Imuno-senescência na Esquistossomose Crônica Humana

Ana Maria Caetano de FariaDepartamento de Bioquímica e Imunologia

ICB – UFMG

Palestra na Santa CasaBelo Horizonte

Junho 2004

Teoria explicativas da senescência 1. Stress oxidativo:

Paradoxo do oxigênio: necessário para a produção de energia

(ATP) mas potencialmente perigoso a longo prazo pela capacidade de geração de moléculas parcialmente reduzidas muito reativas,os radicais livres (O2

.-, H2O2 e OH.).

ATP

ADP + fosfato

Radicais livres

H+ H+ H+

Ubiquinona

Citocromo c ATP sintase

e-+O2+H+=H20e-

Radicais livres

ATP

Evidências a favor:

- Hiperexpressão de enzimas anti-oxidantes retarda o acúmulo de danos oxidativos e extende a expectativa máxima e média

de vida de Drosophila melanogaster;- variações na longevidade entre diferentes espécies correlaciona-se inversamente com os níveis de geração de

superóxido e H2O2 pela mitocôndria;- a restrição calórica diminui os níveis basais de stress oxidativo

e seus danos, retarda os comprometimentos celulares associados à idade e aumenta a expectativa de vida.

RatoDieta normal:

Tempo médio de vida: 23 mesesTempo máximo de vida: 33 meses

Restrição calórica: Tempo médio de vida: 33 meses

Tempo máximo de vida: 47 meses

AranhaDieta normal:

Tempo médio de vida: 50 diasTempo máximo de vida: 100 dias

Restrição calórica: Tempo médio de vida: 90 dias

Tempo máximo de vida: 139 dias

Peixe GuppyDieta normal:

Tempo médio de vida: 33 mesesTempo máximo de vida: 54 meses

Restrição calórica: Tempo médio de vida: 46 meses

Tempo máximo de vida: 59 meses

HumanosDieta normal:

Tempo médio de vida: 75 anosTempo máximo de vida: 120 anos

Restrição calórica: Tempo médio de vida: ???

Tempo máximo de vida: ???

Efeito da restrição calórica em diferentes espécies

Fatores conservados evolutivamente que protegem contra os processos do

envelhecimento: 1. Enzimas anti-oxidantes como Cu/Zn superóxido dismutase

(SOD) e de catalase (CAT);

2. Heat shock proteins (hsp);

3. Genes de reparo de DNA;

3. Proto-oncogene Ras.

2. Redução da capacidade replicativa por encurtamento dos telômeros:

Células somáticas normais sofrem um número limitado de divisões

celulares antes de atingirem a senescência replicativa (Hayflick, 1965). Os telômeros foram identificados como candidatos para o “relógio replicativo” que regula o número de divisões possíveis para uma determinada célula.

Telômeros são estruturas complexas de DNA-proteína compostos por hexâmeros repetitivos de DNA nas terminações dos cromossomas lineares.

TTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3AATCCAATCCC-5

TRF2 TRF2

Como a DNA polimerase requer um template para a replicação, cada divisão celular resulta na perda de parte das regiões telomêricas.

Encurtamento do telômero de células somáticas humanas tem sido detectado em indivíduos idosos assim como em fibroblastos humanos em cultura. Redução: 33 pb por ano.

Células transformadas apresentam um mecanismo para evitar esse encurtamento e manter a capacidade replicativa: a expressão da ribonucleoproteina Telomerase, capaz de extender as terminações teloméricas.

TTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3AATCCAATCCC-5

TRF2 TRF2

CAAUCCCAAUC

Telomerase

Imuno-senescência

T CD4+

B1 (CD5+)T CD8+

B2 (CD5-)

Timo Medula óssea Peritôneo

CD44lo CD45RO CD62Lhi

IgM

CD44lo CD45RO CD62Lhi

*

*

* ***

*

NK

Mø

DC

APC

IL-7

IL-2

IL-15 IL-21

IgA

IgG

IgM

Sistema imune do adulto jovem

T CD4+T CD8+

B2 (CD5-)

Timo Medula óssea Peritôneo

IgM

*

*

* ***

*

NK

Mø

DC

APC

IgA

IgM

IL-7

IL-2

IL-21IL-15

**

*

CD44lo CD45RO CD62Lhi

CD44lo CD45RO CD62Lhi

B1 (CD5+)

IgG

IL-6IFN-TNF-IL-1

Alterações associadas ao envelhecimento

Dinâmica de populações de célulasU

nida

des

Arb

itrár

ias

Idade (anos) 0 60 120 0 60 120 0 60 120

NK alta atividade NK baixa atividade Atividade NK

Ig sérica Células B Auto Ac

0 60 120 0 60 120 0 60 120

Células T T virgens T memória

CD8+

CD4+CD8+

CD4+

0 60 120 0 60 120 0 60 120

0 60 120

IL-6

0 60 120

IL-1

0 60 120

TNF-

Produção de citocinas por linfócitos T

Uni

dade

s A

rbitr

ária

s

Idade (anos)

0 60 120

IL-2

IL-7 IL-2 IL-15 IL-21FC

longo longo curto muito curtotelômero

precursor virgem memória senescente

Desenvolvimento de linfócitos T

+++ + +++ - telomerase

Mecanismos de remodelagem na Imuno-senescência

Protocolo SENIEUR (Lighart et al, 1984) – estudo de centenários saudáveis mostrou a existência de mecanismos de remodelagem do sistema imune

Número aumentado de células NK com alta atividade citotóxica (CD16+CD57-)

Acúmulo linfócitos T CD8+CD28-CD45RA (com telômeros curtos) produtores de IFN, IL-4 e IL-10

Aumento na produção de anticorpos e de células B1

Indução da expressão de telomerase ??

Imuno-senescência na esquistossomose

mansônica crônica em humanos

Esquistossomose mansoni

É uma doença endêmica de ampla distribuição mundial, ocorrendo em diversas áreas rurais de países tropicais

Segunda principal doença parasitária crônica, afetando mais de 200 milhões de indivíduos em todo mundo;

WHO 2000

No Brasil, há 2,5 milhões de pessoas infectadas, do norte do Pará até o Rio Grande do Sul, sendo que a região NE e MG são as regiões mais atingidas;

A esquistossomose é o protótipo de uma disfunção

imunológica de natureza crônica resultante do

parasitismo pelo S. mansoni, produzindo um

espectro amplo de manifestações clínicas e

imunológicas.

Aspectos da Reatividade Imunológica na Esquistossomose mansoni

Reação inflamatória do tipo granulomatosa resultante da

reatividade do hospedeiro aos antígenos solúveis do ovo

do parasita.

Envolvimento de vários tipos celulares: eosinófilos,

macrófagos e linfócitos.

Principais sítios: fígado e intestino.

Cinética da reatividade imunológica

Infecção crônica

Forma Clínica Intestinal

Fase aguda – Th1 proliferação

Ovoposição – mudança para um padrão Th2

Fase crônica – imuno-modulação

Granuloma

-Papel de IL-4 na diminuição da atividade proliferativa de

PBMC e na formação do granuloma in vitro;

Aspectos Relevantes da Reatividade Imunológica de Indivíduos Portadores da Forma Clínica Intestinal

Malaquias, et al 1997Falcão et al 1998

Correa-Oliveira, et al 1998

-Papel de IFN- induzindo a resposta proliferativa das PBMC

frente aos antígenos SEA e SWAP;

-Importância da IL-10 na modulação da resposta proliferativa

das PBMC e na modulação do granuloma in vitro

Envelhecimento

Esquistossomose

Formação de granuloma

Imuno-regulação

Imunidade protetora

Involução tímica

Acúmulo de linfócitos T ativados

Produção de citocinas alterada

Aumento em anticorpos séricos

A esquistossomose é uma doença crônica que persiste

por toda a vida do indivíduo; seu desenvolvimento se

sobrepõe ao processo natural e progressivo do

envelhecimento;

Estudar a influência do envelhecimento na reatividade

imunológica celular em indivíduos portadores da infecção

crônica pelo S. mansoni

Objetivo

População Estudada (73 indivíduos)

Metodologia

Faixas Etárias (anos)Negativos

Infectados>100 ovos/g fezes

10-24

25-49

50-69

70-95

Número de indivíduos

* Estudo transversal da população

12 8

9 9

15 6

7 6

Heparina

Cultura

HemogramaEDTA

RPMI / PMA + ionomicina / SEA ou SWAP 25ug/ml 5h 37oC 5% C02

Fixação

Leitura no citômetro de fluxo

Sangueperiférico

Lise das hemáciasPermeabilização

Anticorpos Marcados com FITC

Anticorpos Marcados com PE

Linfócitos B

CD19

Células NK

CD16

Linfócitos T

CD4 e CD8 IL-2, IFN-, IL-4, IL10

CD4-FITCA

nti

IL

-10

PE

B

4,33 %1,20%

Tamanho

Gra

nu

los

ida

de

Linfócitos

A

Análise de linfócitos do sangue periférico por citometria de fluxo

Idade (anos)

00.51.01.52.02.53.03.5

IL-2IL-4IL-10IFN

% c

élul

a po

sitiv

as

Células CD4+

00.20.40.60.81.01.21.4

Células CD8+

* p< 0.05

00.20.40.60.81.01.21.4

10-24 24-49 50-69 70-950

0.51.01.52.02.53.03.5

10-24 24-49 50-69 70-95

% c

élul

as p

ositi

vas

Neg

ativ

os

Infe

ctad

os

*

*

*

* *

Produção de citocinas

Jovem

Esquistossomose

CD8+

CD8+

IL-10

IFN-IL- 4

IFN-IL- 4

IL-10

1

3

5

0

1

2

IL-10

IL-4

IFN-0

1

2

10-69 70-95 10-69 70-95

*

*

*

Modulação da produção de citocinas nos idosos

CD4+ cells%

cé

lula

s p

osi

tiva

s%

cé

lula

s p

osi

tiva

s%

cé

lula

s p

osi

tiva

sNegativos Infectados

Idade

IL-10

1

3

5

*

Modulação na produção de citocinas nos idosos

CD8+ cells%

cé

lula

s po

sitiv

as

Negativos Infectados

Idade 10-69 70-95 10-69 70-95

Produção de IL-10 se mantém em indivíduos infectados

por uma população diferente de linfócitos T

Negativos

%L

infó

cito

s T

IL-1

0+

Infectados

10-24 25-69 70-95

0

1

2

3

4

5

6

10-24 25-69 70-95

0

1

2

3

4

5

6

*

*

Idade (anos)

CD4+ CD8+

CD4+

CD8+

0

1

2

3

4

5

6

0

1

2

3

4

5

6

*CD4+

CD4+

CD8+

*

CD4+

CD8+

Envelhecimento

Esquistossomose

CD4+

CD4+ CD8+IL-10

IL-10

IFN-

IL-10

IL- 4IFN-

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

% P

ositi

ve c

ells

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

% P

ositi

ve c

ells

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

10-24 24-49 50-69 70-95

%P

osi

tive

cells

10-24 24-49 50-69 70-95

*

* *

*

**

*

*

Controle

SEA

SWAP

Frequência de células NK produtoras de IFN-Negativos Infectados

As grandes diferenças no padrão de citocinas ocorrem em indivíduos jovens ou mais velhos (acima de 70 anos)

A infecção em indivíduos jovens está associada à produção de IL-4 aumentada por células CD8+

A infecção em indivíduos idosos está associada a mudança da produção de IFN- para a produção de IL-4 por células CD4+

Ocorre um aumento na produção de IL-10 nos indivíduos idosos e esse aumento é mantido nos indivíduos infectados

A frequência de células NK produtoras de IFN- está significativamente aumentada em indivíduos idosos e negativos quando estimulados por antígenos do parasita

Agradecimentos

Elaine Speziali

Rodrigo Corrêa OliveiraJeffrey BethonyOlindo de Assis Martins

Centro de Pesquisas Rene Rachou – FioCruz Departamento de Bioquímica e Imunologia - UFMG

Financiamento: WHO/TDR