III Encontro Nacional de Tuberculose

Identificação e tipagem molecular de cepas de

MCR isoladas de infecções em procedimentos

invasivos no Pará e em outros estados do Brasil

Cristina Viana-Niero

Grupo M. chelonae-abscessus

Micobactérias de crescimento rápido,

Amplamente distribuídas na natureza,

Patógenos oportunistas.

M. abscessus (Kusunoki, S., and T. Ezaki. 1992; Lévy-Frébault et al., 1986)

M. chelonae (Kusunoki, S., and T. Ezaki. 1992; Lévy-Frébault et al., 1986)

M. immunogenum (Wilson et al.,2001; Sampaio et al., 2006)

M. massiliense (Adékambi et al., 2006; Simmon et al., 2007)

M. bolletii (Adékambi et al., 2006)

Procedimentos no. de isolados

Cirurgias laparoscópicas 58

(2 mamoplastias e 1 liposucção)

Injeção intra muscular

Mesoterapia

1

8

Surto envolvendo 311 pacientes submetidos a diferentes

procedimentos invasivos em 16 hospitais e clínicas em Belém, PA

(2004 e 2005)

0

5

10

15

20

25

No.

de iso

lados

Amostras isoladas no Instituto Evandro Chagas, Belém, PA

250

200

75

50

PRA-hsp65

m B H

BstEII [bp] (235, 210)

HaeIII [bp] (200, 70, 60, 50)

M. abscessus 2, M. massiliense e M. bolletii

(Devallois et al., 1997; Adékambi et al., 2004 e 2006)

Características fenotípicas:

tempo de crescimento

(< 7 dias e ausência de pigmentação)

Identificação molecular inicial:

PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis)

Isolados Diferenças de nucleotídeos na seqüência do gene

hsp65

posição 187 229 340

M. massiliense CIP 108297

C G T

M. abscessus 2 ATCC 14472

T C C

M. bolletii CIP 108541 T C C

Análise por seqüenciamento do gene hsp65

Seqüenciamento do gene hsp65

11 isolados obtidos após cirurgias laparoscópicas e 1 após injeção

Número de acesso

GenBank

Cepas No. de nucleotídeos

idênticos/total

Índice de similaridade (%)

AY596465 M. massiliense CIP108297 401/401 100

AY859675 M. bolletii CIP108541 398/401 99,25

DQ869273 M. abscessus 2 ATCC14472 398/401 99,25

AY458075 M. abscessus 1 CIP104536 396/401 98,75

AY458082 M. chelonae ATCC19237 372/401 92,5

DQ288262 M. immunogenum 2 F1112 370/401 92,26

AY458081 M. immunogenum 1 CIP106684 367/401 91,52

< 97% de similaridade espécies diferentes

McNabb et al., 2004

< 1,7% de divergência mesma espécie

> 3% de divergência espécies diferentes

Número de acesso GenBank

Cepas No. de nucleotídeos

idênticos/total

Índice de similaridade

(%)

AY593981 M. massiliense CIP 108297 706/711 99,29

AY859692 M. bolletii CIP 108541 700/711 98,45

DQ288264 M. immunogenum 2 F1112 633/651 97,23

AY262739 M. immunogenum 1 CIP106684 691/711 97,18

AY147164 M. abscessus 1 CIP 104536 686/711 96,48

AY262740 M. chelonae ATCC 19237 679/711 95,49

ND M. abscessus 2

< 1,7% de divergência mesma espécie

> 3% de divergência espécies diferentes

Adékambi et al., 2003

ND não disponível

Seqüenciamento do gene rpoB

11 isolados obtidos após cirurgias laparoscópicas

Injetável: 4 nucleotídeos de diferença em relação as amostras de cirurgia (99,37%)

Seqüenciamento do gene rpoB

8 isolados obtidos após mesoterapia

Número de acesso GenBank

Cepas No. de nucleotídeos

idênticos/total

Índice de similaridade

(%)

AY859692 M. bolletii CIP108541 711/711 100 (2 cepas)

710/711 99,85 (3 cepas)

709/711 99,56 (3 cepas)

Espécie diferente procedimento diferente surto distinto

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR

isolados de uma mesma espécie são

“iguais” ou “diferentes”?

Isolados clínicos previamente identificados

Tipagem molecular por PFGE

(Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Captura de imagem e análise de dados

Eletroforese em campos alternados

Suspensão bacteriana

Mix: bactéria e agarose = plug

Lise bacteriana (liberação de DNA)

PFGE

Pulsed Field Gel Electrophoresis

Critério de interpretação (Tenover et al., 1997)

Digestão enzimática

Resultado de PFGE No. de bandas

diferentes

Correlação epidemiológica

relacionada 0 Isolado é parte do surto

Fortemente relacionada 2-3 Isolado é provavelmente parte

do surto

Possivelmente relacionada

4-6 Isolado é possivelmente parte do surto

Não relacionada > 7 Isolado não pertence ao surto

Critérios de interpretação

mesoterapia

59 isolados - PA

18 isolados - GO

22 isolados - ES

30 isolados - RJ

9 isolados - RS

5 isolados - PR

15.0

0

20.0

0

25.0

0

40.0

0

50.0

0

80.0

0

100.

00

120.

00

140.

00

200.

00

250.

00

300.

00

400.

00

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. massiliense

M. bolletii

M. bolletii

M. abscessus

M. chelonae

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Belém, PA

Rio de Janeiro, RJ

Goiania, GO

Vitória, ES

Curitiba, PR

Rio de Janeiro, RJ

Belém, PA

Santo Angelo, RS

Curitiba, PR

Vitória, ES *

Vitória, ES *

Vitória, ES *

Belém, PA *

CCUG 48898

CCUG 50184

ATCC 14472

ATCC 19977

ATCC 35752

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PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis

Conclusões

Os casos de infecção após mesoterapia, ocorridos em Belém, foram

causados por M. bolletii e divididos em três grupos por rpoB e PFGE.

O isolado obtido após uso de injetável foi identificado como M. massiliense

mas apresentou seqüência do gene rpoB e perfil de PFGE diferente dos

isolados provenientes de cirurgias.

Os casos de infecção após cirurgias em diferentes estados brasileiros foram

causados por uma única cepa de M. massiliense, sugerindo uma única fonte

de infecção.

A identificação de espécies estreitamente relacionadas exige a realização

de vários testes fenotípicos e moleculares.

Cristina Viana-NieroMichelle Christiane da Silva Rabello

Sylvia Cardoso Leão

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, UNIFESPUniversidade Federal de São Paulo, SP

Rafael da Silva DuarteUniversidade Federal do Rio de Janeiro, RJ

Moisés PalaciUniversidade Federal do Espírito Santo, ES

Maria Cristina LourençoFundação Osvaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ

André KipnisUniversidade Federal de Goiás, GO

Marta Osório RibeiroIPB Lacen Rio Grande do Sul, RS