imunobioinformÁtica aplicada ao diagnÓstico de …§ão... · 2018-04-09 · para o controle e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ

CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ANA ALICE MAIA GONÇALVES

IMUNOBIOINFORMÁTICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO DE

Schistosoma mansoni

DIVINÓPOLIS, MG

FEVEREIRO, 2018

ANA ALICE MAIA GONÇALVES

IMUNOBIOINFORMÁTICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO DE

Schistosoma mansoni

Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-

graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal de São João Del-Rei, como requisito

parcial para a obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Alexsandro Sobreira Galdino

Co-Orientador: Prof. Dr. Carlos Chavez Oletégui

DIVINÓPOLIS, MG

FEVEREIRO, 2018

iii

FE

Dedico este trabalho a todos da minha família, que

me apoiaram e estiveram presentes em todos os

momentos, sempre me dando forças para vencer todas as

minhas batalhas!

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por sempre estar comigo, me guiando,

iluminando, protegendo e abençoando. ELE que sempre abriu as portas da minha

vida, me dando forças e sabedoria para enfrentar todos os desafios.

A minha mãe, por ser a pessoa mais batalhadora que conheço. Essa mulher

GIGANTE me ensinou a enfrentar desafios, medos, a ir atrás dos meus sonhos com

todas as garras, porém, sempre mantendo a humildade e os pés no chão. Sempre

sacrificando seus próprios sonhos para me levar até o céu. Um simples “Obrigada

por tudo” está longe de representar minha gratidão.

Aos meus irmãos, Tamires e Wagner, que sempre apoiaram minhas decisões

e me aconselharam nos momentos de indecisões, me dando forças para sempre

batalhar. Muito obrigada! Aos meus familiares, que são a minha base, sempre me

motivando a estudar, entendendo meus momentos de afastamento e vibrando sempre

com cada vitória conquistada.

Ao Prof. Dr. Alexsandro Galdino, por me receber de portas abertas ao LABIOM,

me acolhendo desde o início dessa caminhada. Muito obrigada por todos os

ensinamentos e por todas as palavras de incentivo. Obrigada por ser um orientador

que acompanha todos os nossos passos, que sabe de todas as pontas e vírgulas do

projeto, sempre nos amparando e preocupando com nosso desenvolvimento científico

e, também, com nosso bem-estar.

A Prof.ª Dra. Débora Lopes, pela oportunidade de colaboração e, assim,

realização de parte tão importante deste projeto, contribuindo para meu crescimento

profissional e acadêmico.

A Laís, que me acolheu desde o meu primeiro dia no laboratório. Sempre

disposta a me ajudar, me incentivando, me ajudando e sempre me salvando! Eu não

sei como conseguiria completar esta etapa sem você!! Não tenho palavras para

descrever a minha gratidão a você, obrigada por ser uma amiga dentro e fora do

laboratório.

A Maria Juliana, que foi parte essencial deste trabalho, sempre disposta a me

ensinar, com a maior paciência do mundo, tirando todas as minhas dúvidas e

acrescentando muito em minha vida profissional e pessoal! O meu enorme MUITO

OBRIGADA por fazer esta caminhada ser mais leve e divertida.

v

A Luana, que chegou de mansinho, se tornando parte muito importante desta

jornada! Obrigada pelo seu companheirismo, pela ajuda nas horas do sufoco, pela

ajuda nas horas normais, pelas risadas e tudo mais! Obrigada por tudo!!

Agradeço também a Suliana, Reysla e Juliana por toda a ajuda e

companheirismo, dentro e fora do laboratório, sendo muito importantes para esta

jornada. Muito obrigada por todos os ensinamentos e por toda a ajuda!!

A todos da Equipe LABIOM, pelos momentos de trabalho e descontração

juntos. Vocês são uma família e só tenho que agradecer por poder fazer parte dela!!

Agradeço a todos meus amigos que, de algum modo, fizeram parte desta

jornada, torcendo e me apoiando.

A todos vocês, que fizeram parte desta jornada, muito obrigada!

vi

RESUMO

A esquistossomose, doença causada por trematódeos do gênero Schistosoma, representa um importante problema de saúde pública no mundo. Atinge principalmente países em desenvolvimento, devido às precárias condições de sobrevivência. No Brasil, a infecção por Schistosoma mansoni atinge 19 Estados, destacando-se o de Minas Gerais, onde prevalece em mais da metade de seus municípios. Para o controle e monitoramento eficaz da doença, é primordial a disponibilidade de testes de diagnóstico que sejam sensíveis e específicos. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi a identificação e seleção de novos antígenos, por meio de análises in silico, para a composição de um kit de diagnóstico inovador contra S. mansoni. Com a disponibilidade de informações e propriedades do parasito, contidas em bancos de dados, foi possível triar epítopos com capacidade antigênica, a partir de proteínas hipotéticas do S. mansoni, utilizando ferramentas de bioinformática. A triagem dos epítopos mais promissores, como candidatos a comporem kits de ensaios sorológicos, baseou-se em critérios de seleção, como, a localização celular, afinidade por moléculas HLA de classe II e por BCR, antigenicidade, baixa similaridade com proteínas humanas ou com proteínas de helmintos. Ao final das análises, os cinco melhores epítopos foram selecionados e, a partir deles, foi criada uma proteína multiepitopo recombinante por meio de desenho racional. O gene sintético, que codifica a proteína multiepitopo (denominada rMEBIOSM) foi clonado num vetor pET21a, para posterior inserção em células de Escherichia coli BL21 (λDE3). Entretanto, não foi possível observar a banda correspondente à massa molecular de rMEBIOSM. Isso indica que, mesmo após a modificação de determinadas variáveis do protocolo de expressão, assim como a utilização de cepas diferentes, não houve expressão da proteína. O resultado obtido foi confirmado por meio de purificação de cromatografia de afinidade e Dot-Blot. Tais achados demonstraram que, possivelmente, a E. coli não foi a célula hospedeira adequada para a expressão da proteína, sendo necessária, então, a utilização de outras células hospedeiras para expressar a proteína rMEBIOSM. Palavras Chave: esquistossomose, bioinformática, proteína multiepitopo, diagnóstico.

vii

ABSTRACT

Schistosomiasis, a disease caused by trematodes of the genus Schistosoma, represents a major public health problem in the world. Affects mainly developing countries, due to precarious conditions of survival. In Brazil, Schistosoma mansoni infection affects 19 states, most notably Minas Gerais, where it prevails in more than half of its municipalities. For the control and effective monitoring of the disease, it is essential the availability of diagnostic tests that are sensitive and specific. In this context, the aim of this study was the identification and selection of new antigens, by in silico analysis, for the composition of a novel diagnostic kit against S. mansoni. With the availability of information and properties of the parasite, contained in databases, it was possible to screen antigenic epitopes from hypothetical S. mansoni, proteins using bioinformatics tools. The screening of the most promising epitopes, as candidates to compose serological test kits tests, were based on selection criteria, such as, cellular localization, affinity HLA class II molecules and BCR, antigenicity, low similarity to human or helminth proteins. At the end of the analyzes, the five best epitopes were selected and, from them, a recombinant multiepitope protein was created by rational design. The synthetic gene, encoding the multiepitope protein (termed rMEBIOSM) was cloned into a vector pET21a, for further insertion into Escherichia coli BL21 (λDE3) cells. However, it was not possible to observe the band corresponding to the molecular mass of rMEBIOSM. This indicates that, even after modification of certain variables of the expression protocol, as well as the use of different strains, there was no expression of the protein. The result wasconfirmed by affinity chromatography purification and Dot-Blot. Such findings demonstrated that, possibly, E. coli was not the host cell suitable for protein expression, thus requiring the use of other host cells to express the rMEBIOSM protein.

Key words: schistosomiasis, bioinformatics, multiepitope protein, diagnosis.

viii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16

1.1 ESQUISTOSSOMOSE .................................................................................... 16

1.2 CICLO BIOLÓGICO DO S. mansoni ............................................................... 18

1.3 IMUNOPATOLOGIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS .................................... 19

1.4 CONTROLE E TRATAMENTO ........................................................................ 22

1.4.1 Vacinas ...................................................................................................... 24

1.5 DIAGNÓSTICO ................................................................................................ 26

1.6 BIOINFORMÁTICA .......................................................................................... 34

2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 36

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 38

3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 38

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 38

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 39

4.1 ANÁLISES IN SILICO ...................................................................................... 42

4.1.1 Predição da localização celular.................................................................. 42

4.1.2 Predição de peptídeo sinal ........................................................................ 42

4.1.3 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas ...................... 42

4.1.4 Predição de epítopos com afinidade por moléculas de HLA classe II ....... 43

4.1.5 Predição de epítopos lineares com afinidade pelos receptores de

antígenos de células B........................................................................................ 43

4.1.6 Predição de antigenicidade ........................................................................ 44

4.1.7 Análise de homologia ................................................................................. 44

4.1.8 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do

parasito ............................................................................................................... 44

4.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE . 44

4.3 LINHAGEM BACTERIANA .............................................................................. 45

4.4 PLASMÍDEO .................................................................................................... 46

4.5 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM

PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM ........................................................................ 48

ix

4.6 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM ............................. 49

4.7 ANÁLISE EM GEL SDS-PAGE DA PROTEÍNA rMEBIOSM ........................... 50

4.8 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM .................................................... 50

4.9 DOT-BLOT ....................................................................................................... 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 53

5.1 ANÁLISES IN SILICO ...................................................................................... 53

5.1.1 Obtenção das sequências de proteínas hipotéticas de S. mansoni ........... 53

5.1.2 Predição de localização celular.................................................................. 53

5.1.3 Predição de peptídeo sinal ........................................................................ 55

5.1.4 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas ...................... 56

5.1.5 Predição de epítopos com afinidade por moléculas do HLA classe II ....... 57

5.1.6 Predição de epítopos lineares com afinidade pelo receptor de antígeno de

célula B ............................................................................................................... 59

5.1.7 Predição de antigenicidade ........................................................................ 61

5.1.8 Análise de homologia ................................................................................. 62

5.1.9 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do

parasito ............................................................................................................... 64

5.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE . 65


PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM ........................................................................ 68

5.4 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM E ANÁLISE POR

GEL SDS-PAGE .................................................................................................... 70

5.5 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM E DOT-BLOT .............................. 78

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 82

7 PERSPECTIVAS .................................................................................................... 83

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 84

APÊNDICE .............................................................................................................. 106

ANEXO ................................................................................................................... 109

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição global das espécies de Schistosoma.. ................................... 17

Figura 2: Distribuição geográfica de S. mansoni no Brasil. ...................................... 18

Figura 3: Fluxograma das análises in silico das proteínas ....................................... 40

Figura 4: Fluxograma das análises in vitro da produção da proteína multiepitopo ... 41

Figura 5: Mapa físico do vetor pET21a .................................................................... 47

Figura 6: Mapa da região do polylinker do vetor pET21a ......................................... 47

Figura 7: Predição de localização celular da proteína hipotética Smp_144770 pelo

programa Psort II ....................................................................................................... 54

Figura 8: Predição de peptídeo sinal ........................................................................ 56

Figura 9: Análise da orientação da proteína Smp_179660 na membrana plasmática

pelos programas TMHMM, TMpred e SOSUI ............................................................ 57

Figura 10: Predição de epítopos pelo programa Tepitool da proteína Smp_126900.

.................................................................................................................................. 59

Figura 11: Predição de epítopos com afinidade por BCR ........................................ 61

Figura 12: Predição de antigenicidade realizada pelo programa VaxiJen ................ 62

Figura 13: Predição da expressão das proteínas correspondentes aos epítopos

selecionados nas diferentes fases de vida do parasito ............................................. 64

Figura 14: Desenho da proteína multiepitopo recombinante rMEBIOSM ................. 66

Figura 15: Predição da estrutura da proteína multiepitopo recombinante pelo

programa Phyre2 ....................................................................................................... 67

Figura 16: Ponto isoelétrico teórico e massa molecular da rMEBIOSM ................... 68

xi

Figura 17: Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e

pLysE. ....................................................................................................................... 72

Figura 18: Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e

pLysE do sobrenandante e pellet. ............................................................................. 75

Figura 19: Análise por SDS-PAGE 12% da purificação da cepa pLysS ................... 79

Figura 20: Teste Dot-Blot ......................................................................................... 80

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Cepas e genótipos de Escherichia coli ..................................................... 46

Tabela 2: Epitopos selecionados para comporem a proteína multiepitopo ............... 63

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

aa Aminoácido

APC Células apresentadores de antígenos, do inglês: Antigen-

presenting cells

APS Persulfato de amônio, do inglês: Ammonium persulfate

BCR Receptor de antígeno de célula B, do inglês: B cell antigen

receptor.

ºC Graus Celsius

CAA Antígeno anódico circulante, do inglês: Circulating anodic antigen

CCA Antígeno catódico circulante, do inglês: Circulating cathodic

antigen

cm Centímetros

COPT Teste de precipitina circunoval, do inglês: Circumoval precipitin

test

DNA Ácido Desoxirribonucléico, do inglês: Deoxyribonucleic acid

E. coli Escherichia coli

ELISA Ensaio de absorção imunoenzimático, do inglês: Enzyme linked

immunosorbent assay

GLA-SE Emulsão estável adjuvante glicopiranosil lipídeo, do inglês:

Glucopyranosyl lipid adjuvant stable emulsion

h Horas

H Histidina

His-tag Resíduos de Histidina

xiv

HLA Antígeno leucocitário humano, do inglês: Human leukocyte

antigen

HRP Peroxidase de rabanete, do inglês: Horseradish peroxidase

IFA Ensaio de imunofluorescência indireta, do inglês: Indirect

immunofluorescence assay

IFN- γ Interferon gama

Ig Imunoglobulina

IHT Teste de hemaglutinação indireta, do inglês: Indirect

hemagglutination test

IL Interleucina

IPTG Isopropil-tio-β-galactosídeo

KK Kato-Katz

M Molar

MDA Administração de medicamentos em massa, do inglês: Mass drug

administration

Meio LB Meio Luria-Bertani

mg Miligrama

min Minuto

mL Mililitro

mm Milímetros

mM Milimolar

mRNA RNA mensageiro

Ni-NTA Coluna de afinidade de níquel

nm Nanômetro

OD Densidade Óptica

xv

OXA Oxaminiquina

PBS Tampão salina fosfato

PBS-T-BSA Tampão salina fosfato contendo albumina e polissorbato

PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês: Polymerase chain

reaction

PZQ Praziquantel

pH Potencial hidrogeniônico

pI Ponto isoelétrico

rpm Rotação por minuto

RNA Ácido ribonucleico, do inglês: Ribonucleic acid

SDS Dodecil sulfato de sódio, do inglês: Sodium dodecyl sulfate

SEA Antígeno solúvel do ovo, do inglês: Soluble egg antigen

SWAP Preparação de antígeno solúvel de verme adulto, do inglês:

Soluble adult worm antigen preparation

TF-Test® Teste de três fezes; do inglês: Three fecal test

TEMED Tetrametilelenodiamônio

Th1 Subpopulação de células T auxiliares do tipo 1, do inglês: T

helper cells type 1

Th2 Subpopulação de células T auxiliares do tipo 2, do inglês: T

helper cells type 2

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

tRNA RNA transportador

Tsp Tetraspanina

µg Micrograma

µl Microlitro

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 ESQUISTOSSOMOSE

A esquistossomose é uma doença causada por trematódeos do gênero

Schistosoma (BASCH, 1991; COLLEY; SECOR, 2014). Tem grande relevância clínica

e socioeconômica (AMARAL et al., 2017; WHO, 2013), sendo considerada

negligenciada tanto pelos órgãos públicos como pela indústria farmacêutica,

especialmente porque os países endêmicos são, na sua maioria, subdesenvolvidos

(GRYSEELS, 2012). Das doenças negligenciadas, é considerada a segunda mais

prevalente, estando atrás somente da malária (CHITSULO et al., 2000;

ELMORSHEDY et al., 2016). Trata-se de uma infecção helmíntica que afeta humanos

com grande impacto social, apresentando altas taxas de morbidade e mortalidade

global, o que a torna um grave problema de saúde pública (OLIVEIRA et al., 2016b;

VAN DER WERF et al., 2003).

A distribuição geográfica das espécies do parasito abrange 78 países,

infectando mais de 240 milhões de pessoas e, aproximadamente, 800 milhões vivem

em áreas de risco (WEERAKOON et al., 2015). Tem prevalência em áreas tropicais e

subtropicais, especialmente em áreas pobres e rurais, onde as condições de

saneamento e qualidade de vida são precárias (DA MARTINS et al., 2015). Em 2016,

pelo menos 206,5 milhões de pessoas necessitaram de tratamento preventivo, dos

quais mais de 88 milhões receberam tratamento (“WHO | Schistosomiasis”, 2017).

Dentre as espécies existentes, seis estão envolvidas na infecção de humanos:

Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum, S. mekongi, S. intercalatum e

S. guineensi (COLLEY et al., 2014). Três destas são consideradas mais importantes:

S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium, sendo que S. mansoni tem a maior

distribuição geográfica dentre elas (GRYSEELS et al., 2006; WANG; DA’DARA;

SKELLY, 2017). A distribuição global das espécies está representada na Figura 1.

17

Figura 1: Distribuição global das espécies de Schistosoma.

Fonte: (COLLEY et al., 2014).

O S. mansoni é a única espécie encontrada na América Latina (WEERAKOON

et al., 2015), estando presente também na África, Oriente Médio, Caribe e América

Latina (“WHO | Schistosomiasis”, 2017). No Brasil, as áreas endêmicas e focais

abrangem 19 Unidades Federadas, sendo que as áreas endêmicas compreendem os

Estados de Alagoas, Bahia, Pernambuco, Rio Grande do Norte (faixa litorânea),

Paraíba, Sergipe, Espírito Santo e Minas Gerais (predominantemente no Norte e

Nordeste do Estado). As áreas focais compreendem os Estados do Pará, Maranhão,

Piauí, Ceará, Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina, Paraná, Rio Grande do Sul,

Goiás e no Distrito Federal (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). É estimado que,

atualmente, seis milhões de pessoas estão infectadas e 25 milhões vivem em áreas

de risco de contrair a esquistossomose no país (ESPÍRITO-SANTO et al., 2015). O

Estado de Minas Gerais é considerado de grande importância epidemiológica para a

infecção no Brasil, visto que esta doença apresenta prevalência em cerca de 61% dos

seus municípios (DRUMMOND et al., 2010; FERREIRA et al., 2017), com mais de 10

milhões de pessoas vivendo em áreas endêmicas (DE CARVALHO et al., 2012;

DRUMMOND et al., 2010) . A Figura 2 representa a distribuição geográfica de S.

mansoni no Brasil.

18

Figura 2: Distribuição geográfica de S. mansoni no Brasil.

Fonte: (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

1.2 CICLO BIOLÓGICO DO S. mansoni

O S. mansoni tem um ciclo biológico complexo, envolvendo a fase de

reprodução assexuada no hospedeiro intermediário (caramujos do gênero

Biomphalaria) (CRISCIONE et al., 2009) e a fase de reprodução sexuada no

hospedeiro definitivo (homem e pequenos mamíferos) (BOROS, 1989; PEARCE;

MACDONALD, 2002).

O ciclo de vida se inicia quando os ovos eliminados junto às fezes de pessoas

infectadas entram em contato com a água (CARVALHO, 2016; PAN, 1965), eclodindo

e liberando miracídios, que são guiados por estímulos químicos e luminosos para

penetrar no hospedeiro intermediário (GRYSEELS et al., 2006). Uma vez no

hospedeiro intermediário, os miracídios dão origem à esporocistos primários e, após

14 dias de penetração, a esporocistos secundários. Estes sofrem modificações

anatômicas, iniciando a proliferação de células germinativas e, então, a formação de

19

cercárias. A formação completa das cercárias ocorre entre 27 a 30 dias após a

penetração dos miracídios (CARVALHO, 2016; PAN, 1965). As cercárias deixam o

hospedeiro intermediário entre 4 a 6 semanas após a infecção e nadam na água por

até 72h em busca do hospedeiro definitivo. A liberação da cercária é provocada pela

claridade e ocorre principalmente durante o dia (GRYSEELS et al., 2006).

As cercárias penetram na pele ou mucosa do hospedeiro definitivo e dão início

a fase sexuada do ciclo, sendo que a penetração é realizada por atividade mecânica

e por liberação de enzimas proteolíticas cercarianas (JAMIESON, 2016). A penetração

das cercárias leva a alterações morfofisiológicas, causadas pelas mudanças de

osmolaridade e temperatura, transformando-as em esquistossômulos (CARVALHO,

2016; STIREWALT, 1974). Estes saem da derme e vão para os pulmões através da

corrente sanguínea, onde sofrem a fase de alongamento. Após esta fase, eles caem

novamente na corrente sanguínea e chegam até as veias do sistema porta-hepático,

onde ocorre a maturação e acasalamento (CRABTREE; WILSON, 1986; KRAUTZ-

PETERSON et al., 2009; WILSON et al., 1978).

Os vermes adultos medem entre 1 a 2 centímetros (cm) de comprimento e 0,3

a 0,6 mm de largura (LAMBERTUCCI, 2010; VALE et al., 2012); são dióicos com corpo

cilíndrico, apresentando duas ventosas, tegumento complexo, trato digestivo cego e

órgãos de reprodução (JAMIESON, 2016). O macho possui um canal ginecóforo, no

qual a fêmea se aloja (LAMBERTUCCI, 2010; VALE et al., 2012) e, quando

acasalados, migram pela corrente sanguínea até as veias mesentéricas, onde as

fêmeas iniciam a oviposição (KRAUTZ-PETERSON et al., 2009).

A produção de ovos se inicia no período entre 5 a 7 semanas após a infecção,

onde são eliminados juntos às fezes, dando continuidade ao ciclo (COLLEY et al.,

2014). Porém, pode acontecer de alguns ovos serem transportados pela circulação

sanguínea para outros órgãos, e provocarem uma reação inflamatória granulomatosa

em torno da região onde ficam retidos (CARVALHO, 2016).

1.3 IMUNOPATOLOGIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

A esquistossomose pode levar a diferentes manifestações, tendo como fatores

importantes para o seu desenvolvimento clínico a localização do parasito, a carga

20

parasitária e a resposta imune do hospedeiro frente aos antígenos do S. mansoni

(BOROS, 1989; CARVALHO, 2016; TORRES, 1976). Pode ser classificada como

aguda, tendo característica assintomática em indivíduos localizados em áreas

endêmicas e sintomáticas para indivíduos de áreas não endêmicas, ou crônica (ROSS

et al., 2013; WEERAKOON et al., 2015).

A fase aguda representa a fase inicial da doença, caracterizada pela resposta

imune do hospedeiro frente à penetração da cercária, aos esquistossômulos, vermes

adultos, produção e liberação de ovos (ROSS et al., 2007; WEERAKOON et al., 2015).

A primeira manifestação clínica frente à infecção é a dermatite cercariana, mediada

pela resposta imunológica com produção de Imunoglobulinas E (IgE) (BURKE et al.,

2009; CALDAS et al., 2008; GRYSEELS et al., 2006; ROSS et al., 2007, 2002). A

dermatite é causada pela penetração percutânea das cercárias, provocando urticárias

temporárias que podem persistir por dias, como lesões pápulas pruriginosas,

ocorrendo principalmente após infecções primárias (BOTTIEAU et al., 2006;

GRYSEELS et al., 2006). A resposta inicial à doença é desenvolvida pelo sistema

imune inato, seguida em poucos dias por uma resposta imune adaptativa CD4+ T-

helper tipo 1 (Th1) (BARSOUM; ESMAT; EL-BAZ, 2013; ROSS et al., 2007). Este tipo

de resposta é mediada pela produção de citocinas pro-inflamatórias, como

interleucina-2 (IL-2), interferon-γ (IFN-γ), fator de necrose tumoral- α (TNF-α)

(CHIARAMONTE et al., 1999; LAMBERTUCCI, 2010), IL-1 e IL-6 (BARTLEY et al.,

2006; BURKE et al., 2009; OSWALD et al., 2001; PEARCE; MACDONALD, 2002;

WILSON et al., 2007; WYNN et al., 2004).

As manifestações clínicas na fase aguda podem incluir febre, fadiga, mialgia,

mal-estar, eosinofilia e infiltrados irregulares no peito visualizados por radiografia

(GRYSEELS et al., 2006). Além disso, pode levar a complicações mais graves,

comprometendo funções respiratórias e causando tosse, dispneia e dor torácica;

comprometimento com funções digestivas, levando a dor abdominal, diarreia, perda

de peso e hepatoesplenomegalia pode ser observado em situações mais graves

(JAURÉGUIBERRY; PARIS; CAUMES, 2010).

A infecção crônica é causada pela retenção dos ovos durante a migração pela

corrente sanguínea. Uma vez na circulação, os ovos não eliminados pelas fezes

podem atingir e se alocarem em certos órgãos e tecidos como baço, fígado, pulmão e

sistema cerebrospinal (CHEEVER; HOFFMANN; WYNN, 2000; GRYSEELS et al.,

2006). Nesta fase, a resposta é mediada por células do tipo Th2, havendo, então, uma

21

mudança de perfil imunológico frente à infecção. As células inflamatórias são

progressivamente eliminadas, sendo substituídas por fibroblastos (BARSOUM;

ESMAT; EL-BAZ, 2013). A resposta do tipo Th2 suprime a resposta pró-inflamatória

Th1 e surge com a deposição de ovos, produzindo várias citocinas, como IL-4, IL-5,

IL-10 e IL-13 (CHIARAMONTE et al., 1999; LAMBERTUCCI, 2010). Em decorrência

disso, pode-se observar uma reação inflamatória eosinofílica e granulomatosa, sendo

substituídas progressivamente por depósitos fibrosos, em resposta a enzimas

proteolíticas secretadas pelos ovos retidos (CHEEVER; HOFFMANN; WYNN, 2000;

GRYSEELS et al., 2006). A inabilidade do hospedeiro de produzir uma resposta imune

do tipo Th2 para regular a resposta pró-inflamatória inicial pode ser fatal

(CHIARAMONTE et al., 1999; LAMBERTUCCI, 2010).

Apesar dos granulomas protegerem os tecidos do hospedeiro ao isolar as

toxinas secretadas pelos ovos, eles são os responsáveis pela patogênese da doença,

causando inflamação grave, eosonofilia, deposição de colágeno, fibrose e hipertensão

portal (AMARAL et al., 2017; HAMS; AVIELLO; FALLON, 2013; WILSON et al., 2007).

No fígado, como consequência, os granulomas podem levar à fibrose grave,

interrompendo o fluxo sanguíneo e causando hipertensão portal (AMARAL et al.,

2017; GRYSEELS et al., 2006; ROSS et al., 2002), esplenomegalia, circulação venosa

coleteral, desvio portacaval e varizes gastrointestinais (CHEEVER, 1968; GRYSEELS

et al., 2006; GRYSEELS; POLDERMAN, 1987; KARDORFF et al., 1996). O

sangramento de varizes gastroesofágicas é a complicação mais grave e

frequentemente fatal da fibrose hepática causada por S. mansoni (GRYSEELS et al.,

2006).

Da mesma forma, no intestino, os granulomas podem causar hiperplasia da

mucosa, polipose, ulceração e formação de abscessos (GRYSEELS et al., 2006;

MOHAMED; AL KARAWI; YASAWY, 1990), sendo que a maior parte das lesões estão

situadas, principalmente, no intestino grosso e reto (GRYSEELS et al., 2006).

Adicionalmente, a deposição de ovos pode acontecer em órgãos atípicos.

A esquistossomose pulmonar é devido a deposição de ovos nos capilares

perialveolares pulmonares, originando sintomas brônquicos e posteriormente,

hipertensão pulmonar, causada por complicação devido à fibrose (GRYSEELS et al.,

2006).

A neuroesquistossomose é devido à deposição de ovos no sistema nervoso

central, sendo que S. mansoni afeta principalmente a medula espinhal (PITTELLA;

22

LANA-PEIXOTO, 1981; VALE et al., 2012). É a síndrome clínica mais grave, tendo

como sintomas dor lombar, dor radicular dos membros inferiores, fraqueza muscular,

perda sensorial e disfunção da bexiga (BARSOUM; ESMAT; EL-BAZ, 2013).

A resposta imune contra antígenos liberados pelo ovo tem intensidade máxima

no início da infecção, declinando durante o tempo da infecção. A resposta inflamatória

granulomatosa tem pico 8 a 10 semanas após a infecção, ocorrendo uma modulação

negativa por volta da 12ª semana após a exposição ao parasito, com declínio também

das citocinas. Porém, a fibrose é acumulativa e, na maioria das vezes, irreversível

(BOROS, 1989; NASCIMENTO-CARVALHO; MORENO-CARVALHO, 2005).

1.4 CONTROLE E TRATAMENTO

As medidas preventivas para o controle da doença, atualmente, envolvem

melhoria do saneamento, modificações ambientais para reduzir a exposição ao

hospedeiro intermediário e liberação de cercarias e educação para reduzir o contato

de água não-tratada. Além disso, a transmissão da esquistossomose pode ser contida

pela administração de medicamentos em massa (MDA, do inglês: Mass Drug

Administration) para quimioterapia em grupos de risco e de indivíduos infectados

(ELBAZ; ESMAT, 2013; MCCARTHY et al., 2012). Dessa forma, torna-se possível

conduzir a redução da prevalência, mortalidade e morbidade (CARVALHO, 2016).

Apesar das medidas de controle existentes, o controle da doença em países

endêmicos é um dos maiores problemas enfrentado pela saúde pública. Alguns

fatores são responsáveis por dificultarem a erradicação da esquistossomose, nestas

áreas, como a ampla disseminação dos hospedeiros intermediários e a capacidade

de conseguir escapar de pesticidas usados no controle de moluscos, o alto custo com

implementação de condições sanitárias ideais e suprimento de água potável, o contato

constante da população rural com água não tratada, o longo prazo que é preciso para

a educação sanitária e o tempo necessário para a população aderir aos programas de

controle. Além disso, o tratamento individual ou em massa tem sido eficiente para

controlar a morbidade, porém não consegue reduzir a prevalência devido às

constantes reinfecções, além de não haver vacinas disponíveis para prevenir a

doença (COURA; AMARAL, 2004).

23

Na década de 70, surgiram duas drogas para o tratamento da doença:

oxaminiquina (OXA) e praziquantel (PZQ). Ambas mostraram alta taxa de cura e baixa

toxicidade. Estas drogas se mostraram efetivas em controlar a morbidade ao reduzir

a carga parasitária, e a taxa de reinfecção, quando usadas repetidamente em áreas

endêmicas (BINA; PRATA, 1980; COURA et al., 1992; COURA; AMARAL, 2004;

COURA; COURA, 1980; KATZ; ROCHA; PEREIRA, 1980; PRATA et al., 1980).

Porém, somente a terapia não é capaz de impedir a transmissão, uma vez que

interrupção do tratamento leva à reversão da susceptibilidade ao parasito (COURA;

AMARAL, 2004; COURA; MENDONÇA; MADRUGA, 1987).

O PZQ atualmente é o fármaco utilizado para o tratamento da

esquistossomose, conferindo uma taxa de cura entre 60 a 90% (CIOLI et al., 2012;

ELBAZ; ESMAT, 2013). Apresenta algumas vantagens em relação à OXA,

apresentando baixo custo, baixa toxicidade, boa estabilidade e é eficaz contra todas

as espécies de Schistosoma (DOENHOFF; CIOLI; UTZINGER, 2008). A importância

da última característica é percebida principalmente em áreas em que há prevalência

de mais de uma espécie de Schistosoma, como na África. Mesmo quando o fármaco

não consegue curar totalmente, há drástica redução no número de ovos eliminados,

diminuindo assim os sintomas da fase crônica da doença (CIOLI et al., 2012; ELBAZ;

ESMAT, 2013).

Apesar das vantagens, há pontos negativos em relação ao fármaco. O PZQ

não tem eficácia contra formas imaturas do parasito, sendo aparentemente eficaz nos

primeiros dias da infecção, com subsequente queda da eficácia por volta da quarta

semana, reestabelecendo sua eficiência terapêutica após a sétima semana da

infecção (ELBAZ; ESMAT, 2013; PAVLIN; KOZARSKY; CETRON, 2012; PÉREZ DEL

VILLAR et al., 2012). Além disso, o PZQ tem sua eficácia reduzida em indivíduos de

áreas endêmicas devido às constantes reinfecções, sendo causadas pelo

aparecimento de variantes genéticas de S. mansoni tolerantes ao fármaco

(BOURGUINAT et al., 2007; CRELLEN et al., 2016; NORTON et al., 2010; WEBSTER

et al., 2014; WOLSTENHOLME et al., 2004).

Na Assembléia Geral das Nações Unidas realizada em 2015, foi proposto um

plano de ação que tem como meta mundial erradicar as doenças tropicais

negligenciadas até 2030, dentre estas, está incluída a esquistossomose mansônica.

Sendo assim, um diagnóstico eficaz, de alta sensibilidade e especificidade, faz-se

necessário para possibilitar a detecção da doença na fase inicial e também para

24

avaliar a cura após o tratamento, tornando-se de extrema importância para o controle

da doença (BERHE et al., 2004; CARVALHO, 2016).

1.4.1 Vacinas

Uma das alternativas mais eficazes de controle para várias doenças, incluindo

a esquistossomose, é por meio da utilização de vacinas. A vacina ideal é capaz de

induzir uma resposta imune igual ou melhor do que a produzida pela infecção natural.

Como resultado, o indivíduo pode obter uma imunidade a longo prazo contra o

patógeno, evitando a trasmissão da doença e contribuindo para o controle e

erradicação da doença (COZZI; SCARSELLI; FERLENGHI, 2013; LILJEROOS et al.,

2015).

Apesar da terapia com o PZQ estar desempenhando um papel importante no

controle e prevenção da esquistossomose, a não prevenção de reinfecção e o

surgimento de parasitos resistentes à droga dificultam a contenção da doença (CIOLI

et al., 2014; TEBEJE et al., 2016). Neste contexto, uma vacina seria o componente

chave na abordagem de controle e eliminação da esquistossomose (TEBEJE et al.,

2016). Um estado imune contra S. mansoni pode ser alcançado pela integração de

mecanismos humorais e celulares, baseado na produção de mediadores celulares do

tipo Th1 e Th2 específicos contra o antígeno, de forma a alcançar uma relação

favorável entre os níveis de IgE e IgG4 (BARSOUM; ESMAT; EL-BAZ, 2013;

MCMANUS; LOUKAS, 2008).

O S. mansoni possui ciclo de vida complexo e evoluiu para viver durante

décadas no hospedeiro (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015; GRYSEELS, 2012),

possuindo estratégias intrigantes para evadir o sistema imunológico do indivíduo

infectado (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015; JENKINS et al., 2005). Considerando

isto, torna-se uma tarefa difícil desenvolver uma vacina efetiva contra este parasito.

Porém, acredita-se que uma redução parcial da carga parasitária pode ter impacto no

controle e erradicação da doença (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015), tendo

redução na quantidade de ovos que são depositados em tecidos e que são

excretados, diminuindo assim a patogenicidade e transmissão da doença

(MERRIFIELD et al., 2016).

As vacinas tradicionais são elaboradas isolando e purificando partes

antigênicas de um patógeno, que normalmente é morto por calor ou quimicamente

25

inativado (OLIVEIRA et al., 2016a; SOUZA et al.,1987). A vacina contendo cercária

de S. mansoni irradiada demonstrou proteção em vários mamíferos (FUKUSHIGE et

al., 2015; MCMANUS; LOUKAS, 2008; TEBEJE et al., 2016), com potencial de atingir

proteção de 78% em uma única dose de vacinação (FUKUSHIGE et al., 2015;

TEBEJE et al., 2016), porém apresenta um alto risco de infecção durante a imunização

nos indivíduos imunizados (OLIVEIRA et al., 2016a; SOUZA et al.,1987).

Há três antígenos vacinais em fase de testes clínicos humanos: Sm14 (

proteína ligadora de ácido graxo de S. mansoni), Sm-TSP-2 (tetraspanina 2 de S.

mansoni) e Sh28GST (glutationa S-transferase de S. haematobium). A Sm-p80,

também está sendo estudada contra a esquistossomose, em fase pré-clínica

(MERRIFIELD et al., 2016; TEBEJE et al., 2016).

Os parasitos usam proteínas ligadoras de ácidos graxo para absorver,

transportar e compartimentar ácidos graxos do hospedeiro, pois eles não possuem

uma vida dependente de oxigênio para a síntese de esteróis e ácidos graxos. Devido

ao seu papel biológico crítico, a Sm14 tem sido considerada uma potencial candidata

para vacina (TEBEJE et al., 2016; TENDLER; SIMPSON, 2008). Quando testada na

forma recombinante sem uso de adjuvante apresentou 67% de proteção em termos

contra S. mansoni em modelo murino (TEBEJE et al., 2016; TENDLER et al., 1996).

Quando testada em preparação concomitante ao adjuvante glicopiranosil lipídeo

(GLA-SE, do inglês: glucopyranosyl lipid adjuvant stable emulsion) concluiu com

sucesso a fase clínica 1, em voluntários saudáveis no Brasil, sendo confirmada como

segura e imunogênica (SANTINI-OLIVEIRA et al., 2016). A fase clínica 2 está em

andamento, sendo realizados testes com a Sm14 em áreas endêmicas do Brasil e

África (TEBEJE et al., 2016; TENDLER; ALMEIDA; SIMPSON, 2015).

As Tetraspaninas (Tsp) são um grupo de proteínas imensamente expressas no

tegumento do esquistossoma, o que sugere maior vulnerabilidade ao sistema

imunológico do hospedeiro (BRASCHI; BORGES; WILSON, 2006; TEBEJE et al.,

2016). A importância das tetraspaninas para a sobrevivência do parasito foi

recentemente demonstrada. O silenciamento da transcrição de Tsp-1 e Tsp-2 (as duas

principais tetraspaninas) resultou em redução significativa no número de vermes que

conseguem atingir a maturidade no hospedeiro definitivo (FONSECA; OLIVEIRA;

ALVES, 2015; TRAN et al., 2010). Estudos pré-clínicos em modelo murino da vacina

com Tsp-2 mostraram uma grande redução da carga parasitária e está atualmente em

fase clínica 1 (CHENG et al., 2013; CURTI et al., 2013; MERRIFIELD et al., 2016).

26

A Sh28GST é uma enzima envolvida no metabolismo de ácidos graxos e

síntese de prostaglandina D2 (TEBEJE et al., 2016), e na proteção do parasito contra

compostos tóxicos, ajudando o parasito a escapar do sistema imune do hospedeiro

(MIELE et al., 2004). A vacina recombinante de Sh28GST foi a primeira vacina contra

esquistossomose a entrar em fase clínica (RICCIARDI; NDAO, 2015), sendo que as

fases clínicas 1 e 2 foram seguras para a saúde de adultos e crianças (MO et al.,

2014;TEBEJE et al.,2016). A fase clínica 3 foi realizada em 2012, sendo avaliada se

a coadministração da vacina em questão e o PZQ poderiam atrasar o reaparecimento

da doença de S. haematobium em crianças infectadas, porém os resultados ainda não

foram divulgados (MERRIFIELD et al., 2016; TEBEJE et al., 2016).

A Calpaína é uma protease de cisteína neutra ativada com cálcio (MCMANUS;

LOUKAS, 2008; TEBEJE et al., 2016) e tem um papel importante na evasão imune,

estando envolvida na reciclagem/renovação de proteínas de superfície do parasito,

um signifcativo mecanismo de escape imunológico como proteção do parasito contra

as defesas do hospedeiro (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015; SILVA; CLARKE;

PODESTA, 1993). A vacina com Sm-p80, a subunidade grande da calpaína de S.

mansoni, apresentou 49% de redução da carga parasitária junto com o ajduvante

resiquimod, em modelo murino (AHMAD et al., 2010; TEBEJE et al., 2016). Utilizando

o adjuvante oligodesoxinucleotídeo, foi possível atingir 70% de redução da carga

parasitária e 75% da redução de ovos, in vivo (AHMAD et al., 2009b; TEBEJE et al.,

2016). Quando testada como vacina de DNA, em modelo animal, a Sm-p80 alcançou

59% de redução da carga parasitária e 84% da redução de ovos (AHMAD et al.,

2009a; TEBEJE et al., 2016).

1.5 DIAGNÓSTICO

Métodos que possibilitem o diagnóstico preciso de infecções são um pré-

requisito para o controle eficiente da doença. Além disso, com o grande número de

pessoas infectadas mundialmente por esquistossomose, é imprescindível o uso de

um diagnóstico eficaz para a detecção da doença, o que permite o acesso rápido de

tratamento ideal e preciso, além de ajudar a reduzir as taxas de transmissão do

parasito (HAMILTON; KLINKERT; DOENHOFF, 1998).

27

Atualmente, os métodos de diagnóstico podem ser divididos em diretos ou

indiretos, e também, qualitativos ou quantitativos. Os métodos diretos permitem a

detecção do parasito propriamente dito ou fases detectáveis, como ovos, substâncias

antigênicas ou vestígios moleculares. Os métodos indiretos propiciam a detecção de

antígenos do parasito ou a detecção de anticorpos específicos no soro do hospedeiro

(CARVALHO, 2016; RABELLO, 1990). Os métodos qualitativos possibilitam somente

a detecção da existência do parasito, enquanto que os métodos quantitativos

permitem a detecção da carga parasitária e/ou resposta imunológica do indivíduo

infectado, permitindo estabelecer indicadores epidemiológicos para programas de

controle (CARVALHO, 2016).

A detecção de ovos nas fezes é o método tradicional para o diagóstico direto

de esquistossomose, tendo como característica principal a sua especificidade

(HAMILTON; KLINKERT; DOENHOFF, 1998). Os principais testes parasitológicos

utilizados atualmente são o de sedimentação espontânea (CARVALHO, 2016;

HOFFMAN; PONS; JANER, 1934), a técnica de centrifugação com formol e acetato

de etila (TF-Test®- Teste de três fezes; do inglês: Three fecal test) (CARVALHO, 2016;

GOMES et al., 2004) e a técnica de Kato-Katz (KK) (CARVALHO, 2016; KATZ;

CHAVES; PELLEGRINO, 1972).

A técnica de sedimentação espontânea possibilita a identifcação dos ovos e a

diferenciação em ovos viáveis ou não. É um ótimo método qualitativo, porém não

permite a quantificação da intensidade da infecção medida pela contagem de ovos

encontrados na amostra analisada (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). A técnica de

TF-Test® é composta por três amostras fecais coletadas em dias alternados e unidas

por meio de concentração do sedimento por centrifugação rápida. As amostras são

duplamente filtradas, transferidas para uma solução conservadora (formalina 10%) e

seguidamente examinadas por microscopia óptica (CARVALHO, 2016).

O método parasitológico recomendado pela Organização Mundial de Saúde é

a técnica KK (WHO, 1993). A técnica utiliza um cartão com orifício central de 6 mm,

para medir a quantidade de fezes a ser examinada (≅43,7 mg). As fezes obtidas são

transferidas para uma lâmina de vidro e cobertas por lamínula de celofane, sendo

possível a visualização dos ovos pelo exame microscópico (KATZ; CHAVES;

PELLEGRINO, 1972). O método apresenta um alto nível de especificidade, é simples,

menos laborioso do que muitas outras metodologias, tem baixo custo e pode ser

facilmente utilizado em campo (WEERAKOON et al., 2015). Este método

28

parasitológico providencia uma sensibilidade tolerável para pacientes de áreas

endêmicas (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; HINZ et al., 2017). Em contrapartida, a

sensibilidade é baixa para indivíduos infectados que vivem em áreas não endêmicas,

assim como para indivíduos em fase aguda ou com baixo nível de infecção (COLLEY

et al., 2014; HINZ et al., 2017; WAMI et al., 2014), como, por exemplo, turistas que

retornam de áreas endêmicas (GRENFELL et al., 2013c; HINZ et al., 2017; VAN

MEENSEL et al., 2014). As desvantagens deste método estão relacionadas ao

número de ovos presentes nas fezes de indíviduos com baixa carga parasitária,

variações diárias de oviposição e apenas uma pequena quantidade da amostra de

fezes é examinada em uma única lâmina de KK (KONGS et al., 2001; SIQUEIRA et

al., 2015). Tais questões subestimam a real prevalência da doença, principalmente

em áreas de baixa transmissão (ENK et al., 2008; SIQUEIRA et al., 2015). A presença

de ovos nas fezes tem maior variação em diferentes dias do que em diferentes lâminas

da mesma amostra, indicando que um maior número de exame de diferentes amostras

seria o ideal para avaliar com maior precisão a prevalência da doença (SIQUEIRA et

al., 2015; UTZINGER et al., 2001). A sensibilidade do método pode ser melhorada

utilizando várias amostras durante vários dias consecutivos, porém esta abordagem

pode comprometer a simplicidade e custo-efetividade do teste, além de induzir à

relutância dos indivíduos para fornecerem mais de uma amostra de fezes, o que

limitaria o trabalho dos profissionais de saúde (ENGELS; SINZINKAYO; GRYSEELS,

1996; WEERAKOON et al., 2015).

Há outros métodos diretos de detecção, como a técnica de eclosão de

miracídios, biópsia retal e biópsia hepática. A técnica de eclosão de miracídios é

baseada em colocar a amostra de fezes em recipiente próprio transparente, contendo

água morna e expor este recipiente à luz solar ou artificial. Depois de algum tempo, é

possível visualizar a olho nu ou com uma lupa os miracídios que sairam dos ovos,

caso haja. A biópsia retal fundamenta-se na retirada e examinação de fragmentos da

mucosa retal, permitindo a detecção de ovos em seus diferentes estágios evolutivos.

A biópsia hepática consiste na realização de exame de fragmento do fígado, obtido

cirurgicamente ou por meio de punção. A confirmação da infecção é realizada pela

presença de ovos ou granulomas. Esta biópsia só é realizada quando a doença se

apresenta clinicamente grave ou quando não foi possível confirmar a infecção por

outros métodos de diagnóstico e, também, para diferenciar de outras hepatopatias

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

29

Embora as técnicas apresentadas mostrem-se bastante eficientes e simples,

geralmente são inadequadas para o diagnóstico da infecção recente, quando ainda

não há produção de ovos, e também quando a oviposição é limitada (ABDEL-

HAFEEZ et al., 2015; PONTES; DIAS-NETO; RABELLO, 2002). Métodos moleculares

(ABDEL-HAFEEZ et al., 2015) e sorológicos (HINZ et al., 2017) são alternativas

promissoras para o diagnóstico da infecção.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês: Polymerase chain

reaction) é um método molecular útil para a detecção de baixa carga parasitária e é

altamente sensível para o diagnóstico de doenças infecciosas (SIQUEIRA et al.,

2015). A PCR convencional amplifica um segmento específico de gene e trata-se de

uma técnica que permite detectar ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês:

Deoxyribonucleic acid) do parasito em fezes (GORDON et al., 2012; PONTES et al.,

2003; WEERAKOON et al., 2015). Baseado no princípio molecular do método de

detecção, a amplificação do DNA ou do ácido ribonucléico (RNA, do inglês:

Ribonucleic acid) do parasito por PCR é um complemento promissor para o

diagnóstico preciso da esquistossomose. Além disso, avanços recentes incluem

detecção de DNA de ovo, DNA circulante sem parasito celular (provenientes de

esquistossômulos mortos, perda de tegumentos dos vermes ou desintegração de ovos

inativos) e microRNAs circulantes (WEERAKOON et al., 2015).

A PCR-ELISA é uma alternativa de diagnóstico que permite a detecção de DNA

de S. mansoni em fezes de indivíduos com baixa infecção, permitindo a detecção de

DNA amplificado por PCR utilizando uma plataforma de Ensaio de absorção

imunoenzimático (ELISA, do inglês: Enzyme linked immunosorbent assay) (GOMES

et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2015).

Apesar dos métodos moleculares apresentarem alta sensibilidade e

especificidade, possuem alto custo e requerem equipamentos caros para sua

realização (HUSSEIN et al., 2012), além de ser necessário um alto conhecimento para

a realização da técnica, fatos que podem dificultar o acesso a este tipo de diagnóstico

(WEERAKOON et al., 2015).

Testes sorológicos são especialmente úteis para a vigilância da doença e

triagem preliminar em áreas não endêmicas (DOENHOFF; CHIODINI; HAMILTON,

2004; WANG; UTZINGER; ZHOU, 2008; WEERAKOON et al., 2015; WU; HALIM,

2000), onde a baixa sensibilidade dos testes parasitológicos possa levar a resultados

falso-negativos de indivíduos infectados (ALARCÓN DE NOYA et al., 2007;

30

WEERAKOON et al., 2015). Testes para detecção de antígenos e anticorpos, como

teste de precipitina circunoval (COPT, do inglês: Circumoval precipitin test), teste de

hemaglutinação indireta (IHT, do inglês: Indirect hemagglutination test), ensaio de

imunofluorescência indireta (IFA, do inglês: Indirect immunofluorescence assay) e

ELISA são exemplos de testes aplicados para diagnóstico de S. mansoni


O método COPT é baseado na precipitação do soro do indivíduo após o contato

com ovos liofilizados ou fecundados (GOMES; ENK; RABELLO, 2014), apresentando

sensibilidade entre 92 a 100% e especificidade entre 96 a 100% (ALARCÓN DE NOYA

et al., 2007; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Possui algumas limitações relacionadas

ao tempo de execução e período variável de seroconversão após o tratamento

(GOMES; ENK; RABELLO, 2014).

O IHT é um teste indireto que utiliza glóbulos vermelhos liofilizados cobertos

com antígenos, sendo que antígeno solúvel do ovo (SEA, do inglês: Soluble egg

antigen) é o mais utilizado, para a detecção de anticorpos no soro de indivíduo

infectado por meio de aglutinação. A técnica é simples, requer somente equipamento

básico de laboratório para a sua execução e devido a isto, pode ser empregada em

campo (GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Apesar de apresentar uma alta

sensibilidade, entre 71 a 97% (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; YU et al., 2007), o

método apresenta algumas desvantagens, como baixa especificidade devido a

reações cruzadas com outros helmintos (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; ZHOU et

al., 2007, 2008) e reações positivas mesmo após o tratamento (GOMES; ENK;

RABELLO, 2014; ZHOU et al., 2008).

A técnica IFA baseia-se na reação entre antígenos do parasito e anticorpos

antiesquistossoma produzidos por indivíduos infectados (AZAB; SAFER; GHAFFAR,

1984; KAMIYA et al., 1982; KOLÁROVÁ; SÝKORA; BAH, 1994; WEERAKOON et al.,

2015). É um método sensível de diagnóstico, especialmente útil para áreas de baixa

endemia, capaz de detectar IgM e IgG na fase aguda ou crônica da doença

(BURLANDY-SOARES et al., 2003; KANAMURA et al., 1979, 1998; WEERAKOON et

al., 2015). O uso da técnica é limitado devido à necessidade de microscópio caro e

complexo, reagentes caros e pessoas qualificadas para sua realização (GOMES;

ENK; RABELLO, 2014).

Atualmente, o método sorológico de diagnóstico mais utilizado para detecção

da infecção é o ELISA (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; HAMILTON; KLINKERT;

31

DOENHOFF, 1998). A técnica permite detectar várias classes de anticorpos com base

no reconhecimento por diferentes antígenos do parasito, expressos em qualquer uma

das suas fases (GOMES; ENK; RABELLO, 2014). É altamente sensível e útil para

levantamentos epidemiológicos da esquistossomose (ALARCÓN DE NOYA et al.,

2007; BOTELHO et al., 2009; DA SILVA et al., 1998; ISHIDA et al., 2003; SORGHO

et al., 2005; TURNER et al., 2004). O ensaio de ELISA pode ser utilizado para a

detecção de anticorpos do indivíduo ou de antígenos do agente causador da infecção

(CROWTHER, 2009).

A reatividade entre anticorpos do soro do indivíduo infectado e antígenos

extraídos de diferentes estágios do parasito tem sido testada efetivamente nesta

técnica (LUNDE; OTTESEN, 1980; MCLAREN et al., 1978; SARHAN et al., 2014;

SMITH et al., 2012; WEERAKOON et al., 2015). Dois antígenos circulantes do

parasito, o antígeno catódico circulante (CCA, do inglês: circulating cathodic antigen)

e o antígeno anódico circulante (CAA, do inglês: circulating anodic antigen), são

proteoglicanos derivados do epitélio intestinal do parasito, que têm sido testados em

protocolos de diagnósticos sorológicos, porque são descritos como importantes alvos

para detectar infecção ativa e também a resposta terapêutica (AGNEW et al., 1995;

BARSOUM; COLLEY; KAMAL, 1990; LAMBERTON et al., 2014; STOTHARD, 2009;

VAN LIESHOUT; POLDERMAN; DEELDER, 2000; WEERAKOON et al., 2015).

Ambos são encontrados no sangue 3 semanas após a infecção (BARSOUM;

COLLEY; KAMAL, 1990; VAN DAM et al., 1996; WEERAKOON et al., 2015) e podem

ser detectados na urina ou soro de indivíduos (DE JONGE et al., 1990; VAN ETTEN

et al., 1994; WEERAKOON et al., 2015). O uso destes antígenos para diagnóstico

apresenta vantagens como alta especificidade, correlação positiva com a carga

parasitária e estimativa da intensidade da infecção (GOMES; ENK; RABELLO, 2014;

POLMAN et al., 1995; VAN LIESHOUT et al., 1995a, 1995b), além de desaparecem

rapidamente após o tratamento, podendo ser utilizados como avaliação da cura (EL-

MORSHEDY et al., 1996; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Entretanto, apresenta

baixa sensibilidade em áreas não endêmicas ou indivíduos com infecção leve


Outra alternativa de diagnóstico foi desenvolvida utilizando o antígeno CCA,

pelo teste imunocromatográfico POC-CCA® (point-of-care circulating cathodic

antigen). Trata-se de um ensaio de fluxo lateral, disponível comercialmente, utilizado

para detectar CCA (COLLEY et al., 2013; LEGESSE; ERKO, 2007; STOTHARD et al.,

32

2006; VAN DAM et al., 2004; VAN LIESHOUT; POLDERMAN; DEELDER, 2000) na

urina do indivíduo infectado. Este método é considerado bastante eficaz e confiável,

principalmente em áreas endêmicas e em indivíduos com alta intensidade de infecção

(COLLEY et al., 2013; COULIBALY et al., 2011; SHANE et al., 2011; TCHUEM

TCHUENTÉ et al., 2012). Por outro lado, mais estudos são necessários para avaliar

a performance do teste em áreas não endêmicas e em indivíduos com baixa carga

parasitária (SIQUEIRA et al., 2016).

Os métodos sorológicos de diagnóstico comumente utilizados apresentam

algumas limitações, como: variação dos títulos de anticorpos, que podem permanecer

ou aumentar após o tratamento (HINZ et al., 2017; SOENTJENS et al., 2014b); a

inabilidade em distinguir entre infecção passada, aguda ou reinfecção (ELBAZ;

ESMAT, 2013; GRENFELL et al., 2014; HINZ et al., 2017; WILKINS; KEYSTONE,

2013); a baixa produção de anticorpos, seroconversão tardia ou ausente (HINZ et al.,

2017; SOENTJENS et al., 2014a; XIE et al., 2014) ou uma resposta decrescente de

anticorpos em indivíduos de áreas endêmicas, devido às constantes exposições ao

parasito (DUVALL et al., 2014; HINZ et al., 2017). Tais limitações podem levar a

resultados de baixa confiabilidade (HINZ et al., 2017).

A busca por um método confiável para o monitoramento e controle da

esquistossomose tem levado à investigação de vários antígenos (CAVALCANTI et al.,

2013). A triagem dos antígenos adequados representa uma das maiores dificuldades

no desenvolvimento de testes de diagnóstico. Diante disso, sabe-se que existem

alguns fatores que podem influenciar na seleção de um antígeno apropriado, tais

como: simplicidade de obtenção e produtividade, alta estabilidade em condições

simples de estocagem e elevada antigenicidade e imunogenicidade (RABELLO et al.,

2008).

Os antígenos utilizados atualmente em ensaios sorológicos podem ser obtidos

de diferentes estágios evolutivos do parasito (HINZ et al., 2017). Geralmente são

empregados como um mix de proteínas expressas em diferentes fases do parasito ou

como proteínas específicas, isoladas por métodos de purificação de alta eficiência. A

preparação de antígeno solúvel de verme adulto (SWAP, do inglês: soluble adult worm

antigen preparation) é considerada a fonte mais fácil e abundante de material

antigênico (DOENHOFF; CHIODINI; HAMILTON, 2004). Antígenos de cercárias são

menos utilizados em consequência de sua baixa sensibilidade e especificidade

(LUNDE; OTTESEN, 1980). Proteínas de esquistossômulos são apontadas com maior

33

sensibilidade quando comparadas à SEA (HINZ et al., 2017; SMITH et al., 2012),

sendo mais eficazes para diagnosticar indivíduos de áreas endêmicas, mas com

considerável potencial para serem utilizadas no diagnóstico de indivíduos de áreas

não endêmicas (GRENFELL et al., 2013a, 2013b; HINZ et al., 2017). Os SEA são

utilizados normalmente em preparações brutas ou purificados, apresentando melhor

performance nas preparações purificadas (HINZ et al., 2017; LONG et al., 1982).

Estes antígenos apresentam sensibilidade que pode variar de moderada a alta em

teste de ELISA, porém podem apresentar baixa especificidade (DAWSON et al.,

2013; DOENHOFF et al., 1993; HINZ et al., 2017; SORGHO et al., 2005), em

consequência de possíveis reações cruzadas com antígenos de outros helmintos

(GRENFELL et al., 2013c; HINZ et al., 2017).

Além dos métodos de diagnóstico citados acima, há também o diagnóstico por

imagem, como: ultrassonografia de abdômen, utilizado para o diagnóstico da forma

hepatoesplênica da esquistossomose; radiografia do tórax em PA e perfil, utilizado

para diagnosticar a hipertensão arterial pulmonar consequente da artrite pulmonar

causada pela esquistossomose; endoscopia digestiva alta, utilizada para o diagnóstico

e tratamento das varizes gastroesofágicas resultantes da hipertensão portal na

esquistossomose hepatoesplênica; ressonância magnética, utilizado para

diagnosticar a mielopatia esquistossomótica e eco-doppler-cardiografia, exame

alternativo para diagnosticar a hipertensão pulmonar esquistossomótica

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

Um dos maiores entraves da pesquisa por testes de diagnóstico baseados no

reconhecimento por anticorpos é a ocorrência de reações cruzadas. Isso é

particularmente verificado quando se emprega antígeno bruto, sem purificação, por

possuírem frações antigênicas compartilhadas por muitos parasitos, protozoários e

até mesmo bactérias (RABELLO et al., 2008). Antígenos recombinantes têm sido

utilizados como alternativa aos SEA e antígenos solúveis de SWAP para o diagnóstico

da esquistossomose. Esta abordagem tem sido bastante utilizada com o intuito de

aumentar a especificidade do teste e minimizar as reações cruzadas, visto que é uma

forma de manipulação que não exige a manipulação do parasito e permite a seleção

do alvo antigênico antes da construção e expressão do antígeno (CAVALCANTI et al.,

2013; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Além disso, a metodologia permite produção

em larga escala, viabilizando o processo de desenvolvimento e comercialização do

teste de diagnóstico. Portanto, é imprescindível a busca por antígenos adequados

34

para uma abordagem soroepidemiológica, a fim de diagnosticar com maior

especificidade, sensibilidade e eficácia a infecção por S. mansoni.

1.6 BIOINFORMÁTICA

Segundo a American Medical Informatics Association, a bioinformática é “o

desenvolvimento de armazenamento, analítica e métodos interpretativos para otimizar

a transformação de dados biomédicos e dados genômicos cada vez mais volumosos,

em saúde pró-ativa, preditiva, preventiva e participativa”. A bioinformática é a ciência

interdisciplinar sobre armazenamento, recuperação e análises de informações

biológicas. A aplicação da bioinformática é um componente essencial para a

genômica, proteômica, predição funcional de proteínas e investigação de diferentes

expressões de genes em tecidos sadios e doentes (LYNN; LLOYD; FARRELLY,

2003).

Com o acúmulo de dados genômicos em bancos de dados públicos, surgiu no

século 21 uma abordagem multidisciplinar para identificar alvos para o diagnóstico e

vacinas, chamada de Imunobioinformática (CARVALHO et al., 2017). A

imunobioinformática lida com a aplicação de métodos computacionais para problemas

imunológicos e é considerado uma parte da bioinformática (BACKERT;

KOHLBACHER, 2015). O campo da imunobioinformática aprimorou nas últimas

décadas e os métodos para predição de epítopos (porção da proteína que tem

capacidade de ser reconhecida pelo sistema imune) têm sido amplamente utilizados

e aplicados com sucesso em várias áreas (BOISGUÉRIN et al., 2014; SCHUBERT et

al., 2016; SHUKLA et al., 2015).

Métodos in silico capazes de fazer a predição de epitopos imunológicos para

reconhecimento de células T e B auxiliam na determinação e rastreio de epítopos com

a maior chance de induzir respostas imunes protetoras (BERGMANN-LEITNER et al.,

2013). Como exemplo, a vacinologia reversa é o método de bioinformática que permite

a identificação de antígenos de um patógeno utilizando análises computacionais do

seu genoma, sem a necessidade de manipulação do microrganismo, para o

desenvolvimento de vacinas (DOYTCHINOVA; FLOWER, 2008). Seguindo o mesmo

princípio da vacinologia reversa, é possível identificar e selecionar antígenos com

potencial para comporem kits de diagnóstico, utilizando análises in silico (CARVALHO

35

et al., 2011). Alguns autores utilizaram as ferramentas de bioinformática para

selecionarem candidatos para o diagnóstico de várias doenças, obtendo resultados

promissores (CALERO et al., 2013; CARVALHO et al., 2017; DE SOUZA et al., 2018;

GUO et al., 2012; LOPES et al., 2017; MUSTAFA, 2013; ZHANG et al., 2007).

O resultado do sequenciamento do genoma de S. mansoni (BERRIMAN et al.,

2009), em conjunto com a disponibilidade de ferramentas de bioinformática cada vez

mais sofisticadas, tem fornecido recursos valiosos para a investigação de epítopos do

parasito para triagem de antígenos promissores para comporem kits de diagnóstico

(MCCARTHY et al., 2012; SILVA-MORAES et al., 2014).

Pode-se concluir, então, que os métodos computacionais são fortes aliados

para a pesquisa, proporcionando um direcionamento para a seleção de pequenas

porções de proteínas que são capazes de serem reconhecidas pelo sistema imune,

permitindo o desenvolvimento de estratégias mais sensíveis e eficazes que possam

ajudar no controle da esquistossomose, com redução de custos da pesquisa e do

tempo de bancada.

36

2 JUSTIFICATIVA

A esquistossomose representa um importante problema de saúde pública, com

grande relevância clínica e socioeconômica (AMARAL et al., 2017; WHO, 2013),

sendo uma das doenças negligenciadas que mais afeta pessoas no mundo,

principalmente em países subdesenvolvidos (COURA; AMARAL, 2004). A falta de

saneamento básico e água potável, assim como condições precárias que refletem na

qualidade de vida de indivíduos, principalmente aqueles que vivem em áreas

endêmicas, são fatores que contribuem para a disseminação da doença (DA

MARTINS et al., 2015).

A doença se encontra em situação alarmante, uma vez que o controle da

transmissão da esquistossomose, especialmente em países endêmicos, enfrenta

várias dificuldades, tornando-se insuficientes e ineficazes (COURA; AMARAL, 2004).

Frente às limitações, faz-se necessário o desenvolvimento de um diagnóstico de alta

sensibilidade e especificidade, para a fase aguda e crônica da doença. Além disso,

torna-se imprescindível estabelecer testes capazes de detectar a doença em

indivíduos com alta ou baixa carga parasitária e avaliar a cura, indicando a real

prevalência da esquistossomose, contribuindo para o tratamento precoce, e auxiliar

na erradicação da doença.

A investigação por métodos de vigilância e controle da esquistossomose tem

estimulado a busca de vários alvos antigênicos contra a esquistossomose

(CAVALCANTI et al., 2013). Antígenos recombinantes têm sido utilizados para a

busca de novos candidatos para diagnóstico e terapia para doenças (CAVALCANTI

et al., 2013; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Embora a identificação de epítopos sem

a manipulação do parasito esteja contribuindo fortemente para o avanço das

pesquisas, a escolha dos antígenos apropriados é de crucial importância para o

desenvolvimento dos testes sorológicos, uma vez que a ocorrência de reações

cruzadas representa uma das maiores dificuldades em ensaios baseados na detecção

de anticorpos (RABELLO et al., 2008).

Os avanços biotecnológicos têm permitido a identificação racional de epítopos

como alvos contra a esquistossomose, podendo ter como finalidade a contrução de

proteínas recombinantes como uma estratégia para o reconhecimento por anticorpos

em kits de diagnóstico. Este método tem se mostrado eficiente, permitindo o aumento

37

da sensibilidade do teste (DE SOUZA et al., 2013), possibilitando a redução da

complexidade e custo final dos kits de diagnóstico (DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006).

Diante do exposto, este trabalho foi desenvolvido frente à necessidade do

desenvolvimento de um kit de diagnóstico inovador para S. mansoni, sendo composto

por antígenos que possam proporcionar alta sensibilidade e especificidade. Diante do

progresso na área computacional e da disponibilidade de ferramentas de

bioinformática cada vez mais sofisticadas, concomitante à informação genômica do

parasito (BERRIMAN et al., 2009). A proposta foi selecionar, por meio de análises in

silico, novos antígenos de S. mansoni para comporem uma proteína multiepitopo

recombinante, com objetivo de avaliar sua antigenicidade em testes sorológicos.

38

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Construir uma proteína multiepitopo recombinante a partir de epítopos

selecionados por análises in silico para a composição de um kit de diagnóstico

inovador para o S. mansoni.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Identificar, por análises in silico, epítopos provenientes da membrana do parasito S.

mansoni;

- Caracterizar e selecionar os epítopos mais antigênicos;

- Desenhar racionalmente a proteína multiepitopo recombinante;

- Expressar a proteína multiepitopo recombinante em Escherichia coli (E. coli);

- Purificar a proteína multiepitopo recombinante em coluna de afinidade de níquel (Ni-

NTA);

- Detectar a proteína por meio da metodologia de Dot-Blot.

39

4 MATERIAL E MÉTODOS

A metodologia utilizada foi realizada em duas etapas: análises in silico, a partir

de sequências proteicas obtidas em um banco de dados que contêm informações

genômicas do parasito para a predição e seleção de epítopos antigênicos (Figura 3);

e metodologia in vitro, na qual corresponde à expressão do gene correspondente à

proteína multiepitopo, desenhada a partir de epítopos selecionados in silico (Figura 4).

40

Figura 3. Fluxograma das análises in silico das proteínas.

Obtenção das sequências

↓

Predição da localização celular

↓

Predição de peptídeo sinal e clivagem

da sequência correspondente

↓

Predição de hélices transmembrânicas

↓

Predição de epítopos com afinidade

por moléculas de HLA classe II

↓

Predição de epítopos lineares com

afinidade por BCR

↓

Predição de antigenicidade

↓

Análise de homologia com proteínas

humanas e proteínas de helmintos

↓

Predição da expressão das proteínas

nas diferentes fases do parasito

↓

Desenho racional da proteína

multiepitopo recombinante

↓

Análises in silico da proteína

multiepitopo recombinante

41

Figura 4. Fluxograma das análises in vitro da produção da proteína multiepitopo.

Preparação de células competentes

↓

Transformação com plasmídeo

pET21a::rMEBIOSM

↓

Expressão heteróloga da proteína rMEBIOSM

↓

Análise em gel SDS-PAGE

↓

Purificação

↓

Análise em gel SDS-PAGE

↓

Dot-Blot

42

4.1 ANÁLISES IN SILICO

As sequências proteicas foram obtidas no banco de dados do GeneDB

(http://www.genedb.org/Homepage/Smansoni) (LOGAN-KLUMPLER et al., 2012),

onde foram selecionadas apenas proteínas hipotéticas de S. mansoni.

4.1.1 Predição da localização celular

As sequências das proteínas hipotéticas obtidas a partir do banco de dados

foram inicialmente analisadas utilizando o programa PSORT II

(http://psort.hgc.jp/form2.html) (NAKAI; HORTON, 1999). Foram selecionadas as

proteínas que apresentaram maior probabilidade de estarem localizadas na

membrana plasmática.

4.1.2 Predição de peptídeo sinal

As proteínas selecionadas anteriormente foram analisadas pelo programa

SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (EMANUELSSON et al., 2007)

para a predição da presença de peptídeo sinal. Aquelas proteínas que apresentaram

peptídeo sinal tiveram a sequência correspondente retirada da sequência proteica

total para a realização das próximas análises.

4.1.3 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas

As proteínas selecionadas anteriormente foram analisadas para a predição de

hélices transmembrânicas e seleção das regiões expostas. Para esta análise, foram

utilizados três programas: TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)

(SONNHAMMER; VON HEIJNE; KROGH, 1998), TMpred

(http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html) (HOFMANN; STOFFEL,

1993) e SOSUI 1.11 (http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)

(HIROKAWA; BOON-CHIENG; MITAKU, 1998). Estes programas fazem a predição

da conformação da proteína na membrana do parasito, mostrando quais aminoácidos

43

compõem a região interna, hélice transmembrânica e região exposta. Os resultados

dos três programas foram comparados, sendo selecionados somente as partes

expostas das proteínas que eram em comum nos três programas, com tamanho de

no mínimo 35 aminoácidos.

4.1.4 Predição de epítopos com afinidade por moléculas de HLA classe II

Após a seleção de regiões expostas, avaliou-se a afinidade de ligação entre

pequenas porções de 15 aminoácidos da sequência exposta por diferentes moléculas

de Antígeno leucocitário humano (HLA, do inglês: Human leukocyte antigen) de

Classe II. O programa Tepitool (http://tools.iedb.org/tepitool/) (PAUL et al., 2016) foi

utilizado para a predição de epítopos com afinidade por sete moléculas de HLA (DRB1

0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1 1501).

Estes alelos foram selecionados por serem amplamente encontrados nas superfícies

das células apresentadoras de antígenos (APC, do inglês: antigen-presenting cells)

(TEXIER et al., 2000). O programa foi ajustado para fazer a predição de epítopos que

tivessem 100% de afinidade por todas as moléculas de HLA selecionadas.

4.1.5 Predição de epítopos lineares com afinidade pelos receptores de antígenos de

células B

As regiões expostas selecionadas anteriormente foram também analisadas

pelo programa ABCpred (http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/) (SAHA;

RAGHAVA, 2006) para a predição de antígenos com afinidade pelo receptor de

antígeno de célula B (BCR, do inglês: B cell antigen receptor). O programa faz a

predição de epítopos contendo 10,12,14,16,18 e 20 aminoácidos com um threshold

de 0.51 e acurácia de 65,93%. Para a triagem em questão, foi ajustado o parâmetro

de busca para epítopos contendo 16 aminoácidos e todos acima do threshold foram

considerados.

Os epítopos preditos com afinidade tanto pelas moléculas de HLA quanto por

BCR foram, então, comparados. Aqueles que fossem reconhecidos por ambos

receptores do sistema imune foram selecionados.

44

4.1.6 Predição de antigenicidade

O programa VaxiJen v2.0 (http://ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/Vaxi

Jen.html) (DOYTCHINOVA; FLOWER, 2008) foi utilizado para determinar a

antigenicidade dos epítopos selecionados na última etapa. O programa faz a análise

baseado com valor de corte de 0.5 e acurácia de 78%. Somente epítopos preditos

como antigênicos foram considerados.

4.1.7 Análise de homologia

Após a seleção dos epítopos, utilizou-se o programa NCBI Blast+

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/) (CAMACHO et al., 2009) para conferir,

hipoteticamente, se os epítopos selecionados apresentavam homologia com

proteínas humanas ou com proteínas de outros helmintos (filo Nematoda), que

geralmente possam acarretar em resultados falso-negativos e reações cruzadas,

respectivamente. Foram desconsiderados os epítopos que apresentaram homologia

acima de 60% (CARVALHO et al., 2011).

4.1.8 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do parasito

Após a seleção final de epítopos, foi analisada a predição da expressão das

proteínas que correspondem aos epítopos selecionados, nas diferentes fases de vida:

cercária, esquistossômulo e verme adulto do parasito. Esta informação está disponível

no banco de dados GeneDB.

4.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE

O desenho racional da proteína foi baseado em tecnologias já desenvolvidas

pelo grupo de Biotecnologia de Microrganismos como as utilizadas para o

desenvolvimento de kits de diagnóstico de Rubéola, Hepatite C, Hepatite B,

Leishmaniose visceral canina e Esquistossomose (BR1020120024691,

BR1020120024705, BR1020120024683, BR 1020140313311 e BR1020160052025).

45

Para compor a proteína multiepitopo, foram selecionados os melhores epítopos

triados pela bioinformática. Eles foram alternados entre si até formar a melhor

sequência, de acordo com análises de predição de antigenicidade, ponto isoelétrico

(pI), massa molecular e estrutura tridimensional. A proteína multiepitopo originada foi

nomeada como rMEBIOSM.

Análises in silico eram realizadas ao final de cada tentativa de alternar as

sequências dos epítopos para formar a proteína multiepitopo com o propósito de

selecionar a melhor sequência.

O programa Compute pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/)

(GASTEIGER et al., 2005) foi usado para conferir o ponto isoelétrico (pI) hipotético e

a massa molecular da proteína. Com o programa VaxiJen v2.0, avaliou-se a predição

de antigenicidade e empregando o programa Phyre2 (http://www

.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) (KELLEY et al., 2015), foi possível

prever a estrutura tridimensional hipotética da proteína.

A sequência de aminoácidos da proteína multiepitopo selecionada foi enviada

para a empresa Epoch Biolabs (Fort Bend Country), onde o gene foi sintetizado e

clonado no vetor de expressão em E. coli pET21a, originando o plasmídeo nomeado

como pET21a::rMEBIOSM. A empresa realiza o desenho do gene considerando os

seguintes critérios: otimização do gene utilizando códons preferenciais (códon usage)

para E.coli BL21(λ DE3) e adição de sítios de restrição apropriados na extremidade

do gene para facilitar a clonagem.

4.3 LINHAGEM BACTERIANA

As cepas de E. coli utilizadas neste trabalho estão representadas juntamente

com seus genótipos na Tabela 1. Estas cepas foram escolhidas por serem células

manipuladas por engenharia genética a fim de proporcionar a indução da expressão

de genes em plasmídeos pelo indutor isopropil-tio-β-galactosídeo (IPTG), através do

promotor T7.

As cepas pLysS e pLysE foram selecionadas por possuírem o plasmídeo que

produz a lisozima T7 (MIERENDORF; YEAGER; NOVY, 1994), a qual controla a

expressão de proteínas recombinantes, evitando a produção da proteína

recombinante sem a presença do indutor (ROSANO; CECCARELLI, 2014). A cepa

46

C41 (DE3) foi selecionada por sua capacidade de expressar proteínas tóxicas

(MIROUX; WALKER, 1996) e de difícil expressão (PAPANEOPHYTOU;

KONTOPIDIS, 2014). A cepa Arctic Express (DE3) foi selecionada por sua capacidade

de expressar proteínas em formas mais solúveis (HONG; RASHID; SANTIAGO-

VÁSQUEZ, 2013).

Tabela 1: Cepas e genótipos de Escherichia coli.

CEPAS GENÓTIPOS

BL21(λ DE3) pLysS F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)

BL21 (λ DE3) pLysE F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB- mB-) λ(DE3) pLysE(cmR)

C41 (DE3) F - ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm λ (DE3)

ARCTIC EXPRESS (DE3) F– ompT hsdS (rB – mB –) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [cpn10 cpn60 Gentr]

4.4 PLASMÍDEO

O plasmídeo utilizado para clonagem e expressão da rMEBIOSM foi o pET21a

(Novagen, Windsor, Reino Unido), cujo mapa físico é representado na Figura 5 e a

região do polylinker é representado na Figura 6.

47

Figura 5. Mapa físico do vetor pET21a.

Fonte: NOVAGEN

Figura 6. Mapa da região do polylinker do vetor pET21a. O gene sintético rMEBIOSM foi clonado entre os sítios de Nde I e Xho I do vetor pET21a, com a sequência da cauda de histidina na extremidade C-terminal.

Fonte: NOVAGEN

48


PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM

A preparação de células competentes inicia-se realizando pré-inóculo da cepa

a ser transformada, onde é inoculado uma colônia da cepa em 5 mililitros (mL) de meio

Luria-Bertani (LB).

O pré-inóculo é incubado a 37 graus Celsius (ºC), sob agitação 180-200 rotação

por minuto (rpm), durante 16 horas (h). Posteriormente, 1,25 mL do pré-inóculo foram

inoculados em 30 mL de meio LB. Em seguida, foram incubados a 37ºC, sob agitação

(180-200 rpm), até atingir uma Densidade Óptica (OD) 600 nanômetro (nm) de 0,3.

Após atingir a OD600nm de 0,3, foi centrifugado (35000xg/10min/4ºC) 1 mL do

conteúdo do inóculo.

Após a centrifugação, a amostra foi levada para a capela de fluxo laminar em

um recipiente contendo gelo. O sobrenadante foi descartado e adicionado 1mL de

CaCl2 0,1 Molar (M) ao pellet.

A amostra foi homogeneizada suavemente e centrifugada

(35000xg/10min/4ºC). O sobrenadante foi descartado, adicionado 100 microlitros (μL)

de CaCl2 + glicerol 15% ao pellet e homogeneizado suavemente.

A transformação das células hospedeiras, E. coli BL21 (λDE3) pLysS e pLysE,

C41 (DE3) e ArcticExpress (DE3) foi realizada através da técnica de choque térmico,

possibilitando a inserção do vetor de expressão (SAMBROOK et al., 1989).

Uma alíquota de 100 μL de células competentes de cada cepa foi utilizada para

a transformação, com o acréscimo de no máximo 1/10 do volume de amostra contendo

o pET21a::rMEBIOSM e incubada no gelo por 30 minutos (min). Decorrido este tempo,

a amostra foi incubada no banho-maria a 42ºC por 90 segundos, a fim de realizar um

choque térmico nas células. Em seguida, foi incubada novamente no gelo por 10 min

e logo após, adicionou-se 1 mL de meio LB líquido, sendo incubada em banho-maria

a 37ºC por 1 h.

A amostra foi centrifugada (17000xg/10 min a 4°C), o sobrenadante descartado

até sobrar 200 μL do mesmo e o pellet homogeneizado ao sobrenadante. Por fim,

utilizando pérolas de vidro, realizou-se o plaqueamento de 50 e 150 μL de células

transformadas com o plasmídeo pET21a::rMEBIOSM em cada placa de Petri com

meio LB ágar contendo ampicilina na concentração de 100 μg/mL. As placas foram

incubadas em estufa a 37°C por 16-18 h.

49

4.6 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM

A indução da expressão gênica foi realizada com o objetivo de verificar a

capacidade das cepas de E. coli utilizadas expressarem a proteína multiepitopo

recombinante. Para esta finalidade, foram retirados da placa de Petri de um a três

clones contendo a construção plasmidial pET21a::rMEBIOSM e inoculados num

falcon com 5 mL de meio LB líquido contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubados a

37ºC, sob agitação 180-200 rpm, durante 16h. Posteriormente, inoculou-se 1,25 mL

do pré-inóculo em 25 mL de meio LB contendo ampicilina na concentração de 100

μg/mL, incubado a 37ºC, sob agitação (180-200 rpm), até atingir uma OD600nm de

0,6.

Após atingir a OD600nm de 0,6, foi coletado 2mL da cultura, denominado de

tempo de indução = 0h e se iniciou a processo de indução. Foram testados diferentes

tipos de indutores e diferentes temperaturas pós-indução. Para as cepas pLysS e

pLysE, o protocolo utilizado por Galdino e colaboradores (2016) foi o escolhido para a

indução da expressão, o qual se mostrou eficiente para expressão da proteína

recombinante utilizada por estes autores. Além de utilizar o protocolo original, como

alternativa, ele foi modificado para se alcançar a expressão da proteína. Na primeira

modificação, alterou-se a concentração final de IPTG e temperatura pós-indução,

diminuindo para 0,03 mM e 25ºC, respectivamente. Na segunda modificação, o tipo

de indutor utilizado foi modificado do protocolo original, utilizando-se lactose na

concentração final de 1 mM.

Para as cepas C41 (DE3) e Arctic Express (DE3), o protocolo da indução da

expressão também foi o mesmo utilizado por Galdino e colaboradores (2016). Porém,

para a cepa Arctic Express (DE3), a temperatura pós-indução foi modificada para

12ºC, estando dentro da faixa de temperatura para indução indicada pelo fabricante.

Foram coletadas alíquotas de 1 mL no tempo de indução de 30 min, 1h30 min e

2h30min. Após serem centrifugadas (17000xg/5min), descartou-se o sobrenadante e

o pellet foi ressuspendido em 50 μL de tampão de amostra com β-mercaptoetanol.

50

4.7 ANÁLISE EM GEL SDS-PAGE DA PROTEÍNA rMEBIOSM

A análise da indução da expressão da proteína foi verificada em gel de

poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio (SDS, do inglês: Sodium Dodecyl

Sulfate), de acordo com a metodologia de Harlow e Lane (1988).

No preparo das amostras das proteínas, foi adicionado tampão de amostra com

β-mercaptoetanol, sendo um tampão desnaturante. Depois, foram fervidas por cinco

minutos, centrifugadas (17000xg/5 min) e então aplicado 20 μL do sobrenadante de

cada amostra nas canaletas do gel. Em uma das canaletas, foi aplicado o marcador

de massa molecular (PierceTM Unstained Protein MW Marker 26610, Thermo Fisher

Scientific.). O pellet resultante da centrifugação também foi aplicado juntamente com

tampão de amostra, como tentativa para verificar se a proteína recombinante se

encontrava na parte insolúvel da amostra (pellet).

Em seguida à aplicação das amostras, o gel foi submetido à eletroforese a 60V

até a entrada no gel separador e de 80V até o final da corrida eletroforética, em

tampão de corrida Tris-glicina no potencial Hidrogeniônico (pH) 8.7 com SDS.

Posteriormente, o gel foi corado com Coomassie brilliante blue R-250 até 16 horas,

subsequentemente descorado com solução de metanol e ácido acético até a

visualização das bandas proteicas.

4.8 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM

Para o processo de purificação da proteína rMEBIOSM, foi realizada a indução

seguindo protocolo descrito no item 4.6. A amostra final da indução foi centrifugada

(17000xg/5 min), sendo o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido em 1 mL

de tampão de lise para ser utilizado no processo de purificação. A amostra foi

incubada à 4°C por 16 h. Após, a amostra foi sonicada (6 pulsos de 5 segundos a

40mA, com intervalo de 10 segundos entre cada pulso) e reservada em um béquer

contendo gelo.

A resina de cromatografia de afinidade Níquel-NTA (HIS-Select ® Nickel Affinity

Gel P6611, Sigma Aldrich) é armazenada num microtubo contendo álcool 30%. Para

separar a resina do álcool, realizou-se uma centrifugação (1600xg/3 min/25ºC) do

51

microtubo para permitir o descarte do álcool. A preparação da resina para a purificação

se inicia com a lavagem da mesma com 1mL de água destilada, sendo, logo depois,

o microtubo centrifugado (1600xg/3min/25ºC) e o sobrenadante descartado,

realizando esse processo cinco vezes. Em seguida, a resina foi pré-equilibrada com a

adição de 1mL de tampão de lise, pois a amostra encontrava-se ressuspendida em

tampão de lise. O microtubo foi centrifugado (1600xg/3min/25ºC), o sobrenadante

descartado e o procedimento repetido por cinco vezes vezes.

A amostra já sonicada foi centrifugada e todo o sobrenadante transferido para

a resina previamente equilibrada com tampão de lise. O protocolo de purificação

utilizado por De Souza e colaboradores (2013) foi o escolhido inicialmente para a

purificação. Porém, além de utilizar o protocolo original, este foi modificado duas

vezes, a fim de se alcançar a purificação da proteína recombinante. No protocolo

original, centrifugou-se a amostra sonicada a 17000xg/15min/4ºC e o sobrenadante

originado foi adicionado à resina. Na primeira modificação, alterou-se apenas o tempo

de centrifugação do protocolo, utilizando 2 min ao invés de 15 min. Já na segunda

modificação, a amostra sonicada foi adicionada à resina sem ser centrifugada. O

microtubo contendo a amostra e a resina foi homogeneizado por inversão e colocado

num aparato de homogeneização, onde permaneceu sob agitação por 1h a 4º C.

Após 1h em agitação, realizou-se uma nova centrifugação (1600xg/3min/25ºC)

e o sobrenadante foi coletado (flow-through). Foram realizadas cinco lavagens

adicionando 1 mL de tampão de lavagem à resina. Em cada lavagem, o microtubo foi

centrifugado (1600xg/3min/25ºC) e homogeneizado por inversão e o sobrenadante

transferido para um novo microtubo devidamente identificado. Para constatar qual a

concentração de imidazol do tampão de eluição é capaz de eluir a proteína

rMEBIOSM, foram testados quatro tampões de eluição com diferentes concentrações

de imidazol: 50mM, 100mM, 200mM e 500mM. Portanto, após o término da lavagem,

foi adicionado 500 μL de tampão de eluição, o microtubo foi homogeneizado por

inversão e centrifugado (1600xg/3min/25ºC). Este procedimento foi realizado duas

vezes para cada tampão de eluição com concentração diferente de imidazol e o

sobrenadante originado de cada centrifugação foi transferido para um novo microtubo

devidamente identificado. Os sobrenadantes coletados nas lavagens e nas eluições

foram armazenados à - 20ºC para posterior análise em gel SDS-PAGE.

52

4.9 DOT-BLOT

Para o Dot-Blot, a membrana de Difluoreto de Polivinilideno (PVDF) (Westran®

General Electric – GE, Estado Unidos) foi imersa em metanol (Sigma®- Alemanha) e

com auxílio de uma pipeta aplicou-se 2 μL da proteína rMEBIOSM em dois pontos da

membrana (os sobrenadantes originados das lavagens e eluições da purificação

foram juntados num microtubo e a amostra originada foi utilizada para o teste). A

membrana foi secada por 1h em estufa à 37ºC e acondicionada em uma placa de

Petri. Em seguida, os sítios inespecíficos foram bloqueados pela imersão da

membrana em 5 mL de solução tampão salina fosfato contendo 5% de albumina e

polissorbato (Tween-20 Sigma®- Alemanha) 0,05% (PBS-T-BSA) por 1h em

temperatura ambiente sob uma leve agitação mecânica. Logo depois, a membrana foi

lavada com PBS-Tween-20 a 0,05% (Sigma®- Alemanha), mantendo a solução por 5

minutos sob leve agitação mecânica. Este procedimento foi repetido 3 vezes. O

anticorpo monoclonal anti poli-histidina (anti-His) conjugado com peroxidase de

rabanete (HRP, do inglês: horseradish peroxidase) (Sigma®- Alemanha) foi diluído na

proporção de 1:1000 em solução PBS-T-BSA e aplicado sobre a membrana e mantido

por uma hora em temperatura ambiente, sob leve agitação mecânica. A membrana foi

lavada novamente 3 vezes com PBS-Tween-20 a 0,05% (Sigma®- Alemanha), por

cinco minutos sob agitação leve.

O reagente para revelação do teste foi preparado com 3,3’-Diaminobenzidina

(DAB - Sigma®- Alemanha) com adição de 40 μL de peróxido de hidrogênio (H2O2) a

10% no volume final de 15 mL de solução Tris- NaCl pH 7,6 em seguida, foi aplicado

sobre a membrana para o aparecimento de cor na área onde foi aplicada a amostra.

Com a finalidade de parar a reação de revelação, utilizou-se a água.

53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISES IN SILICO

5.1.1 Obtenção das sequências de proteínas hipotéticas de S. mansoni

Diante da situação alarmante da doença, tem-se a necessidade de buscar

novas estratégias de controle e, para isto, as ferramentas de bioinformática estão se

tornando grandes aliadas às pesquisas. O sequenciamento genômico do parasito,

assim como a disponibilidade de programas que predizem particularidades do

Schistosoma estão sendo amplamente utilizados, o que cada vez mais facilita a busca

por técnicas de diagnósticos baseadas em antígenos (CARVALHO et al., 2011).

Apesar da complexidade do S. mansoni, avanços na biologia molecular têm permitido

a investigação de peculiaridades do genoma, o que vêm facilitando a pesquisa por

pequenas regiões proteicas antigênicas do parasito (LOPES et al., 2017).

Utilizando o banco de dados de domínio público GeneDB, verificou-se que o

genoma do parasito contém 3.080 proteínas hipotéticas, cuja função e localização são

desconhecidas. Para este trabalho, foram selecionadas 390 sequências de proteínas

hipotéticas de S. mansoni para as análises in silico. Aproximadamente 40% do

genoma do parasito é composto por proteínas hipotéticas e estas são alvos muito

promissores a serem caracterizados e testados (FONSECA et al., 2012).

5.1.2 Predição de localização celular

O parasito possui um tegumento composto por uma membrana plasmática

dupla incomum, responsável pela absorção de nutrientes, crescimento e

desenvolvimento e auxilia na proteção contra o sistema imune do hospedeiro, tendo

um papel importante na interação parasito-hospedeiro (HAN et al., 2009; MCLAREN;

HOCKLEY, 1977). O tegumento sofre várias mudanças durante as fases de vida do

parasito, e estas mudanças são importantes para a sua sobrevivência e resistência à

imunidade do hospedeiro, sendo, então, uma fonte relevante de antígenos (ABATH;

54

WERKHAUSER, 1996). Os antígenos encontrados na superfície do tegumento

tendem a ter uma boa imunogenicidade, pois estão expostos diretamente ao sistema

imunológico (DA’DARA et al., 2003; DE OLIVEIRA LOPES et al., 2013; TRAN et al.,

2006). Estudos realizados por Carvalho e colaboradores (2011) corroboram com estas

informações, sendo selecionados epítopos da superfície do parasito, por meio de

análises in silico, e estes se mostraram possíveis candidatos para o diagnóstico de

S. mansoni.

Diante destas considerações, o estudo teve como um dos critérios de seleção

das proteínas a localização celular. Somente aquelas que tinham probabilidade de

serem expressas na membrana plasmática do parasito foram selecionadas. Apesar

de não ser possível analisar por meio de programas de bioinformática se a proteína

está presente na membrana interna ou externa do tegumento, este critério foi utilizado

devido a hipótese de que as proteínas do tegumento sejam mais susceptíveis ao

sistema imunológico, com maior probabilidade de reconhecimento por anticorpos.

Utilizando o programa Psort II, foi possível fazer a predição da localização

celular e selecionar somente aquelas proteínas que tinham maior probabilidade de

serem de membrana plasmática. De 390 proteínas, 172 foram preditas como

transmembrânicas e selecionadas para as análises posteriores. A Figura 7 representa

a predição de localização celular da Smp_144770, formada por uma sequência de 928

aminoácidos, que apresentou 73.9 % de probabilidade de estar localizada na

membrana.

Figura 7. Predição de localização celular da proteína hipotética Smp_144770 pelo programa Psort II. Onde X indica a probabilidade de 73.9% de ser uma proteína de membrana plasmática.

X

55

5.1.3 Predição de peptídeo sinal

Muitas das proteínas que são sintetizadas em compartimentos celulares não

desempenham seus papéis biológicos nos locais onde são geradas, sendo exportadas

para o seu local de função. O peptídeo sinal é uma sequência pequena composta por

15 a 60 aminoácidos, localizada normalmente na porção N-terminal da proteína (DE

OLIVEIRA LOPES et al., 2013), e atua no direcionamento das proteínas, não estando

presente na proteína madura (AUCLAIR; BHANU; KENDALL, 2012).

De Oliveira e colaboradores (2013) enfatizaram a importância da análise da

presença de peptídeo sinal, pois, para manter a confiabilidade, a sequência de

peptídeo sinal deve ser retirada, caso esteja presente na proteína. De contrário, pode

gerar resultados errôneos, uma vez que a sequência da proteína pode ser alterada e

estabelecer uma conformação distorcida na membrana plasmática. Esta análise é de

grande importância, uma vez que consegue mimetizar o que acontece naturalmente

no organismo e, caso a sequência correspondente não seja retirada, a topologia da

proteína na membrana pode ser predita de forma errada. Estudos realizados por

Zhang e colaboradores (2014) também ressaltaram a importância de se predizer a

presença do peptídeo sinal nas análises para a triagem de epítopos. Para este estudo,

esta etapa não foi de critério de exclusão, pois as proteínas que não apresentaram o

peptídeo sinal também foram mantidas para as análises, devido ao fato de serem

direcionadas para a membrana plasmática ou secretadas por mecanismos não-

canônicos (LOPES et al., 2017; MAMBULA et al., 2007; ZHANG et al., 2012).

As proteínas transmembranas selecionadas anteriormente foram analisadas

pelo programa SignalP 4.1, o qual faz a predição da presença de peptídeo sinal e do

seu local de clivagem, simulando assim o que ocorre no organismo. De 172 proteínas

selecionadas, 21 apresentaram a presença de peptídeo sinal e a sequência

correspondente ao peptídeo sinal foi retirada para as análises seguintes. As proteínas

que não apresentaram peptídeo sinal também foram mantidas para as próximas

análises. A Figura 8A representa a proteína Smp_170620, que possui o peptídeo sinal,

bem como o seu sítio de clivagem e a Figura 8B representa a proteína Smp_145040,

que não possui o peptídeo sinal.

56

Figura 8. Predição de peptídeo sinal. A- Presença de peptídeo sinal na proteína Smp_170620, onde X corresponde a sequência de peptídeo sinal e Y corresponde ao sítio de clivagem. B- Ausência de peptídeo sinal na proteína Smp_145040, não havendo pico acima do limiar.

5.1.4 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas

Como critério de seleção para este estudo, somente as partes expostas das

proteínas foram selecionadas para análises posteriores, pois supostamente estão

mais susceptíveis ao sistema imune do hospedeiro (DE OLIVEIRA LOPES et al.,

2013). Seguindo este critério, Lopes e colaboradores (2017) selecionaram epítopos

de partes expostas de proteínas, por meio de análises in silico, que foram capazes

tanto de estimular linfócitos T CD4 quanto de serem reconhecidos por soro de

indivíduos infectados.

Para esta seleção, foram utilizados os programas TMHMM, TMpred e SOSUI

1.11, com intuito de realizar a predição da orientação das proteínas na membrana

plasmática. De 172 proteínas analisadas, 48 proteínas apresentaram regiões

expostas acima de 35 aminoácidos, sendo selecionadas para as próximas análises,

totalizando em 56 regiões expostas (algumas proteínas apresentaram mais de uma

região exposta com, no mínimo, 35 aminoácidos). As regiões intracelulares e hélices

transmembrânicas foram descartadas. O critério de selecionar somente regiões

X

Y

A B

57

expostas contendo ao menos 35 aminoácidos foi utilizado com o objetivo de se obter

uma cadeia peptídica que irá gerar um número satisfatório de epítopos com afinidade

por moléculas de HLA de classe II e por BCR.

A Figura 9 representa a predição da proteína Smp_179660 pelos programas

TMHMM, TMpred e SOSUI 1.11, na qual se nota que todos os programas fazem a

predição de quais aminoácidos compõem a região exposta, hélices transmembrânicas

e região intracelular da proteína.

Figura 9. Análise da orientação da proteína Smp_179660 na membrana plasmática pelos programas TMHMM, TMpred e SOSUI. A- TMHMM: prediz que as regiões expostas são entre os aminoácidos 1 a 61, 161 a 443 e 509 a 836; B-TMpred: prediz que as regiões expostas são entre os aminoácidos 1 a 60,163 a 448 e 510 a 838 e, C- SOSUI: prediz que as regiões expostas são entre os aminoácidos 1 a 61, 163 a 443 e 511 a 832. Nota-se que há três regiões expostas em comum nos três programas, sendo selecionadas para as próximas análises.

5.1.5 Predição de epítopos com afinidade por moléculas do HLA classe II

As moléculas HLA de classe II são expressas na superfície de células do

sistema imune, como células B, células dentríticas e macrófagos, e atuam na

apresentação de fragmentos de proteínas exógenas para o sistema imune (ROCHA

et al., 2008). As APC reconhecem os antígenos por meio de receptores de superfície

celular, com subsequente degradação a peptídeos menores. As moléculas de HLA de

A B

C

58

classe II são sintetizadas no retículo endoplasmático e transportadas em fagosomas

ou endosomas, onde se ligam ao peptídeo. O complexo HLA II ligado ao peptídeo é,

então, transportado para a superfície da célula, sendo responsável pela apresentação

do antígeno para as células T CD4+ (ROBINSON; DELVIG, 2002). As células T CD4+

ativadas se diferenciam em subtipos e possuem diversas funções importantes

(LUCKHEERAM et al., 2012), como a ativação de células B.

Os genes HLA constituem um dos sistemas genético humano mais polimórfico

conhecido atualmente (PETZL-ERLER; LUZ; SOTOMAIOR, 1993; TROWSDALE;

KNIGHT, 2013), e para as HLA de classe II, as moléculas HLA-DRB1 são as mais

abundantes na superfície das células apresentadores de antígenos, sendo que mais

de 200 alelos já foram descritos para este locus. Os sete alelos das HLA de classe II

(DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1

1501) analisados foram selecionados por serem amplamente encontradas em

diferentes populações pelo mundo, principalmente na população caucasiana (TEXIER

et al., 2000).

Uma forma de se selecionar peptídeos como alvos antigênicos é por intermédio

de análise de afinidade entre determinadas sequências proteicas e moléculas de HLA.

Alguns antígenos são chamados de promíscuos, pois podem ser reconhecidos por

diversas moléculas de HLA. Uma vez utilizando estes antígenos, seria possível

amplificar a gama de indivíduos que poderiam reconhecê-los, aumentando assim a

probabilidade de estimular o sistema imune, já que o perfil de HLA de cada pessoas

pode modificar bastante devido ao polimorfismo (WIENS et al., 2013). Sendo assim,

para este estudo, priorizou-se a seleção de epítopos que eram reconhecidos ao

mesmo tempo por todas as sete moléculas de HLA citadas acima. De fato, Oliveira e

colaboradores (2016a), obtiveram, por meio de tais análises, epítopos capazes de

estimular a proliferação de linfócitos T CD4, se mostrando candidatos promissores

para a composição de vacinas. Ainda, Carvalho e colaboradores (2017), também

obtiveram resultados promissores para o diagnóstico de S. mansoni utilizando este

critério.

Portanto, as regiões expostas selecionadas anteriormente foram analisadas

pelo programa Tepitool, para predição de epítopos, que tenham afinidade de ligação

por sete moléculas de HLA classe II: DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1

0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1 1501. Os epítopos foram selecionados pelo

critério de afinidade, quando apresentassem capacidade hipotética de interação com

59

100% dos alelos, baseado na hipótese de que a comunicação epítopo-HLA consiga

estimular a resposta imune do hospedeiro, de acordo com as predições. A Figura 10

representa a relação dos epítopos preditos para a proteína Smp_126900. Foram

gerados 12 epítopos com afinidade pelas sete moléculas de HLA selecionadas.

Figura 10. Predição de epítopos pelo programa Tepitool da proteína Smp_126900.Todos os epítopos presentes na figura foram selecionados, pois todos eles têm 100% de afinidade pelos sete HLAs escolhidos.

5.1.6 Predição de epítopos lineares com afinidade pelo receptor de antígeno de

célula B

A resposta imune contra o parasito envolve a resposta celular e humoral

(CALDAS et al., 2008). A resposta humoral à antígenos proteicos é dependente do

reconhecimento por linfócitos T auxiliares. Estas células interagem com os linfócitos

B, estimulando a expansão clonal, mudança de classe, maturação de afinidade e

diferenciação em linfócitos B de memória (MESQUITA JÚNIOR et al., 2010). Este é

um evento inicial crucial para a produção da resposta humoral contra parasitos

extracelulares, levando à produção de anticorpos com alta capacidade de

reconhecimento do antígeno (HARDTKE; OHL; FÖRSTER, 2005).

O complexo BCR, responsável pelo reconhecimento de antígenos pelas células

B, é composto por molécula de anticorpo transmembrana associada a duas cadeias

de sinalização. As imunoglobulinas das classes M e D são os anticorpos de membrana

receptores de antígenos de células B virgens e, juntamente com Igα e Igβ, que são

60

cadeias proteicas ligadas não covalentemente à imunoglobulina receptora,

transduzem o sinal gerado após o reconhecimento do antígeno. Os antígenos

proteicos são internalizados, processados e apresentados. A ativação de células B

por antígenos tem como efeito o aumento da expressão de moléculas de HLA de

classe II em sua superfície, que apresentam o antígeno às células T auxiliares

previamente ativadas, que são fortes estimuladoras da proliferação e diferenciação de

células B (ABBA; LICHTMAN; PILLAI, 2012).

Para compor uma proteína multiepitopo recombinante, é necessário trabalhar

com epítopos lineares, uma vez que epítopos conformacionais têm uma grande

probabilidade de não manterem a sua imunorreatividade, sendo que provavelmente a

sua integridade conformacional não seria mantida quando incorporados à proteína

recombinante (DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006). Estudos realizados por De Souza e

colaboradores (2018) selecionaram um epítopo linear, capaz de ser reconhecido por

IgG em soro de indivíduos infectados, sendo candidato promissor para o diagnóstico

de S. mansoni.

Para a predição de epítopos lineares com afinidade por BCR, as partes

expostas das proteínas que geraram antígenos com afinidade por moléculas de HLA

de classe II, foram submetidas ao programa ABCpred. Foram preditos epítopos com

sequência de 16 aminoácidos e aqueles que apresentassem threshold acima de 0.51

foram considerados. A Figura 11 representa parte do resultado gerado pela análise

da proteína Smp_179660.

Com objetivo de selecionar epítopos para cada região exposta, as sequências

de aminoácidos dos epítopos preditos com afinidade por moléculas de HLA de classe

II e BCR foram então comparadas. Aqueles reconhecidos, ao mesmo tempo com o

mínimo de doze aminoácidos em comum, por estas duas moléculas do sistema imune

foram selecionados. Este critério de seleção foi estabelecido com objetivo de

mimetizar o que acontece no organismo, visto que a ativação de linfócitos B por

antígenos proteicos é dependente de células T CD4.

Embora algumas sequências de cada epítopo não tenham tido 100% de

compatibilidade entre BCR e HLAs, a literatura afirma que os anticorpos reconhecem

determinantes lineares formados por cerca de seis aminoácidos (ABBA; LICHTMAN;

PILLAI, 2012). Baseado nisto, acredita-se que, apesar das células B não

reconhecerem a sequência total de certos epítopos selecionados para HLA, eles

podem ser potenciais alvos antigênicos, uma vez que podem ser reconhecidos por

61

anticorpos em soros de pacientes infectados e serem utilizados como uma alternativa

para diagnóstico. Carvalho e colaboradores (2017) obtiveram, por meio de tais

análises, epítopos de proteínas hipotéticas e também de proteínas já descritas e que

foram reconhecidos por ambas as moléculas do sistema imune, apresentando alta

sensibilidade e especificidade, sendo ótimos candidatos para diagnosticar a infecção

por S. mansoni.

Figura 11. Predição de epítopos lineares com afinidade por BCR. Todos os epítopos presentes na figura têm threshold acima de 0.51 e foram considerados para a próxima etapa.

5.1.7 Predição de antigenicidade

A antigenicidade de um epítopo refere-se à capacidade de interação com o

sítio de ligação (paratopo) do anticorpo (VAN REGENMORTEL, 2001). Uma proteína

considerada antigênica é capaz de ser reconhecida com alta sensibilidade e

especificidade por soro de pacientes infectados (DIAS et al., 2017). Estudos

realizados por Mohammad e colaboradores (2016), utilizando o preditor de

antigenicidade VaxiJen, selecionaram-se epítopos ditos como antigênicos, sendo

candidatos promissores para a composição de vacinas e kits de diagnóstico. Dito isso,

62

é de extrema importância o uso de uma ferramenta de bioinformática capaz de

predizer a probabilidade antigênica de um epítopo, proporcionando um

direcionamento na triagem de alvos, o que visa a elaboração de um kit de diagnóstico

com alta sensibilidade e especificidade.

Sendo assim, os epítopos selecionados pelas análises anteriores foram

submetidos ao VaxiJen. A ferramenta faz a predição de antigenicidade de acordo com

cada tipo de organismo. Para parasito, o threshold é 0.5, sendo considerados

antigênicos os epítopos que alcançassem este valor, segundo a predição. Após a

análise, somente os epítopos preditos como antigênicos foram considerados para a

montagem da proteína multiepitopo. A Figura 12 representa o resultado da predição

de antigenicidade dos epítopos Smp_145040.

Figura 12. Predição de antigenicidade realizada pelo programa VaxiJen. Este epítopo foi considerado antigênico, tendo valor de antigenicidade de 1.2021.

5.1.8 Análise de homologia

A análise de homologia entre os epítopos e proteínas humanas ou proteínas de

outros helmintos é importante para a triagem de candidatos para kits de diagnóstico.

O sistema imune elimina ou regula autoantígenos reativos, sendo assim, os epítopos

que apresentam homologia significativa com proteínas humanas são considerados de

63

baixa imunogenicidade (CARVALHO et al., 2011). Além disso, as reações cruzadas

entre helmintos podem dificultar o diagnóstico preciso de uma determinada doença,

devido à presença de epítopos antigênicos comuns, em diferentes espécies de

parasitas (ISHIDA et al., 2003). Esta análise foi utilizada em diversos estudos,

destacando a sua importância (CARVALHO et al., 2011; CARVALHO et al., 2017; DE

SOUZA et al., 2018; LOPES et al., 2017).

Todos os epítopos selecionados pela última análise foram submetidos à análise

de homologia pelo programa NCBI Blast+. Foi possível excluir aqueles epítopos

preditos com homologia significativa com proteínas de outras espécies

filogeneticamente relacionadas ou não, evitando assim resultados falso-negativos ou

falso-positivos em testes. Não foi observada homologia com outros helmintos, e

aqueles epítopos que apresentaram homologia acima de 60% com proteínas

humanas foram descartados, seguindo o critério utilizado por Carvalho e

colaboradores (2011).

Após esta última análise, todos os epítopos selecionados possuem todos os

critérios de seleção das análises in silico, sendo possível selecionar os melhores

epítopos para comporem a proteína multiepitopo. Para isto, optou-se por selecionar

cinco epítopos, com sequência de 15 aminoácidos cada. A seleção final foi baseada

nos maiores valores de antigenicidade, sendo possível selecionar 5 melhores epítopos

dentro dos critérios estabelecidos. A Tabela 2 representa os epítopos selecionados,

bem como suas proteínas de origem, seu valor de antigenicidade e o número de

aminoácidos (aa) que as moléculas HLA classe II e BCR reconhecem.

Tabela 2: Epítopos selecionados para comporem a proteína rmultiepitopo.

Proteína Epítopo Valor de

antigenicidade

Reconhecimento

por HLA classe II

Reconhecimento

por BCR

Smp_159780 Ep1 1.4179 15 aa 12 aa

Smp_179660 Ep2 1.3869 15 aa 15 aa

Smp_126900 Ep3 1.2524 15 aa 15 aa

Smp_145040 Ep4 1.2021 15 aa 12 aa

Smp_159780 Ep5 1.1744 15 aa 14 aa

64

5.1.9 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do parasito

O banco de dados GeneDB dispõe de informações sobre o transcriptoma das

proteínas de S. mansoni, onde se pode verificar a probabilidade de expressão da

proteína nas diferentes fases de vida do parasito. Esta informação foi analisada para

as proteínas correspondentes aos epítopos selecionados.

Neste contexto, mediante o estudo desta informação, verificou-se que todas as

proteínas são expressas em todas as fases do parasito, com diferença de níveis de

expressão nas diferentes fases de vida. Porém, todas apresentaram maior nível de

expressão em esquistossômulos. A Figura 13 representa a predição das proteínas

correspondentes aos epítopos selecionados para comporem a proteína multiepitopo

recombinante.

Figura 13. Predição da expressão das proteínas correspondentes aos epítopos

selecionados nas diferentes fases de vida do parasito. C: cercária; 3S:

esquistossômulo de 3h; 24S: esquistossômulo de 24h; A: verme adulto. A: predição

da proteína Smp_159780. B: predição da proteína Smp_179660. C: predição da

proteína Smp_126900. D: predição da proteína Smp_145040. Nota-se que as

proteínas são expressas em todas as fases de vida do parasito, tendo maior

expressão na fase esquistossômulo de 24h.

A B

C D

65

Diante das análises apresentadas, sugere-se que a utilização dos epítopos

selecionados a partir destas proteínas proporcionará um diagnóstico da doença na

fase aguda e crônica. A possibilidade de diagnosticar a doença na fase aguda, uma

vez que que as proteínas possuem maior nível de expressão nas fases iniciais de vida

do parasito (cercária e esquistossômulo), tem relevância na importância clínica. Isso

acontece porque um método de diagnóstico que possibilite a detecção da doença na

fase aguda é crucial para evitar as reações patológicas irreversíveis causadas pelo

depósito de ovos em tecidos e órgãos (HUSSEIN et al., 2012), permitindo o tratamento

precoce da doença (BAHGAT et al., 2011). Como consequência, pode ser observada,

junto às medidas adequadas de controle, a diminuição da transmissão e maior

controle sobre a prevalência da doença.

5.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE

A necessidade de mais de um epítopo e ou proteína recombinante para garantir

um diagnóstico sensível e específico pode resultar em um aumento no custo final

deste kit. Em contraste, a estratégia promissora de uma proteína multiepítopo pode

reduzir a complexidade do procedimento e minimizar o custo final dos kits de

diagnóstico (DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006).

A construção de proteínas multiepitopo recombinantes contendo uma alta

densidade de epítopos racionalmente selecionados tem sido uma alternativa para a

detecção de anticorpos no diagnóstico. Estudos realizados por Chao e colaboradores

(2016) para S. japonicum, demonstraram que a proteína multiepitopo recombinante

tem maior potencial de ser reconhecida por soro de indivíduos infectados do que por

antígenos separados. Além disso, diversos trabalhos publicados já relataram que

essas proteínas exibem uma ampla habilidade para expor os epítopos constituintes

com grande eficiência, resultando em maior sensibilidade e especificidade do teste e

abrangendo diagnóstico para várias doenças (ANANDARAO et al., 2005, 2006;

CAMUSSONE et al., 2009; CHENG et al., 2011; DAI et al., 2012; DE SOUZA et al.,

2013; DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006; DUTHIE et al., 2010; FARIA et al., 2015; GALDINO

et al., 2016; HOUGHTON et al., 2000; LIN; CHEN; YAN, 2008; TRIPATHI et al., 2007).

Para o desenho racional da quimera, todos os cinco epítopos selecionados

pelas análises in silico foram utilizados para a construção da mesma, no qual foram

66

inseridos linkers flexíveis entre os epítopos. Ao final da sequência, na porção C-

terminal, foram inseridos seis resíduos de histidina (H) para permitir a detecção e

purificação da proteína recombinante.

A proteína recombinante gerada possui 304 aminoácidos, sendo a sequência

dos epítopos repetida três vezes para atingir a massa molecular desejada. Todas as

possibilidades de posições dos epítopos foram testadas, alterando-se a ordem de

cada um. A antigenicidade de cada tentativa de proteína multiepitopo recombinante

foi conferida pelo programa VaxiJen e a selecionada possui antigenicidade no valor

de 1.0738.

A Figura 14 representa a disposição dos epítopos para a formação da proteína

rMEBIOSM.

Figura 14. Desenho da proteína multiepitopo recombinante rMEBIOSM. Os epítopos de cada proteína foram dispostos de forma sequencial, tendo como início o Ep2 (proteína de origem Smp_179660), seguido por Ep3 (proteína de origem Smp_126900), Ep4 (proteína de origem Smp_145040), Ep5 (proteína de origem Smp_159780) e Ep1 (proteína de origem Smp_159780). Entre cada epitopo está presente o linker flexível. A cadeia proteica termina com uma cauda de seis histidinas (H).

Também como critério de seleção, a estrutura terciária de cada possível

proteína multiepitopo foi predita pelo programa Phyre2. A Figura 15 representa a

estrutura da proteína multiepitopo rMEBIOSM predita pelo Phyre2.

A predição da estrutura é baseada em modelos já existentes em banco de

dados. Aquelas sequências de proteína que tiveram a estrutura preditas a serem muito

enoveladas foram descartadas, pois este enovelamento poderia ser um impedimento

para o reconhecimento de anticorpos. Dipti e colaboradores (2006) obtiveram uma

predição de estrutura similar para a proteína recombinante do estudo em questão,

sendo justificado o uso desta pela exposição dos epítopos, no qual eles estariam

provavelmente mais acessíveis para as interações com anticorpos, aumentando a

sensibilidade e especificidade na reatividade com os anticorpos. A reatividade entre

os epítopos e anticorpos foi confirmada experimentalmente, afirmando a teoria de

maior acessibilidade dos epítopos.

Ep2 Ep3 Ep4 Ep5 Ep1 HHHHHH

67

Figura 15. Predição da estrutura da proteína multiepitopo recombinante pelo programa Phyre2.

A predição da estrutura da proteína recombinante selecionada apresentou

baixa confiança e teve 89% da sua sequência predita como desordenada. Regiões

desordenadas não apresentam uma estrutura terciária bem definida

(SCHLESSINGER et al., 2011; VICEDO et al., 2015) e proporcionam um

reconhecimento molecular promíscuo, com ligação transitória para vários alvos e por

isso, ajudam a aumentar a complexidade das interações proteicas (GU; HILSER,

2009; TOMPA; SZÁSZ; BUDAY, 2005). A baixa similaridade e nível de confiança da

predição podem ser justificada por se tratar de uma proteína multiepitopo

recombinante inexistente na natureza.

O valor do pI teórico e da massa molecular da proteína selecionada foram

conferidos utilizando o programa Compute pI/mW. O pI é o valor no qual o potencial

Hidrogeniônico (pH) de uma molécula se encontra com a carga líquida igual a zero

(BROOKS; FELL; FREI 1986) e este valor é importante para a etapa de diálise da

proteína, uma vez que durante o processo, o pH deve manter uma determinada

distância do pI, caso contrário haverá a precipitação da proteína. A massa molecular

predita da proteína auxiliou na identificação ao se comparar a massa em relação a um

68

marcador de peso molecular padrão na eletroforese do tipo SDS-PAGE. A Figura 16

representa o resultado para massa molecular e pI de rMEBIOSM.

Figura 16. Ponto isoelétrico teórico e massa molecular da rMEBIOSM. O ponto isoelétrico teórico e massa molecular são de 8.78 e 30.8 kDa, respectivamente.

A sequência proteica foi enviada para a empresa Epoch Biolabs (Fort Bend

County, Texas, EUA), que realizou a síntese do gene contendo códons preferenciais

para E. coli e a clonagem deste no vetor de expressão pET21a.


PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM

A E. coli é um dos possíveis organismos de escolha para expressão de

proteínas recombinantes e se tornou a plataforma de expressão mais popular

(ROSANO; CECCARELLI, 2014). A escolha da E. coli para a expressão da proteína

rMEBIOSM se deve às várias vantagens apresentadas pela mesma, como, a

simplicidade relativa, cultivo barato e rápido, genética já caracterizada e existência de

69

várias ferramentas compatíveis para a biotecnologia (SORENSEN; MORTENSEN,

2005).

Vários autores utilizaram a E. coli para expressão de proteínas recombinantes,

devido às vantagens apresentadas por este microrganismo, tendo a expressão

realizada com sucesso (ARORA; KHANNA, 1996; BRIAND et al., 2016; DE SOUZA et

al., 2013; DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006; FREIHERR VON ROMAN et al., 2014; GALDINO

et al., 2016; MCKINSTRY et al., 2014; VOULGARIDOU et al., 2013).

A preparação de células competentes é realizada para capacitar a célula a

receber a construção plasmidial. Logo após as células se tornarem competentes,

inicia-se o protocolo de transformação. A transformação bacteriana teve como objetivo

inserir o plasmídeo pET::rMEBIOSM em células E.coli BL21 pLysS, pLysE, C41 (DE3)

e Arctic Express (DE3).

A transformação é confirmada como bem sucedida quando é possível visualizar

a presença de colônias em placas de Petri com meio LB sólido, contendo ampicilina

na concentração final de 100μg/mL, sendo esta utilizada como marca de seleção dos

clones recombinantes.

Marcas de seleção são utilizadas para conferir resistência a várias substâncias

(VICKERS et al., 2013). As mais utilizadas para a seleção de bactérias são os

antibióticos ampicilina e kanamicina (HERSHFIELD et al., 1974; JANG; MAGNUSON,

2013; SUTCLIFFE, 1978), a qual permite a seleção das células transformantes que

receberam o plasmídeo, ao adicionar o antibiótico relacionado a marca de seleção no

meio de cultura (MANNA et al., 2013; PRESTON, 2003; SAMBROOK; RUSSELL,

2001). No caso do plasmídeo pET21a::rMEBIOSM, a marca de seleção utilizada foi o

gene que confere resistência a ampicilina, que codifica a enzima β-lactamase, a qual

hidrolisa o anel β-lactâmico presente na ampicilina (BRIÑAS et al., 2002;

LIVERMORE, 1995).

Portanto, somente as células que receberam o plasmídeo são capazes de

crescer em meio contendo ampicilina. As transformações com as cepas pLysS, pLysE,

C41(DE3) e Arctic Express (DE3) foram bem sucedidas.

70

5.4 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM E ANÁLISE POR GEL

SDS-PAGE

O promotor é o componente-chave de um sistema de expressão, pois ele

controla a iniciação da transcrição de genes associados (KAUR; KUMAR; KAUR,

2018). O sistema de expressão mais utilizado para E. coli é o pET, contendo o

promotor T7 (GRÄSLUND et al., 2008; JIA; JEON, 2016), sendo o sistema de

expressão de escolha para este estudo.

A expressão com o sistema pET requer uma célula hospedeira engenheirada

com a região DE3 do bacteriófago λ, gene que codifica a T7 RNA polimerase

(MIERENDORF; YEAGER; NOVY, 1994). A atividade do promotor T7 é forte e a

produção da proteína recombinante pode totalizar até 50% das proteínas celulares

(JIA; JEON, 2016; STUDIER; MOFFATT, 1986). O gene da T7 RNA polimerase está

sob o controle do promotor lacUV5, que é ativado na presença de IPTG (JIA; JEON,

2016; PAN; MALCOLM, 2000). Além disso, o genoma da E. coli e o plasmídeo pET

contém o gene LacI, o qual codifica o repressor do promotor lacUV5. Assim, a

transcrição da T7 RNA polimerase se inicia com a presença de IPTG, que se liga e

desencadeia a liberação do repressor do operador lac, iniciando a transcrição do gene

de interesse (SORENSEN; MORTENSEN, 2005). Por outro lado, a expressão de

proteínas recombinantes podem ser controladas por meio da coexpressão da lisozima

T7, a qual se liga à T7 RNA polimerase e inibe a transcrição do gene de interesse

(JIA; JEON, 2016; STANO; PATEL, 2004).

A cepa BL21 de E. coli e seus derivados são os hospedeiros mais utilizados

para a produção de proteínas recombinantes, sendo que estas cepas são deficientes

das proteases lon e ompT, que podem aumentar a instabilidade da proteína (JIA;

JEON, 2016).

Diante disso, as células hospedeiras escolhidas inicialmente para a expressão

heteróloga foram as cepas BL21 (λ DE3) pLysS e pLysE, denominadas assim pelo

plasmídeo que possuem, o qual produz a lisozima T7 (MIERENDORF; YEAGER;

NOVY, 1994). As células hospedeiras contendo o plasmídeo pLysS produzem baixas

quantidades de lisozima T7, enquanto que células contendo o plasmídeo pLysE

produzem uma grande quantidade da enzima, sendo então a cepa com maior controle

rigoroso para a produção de proteínas recombinantes nas cepas λDE3

(MIERENDORF; YEAGER; NOVY, 1994; STUDIER, 1991). Como alternativa, as

71

cepas C41 (DE3) e Arctic Express (DE3) foram utilizadas para tentar expressar a

proteína multiepitopo.

A cepa C41 (DE3) é uma mutante de BL21 (DE3) e é superior a esta na

expressão de várias proteínas heterólogas (DUMON-SEIGNOVERT; CARIOT;

VUILLARD, 2004). Estudos realizados por Miroux e Walker (1996) demonstraram que

C41 (DE3) foi mais eficaz do que BL21 (DE3) para a expressão de proteínas

globulares e de membranas que possam ter efeito tóxico. Além disso, com a utilização

da cepa, foi possível a expressão de altos níveis de proteínas que foram incapazes

de serem expressas em grandes quantidades em BL21 (DE3) (PAPANEOPHYTOU;

KONTOPIDIS, 2014), com trabalhos já publicados sobre a utilização de C41 (DE3)

para a expressão de proteínas difíceis de serem expressas (ARECHAGA et al., 2003;

PAPANEOPHYTOU; KONTOPIDIS, 2014; SMITH; WALKER, 2003; SORENSEN;

SPERLING-PETERSEN; MORTENSEN, 2003).

A cepa Arctic Express (DE3) é uma mutante de BL21 (DE3) que auxilia na

expressão de proteínas em formas mais solúveis (HONG; RASHID; SANTIAGO-

VAZQUEZ, 2013). Esta cepa possui, respectivamente, a chaperonina e co-

chaperonina adaptadas ao frio Cpn60 e Cpn10, retiradas da bactéria psicrofílica

Oleispira antarctica (FERRER et al., 2004; ROSANO; CECCARELLI, 2014). Estas

conferem processamento melhorado de proteínas a temperaturas mais baixas,

aumentando potencialmente o rendimento da proteína recombinante ativa e solúvel.

Estudos realizados por Hartinger e colaboradores (2010) concluíram que, a cepa

Arctic Express (DE3), quando comparada à outras cepas, proporcionou uma

expressão mais eficiente de uma enzima que geralmente é produzida na forma de

corpos de inclusão, gerando uma quantidade satisfatória da enzima ativa e na forma

solúvel.

Posteriormente a etapa de transformação com o plasmídeo, iniciou-se a

indução da expressão da proteína de interesse, no intuito de verificar a capacidade

das cepas expressarem a proteína rMEBIOSM, sendo avaliada por meio de um gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE). Com objetivo de realizar a expressão da proteína

multiepitopo, foram testadas diferentes condições da indução.

O protocolo utilizado por Galdino e colaboradores (2016) foi o escolhido

inicialmente para a expressão da proteína recombinante com as cepas pLysS e

pLysE. O protocolo de indução utilizado por estes autores tem como temperatura pré

e pós-indução de 37ºC e IPTG como indutor, com concentração final de 1mM.

72

Porém, aparentemente, não houve expressão da proteína recombinante

utilizando este protocolo. A Figura 17 traz o resultado de indução de pLysS e pLysE,

onde foram aplicados no gel SDS-PAGE o sobrenadante da indução.

Uma vez que não houve o aparecimento de uma banda mais evidente na altura

correspondente a massa molecular teórica da proteína rMEBIOSM (Figura 17), foram

modificadas três variáveis na indução como tentativa para expressar a proteína

recombinante: temperatura pós-indução; indutor e concentração do indutor IPTG,

sendo descritas por maximizar a solubilidade de proteínas recombinantes

(HATAYAMA et al., 2012; SINGHA et al., 2017; SONG et al., 2012; WINGFIELD,

2005).

Figura 17. Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e pLysE. M- marcador de massa molecular. MW - massa molecular. 0, 0.5, 1.5 e 2.5 correspondem ao tempo de indução em horas das amostras coletadas. Da esquerda para a direita estão as amostras de indução de pLysS, logo em seguida está o marcador, e nas últimas canaletas estão as amostras de indução de pLysE (neste gel foram aplicados somente o sobrenadante das amostras). Nota-se que não houve expressão da proteína rMEBIOSM, que tem massa molecular de aproximadamente 30kDa.

A expressão de proteínas heterólogas em E. coli apresenta limitações, como,

agregação e mal dobramento da proteína recombinante, resultando em depósito de

corpos de inclusão biologicamente inativos no citoplasma. Estes corpos de inclusão

são formados, geralmente, como resultado da inabilidade da proteína se dobrar

73

rapidamente, levando ao acúmulo de intermediários ou pela falta de interação da

proteína com moduladores apropriados (SINGHA et al., 2017).

Sendo assim, diminuir as taxas de produção da proteína recombinante pode

beneficiar a sua solubilidade, pois ela terá mais tempo para se dobrar devidamente

(ROSANO; CECCARELLI, 2014). O método mais utilizado para diminuir a síntese de

proteína é reduzir a temperatura de indução (ROSANO; CECCARELLI, 2014;

SCHEIN; NOTEBORN, 1988; VASINA; BANEYX, 1997; VERA et al., 2007). Dessa

forma, uma temperatura mais baixa irá diminuir a agregação proteica, que é

favorecida a altas temperaturas, uma vez que as interações hidrofóbicas são

dependentes da temperatura (BALDWIN, 1986; MAKHATADZE; PRIVALOV, 1995;

ROSANO; CECCARELLI, 2014; SCHELLMAN, 1997). Corroborando com estes

dados, estudos realizados por Voulgaridou e colaboradores (2013), demonstraram

que a solubilidade da proteína ALDH3A1 aumentou de 2.5% para 35.5%, quando a

temperatura foi reduzida de 37°C para 25°C.

Além disso, o efeito de indutores na formação de corpos de inclusão acontece

mais comumente em sistemas com promotores fortes (KAUR; KUMAR; KAUR, 2018).

Baixos níveis de indutor podem resultar em uma indução ineficiente, porém, a

concentração de indutor em excesso pode levar a efeitos tóxicos, como diminuição do

crescimento das células e, também, redução da produção da proteína recombinante.

Estudos realizados por Mühlmann e colaboradores (2017), otimizaram a concentração

de IPTG para a indução da proteína recombinante do estudo. Os melhores resultados

obtidos foram com a concentração de IPTG entre 0.05 a 0.1mM, sendo que estes

valores se encontram longe da concentração recomendada de 1mM. Em alternativa,

a lactose pode ser utilizada como indutor, diminuindo os custos da expressão e a

toxicidade causada pelo IPTG, sendo capaz de induzir a expressão com a mesma

eficiência do IPTG (NEUBAUER et al., 1992).

Diante do exposto, o segundo protocolo de indução testado teve como

mudança a temperatura pós-indução, sendo diminuída para 25ºC, e a concentração

do indutor, utilizando IPTG na concentração final de 0,3mM. O terceiro protocolo

testado teve como mudança o indutor utilizado, sendo a lactose usada para induzir a

expressão da proteína, com temperatura pós-indução de 37ºC e em uma

concentração final de 1mM. Porém, mesmo modificando estas variáveis na indução,

aparentemente não houve expressão da proteína rMEBIOSM.

74

Como alternativa de expressão, foram utilizadas as cepas C41 (DE3) e Arctic

Express (DE3). Em ambos os protocolos de indução, a concentração final de IPTG foi

de 1mM. Porém, para a cepa C41, utilizou-se a temperatura pós-indução de 37°C e,

para a cepa Arctic Express, temperatura pós indução de 12ºC. Segundo instruções

do fabricante, Agilent Technologies, a expressão utilizando Arctic Express (DE3) deve

ser realizada entre 10ºC a 13ºC, corroborando com a expressão de proteínas

recombinantes nessa faixa de temperatura, por alguns autores (HARTINGER et al.,

2010; MUDAPAKA; TAYLOR, 2015; POROWIŃSKA; CZARNECKA; KOMOSZYŃSKI,

2014; SHAH; WALLING, 2017). Por não se saber o motivo da proteína recombinante

não estar sendo expressa, as cepas C41 e Arctic Express foram escolhidas por suas

capacidades, respectivamente, de expressar proteínas tóxicas e de difícil expressão

e por aumentar a solubilidade da proteína recombinante, sendo estes problemas

comuns encontrados na expressão de proteínas heterólogas. No entanto, estas cepas

também não foram capazes de expressarem a proteína recombinante rMEBIOSM.

Na eletroforese em gel de SDS-PAGE, a fração solúvel (sobrenadante) e

insolúvel (pellet), resultante da indução de todas as cepas, foram verificadas para se

certificar que a proteína não estava presente em forma de corpos de inclusão.

Entretanto, não foi possível visualizar a banda proteica correspondente à massa

molecular teórica da rMEBIOSM no gel SDS-PAGE, independente do protocolo de

indução realizado, podendo-se sugerir que nenhuma das cepas foi capaz de

expressar a proteína recombinante, sendo confirmado posteriormente pela purificação

e Dot-Blot. A Figura 18 traz o resultado de indução de pLysS e pLysE, onde foram

aplicados no gel SDS-PAGE o sobrenadante e o pellet resultante da indução.

Alguns fatores têm impacto na expressão de proteínas recombinantes,

resultando em uma expressão de baixo nível ou nenhuma expressão, como: códon

do gene, estabilidade do RNA mensageiro (mRNA), degradação (SINGHA et al.,

2017), toxicidade e insolubilidade da proteína recombinante (ROSANO;

CECCARELLI, 2014).

O código genético do mRNA é redundante, com 61 códons sendo traduzidos

em 20 aminoácidos diferentes, sendo que cada aminoácido pode ser codificado por

até 6 códons diferentes. Porém, alguns códons são usados com mais frequência do

que outros, sendo este fenômeno chamado de codon usage bias (BRANDIS;

HUGHES, 2016). Portanto, cada organismo tem uma tendência para códons

preferenciais e isto reflete na eficiência com que moléculas de RNA transportador

75

(tRNA) são capazes de reconhecer códons diferentes (GOMES et al., 2016). Dito

isso, se o gene clonado contém códons incomuns ao do hospedeiro, no momento da

síntese, ocorre a depleção de tRNA de baixa abundância. Isto pode acarretar em uma

má incorporação de aminoácidos, afetando os níveis da expressão da proteína

recombinante e sua atividade (GUSTAFSSON; GOVINDARAJAN; MINSHULL, 2004;

ROSANO; CECCARELLI, 2014). Porém, a empresa Epoch Biolabs, responsável pela

síntese do gene e clonagem no plasmídeo pET21a, otimiza a sequência de

nucleotídeos para a expressão em E. coli, o qual também foi conferido pelo programa

da GenScript (https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis), podendo

descartar que este seja o problema da expressão da proteína recombinante.

Figura 18. Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e pLysE do sobrenandante e pellet. M- marcador de massa molecular. MW - massa molecular. 0.0P e 2.5P correspondem ao pellet do tempo de 0h e 2.5h, respectivamente. 0.0S e 2.5S correspondem ao sobrenadante do tempo de 0h e 2.5, respectivamente. Da esquerda para a direita estão as amostras de indução de pLysS, logo em seguida está o marcador, e nas últimas canaletas estão as amostras de indução de pLysE. Nota-se que não houve expressão da proteína rMEBIOSM, que tem massa molecular de aproximadamente 30kDa.

76

Para verificar se a proteína recombinante estava sendo tóxica para a célula

hospedeira ou se ela estava sendo produzida em forma de corpos de inclusão,

diferentes cepas e protocolos de expressão foram testados. Na expressão em E. coli,

o vazamento da expressão é um grande problema encontrado (KAUR; KUMAR;

KAUR, 2018), causada por um pequeno vazamento da produção da T7 RNA

polimerase, levando a produção da proteína recombinante sem a presença do indutor.

Sendo assim, se a proteína for tóxica ao hospedeiro, este vazamento pode inibir o

crescimento celular e reduzir o rendimento total da proteína (GUAN et al., 2013;

SINGHA et al., 2017). Entretanto, as cepas pLysS e pLysE podem evitar a toxicidade

causada pela produção da proteína antes da indução, devido a produção da lisozima

T7 (ROSANO; CECCARELLI, 2014). Estas cepas, juntamente com a C41 (DE3), não

foram capazes de expressar a proteína recombinante, descartando a possibilidade da

toxicidade da proteína. Além disso, a insolubilidade da proteína também foi

descartada, uma vez que foram testados diferentes protocolos com cepas diferentes,

descritos por aumentar a solubilidade da proteína recombinante.

Em E. coli, a meia-vida do mRNA varia de alguns segundos até 20 minutos

(SINGHA et al., 2017), tempo muito mais curto do que em eucariotos, podendo

representar um passo restringente na tradução e expressão de proteínas

recombinantes (MAKINO; SKRETAS; GEORGIOU, 2011). Deste modo, alguns fatores

estão envolvidos na degradação do transcrito, como, exonucleases, endonucleases,

estrutura secundária e sítio de ligação para o ribossomo (SCHUMANN; FERREIRA,

2004). Os mRNAs são degradados principalmente pela enzima exonuclease 3’→ 5’

e endonuclease RNase E (SINGHA et al., 2017), impossibilitando a tradução da

proteína. Ainda, a sequência denominada Shine-Dalgardo foi descoberta na

extremidade 5’ do mRNA de bacteriófago, a qual interage com a extremidade

complementar 3’ do ribossomo 16S durante a iniciação da tradução (SCHUMANN;

FERREIRA, 2004; SHINE; DALGARNO, 1974). Esta sequência aumenta de 3 a 6

vezes a produção de proteínas (RINGQUIST et al., 1992; SCHUMANN; FERREIRA,

2004). Além disso, o espaçamento entre a sequência e o códon de iniciação também

influencia na eficácia da tradução, podendo variar de 5 a 13 aminoácidos (GOLD,

1988; SCHUMANN; FERREIRA, 2004), com espaçamento mínimo requerido de 3 a 4

aminoácidos (SINGHA et al., 2017). Logo, a presença de estrutura secundária do

mRNA na extremidade 5’, sequestrando a sequência Shine-Dalgarno, reduz

significativamente a tradução do transcrito (SCHUMANN; FERREIRA, 2004). Sendo

77

assim, a afinidade desta sequência com o ribossomo é um fator crítico, influenciando

a eficácia da expressão de proteínas (JOSEPH; PICHAIMUTHU; SRIMEENAKSHI,

2015; KOMAROVA et al., 2005; VIMBERG et al., 2007). Dito isso, estes podem ser

possíveis fatores pelo qual a proteína rMEBIOSM não foi expressa, visto que as cepas

utilizadas não são mutantes que não produzem endonucleases e exonucleases, que

poderia causar a degradação do mRNA. Além disso, a sequência Shine-Dalgarno não

foi inserida no gene para a proteína rMEBIOSM, podendo ser fator limitante para a

tradução do mRNA, visto a sua importância para este processo.

Um outro grande problema encontrado na produção de proteínas

recombinantes em E. coli é a degradação proteica, afetando a qualidade e quantidade

da produção de proteína (SINGHA et al., 2017). A instabilidade da proteína dentro do

hospedeiro procarionte é uma limitação na produção de proteínas de eucariotos

(FAKRUDDIN et al., 2013). Sendo assim, a proteína pode ser degradada por

proteases antes da detecção da expressão por testes (DUONG-LY; GABELLI, 2014).

Vários aspectos podem afetar a instabilidade da proteína, como, a sequência de

aminoácidos, a construção da proteína, a célula hospedeira, condições de expressão

e purificação (JOSEPH; PICHAIMUTHU; SRIMEENAKSHI, 2015).

A adição de inibidores de proteases no meio, como leupeptina e aprotinina,

podem ajudar a prevenir a degradação da proteína recombinante (DUONG-LY;

GABELLI, 2014). Além disso, muitas proteínas recombinantes são expressas com

tags ou sequências fusionadas para prevenir a degradação proteolítica e aumentar a

estabilidade. Ainda, a estabilidade da proteína recombinante pode ser melhorada e

aumentada com a adição de meios customizados para a produção, contendo traços

de metais, vitaminas e minerais, podendo servir como cofatores, grupos prostéticos

ou ligantes para proteína recombinante (JOSEPH; PICHAIMUTHU; SRIMEENAKSHI,

2015). Também, a secreção da proteína recombinante para o meio periplasmático

permite maior nível de expressão do que a secreção para o citoplasma, onde a

proteína pode ser degradada por proteases (FAKRUDDIN et al., 2013; HOFFMAN;

WRIGHT, 1985).

A susceptibilidade da proteína por proteases pode ser aumentada pela

presença de certos aminoácidos no N e C-terminal da proteína recombinante

(FAKRUDDIN et al., 2013). A presença de aminoácidos no N-terminal como arginina,

lisina, leucina, fenilananina, triptofano ou tirosina diminuem a meia-vida da proteína.

Estudos realizados por Tobias e colaboradores (1991), demonstraram que, proteínas

78

contendo estes aminoácidos no N-terminal tiveram meia-vida de 2 minutos, em

comparação a proteínas contendo outros aminoácidos, que têm meia-vida de mais de

10 horas. Além disso, O C-terminal de proteínas contendo aminoácidos não-polares

podem levar a rápida degradação, em contraste com proteínas contendo aminoácidos

polares ou com carga, que não são degradados (FAKRUDDIN et al., 2013;

GOTTESMAN; WICKNER; MAURIZI, 1997). O N-terminal da sequência da proteína

rMEBIOSM contém arginina, leucina, fenilananina e tirosina e o C-terminal é composto

praticamente por aminoácidos não-polares, podendo contribuir grandemente para a

instabilidade e degradação da proteína recombinante. Mesmo após várias tentativas

de expressar a proteína, o motivo da não expressão ou detecção permanece

desconhecido. Dessa forma, uma possível explicação seria a instabilidade da

rMEBIOSM, a qual pode estar sofrendo degradação por proteases, sendo tal processo

fortemente influenciado pela composição de aminoácidos no N e C-terminal,

justificando a não detecção da proteína rMEBIOSM pelos testes realizados.

5.5 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM E DOT-BLOT

Em expressão de proteínas recombinante, algumas podem estar mascaradas por

proteínas de peso molecular aproximado do hospedeiro no gel SDS-PAGE

(BIOSCIENCES, 2001) e neste caso, técnicas mais sensíveis são necessárias para

detectar a proteína recombinante. Objetivando confirmar se realmente a proteína

rMEBIOSM não foi expressa, foram realizados testes de purificação e Dot-Blot.

A purificação por meio de cromatografia de afinidade é um método eficiente que

utiliza tags com afinidade peptídica, as quais são fusionadas à proteína de interesse,

permitindo a sua purificação (BORNHORST; FALKE, 2000; JARVIK; TELMER, 1998;

NILSSON et al., 1997), sendo empregado para purificar proteínas recombinante

contendo tags de afinidade. Este método baseia-se na interação entre íon de metal

de transição (como o níquel) imobilizado em uma matriz e cadeias laterais de

aminoácidos específicos. Assim, a histidina é o aminoácido que tem a interação mais

forte com matrizes de íon metálicos imobilizados, logo, peptídeos contendo sequência

de resíduos consecutivos deste são retidos eficientemente na matriz, podendo ser

facilmente eluídos com imidazol (BORNHORST; FALKE, 2000; PORATH, 1992).

79

Portanto, realizou-se a purificação das amostras de indução da expressão, para

verificar a presença da proteína recombinante. Durante o processo, foram utilizadas

diferentes concentrações de imidazol, para avaliar qual concentração seria capaz de

eluir melhor a proteína. Somente as amostras de indução de pLysS e pLysE foram

purificadas, visto que as cepas C41 e Arctic Express obtiveram o mesmo resultado

em gel SDS-PAGE da indução, ou seja, não apresentaram expressão da proteína. As

amostras de pLysE e pLysS foram unidas e purificadas juntas.

O processo da purificação foi verificado por gel de eletroforese SDS-PAGE

12%. Para a análise em gel SDS-PAGE, não foram aplicadas todas as amostras

derivadas da purificação, sendo aplicadas aquelas que eram mais relevantes para

avaliar o resultado. A Figura 19 apresenta o resultado da purificação cujo as amostras

foram centrifugadas a 17000xg/15min/4ºC, não sendo possível visualizar a banda

correspondente à massa molecular da proteína rMEBIOSM em nenhum dos

protocolos de purificação realizados.

Figura 19. Análise por SDS-PAGE 12% da purificação da cepa pLysS. M- marcador de massa molecular. MW- massa molecular. FT- flow-through; L1- lavagem 1; L2- lavagem 2; E1 e E2- eluições 1 e 2 com 50mM de imidazol; E3 e E4- eluições 3 e 4 com 100mM de imidazol; E5 e E6- eluições 5 e 6 com 200mM de imidazol; E7 e E8- eluições 7 e 8 com 500mM de imidazol. Nota-se a ausência da banda de peso molecular aproximado à da proteína rMEBIOSM (30kDa).

80

O Dot-Blot é uma técnica bastante similar a técnica Werstern-Blot que permite

a detecção de proteínas (FALCONAR; ROMERO-VIVAS, 2013; GROEN et al., 2000;

IGLESIAS-FIGUEROA et al., 2016; WANG et al., 2008; ZHU et al., 2010), podendo

ser utilizado como alternativa ao ELISA, se mostrando uma técnica imunológica útil

que pode ser usada rotineiramente (GUILLEMIN et al., 2009).

Esta técnica foi utilizada como teste final para confirmação da não expressão

da proteína da rMEBIOSM. As alíquotas das amostras purificadas (lavagens e

eluições), resultantes da junção das amostras de pLysS e pLysE, foram utilizadas para

realizar o teste. Quando há a presença da proteína recombinante com cauda de

histidina na amostra, há reação de cor marrom ao adicionar o anticorpo anti-His

conjugado com HRP nos pontos da membrana onde a amostra foi aplicada. A Figura

20 representa o resultado do teste, onde não houve reação de cor entre a amostra e

o anticorpo anti-His.

Figura 20. Teste Dot-Blot. Pode-se concluir, pela ausência de cor na membrana Difluoreto de Polivinilideno utilizada, que não houve expressão da proteína recombinante rMEBIOSM.

A princípio, a seleção de hospedeiro para expressão baseava-se na

capacidade de realização da transcrição do gene, sendo garantia que o produto seria

expresso. Hoje, sabe-se que a compatibilidade do ambiente bioquímico do

hospedeiro, juntamente à sua capacidade de processar e traduzir a transcrição do

RNA, além da capacidade de modificar e sustentar a proteína no seu estado intacto e

funcional, são tão importantes quanto a capacidade de transcrição do gene (GREENE,

2004).

A E. coli foi o hospedeiro escolhido para a expressão da proteína recombinante

rMEBIOSM devido às suas vantagens para esta tecnologia, já descritas acima. Porém,

depois de vários testes realizados, conclui-se que este não é o hospedeiro adequado

81

para a expressão da proteína em questão, uma vez que não foi possível detectar a

presença proteína recombinante, mesmo após a utilização de diferentes protocolos e

diferentes cepas. Para tentar contornar o problema da expressão, células eucarióticas

podem ser utilizadas como sistemas de expressão alternativos ao sistema procarioto,

compreendendo sistemas de células de mamíferos, insetos, fungos e leveduras

(GOMES et al., 2016).

82

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A partir de proteínas transmembranas hipotéticas do parasito, foi possível

identificar e selecionar, por meio de análises in silico, epítopos antigênicos, que

apresentaram afinidade de ligação por moléculas de HLA de classe II e de BCR.

Realizou-se o desenho racional de uma proteína multiepitopo recombinante a

partir dos epítopos selecionados, para avaliação da capacidade de reconhecimento

por anticorpos contra o Schistosoma mansoni em ensaios sorológicos, in vitro.

A expressão da proteína multiepitopo recombinante não foi alcançada, não

sendo possível a sua detecção pelos testes realizados.

Mais testes são necessários para avaliar a capacidade antigênica da proteína

multiepitopo recombinante.

83

7 PERSPECTIVAS

Avaliar a capacidade de reconhecimento por anticorpos presentes no soro de

indivíduos infectados dos dois melhores epítopos selecionados, segundo a predição

de antigenicidade, os quais serão obtidos por síntese química.

Expressar a proteína multiepitopo em hospedeiro diferente, para posterior

purificação e avaliação do reconhecimento do soro de indivíduos infectados frente à

proteína, por anticorpos presentes no soro de indivíduos infectados.

84

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106

APÊNDICE

MEIO DE CULTURA E SOLUÇÕES

MEIO LB LÍQUIDO

Peptona de caseína 1,0 % (p/v)

Extrato de levedura 0,5 % (p/v)

NaCl 1,0 % (p/v)

O pH foi ajustado para 7,2.

MEIO LB SÓLIDO

Peptona de caseína 1,0 % (p/v)

Extrato de levedura 0,5 % (p/v)

NaCl 1,0 % (p/v)

Ágar 1,5 % (p/v)

O pH foi ajustado para 7,2.

SDS-PAGE

Tampão de corrida 5X Tris-Glicina pH 8.7

Tris base - 15,14 g

Glicina - 72,0 g

SDS - 5.0 g

Tampão de amostra SDS PAGE com β-mercaptoetanol

Tris-HCl - 50mM pH 6, 8

SDS - 2%

Azul de bromofenol - 0, 1%

Glicerol - 10%

β-mercaptoetanol - 10%

107

Gel de Concentração SDS-PAGE (5%)

H2O

Solução Bis-acrilamida - 30%

Tris-HCl - 1,0M pH 6, 8

SDS -10%

APS (Persulfato de amônio, do inglês: Ammonium persulfate) - 10%

TEMED (tetrametilelenodiamônio)

Gel de separação SDS-PAGE (12%)

H2O

Solução Bis-acrilamida - 30%

Tris-HCl - 1, 5 M pH 8, 8

SDS - 10%

APS - 10%

TEMED

Solução corante SDS-PAGE

Coomassie Blue R-250 - 0,25% (P/V)

Metanol - 40% (v/v)

Ácido Acético - 10% (v/v)

Solução Descorante SDS - PAGE

Metanol - 40% (v/v)

Ácido acético - 10% (v/v)

Purificação da proteína rMEBIOSM

Tampão de lise pH 8,0

NaH2PO4 1M - 50 mM

NaCl 5M - 300 mM

Imidazol 2M -10 mM

Ureia 8M - 9,6 g

108

Tampão de lavagem pH 8,0

NaH2PO4 1M - 50 mM

NaCl 5M - 300 mM

Imidazol 2M - 20 mM

Uréia 8M - 9,6g

Tampão de eluição pH 8,0

NaH2PO4 1M - 50 mM

NaCl 5M - 300 mM

Imidazol 2M – 50 mM (0,5mL); 100 mM (1 mL); 200 mM (2mL); 500 mM (5mL)

Uréia 8M - 9,6g

Dot-Blot

Tris-NaCl pH 7, 6

Tris - 50 mM

NaCl - 150 mM

Tampão PBST 1X

Tampão PBS 1 X

Tween-20 - 0,05% (v/v)

Tampão PBS-T-BSA

Tampão PBS 1 X

Tween- 20 - 0,05% (v/v)

Albumina 5%

Anticorpo monoclonal anti poli-histidina conjugado com peroxidase de rabanete (anti-

His-HRP, Sigma) na diluição de 1:1000 em solução de PBS-T-BSA

109

ANEXO

PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O MESTRADO

imunobioinformÁtica aplicada ao diagnÓstico de …§ão... · 2018-04-09 · para o controle e...

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