de supranumerários, bem como sobre a organização genômica de
segmentos cromossômicos (Galetti Jr. & Martins, 2004).
Com relação à organização genômica, tem sido constatado que genes
de cópia única ou de poucas cópias correspondem a uma pequena parte do
genoma dos vertebrados (2-10%), quando comparado às regiões repetitivas
10
(Horvath et al., 2001). Eucariotos tem dois tipos de DNA altamente repetitivos:
sequências de DNA repetitivo dispersas e sequências de DNA repetidas em
tandem. As sequências de DNA repetidas em tandem incluem os DNAs
satélites e os DNAs ribossomais, enquanto as sequências repetitivas dispersas
englobam os elementos transponíveis (Phillips & Reed, 1996; Martins, 2007).
Estudos recentes em peixes neotropicais, como em Leporinus spp.,
Pimelodus spp., Serrasalmus spp., Triportheus spp. entre outros, tem utilizado
a técnica da hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas de DNA
ribossômico 18S para compreender a organização das regiões organizadoras
de nucléolo (Martins & Galetti Jr., 1999; Garcia & Moreira-Filho, 2008;
Nakayama et al., 2008; Diniz et al., 2009). Este método é considerado mais
sensível que a impregnação por nitrato de prata e que a Cromomicina A3
porque localiza as sequências de DNA ribossômico nos cromossomos, ao
invés de marcar as proteínas nucleolares envolvidas com a atividade
transcricional dos genes ribossomais como ocorre com a impregnação com
nitrato de prata (Miller et al., 1976; Pendás et al., 1993a,b; Phillips & Reed,
1996). Análise da localização física cromossômica do DNAr 5S também tem
sido utilizada em estudos evolutivos de peixes (Martins & Galetti Jr., 1999;
2000; Martins, 2007).
Outra classe importante de elementos repetitivos são os elementos
transponíveis, que são sequências capazes de se integrar em novas
localizações do genoma e mobilizar sequências não-autônomas, sendo que
todos os tipos conhecidos destes elementos são encontrados nos genomas
dos peixes (Volff et al., 2003; Ozouf-Costaz et al, 2004). Apesar de existirem
poucos estudos, envolvendo a distribuição de elementos transponíveis em
cariótipos de peixes neotropicais até o momento, a utilização destas
sequências no mapeamento físico cromossômico pode proporcionar maior
esclarecimento acerca do genoma das espécies, de como este genoma está
organizado e como ocorreu a sua evolução. Além disso, este conjunto de
informações pode ser empregado em estudos de genética aplicada (Martins,
2007).
11
Análises citogenéticas sequenciais já efetuadas em Symphysodon
(coloração convencional com Giemsa, bandamento C e impregnação com
nitrato de prata), tanto para cromossomos mitóticos quanto meióticos, vêm
mostrando uma grande variabilidade intra e interespecífica tanto em relação à
estrutura cromossômica como em relação aos marcadores RONs e banda C
(Mesquita, 2002; Gross, 2006; Mesquita et al., 2008). Ainda, Gross (2006)
verificou em células profásicas I de S. haraldi uma cadeia cromossômica em
anel, que não havia sido descrita para peixes, especialmente os neotropicais.
Desse modo, o emprego de técnicas de citogenética molecular como
FISH, utilizando sondas de DNA ribossômico 5S e 18S e elementos
retrotransponíveis Rex3, são úteis para auxiliar na compreenção da complexa
organização dos cromossomos nas espécies de Symphysodon. Além disso,
análises meióticas, principalmente envolvendo complexo sinaptonêmico,
podem trazer informações adicionais sobre os eventos que propiciaram a
formação desta cadeia e como os cromossomos estão se emparelhando
durante a meiose.
12
I.5 Objetivos
I.5.1 Geral
Analisar os cromossomos mitóticos e compreender o comportamento
cromossômico meiótico de Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus
e Symphysodon haraldi selvagens, procurando verificar a existência de
diferenças citogenéticas entre os indivíduos das colorações selvagens, ou seja,
disco verde, disco azul/marrom e disco heckel, encontrados na bacia
amazônica e inferir sobre eventos que propiciaram a formação da cadeia
cromossômica encontrada em S. aequifasciatus e S. haraldi e não em S.
discus.
I.5.2 Específicos
a) Determinar o cariótipo dos acarás-disco selvagens, de colorações
verde, azul/marrom e heckel, para verificar se existem diferenças citogenéticas
entre eles.
b) Caracterizar o comportamento dos cromossomos nos diversos
estágios da meiose de machos e fêmeas destas espécies, para cada padrão de
coloração.
c) Estabelecer o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva e
das regiões organizadoras de nucléolo (com a impregnação por prata e FISH)
nos cromossomos mitóticos e meióticos.
d) Identificar o complexo sinaptonêmico dos cromossomos formadores
da cadeia cromossômica de S. aequifasciatus e S. haraldi.
13
II. Material e métodos
II.1 Material
Foram estudados, citogeneticamente, 22 exemplares de acarás-disco
verde (Symphysodon aequifasciatus - 14 machos e oito fêmeas), 37 discos
heckel (S. discus- 15 machos e 22 fêmeas) e 49 marrom/azuis (S. haraldi - 21
machos e 28 fêmeas), adotando o mais recente esquema de classificação
proposto por Bleher et al. (2007).
Estes peixes foram mantidos vivos no Laboratório de Genética Animal
do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia – INPA, Coordenação de
Pesquisas em Biologia Aquática, onde foram realizadas as análises.
Para a obtenção de preparações cromossômicas foi extraído o órgão
hematopoiético de todos os indivíduos e as gônadas dos machos e fêmeas
imaturas, sendo estes exemplares numerados, registrados, fixados em formol
10% durante 24h e acondicionados posteriormente em recipientes contendo
álcool 70%. Dez espécimes de cada espécie foram depositados na coleção de
peixes do INPA (INPA 28582, INPA 28583, INPA 28584) e os outros indivíduos
estão depositados na coleção de peixes do Laboratório de Genética Animal do
INPA. Todo este estudo foi efetuado com permissão do IBAMA (Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis, licença
011/2005 e licença permanente de Eliana Feldberg).
II.2 Métodos
II.2.1 Indução de mitoses
Para se obter um maior número de células em metáfase foi utilizada a
técnica para indução de mitoses descrita por Molina (2001), na qual o
composto farmaceutico Munolan (Allergan Frumtost) foi dissolvido em água (1
comprimido por mL de água destilada), sendo esta solução posteriormente
injetada intraperitonialmente na região dorso-lateral do peixe, na proporção de
1mL para cada 100g de peso do animal. Os peixes submetidos ao tratamento
foram colocados em aquários bem aerados por 24 horas.
14
II.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos
Para a obtenção das preparações cromossômicas mitóticas foi utilizada
a porção anterior e/ou posterior do rim, que é o órgão hematopoiético dos
peixes, segundo a técnica alternativa para peixes descrita por Moreira-Filho &
Bertollo (1990).
Os acarás-disco foram anestesiados em água contendo gelo e
sacrificados em seguida. O rim foi retirado e lavado em pequenos recipientes
de vidro contendo solução hipotônica de KCl a 0,075M, sendo transferido
imediatamente para outro recipiente de vidro com cerca de 10mL da solução
hipotônica, onde foi dissociado com pinças de dissecção e seringa desprovida
de agulha, que serviu para aspirar e expirar suavemente a suspensão para
divulcionamento do tecido renal e consequente separação das celulas. Uma
solução aquosa de colchicina a 0,0125% foi adicionada in vitro, na proporção
de 0,5mL para 15mL de KCl. A suspensão celular obtida foi mantida em estufa
a 37 °C por 30 minutos. Após este tempo, o material foi ressuspendido
cuidadosamente com o auxílio de uma seringa sem agulha e transferido para
um tubo de centrífuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. O fixador Carnoy foi
preparado na proporção 3:1 (metanol: ácido acético) e 0,3mL foram
adicionados à suspensão celular, que foi centrifugada durante 10 minutos a
900 rpm, sendo posteriormente descartado o sobrenadante. Novamente o
material foi ressuspendido com o auxílio de uma pipeta Pasteur, 8mL de fixador
Carnoy foram adicionados e a suspensão foi novamente centrifugada durante
10 minutos a 900 rpm, sendo este procedimento repetido por mais duas vezes.
Após a última centrifugação e a eliminação do sobrenadante, 1,5mL de fixador
foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. Essa suspensão
celular foi estocada em tubo de 1,5 ml e mantida em freezer para posterior
utilização.
15
II.2.3 Preparação das lâminas com cromossomos mitóticos
Para a preparação das lâminas com cromossomos mitóticos, as
mesmas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente imersas em água
destilada a 50 ºC, em banho-maria. Após cinco minutos, as lâminas foram
retiradas da água de forma a manter uma película de água sobre a sua
superfície, na qual foi gotejada a suspensão celular em diferentes regiões.
II.2.4 Obtenção de cromossomos meióticos
Para a obtenção das preparações cromossômicas meióticas foram
utilizadas gônadas masculinas e femininas (imaturas), empregando-se a
técnica descrita por Bertollo et al. (1978), com algumas modificações propostas
por Gross (2006).
Para caracterização das diferentes fases meióticas, as gônadas não
foram tratadas com solução de colchicina. Após o sacrifício do peixe, os
testículos e ovários imaturos foram seccionados em fragmentos bem pequenos
e colocados em solução hipotônica de KCl a 0,075M por 30 minutos. Logo
após, o material foi transferido para uma cubeta contendo fixador Carnoy (3
partes de metanol: 1 parte de ácido acético) recém-preparado, por 20 minutos.
Após este período, o fixador foi descartado, sendo este processo de fixação
repetido por mais duas vezes. Em seguida, o material foi guardado em
refrigerador a 4 ºC, em tubos de 1,5 ml com fixador Carnoy para ser
processado posteriormente, ou então fragmentos foram retirados do fixador e
secos em papel de filtro para a continuação da técnica. Após o fragmento
gonadal estar seco, este foi colocado sobre uma lâmina limpa e macerado em
1mL de ácido acético 50%, com o auxílio de um bastão de vidro. O material foi
seco sobre a lâmina em uma placa aquecedora a 40 ºC, sendo posteriormente
corado com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8 por 10 minutos e
lavado em água de torneira e a lâmina seca diretamente ao ar.
16
II.2.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos nos cromossomos mitóticos e meióticos
Para a caracterização das regiões organizadoras de nucléolos (RON) foi
utilizada a técnica descrita por Howell & Black (1980), que consistiu em pingar
sobre a preparação cromossômica 1mL de uma solução coloidal, obtida com
1g de gelatina comercial sem sabor dissolvida em 50mL de água destilada e
acrescida de 0,5mL de ácido fórmico. Em seguida, foram adicionados sobre a
solução coloidal 2mL de solução aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 50%,
agitando levemente a lâmina, que foi coberta com uma lamínula. A lâmina foi
colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 ºC, por um período variável
de 3 a 8 minutos, até atingir uma coloração marrom dourada, sendo então
lavada em água destilada, permitindo que a lamínula fosse retirada
naturalmente pela própria água. As lâminas secaram diretamente ao ar, sendo
posteriormente coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8
por 1 minuto, lavadas em água de torneira e secas novamente ao ar.
II.2.6 Detecção da heterocromatina constitutiva nos cromossomos mitóticos e meióticos
Para a caracterização da heterocromatina constitutiva foi utilizada a
técnica de banda C descrita por Sumner (1972), com algumas modificações.
As lâminas contendo as preparações cromossômicas foram tratadas
durante 2 minutos com HCl 0,2N a 46 ºC, lavadas em água destilada à
temperatura ambiente e secas ao ar. Em seguida, as preparações
cromossômicas mitóticas foram incubadas a 46 ºC, em solução de hidróxido de
bário a 5%, filtrada e recém preparada, por 1minuto e 30 seguntos e as
meióticas por 4 minutos e 30 segundos. A ação do hidróxido de bário foi
interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (46
ºC), sendo posteriormente lavada em água destilada. Após secas, as lâminas
foram incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico
0,03M, pH 6,8), em banho-maria a 60 ºC, por um período de 15 minutos, sendo
posteriormente secas ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato
0,06M e pH 6,8 por 20 minutos, lavadas em água de torneira e secas
novamente ao ar.
17
II.2.7 Hibridização fluorescente in situ (FISH)
II.2.7.1. Extração do DNA
Para extração do DNA foi utilizado tecido muscular de Symphysodon
aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, seguindo o protocolo de Sambrook &
Russell (2001), com algumas modificações. Para tanto, foi utilizado o tampão
de lise (Tris-HCl 10 mM em pH 8,0 , NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS
1%) de Estoup et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente foram
acrescentados: 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10
mg/mL). As amostras foram incubadas para que o tecido fosse totalmente
digerido. A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol, fenol e
clorofórmio, álcool isoamílico e clorofórmio hidratado (500 μL de cada um
destes reagentes). Após a lise, o DNA foi separado das proteínas por
precipitação salina juntamente com centrifugação a 14.000 rpm. A fase aquosa
(sobrenadante) que contém o DNA foi separada em um novo tubo e o DNA
precipitado com volume de isopropanol 100% igual ao volume da fase aquosa
obtida. Em seguida a amostra foi submetida a centrifugação, o sobrenandante
descartado e o tubo contendo pellet de DNA colocado para secar. Ao final, o
DNA foi hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q, dependendo
da quantidade do pellet de DNA formado. Para possibilitar a análise da
quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por
comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese
padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos)
em gel de agarose 1,5% e corado com Sybr Safe (1:10.000). A visualização e
análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100
(BioAgency), o qual possui acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260
nM).
II.2.7.2. Obtenção das sondas via PCR e marcação por kit nick translation
(Bionick labeling system-Invitrogen)
Para a obtenção das sondas do elemento retrotransponível Rex 3 e de
DNAr 5S e DNAr 18S foi utilizado o DNA genômico extraído do músculo de
18
Symphysodon spp. A sondas foram obtidas por amplificação por Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR - Saiki et al., 1988) utilizando os primers:
- Rex3 (RTX3-F3 5` CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG e RTX3-R3 5` TGG
CAG ACN GGG GTG GTG GT) (Volff et al., 1999; 2001);
- DNAr 5S (A 5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3‘ e B 5’-
CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’) (Komiya & Takemura, 1979);
- DNAr 18S (IpF 5’CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e IpR
5’CCGAGGACCTCACTAAACCA) desenhados a partir da sequência completa
do gene RNAr 18S de Ictalurus punctatus disponível nos bancos de dados do
NCBI (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
(código identificador da sequência AF021880).
Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas:
a) Rex3: 2 minutos a 95 ºC (desnaturação); 35 ciclos de um minuto a 95
ºC, 40 segundos a 55 ºC, 2 minutos a 72 ºC (amplificação); 5 minutos a 72 ºC
(extensão);
b) 5S: 5 minutos a 94 ºC (desnaturação); 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
segundos a 59 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
segundos a 57 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 25 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC (amplificação); 7 minutos a 72 ºC
(extensão);
c) 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação); 35 ciclos de 1 minuto a 95 ºC,
30 segundos a 55 ºC, 1 minuto e 40 segundos a 72 ºC (amplificação); 7 minutos a
72 ºC (extensão).
As reações de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf -
Mastercycler Gradient, para volume final de 25 μL (1 μL de DNA genômico; 2,5
μL de Tampão 10X com cloreto de magnésio; 0,25 μL de Taq DNA Polimerase;
1,5 μL de dNTP (1 mM); 1,5 μL de cada primer (5 mM); água milli-Q para
completar o volume).
As sondas foram marcadas por biotina 14-dATP por nick translation,
seguindo protocolo do fabricante (Bionick labeling system-Invitrogen). Para tanto,
em um tubo de eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparado uma solução
19
contendo 1 μL de Mix dNTP 10x; 1 μL de sonda de DNA (200 ng/ μL); 1 μL de
Mix de enzima 10x; 6 μL de água milli-Q, totalizando 9 μL, para cada lâmina a
ser hibridizada. Esta solução foi homogeneizada, centrifugada brevemente e
incubada a 16 ºC por 45 minutos no termociclador. Em seguida, para
interromper a reação, foi adicionado 1 μL de stop buffer contendo 1 μL de
acetato de sódio 3M. Para a precipitação da sonda marcada foram adicionados
22 μL de etanol 100% gelado e deixado precipitar em freezer -70 ºC por duas
horas. Decorrido este tempo, a sonda foi centrifugada por 15 minutos a 15.000
rpm a 4 ºC, o sobrenadante foi descartado com cuidado e o tubo contendo a
sonda seco a temperatura ambiente. Após seca, a sonda foi ressuspendida
com 6 μL de água milli-Q. Adicionalmente, as sondas de Rex3 foram marcadas
por nick translation usando digoxigenina (Roche) e usadas em hibridizações
duplas com o DNAr 5S, sendo os cromossomos contra-corados com DAPI.
II.2.7.3. Hibridização cromossômica mitótica e meiótica
II.2.7.3.1. Desnaturação dos cromossomos e tratamento com RNAse
Lâminas recém-preparadas com cromossomos foram desidratadas em
álcool 70, 85 e 100% gelado, por cinco minutos cada. O DNA cromossômico das
preparações mitóticas foi desnaturado por 10 segundos em formamida 70% (70
mL de formamida e 30 mL de 2xSSC), pH 7,0 a 67 ºC e o das preparações
meióticas por 15 segundos. Após a desnaturação, as lâminas foram novamente
desidratadas em série alcoólica gelada (70, 80 e 100%, cinco minutos cada). Em
seguida, as lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x (7,58 g de cloreto de
sódio 1,36M; 0,993 de fosfato de sódio dibásico – Na2HPO4; 0,414g de fosfato
de sódio monobásico- NaH2PO4; completar para volume de 1000 mL com água
milli-Q) durante cinco minutos, em temperatura ambiente. Em seguida as
lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70, 80 e 100%, cinco
minutos cada) e incubadas em 90µg de RNase (3,2 μL de Rnase 10 mg/mL e
796,8 μL de 2xSSC), sob lamínula, a 37 ºC por 1 hora em câmara úmida. Para
interromper a degradação do RNA as lâminas foram lavadas três vezes por
20
cinco minutos cada com 2xSSC (removendo as lamínulas antes da primeira
lavagem) e uma vez em PBS 1x durante 5 minutos.
II.2.7.3.2. Desnaturação da sonda e hibridização
Para cada lâmina a ser hibridizada foi adicionado, em um tubo eppendorf,
6 μL da sonda, 15 μL de formamida (concentração final de 50%), 6 μL de
sulfato de dextrano 50% (concentração final de 10%) e 3 μL (1/10) de 20xSSC
(concentração final de 2xSSC), totalizando um volume de 30 μL. A sonda foi
desnaturada a 95 ºC por cinco minutos em termociclador e em seguida
colocada imediatamente no gelo.
A solução de hibridização foi colocada sobre uma lâminula e a lâmina
desnaturada invertida foi colocada sobre a lamínula. Para a hibridização as
lâminas permaneceram com o material voltado para baixo em câmara úmida
(2xSSC), a 37 ºC, por cerca de 12 horas. Decorrido este tempo, a lamínula foi
removida e a lavagem pós-hibridização ocorreu a 72 ºC em 2xSSC, pH 7,0 por 5
minutos. Em seguida as lâminas foram imersas em tampão PBD, pH 7,0 (20 mL
de 20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em pó desnatado; água destilada). Para a
detecção das sondas foi aplicado em uma lamínula 4 μL de FITC-Avidina
conjugada 0,07% (Sigma) e 26 μL de Tampão C (0,1M de bicarbonato de sódio
pH 8,5 e 0,15M cloreto de sódio), sendo a lâmina colocada invertida sobre a
lamínula e incubada durante 30 minutos em câmara úmida a 37 ºC. Após isso a
lamínula foi removida e as lâminas lavadas três vezes em tampão PBD a 45 ºC,
por dois minutos cada. Em seguida, duas séries de amplificação de sinal foram
efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em tampão PBD (1 μl de anti-
avidina estoque em 19 μl 1xPBD por lâmina), sendo as lâminas incubadas 10
minutos em câmara úmida a 37 ºC. Cada tratamento com antiavidina-biotina
conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em Tampão C
(4 μL FITC-Avidina 0,07% e 26 μL de Tampão C), com incubação por 10 minutos
em câmara úmida a 37 ºC. Depois de cada passo de amplificação, as lâminas
foram lavadas três vezes em tampão 1xPBD a 45 ºC por 2 minutos cada. Os
cromossomos foram contracorados com iodeto de propídeo 0,2% diluído em
21
antifade Vector (20 μL de antifade e 0,7 μL de iodeto de propídeo 50 μg/mL) e
cobertos com lamínula para proceder a análise imediata.
As análises foram efetuadas em Microscópio Olympus Bx-51 e as
metáfases capturadas através do Programa Image –PRO MC60.
II.2.7.4. Caracterização das sondas de DNA
II.2.7.4.1. Construção de vetores plasmidiais recombinantes contendo
fragmentos de DNA obtidos por PCR
A construção de vetores plasmidiais recombinatnes contendo
fragmentos de DNA (produtos de PCR) foi realizada para a caracterização
destes segmentos de DNA, no Laboratório Temático de Biologia Molecular-
INPA. O kit de ligação pGEM-T Easy Vector System I (Promega) foi utilizado
para ligação dos fragmentos de interesse ao plasmídeo pGEM-T, seguindo as
especificações do fabricante. Para tanto, para cada amostra foi adicionado em
um eppendorf de 1,5 mL: 1,5 μL de água milli-Q, 5 μL de Tampão, 1 μL de
plasmídeo, 1,5 μL de produto de amplificação, 1 μL de T4 DNA ligase, sendo
esta solução incubada a 4 ºC overnight (cerca de 12 horas).
II.2.7.4.2. Transformação
As construções recombinantes obtidas foram utilizadas para a
transformação de células competentes de Escherichia coli DH5α (cedidas pelo
Dr. Spartaco Astolfi Filho - UFAM).
As células competentes foram retiradas do freezer -70 oC e colocadas
em recipiente com gelo mantido dentro do fluxo laminar para descongelar. Em
um tubo de 1,5 ml contendo 50 μL de bactérias competentes foram adicionados
5 μL de plasmídios recombinantes, seguido de leve agitaçao. A mistura foi
deixada no gelo por 30 minutos. Transcorrido este tempo, a amostra de
transformação foi colocada em banho-maria a 37 ºC por um minuto e, em
seguida, voltou ao gelo por dois minutos o que possibilitou o choque térmico e
permitiu que os poros da membrana se abrissem mais e internalizassem o DNA
plasmidial. Posteriormente foram adicionados e misturados com muito cuidado
22
950 μL de meio líquido LB (peptona 1%; cloreto de sódio 0,17M; extrato de
levedura 0,5%, pH 7,5), sendo a mistura incubada em um agitador (shaker) 225
rpm por uma hora para que as bactérias começassem a recupar a parede
celular. Faltando 15 minutos para acabar a incubação, as placas com meio LB
sólido (peptona 1%; cloreto de sódio 0,17M; extrato de levedura 0,5%, ágar
1,5%, pH 7,5) contendo 2 μL de amplicilina foram retiradas da geladeira e foi
adicionado 35 μL de X-Gal, deixando-as semi-abertas. Ao término da
incubação os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm e o
sobrenadante foi descartado por inversão do tubo. O meio de cultura líquido
restante no tubo foi utilizado para ressuspender as bactérias recombinantes
com cuidado que foram posteriormente adicionadas à placa e espalhadas com
alça de vidro flambada e frio. Após secas, as placas foram incubadas viradas
para baixo em uma estufa a 37 ºC overnight (cerca de 12 horas), até haver o
crescimento das colônias. As colônias recombinantes apresentaram coloração
branca e foram selecionadas. Cada colônia foi retirada com uma ponteira e
colocada em uma solução de PCR padrão (11,7 μL de água, 5 μL de dNTP, 1
μL de cada primer, 2,5 μL de tampão, 0,19 μL de Taq), utilizando os primers
universais M13 (F 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’; R 5’-
CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'). Os clones recombinantes resultantes
foram estocados em glicerol 70% e armazenados em freezer a -80 ºC.
II.2.7.4.3. Sequenciamento das sondas de DNA
Para verificar se o fragmento amplificado por PCR correspondia às
regiões de interesse, o sequenciamento do DNA foi realizado pelo método de
Sanger et al. (1977), com terminadores marcados com fluorescência. Para a
realização das reações de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET
Terminator Cycle Sequencing (GE HealthCare), no qual cada
dideoxinucleotídeo (terminador) é marcado com fluoresceína (responsável pela
ativação do segundo elemento) e um dos quatro tipos de rodamina, cuja
fluorescência é captada pelo sequenciador automático de DNA.
As reações de sequenciamento foram realizadas em placas de 96
poços, utilizando-se entre 150 e 300 ng do produto de PCR purificado; 5 pmol
23
de cada primer em reações separadas; 4 μL do premix (kit) e água mili-Q para
completar o volume de 10 μL. Essas reações foram feitas em um termociclador
Eppendorf - Mastercycler Gradient, em 30 ciclos sendo: desnaturação a 95 ºC
por 20 segundos, anelamento a 50 ºC por 15 segundos e extensão a 72 ºC por
1 minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no sequenciamento foram os
mesmos utilizados para o PCR. Depois de sequenciado, os fragmentos foram
submetidos a um tratamento de precipitação para a eliminação de produto não
incorporado durante a reação de sequenciamento. Logo após foi realizada a
leitura automática do fragmento no sequenciador automático de DNA
MegaBACE 1000 (GE HealthCare), nas condições de injeção e corrida
recomendadas pelo fabricante.
As amostras sequenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do
sequenciador para outro computador. As sequências geradas foram
comparadas com sequências depositadas no banco de dados público na
Internet, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), por uma procura realizada
com o programa BLAST. Este procedimento foi realizado para determinar se o
fragmento sequenciado realmente correspondia ao gene de interesse. Depois
de conferidas, todas as sequências foram alinhadas utilizando-se o programa
de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que está incluso no
BioEdit v. 5,0,6 (Hall, 1999). O alinhamento gerado foi manualmente conferido
e editado no mesmo programa.
II.2.8 Microespalhamento para visualização do complexo sinaptonêmico
Para obtenção do complexo sinaptonêmico a partir de gônadas
masculinas foi utilizada a técnica descrita por Moses (1977), Dresser & Moses
(1980), coloração por Howell & Black (1980), com algumas modificações.
Para tanto, as gônadas masculinas foram retiradas e lavadas em
solução de Hanks, sendo posteriormente colocadas numa placa escavada
contendo a mesma solução. Com o auxílio de duas pinças, o material foi
divulsionado, sendo os pedaços maiores descartados. Em seguida, o material
foi macerado em uma placa escavada e ressuspedido várias vezes com o
24
auxílio de uma seringa sem agulha, sendo então transferido para um tubo de
centrífuga, onde foram adicionados 6 mL de solução de Hanks. Com o auxílio
de uma pipeta Pasteur o material foi ressuspendido e, logo após, centrifugado
por 4-5 minutos a 800 rpm. A maior parte do sobrenadante foi descartada,
deixando-se cerca de 1-1,5 vezes o volume do pellet celular . O pellet foi
ressuspendido com o que restou do sobrenadante, sendo esta suspensão
mantida em gelo durante o preparo das lâminas. Em um suporte côncavo com
parafilme aderido à superfície, foi colocado 1,5 mL de solução de NaCl 0,5%
formando uma gota arredondada, onde foi colocada 0,3 mL da suspensão
celular, com o auxílio de uma pipeta Pasteur de ponta bem fina, cuidando para
que esta não afundasse. Em seguida, uma lâmina plastificada preparada
anteriormente (utilizando solução de plástico a 0,6% (peso/volume) diluída em
clorofórmio) foi encostada sobre a superfície da gota de NaCl 0,5% contendo a
suspensão celular, sendo esta levantada paralelamente à gota. A lâmina foi
então imersa numa solução fixadora de paraformaldeído 4% acrescida de 1,5
mL de dodecilsulfato de sódio (SDS) 0,3%, por 5 minutos em temperatura
ambiente. Em seguida a lâmina foi transferida para numa solução fixadora de
paraformaldeído 4%, pH 8,2, por 5 minutos em temperatura ambiente. Após
seca, a lâmina foi imersa na solução de photo-floo (Kodak) 0,4%, pH 9,0, por
15 segundos em temperatura ambiente. Por último, a lâmina foi retirada da
solução de photo-floo, teve sua parte de trás limpa com lenço de papel e
deixada secar naturalmente, em ambiente livre de poeira. Após secarem, as
lâminas foram impregnadas com nitrato de prata. Para tanto, foi colocada sobre
a lâmina 1 mL de uma solução coloidal reveladora (1g de gelatina em 50 mL de
água destilada com 0,5 mL de ácido fórmico) e 2 mL de solução de nitrato de
prata (AgNO3) a 50%, sendo a lâmina coberta com lamínula e incubada em
câmara úmida, a 60 ºC, até atingir coloração marrom-dourada (geralmente 2-3
minutos), quando foi lavada em água destilada, permitindo que a lamínula
fosse retirada naturalmente pela própria água. As lâminas secaram diretamente
ao ar. Normalmente duas lâminas por indivíduo foram feitas, sendo uma
destinada para análise em microscopia óptica, objetiva de 100x e outra para a
microscopia eletrônica. Para a observação em microscopia eletrônica, o
25
plástico que recobria as lâminas foi cortado com um estilete e a lâmina
mergulhada lentamente numa coluna de água, com uma inclinação de 60º,
para o descolamento do plástico, o qual permanecia na superfície. Com uma
pinça delicada, as telinhas metálicas (grids) “Mash 50” foram colocadas sobre o
plástico flutuante. Em seguida este plástico com as telas foi capturado com um
retângulo de parafilme, o qual secou naturalmente. As telinhas contendo o
material a ser analisado foram guardadas em caixinhasas próprias, para
posterior análise em microscópio eletrônico, a qual foi feita no microscópio
eletrônico Philips, do departamento de microscopia da Universidade Estadual
Paulista, UNESP-Botucatu.
II.2.9 Análises cromossômicas
As preparações mitóticas e meióticas (análises convencionais e FISH)
foram analisadas em microscópio óptico e/ou fotomicroscópio de
epifluorescência Olympus Bx-51 do Laboratório de Genética Animal-CPBA,
INPA e Olympus Bx-61 do Laboratório de Genômica Integrativa – UNESP-
Botucatu, em objetiva de imersão. As melhores preparações cromossômicas
foram selecionadas e tiveram sua imagem capturada. A montagem dos
cariótipos foi feita a partir de cromossomos metafásicos mitóticos, os quais
foram recortados, tentativamente emparelhados, medidos e colocados em
ordem decrescente de tamanho. A relação de braços dos cromossomos
mitóticos foi determinada de acordo com a proposta de Levan et al. (1964).
Devido à dificuldade de emparelhamento cromossômico, o qual é peculiar nos
ciclídeos, uma vez que estes apresentam tamanhos e morfologia
cromossômica similar, os cromossomos foram agrupados segundo Thompson
(1979) e Mesquita et al. (2008), sendo consideradas três categorias: meta-
submetacêntricos, subtelo-acrocêntricos e microcromossomos. Foram
considerados microcromossomos os cromossomos com tamanho pequeno (de
0,5 a 1,5 μm) e que aparecem na maioria das metáfases como pontos. Como
os centrômeros destes cromossomos não são evidentes na maioria das
metáfases é difícil estabelecer a morfologia cromossômica (para revisão sobre
microcromossomos ver Mesquita et al., 2008). Para interpretação da meiose
26
foram consideradas as seguintes fases: leptóteno/zigóteno, paquíteno,
diplóteno, diacinese, metáfase I e metáfase II, dando maior ênfase ao
diplóteno, diacinese, metáfase I e metáfase II.
Para a análise do complexo sinaptonêmico as células paquitênicas e
diplotênicas que apresentaram boas condições de extensão do segmento
emparelhado tiveram sua imagem capturada em fotomicroscópio de
epifluorescência Olympus Bx-51 do Laboratório de Genética Animal-CPBA,
INPA ou foram fotografadas no microscópio eletrônico Philips (Centro de
Microscopia Eletrônica- UNESP-Botucatu, SP), em filme 35mm, com exposição
de 2,04 segundos. Os negativos foram revelados em revelador Dektol (Kodak)
diluído em água, na proporção de 4:1, em temperatura ambiente, por 7
minutos, e fixação em fixador Kodak durante 13 minutos. As imagens foram
ampliadas e reveladas em papel Kodabrome Print RC F3 (Kodak).
27
III. Resultados e discussão Os resultados obtidos com a análise citogenética das três espécies do
gênero Symphysodon e a discussão destes dados são apresentados na forma
de quatro artigos científicos, mencionado a seguir:
III.1.Artigo 1 - Intrigante evidência de translocações em acarás-disco
(Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossômica meiótica em
vertebrados. Publicado no periódico Heredity 102: 435-441.
III.2.Artigo 2: Análise citogenética comparativa das espécies do gênero
Symphysodon (Cichlidae): características cromossômicas de retrotransposons
e subunidade menor do DNA ribossomal. Enviado para publicação no periódico
Cytogenetic and Genome Research, em 13/07/2009. Aceito para publicação
em 24/08/09. Primeira revisão efetuada em 25/08/09.
III.3.Artigo 3: Variabilidade intra e interespecífica do locus do DNAr 18S entre
acarás-disco Symphysodon: rearranjos cromossômicos. Enviado para
publicação no periódico Journal Fish Biology, em 09/06/2009. Aceito para
publicação em 10/08/2009. Primeira revisão efetuada em 20/08/2009.
III.4.Capítulo 4: Complexo sinaptonêmico em acarás-disco: cadeia
cromossômica meiótica. A ser enviado para publicação no periódico Micron.
28
III.1.Artigo 1: Intrigante evidência de translocações em acarás-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossômica meiótica em vertebrados
29
30
III.1.1. Introdução
Os acarás-disco, gênero Symphysodon Heckel, 1840, formam o grupo
mais intrigante e distinto entre os ciclídeos sulamericanos devido à morfologia
de seu corpo, aos padrões de coloração e características cromossômicas
(Kullander, 1996; Feldberg et al., 2003; Ready et al., 2006). Nos últimos
quarenta anos algumas publicações tem indicado que Symphysodon tem o
maior número diploide de todos os ciclídeos, sendo a maioria das informações
referentes à Symphysodon aequifasciatus (Ohno & Atkin, 1966; Thompson,
1979; Takai et al., 2002).
Recentemente, Mesquita et al. (2008) demonstraram que S. discus e S.
haraldi também apresentam um cariótipo derivado. Todas as espécies do
gênero Symphysodon possuem um elevado número diploide (2n=60), com
predominância de cromossomos meta-submetacêntricos, variação morfológica
inter e intraespecífica e microcromossomos (ver Tabela 1 – Introdução Geral,
página 20). O alto número diploide detectado em Symphysodon já foi explicado
de duas formas: como uma consequência de poliploidização (Thompson, 1976)
e por meio de rearranjos cromossômicos, como inversões pericêntricas,
translocações e fissões/fusões (Mesquita et al., 2008). As diferentes fórmulas
cariotípicas descritas para as diferentes espécies de acarás-disco podem ter
sido ocasionadas por enganos na classificação dos cromossomos, uma vez
que o nível de condensação dos cromossomos pode interferir nas análises e a
maioria dos autores não empregou a terminologia microcromossomo. Além
disso, a falta de consenso na classificação taxonômica das espécies pode
também ter gerado erros.
O cariótipo das três espécies apresenta blocos heterocromáticos
localizados principalmente na região pericentromérica de todos os
cromossomos e na região proximal de braços curtos e longos de alguns pares
(Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008). Com relação à região organizadora
de nucléolo (RON), Takai et al. (2002) detectaram um sistema de RON simples
em S. aequifasciatus, usando impregnação por nitrato de prata. Entretanto,
Mesquita et al. (2008) descreveram um sistema de RONs múltiplas em S.
31
aequifasciatus (cromossomos dos pares 5, 10, 11, 15, 21 e 22), S. discus (18
e 24) e S. haraldi (3, 5, 10, 11, 21 e 22).
A análise de configurações meióticas tem sido utilizada para confirmar a
ocorrência de poliploidização, eventos de duplicação e rearranjos
cromossômicos que ocorreram durante a evolução de mamíferos e outros
grupos de vertebrados (Villena & Sapienza, 2001; Dumas & Britton-Davidian,
2002; Siqueira-Jr et al., 2004; Gallardo et al., 2006). Se poliploidização ou
rearranjos cromossômicos tiverem ocorrido, o pareamento cromossômico
meiótico pode ser complexo e resultar em gametas balanceados ou
desbalanceados (Sharp & Rowell, 2007).
Assim como em outros teleósteos, o estudo de cromossomos meióticos
em ciclídeos neotropicais tem sido negligenciado. Os poucos relatos
encontrados na literatura descrevem características notáveis, como
discordância entre número cromossômico de células somáticas e gonadais em
Gymnogeophagus balzanii (Feldberg & Bertollo, 1984).
Neste estudo foram investigados os cromossomos meióticos de
espécies selvagens de Symphysodon, enfatizando a configuração da complexa
cadeia cromossômica meiótica que nunca havia sido encontrada em peixes.
Esta informação poderá contribuir para o entendimento dos rearranjos
cromossômicos envolvidos na carioevolução deste grupo de peixe.
III.1.2. Material e métodos
Os acarás-disco foram coletados em seus habitats naturais na bacia
Amazônica, estado do Amazonas, Brasil. Os peixes foram identificados de
acordo com a taxonomia de Bleher et al. (2007), isto é, S. aequifasciatus (disco
verde), S. discus (discos Heckel) e S. haraldi (disco azul/marrom).
Trinta e cinco machos e nove fêmeas de Symphysodon spp. foram
analisados neste estudo, com licença do IBAMA (11/2005): oito machos e três
fêmeas de S. aequifasciatus do rio Tefé; 15 machos e três fêmeas de S. discus
do rio Negro (proximidades de Novo Airão) e 15 machos e três fêmeas de S.
haraldi do rio Manacapuru (Figura 1). Espécimes testemunhos foram
depositados na Coleção de Peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da
32
Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas, Brasil (INPA 28582, INPA 28583, INPA
25498).
Figura 1 – Espécies selvagens de Symphysodon analisadas, suas distribuições
geográficas na bacia Amazônica (modificado de Bleher, 2006) e os paleoarcos
de Caravari e Purus. a) Symphysodon aequifasciatus; b) S. discus; c) S.
haraldi; d) Mapa geográfico mostrando os locais de amostragem dos discos: a,
Tefé; b, Novo Airão; c, Manacapuru.
33
Preparações cromossômicas meióticas foram obtidas utilizando células
gonadais, segundo protocolo descrito por Bertollo et al. (1978), com
modificações. Testículos e ovários imaturos de indivíduos não submetidos à
colchicinização foram colocados em solução hipotônica (KCl 0,075M) por 30
minutos e fixados em Carnoy (3 metanol : 1 ácido acético) por 20 minutos; este
último tratamento foi repetido por três vezes. A seguir, as gônadas foram
maceradas em ácido acético 50% sobre uma lâmina e secas sobre uma placa
de metal aquecida à temperatura de 45 ºC. Todas as preparações
cromossômicas foram coradas com solução de Giemsa 5% por 10 minutos. A
heterocromatina constitutiva foi detectada pela técnica de Sumner (1972) e as
regiões organizadoras de nucléolo foram impregnadas pelo íon prata de acordo
com a técnica de Howell & Black (1980).
III.1.3. Resultados
Poucas fêmeas foram analisadas devido à presença de grande
quantidade de vitelo nas fêmeas maduras, sendo que este fator interfere na
técnica utilizada, tornando-a impraticável. As células gonadais em intérfase e
prófase I de machos e fêmeas de S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi não
apresentaram regiões heteropicnóticas positivas que indicassem a presença de
cromatina sexual (Figura 2 a, b, c). O comportamento cromossômico de
algumas fases meióticas de S. aequifasciatus e S. haraldi foi similar, mas
diferenças foram detectadas em S. aequifasciatus/S. haraldi e S. discus. Uma
cadeia cromossômica multivalente e 20 bivalentes foram observados no
diplóteno de espermatócitos e oócitos de S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura
2 d, e) e 30 bivalentes foram detectados em S. discus (Figura 2 f). Nas três
espécies, a maioria dos bivalentes apresentou dois quiasmas terminais. A
cadeia cromossômica (C) observada em células diplotênicas de S.
aequifasciatus e S. haraldi provavelmente é composta por 20 elementos,
porque até 20 bivalentes (II) foram encontrados nesta fase. Embora
2n=20II+CXX (onde CXX significa cadeia cromossômica meiótica composta de
20 elementos) represente o maior grau de pareamento cromossômico
observado em diplótenos de S. aequifasciatus e S. haraldi, somente 2% das
34
células analisadas apresentaram esta configuração. Nas duas espécies, a
configuração mais frequente foi uma cadeia cromossômica linear com número
variável de elementos, assim como o número de bivalentes e univalentes
(Figura 3). Esta variação pode ser explicada pela dinâmica do ciclo de divisão
celular (diplóteno precoce, intermediário e tardio). Assim, quando o número de
elementos da cadeia e/ou bivalentes diminui, o número de univalentes aumenta
e uma cadeia cromossômica linear pode ser detectada. Desta forma, durante a
diacinese de S. aequifasciatus e S. haraldi uma cadeia cromossômica em anel
e um número variável de bi- e univalentes foram visíveis (Figura 2 g, h). Em S.
discus esta fase foi caracterizada pela ocorrência de 30 bivalentes, alguns dos
quais exibem uma separação precoce dos cromossomos (Figura 2 i). Células
em metáfase I de S. aequifasciatus e S. haraldi apresentaram a cadeia
cromossômica com disposição em zigzag, indicando uma orientação alternada
dos centrômeros dos cromossomos homólogos (Figura 2 j, k). Células em
metáfase I de S. discus mostraram bivalentes típicos alinhados na placa
equatorial (Figura 2 l). Células em metáfase II das três espécies apresentaram
n=30 cromossomos, confirmando que a segregação dos cromossomos ocorreu
corretamente na anáfase I precedente (Figura 2 m, n, o).
Células diplotênicas de S. aequifasciatus e S. haraldi, submetidas à
técnica de banda C, mostraram a maioria dos bivalentes com dois blocos
heterocromáticos conspícuos, indicando que, provavelmente, estejam
localizados na região pericentromérica, enquanto que a cadeia cromossômica
apresentou um número variável de marcações heterocromáticas (Figuras 4 a,
b). Banda C positiva foi detectada em quase todos os bivalentes diplotênicos
de S. discus machos e fêmeas, sendo o padrão similar ao encontrado em
bivalentes de S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura 4 c).
Os núcleos interfásicos de células gonadais masculinas e femininas das
três espécies de Symphysodon, assim como células da prófase I, foram
impregnados com íon prata. O núcleo interfásico, nas três espécies,
apresentou um número variável de nucléolos marcados com nitrato de prata,
sendo encontradas até seis marcas em S. aequifasciatus e S. haraldi, e até
quatro em S. discus (Figura 4 d, e, f). Em S. aequifasciatus e S. haraldi até
35
duas RONs foram observadas em diplóteno e diacinese. Em S. aequifasciatus
os sítios estavam em bivalentes (Figura 4 g) e em S. haraldi, um estava em um
bivalente e outro na cadeia cromossômica (Figura 4 h). Células da prófase I
tardia de S. discus apresentaram um ou dois bivalentes portando a RON
(Figura 4 i).
36
Figura 2 – Células testiculares meióticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g, j, m), S. haraldi (b, e, h, k, n) e S. discus (c, f, i, l, o) submetidas à coloração convencional. (a-c) Leptóteno/Zigóteno. (d, e) Diplóteno mostrando uma cadeia cromossômica em anel (cabeça de seta) e 20 bivalentes. A maioria dos bivalentes apresenta dois quiasmas terminais (setas). (f) Diplóteno com 30 bivalentes, a maioria exibindo quiasmas terminais (seta). (g, h) Diacinese mostrando uma cadeia cromossômica linear (cabeça de seta) e vários bivalentes e univalentes. (i) Diacinese mostrando a separação precoce de elementos de um bivalente (seta). (j, k) Metáfase I revelando a orientação em zigzag dos cromossomos dentro da cadeia (cabeça de seta). (l) Metáfase I com bivalentes alinhados na placa equatorial. (m-o) Metáfase II com n=30 cromossomos (barra: 10 μm).
37
Figura 3 – Frequência das fórmulas meióticas nas células em diplóteno e
diacinese analisadas em Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi, mostrando
a barra de desvio padrão e números variáveis de bivalentes, elementos
formadores da cadeia e univalentes, provavelmente devido a uma
terminalização precoce de quiasmas. II = bivalente; C XX = cadeia
cromossômica com 20 elementos; C XIX = cadeia cromossômica com 19
elementos; C XVIII = cadeia cromossômica com 18 elementos; C XVII = cadeia
cromossômica com 17 elementos; C XVI = cadeia cromossômica com 16
elementos; C XV = cadeia cromossômica com 15 elementos; U = univalentes.
38
Figura 4 - Células testiculares meióticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d,
g), S. haraldi (b, e, h) e S. discus (c, f, i) após bandamento C (a-c) e
impregnação por íon prata. (a-b) Diplóteno mostrando blocos heterocromáticos
(cabeça de seta) nos elementos cromossômicos formadores da cadeia e em
quase todos os bivalentes (seta). (c) Diplóteno com banda C positiva (seta) na
maioria dos bivalentes. (d-f) Núcleos interfásicos, revelando cinco, seis e quatro
nucléolos (cabeça de seta), respectivamente. (g) Diacinese com uma RON em
um grande bivalente. (h) Diacinese mostrando RONs (cabeças de seta) em um
elemento da cadeia cromossômica e em um bivalente de tamanho mediano
(seta). (i) Diacinese com uma RON em um bivalente de tamanho pequeno
(barra: 10 μm).
39
Figura 5 - Representação esquemática da possível origem da cadeia
cromossômica das células meióticas de Symphysodon aequifasciatus e S.
haraldi (n representa os outros pares cromossômicos envolvidos na meiose
múltipla). (a) Translocações simples e heterozigotas envolvendo pequenos
segmentos de alguns pares cromossômicos. (b) Elementos cromossômicos
derivados de translocações. (c) Configuração meiótica da cadeia
cromossômica, causada por translocações múltiplas e seriadas.
40
III.1.4. Discussão
Apesar da falta de consenso na nomenclatura taxonômica, atualmente
aceita-se a presença de três espécies distintas de Symphysodon, baseando-se
na coloração, morfologia, características moleculares e padrões de distribuição
geográfica pela bacia Amazônica (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007).
Estudos citogenéticos tem indicado que o número diploide igual a 60
cromossomos é encontrado, invariavelmente, em S. aequifasciatus, S. discus e
S. haraldi. Entretanto, distintas fórmulas cariotípicas, número de RONs e
localização da heterocromatina constitutiva sugerem que os cariótipos são
espécie-específicos e refletem a existência de três espécies (Mesquita et al.,
2008).
Tanto Ready et al. (2006) quanto Bleher et al. (2007), analisando
sequências mitocondriais do Citocromo B e D-loop, respectivamente, sugerem
que discos heckel e os discos marrons/azuis não são geneticamente distintos,
provavelmente devido a eventos de introgressão, mas ambas as espécies são
diferentes dos discos verdes. Em contraste, Koh et al. (1999) demonstraram
que há uma clara diferenciação genética entre todas as espécies, baseados em
análises de RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) e que S. discus
é a mais divergente das espécies de acarás-disco. Em um trabalho mais
recente Farias & Hrbek (2008), analisando molecularmente a região controle do
DNA mitocondrial e o gene nuclear RAG1, sugerem a existência de quatro
grupos de discos na região amazônica, sendo que as colorações fenotípicas
dos animais representam unidades geográficas, onde os discos verdes
ocorreriam acima da cidade de Coari (AM), os discos azuis de Coari até o
encontro das águas dos rios Negro e Solimões (próximo à cidade de Manaus) e
o grupo marrom nas águas do rio Amazonas (após a junção do rio Negro com o
Solimões). Adicionalmente, um quarto grupo foi evidenciado na região do rio
Xingu.
A análise do comportamento cromossômico meiótico das espécies de
discos corroborou os dados mitóticos com relação ao número de espécies,
assim como número diploide, distribuição da heterocromatina e RONs, mas
revelou uma surpreendente característica meiótica. Em S. aequifasciatus e S.
41
haraldi 20 bivalentes e uma grande cadeia cromossômica (composta de até 20
elementos) foram observados, enquanto que em S. discus 30 bivalentes típicos
foram evidenciados. Não foi posssível afirmar quais cromossomos formam a
cadeia cromossômica usando apenas métodos citogenéticos clássicos.
Certamente a cadeia cromossômica não é composta apenas pelos
microcromossomos, uma vez que apenas dois pares foram detectados nas
análises mitóticas. Além disso, um sítio ribossomal esteve presente na cadeia
cromossômica de S. haraldi e em cromossomos mitóticos desta espécie os
pares cromossômicos portadores de Ag-RONs foram 3, 5, 10, 11, 21 e 22 e,
nenhum destes foi considerado microcromossomo (Figura 4 h).
Figuras meióticas múltiplas envolvendo mais de quatro cromossomos
são raras e a maioria dos casos está confinada a plantas e invertebrados, não
tendo ainda sido descrita para peixes (para revisão ver Grützner et al., 2006).
Até este estudo, a maior cadeia cromossômica detectada em vertebrados havia
sido encontrada em machos de ornitorrinco (Ornithorhynchus anatinus), os
quais apresentam cinco cromossomos X e cinco Y. Estes 10 cromossomos
formam uma cadeia meiótica multivalente complexa na meiose destes
indivíduos (Grützner et al., 2004). Ao contrário do que foi visto em ornitorrinco,
a cadeia cromossômica encontrada nas espécies de acará-disco, S.
aequifasciatus e S. haraldi, não é formada por cromossomos sexuais, uma vez
que é encontrada tanto em machos quanto em fêmeas.
Entre os peixes, multivalentes meióticos não envolvendo cromossomos
sexuais foram evidenciados em poucas espécies, os salmonídeos Salvelinus
namaycush e Salvelinus fontinalis (Lee & Wright, 1981; Disney & Wright-Jr,
1990), e o gobídeo Gobius fallax (Thode et al., 1988). A origem do
emparelhamento múltiplo para estas espécies foi relacionada à hibridização
entre as mesmas e rearranjos Robertsonianos, respectivamente. Em S.
aequifasciatus e S. haraldi, a cadeia cromossômica meiótica provavelmente
seja resultado de múltiplas translocações de pequenos segmentos de pares
cromossômicos (Figura 5). Mecanismo similar foi proposto para explicar a
configuração multivalente de células meióticas dos anfíbios anuros
42
Physalaemus petersi e Eleutherodactylus binotatus (Lourenço et al., 2000;
Siqueira-Jr et al., 2004).
Em geral, a hibridização e a presença de translocações heterozigotas
reduzem a adaptabilidade devido à formação de gametas desbalanceados.
Entretanto, alguns relatos tem mostrado translocações, as quais podem ser
conservadas em populações que apresentam mecanismos que favorecem uma
orientação alternada nos cromossomos durante a metáfase I, levando à
segregação dos cromossomos translocados para o mesmo pólo celular
(Eichenlaub-Ritter & Winking, 1990; Mirol & Bidau, 1994). Como a cadeia
cromossômica meiótica está presente em ambos os sexos de S. aequifasciatus
e S. haraldi, a translocação autossômica pode estar fixada nas populações de
Tefé e Manacapuru, analisadas no presente trabalho. A orientação em zigzag
da cadeia cromossômica durante a metáfase I em S. aequifasciatus e S. haraldi
pode ser característica de um processo que tenha favorecido a formação de
gametas balanceados e a fixação destes rearranjos dentro da população.
Outros animais, como ovelhas e aranhas, apresentam zonas de hibridação
entre raças. Estas raças apresentam homologia monobranquial e quando se
intercruzam carregam rearranjos Robertsonianos múltiplos, envolvendo
cromossomos homeólogos, o que resulta em cadeias multivalentes e indivíduos
totalmente férteis (Rowell, 1990; Narain & Fredga, 1997; Sharp & Rowell,
2007).
Entretanto, o envolvimento de regiões heterocromáticas terminais na
cadeia cromossômica de S. aequifasciatus e S. haraldi deve ser considerada. A
associação heterocromática de cromossomos não homólogos já foi verificada
por John & King (1982) no gafanhoto Heteropternis obscurella (Orthoptera).
Embora não tenhamos encontrado nenhuma evidência de variação
heterocromática intraespecífica em S. aequifasciatus e S. haraldi, blocos de
banda C terminais podem afetar os quiasmas terminais. Isto poderia levar à
variação no número de univalentes e bivalentes nas diferentes subfases do
diplóteno e diacinese, como mostrado na figura 3. Porém, como apenas 12
braços totalmente heterocromáticos estão presentes nos cariótipo destas
espécies, a associação entre blocos de heterocromatina somente poderia
43
resultar numa cadeia com 12 elementos. Esta evidência sugere que este tipo
de associação não é o único mecanismo responsável pela formação da cadeia
cromossômica, sendo necessária a existência de múltiplas translocações para
originar a figura meiótica verificada nas duas espécies.
Heterocromatina, em peixes, é rica em sequências repetitivas, sendo a
maioria destas, elementos transponíveis (para revisão ver Martins, 2007;
Ferreira & Martins, 2008). Os elementos transponíveis são considerados os
maiores promotores da diversidade genômica e biológica dos vertebrados,
possivelmente desempenham um papel importante na especiação e grandes
mudanças evolutivas (Bohne et al., 2008). A carioevolução de Symphysodon
provavelmente não tenha ocorrido somente por poliploidia ou rearranjos
cromossômicos, como previamente sugerido por Thompson (1976) e Mesquita
et al. (2008), respectivamente, mas também pode ter sido mediada pelo
acúmulo de elementos transponíveis em heterocromatinas terminais e
translocações envolvendo estas regiões. O movimento destes elementos
móveis pode ter ocorrido após hibridação entre espécies de acarás-disco sem
cadeia cromossômica (por exemplo S. discus e um ancestral de S.
aequifasciatus e S. haraldi) e resultou em indivíduos com cadeia cromossômica
meiótica em machos e fêmeas.
Desde a década de 1960, acarás-disco selvagens tem sido exportados
para o Japão, Alemanha e Estados Unidos com o objetivo de criar novas
variedades e para suprir o mercado do peixe ornamental. Programas de
reprodução do tipo tentativa e erro, utilizando diferentes populações selvagens
tem produzido discos com novas características, existindo mais de 600
diferentes variantes, sendo que pelo menos 1,5 milhões de discos são criados
por mês no mundo inteiro (Chan, 1991; Bleher, 2006).
Além disso, processos de seleção artificial de acarás-disco também tem
sido empregados nos últimos 50 anos para a reprodução, sendo que a seleção
de cores fortes, da forma corporal e da coloração das nadadeiras resultou em
várias formas cultivadas que não existem na natureza (Bleher & Göbel, 1992).
Segundo os criadores, a maioria das cores variantes é resultado de endogamia
e cruzamentos entre as espécies S. aequifasciatus e S. haraldi. Os dados
44
genéticos revelados por marcadores RAPD para os acarás-discos selvagens e
cultivados corroboram estes dados (Koh et al., 1999). Symphysodon discus
normalmente não é usado em reproduções cruzadas e isto provavelmente
ocorre porque o cruzamento entre variedades de discos que apresentam
cadeia cromossômica (originados de S. aequifasciatus e S. haraldi) com as que
não apresentam cadeia (descendentes de S. discus) resultem em inviabilidade
dos híbridos ou prole infértil.
Do ponto de vista evolutivo, a cadeia cromossômica observada em S.
aequifasciatus e S. haraldi parece ser uma característica derivada, e a
presença desta cadeia em ambas as espécies indica que elas provavelmente
sejam espécies irmãs, tendo S. discus como grupo irmão deste clado ou como
parental. Entretanto, a partir de análises moleculares baseadas na sequência
parcial do D-loop e Citocromo C não foi possível afirmar se S. discus é basal
dentro de Symphysodon (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). As diferenças
cromossômicas meióticas entre estas espécies relacionadas sugerem que
estas características podem estar relacionadas com a especiação das
mesmas.
As tribos Heroine, que inclui os acarás-discos, e Cichlasomine são as
linhagens mais recentes da radiação Neotropical e a idade estimada para o
surgimento destes grupos é de 12 milhões de anos, com base na análise de
sequências do gene mitocondrial 16S. A subsequente diversificação dos
heroíneos é estimada como ocorrida em 5,5 milhões de anos, no Mioceno
tardio (Farias et al., 1998). É provável que neste tempo, um ancestral dos
discos tenha sofrido um aumento no número diploide (de 48 para 60), que pode
ter ocorrido por poliploidia (Thompson, 1976) ou por rearranjos cromossômicos
(Mesquita et al., 2008). Contrariando a hipótese de Ready et al. (2006),
acreditamos que Symphysodon discus (discos heckel) seria a espécie mais
antiga na bacia amazônica. S. discus poderi ter hibridizado com um ancestral
das outras espécies de discos, o qual já estaria extinto ou ainda não foi
amostrado, e isto teria ocasionado a movimentação de elementos
transponíveis, causando rearranjos cromossômicos múltiplos (como as
translocações) que levaram à origem da cadeia cromossômica meiótica em
45
indivíduos de uma população que seria ancestral de S. aequifasciatus e S.
haraldi. A diversificação de S. aequifascistus e S. haraldi pode ter ocorrido a 5
ou 3 milhões de anos, quando os arcos do Caravari e Purus se formaram,
respectivamente (Lundberg et al., 1998; Hoorn et al., 1995; Irion et al., 1995)
(Figura 1). Os arcos (Purus ou Caravari), que atualmente encontram-se
subterrâneos, podem ter atuado temporariamente como uma barreira para as
populações ancestrais de indivíduos portadores de cadeia cromossômica
meiótica, o que poderia ter levado a uma diferenciação das espécies, seguida
por uma fragmentação da sua zona de distribuição. Então, posteriormente, S.
aequifasciatus e S. haraldi poderiam ter entrado em contato secundário. A
seleção pode ter favorecido indivíduos que apresentavam a capacidade de
segregar balanceadamente os cromossomos múltiplos, resultando em formas
cariotípicas estáveis.
Os mecanismos que tem atuado durante a evolução cromossômica de
Symphysodon parecem ser complexos e novos estudos, incluindo mapeamento
cromossômico de sequências repetitivas, análises do complexo sinaptonêmico
e amostragem de novas populações são necessárias. Estas informações
poderão contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos
cromossômicos envolvidos no processo de especiação, bem como poderão ser
aplicados em programas de reprodução destes animais com interesse
comercial.
46
III.2.Artigo 2: Análise citogenética comparativa das espécies do gênero Symphysodon (Cichlidae): características cromossômicas de retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal
Comparative cytogenetic analysis of the genus Symphysodon (discus fishes,
Cichlidae): chromosomal characteristics of retrotransposons and minor
ribosomal DNA. Cytogenetic and Genome Research.
Enviado em 13/07/2009. Aceito para publicação em 24/08/09. Primeira revisão
efetuada em 25/08/09.
47
III.2.1. Introdução
A heterocromatina em peixes é rica em sequências repetitivas e estas
tem merecido atenção especial em estudos relativos à estrutura centromérica e
telomérica (Lanfredi et al., 2001; Vicente et al., 2001), origem e evolução de
cromossomos sexuais (Devlin et al., 1998; Stein et al.; 2001; Venere et al.,
2004), cromossomos supranumerários (Mestriner et al., 2000; Jesus et al.,
2003) e evolução dos genomas (Dasilva et al., 2002). Dentre as sequências
repetitivas destacam-se os elementos transponíveis e genes ribossomais. Os
elementos transponíveis são sequências capazes de se integrar em novas
localizações do genoma e mobilizar sequências não-autônomas, sendo que
todos os tipos de transposons e retrotransposons conhecidos são encontrados
em genomas de peixes (Volff et al., 2003; Ozouf-Costaz et al., 2004). Em
contraste com o genoma dos mamíferos, o genoma dos peixes teleósteos
contém múltiplas famílias ativas de elementos móveis, os quais tem atuado na
especiação e viabilidade dos indivíduos (Volff, 2005; Feschotte & Prithman,
2007). De todos os elementos retrotransponíves, Rex abriga várias famílias
abundantes em teleósteos, sendo que o elemento Rex3 tem a maior
distribuição neste grupo, com diferentes padrões de organização no genoma de
cada espécie (Tabela 1). Neste grupo, algumas cópias de Rex3 estão
associadas com regiões codificantes, o que poderia ser um importante fator
para a evolução (Volff et al., 1999; 2001). Outras sequências repetitivas
importantes são os DNAs codificadores de RNAs ribossomais, que podem ser
divididos em duas famílias multigênicas, repetidas em tandem: a primeira
classe, representada pelo DNAr 45S, que compreende as regiões que
transcrevem os genes RNAs 28S, 18S e 5,8S, além de espaçadores
intergênicos; e a segunda classe, DNAr 5S, consiste de uma sequência
altamente conservada de 120 pares de base e espaçadores não transcritos
(NTS) de tamanho variável (Martins, 2007).
Estudos que identificam regiões repetitivas vêm sendo realizados em
ciclídeos africanos, principalmente com diferentes espécies de tilápia (Oliveira
& Wright, 1998; Martins & Wasko, 2004; Ferreira & Martins, 2008). Para os
48
ciclídeos neotropicais este tipo de estudo está apenas começando
(Mazzuchelli & Martins, 2009), frente à grande riqueza de espécies desta
família.
Os acarás-disco constituem um excelente modelo para a realização de
estudos evolutivos. Endêmicas da bacia amazônica, as três espécies
atualmente reconhecidas do gênero Symphysodon (S. aequifasciatus, S. discus
e S. haraldi, Cichlidae, Perciformes) apresentam alto nível de variabilidade
genética associada a diferentes tipos de biótopos, sendo há muito tempo tema
de estudos taxonômicos e filogenéticos, tanto em nível morfológico quanto
molecular, principalmente por tratar-se de espécies amplamente exploradas
como peixes ornamentais (Kullander, 1996; Ready et al., 2006; Bleher et al.,
2007; Amado et al., 2008; Farias & Hrbek, 2008; Silva et al., 2008). Análises
citogenéticas clássicas revelaram que as três espécies de Symphysodon
apresentam o maior número diploide encontrado na família (2n=60), com a
maioria dos cromossomos do tipo meta-submetacêntricos, ausência de
cromossomos sexuais diferenciados e presença de grandes blocos de
heterocromatina constitutiva (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et
al., 2002; Mesquita et al., 2008). Todas estas características são consideradas
derivadas para a família Cichlidae (Feldberg et al., 2003). Além disso, S.
aequifasciatus e S. haraldi apresentam a maior cadeia cromossômica meiótica
descrita para vertebrados, a qual compreende até 20 elementos, em machos e
fêmeas, cuja origem pode estar baseada em uma série de translocações que
envolveram regiões heterocromáticas (Gross et al., 2009).
Visando um melhor entendimento da organização cromossômica e
carioevolução, o presente estudo apresenta o mapeamento físico
cromossômico das sequências repetitivas do retrotransoposon Rex3 e do DNAr
5S nas três espécies selvagens do gênero Symphysodon.
III. 2.2. Material e métodos
Os indivíduos de acarás-disco foram coletados no estado do Amazonas,
Brasil, sob licença do IBAMA (011/2005) e identificados de acordo com as
características propostas mais recentemente para o gênero (Bleher et al.,
49
2007). Foram coletados oito machos e três fêmeas de disco verde (S.
aequifasciatus) provenientes do rio Tefé; 15 machos e três fêmeas de disco
heckel (S. discus) do rio Negro (proximidades de Novo Airão) e 15 machos e
três fêmeas de disco azul/marrom (S. haraldi) do rio Manacapuru. Espécimes
testemunhos foram depositados na coleção de peixes do INPA (INPA 28582,
INPA 28583, INPA 28584) e outros indivíduos estão depositados na coleção de
peixes do Laboratório de Genética Animal do INPA.
Cromossomos mitóticos e meióticos foram obtidos de células renais e
gonadais de machos e fêmeas de S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi,
seguindo os protocolos descritos por Moreira-Filho & Bertollo (1990) e Gross et
al. (2009), respectivamente. O composto farmacêutico Munolan (Allergan
Frumtost) foi usado para estimular a divisão celular mitótica (Molina, 2001). A
heterocromatina foi detectada utilizando o protocolo descrito por Sumner
(1972).
O DNA genômico total foi extraído do músculo de Symphsysodon
aequifasciatus (disco verde), Symphysodon discus (disco heckel) e Symphysodon
haraldi (discos azul/marrom) seguindo o protocolo de fenol-clorofórmio detalhado
em Sambrook & Russell (2001). Para a amplificação por PCR (Polymerase Chain
Reaction) do retrotransposon Rex3 foram utilizados os primers RTX3-F3 (5’-CGG
TGA YAA AGG GCA GCC CTG) e RTX3-R3 (5’-TGG CAG ACN GGG GTG
GTG GT) (Volff et al. 1999, 2001). Para obter unidades repetitivas do DNAr 5S
por PCR foi utilizado o conjunto de primers 5Sa (5’-TAC GCC CGA TCT CGT
CCG ATC) e 5Sb (5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC) (Komiya &
Takemura, 1979). As reações de PCR foram feitas para volume final de 25 μL
(1 μL de DNA genômico -100 ng); 2,5 μL de Tampão 10X com cloreto de
magnésio 1,5 mM; 0,25 μL de Taq DNA Polimerase (5 U/μL); 1,5 μL de dNTP
(1 mM); 1,5 μL de cada primer (5 mM); água milli-Q para completar o volume).
Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas: a) Rex3: 2 minutos a 95
ºC (desnaturação); 35 ciclos de um minuto a 95 ºC, 40 segundos a 55 ºC
(anelamento), 2 minutos a 72 ºC (extensão); 5 minutos a 72 ºC (extensão final).
b) DNAr 5S: 5 minutos a 94 ºC (desnaturação); 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
50
segundos a 59 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC , 30
segundos a 57 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 25 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30
segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC (extensão); 7 minutos a 72 ºC
(extensão final).
Os produtos da PCR foram clonados no plasmídeo pGEM-T e células
competentes de Escherichia coli DH5α foram utilizadas para a transformação.
Dezesseis clones de Rex3 e oito de DNAr 5S foram sequenciados no
sequenciador automático MegaBace 1000 seguindo as instruções do fabricante.
Para as reações de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator
Cycle Sequencing (GE HealthCare). As sequências geradas foram comparadas
com sequências depositadas nos bancos de dados disponíveis na Internet
através do NCBI (National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Depois de conferidas, todas as sequências foram
alinhadas utilizando-se o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson
et al., 1994), que está incluso no BioEdit 7.0 (Hall 1999). O alinhamento gerado
foi manualmente conferido e editado no mesmo programa.
As sondas de Rex3 e do DNAr 5S, obtidas por PCR, foram marcadas com
biotina 14-dATP por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) e as
hibridizações fluorescente in situ homólogas e heterólogas foram realizadas de
acordo com o protocolo descrito por Pinkel et al. (1986) e Martins & Galetti Jr.
(2001), com modificações. O DNA cromossômico mitótico foi desnaturado por 10
segundos em formamida 70% em 2xSSC a 67 ºC e o meiótico por 15 segundos.
A solução de hibridização (100 ng de sonda desnaturada, 10 mg/mL de sulfato de
dextrano, 2xSSC e formamida 50% em um volume final de 30 μl) foi colocada
sobre a lâmina e a hibridização ocorreu a 37 ºC, overnight (cerca de 12 horas),
em câmara úmida (2xSSC). A lavagem pós-hibridização ocorreu a 72 ºC em
2xSSC, pH 7,0 por 5 minutos. Em seguida as lâminas foram imersas em tampão
PBD (20 mL de 20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em pó desnatado; água
destilada, volume final 100 mL, pH 7,0). A detecção das sondas foi feita por meio
de FITC-Avidina conjugada (Sigma) em tampão C (0,1M bicarbonato de sódio,
0,15M de cloreto de sódio) por 30 minutos. As lâminas foram lavadas 3 vezes em
tampão PBD a 45 ºC, por 2 minutos cada. Em seguida, duas séries de
51
amplificação de sinal foram efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em
tampão PBD (2 μl de anti-avidina em 38 μl de PBD), sendo as lâminas incubadas
por 5 minutos em câmara úmida a 37 oC. Cada tratamento com antiavidina-
biotina conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em
Tampão C, com incubação por 8 minutos em câmara úmida a 37 ºC. Depois de
cada passo de amplificação, as lâminas foram lavadas três vezes em tampão
PBD a 45 oC por 2 minutos. Os cromossomos foram contracorados com iodeto de
propídeo 0,2% diluído em antifade (Vector). Adicionalmente, as sondas de Rex3
foram marcadas por nick translation usando digoxigenina (Roche) e usadas em
hibridizações duplas com o DNAr 5S, sendo os cromossomos contra-corados
com DAPI. Cromossomos hibridizadors foram analisados usando microscópio
Olympus BX61 e as imagens foram capturadas com câmera digital Olymphys
DP71, com o programa Image-Pro MC 6.0. As metáfases mitóticas foram
processadas no programa Adobe Photoshop CS3, sendo os cromossomos
medidos no programa livre Image J. A montagem dos cariótipos foi feita de
acordo com Thompson (1979) e Mesquita et al. (2008).
III.2.3. Resultados
A amplificação com os primers para Rex3 resultou em um fragmento de
aproximadamente 460 pb que foi clonado e sequenciado para as três espécies
de Symphysodon (Figura 1a). As sequências foram comparadas com outras
disponíveis nos bancos de dados do NCBI e apresentaram alta similaridade
com elementos Rex3 identificados em outras espécies de peixes, incluindo
algumas espécies de ciclídeos como Cichlasoma labridens (95%) e
Oreochromis niloticus (87%), e com peixes considerados modelos genéticos
como, Danio rerio (78%).
Já a amplificação com os primers para DNAr 5S resultou em um
fragmento de 700 pb, incluindo NTS, para as três espécies de Symphysodon
(Figura 1b), as quais apresentaram 100% de similaridade a segmentos
correspontes à região codificante do RNAr 5S de Leporinus spp.
52
A análise cariotípica das três espécies de Symphysodon revelou a
presença de 2n=60 cromossomos, ausência de cromossomos sexuais
diferenciados e de polimorfismo cromossômico populacional, sendo que S.
aequifasciatus apresentou fórmula cariotípica igual a 50m-sm+6st-a+4mi, S.
discus 50m-sm+10st-a e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi (Figura 2).
A heterocromatina foi evidenciada na região pericentromérica da maioria
dos cromossomos mitóticos das três espécies (Figura 2). Porém, em alguns
pares, a heterocromatina constitutiva ocupou braços cromossômicos inteiros,
tais como, braço curto dos cromossomos dos pares 5, 6, 7, 9, 10, 12, 14, 16,
17, 18 em S. aequifasciatus (Figura 2a); 4, 8, 9, 10, 12 a 15, 18, 20, 22 e 23 de
S. discus (Figura 2b); 11, 15 a 20 de S. haraldi (Figura 2c). Ainda, em S.
aequifasciatus foi evidenciada, em um dos homólogos do primeiro par
cromossômico, uma marcação heterocromática instersticial no braço longo
(Figura 2a) e em S. haraldi os pares 23 e 29 são totalmente heterocromáticos
(Figura 2c).
53
Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe
(1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers Rex3
(a) e DNAr 5S (b) para as três espécies de Symphysodon (1 – S.
aequifasciatus; 2 – S. discus; 3 – S. haraldi).
54
Figura 2 – Cariótipos de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b) e S.
haraldi (c) submetidos a bandeamento C (barra de escala: 10 μm).
55
As hibridizações homólogas (sondas de DNA da mesma espécie) e
heterólogas (sonda de uma espécie hibridizada em cromossomo de outra)
apresentaram resultados similares, tanto para Rex3 quanto para 5S. Com
relação à localização do elemento Rex3, as três espécies apresentaram um
padrão de distribuição compartimentalizado em alguns cromossomos, com
sinais de hibridização fracos na região centromérica da maioria dos
cromossomos (Figura 3), tanto em machos como em fêmeas, mas que são
bem visíveis nas metáfases espermatogoniais (Figura 3d). Na análise dos
cromossomos mitóticos estas marcações mais conspícuas foram evidenciadas
em regiões pericentroméricas e invadindo braços curtos dos pares
cromossômicos, sendo que S. aequifasciatus apresentou 12 marcas
moderadamente acentuadas (região pericentromérica invadindo os braços
curtos dos cromossomos dos pares 7, 9, 10, 13, 15 e 16) (Figura 3a), 18 sinais
bem evidentes em S. discus (região pericentromérica dos pares 19, 21 e 25, e
invadindo braços curtos dos pares 14, 18, 20, 23, 26 e 27) (Figura 3b) e 24
sítios tênues em S. haraldi (região centromérica dos cromossomos 5, 8, 14, 16,
17 e invadindo braços curtos dos cromossomos 6, 9, 10, 18, 19, 22, 29) (Figura
3c). Em células diplotênicas e em diacinese das três espécies, a maioria dos
bivalentes apresentou duas marcações conspícuas, as quais provavelmente
estão localizadas em regiões pericentroméricas (Figura 3f). Entretanto, em S.
aequifasciatus (Figura 3e) e S. haraldi (Figura 3g), um número variável de sítios
fluorescentes foram evidenciados na cadeia cromossômica.
56
Figura 3 – Localização física cromossômica do retrotransposon Rex3 (sítios amarelos) nos cariótipos e células meióticas testiculares de Symphysodon aequifasciatus (a, d, e), S. discus (b, f) e S. haraldi (c, g). a-c) Cariótipos. d) Metáfase espermatogonial revelando marcações pericentroméricas de Rex3 em todos os cromossomos (seta); e-g) Diplóteno revelando sequências de Rex3 na cadeia cromossômica (seta) e em bivalentes (cabeça de seta) (barra 10 μm).
57
Com relação à localização física cromossômica do DNAr 5S, apenas
um par de cromossomos marcados foi evidenciado nas três espécies. Nos
cromossomos mitóticos o DNAr 5S foi identificado na região sub-terminal dos
braços curtos dos cromossomos do par 10 em S. aequifasciatus (Figura 4a),
enquanto que em S. discus (Figura 4b) e S. haraldi (Figura 4c) este sítio foi
evidenciado na região sub-terminal do braço curto dos cromossomos do par 18.
Nos cromossomos meióticos das três espécies os sítios de DNAr 5S foram
localizados em bivalentes típicos e não estão envolvidos com a cadeia
cromossômica (Figura 4d, e, f). A FISH dupla revelou que os elementos Rex3
estão flanqueando os genes RNAr 5S nas três espécies (Figura 4g).
58
Figura 4 – Localização física cromossômica do DNAr 5S (sírios amarelos) nos cariótipos e células testiculares meióticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. discus (b, e) e S. haraldi (c, f). a-c) Cariótipos. d-f) Diplóteno revelando sítios de DNAr 5S em bivalentes (seta). g) Metáfase de Symphysodon aequifasciatus mostrando as sequências de Rex3 (sítios róseos) flanqueando os genes RNAr 5S (sítios verdes). O mesmo padrão foi encontrado em S. discus e S. haraldi (barra: 10 μm).
59
III.2.4. Discussão
Os elementos Rex3 podem ter apresentado um papel importante durante
a evolução dos ciclídeos neotropicais, incluindo as espécies de Symphysodon.
De acordo com árvores filogenéticas (Kullander, 1998; Farias et al., 2001;
Smith et al., 2008), Astronotus ocellatus é uma das espécies consideradas
basais para os ciclídeos neotropicais e esta apresenta pequenos blocos de
heterocromatina constitutiva restritos às regiões pericentroméricas de todos os
cromossomos, sendo que os elementos repetitivos AoRex3 (retroelemento da
família Rex3 isolado com enzimas de restrição de Astronotus ocellatus) estão,
preferencialmente, localizados nestas regiões (Mazzuchelli & Martins, 2009).
Symphysodon é um gênero considerado derivado dentre os ciclídeos e as suas
espécies apresentam grande quantidade de heterocromatina constitutiva nas
regiões pericentroméricas de quase todos os cromossomos, sendo que em
alguns pares os blocos heterocromáticos invadem a região proximal dos braços
curtos e longos (Takai et al., 2002; Mesquita et al. 2008; presente trabalho).
Todas as hibridizações in situ usando sondas específicas de Rex3 resultaram
em sinais fluorescentes co-localizados com heterocromatina (Figura 5a, b, c),
entretanto S. haraldi apresentou sinais tênues quando comparado com as
outras espécies do gênero. Análises da distribuição do Rex3 em cromossomos
meióticos nas espécies de Symphysodon corroboram os dados mitóticos com
relação à localização preferencial destas sequências na heterocromatina,
porém os sinais são mais evidentes em células testiculares. Banda C em
células diplotênicas de S. aequifasciatus e S. haraldi indicaram que a maioria
dos bivalentes apresenta dois blocos heterocromáticos, os quais
provavelmente estão localizados em regiões pericentroméricas, e um número
variável de blocos heterocromáticos na figura meiótica multivalente (Gross et
al., 2009). Um padrão similar foi encontrado na FISH utilizando as sondas de
Rex3, o que sugere o envolvimento destas sequências nos rearranjos
cromossômicos que originaram esta figura meiótica. Interessantemente,
estudos envolvendo localização física cromossômica dos elementos
retrotransponíveis Rex3 tem revelado diferentes padrões de distribuição para
as espécies das ordens Perciformes e Tetraodontiformes (Tabela 1), sendo que
60
a maioria delas tem apresentado o Rex3 disperso uniformemente pelo
genoma e não relacionados à heterocromatina. Integração preferencial em
região heterocromática foi observada em Notothenia coriiceps, que apresenta o
cariótipo mais derivado dentre os Perciformes marinhos já analisados, cuja
distribuição é mais compartimentalizada, com acúmulo nas regiões
pericentroméricas, sugerindo uma correlação entre rearranjos cariotípicos e
atividade deste retrotransposon (Ozouf-Costaz et al., 2004).
Entretanto, em Symphysodon muitas regiões heterocromáticas não
apresentaram sinais de hibridização da sonda Rex3, como a marcação
instersticial heterocromática presente em apenas um dos homólogos do
primeiro par de S. aequifasciatus, os cromossomos heterocromáticos (par 23)
de S. haraldi e muitos braços curtos das três espécies, mostrando que as
espécies de Symphysodon permanecem com muitas sequências
heterocromáticas não conhecidas.
A heterocromatina é atualmente reconhecida como uma parte importante
do genoma dos eucariotos, cujas funções incluem segregação cromossômica,
organização nuclear e regulação da expressão gênica, e também pode afetar o
processo de recombinação gênica (Grewal & Jia, 2007; Skipper, 2007; Bühler,
2009). Entretanto, evidências mostram que esta região pode ter funções
adicionais, incluindo a regulação da mitose, progressão do ciclo celular e
proliferação das células, assim como pode estar associada com respostas a
muitas formas de estresses exógenos, como trocas de temperatura, choques
térmicos e hipóxia (Burt & Trivers, 2006; Varriale et al., 2008). Desta forma, as
diferenças encontradas no padrão heterocromático e na
quantidade/intensidade de sinais de Rex3 nos cariótipos das espécies
selvagens de Symphysodon podem estar correlacionadas e/ou refletindo uma
adaptação ao ambiente em que vivem? Esta é uma questão que merece uma
atenção especial, uma vez que os rios amazônicos apresentam grande
heterogeneidade quanto aos padrões físico-químicos desde a origem da bacia
amazônica, sendo isto reconhecido facilmente pelas diferentes colorações de
água (Tabela 2). Os rios amazônicos são classificados em rios de águas
brancas, com coloração barrenta, que possuem grande quantidade de
61
sedimentos em suspensão; rios de águas claras com pouco material em
suspensão; e rios de águas pretas, coloração esta originada da decomposição
parcial de material orgânico proveniente da floresta (Sioli, 1990; Santos &
Ferreira, 1999). Estas características geológicas e os parâmetros físico-
químicos das águas afetam diretamente a distribuição dos acarás-disco na
bacia amazônica (Bleher, 2006, Ready et al., 2007, Bleher et al., 2007, Farias &
Hrbek, 2008). Os discos marrom/azul (S. haraldi) apresentam maior distribuição
na bacia amazônica, sendo encontrados em tributários ao longo do eixo
Amazonas-Solimões (Bleher, 2006, Bleher et al., 2007). Os discos verdes e
heckel apresentam distribuição mais restrita, sendo os verdes encontrados na
porção mais a oeste da bacia amazônica (região de Tefé, Juruá e Jutaí) e os
heckel nos rios Negro, Abacaxis e Nhamundá (Ready et al., 2006; Bleher et al.,
2007). Como cada uma das espécies de disco está relacionada a um ambiente
amazônico e diferentes números de sinais conspícuos de Rex3 são
encontrados nas espécies de Symphysodon, acreditamos que processos
fisiológicos (incluindo a expressão de genes) podem estar envolvidos com a
distribuição dos elementos móveis, uma vez que os transposons e
retrotransposons podem controlar genes epigeneticamente, quando inseridos
nos genes ou próximos a eles, causando silenciamento gênico pela indução da
metilação do DNA (Volff, 2005). Talvez este seja um dos motivos da existência
de diferentes padrões de heterocromatina constitutiva e níveis de intensidade
de sinais de Rex3, os quais são encontrados atualmente nas três espécies de
Symphysodon.
62
Tabela 1 – Padrão de dispersão cromossômica dos elementos Rex3 em diferentes espécies de
peixes.
Espécie (Ordem) Padrão de dispersão Referência
Artedidraco shackletoni (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Astronotus ocellatus* (Perciformes) Compartimentalizado Mazzuchelli & Martins, 2009Bovichtus angustifrons (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Chionodraco hamatus (Perciformes) Compartimentalizado Ozouf-Costaz et al., 2004 Dissostichus mawsoni (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Gymnodraco acuticeps (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Gymnodraco victori (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Neopagetopsis ionah (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al. 2004 Notothenia coriiceps (Perciformes) Compartimentalizado Ozouf-Costaz et al., 2004 Patagonotothen tesselata (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Symphysodon aequifascistus (Perciformes) Compartimentalizado Presente trabalho Symphysodon discus (Perciformes) Compartimentalizado Presente trabalho Symphysodon haraldi (Perciformes) Compartimentalizado Presente trabalho Tetraodon nigroviridis (Tetraodontiformes) Compartimentalizado Fisher et al., 2004 Trematomus hansoni (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Trematomus newnesi (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Trematomus bernacchii (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Trematomus pennellii (Perciformes) Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004
* sonda utilizada para hibridização foi AoRex3
Tabela 2: Parâmetros físico-químicos medidos nos hábitats dos acarás-disco, a 1,5m de profundidade (Bleher, 2006).
Disco heckel Disco verde Disco marrom/azul Coloração da água Preta Preta Clara ou misturada Temperatura média da água 28,6 28,2 28,8 pH médio 4,78 5,42 6,14 Condutividade elétrica média 9,2 μS/cm 10,5 μS/cm 31,4 μS/cm
63
Figura 5 – Idiograma comparativo de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b), S. haraldi (c); em preto a heterocromatina
centromérica/pericentromérica com tênues marcações fluorescentes de Rex3, claramente visualizada na maioria dos
cromossomos; em amarelo, marcações conspícuas mais acentuadas de Rex 3; em vermelho, os genes RNAr 5S co-localizados
com heterocromatina; em rosa, sequências desconhecidas de heterocromatina.
64
A presença de elementos transponíveis também pode estar atuando na
variabilidade genética, verificada tanto em nível molecular (Ready et al., 2006,
Bleher et al., 2007, Farias & Hrbek, 2008) quanto citogenético (Mesquita et al.,
2008), assim como na variabilidade fenotípica visualizada tanto em ambiente
natural quanto em indivíduos reproduzidos em cativeiro (Bleher & Göbel, 1992).
Além disso, a presença de grandes sinais de elementos repetitivos também
explica o aumento do genoma dos Symphysodon quando comparado a outros
ciclídeos neotropicais, aumento este que havia sido explicado por Thompson
(1976) como sendo resultado de uma poliploidização. Outro fato que reforça a
evidência da participação de Rex3 na carioevolução dos acarás-disco é a sua
presença na cadeia cromossômica meiótica de S. aequifasciatus e de S.
haraldi. Isto corrobora a hipótese de Gross et al. (2009), que sugere o
envolvimento de elementos transponíveis na origem da cadeia cromossômica.
Com relação à localização física cromossômica do gene de RNAr 5S, o
mapeamento destas sequências em diversas espécies de peixes tem
evidenciado esses sítios comumente localizados nos segmentos intersticiais
dos cromossomos (revisado por Martins & Wasko, 2004; Ferreira et al., 2007;
Nakayama et al., 2008) e esse mesmo padrão também foi observado para
mamíferos (Frederiksen et al., 1997) e anfíbios (Schmid et al., 1987; Lucchini et
al., 1993). Tal padrão de localização cromossômica parece corresponder a uma
condição ancestral, especialmente para peixes, sendo que esta posição
resultaria em uma proteção destas sequências contra transposições e eventos
de permuta (Martins & Galetti Jr., 1999). Translocações e permutas envolvendo
regiões terminais são mais comuns em espécies que apresentam a
configuração Rabl durante a divisão celular, quando os cromossomos
permanecem próximos uns dos outros no núcleo durante a intérfase, com os
centrômeros direcionados para um pólo e os telômeros para o outro (Schweizer
& Loidl, 1987; Sumner, 2003). Este é o caso das três espécies de
Symphysodon. Embora eles tenham somente um par cromossômico marcado
com a sonda DNAr 5S na região terminal do braço curto, os pares marcados
não são os mesmos. Sítios de DNAr 5S em S. aequifasciatus são encontrados
nos cromossomos do par 10, enquanto em S. discus e S. haraldi estão
65
localizados nos cromossomos do par 18, onde o gene RNAr 5S é co-
localizado com heterocromatina e flanqueado por elementos Rex3 nas três
espécies (Figura 5 a, b, c). Como elementos transponíveis podem servir como
substrato para recombinação de DNA devido sua natureza repetitiva,
especialmente durante a configuração Rabl (Kidwell & Lisch, 1997; Kazazian &
Moran, 1998; Rouzic & Capy, 2005), isto pode ter facilitado os rearranjos
cromossômicos que causaram diferenças na posição do DNAr 5S entre S.
aequifasciatus e S. discus/S. haraldi. Em plantas, a associação de locus de
DNAr com regiões de heterocromatina tem sido extensivamente documentada
(Siljak et al., 2002) e os elementos transponíveis detectados na
heterocromatina centromérica e nas regiões organizadoras nucleolares
parecem afetar a mobilidade, evolução e expressão dos genes ribossomais,
como sugerido para arroz e tabaco (Dong et al., 1998; Franz et al., 2000).
Apesar da evidência de translocações envolvendo os cromossomos
portadores dos sítios DNAr 5S, os dados obtidos com estas sondas de DNAr
sugerem que os cromossomos dos pares 10 e 18 não estão envolvidos na
formação da figura meiótica multivalente de S. aequifasciatus e S. haraldi,
respectivamente. Porém, existe uma possível correlação entre aumento da
heterocromatina, rearranjos cariotípicos e atividade dos retrotransposons Rex3,
onde o acúmulo e atividade dos elementos móveis estariam facilitando as
translocações múltiplas e seriadas que originaram esta cadeia cromossômica
meiótica.
Embora os elementos repetitivos de DNA tenham sido considerados, por
muitas décadas, “DNA lixo” por não se saber ao certo a sua função (Doolittle &
Sapienza, 1980; Orgel & Crick, 1980), ao longo dos últimos anos esta opinião
mudou devido aos dados acumulados sobre origem e divergência taxonômica
dos eucariotos (Bonaccorsi & Lohe, 1991; Dong et al., 1998; Feschotte &
Prithman, 2007). Dados recentes tem apoiado um papel importante do DNA
repetitivo na evolução estrutural e funcional de genes e genomas em uma
variedade de organismos (Biémont & Vieira, 2006). Embora mecanismos
evolutivos tenham impedido grandes mudanças cariotípicas nas diferentes
espécies e populações de Symphysodon, seus genomas estão em evolução
66
contínua, demonstrado aqui pelas variações cromossômicas observadas. A
fração repetitiva do genoma (exemplificada pelo DNAr 5S e Rex 3) pode
escapar da pressão seletiva que atua no segmento não-repetitivo,
representando assim bons marcadores para detectar acontecimentos
evolutivos. Além disso, o acúmulo de sequências repetitivas em áreas
específicas no genoma pode causar rearranjos cromossômicos por meio de
quebra, deleções, inversões e duplicações (Lim & Simmons, 1994; Dimitri et al.,
1997). Considerando o acúmulo de heterocromatina e sequências de DNA
repetitivo em Symphysodon, quando comparado com outros ciclídeos, o gênero
representa um interessante modelo para investigar o papel do DNA repetitivo
na evolução cromossômica. Desta forma, a análise de outras famílias de DNA
repetitivo e o número de cópias destas sequências no genoma dos acarás-
disco, e também de outras espécies amazônicas, irá contribuir grandemente
para a compreensão dos mecanismos evolutivos envolvidos na geração da
complexa estrutura genômica destes organismos, além de melhor elucidar a
hipótese da correlação entre acúmulo diferencial de elementos repetitivos e
adaptação dos peixes aos diferentes ambientes aquáticos amazônicos.
67
III.3.Capítulo 3: Variabilidade intra e interespecífica do locus do DNAr 18S entre acarás-disco Symphysodon: rearranjos cromossômicos
Variability inter and intraspecific of 18S rDNA locus among Symphysodon
fishes: chromosomal rearrangements. Journal Fish Biology.
Enviado 09/06/2009. Aceito para publicação em 10/08/2009. Primeira revisão
efetuada em 20/08/2009.
68
III.3.1. Introdução
O RNA ribossomal (rRNA) é o mais abundante na célula e constitui
aproximadamente 80% do RNA total de células em divisão. As moléculas de
RNA são componentes estruturais dos ribossomos e estão envolvidas em
atividades catalíticas, organizacionais e de regulação de síntese protéica em
todas as células (Doudna & Rath, 2002). Estes genes são divididos em duas
famílias multigênicas repetidas em tandem, as quais estão situadas em
arranjos independentes e, em peixes, normalmente localizam-se em ambientes
cromossômicos distintos (Galetti Jr. & Martins, 2004; Martins, 2007). A primeira
classe é formada pelo DNAr 5S, que codifica o RNAr 5S, sintetizado pela RNA
Polimerase III (Doudna & Rath, 2002; Hernandez-Verdun et al., 2002). A
segunda classe é representada pelo DNAr 45S, que codifica os RNAs
ribossomais ribossomais 18S, 5.8S e 28S, sintetizados pela RNA Polimerase I,
e um espaçador intergênico não transcrito (IGS) (Doudna & Rath, 2002;
Hernandez-Verdun et al., 2002; Boisvert et al., 2007). Múltiplas cópias desta
segunda classe (DNAr 45S) correspondem às regiões organizadoras de
nucléolo (RONs), as quais são positivas para impregnação com íon prata,
quando ativas (Howell & Black, 1980; Boisvert et al., 2007).
Os ciclídeos tem despertado interesse científico devido sua rápida
radiação adaptativa, a qual tem levado a uma extensa diversidade ecológica, e
também graças à sua grande importância na aquicultura tropical e subtropical
(Kornfield et al., 1979; 1984; Stiassny, 1991; Feldberg et al., 2003; Kullander,
2003; Martins et al., 2004; Smith et al., 2008, entre outros). Apesar da
diversidade ecológica e morfológica dos ciclídeos, a maior parte das
informações genéticas/genômicas baseia-se em informações cariotípicas,
sendo evidente uma distribuição bimodal de números diploides relacionados à
distribuição geográfica das espécies, onde espécies africanas apresentam
2n=44 cromossomos, enquanto que número diploide modal igual a 48 é
encontrado nas espéces neotropicais (Feldberg et al., 2003). Com relação aos
ciclídeos neotropicais, os acarás-disco, gênero Symphysodon, são o grupo
mais intrigante e distinto devido à sua morfologia, padrões de coloração (Ready
69
et al.¸ 2006) e características cromossômicas (Thompson, 1979; Feldberg et
al., 2003; Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009), sendo considerado o
gênero mais derivado dentre os ciclídeos (Kullander, 1998; Farias et al., 2001;
Smith et al., 2008). Dados acumulados nas últimas décadas indicam que as
espécies de Symphysodon apresentam o maior número diploide (2n=60
cromossomos) de todos os ciclídeos (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979;
Takai et al., 2002), sugerindo a ocorrência de rearranjos cromossômicos
durante sua história evolutiva (Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009).
Em várias espécies da família Cichlidae, sistemas simples de regiões
organizadoras de nucléolo e marcações presentes nos maiores cromossomos
do complemento são consideradas características plesiomórficas (Feldberg et
al., 2003). Para o peixe ornamental acará-disco impregnações do íon prata em
cromossomos mitóticos das espécies S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi
tem mostrado uma grande variabilidade no número de marcações de regiões
organizadoras de nucléolo, tanto intra quanto interespecificamente (Mesquita et
al., 2008). Além disso, estudos dos cromossomos meióticos de S. haraldi tem
evidenciado sítios ribossomais na cadeia cromossômica meiótica diplotênica,
sugerindo o envolvimento destas sequências em rearranjos cromossômicos
que originaram esta figura meiótica (Gross et al., 2009).
Considerando a variabilidade da Ag-RON nas três espécies do gênero
Symphysodon, o objetivo deste trabalho foi investigar a distribuição das
sequências de DNA ribossomal 18S, verificando se estas coincidem com as
marcações da Ag-RON nos cromossomos mitóticos das três espécies.
III.3.2. Material e métodos
Os indivíduos foram coletados no estado do Amazonas, Brasil, sob
licença do IBAMA (011/2005) e identificados de acordo com as características
propostas mais recentemente para o gênero (Bleher et al., 2007). Foram
analisados oito machos e oito fêmeas de disco verde (S. aequifasciatus)
provenientes do rio Tefé; 15 machos e 14 fêmeas de disco heckel (S. discus)
do rio Negro (proximidades de Novo Airão) e 15 machos e 15 fêmeas de disco
azul/marrom (S. haraldi) do rio Manacapuru. Espécimes testemunho foram
depositados na coleção de peixes do INPA (INPA 28582, INPA 28583, INPA
70
28584) e outros indivíduos estão depositados na coleção de peixes do
Laboratório de Genética Animal do INPA.
O DNA genômico total foi extraído do músculo de Symphysodon
aequifasciatus (disco verde), Symphysodon discus (disco heckel) e Symphysodon
haraldi (discos azul/marrom) seguindo o protocolo de fenol-clorofórmio detalhado
em Sambrook & Russell (2001). Para a amplificação por PCR (Polymerase Chain
Reaction) do gene rRNA 18S foram utilizados os primers 18Sf (5’CCG CTT TGG
TGA CTC TTG AT) e 18Sr (5’CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA) desenhados a
partir da sequência completa do gene RNAr 18S de Ictalurus punctatus
disponível nos bancos de dados do NCBI (National Center for Biotechnology
Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (código identificador da sequência
AF021880). As reações de PCR foram feitas para volume final de 25 μL (1 μL
de DNA genômico -100 ng); 2,5 μL de Tampão 10X com cloreto de magnésio
1,5 mM; 0,25 μL de Taq DNA Polimerase (5 U/μL); 1,5 μL de dNTP (1 mM); 1,5
μL de cada primer (5 mM); água milli-Q para completar o volume. Os ciclos de
amplificação seguiram as seguintes etapas: 2 minutos a 95 oC; 35 ciclos de um
minuto a 95 oC (desnaturação), 30 segundos a 55 oC (anelamento), 1 minuto e
40 segundos a 72 oC (extensão); 7 minutos a 72 oC (extensão final).
III.3.2.2.2. Sequenciamento Os produtos da PCR foram sequenciados no sequenciador automático
MegaBace 1000 seguindo as instruções do fabricante. Para as reações de
sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing
(GE HealthCare). As sequências geradas foram comparadas com sequências
depositadas nos bancos de dados do NCBI. Depois de conferidas, todas as
sequências foram alinhadas, utilizando o programa de alinhamento múltiplo
Clustal W (Thompson et al. 1994), que está incluso no BioEdit 7.0 (Hall 1999). O
alinhamento gerado foi conferido manualmente e editado no mesmo programa.
III.3.2.2.3. Obtenção de cromossomos e detecção da região organizadora de nucléolo
71
Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células renais de S.
aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, seguindo protocolos descritos por
Moreira-Filho & Bertollo (1990). Para estimular a divisão celular mitótica foi
utilizado o composto farmacêutico Munolan (Allergan Frumtost), conforme
técnica descrita por Molina (2001). As preparações cromossômicas foram
coradas com solução de Giemsa 5% por 10 minutos. As regiões organizadoras
de nucléolo foram detectadas pela técnica de Howell & Black (1980).
III.3.2.2.4. Hibridização fluorescente in situ em cromossomos mitóticos Os produtos da PCR foram marcados por biotina 14-dATP por nick
translation (Bionick labeling system-Invitrogen) e as hibridizações fluorescente in
situ homólogas e heterólogas foram realizadas de acordo com o protocolo
descrito por Pinkel et al. (1986) e Martins & Galetti Jr. (2001), com modificações.
O DNA cromossômico mitótico foi desnaturado por 10 segundos em formamida
70% em 2xSSC (17,53 g de cloreto de sódio 0,29M, 8,82 g de citrato de sódio,
água destilada para volume final de 1000 mL, pH 7,0) a 67 oC. A solução de
hibridização (100 ng de sonda desnaturada, 10 mg/mL de sulfato de dextrano,
2xSSC e formamida 50% em um volume final de 30 μl) foi colocada sobre a
lâmina e a hibridização ocorreu a 37 oC, overnight (12 horas), em câmara úmida
(2xSSC). A lavagem pós-hibridização ocorreu a 72 oC em 2xSSC, pH 7,0 por 5
minutos. Em seguida as lâminas foram imersas em tampão PBD (20 mL de
20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em pó desnatado; água destilada, volume
final 100 mL, pH 7,0). A detecção das sondas foi feita por meio de FITC-Avidina
conjugada (Sigma) em tampão C (Coupling Buffer: 0,1M bicarbonato de sódio,
0,15M de cloreto de sódio) por 30 minutos. As lâminas foram lavadas três vezes
em tampão PBD a 45 oC , por 2 minutos cada. Em seguida, duas séries de
amplificação de sinal foram efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em
tampão PBD (2 μl de anti-avidina em 38 μl PBD), sendo as lâminas incubadas por
5 minutos em câmara úmida a 37 oC. Cada tratamento com antiavidina-biotina
conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em Tampão
C, com incubação por 8 minutos em câmara úmida a 37 oC. Depois de cada
passo de amplificação, as lâminas foram lavadas três vezes em tampão PBD a
72
45 oC por 2 minutos. Os cromossomos foram contracorados com iodeto de
propídeo 0,2% diluído em antifade (VectaShield-Vector).
Cromossomos hibridados foram analisados usando o microscópio
Olympus BX 61 e as imagens capturadas com câmera digital Olympus DP71,
com o programa Image-Pro MC 6.0.
As metáfases mitóticas foram processadas no programa Adobe Photoshop
CS3, sendo os cromossomos medidos no programa livre Image J. A montagem
dos cariótipos foi feita de acordo com Thompson (1979) e Mesquita et al. (2008).
III.3.3. Resultados
A amplificação da unidade ribossomal 18S (família 45S) resultou em um
fragmento de aproximadamente 1400 pb para as três espécies de
Symphysodon (Figura 1), cuja sequência apresentou alta similaridade com
DNAr 18S de outras espécies de peixes, incluindo o ciclídeo Oreochromis
esculentus (99%) e o peixe considerado modelo genético Oryzias latipes
(97%), as quais estão depositadas nos bancos de dados do NCBI.
73
Figura 1 –Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe
(1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers DNAr
18S para as três espécies de Symphysodon (1 – S. aequifasciatus; 2 – S.
discus; 3 – S. haraldi).
74
As três espécies de Symphysodon apresentaram 2n=60 cromossomos
e ausência de cromossomos sexuais diferenciados, sendo que S.
aequifasciatus mostrou 50m-sm+6st-a+4mi (Figura 2a), S. discus 50m-
sm+10st-a (Figura 2b) e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi (Figura 2c).
A análise de células mitóticas submetidas à impregnação pelo íon prata
evidenciou um sistema de RON múltipla nas três espécies de Symphysodon e
variação intraindividual, bem como intra e interespecífica. Em S. aequifasciatus
as RONs estiveram localizadas na região terminal dos braços longos dos
cromossomos do par 1 e ocupando todo o braço curto dos cromossomos dos
pares 3 e 8 (Figura 2d); em S. discus as RONs foram detectadas sobre a
região terminal do braço curto dos pares 17 e 23 (Figura 2e) e em S. haraldi
sobre o braço curto dos cromossomos 4, 6, 11 e 21 (Figura 2f). Todas as
combinações possíveis, envolvendo estes pares cromossômicos, foram
encontradas, estando as RONs ativas em cromossomos homólogos ou não,
porém nunca mais que duas marcações por célula metafásica foram
evidenciadas.
75
Figura 2 – Cariótipos em coloração convencional (a, b, c) e regiões
organizadoras de nucléolo reveladas por impregnação com nitrato de prata,
indicando todos os pares envolvidos (d, e, f) nas espécies Symphysodon
aequifasciatus (a, d), Symphysodon discus (b, e) and Symphysodon haraldi (c,
f). Somente um dos homólogos está representado porque todas as
combinações de Ag-RON envolvendo estes pares cromossômicos foram
encontradas (barra = 10 μm).
76
Com relação aos sítios ribossomais DNAr 18S, as três espécies de
Symphysodon apresentaram variabilidade intra e interespecífica quanto à
distribuição destas sequências nos cromossomos mitóticos, porém variação
intraindividual não foi observada. Em S. aequifasciatus foram evidenciados dois
a três sítios do gene RNAr 18S, os quais apresentaram três padrões de
distribuição cariotípica, envolvendo regiões terminais dos braços curtos de: (1)
ambos os homólogos do par 8 (2 sítios – Figura 3a), com heteromorfismo de
tamanho; (2) um dos homólogos dos pares 3 e 19 (2 sítios – Figura 3b); (3) um
dos homólogos dos pares 3, 8 e 19 (3 sítios – Figura 3c).
Em S. discus foram evidenciados de dois a cinco sítios do gene RNAr
18S, os quais apresentaram quatro padrões de distribuição cariotípica, sempre
envolvendo regiões terminais dos braços curtos de: (1) um dos homólogos do
par 6 e ambos os homólogos dos pares 17 e 23 (5 sítios – Figura 3d); (2)
ambos os homólogos dos pares 17 e 23 (4 sítios – Figura 3e); (3) um homólogo
do par 17 e ambos os homólogos do par 23 (3 sítios – Figura 3f); (4) um dos
homólogos do par 6 e 17 (2 sítios – Figura 3g).
Em S. haraldi foram evidenciados de dois a três sítios do gene RNAr
18S, os quais apresentaram quatro padrões de distribuição cariotípica,
envolvendo tanto marcas na região terminal dos pares cromossômicos 4 e 6
quanto intersticiais dos pares 1 e 28: (1) ambos os homólogos do par 4 (2 sítios
– Figura 3h); (2) um homólogo dos pares 4 e 6 (2 sítios – Figura 3i); (3) um
homólogo dos pares 4, 6 e 28 (3 sítios – Figura 3j); (4) um dos homólogo dos
pares 1, 4 e 6 (3 sítios – Figura 3k). A frequência dos diferentes padrões de
distribuição do sítio DNAr 18S foi similar dentro de cada espécie, mas em S.
aequifasciatus e S. haraldi um padrão preferencial foi encontrado (Tabela 1).
77
Figura 3 – Padrões de distribuição dos sítios de DNAr 18S (sinais amarelos)
em cromossomos mitóticos de Symphysodon aequifasciatus (a-c); S. discus (d-
g); S. haraldi (h-k). Cariótipos (a, d, h) e em destaque (b, c, e, f, g, i, j, k) os
padrões variantes dos sítios ribossomais DNAr 18S para cada espécie (barra =
10 μm).
78
Tabela 1 – Pares cromossômicos de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi mostrando os diferentes padrões (coluna)
de distribuição do DNAr 18S (A, B – homólogos) e a frequência de cada padrão por espécie.
S. aequifasciatus S. discus S. haraldi Padrão Padrão Padrão
Pares cromossômicos 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 4
1A - - - - - - - - - - 3A - - - - - - - - - 4A - - - - - - - 4B - - - - - - - - - - 6A - - - - - - 8A - - - - - - - - - 8B - - - - - - - - - -
17A - - - - - - - - 17B - - - - - - - - 19A - - - - - - - - - 23A - - - - - - - - 23B - - - - - - - - 28A - - - - - - - - - -
Frequência do padrão 50,0% 33,0% 17,0% 20,0% 30,0% 30,0% 20,0% 40,0% 20,0% 20,0% 20,0%
79
III.3.4. Discussão
Em peixes, a análise do número e localização das RONs é amplamente
efetuada por meio da impregação destas regiões com nitrato de prata (Galetti
Jr. & Martins, 2004). Porém, como a prata se associa a proteínas nucleolares
envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais da família 45S
(Miller et al., 1976; Howell & Black, 1980; Boisvert et al., 2007) e também pode
impregnar regiões heterocromáticas ricas em resíduos ácidos (Sumner, 1990),
grande parte da variação que tem sido detectada em peixes pode estar
associada à atividade desses cístrons ou à presença de blocos
heterocromáticos ácidos.
As três espécies de Symphysodon submetidas à impregnação com íon
prata no presente trabalho revelaram variabilidade intraindividual, bem como
inter e intraespecífica. Os dados de RON obtidos para S. discus corroboram os
dados prévios, porém em S. aequifasciatus e S. haraldi o número de
cromossomos envolvidos com a RON foi menor quando comparado ao padrão
descrito por Mesquita et al (2008), que mostraram o envolvimento de seis pares
cromossômicos na primeira espécie e cinco pares cromossômicos na segunda,
sendo até cinco marcações evidenciadas por célula. Parte da variabilidade
encontrada por Mesquita et al. (2008) em relação aos pares cromossômicos
envolvidos com a RON pode ser devido à impregnação de heterocromatina
constitutiva com íon prata, uma vez que em alguns indivíduos do presente
trabalho a prata impregnou tanto as RONs como regiões heterocromáticas não
portadoras de sítios ribossomais, como é o caso dos cromossomos do par 1
em S. aequifasciatus (Figura 2d e 3 a-c) e pares 11 e 21 em S. haraldi (Figuras
2f e 3 h-k).
Além disso, a presença de constrições secundárias que se estendem ao
longo de um braço cromossômico inteiro em S. aequifasciatus e S. haraldi
(Figura 2d, 2f) também poderiam explicar os diferentes citótipos descritos para
a mesma espécie por Mesquita et al. (2008). Quando ativo, o DNA ribossomal
presente nestes braços cromossômicos pode não estar suficientemente
compactado para ser visível em coloração convencional, o que ocasionaria a
80
anfiplastia, que é a habilidade dos cromossomos nucleolares metafásicos
apresentarem-se sob diferentes formas relacionadas à atividade das RONs,
sendo este este um fenômeno epigenético (revisado por Pikaard, 2000). Assim,
a variação intraindividual da RON, evidenciada por nitrato de prata nas três
espécies de Symphysodon, pode ser considerada como resultado da atividade
dos cistrons ribossomais. Já, a variação intra e interespecífica não pode ser
creditada a efeitos epigenéticos, pois a detecção dos sítios DNAr 18S
evidenciou diferenças no número de loci (duas a cinco marcações, envolvendo
homólogos e não homólogos) e de tamanho, revelando um complexo padrão
de distribuição destas sequências nos cromossomos mitóticos de indivíduos de
uma mesma espécie (Figura 3; Tabela 1). Esta variabilidade detectada pela
sonda DNAr 18S também não pode ser explicada por falhas no processos de
hibridização, uma vez que as sondas foram hibridizadas em condições de alta
estringência, além de terem sido efetuadas hibridizações homólogas (sondas
de DNA da mesma espécie) e heterólogas (sonda de uma espécie hibridizada
em cromossomo de outra), as quais apresentaram os mesmos resultados.
Em Symphysodon os sinais de 18S, assim como as marcações com
nitrato de prata, estão principalmente localizados nos braços curtos, em regiões
terminais e intersticiais proximais (Figura 3), o que poderia ter facilitado a sua
transposição para outros pares de cromossomos por eventos de translocações.
Estes rearranjos também parecem ter provocado a mudança de posição do
DNAr 5S, o qual não é sintênico aos DNAr 18S nas três espécies de
Symphysodon, estando presente nos cromossomos dos pares 10 de S.
aequifasciatus e 18 em S. discus e S. haraldi (Gross et al., 2009; no prelo a). A
localização separada dos sítios DNAr 45S e DNAr 5S é a situação mais comum
entre os peixes, provavelmente porque a transcrição dos genes do RNAr 45S é
efetuada pela RNA polimerase I e o RNAr 5S pela polimerase III (revisado em
Martins & Galetti Jr., 2001; Martins, 2007).
Além da variação de número e posição dos sítios 18S, também pode ser
observado heteromorfismo de tamanho das marcas em cromossomos
homólogos nos acarás-disco, o que sugere duplicação destas sequências e/ou
crossing-over desigual, como já foi proposto para outros peixes e mamíferos
81
(Ashley & Ward, 1993; Salvadori et al., 1995; Boron et al., 2006). Esta
suposição é reforçada pelo fato de que as três espécies de Symphysodon
apresentam tanto os cístrons de DNAr 5S como os DNAr 45S em regiões de
heterocromatina constitutiva, o que tem sido extensivamente documentado em
peixes (Pendás et al., 1993a, b; Fujiwara et al., 1998; Artoni et al., 2008;
Nakayama et al., 2008; entre outros). A heterocromatina é atualmente
reconhecida como uma importante parte do genoma dos eucariotos (Grewal &
Jia, 2007; Skipper, 2007; Bühler, 2009). Devido à natureza repetitiva dos DNAs
ribossomais e de outras sequências encontradas na heterocromatina
constitutiva, erros da DNA polimerase na adição de nucleotídeos durante a
duplicação do material genético e crossing-over desigual, podem ocasionar
acúmulo de DNAr (Pendás et al., 1993a). Além disso, a tendência da
associação na organização nucleolar também poderia facilitar translocações
não-recíprocas entre RONs (revisado em Wasko & Galetti Jr, 2000). Todos
estes fatores, aliados à presença de elementos transponíveis nas regiões
heterocromáticas nas três espécies de Symphysodon (Gross et al., no prelo)
podem ter ocasionado os polimorfismos estruturais dos sítios ribossomais
DNAr 45S encontrados nas mesmas.
Recentemente uma nova abordagem acerca da variabilidade do DNAr
tem surgido, a qual considera esta região genômica como instável e sendo um
dos sítios mais frágeis, que funcionaria como um sensor primário de danos
ocasionados por diversos fatores, inclusive ambientais (Kobayashi, 2006;
2008). Além disso, alguns elementos transponíveis apresentam inserção
preferencial em posições nucleotídicas particulares do genoma, como é o caso
do elemento LINE (long interspersed nuclear element) que se insere
especificamente nos genes de RNAr 28S em Drosophila melanogaster
tornando esta sequência não funcional (Eickbush, 2002). A manutenção do
número de cópias viáveis dos genes de RNAr sendo expressas é de extrema
importância para a célula e, portanto, duplicações das sequências ou
silenciamento destes genes podem ocorrer, o que explicaria a sua associação
com heterocromatina constitutiva, que promove um controle epigenético do
genoma por meio de metilação de histonas (Sullivan et al., 2001; Kobayashi,
82
2006; 2008; Grewal & Jia, 2007). Assim, o número de cópias de DNAr sempre
flutuaria e por isso um grande número destas sequências seria encontrado no
genoma, garantindo assim a manutenção de cópias viáveis (Kobayashi, 2006;
2008). Esta hipótese é reforçada pelo fato de que os nucléolos parecem
coordenar as respostas dos organismos quando submetidos a estresses
(Olson, 2004).
Os nucléolos são estruturas nucleares organizadas em torno das RONs
ativas, que são as regiões cromossômicas portadoras das sequências
ribossomais DNAr 45S repetidas em tandem, que tem como função primária a
biogênese dos ribossomos (Hernandez-Verdun et al., 2002; Hernandez-
Verdun, 2004). Porém, evidências mostram que eles apresentam funções
adicionais, dentre elas a regulação da mitose, progressão do ciclo celular e
proliferação das células, estando também associados com respostas a muitas
formas de estresses exógenos, como alterações de temperatura, choque
térmico, hipóxia e outros (Visintin & Amon, 2000; Boisvert et al., 2007; Varriale
et al., 2008). Segundo Burt & Trivers (2006) isto ocorre porque os elementos
repetitivos, dentre eles o DNAr, estão envolvidos com uma sofisticada
maquinaria enzimática, como é o caso do envolvimento destes elementos na
evolução do sistema imune dos vertebrados.
A bacia amazônica, local de endemismo das espécies de Symphysodon,
além de apresentar rios com diferentes características físico-químicas (pH,
condutividade elétrica, temperatura) também apresenta pulsos de inundação
que provocam o alagamento de regiões de floresta durante a época da cheia
(Junk & Furch, 1993). Estas flutuações no nível da água expõem os peixes a
extremas diferenças na disponibilidade de alimentos e abrigos, densidade de
predadores e parasitas, e propriedades físico-químicas da água, como oxigênio
dissolvido, sendo que em áreas alagáveis há uma tendência para o
estabelecimento de condições hipóxicas permanentes ou transitórias (Junk,
1997). Estas pressões ambientais levaram os peixes desta região a
desenvolver uma grande plasticidade genotípica durante o processo evolutivo,
podendo ser observado uma série de ajustes etológicos, morfológicos,
fisiológicos, metabólicos e moleculares que lhes ajuda a manter a homeostase
83
orgânica e lhes permite a sobrevivência durante estas mudanças sazonais
(Almeida-Val et al., 1993; Almeida-Val & Farias, 1996). Os acarás-disco
apresentam uma alta variabilidade genética molecular e cromossômica (Farias
& Hrbek, 2008; Mesquita et al., 2008) e também adaptações que lhes permite
sobreviver em condições de hipóxia moderada (Chippari-Gomes et al., 2003).
Como as três espécies habitam locais suceptíveis a estas variações
ambientais, é possível que ao longo da evolução das mesmas, estas condições
tenham favorecido a movimentação de elementos transponíveis, ocasionando
eventos de translocação que promoveram a variabilidade do DNAr 18S e da
RON, sugerindo que o genoma destas espécies pode ter sido continuamente
modificado pelas variações dos DNAs repetitivos. Assim, rearranjos
cromossômicos estruturais parecem estar atuando efetivamente na
carioevolução dos acarás-disco e o padrão de organização e compactação
cromossômica podem ter favorecido sua adaptabilidade a diferentes condições
ambientais.
84
III.4.Capítulo 4: Complexo sinaptonêmico em acarás-disco: cadeia cromossômica meiótica
Complex synaptonemical analysis in Discus fish: the meiotic chromosomomal
chain.
Revista à ser enviado para publicação: Micron
85
III.4.1 Introdução
Desde meados da década de 1960, estudos citogenéticos das espécies
selvagens de acará-disco (Symphysodon, Cichlidae, Perciformes) tem revelado
diferentes fórmulas cromossômicas, apesar do número diploide sempre ter sido
igual a 60 cromossomos (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et al.,
2002; Mesquita et al., 2008). Bandeamentos cromossômicos e mapeamento
físico de sequências de DNA repetitivo em cromossomos das três espécies de
Symphysodon revelaram grandes blocos de heterocromatina constitutiva (que
abriga elementos transponíveis como o retrotransposon Rex3), polimorfismo
inter e intraespecífico das regiões organizadoras de nucléolo (RON) e dos
genes RNAr 18S, além de diferenças na localização física cromossômica do
sítio ribossomal 5S, o que indica a presença de grandes rearranjos
cromossômicos neste táxon (Gross et al., 2009; no prelo a; b). Análises
meióticas conduzidas nas três espécies revelaram que todos os indivíduos de
S. discus apresentam 30 bivalentes típicos durante a prófase I, porém em S.
aequifasciatus e S. haraldi um intrigante comportamento cromossômico
meiótico foi evidenciado, onde em ovócitos e espermatócitos uma cadeia
cromossômica de até 20 elementos foi encontrada em células em diplóteno,
diacinese e metáfases I (Gross et al., 2009). Esta cadeia cromossômica
provavelmente originou-se a partir de uma série de translocações
cromossômicas múltiplas, decorrentes de movimentação de elementos
transponíveis após hibridização de espécies/populações ancestrais (Gross et
al., 2009; no prelo a).
Métodos citogenéticos clássicos e moleculares, abordando
cromossomos já compactados de Symphysodon, sejam eles mitóticos ou
meióticos, ainda não foram suficientes para elucidar a evolução cariotípica
deste gênero. A observação do emparelhamento dos cromossomos em
prófases meióticas, onde os cromossomos estão parcialmente condensados,
pode auxiliar na estimativa do grau de homologia entre os cromossomos de
espécies relacionadas e na detecção de rearranjos cromossômicos por meio da
análise do complexo sinaptonêmico, que é uma estrutura proteica tripartida que
86
se forma durante o zigóteno entre cromossomos homólogos ou entre regiões
de homologia de cromossomos não-homólogos (Smithies & Powers, 1986;
Carpenter, 1987; John, 1990; Jinks-Robertson et al.,1997; Traut & Clarke,
1997). Deste modo, a proposta deste trabalho foi a análise do complexo
sinaptonêmico, em paquíteno e diplóteno, das espécies S. aequifasciatus e S.
haraldi, portadoras da cadeia cromossômica multivalente, visando
compreender a carioevolução dos acarás-disco.
III.4.2. Material e Métodos
A análise de células meióticas profásicas de acarás-disco machos foram
efetuadas em seis exemplares de Symphysodon aequifasciatus e seis
exemplares de Symphysodon haraldi. Os peixes foram anestesiados em água
gelada, sendo posteriormente sacrificados por meio da secção da medula
espinhal. A técnica para análise do complexo sinaptonêmico seguiu os
protocolos descritos por Moses (1977) e Dresser & Moses (1980) e a
impregnação com nitrato de prata foi efetuada de acordo com protocolo
descrito por Howell & Black (1980). Aproximadamente 100 espermatócitos por
indivíduo foram analisados em S. aequifasciatus e S. haraldi. Para a análise do
complexo sinaptonêmico as células paquitênicas e diplotênicas que
apresentaram boas condições de extensão dos segmentos emparelhados,
tiveram sua imagem capturada em fotomicroscópio Olympus Bx-51 do
Laboratório de Genética Animal-CPBA (INPA) e as células profásicas,
colocadas sobre membrana plástica e telas metálicas, foram fotografadas em
microscópio eletrônico de transmissão Philips, no Centro de Microscopia-
UNESP-Botucatu, em filme 35mm, com exposição de 2,04 segundos, a 80Kv.
III.4.3. Resultados
Uma proporção muito baixa de células paquitênicas foi observada em
Symphysodon aequifasciatus e Symphysodon haraldi, quando comparadas às
outras fases meióticas profásicas (1:45). Em todos os paquítenos, de ambas as
espécies, um pareamento atípico dos cromossomos foi observado (Figuras 1,
87
2). Um número variável de bivalentes por célula (10-20) apresentou
pareamento sináptico na totalidade da sua extensão. Assinapse temporária
(falta de emparelhamento) de segmentos terminais foi evidenciada em alguns
bivalentes (Figura 1a). Elementos laterais descontínuos foram observados em
células de S. aequifasciatus e S. haraldi, os quais apareceram ligados a outros
elementos, formando a cadeia cromossômica que assumiu diversas
conformações, desde lineares (com as extremidades separadas) até em anel
(com as extremidades unidas) (Figura 1a, 1b). O estabelecimento do número
de cromossomos formadores da cadeia multivalente e dos bivalentes típicos
não foi alcançado, uma vez que devido às diferentes conformações da cadeia
multivalente, o emparelhamento dos segmentos homólogos parece ser variável
entre os indivíduos e, além disso, sempre ocorreu sobreposição dos
cromossomos, fato que também inviabilizou a reconstrução dos pareamentos,
tanto na microscopia óptica como na microscopia eletrônica de transmissão.
Em associação com os elementos de cada complexo sinaptonêmico
uma estrutura proeminente eletrodensa, identificada como cinetocoro, foi
observada (Figura 2a). Ambas as regiões terminais dos elementos laterais
também apareceram mais escuras que a maior parte do comprimento
cromossômico, as quais provavelmente referem-se às placas de ancoragem na
membrana nuclear (Figura 2b). Em células meióticas paquitênicas de ambas as
espécies de Symphysodon alguns centrômeros foram observados em
associação, formando aglomerados escuros (Figura 1a). Nódulos de
recombinação, em número variável, foram evidenciados em associação com o
complexo sinaptonêmico de bivalentes e da cadeia cromossômica, os quais
provavelmente finalizam em quiasmas (Figura 2b). Durante o diplóteno, apesar
do complexo sinaptonêmico iniciar sua desestruturação, quiasmas foram
visualizados tanto em bivalentes típicos quanto em elementos formadores da
cadeia cromossômica, porém o número de quiasmas também foi variável em
cada elemento e não pode ser estabelecido (Figura 1c).
88
Figura 1: Prófase I obtida por processo de microespalhamento de S. aequifasciatus impregnada com nitrato de prata, em
microscopia óptica. a) Célula paquitênica tardia; b) seu esquema evidenciando a cadeia cromossômica multivalente (seta e
esquema em vermelho), 16 bivalentes em emparelhamento completo (esquema em azul), 1 bivalente com assinapse na região
terminal (cabeça de seta e esquema em roxo) e bivalentes em associação centromérica temporária (estrela e esquema em verde);
c) Diplóteno incompleto, evidenciando quiasmas na cadeia cromossômica em anel (seta). Note que apesar do complexo
sinaptonêmico estar se desintegrando, os elementos laterais também podem ser evidenciados em algumas porções (cabeça de
seta). Para S. haraldi as mesmas configurações meióticas foram encontradas (barra: 10 μm).
89
Figura 2: Prófase I obtida por processo de microespalhamento de S. haraldi impregnada com nitrato de prata, em microscopia eletrônica de transmissão. a) Paquíteno (1000x de aumento) com número de bivalentes e elementos formadores da cadeia cromossômica não determinado. Os cinetocoros (cabeça de seta) e regiões eletrodensas, provavelmente regiões de ancoragem na membrana nuclear (seta), preservados em bivalentes típicos, com complexo sinaptonêmico distribuído ao longo de todo o comprimento. A região nucleolar está evidenciada (nu). Note que ao longo de alguns elementos cromossômicos o complexo sinaptonêmico apresenta coloração mais conspícua e podem estar indicando regiões de heterocromatina diferenciada; b) Detalhe dos elementos laterais do complexo sinaptonêmico e nódulos de recombinação (seta) ao longo da cadeia cromossômica (5750 x de aumento). Para S. aequifasciatus as mesmas configurações meióticas foram encontradas.
90
III.4.4. Discussão
As prófases meióticas em espermatócitos de Symphysodon
aequifasciatus e S. haraldi não apresentaram características similares às
descritas para outras espécies de peixes tropicais, onde núcleos paquitênicos
apresentam os cromossomos autossômicos homólogos totalmente
emparelhados, sendo possível verificar a metade do número diploide em
bivalentes típicos (Dias, 1995; Rodionova et al., 1996; Bertollo & Mestriner,
1998; Portela-Castro et al.; 2001). Os paquítenos de Symphysodon
aequifasciatus e S. haraldi apresentaram número variável de bivalentes típicos
e uma cadeia cromossômica multivalente. Além disso, alguns centrômeros
foram vistos em associação e geralmente esta interação de centrômeros está
relacionada com a quantidade de heterocromatina constitutiva que flanqueia
esta região, ou seja, quando a região heterocromática centromérica é pequena,
esta somente suporta uma única interação de emparelhamento e quando esta
região é grande, a associação multivalente pode ocorrer (Stewart & Dawson,
2008). Apesar de S. aequifasciatus e S. haraldi apresentarem grandes blocos
de heterocromatina na região pericentromérica (Mesquita et al., 2008; Gross et
al., 2009), a associação de blocos heterocromáticos não é a causa da
formação da cadeia cromossômica meiótica, uma vez que nas duas espécies a
figura meiótica multivalente foi encontrada ao longo de toda a prófase I e
metáfase I. Segundo De Jong & Stam (1983) e Disney & Wright (1987)
associações centroméricas por heterocromatina desaparecem completamente
durante a diacinese/metáfase I em organismos que apresentam configurações
meióticas multivalentes em paquítenos, sendo visíveis, nesta fase, apenas
bivalentes típicos. Assim, a hipótese de associação centromérica pode ser
descartada para as espécies de Symphysodon.
Por outro lado, o padrão de emparelhamento dos cromossomos
paquitênicos em ambas as espécies de Symphysodon corroboram os dados
obtidos para indivíduos híbridos ou de origem poliplóide. Em híbridos, como
aqueles obtidos dos cruzamentos de Salvelinus alpinus x Salvelinus fontinalis e
Poecilia velifera x Poecilia reticulatus (Lee & Wright, 1981; Disney & Wright,
91
1987; Rodionova et al., 1996), a configuração multivalente ocorre devido ao
emparelhamento de cromossomos homólogos e homeólogos das espécies com
diploidização incompleta. O número diploide encontrado para as espécies de
Symphysodon (2n=60 cromossomos) é o maior número diploide já encontrado
para família Cichlidae (para revisão Feldberg et al., 2003) e em 1976
Thompson sugeriu que Symphysodon haraldi (originalmente descrito na
publicação como S. aequifasciatus) poderia ser uma espécie poliplóide. Em
2008, Mesquita et al. analisando as três espécies do gênero sugeriram uma
outra hipótese para a carioevolução do gênero, a qual estaria baseada em
rearranjos cromossômicos. Mais recentemente, Gross et al. (2009; no prelo a)
sugeriram que o aumento do número diploide e os rearranjos cromossômicos
encontrados nas espécies de Symphysodon teriam sido mediados pelo
acúmulo de elementos transponíveis, como o Rex 3, uma vez que a origem da
figura meiótica multivalente encontrada em S. aequifasciatus e S. haraldi
parece estar baseada em uma série de translocações cromossômicas
múltiplas, que teriam ocorrido após a hibridização de espécies/populações
ancestrais deste gênero.
Esta última hipótese implica que grande parte da variabilidade
cromossômica do gênero Symphysodon seria encontrada apenas em espécies
portadoras da cadeia cromossômica, mas variabilidade intra e interespecífica
de RONs e sítios ribossomais 18S e 5S foi verificada para as três espécies do
gênero, inclusive em S. discus que não é portadora de cadeia cromossômica
meiótica (Gross et al., no prelo a,b). Estes fatos nos levaram a sugerir uma
outra hipótese, onde as espécies/populações ancestrais teriam sofrido
rearranjos cromossômicos independentes, já favorecendo a variabilidade
cromossômica e, após a hibridização, a cadeia cromossômica teria se
originado nos híbridos como uma forma de ajustamento sináptico (para que
houvesse o emparelhamento de segmentos homólogos devido à homologia
monobranquial dos cromossomos parentais) e promovesse a viabilidade dos
híbridos, que atualmente são reconhecidos como duas espécies distintas e
viáveis. Esta conformação meiótica pode ser preferencial, em detrimento da
formação de bivalentes típicos, como já sugerido para outras espécies de
92
peixes híbridos (Lee & Wright, 1981; Disney & Wright, 1987) e por este motivo
ainda está sendo evidenciada nestas duas espécies de Symphysodon.
Em muitas espécies, a habilidade dos cromossomos homólogos ou de
segmentos homólogos em se reconhecerem na prófase meiótica I é
complicada quando ocorre a presença de sequências repetitivas similares nos
cromossomos (Moore, 2002). Como os elementos repetitivos estiveram
envolvidos com estes eventos de transposição que originaram a cadeia
cromossômica, várias formas de emparelhamento de segmentos homólogos
podem ser possíveis, o que explicaria as diversas conformações da figura
meiótica multivalente de S. aequifasciatus e S. haraldi.
Apesar da heterocromatina promover a associação de cromossomos
não homólogos em alguns organismos (John & King, 1982), este fato
certamente não pode ser considerado determinante na formação da cadeia
cromossômica meiótica de S. aequifasciatus e S. haraldi, uma vez que
quiasmas são visualizados dentro da cadeia cromossômica, o que sugere que
os seus segmentos formadores são homólogos para que haja a recombinação.
Esta conformação meiótica pode ser um fator determinante na
reprodução destas espécies e na garantia de sua viabilidade, uma vez que as
mesmas tem um complexo comportamento reprodutivo (Câmara, 2004;
Chellappa et al.,2005; Cardoso, 2008). Em um estudo efetuado em condições
naturais, Cardoso (2008) analisou ovócitos de fêmeas selvagens de
Symphysodon aequifasciatus em estádio de maturação avançada e verificou
que a espécie apresenta dois grupos modais pronunciadamente definidos,
sendo um de ovócitos de reserva (diâmetro de 0,4mm) e outro de ovócitos
prontos para serem liberados (diâmetro de 0,9mm). Porém, entre os dois
extremos, dois grupos modais pouco definidos foram encontrados. Acreditamos
que estes ovócitos intermediários devem estar relacionados a células
gaméticas que não conseguiram completar o seu processo de divisão celular
devido à não disjunção correta da cadeia cromossômica meiótica, sendo
portanto células inviáveis e que podem ser reabsorvidas pelo organismo. Já,
em Symphysodon discus ovócitos pertencentes a grupos modais pouco
definidos não foram encontrados (Câmara, 2004) e como esta espécie não é
93
portadora de figura meiótica multivalente, a maioria dos gametas apresenta o
conteúdo genético esperado, não havendo a necessidade da reabsorção de
ovócitos mal formados. Contudo, estudos reprodutivos abordando a terceira
espécie, que também apresenta cadeia cromossômica meiótica, ainda não
foram efetuados para confirmar esta hipótese.
Estes dados reforçam a complexa evolução cromossômica de
Symphysodon e apesar da análise do complexo sinaptonêmico confirmar o
emparelhamento de regiões homólogas na cadeia cromossômica de
Symphysodon aequifasciatus e Symphysodon haraldi e indicar a origem híbrida
destas espécies, todas as técnicas citogenéticas clássicas e moleculares já
aplicadas não permitiram definir quais são os cromossomos formadores desta
figura multivalente, porém já indicam que o emparelhamento não é único, nem
mesmo no próprio indivíduo, devido às diversas conformações da cadeia e o
número variável de elementos na prófase meiótica.
94
IV. Conclusões Gerais - As características citogenéticas das populações amostradas
corroboram a existência de três espécies, sendo elas S. aequifasciatus (disco
verde), S. discus (disco heckel) e S. haraldi (disco azul e marrom).
- Apesar das três espécies de Symphysodon apresentarem 2n=60
cromossomos, características cromossômicas distintas foram evidenciadas
para cada espécie.
As espécies S. aequifasciatus e S. haraldi provavelmente tiveram uma
origem híbrida, cujos parentais ainda não foram encontrados e estas
apresentaram uma cadeia cromossômica meiótica durante o diplóteno e que
não está relacionada a cromossomos sexuais
A figura meiótica multivalente deve ter se originado a partir de uma série
de translocações que envolveram regiões ricas em elementos móveis. Estas
translocações teriam ocorrido dentro de cada população/espécie ancestral
antes de acontecer a hibridização das espécies ou então os elementos
repetitivos teriam se movimentado ativamente após a hibridização entre os
ancestrais dos discos que não possuiam cadeia cromossômica
- A cadeia cromossômica de S. aequifasciatus e S. haraldi não é
formada apenas por microcromossomos, uma vez que ambas as espécies
apresentam apenas quatro destes, e também não ocorre devido a associações
heterocromáticas, pois esta figura meiótica multivalente se mantém durante
toda a prófase e metáfase I, sendo evidente a presença de quiasmas em
regiões homólogas. Entretanto, os blocos de heterocromatina podem estar
afetando o número de quiasmas.
- Os sítios de 5S não estão envolvidos com as translocações formadoras
da cadeia cromossômica meiótica, apesar de estarem colocalizados com
heterocromatina constitutiva. Variabilidade inter e intraespecífícia da região
organizadora de nucléolo foi evidenciada pela impregnação por nitrato de prata
e confirmada pela localização física do gene RNAr 18S em cromossomos
mitóticos, reforçando a hipótese do envolvimento do DNA repetitivo nos
rearranjos cromossômicos que ocorreram nos acarás-disco.
95
- A carioevolução dos Symphysodon está baseada em uma possível
correlação entre acúmulo e movimentação de elementos repetitivos, ganho de
heterocromatina, heterocromatinização e rearranjos cromossômicos.
96
V. Perspectivas futuras Avanços significativos foram alcançados no entendimento da evolução
cariotípica de Symphysodon, mas muitas contribuições a respeito da
organização genômica dos acarás-disco ainda podem ser obtidas. Para tanto, o
próximo passo é focar em três frentes:
- Mapeamento de outras sequências repetitivas como histonas,
elementos transponíveis (Rex1, Rex6, mariner, entre outros), assim como
outros repetitivos isolados por restrição enzimática ou Cot-DNA.
- Microdissecção da cadeia cromossômica meiótica das espécies S.
aequifasciatus e S. haraldi e a marcação destas com fluorescência para serem
utilizadas como sondas homólogas e heterólogas em cromossomos mitóticos.
Esta análise poderá esclarecer quais são os cromossomos formadores desta
figura multivalente, além de indicar se estes são homeólogos entre as
diferentes espécies.
- Análises de GISH poderão confirmar a origem híbrida das espécies
portadoras da cadeia cromossômica.
97
VI. Referência bibliográfica Almeida-Val, V.M.F.; Val, A.L.; Hochachka, P.W. 1993. Hypoxia Tolerance. In:
Hochachka, P.W.; Lutz, P.L.; Sick, T.; Rosenthal, M.; van den Thillart, G.
(Org.). Surviving Hypoxia: Mechanisms for Control and Adaptation. CRC
Press, Boca Raton. p. 435-445.
Almeida-Val, V.M.F.; Farias, I.P. 1996. Metabolic adjustments to chronic
hypoxia. In: Val, A.L.; Almeida-Val, V.M.F.; Randall, D.J. (Org.). Physiology
and Biochemistry of the Fishes of the Amazon. Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia, Manaus, Amazonas. p. 257-271.
Amado, M.V.; Hrbek, T.; Gravena, W.; Fantin, C.; Assunção, E.N.; Astolfi-Filho,
S.; Farias, I.P. 2008. Isolation and characterization of microsatellite markers
for the ornamental discus fish Symphysodon discus and cross-species
amplification in other Heroini cichlid species. Molecular Ecology Research,
8(6): 1451–1453.
Artoni, R.F.; Vicari, M.R.; Bertollo, L.A.C. 2000. Citogenética de peixes
neotropicais: métodos, resultados e perspectivas. Publicatio UEPG Biological
and Health Sciences 6(1): 43-60.
Artoni, R.F.; Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Vicari, M.R.; Almeida, M.C.; Matoso,
D.A. 2008. Epifluorescence and light microscopy evidencing structural and
functional polymorphism of ribosomal DNA in fish (Teleostei: Astyanax
fasciatus). Micron, 39: 1156–1159.
Asahida, T.; Kobayashi, T.; Saitoh, K.; Nakayama, I. 1996. Tissue preservation
and total DNA extraction from fish stored at ambient temperature using
buffers containing high concentration of urea. Fisheries Science, 62(5): 727-
730.
Ashley, T.; Ward, D.C. 1993. A hot spot of recombination coincides with
interstitial telomeric sequence in the Armenian Amster. Cytogenetic and Cell
Genetics, 62: 169–171.
Axelrod, H.R. 1978. All about Discus. T.F.H. Publications, Neptune City, USA.
128 pp.
98
Bertollo, L.A.C.; Mestriner, C.A. 1998. The X1X2Y sex chromosome system in
the fish Hoplias malabaricus. II. Meiotic analyses. Chromosome Research, 6:
141-147.
Bertollo, L.A.C.; Takahashi, C.S.; Moreira-Filho, O. 1978. Cytotaxonomic
considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erytrinidae). Revista Brasileira
de Genética, 1: 103-120.
Biémont, C.; Vieira, C. 2006. Genetics - Junk DNA as an evolutionary force.
Nature, 443: 521-524.
Bleher, H. 2006. Bleher's Discus. Aquapress Publishers, Pavia, Itália. 671 pp.
Bleher, H.; Göbel, M. 1992. Discus: wild-caught and captive-bred forms.
Aquaprint Verlags, Neu Isemburg, Alemanha. 160 pp.
Bleher, H.; Stölting, K.N.; Salzburger, W.; Meyer, A. 2007. Revision of the
genus Symphysodon Heckel, 1840 (Teleostei: Perciformes: Cichlidae) based
on molecular and morphological characters. Aqua International Journal of
Ichthyology, 13: 133-174.
Bohne, A.; Brunet, F.; Galiana-Arnoux, D.; Schulthesis, C.; Volff, J.N. 2008.
Transposable elements as drivers of genomic and biological diversity in
vertebrates. Chromosome Research, 16: 203-215.
Boisvert, F.M.; Koningsbruggen, S.V.; Navascués, J.; Lamond, A.I. 2007. The
multifunctional nucleolus. Molecular Cell Biology, 8: 574-585.
Bonaccorsi, S.; Lohe, A. 1991. Fine mapping of satellite DNA sequences along
the Y chromosome of Drosophila melanogaster: relationships between the
satellite sequences and fertility factors. Genetics, 129: 177–189. Boron, A.; Ozouf-Costaz, C.; Coutanceau, J.P.; Woroniecka, K. 2006. Gene
mapping of 28S and 5S rDNA sites in the spined loach Cobitis taenia
(Pisces, Cobitidae) from a diploid population and a diploid–tetraploid
population. Genetica, 128: 71–79.
Brum, M.J.I.; Galetti Jr, P.M. 1997. Teleostei ground plan karyotype. Journal
Comparative Biology, 2: 91–102.
Bühler, M. 2009. RNA turnover and chromatin-dependent gene silencing.
Chromosoma, 118: 141–151.
99
Burgess, W.E. 1991. The current status of discus systematics. Tropical Fish
Hobbyist, 39: 30-40.
Burt, A.; Trivers, R. 2006. Genes in conflict: the biology of selfish genetic
elements. Harvard University Press, Cambridge, p. 228-300.
Câmara, M.R. 2004. Biologia Reprodutiva do Ciclídeo Neotropical Ornamental
Acará-Disco, Symphysodon discus Heckel, 1840 (Osteichthyes:
Perciformes: Cichlidae). Tese de doutorado, Universidade Federal de São
Carlos, São Carlos, São Paulo. 135 pp.
Cardoso, F.R. 2008. Ecologia da pesca e biologia reprodutiva do acará-disco
(Symphysodon aequifasciatus, Pellegrin 1904) (Perciformes: Cichlidae) na
RDS Piagaçu-Purus, Amazônia Central: subsídios para o manejo sustentável
de um recurso natural. Dissertação de mestrado, Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas, Manaus,
Amazonas. 115 pp.
Carrel, L. 2004. Chromosome chain makes a link. Nature, 432: 817-818.
Carpenter, T.C. 1987. Gene conversion, recombination nodules, and the
initiation of meiotic synapsis. Bio Essays, 6: 232- 236.
Chan, C. 1991. Dr. Clifford Chan’s Book of Singapore Discus. T.F.H.
Publications, Neptune. 155 pp.
Chao, N.L. 1993. Conservations of rio Negro ornamental fishes. Tropical Fish
Hobbyist, 41(5): 99-114.
Chao, N.L. 2001. The fishery, diversity and conservation of ornamental fishes in
the rio Negro Basin, Brazil- a review of Project Piaba (1989-99). In: Chao,
N.L.; Petry, P.; Prang, G.; Sonneschien, L.; Tlusty, M. (Eds). Conservation
and management of ornamental fish resources of the rio Negro Basin,
Amazonia, Brazil- Project Piaba. Editora da Universidade do Amazonas,
Manaus, Brasil. p. 161-204.
Chellappa, S.; Câmara, M.R.; Verani, J.R. 2005. Ovarian development in the
amazoniam red discus, Symphysodon discus, Heckel (Osteichthyes:
Cichlidae). Brazilian Journal of Biology, 65(4): 609-616.
Chippari-Gomes, A.R.; Lopes, N.P.; Paula-Silva, M.N.; Oliveira, A.R.; Almeida-
Val, V.M.F. 2003. Hypoxia tolerance and adaptations in fishes: the case of
100
amazon ciclhids. In: Val, A.L.; Kapoor, B.G. (Eds) Fish adaptation. Science
Publishers, INC, EUA. p. 37-54.
Crampton, W.G.R. 2008. Ecology and life history of an Amazon floodplain
cichlid: the discus fish Symphysodon (Perciformes: Cichlidae). Neotropical
Ichthyology 6(4): 599-612.
Dasilva, C.; Hadji, H.; Ozouf-Costaz, C.; Nicaud, S.; Jaillon, O.; Weissenbach,
J.; Crollius, H.R. 2002. Remarkable compartmentalization of transposable
elements and pseudogenes in the heterochromatin of the Tetraodon
nigroviridis genome. Proceedings of the National Academy of Science USA,
99(21): 1636- 1641.
De Jong, J.H.; Stam, P. 1983. The association of centromeres of
nonhomologous chromosomes at meiotic prophase in Beta vulgaris L.
Canadian Journal of Genetic and Cytology, 27: 165-171.
Devlin, R.H.; Stone, G.W.; Smailus, D.E. 1998. Extensive direct-tandem
organization of a long repeat DNA sequence on the Y chromosome of
chinoock salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Journal of Molecular
Evolution, 46: 277-287.
Dias, A.L. 1995. Estudo do complexo sinaptonêmico em peixes, “Prochilodus
lineatus” (Prochilodontidae) e “Astyanax scabripinnis” (Characidae): análise
da sinapse dos cromossomos supranumerários. Tese, Universidade Federal
de São Carlos, São Carlos, Brasil. 102 pp.
Dias, A.L.; Foresti, F.; Oliveira, C. 1998. Synapsis in supernumerary
chromosomes of Prochilodus lineatus (Teleostei: Prochilodontidae).
Caryologia, 51(2): 105-113.
Dimitri, P.; Arca, B.; Berghella, L.; Mei, E. 1997. High genetic instability of
heterochromatin after tranposition of the LINE-like I factor in Drosophila
melanogaster. Proceedings of the National Academy of Science USA, 94:
8052–8057.
Diniz, D.; Laudicina, A.; Bertollo, L.A.C. 2009. Chromosomal location of 18S
and 5S rDNA sites in Triportheus fish species (Characiformes, Characidae).
Genetics and Molecular Biology, 32(1): 37-41.
101
Disney, J.E.; Wright, J.E. 1987. Cytogenetic analysis of a Salvelinus hybrid
reveal an evolutionary relationship between the parental species.
Cytogenetics and Cell Genetics, 45: 196-2005.
Disney, J.E.; Wright-Jr, J.E. 1990. Extensive multivalent pairing occurs in male
lake trout meiosis. Genome, 33: 219-224.
Dong, F.; Mille, J.T.; Jackson, S.A.; Wang, G.L.; Ronal, P.; Jiang, J. 1998. Rice
(Oryza sativa) centromeric regions consist of complex DNA. Proceedings of
the National Academy of Science USA, 95: 8135-8140.
Doolittle, W.F.; Sapienza, C. 1980. Selfish genes, the phenotype paradigm and
genome evolution. Nature, 284: 601-603.
Doudna, J.A.; Rath, V.L. 2002. Structure and Function of the Eukaryotic
Ribosome: The Next Frontier. Cell, 109: 153–156.
Dresser, M.E.; Moses, M.J. 1980. Synaptonemal complex karyotyping in
spermatocytes of the Chinese hamster (Cricetulus griseus). Chromosoma,
76: 1-22.
Dumas, D.; Britton-Davidian, J. 2002. Chromosomal rearrangements and
evolution of recombination: comparison of chiasma distribution patterns in
standard and robertsonian populations of the house mouse. Genetics, 162:
1355-1366.
Eichenlaub-Ritter, U.; Winking, H. 1990. Nondisjunction, disturbances in spindle
structure, and characteristics of chromosomes aligment in maturing oocytes
of mice heterozygous for Robertsonian translocations. Cytogenetics and Cell
Genetics, 54: 47-54.
Eickbush, T.H. 2002. R2 and related site-specific non-long terminal repeat
retrotransposons. In: Craig, N.L.; Craigie, R.; Gellert, M.; Lambowitz, A.M.
Mobile DNA II. ASM Press, Washington, DC, EUA. p. 1111-1144.
Estoup, A.; Presa, P.; Krieg, F.; Vaiman, D.; Guyomard, R. 1993. (CT)n and
(GT)n microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo trutta L.
(brown trout). Heredity, 71: 488-496.
Farias, I.P.; Schneider, H.; Sampaio, I. 1998. Molecular phylogeny of
Neotropical cichlids: the relationships of cichlasomines and heroines. In:
Malabarba, L.R.; Reis, R.E.; Vari, R.P.; Lucena, Z.M.; Lucena, C.A.S. (Eds).
102
Phylogeny and classification of Neotropical fishes. Edipucrs, Porto Alegre,
Brasil. p. 499-508.
Farias, I.P.; Ortí, G.; Sampaio, I.; Schneider, H.; Meyer, A. 2001. The
cytochrome b gene as a phylogenetic marker: the limits of resolution for
analyzing relationships among cichlid fishes. Journal of Molecular Evolution,
53: 89-103.
Farias, I.P.; Hrbek, T. 2008. Patterns of diversification in the discus fishes
(Symphysodon spp., Cichlidae) of the Amazon basin. Molecular
Phylogenetics and Evolution, 49: 32–43.
Feldberg, E.; Bertollo, L.A.C. 1984. Discordance in chromosome number
among somatic and gonadal tissue cells of Gymnogeonhagus balzani.
Revista Brasileira de Genética, 4: 639-645.
Feldberg, E.; Bertollo, L.A.C. 1985. Nucleolar organizing regions in some
species of Neotropical cichlids fishes (Pisces, Perciformes). Caryologia,
38(3-4): 319-324.
Feldberg, E.; Porto, J.I.R.; Bertollo, L.A.C. 2003. Chromosomal changes and
adaptation of cichlid fishes during evolution. In: Val, A.L.; Kapoor, B.G. (Eds).
Fish adaptation. Science Publishers, New Hampshire, EUA. p. 285-308.
Ferreira, E.J.G.; Zuanon, J.A.S.; Santos, G.M. 1998. Peixes comerciais do
médio Amazonas - região de Santarém, PA. IBAMA, Brasília, Brasil. 176 pp.
Ferreira, I.A.; Bertollo, L.A.C.; Martins, C. 2007. Comparative chromosome
mapping of 5S rDNA and 5S Hind III repetitive sequences in Erythrinidae
fishes (Characiformes) with emphasis on the Hoplias malabaricus ‘species
complex’. Cytogenetic and Genome Research, 118: 78–83.
Ferreira, I.A.; Martins, C. 2008. Physical chromosome mapping of repetitive
DNA sequences in Nile tilapia Oreochromis niloticus: evidences for a
differential distribution of repetitive elements in the sex chromosomes.
Micron, 39: 411-418.
Feschotte, C.; Prithman, E.J. 2007. DNA transposons and the evolution of
eukaryotic genomes. Annual Review of Genetics, 41: 331-68.
Fisher, C.; Bouneau, L.; Coutanceau, J.P.; Weissenbach, J.; Volff, J.N.; Ozouf-
Costaz, C. 2004. Global heterochromatic colocalization of transposable
103
elements with minisatellites in the compact genome of the pufferfish Tetraodon
nigroviridis. Gene, 336: 175-184.
Franz, P.F.; Armstrong, S.; de Jong, J.H.; Parnell, L.D.; van Drunen, C.; Dean,
C.; Zabel, P.; Bisseling, T.; Jones, G.H. 2000. Integrated cytogenetic map of
chromosome arm 4S of A. thaliana: structural organization of
heterochromatic knob and centromere region. Cell, 100: 367–376.
Frederiksen, S.; Cao, H.; Lomholt, B.; Levan, G.; Hallemberg, C. 1997. The rat
5S rRNA bona fide gene repeat maps to chromosome 19q12→qter and the
pseudogene repeat maps to 12q12. Cytogenetics and Cell Genetics, 76: 101-
106.
Fujiwara, A.; Abe, S.; Yamaha, E.; Yamazaky, F.; Yoshida, M.C. 1998.
Chromosomal localization and heterochromatin association of ribosomal
RNA gene loci and silver-stained nucleolar organizer regions in salmonid
fishes. Chromosome Research, 6: 463–471.
Gallardo, M.H.; González, C.A.; Cebrián, I. 2006. Molecular cytogenetics and
allotetraploidy in the red vizcacha rat, Tympanoctomys barrerae (Rodentia,
Octodontidae). Genomics, 88: 214-221.
Galetti Jr., P.M.; Martins, C. 2004. Contribuição da hibridização in situ para
conhecimento dos cromossomos de peixes. In: Guerra, M. (Org) FISH:
Conceitos e aplicações na citogenética. Sociedade Brasileira de Genética,
Ribeirão Preto, Brasil. p. 61-88.
Garcia, C.; Moreira-Filho, O. 2008. Localization of ribosomal genes in three
Pimelodus species (Siluriformes, Pimelodidae) of the São Francisco River:
5S genes as species markers and conservation of the 18S rDNA sites.
Genetics and Molecular Biology, 31(1-suppl): 261-264.
Grewal, S.I.S.; Jia, S. 2007. Heterochromatin revised. Nature reviews, 8: 35-46.
Gross, M.C. 2006. Comportamento cromossômico meiótico e mitótico de
acarás-disco (Symphysodon aequifasciatus e Symphysodon discus,
Cichlidae, Perciformes) da Amazônia Central. Dissertação de mestrado,
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do
Amazonas, Manaus, Brasil. 67 pp.
104
Gross, M.C.; Feldberg, E.; Cella, D.M.; Schneider, M.C.; Schneider, C.H.;
Porto, J.I.R.; Martins, C. 2009. Intriguing evidence of translocations in Discus
fish (Symphysodon, Cichlidae) and a report of the largest meiotic
chromosomal chain observed in vertebrates. Heredity, 102(5): 435-441.
Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Porto, J.I.R.; Martins, C.; Feldberg,
E. 2009a. Comparative cytogenetic analysis of ornamental Discus fish
species (Symphysodon, Cichlidae, Perciformes): retrotransposons and
ribosomal DNA. Cytogenetics and Genome Research, no prelo.
Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Martins, C.; Feldberg, E. 2009b.
Variability inter and intraspecific of 18S rDNA locus among Symphysodon
fishes: chromosomal rearrangements. Journal Fish of Biology, no prelo.
Grützner, F.; Rens, W.; Tsend-Ayush, E.; El-Mogharbel, N.; O’Brien, P.C.;
Jones, R.C.; Ferguson-Smith, M.A.; Graves, J.A.M. 2004. In the platypus a
meiotic chain of ten sex chromosomes shares genes with the bird Z and
mammal X chromosomes. Nature, 432: 913-917.
Grützner, F.; Ashley, T.; Rowell, D.; Graves, J.A.M. 2006. How did the platypus
get its sex chromosome chain? A comparison of meiotic multiples.
Chromosoma, 115: 75-88.
Guerra, M. 2004. Hibridização in situ: Princípios básicos. In: Guerra, M. (Ed)
FISH: Conceitos e Aplicações na Citogenética. Editora da Sociedade
Brasileira de Genética, Ribeirão Preto, Brasil. p. 1-32.
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor
and analysis program for Windows 95/96/NT. Nucleic Acids Symposium
Series, 41: 95-98.
Heckel, J. 1840. Johan Natterer’s neue Flussfische Brasilien’s nach den
Beobachtungen und Mittheilungen des Entdeckers beschrieben. Ann Wien
von Mus Naturg, 2: 327-470.
Hernandez-Verdun, D.; Roussel, P.; Gébrane-Younès, J. 2002. Emerging
concepts of nucleolar assembly. Journal of Cell Science, 115: 2265-2270.
Hernandez-Verdun, D. 2004. The nucleolus: functional organization and
assembly. Journal of Applied Biomedicine, 2: 57–69.
105
Hoorn, C.; Guerrero, J.; Sarmiento, G.A.; Lorente, M.A. 1995. Andean
tectonics as a cause for changing drainage patterns in Miocene Northern
South America. Geology, 23: 237–240.
Horvath, J.E.; Bailey, J.A.; Locke, D.P.; Eichler, E.E. 2001. Lessons from the
human genome: transitions between euchromatin and heterochromatin.
Human Molecular Genetics, 10: 2215-2223.
Howell, W.M.; Black, D.A. 1980. Controlled silver-staining of nucleolus
organizer regions with a protective colloidal developer: a 1- step method.
Experientia, 36: 1014–1015.
Irion, G.; Müller, J.; Nunes de Mello, J.; Junk, W.J. 1995. Quaternary geology of
the Amazonian lowland. Geo-Mariner Letters, 15: 172–178.
Jesus, C.M.; Galetti Jr., P.M.; Valentini, S.R.; Moreira-Filho, O. 2003. Molecular
characterization and chromosomal location of two families of satellite DNA in
Prochilodus lineatus (Pisces, Prochilodontidae), a species with B
chromosomes. Genetica, 118: 25-32.
Jinks-Robertson, S.; Sayeed, S.; Murphy, T. 1997. Meiotic crossing over
between nonhomologous chromosomes affects chromosome segregation in
yeast. Genetics, 146: 69-78.
John, B. 1990. Meiosis. Cambridge University Press, Cambridge, USA. 396 pp.
John, B.; King, M. 1982. Meiotic effects of supernumerary heterochromatin in
Heteropternis obscurella. Chromosoma, 85: 39-65.
Junk, W.J.; Furch, K. 1993. A general review of tropical South American
floodplains. Wetlands Ecology and Management, 4: 231-238.
Junk, W.J. 1997. General aspects of floodplain ecology with special reference
to Amazonian floodplains. In: Junk, W.J. (Ed.). The Central Amazon
floodplain: ecology of a pulsing system. Springer-Verlag, Berlin, Alemanha. p.
3-20.
Kazazian, H.H.J.; Moran, J.V. 1998. The impact of L1 retrotransposons on the
humam genome. Nature Genetics, 22: 130.
Kidwell, M.G.; Lisch, D.R. 1997. Transposable elements, parasitic DNA, and
genome evolution. Evolution, 55: 1-24.
106
Kobayashi, T. 2006. Strategies to maintain the stability of the ribosomal RNA
gene repeats – Collaboration of recombination, cohesion, and condensation.
Genes & Genetic Systems, 81: 155-161.
Kobayashi, T. 2008. A new role of the rDNA and nucleolus in the nucleus –
rDNA instability maintains genome integrity. Bioessays, 30: 267-272.
Koh, T.L.; Khoo, G.; Fan, L.Q.; Phang, V.P.E. 1999. Genetic diversity among
wild forms and cultivated varieties of discus (Symphysodon spp.) as revealed
by random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting. Aquaculture,
173: 485-497.
Komiya, H.; Takemura, S. 1979. Nucleotide sequence of 5S ribosomal RNA
from rainbow trout (Salmo gairdnerii) liver. The Journal of Biochemistry, 86:
1067-1080.
Kornfield, I.L. 1984. Descriptive genetics of cichlid fishes. In: Turner, B.J. (Ed)
Evolutionay genetics of fishes. Plenun Press, New York, USA. p. 591-610.
Kornfield, I.L.; Rittle, U.; Richler, C.; Warhman, J. 1979. Biochemical and
cytological differentiation among cichlid fishes of the Sea of Galelee.
Evolution, 33: 1-14.
Kullander, S.O. 1996. Eine weitere übersicht der diskusfiche, gattung
Symphysodon Heckel. Datz Sonderheft, Diskus. p. 10-19.
Kullander, S.O. 1998. A phylogeny and classification of the South America
Cichlidae (Teleostei: Perciformes). In: Malabarba, L.R.; Reis, R.E.; Vari, R.P.;
Lucena, Z.M.S.; Lucena, C.A.S. (Eds). Phylogeny and classification of
neotropical fishes. Editora da Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre,
Brasil. p. 461-498.
Kullander, S.O. 2003. Family Cichlidae. In: Reis, R.E.; Kullander, S.O.; Ferraris,
C.J. (Eds). Check list of the freshwater fishes of South and Central America.
Editora da Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre, Brasil. p. 605-654.
Lanfredi, M.; Congiu, L.; Garrido-Ramos, M.A.; Herrán, L.D.; Leis, M.; Chicca,
M.; Rossi, R.; Tagliavini, J.; Rejón, C.R., Rejón, M.R.; Fontana, F. 2001.
Chromosomal location and evolution of a satellite DNA family in seven
sturgeon species. Chromosome Research, 9: 47-52.
107
Lee, G.M.; Wright, J.E. 1981. Mitotic and meiotic analyses of brook trout,
Salvelinus fontinalis. Journal of Heredity, 72: 321-327.
Levan, A.; Fredga, K.; Sandberg, A.A. 1964. Nomenclature for centromeric
position on chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
Lim, J.K.; Simmons, M.J. 1994. Gross chromosome rearrangements mediated
by transposable elements in Drosophila melanogaster. Bioessays, 16: 269-
275.
Lourenço, L.B.; Recco-Pimentel, S.; Cardoso, A.J. 2000. A second case of
multivalent meiotic configurations in diploid species of Anura. Genetics and
Molecular Biology, 23: 131- 133.
Lucchini, S.; Nardi, I.; Barsacchi, G.; Batistoni, R.; Andronico, F. 1993.
Molecular cytogenetics of the ribosomal (18S + 28S and 5S) DNA loci in
primitive and advanced urodele amphibians. Genome, 36: 762-773.
Lundberg, J.G.; Marshall, L.G.; Guerrero, J.; Horton, B.; Malabarba, C.S.L.;
Wesselingh, F.P. 1998. The stage for Neotropical fish diversification: a
history of tropical South American rivers. In: Malabarba, L.R.; Reis, R.E.;
Vari, R.P.; Lucena, Z.M.S.; Lucena, C.A.S. (Eds). Phylogeny and
Classification of Neotropical Fishes. Editora da Pontifícia Universidade
Católica, Porto Alegre, Brasil. p. 13-48.
Martins, C.; Galetti Jr., P.M. 1999. Chromosomal localization of 5S rDNA genes
in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research, 7:
363-367.
Martins, C.; Galetti Jr., P.M. 2000. Conservative distribution of 5S rDNA loci in
Schizodon (Pisces, Anostomidae) chromosomes. Chromosome Research,
8(4): 353-355.
Martins, C.; Galetti Jr., P.M. 2001. Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish
species: is it a general rule for fishes? Genetica, 111: 439-446.
Martins, C.; Wasko, A.P. 2004. Organization and evolution of 5S ribosomal
DNA in the fish genome. In: Williams, C.R. (Ed). Focus on Genome
Research. Nova Science Publishers, New Hampshire, EUA. p. 335-363.
Martins, C.; Oliveira, C.; Wasko, A.P.; Wrigth, J.M. 2004. Physical mapping of
the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) genome by fluorescent in situ
108
hybridization of repetitive DNAs to metaphase chromosomes—a review. Aquaculture, 231: 37-49.
Martins, C. 2007. Chromosomes and repetitive DNAs: a contribution to the
knowledge of fish genome. In: Pisano, E.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.;
Kapoor, B.G. (Eds) Fish Cytogenetics. Science Publisher, New Hampshire,
EUA. p. 421-453.
Mazerolli, A.I.; Weiss, M. 1995. The state of confusion in discus taxonomy. In:
Konings, A. (Ed.) Cichlids Yearbook. Vol. 5. Cichlid Press, Alemanha. p 77-
83.
Mazzuchelli, J.; Martins, C. 2009. Genomic organization of repetitive DNAs in
the cichlid fish Astronotus ocellatus. Genetica, 136: 461-469.
Mesquita, D.R. 2002. Análise da variabilidade cromossômica do peixe
ornamental acará-disco (Symphysodon discus Heckel, 1980; S.
aequifasciatus Pellegrin, 1904; Cichlidae) do Amazonas. Dissertação,
Universidade Federal de São Carlos/ Fundação Universidade do Amazonas,
Manaus, Brasil. 75 pp.
Mesquita, D.R.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2008. Chromosomal variability in the
wild ornamental species of Symphysodon (Perciformes, Cichlidae) from
Amazon. Neotropical Ichthyology, 6: 181–190.
Mestriner, C.A.; Galetti Jr., P.M.; Valentini, S.R.; Ruiz, I.R.G.; Abel, L.D.S.;
Moreira-Filho, O.; Camacho, J.P.M. 2000. Structural and functional evidence
that a B chromosome in the characid fish Astyanax scabripinnis is an
isochromosome. Heredity, 85: 1-9.
Miller, E.A.; Dev, V.G.; Tantravahi, R.; Miller, O.J. 1976. Supression of human
nucleolus organizer activity in mouse human somatic hybrid cells.
Experimental Cell Research, 101: 235-243.
Mirol, P.M.; Bidau, C.J. 1994. Non-random patterns of non-disjunctional
orientation in trivalents of multiple Robertsonian heterozigotes of Dichroplus
pratensis (Acrididae). Genetica, 92: 155-164.
Molina, W.F. 2001. An alternative method for mitotic stimulation in fish
cytogenetics. Chromosome Science, 5: 149-152.
109
Moore, G. 2002. Meiosis in allopolyploids – the importance of Teflon
chromosomes. Trends in Genetics, 18(9): 456-463.
Moreira-Filho, O.; Bertollo, L.A.C. 1990. Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae): A species complex. Revista Brasileira de Genética, 14: 331-
357.
Moses, M.J. 1977. Synaptonemal complex karyotyping in spermatocytes of the
Chinese hamster (Cricetulus griseus). I. Morphology of the autosomal
complement in spread preparations. Chromosoma, 60: 99-125.
Moses, M.J.; Poorman, P.A.; Roderick, T.H.; Davisson, M.T. 1982.
Synaptonemal complex analysis of mouse chromosomes rearrangements IV.
Synapsis and synaptic adjustment in two paracentric inversions.
Chromosoma, 84: 547-574.
Nakayama, C.M.; Feldberg, E.; Bertollo, L.A.C. 2008. Mapping of ribosomal
genes and chromosomal markers in three species of the genus Serrasalmus
(Characidae, Serrasalminae) from the Amazon basin. Genetics and
Molecular Biology, 31(4): 868-873. Narain, Y.; Fredga, K. 1997. Meiosis and fertility in common shrews, Sorex
araneus, from a chromosomal hybrid zone in central Sweden. Cytogenetics
and Cell Genetics, 78: 253-259.
Nascimento, A.L. 2005. Estudos citogenéticos em peixes das subfamílias
Astronotinae, Geophaginae e Cichlasomatinae (Perciformes, Cichlidae) do
Pará. Dissertação, Universidade Federal do Pará, Amazonas, Brasil. 75 pp.
Ohno, S.; Atkin, N.B. 1966. Comparative DNA values and chromosome
complements of eight species of fishes. Chromosoma, 18: 455-466.
Oliveira, C.; Wright, J.M. 1998. Molecular cytogenetic analysis of
heterochromatin in the chromosomes of tilapia, Oreochromis niloticus
(Teleostei: Cichlidae). Chromosome Research, 6: 205-211.
Olson, M.O.J. 2004. Sensing cellular stress: another new function for the
nucleolus? Science Signal Transduction Knowledge Environment, 224: 1-10.
Orgel, L.E.; Crick, F.H.C. 1980. Selfish DNA: the ultimate parasite. Nature, 284:
604–607.
110
Ozouf-Costaz, C.; Brant, J.; Körting, C.; Pisano, E.; Bonillo, C.; Coutanceau,
J.P.;Volff, J.N. 2004. Genome dynamics and chromosomal localization of the
non-LTR retrotranposon Rex1 and Rex3 in Antarctic fish. Antarctic Science,
16(1): 51-57.
Paxton, J.R.; Eschmeyer, W.N. 1995. Encyclopedia of fishes. Academic Press,
San Diego, EUA. 206 pp.
Pendás, A.M.; Moran, P.; Garcia-Vasquez, E. 1993a. Ribosomal RNA genes
are interspersed throughout a heterochromatic chromosome arm in Atlantic
salmon. Cytogenetics and Cell Genetics, 63: 128–130.
Pendás, A.M.; Moran, P.; Garcia-Vasquez, E. 1993b. Multi-chromosomal
location of ribosomal RNA genes and heterochromatin association in brown
trout. Chromosome Research, 1: 63–67.
Phillips, R.B.; Reed, K.M. 1996. Application of fluorescence in situ hybridization
(FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture, 40: 197-216.
Pikaard, C.S. 2000. The epigenetics of nucleolar dominance. Trends in
Genetics, 16(11): 495-500.
Pinkel, D.; Straume, T.; Gray, J.W. 1986. Cytogenetic analysis using
quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 83: 2934-
2938.
Portela-Castro, A.L.B.; Júlio-Júnior, H.F.; Nishiyama, P.B. 2001. New
occurrence of microchromosomes B in Moenkhausia sanctaefilomenae
(Pisces, Characidae) from the Paraná River of Brazil: analysis of the
synaptonemal complex. Genetica, 114: 277-283.
Ready, J.S.; Ferreira, E.J.G.; Kullander, S.O. 2006. Discus fishes: mitochondrial
DNA evidence for a phylogeographic barrier in the Amazonian genus
Symphysodon (Teleostei: Cichlidae). Journal of Fish Biology, 69: 200-211.
Rodionova, M.I.; Nikitin, S.V.; Borodin, P.M. 1996. Synaptonemal complex
analysis of interspecific hybrids of Poecilia (Teleostei, Poecilidae). Brazilian
Journal of Genetics, 19(2): 231-235.
Rouzic, A.L.; Capy, P. 2005. The first steps of transposable elements invasion:
parasitic strategy vs. genetic drift. Genetics, 169: 1033–1043.
111
Rowell, D.M. 1990. Chromosomal fusion in Delena cancerides Walck
(Araneae: Sparassidae): an alternative to speciation by monobranchial
fusion. Genetica, 80: 139-157.
Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.;
Mullis, K. B.; Erlich, H.A. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of
DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491.
Salvadori, S., Deiana, A.M.; Coluccia, E.; Floridia, G.; Rossi, E.; Zuffardi, O.
1995. Co-localization of (TTAGGG)n telomeric sequences and ribosomal
genes in Atlantic eels. Chromosome Research, 3: 54–58.
Sambrook, J.; Russell, D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA. p.
633–664.
Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A.R. 1977. DNA Sequencing with chain
terminating inhibitors. Proceedings of National Academy of Science, 74:
5463-5467.
Santos, G.M.; Ferreira, E.J.G. 1999. Peixes da Bacia Amazônica. In: Lowe-
McConnel, R.H. (Ed). Estudos ecológicos de comunidades de peixes
tropicais. EDUSP, São Paulo, Brasil. p. 345-373.
Santos, V.H.; Foresti, F.; Oliveira, C.; Almeida-Toledo, L.F.; Toledo-Filho, S.A.;
Bernardino, G. 2002. Synaptonemal complex analysis in the fish species
Piaractus mesopotamicus and Colossoma macropomum, and in their
interspecific hybrid. Caryologia, 55(1): 73-79.
Schmid, M.; Vitelli, L.; Batistoni, R. 1987. Chromosome banding in Amphibia.
IV. Constitutive heterochromatin, nucleolus organizers, 18S+28S and 5S
ribosomal RNA genes in Ascaphidae, Pipidae, Discoglossidae and
Pelobatidae. Chromosoma, 95: 271-284.
Schweizer, D.; Loidl, J. 1987. A model for heterochromatin dispersion and the
evolution of C band patterns. Chromosome Today, 9: 61–74.
Sharp, H.E.; Rowell, D.M. 2007. Unprecedented chromosomal diversity and
behaviour modify linkage patterns and speciation potential: structural
heterozygosity in an Australian spider. Journal Evolutionary Biology, 20(6):
2427-2439.
112
Siljak-Yakovlev, S.; Cerbah, M.; Coulaud, J.; Stoian, V.; Brown, S.C.; Zoldos,
V.; Jelenic, S.; Papes, D. 2002. Nuclear DNA content, base composition,
heterochromatin and rDNA in Picea omorika and Picea abies. Theoretical
and Applied Genetics, 104: 505–512.
Silva, T.; Kotlar, B. 1980. Discus. T.F.H. Publications Inc., Neptune City, EUA.
96 pp.
Silva, C.A.; Lima, R.C.A.; Teixeira, A.S. 2008. Isoenzyme electrophoretic
patterns in discus fish (Symphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904 and
Symphysodon discus Heckel, 1840) from the Central Amazon. Genetics and
Molecular Research, 7(3): 791-805.
Sioli, H. 1990. Amazônia: fundamentos da ecologia da maior região de florestas
tropicais. Editora Vozes, Petrópolis, Brasil. 72 pp.
Siqueira-Jr, S.; Ananias, F.; Recco-Pimentel, S. 2004. Cytogenetics of three
Brazilian species of Eleutherodactylus (Anura, Leptodactylidae) with 22
chromosomes and re-analysis of multiple translocations in E. binotatus.
Genetics and Molecular Biology, 27(3): 363-372.
Skipper, M. 2007. Mysteries of heterochromatic sequences unravelled. Nature
Reviews, 8: 567.
Smith, W.L.; Chakrabarty, P.; Sparks, J.S. 2008. Phylogeny, taxonomy, and
evolution of Neotropical cichlids (Teleostei: Cichlidae: Cichlinae). Cladistics,
24: 625–641.
Smithies, O.; Powers, P.A. 1986. Gene conversions and their relation to
homologous chromosome pairing. Philosophical Transactions of the Royal
Society of London, 312: 291-302.
Stein, J.; Phillips, R.B.; Devlin, R.H. 2001. Identification of the Y chromosome in
chinoock salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Cytogenetics and Cell
Genetics, 92: 108-110.
Stewart, M.N.; Dawson, D.S. 2008. Changing partners: moving from
nonhomologous to homologous centromere pairing in meiosis. Trends in
Genetics, 24(11): 564-573.
113
Stiassny, M.L.1991. Phylogenetic intrarelationships of the family Cichlidae: an
overview. In: Keenleyside, M.H.A. (Ed). Cichlid fishes: behaviour, ecology
and evolution. Chapman and Hall, London, UK. p. 1-35.
Sullivan, G.J.; Bridger, J.M.; Cuthbert, A.P.; Newbold, R.F.; Bickmore, W.A.;
McStay, B. 2001. Human acrocentric chromosomes with transcriptionally
silent nucleolar organizer regions associated with nucleoli. EMBO Journal,
20: 2867-2877.
Sumner, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Experimental Cell Research, 74: 304-306.
Sumner, A.T. 1990. Chromosome banding. Uniwin Hyman, London, UK. 434
pp.
Sumner, A.T. 2003. Chromosomes: organization and function. Blackwell
Publishing, New York, USA. 304 pp.
Takai, A.; Yoshikawa, T.; Ojima, Y. 2002. C-banded karyotype and nucleolus
organizer regions in a discus fish, Symphysodon aequifasciata axelrodi
(Cichlidae, Perciformes). Journal of Chromosome Science, 6: 53-55.
Thode, G.; Martinez, G.; Ruiz, J.L.; Lopéz, J.R. 1988. A complex chromosomal
polymorphism in Gobius fallax (Gobiidae, Perciformes). Genetica, 76: 65-71.
Thompson, J.D.; Higging, D.G.; Gibson, T.J. 1994. ClustalW: Improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position specific gap penalties and matrix choice. Nucleic Acids
Research, 22: 4673-4680.
Thompson, K.W. 1976. Some aspects of chromosomal evolution of the
Cichlidae (Teleostei: Perciformes) with Emphasis on Neotropical forms.
Ph.D. Dissertation. University of Texas at Austin, USA. 132 pp.
Thompson, K.W. 1979. Cytotaxonomy of 41 species of Neotropical Cichlidae.
Copeia, 4: 679-691.
Traut, W.; Clarke, C.A. 1997. Karyotype evolution by chromosome fusion in the
moth genus Orgyia. Hereditas, 126: 77-84.
Varriale, A.; Torelli, G.; Bernardi, G. 2008. Compositional properties and
thermal adaptation of 18S rRNA in vertebrates. RNA, 14: 1492-1500.
114
Venere, P.C.; Ferreira, I.A.; Martins, C.; Galetti Jr., P.M. 2004. A novel ZZ/ZW
sex chromosome system for the genus Leporinus (Pisces, Anostomidae,
Characiformes). Genetica, 121: 75-80.
Vicente, V.E.; Jesus, C.M.; Moreira-Filho, O. 2001. Chromosomal localization of
5S and 18S rRNA genes in three Parodon species (Pisces, Parodontidae).
Caryologia, 54: 365-369.
Villena, F.P.M.; Sapienza, C. 2001. Female meiosis drives karyotypic evolution
in mammals. Genetics, 159: 1179–1189.
Visintin, R.; Amon, A. 2000. The nucleolus: the magician’s hat for cell cycle
tricks. Current Opinion in Cell Biology, 12: 752.
Volff, J.N.; Korting, C.; Sweeney, K.; Schartl, M. 1999. The non-LTR
retrotransposon Rex3 from the fish Xiphophorus is widespread among
teleosts. Molecular Biology and Evolution, 16: 1427–1438.
Volff, J.N.; Korting, C.; Meyer, A.; Schartl, M. 2001. Evolution and discontinuous
distribution of Rex3 retrotransposons in fish. Molecular Biology and
Evolution, 18 (3): 427-431.
Volff, J.N.; Bouneau, L.; Ozouf-Costaz, C.; Fischer, C. 2003. Diversity of
retrotransposable elements in compact pufferfish genomes. Trends in
Genetics, 19: 674-678.
Volff, J.N. 2005. Genome evolution and biodiversity in teleost fish. Heredity, 94:
280–294.
Wasko, A.P.; Galetti Jr., P.M. 2000. Mapping 18S ribosomal genes in fish of the
genus Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization (FISH).
Genetics and Molecular Biology, 23(1): 135-138.
Zhang, F.; Takashi, O.; Takashima, F. 1992. Chromosome synapsis and
recombination during meiotic division in gynogenetic triploid ginbuna,
Carassius auratus langsdorfii. Japanese Journal of Ichthyology, 39(2): 151-
155.