tipagem molecular da cápsula de haemophilus influenzae
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Camila Xavier de Carvalho
Tipagem molecular da cápsula de Haemophilus influenzae isolados da nasofaringe de crianças de creches de Goiânia
Orientador: Prof. Dr. André Kipnis Co-Orientadora: Profª. Drª Ana Lúcia S.S. de Andrade
Dissertação de Mestrado Goiânia-GO, 2010
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Camila Xavier de Carvalho
Tipagem molecular da cápsula de Haemophilus influenzae isolados da nasofaringe de crianças de creches de Goiânia
Orientador: Prof. Dr. André Kipnis
Co-Orientadora: Profª. Drª Ana Lúcia S.S. de Andrade
Este trabalho foi realizado com o auxilio financeiro do CNPq.
Dissertação de Mestrado Goiânia-GO, 2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Dissertação submetida ao CPGMT/IPTSP/UFG como requisito parcial pra a obtenção do Grau de Mestre na área de concentração em Microbiologia.
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Ninguém é capaz de aprender,
quando está convencido de que já sabe.
José Roberto Ramos
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Dedicatória
Dedico esse trabalho aos meus pais,
irmão, Aninha, Vinicius e Eduardo JK.
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Agradecimentos
Ao meu orientador, André Kipnis, e a minha co-orientadora professora
Drª. Ana Lúcia S. S. Andrade.
A todos colegas do Programa de Pós-Graduação do IPTSP.
À minha mãe que me apoiou na jornada compreendendo meu caminho e
meu desejo seguindo outra área de estudo e meu irmão André Louis por
acreditar em mim, me apoiar e sempre comemorar as minhas conquistas, e por
ser um irmão-pai, sempre ao meu lado me protegendo.
Agradeço a uma pessoa muito amada por mim, que mesmo sem
conhecer quais dificuldades encontramos no caminho da pesquisa o meu
esposo Eduardo Junqueira Khouri. Também agradeço minha grande amiga
Dra. Alessandra Marques Cardoso e meus amigos, companheiros de
laboratório.
À Lícia Kamila, pela sua doçura e paciência nos momentos em que
precisei interrompê-la.
Aos funcionários e servidores técnico-administrativos do IPTSP pela
atenção e colaboração prestada.
Às crianças e seus responsáveis que consentiram em participar do
estudo, minha gratidão.
A todos, que de alguma forma contribuíram para um êxito deste trabalho,
meu reconhecimento e gratidão.
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Sumário
Dedicatória _______________________________________________________ iv
Agradecimentos ___________________________________________________ v
Lista de figuras ____________________________________________________ viii
Lista de tabelas____________________________________________________ ix
Lista de siglas, símbolos e abreviaturas _________________________________ x
Resumo__________________________________________________________ xi
Abstract__________________________________________________________ xii
1. Introdução _____________________________________________________ 1
1.1. Histórico ___________________________________________________ 1
1.2. Aspectos microbiológicos de Haemophilus influenzae ________________ 2
1.3. Colonização por H. influenzae na infância _________________________ 4
1.4. Mecanismos de Patogenicidade do H. influenzae____________________ 5
1.5. O papel dos outros sorotipos de H. influenzae ______________________ 8
1.6. O papel de H. influenzae não tipável______________________________ 9
1.7. Resistência Antimicrobiana em H. influenzae _______________________ 10
1.8. Fatores de riscos para doenças causadas por H. influenzae ___________ 12
1.9. Isolamento e identificação do H. influenzae ________________________ 15
1.10. Profilaxia: Vacina Conjugada _________________________________ 17
1.11. Epidemiologia _____________________________________________ 19
2. Justificativa ____________________________________________________ 23
3. Objetivos ______________________________________________________ 25
3.1. Geral ______________________________________________________ 25
3.2. Específicos _________________________________________________ 25
4. Material e Métodos ______________________________________________ 26
4.1. População e área de estudo ____________________________________ 26
4.2. Coleta de Dados _____________________________________________ 26
4.3. Amostragem e tamanho da amostra ______________________________ 27
4.4. Coleta de swabs de nasofaringe _________________________________ 27
4.5. Isolamento e Identificação______________________________________ 29
4.6. Extração de DNA Cromossomal _________________________________ 29
4.7. Confirmação da espécie e cápsula por PCR________________________ 30
4.8. PCR para genes de resistência__________________________________ 31
vii
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4.9. Análise dos dados____________________________________________ 32
5. Resultados_____________________________________________________ 33
5.1. Isolamento e identificação molecular por PCR ______________________ 33
5.2. Fatores de Risco _____________________________________________ 34
6. Discussão _____________________________________________________ 37
7. Conclusões ____________________________________________________ 41
8. Referências Bibliográficas _________________________________________ 42
Anexo I - Protocolo _________________________________________________ 55
Anexo II - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ____________________ 56
Anexo III - Questionário______________________________________________ 58
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LISTA DE FIGURAS
Figura I: (A) Swab pernasal_________________________________________28
Figura I: (B)Esquema da técnica referida pela OMS para coleta de
material da nasofaringe. Desenho ilustrativo da obtenção das amostras de
nasofaringe ____________________________________________________28
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LISTA DE TABELAS
Tabela I. Estudos de portador de nasofaringe de Haemophilus influenzae
feitos no Brasil e no mundo_______________________________________ 22
Tabela II. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para
amplificação da região cápsula-específica, tipo específico do genoma e
espécie do H. influenzae e o tamanhos dos produtos esperados__________ 31
Tabela III. Prevalência de tipos capsulares de H. influenzae, HiNT e
presença de genes de resistência para antibióticos beta lactâmicos em
secreções de nasofaringe de 1192 crianças de creches de Goiânia agosto –
dezembro 2005 ________________________________________________ 34
Tabela IV. Características clínicas e demográficas da colonização por
Haemophilus influenzae entre crianças de creches ____________________ 35
Tabela V. Fatores de riscos independentes associados à colonização nasal
de H. influenzae em crianças de creches de Goiânia em análises univariada
e multivariada _________________________________________________ 36
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LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ATCC - American Type Culture Collection
CDC - Center for Disease Control and Prevention
EV - Endovenosa
FNS - Fundação Nacional de Saúde
Hi - Haemophilus influenzae
Hia - Haemophilus influenzae tipo a
Hib - Haemophilus influenzae tipo b
Hic - Haemophilus influenzae tipo c
Hid - Haemophilus influenzae tipo d
Hie - Haemophilus influenzae tipo e
Hif - Haemophilus influenzae tipo f
HiNT - Haemophilus influenzae não tipável
IS1016 - Insertion Sequence 1016
LOS - Lipoligoscarídeos
MS - Ministério da Saúde
OMP – Outer Membrane Protein
OMS - Organização Mundial da Saúde
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PNI - Programa Nacional de Imunizações
PRP - Polirribosil-Ribitol-Fosfato
SPSS - Statistical Package for the Social Science
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RESUMO
Haemophilus influenzae (Hi) é uma das espécies de bactéria que causa infecção em crianças, e se apresenta sob duas formas: capsuladas com seis sorotipos de a-f e não capsuladas ou não tipáveis (HiNT). Cepas capsuladas são responsáveis por uma variedade de doenças invasivas, sendo a meningite a mais freqüente. As cepas não capsuladas ou não tipáveis são responsáveis por infecções do trato respiratório e otite média aguda em menores de 24 meses. As crianças que frequentam creches têm risco aumentado de desenvolverem otite média quando colonizadas por HiNT. Nosso objetivo foi descrever a prevalência de colonização por Hi e fatores de risco associados ao estado de portador em crianças atendidas em creches. Foram analisados swabs de nasofaringe coletados de 1192 crianças saudáveis menores de cinco anos de idade que frequentavam uma das 62 creches de Goiânia - Goiás, Brasil. As amostras foram semeadas em placas de ágar chocolate e incubadas em atmosfera contendo 5% de CO2 a 37°C durante a noite. Os Hi foram identificados de acordo com a morfologia da colônia em meio de cultura, coloração de Gram e a exigência dos fatores V (hemina) e X (NAD). A tipagem capsular assim como a presença dos genes TEM1 e ROB1 para resistência a β-lactâmicos foi avaliada pela PCR. Diferenças de proporção e de média foram avaliadas pelo teste do Chi-quadrado e teste t de student, respectivamente. Estimativas de risco relativo (odds ratio) foram avaliadas por regressão logística uni e multivariada, valores de p menores que 5%, foram considerados estatisticamente significantes. A prevalência de colonização entre as 1192 crianças foi de 32,1% sendo 23,3% para HiNT e 8,8% para cepas capsuladas. A prevalência de cepas portadoras do gene TEM1 foi de 38,4%. Dentre os HiNT a prevalência de cepas portadoras do gene TEM1 foi de 43,2%. Internação prévia da criança nos últimos 6 meses esteve independentemente associado ao risco de portador por H. influenzae tipável. Os dados obtidos neste estudo poderão subsidiar o impacto da introdução da vacina pneumocócica decavalente PHiD-CV.
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ABSTRACT
Haemophilus influenzae (Hi) causes infection in children, and is presented in two groups: with six encapsulated serotypes a-f and non-encapsulated or nontypeable (NTHi). Capsulated strains are responsible for a variety of invasive diseases, with meningitis being the most frequent. Nontypeable strains are responsible for respiratory tract infections and acute otitis media in children under 24 months. Children who attend day care centers have increased risk of developing otitis media when colonized with NTHi. Our goal was to describe the prevalence of colonization by Hi and risk factors associated with carrier status in children attending day care centers. Nasopharyngeal swabs collected from 1192 healthy children under five years of age who attended one of 62 daycare centers in Goiânia - Goiás, Brazil were analyzed. The samples were placed on chocolate agar plates and incubated in an atmosphere containing 5% CO2 at 37 ° C overnight. Hi were identified according with colony morphology in culture, Gram staining, and their requirement for V (hemin) and X (NAD) factors. Capsular typing and the presence of the genes TEM1 and ROB1 for resistance to β-lactams were evaluated by PCR. Differences between proportions and means were tested using Chi-square and Student's t test, respectively. Estimates of relative risk (odds ratio) were evaluated by univariate and multivariate logistic regression, p values less than 5% were considered statistically significant. The prevalence of colonization among the 1192 children was 32.1% and 23.3% for HiNT and 8.8% for encapsulated strains. The prevalence of strains carrying the gene TEM1 was 38.4%. Among HiNT strains the prevalence of TEM1 gene was 43.2%. Previous hospitalization of children in the last 6 months was independently associated with the risk carrier by H. influenzae typeable. The data described in this study will aid investigation on the impact of the 10-valent pneumococcal vaccine (PHiD-CV) introduction.
1. Introdução 1.1. Histórico
Em 1882, Robert Koch foi quem primeiro descreveu um microrganismo
semelhante ao Haemophilus, encontrado em exsudato conjuntival. Entretanto,
considera-se Richard Pfeiffer como o primeiro que identificou o patógeno,
designando-o de Influenza bacillus em 1892. O isolamento desta bactéria no escarro
e em tecido de pulmão de indivíduos que morreram na pandemia de gripe, em 1892,
contribuiu para que fosse considerado como o agente etiológico da gripe conhecida
como influenza (Kilian 1976).
Após a virada do século, o microrganismo também foi encontrado em sangue
e fluido cérebroespinhal de crianças com meningites. Houveram muitos equívocos
até se descobrir um meio de cultura consistente que fosse ajustado aos fatores X e V
necessários para o seu crescimento in vitro (Ward & Zangwill 1999).
Winslow et al. (1917), sugeriram a denominação de Haemophilus para este
grupo de microrganismos, por apresentar crescimento significativo quando cultivado
em meio sintético contendo sangue ou hemácias lisadas. Na década de 1930,
Pittman (1931) definiu os dois maiores grupos de Haemophilus influenzae (Hi): os
capsulados e os não-capsulados. Entre os capsulados, caracterizou sorologicamente
seis sorotipos distintos antigenicamente, designados de a até f, que apresentavam
diferenças bioquímicas na composição orgânica da cápsula polissacarídica. Um ano
depois, o Comitê de Nomenclatura da Associação Americana de Bacteriologistas
denominou-o de Haemophilus influenzae.
Em continuidade a esta linha de trabalho, Pittman (1935) demonstrou que,
dentre os Hi capsulados, o sorotipo b era o responsável por quase todas as
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infecções graves causadas por esta espécie, o que tem sido verificado até hoje por
outros autores (Nascimento-Carvalho & Andrade 2006). Pensava-se então que as
linhagens não capsuladas, encontradas em 50 a 80% do trato respiratório de
pessoas saudáveis como microbiota natural, não estariam relacionadas a doenças
invasivas (Kilian & Biberstein 1984).
Em continuação à caracterização fenotípica, Kilian (1976) subdividiu o Hi em
quatro biotipos (I a IV). Esta classificação baseou-se em ensaios bioquímicos,
associados às características de produzir enzimas como: urease, ornitina-
descarboxilase e triptofanase. Atualmente já são conhecidos oito biotipos (I a VIII), e
estes não possuem relação com os sorotipos (Koneman et al. 1997). Existe, porém
uma associação entre Hi do tipo b e o biotipo I, que é o mais frequente, inclusive nos
estudos pioneiros realizados com cepas isoladas em São Paulo (Landgraf & Vieira
1993).
1.2. Aspectos microbiológicos de Haemophilus influenzae
H. influenzae é um pequeno cocobacilo Gram negativo ou filamentoso,
pleomórfico, imóvel, não esporulado, anaeróbio facultativo, que requer dois fatores
acessórios para crescer in vitro, o fator X (hematina) e V (nicotinamida adenina
dinucleotídeo ou NAD). Possuindo uma distribuição mundial, sendo patogênico
somente para espécie humana, podendo ser capsulado (tipável) ou não-capsulado
(não-tipável). Estes fatores são a base primária na diferenciação laboratorial de Hi
das outras espécies de Haemophilus (Ward & Zangwill 1999, Bricks 1998).
O que contribui para a patogenia do Hi é a estrutura polissacarídica de sua
cápsula (Falla et al. 1995). A diversidade encontrada dentre os Haemophilus
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influenzae capsulados está na composição bioquímica da cápsula de polissacarídeo.
O sorotipo b, também com distribuição mundial, é o mais virulento e na era pré-
vacinação era responsável pela manifestação de 95% das doenças invasivas
causadas por Hi (Falla et al. 1995; Aracil & Campos 2003).
Espécies não-capsuladas podem causar infecções frequentes do trato
respiratório e estruturas próximas, mas raramente causam infecções como
bacteremia (Shapiro & Ward 1991; Casagrande et al. 2002; Aracil-García 2006).
A produção da cápsula é codificada por um complexo de genes, denominado
locus cap, que corresponde a um fragmento de 17Kb do cromossomo. A região
central do locus é específica para sorotipos. As cepas dos sorotipos a – f possuem
uma cópia do locus cap. O locus cap tem uma organização comum para todos os
seis sorotipos capsulados e é formado por três regiões: I II e III. As regiões I e III
contêm os genes necessários para o processamento e exportação do
polissacarídeo, sendo o gene bexA um destes, que é comum para todos os
sorotipos. Estas regiões flanqueiam a região II, onde se encontram os genes
responsáveis pela síntese dos dissacarídeos, sendo, portanto, a região capsular
sorotipo-específica. Na maioria das cepas invasivas do tipo b, o cap é flanqueado
pela sequência de inserção 1016 (IS1016). Estes elementos de inserção podem
estar inseridos entre as regiões I e II, interferindo na funcionalidade do cap,
originando assim as cepas não tipáveis (NT) entre as linhagens Hi. Esta região pode
ser também flanqueada por sequências repetitivas (Kroll et al. 1988; Falla et al.
1994).
Na organização do cap pode haver duplicação ou perda do cluster capsular,
podendo faltar a região I ou III. A maioria das cepas isoladas de H. influenzae
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sorotipo b (Hib) contém uma duplicação parcial do cap, que consiste de uma cópia
intacta e uma segunda cópia que carrega uma deleção parcial do gene bexA (Kroll
et al. 1989; Kroll et al. 1990). Nas cepas Hi sorotipo b, a expressão capsular é
perdida por supressão da cópia única funcional do gene bexA, originando-se assim
cepas b- (cepa Hib mutante). Podem existir situações em que cepas do tipo b
perdem temporariamente a cápsula, porém são capazes de recuperá-la ao invadir o
organismo. Quando são detectadas associadamente a uma infecção invasiva, elas
podem ser classificadas como resultado de falha vacinal. Entretanto, quando
aparecem em portadores, considera-se uma fonte significante de cepas HiNT (Falla
et al. 1994). Assim, cepas mutantes (b-) não capsuladas de Hi têm sido reportadas
em diferentes estudos como variantes desse microrganismo podendo reverter para a
forma capsulada. Cepas mutantes b- podem ser confundidas com cepas HiNT pelos
métodos sorológicos tradicionais (Luong et al. 2004).
1.3. Colonização por Haemophilus influenzae na infância
A bactéria Haemophilus influenzae está frequentemente presente na
nasofaringe e garganta de crianças saudáveis (Riley & Douglas 1981; Teele 1992).
A taxa observada de colonização assintomática por Hi é maior em crianças de idade
pré-escolar e tende a diminuir com o aumento da idade (Rapola et al. 1997). Quase
todos os indivíduos são colonizados por cepas HiNT, enquanto que 1 a 5% dos
indivíduos não vacinados são portadores assintomáticos do Hi tipo b (Ward &
Zangwill 1999; Bricks et al. 2004). As taxas relatadas de colonização por Hi variam
de 5 a 87% (Aniansson et al. 1992), dependendo da idade, saúde e condição
socioeconômica da criança e da população em estudo.
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Grennberg et al. (2004) comprovaram que, a colonização por Hi na
nasofaringe de crianças doentes na faixa de dois anos de idade é maior que nas
crianças mais velhas.
O contato da criança com grande número de pessoas na casa ou família, ou
em creches superlotadas, inclusive creches onde há outras crianças que
apresentam alguma patologia por Hi, pode favorecer o aumento da taxa de
colonização, que pode ser superior a 70% nestas condições (Ward & Zangwill 1999).
1.4. Mecanismos de Patogenicidade do Haemophilus influenzae
Um dos mais importantes fatores de virulência, apresentados pelo Hi, está
relacionado à presença da cápsula. De acordo com classificação proposta por
Pittmam (1931), todas as cepas capsuladas podem ser classificadas em seis
diferentes sorotipos, baseadas nas diferenças da composição bioquímica dos
polissacarídeos da cápsula e reações imunológicas.
O material capsular interfere na fagocitose, constituindo uma importante
propriedade anti-fagocitária, auxiliando na invasão de outros sítios, além de permitir
uma interação com as células do epitélio, favorecendo sua colonização. A estrutura
capsular apresenta também como característica intrínseca, uma baixa
antigenicidade que não ativa a resposta imune via complemento, favorecendo a
invasão do sangue ou do fluido cefalorraquidiano, permitindo a disseminação
microbiana. O Hib apresenta ainda, uma amplificação da produção do material
capsular, de propriedade hidrofílica, o que determina uma maior resistência à
dessecação, favorecendo sua via de transmissão pessoa-pessoa, e aumentando
também a inibição da fagocitose e colonização do epitélio, contribuindo assim para
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as altas prevalência desse tipo capsular em doenças invasivas (Kroll et al. 1994;
Adderson et al. 2001).
Os tipos capsulados, especialmente o Hib, produzem enzimas como as
neuramidases, importantes na invasão das meninges, e pelo menos uma IgA-
protease, que possivelmente atua na clivagem de imunoglobulinas IgAs, presentes
nas secreções e mucosas, em especial, no trato respiratório, o que justificaria seu
sucesso na colonização de portadores (Todar 2004).
O fracionamento da parede celular do Hib resulta em várias proteínas, que
também estão associadas à imunidade, denominadas de Outer Membrane Protein
(OMP) ou proteínas da membrana externa. Em análises realizadas, foi observada a
produção de anticorpos para estas proteínas, como também para outros
lipoligossacarídeos já identificados, demonstrando-se a importância dos antígenos
não capsulares na determinação da imunigenicidade do Hib (Rodriguez et al. 2003;
O’Neill et al. 2003).
Recentemente, foram identificados sete segmentos de DNA (ilhas genéticas)
presente no genoma de Hi sorotipo b, isolado de um caso de meningite, e ausente
no genoma Hi, cepa Rd (não tipável). Esses sete agrupamentos de DNA possuem
sequências ligadas a fatores de virulência como codificação de proteínas
transportadoras, síntese de lipopolissacarídeo (LPS) e incorporação de ferro, além
de sequências implicadas na transferência horizontal de DNA, como elementos
móveis e outras que sugerem a transferência por bacteriófagos. Esses sete
agrupamentos de DNA, possivelmente também estão relacionados à maior
virulência apresentada pelo Hib (Omikunle et al. 2002; Bergman & Akerley 2003).
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Outros tipos capsulados vem sendo identificados como responsáveis por
doenças invasivas, principalmente, em países que adotaram a vacina para o Hib.
Destaca-se entre estes tipos não b, o tipo capsular a (Hia), pelo seu grau de
virulência e taxa preocupante de mortes, o tipo e (Hie), considerado um patógeno
oportunista, e o tipo f (Hif), isolado em casos de doença invasiva na Espanha,
Dinamarca e EUA (Kroll et al. 1994; Meats et al. 2003).
As cepas de HiNT apresentam um importante fator de virulência que auxilia
na evasão dos mecanismos imunológicos do hospedeiro, os lipopolissacarídeos
(LPS). O LPS é uma endotoxina, presente na parede celular de todas as bactérias
Gram negativas, que possui entre outras propriedades, a ativação de macrófagos,
por meio de receptores conhecidos como receptores toll-like (TLR), principalmente o
TLR4 (Poltorak 1998).
Um dos fatores que determinam a virulência das bactérias Gram negativas
como o HiNT, é sua capacidade de incorporar o ácido siálico nas porções terminais
dos lipoligossacarídeos (LOS) da membrana externa, como a lactose, a N-acetil-
lactosamina e possivelmente a N-acetil-galactosamina (Jones et al. 2002). A
caracterização desse mecanismo, a partir do transporte de carboidratos através do
espaço periplasmático ATP-independente, pode consistir em possíveis alvos para
drogas antimicrobianas (Allen et al. 2005).
Haemophilus influenzae possui uma lipoproteína de superfície de 42kDa, a
Proteína D (PD), altamente conservada em Hi capsulado e não capsulado. Esta
proteína está envolvida na patogênese de infecções do trato respiratório,
danificando a função ciliar em modelo de cultura de tecido humano da nasofaringe e
aumenta a capacidade de causar otite média em ratos. A sua atividade
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glicerofosforodiesterase indica que a PD é um fator de virulência que leva a
liberação de fosforocolina das células do hospedeiro (Forsgren et al. 2008).
1.5. O papel dos outros sorotipos de Haemophilus influenzae
Após a introdução da vacina conjugada Hib no calendário vacinal dos países
desenvolvidos em 1986, vários autores levantaram a possibilidade de haver uma
substituição na população do sorotipo b, mais frequente na pré-fase, por outros
sorotipos diferentes que estariam compartilhando o mesmo nicho ecológico (Peltola
2000; Campos 2001; CDC 2002). Especificamente, nos EUA foi observado um
aumento na incidência de Hi sorotipos e e f, sendo que a incidência de doença
invasiva devida a H. influenzae tipo f (Hif) subiu de 0,5/100.000 habitantes em 1989,
para 1,9 /100.000 em 1994. Um aumento semelhante não tem sido descrito para o
Hi sorotipo e (Waggoner-Foutain et al. 1995; Urwin et al. 1996).
Para avaliar a eficácia da vacinação e as possíveis mudanças na
epidemiologia das infecções causadas por Hi é necessário conhecer o sorotipo que
predomina na população vacinada (Aracil-García 2006). Recentemente, o Centers
for Diseases Control and Prevention (CDC) reconheceu falhas e discrepâncias
significativas na determinação dos diferentes sorotipos nos laboratórios dos E.U.A.
(LaClaire et al. 2003). Dada a alta prevalência clínica de Hib no passado, o estudo
de outros sorogrupos tem recebido pouca atenção (Campos et al. 2003). As
informações disponíveis na literatura sobre infecções causadas pelo Hif, pode ser
resumida em alguns casos esporádicos de meningite, pneumonia e bacteremia
(Waggoner-Foutain et al. 1995; Urwin et al. 1996; Glatman-Freedman & Litman
1996). Recentemente, foram descritos na Itália cinco casos de doença invasiva por
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H. influenzae sorotipo e (Hie) em adultos, todos os isolados sensíveis à ampicilina,
cloranfenicol, tetraciclina e cotrimoxazol (Cerquetti et al. 2003).
Os Hi capsulados são responsáveis por doenças invasivas, como, meningite,
bacteremia ou septicemia, epiglotite, pneumonia, artrite séptica, abcessos,
pericardites, empiema, osteomielite e celulite. Em contraste, infecções mucosas
como bronquite, sinusite e otite média são consideradas doenças não invasivas,
mas com grande repercussão socioeconômica (Manson et al. 1982; Ward et al
1994).
1.6. O papel de Haemophilus influenzae não tipável
Os HiNT são microrganismos colonizadores comuns da nasofaringe de
crianças saudáveis, com taxa de 20% de colonização no primeiro ano de vida, e de
50% em crianças de 5 - 6 anos de idade (St. Geme III 2000). As cepas não
capsuladas causam infecções superficiais que afetam o trato respiratório superior,
conjuntivas e o trato geniturinário, em qualquer faixa etária e representam causa
comum de otite média, iniciando a infecção pela colonização do trato respiratório
superior, sendo mais prevalente na infância (Rey & Farhat 1997; St. Geme III 2000).
A otite média aguda (OMA) é a infecção mais comumente diagnosticada na
infância, não só no EUA, onde responde por mais de 20 milhões de visitas ao
consultório pediátrico a cada ano, mas em países industrializados e em
desenvolvimento. No Brasil 7% dos episódios de OMA são causados por Hi (Shi
2001), sendo uma infecção mais prevalente em crianças menores de dois anos de
idade. As crianças colonizadas por cepas HiNT possuem maior risco de desenvolver
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esta infecção (Prymula et al. 2006; Forsgren et al. 2008; Dagan & Frasch 2009;
Vesikari et al. 2009).
Andrade et al. (2001) esperavam que após a imunização contra Hib nos
países da América Latina seriam confrontados com aumento de infecções causadas
pelo HiNT. Estudos feitos no mundo mostram que o HiNT ocupou o nicho ecológico
da cepa encapsulada tipo b, mudando o foco da doença causada por esse agente
patogênico (Peerbooms et al. 2002; Murphy 2003; Watanabe et al. 2004; Liese
2009; O’Brien & Levine 2006).
Atualmente há um investimento em vacinas para a profilaxia das infecções
causadas pelas cepas HiNT, principalmente OMA. Existem estudos que investigam
a eficácia de vacinas pneumocócicas candidatas contra otite média contendo até 11
polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae, cada um conjugado com uma
proteína carreadora recombinante e não lipídica de 42 kDa, conhecida como
proteína D. Esta proteína de superfície celular foi capaz de induzir proteção contra
HiNT em ensaios com ratos chinchila. É considerada uma proteína altamente
conservada em capsulados e não capsulados e, portanto tem o potencial de
oferecer proteção contra a OMA para todas as cepas de Hi (Prymula et al. 2006).
1.7. Resistência Antimicrobiana em Haemophilus influenzae
A resistência do Hi à ampicilina foi comprovada inicialmente em 1972
(Shackelford et al. 1972). Essa resistência se deve à produção bacteriana de uma
enzima β-lactamase (βLac), que destrói o núcleo ativo de benzilpenicilinas e
cefalosporinas de primeira geração. Esta resistência enzimática estaria codificada
nos suportes genéticos extra-cromossômicos, os plasmídios (Thomas et al. 1974;
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Powell 1988). A prevalência de Hi resistentes à ampicilina foi alvo de extensos
levantamentos multicêntricos em diversos países (Doern et al. 1986; Nissinen et al.
1995). Em certos países, a incidência de cepas produtoras de β-lactamases é
particularmente elevada, atingindo 50% nas cepas Hib, e variando de 20 a 30% em
HiNT (Dabernat et al. 2002).
Por anos, os antibióticos ampicilina e/ou cloranfenicol foram recomendados
para o tratamento das meningites em crianças. Entre os anos de 1972 e 1974, nos
EUA e Europa, foram isolados os primeiros Hi resistentes e em seguida a
prevalência de Hi sensíveis foi reduzindo em todo o mundo (Andrade et al. 2001). Hi
capsulados possuem maior resistência aos antibacterianos do que os HiNT. As
cepas capsuladas apresentam também uma maior quantidade de plasmídios
conjugativos do que os isolados não capsulados, correlacionando-se a esse fator a
maior resistência observada nos tipos capsulados (Campos et al. 2004). Atualmente
o tratamento padrão para doenças invasivas, especialmente pneumonias e
meningites, preconiza o emprego de uma cefalosporina de terceira geração por 7 a
10 dias (Miranzi 2004).
Nos EUA, foram detectados por Sykes & Mathew (1978), isolados Hi
ampicilina resistente, devido à produção de enzima beta-lactamase codificada pelo
gene TEM1 (Mendelman et al. 1984; Doern et al. 1986). Atualmente a prevalência
do gene TEM1 em cepas de Hi resistentes a ampicilina naquele país, mantém-se em
torno de 90%, seguindo uma tendência mundial (Karlowsky et al. 2002). Em estudo
conduzido por Markowitz (1980), caracterizou-se pela primeira vez cepas de Hi
produtoras de β-lactamases codificadas pelo gene ROB-1. A prevalência global de cepas
de Hi produtoras de ROB-1 está em torno de 7 a 11%, mas alguns locais dos EUA e
12
12
no México esses índices chegam a 21% e 26%, respectivamente (Karlowsky et al.
2000; Barry et al. 2001; Mathai et al. 2001; Molina et al. 2002; Dabernat et al. 2003).
Em estudos na Europa, os índices de isolados de Hi produtores de β-
lactamases são bastante variáveis, como os observados na Holanda (1,8%), Portugal
(20%), França (47,4%) e Polônia (3,7%) (Sulikowska et al. 2004). Em outras regiões
como no Vietnã, a presença da β-lactamase codificada por TEM-1 é de 56,8%
(Watanabe et al. 2005).
O Ministério da Saúde recomenda o uso do cloranfenicol ou da ceftriaxona
(EV), como tratamento padrão, em pacientes com meningite por Hi, sendo
necessário o monitoramento constante dos isolados de Hi resistentes aos
antimicrobianos, principalmente a resistência ao cloranfenicol e aos β-lactâmicos
(Ministério da Saúde 2004).
No Brasil, em uma análise de 1712 cepas de HI nasofaringe de crianças, de
dez estados brasileiros, o índice de produtores de beta-lactamases foi bastante
heterogêneo, como em Santa Catarina (6,7%), Paraná (18,5%), São Paulo (21,7%),
Distrito Federal (25,0%) e Rio Grande do Sul (57,7%) dos isolados analisados
(Casagrande et al. 2002).
1.8. Fatores de risco para doenças causadas por
Haemophilus influenzae
A prevalência de fatores de risco em diferentes populações e grupos etários
pode ser decisiva, determinando o cenário epidemiológico e explicando as variações
na incidência e distribuição etária entre as populações. Os principais fatores de risco
13
13
para infecção por Hib são a idade, fatores socioeconômicos (que se sobrepõem aos
riscos genéticos), frequentar ambientes como creches, presença de infecções
associadas, ausência de aleitamento materno e fumo passivo (Bouskela et al. 2000).
De todos os fatores de risco, a idade é o mais importante. Na maioria dos
estudos, cerca de 95% dos casos acontecem em crianças com menos de 2 anos
(Ward et al. 1986; Takala 1989; Murphy et al. 1989). No Brasil, segundo dados do
SVS (Secretária de Vigilância em saúde), cerca de 70% dos casos ocorrem nesta
faixa etária (Guia da Vigilância Epidemiológica 1999).
Os fatores de risco socioeconômicos para doença primária invasiva por Hib
compreendem variáveis responsáveis por aumentar a exposição (frequentar creche,
presença de irmãos, ambiente familiar aglomerado) e por aumentar a suscetibilidade
individual (desmame precoce, pais fumantes e infecções frequentes) (Bouskela et al.
2000).
A infecção é adquirida no contato em ambiente fechado, com pessoa
portadora assintomática ou com doença invasiva por Hib (Veronesi & Focaccia
1996; Levine & Schuwartz 1998; Miranzi & Freitas 2006). O contato entre indivíduos
expostos em ambientes fechados e a aglomeração de pessoas aumentam o
potencial de transmissão, provocam o risco de colonização da nasofaringe e o
aparecimento da doença (Miranzi et al. 2003).
A transmissão mais comum ocorre através da dispersão de gotículas,
seguindo-se a colonização. Os adultos geralmente se tornam portadores sãos,
quando em contato com crianças doentes (Ward & Zangwill 1998). O contato com
objetos, como brinquedos contaminados levados à boca, também tem sido descrito
14
14
como importante fator de risco (Peltola et al. 1990). As secreções nasais de
portadores tem concentração maior da bactéria do que a secreção orofaríngea. O
Hib pode sobreviver em objetos como toalhas, fraldas ou bichos de pelúcia por até
48 horas (Peltola et al. 1990).
Alguns autores observaram risco 12,3 vezes maior para crianças menores de
1 ano que frequentam creches; 7,2 vezes maior para crianças de 1 a 2 anos; e 3,8
vezes maior para crianças de 2 a 3 anos (Redmond & Pichichero 1984). É descrito
um risco maior diretamente proporcional ao período de permanência na creche e ao
número de crianças na classe. No Brasil, a questão da incidência dependente da
permanência em creches ainda precisa ser aprofundada. Um estudo mostra que ter
irmãos entre 6 e 10 anos ou membro da família frequentando ensino fundamental
(primeiros 9 anos na escola) aumenta o risco (Istre et al. 1985).
Um importante fator protetor descrito para a doença invasiva por Hib é o
aleitamento materno. Na Finlândia, a duração do aleitamento materno (pelo menos 6
meses) tem sido considerada protetora. É possível que o mecanismo de proteção
envolva a presença de anticorpos anticapsulares no leite humano ou um aumento da
resposta imune ao Hib entre as crianças amamentadas. A ação da imunoglobulina A
(IgA) secretória na proteção contra as infecções por poliovírus, rubéola, influenza,
rinovírus e rotavírus tem sido demonstrada. Estudos mostram que a IgA secretória
dificulta a aderência do microrganismo na superfície da mucosa, reduzindo a
colonização. É possível que a IgA secretória, recobrindo a orofaringe durante a
amamentação, interaja com as mucinas e o glicocálix na nasofaringe, exercendo seu
efeito protetor. Não há dados brasileiros analisando comparativamente o efeito
15
15
protetor da amamentação na colonização ou incidência da doença invasiva em
crianças no 1° ano de vida (Bouskela et al. 2000).
A doença invasiva por Hib ocorre em pequena fração de pessoas infectadas.
O microrganismo pode permanecer na nasofaringe por meses. Isso caracteriza o
estado de portador assintomático e representa um problema de saúde pública
(Levine & Levine 1997, Levine et al. 1998, Ward & Zangwill 1999).
A passagem do microrganismo da colonização do trato respiratório superior
para outros sítios do corpo ocorre pelo comprometimento dos mecanismos de
defesa, como consequência a infecções virais ou deficiência de resposta
imunológica, por exemplo. Outros fatores, como a presença de refluxo, corpos
estranhos e o fumo, entre outros, que danificam o epitélio broncopulmonar, podem
também facilitar o desenvolvimento da doença (Ward & Zangwill 1998).
1.9. Isolamento e Identificação do Haemophilus influenzae
A cultura da amostra de líquor, sangue, secreções de ouvidos, seios da face,
celulites, abscessos e outras é de fundamental importância visando o isolamento e
identificação do Hi, incluindo a determinação do tipo sorológico. Essas bactérias são
oxidase positiva, porém a reação da catalase é variável. Possuindo um sistema
metabólico diferente para crescimento em meios de cultura não enriquecidos, torna-
se necessária a adição de nutrientes especiais como os fatores V e fator X, os quais
estão presentes no sangue de alguns mamíferos (Almeida et al. 2005).
Os meios de cultura convencionalmente utilizados em bacteriologia, na sua
maioria, utilizam o sangue de carneiro para confecção do clássico ágar sangue.
Para disponibilizar os fatores V e X do sangue, faz-se necessário a indução da lise
16
16
das hemácias do sangue do meio de cultura através de incubação a 80oC. Nestas
condições as hemácias do sangue de carneiro liberam uma enzima (NADase) que
degrada o fator V, diferente de hemácias provenientes de sangue de outras
espécies como coelho e cavalo. Desta forma os meios de cultura ideais devem ser
constituídos de uma base de nutrientes, esterilizada e posteriormente resfriada a
80ºC, adicionando-se então o sangue de um desses animais. O aspecto do meio de
cultura torna-se escurecido, sendo por isso chamado de ágar chocolate favorecendo
o crescimento da maioria das espécies de Haemophilus. Certamente este é um dos
pontos limitantes para o isolamento destas bactérias em material clínico suspeito e,
muitas vezes, com quadro clínico sugestivo, de infecção por Haemophilus (Killian &
Biberstein 1984; Lipuma et al. 1990; Campos 1999).
Alguns microrganismos, incluindo espécies de Staphylococcus, Neisseria e
certas espécies de fungos podem sintetizar o fator V. Quando esses microrganismos
estão presentes nas culturas mistas, espécies de Haemophilus, que requerem o
fator V podem aparecer como pequenas colônias, na área de produção do NAD,
próxima da colônia da bactéria produtora. Este fenômeno chama-se de satelitismo,
podendo desta forma colaborar na identificação desses microrganismos (Koneman
et al. 1997; Campos 1999).
Para uma identificação confiável da espécie devem ser aplicadas provas
bioquímicas, como, fermentação da glicose, xilose, lactose, manose, sacarose,
descarboxilação da ornitina, produção de indol e urease, de acordo com o Manual
de Identificação de Hi, da Organização Mundial da Saúde (WHO 1999).
17
17
1.10. Profilaxia: Vacina Conjugada
As vacinas bacterianas tradicionais são feitas com células inteiras atenuadas
ou mortas, como a do Bacilo Calmette-Guérin (BCG) ou a Bordetella pertussis, e
toxóides (toxinas bacterianas quimicamente inativadas) como as vacinas contra
tétano e difteria. Expectativas de grandes descobertas e avanços tecnológicos foram
ampliadas com a possibilidade de vacinas conjugadas. Estas incluem veículos
proteicos, mais imunogênicos, acoplados a polissacarídeos específicos formando o
terceiro grupo de vacinas bacterianas. As tradicionais, no entanto, são produzidas
em alta escala e a custo não elevado tendo sua produção difundida em todo o
mundo, enquanto as conjugadas ainda são restritas a poucos países pelo alto custo
tecnológico.
A primeira vacina disponível para prevenção de doenças provocadas por Hi
tipo b foi desenvolvida no início dos anos 70, composta basicamente de cápsula
polissacarídica purificada de Hib (Rodrigues et al. 1971; Anderson et al. 1972;
Adams et al. 1993). O polissacarídeo purificado demonstrou uma eficiência
satisfatória em crianças acima de 18 meses (Granoff & Cates 1985; Adams et al.
1993). Estudos realizados na Finlândia, a partir de 1974, demonstraram a
capacidade imunogênica da vacina constituída pelo polissacarídeo capsular do Hi, o
polirribosil-ribitol-fosfato ou PRP (Peltola et al. 1984). Os autores concluíram que o
PRP era capaz de conferir proteção a 90% das crianças vacinadas com 18 a 71
meses de idade contra todas as formas de doenças invasivas causadas por Hi tipo
b. Observaram também que a vacina não conferia imunidade a crianças menores
que 18 meses, e que a resposta imunogênica tornava-se mais intensa e duradoura
com o aumento da idade, passando a ser semelhante entre adultos e crianças a
18
18
partir do sexto ano de vida. A persistência de nível protetor de anticorpos nos
vacinados entre 18 e 35 meses de idade variou de um ano e meio a três anos e
meio. A eficácia protetora dessa vacina, em 90% das crianças entre 24 e 59 meses
de idade, foi também comprovada (Dennehy 2001). Em outros estudos realizados
nos EUA, a vacina utilizando o PRP sozinho protegeu 41 a 88% das crianças
estudadas com idade igual ou superior a 18 meses (CDC 1991).
Atualmente, quatro tipos de vacinas conjugadas contra Hib estão licenciadas
para crianças a partir de seis semanas, adotando-se, de regra, o critério da primeira
dose com dois meses de idade. Todas elas utilizam o mesmo princípio imunogênico
variando apenas quanto ao tipo de carreador proteico, como sintetizamos a seguir:
PRP-D (polirribosil-ribitol-fosfato ligado ao toxóide diftérico e produzido por
Connaught Labs), HbOC (polirribosil-ribitol-fosfato ligado à proteína mutante de C.
diphteriae e produzido por Le derle/Praxis), PRP-T (polirribosil-ribitol-fosfato ligado
ao toxóide tetânico e produzido por Pasteur Merieux; Smith Kline e bio-Manguinhos)
e PRP-OMP (polirribosil-ribitol-fosfato ligado à proteína da membrana de N.
meningitidis e produzido por Merck S Dhome).
Após a introdução da vacina Hib, o foco na área de saúde humana tem sido
as cepas HiNT. A vacina Hib não é capaz de prevenir infecções causadas por outros
sorotipos de Hi e nem por HiNT. As vacinas pneumocócicas candidatas que utilizam
como carreador, a proteína D de HiNT, tem demonstrado uma potencial capacidade
de prevenir a otite média aguda (OMA) causada não somente pelos sorotipos de
Streptococcus pneumoniae, mas também por HiNT (Forsgren et al. 2008). As
evidências clínicas do efeito protetor desa proteína foi provado em um estudo
randomizado controlado duplo-cego de eficácia contra OMA com a formulação da
19
19
vacina experimental 11-valente, a qual demonstra significativo efeito protetor conta
OMA causada por HiNT além da OMA causada por S. pneumoniae (Dagan & Frasch
2009; Vesikari et al. 2009).
1.11. Epidemiologia
Antes do surgimento de vacinas conjugadas contra Hi tipo b nos EUA ao final
da década de 1980, o índice anual de incidência de infecções causadas por esta
bactéria estava na faixa de 67 a 129 casos para cada 100.000 crianças de até cinco
anos de idade, sendo que 50% dos casos ocorriam em crianças com idade inferior a
dois anos. Com a generalização do uso das vacinas conjugadas para Hib nos países
industrializados, as infecções clássicas invasoras produzidas por este
microrganismo têm diminuído drasticamente (López et al. 2000).
Após o início da vacinação em 1988, houve um declínio de 80 a 85% dos
casos totais de meningite por Hi tipo b em crianças, não somente nos EUA, mas
também em países da Europa (Mendelman et al. 1987; Adams et al. 1993;
Broadhurst et al. 1993; Murphu et al. 1993). Em 1998, Foxwell et al. (1998), em uma
avaliação da vacinação iniciada nos EUA e na Europa, descreveram e reforçaram os
esforços empreendidos para o desenvolvimento da vacina conjugada contra o Hib,
mostrando sua eficácia. Mas consideraram também que o foco nesta área da saúde
humana tem revelado uma mudança para HiNT, explicado pelo fato de que a vacina
conjugada Hib, ao agir diretamente contra a cápsula do polissacarídeo tipo
específico, não tem capacidade de prevenir infecções causadas pelos HiNT, bem
como pelos outros tipos capsulares.
20
20
De fato, com a redução das doenças invasivas na Europa e EUA pelo
decréscimo do Hib, os problemas de Saúde Pública apontam para a observação dos
outros tipos capsulares (a,c e f) e das cepas não capsuladas (Gómez-De-Leon et al.
2000).
Nas crianças vacinadas com a vacina conjugada Hib, os Hi não b poderão ser
expressivos agentes infecciosos de doença (Heath & McVernon 2002). Reforçando
este pensamento, Adderson et al. (2001) consideram que, com a drástica diminuição
e a hipotética eliminação do Haemophilus influenzae tipo b, outros sorotipos podem
adquirir forte virulência e emergir como importantes patógenos em crianças (Reis et
al. 2002; Almeida et al. 2005).
No Brasil a vacinação para Hib teve início na segunda metade de 1999,
atingindo então a maioria dos municípios. Seu impacto na diminuição dos casos de
meningite por Hib é conhecido parcialmente, havendo carências de publicações.
Dados do CDI/ SVS/ FNS, mostram que em 1999 foram notificados 1616 casos,
enquanto em 2003 houveram 111 casos confirmados de meningite por Hi tipo b,
uma redução de 93,3% em relação a 1999, ano do início da vacinação no Brasil.
Simões et al. (2004) avaliaram o impacto da vacina conjugada Hib em Goiás,
e concluiram que houve um expressivo declínio da incidência de meningite por
Haemophilus influenzae tipo b. O declínio observado foi precoce, ocorrendo um ano
após a introdução da vacina contra o Haemophilus influenzae b. A autora ressalta a
necessidade de vigilância contínua para detectar re-emergência do Haemophilus
influenzae b, avaliar possibilidade de falha vacinal e identificar mudanças no padrão
dos sorotipos do Hi.
21
21
Com objetivo de se identificar estudos que avaliaram a prevalência de
portador nasasofarígeo de Hi em crianças saudáveis que frequentam creches,
realizou-se uma busca eletrônica nas bases de dados PUBMED (U.S. National
Libary of Medicine Institutes of Health), cobrindo o período de junho de 1986 a
dezembro de 2009. Utilizaram-se as seguintes palavras – chave combinadas: Day-
care-center, Haemophilus influenzae, carriage. A tabela I sumariza os resultados
obtidos nos quais se observa grande variabilidade nas taxas de portador de Hi (11 –
92%). Observa-se que no período pré-vacinal a prevalência de colonização por Hib
na nasofaringe de crianças saudáveis variou de 7,3% a 9,8%, no Brasil de acordo
com os estudos de Bonifácio da Silva & Marim (2001) e Bricks et al. (2004), e na
Índia atualmente, em estudo relatado por Sekhar et al. (2009) a prevalência de
colonização por Hib foi de 7,7%, bem semelhante a do Brasil na era pré-vacinal.
Os estudos conduzidos por Bonifácio da Silva & Marim (2001) e Bonifácio da
Silva et al. (2006) evidenciam os dados de estudos feitos nas eras pré e pós-vacinal,
respectivamente, e ao compará-los pode-se notar que houve uma pequena redução
da prevalência de portador Hi (91,8 e 81,5%), mas uma significativa redução da
prevalência de Hib (10 e 0,9%). Nos países em que a vacina Hib foi introduzida
como o Brasil, EUA, França e alguns países asiáticos as taxas de prevalência de
colonização por HiNT se tornaram as mais altas (Dabernat et al. 2003, Barbosa-
Cesnik et al. 2006, Bonifácio da Silva et al. 2006, Oguzkaya-Artan et al. 2007, Torun
et al. 2009).
22
22
Tabela I: Estudos de portador de Haemophilus influenzae (Hi) na nasofaringe realizados no Brasil e
no mundo no período de 1997 a 2009. Autor, ano País/Local Período População de estudo Prevalência Hi Sorotipos
Prevalentes Nº de
crianças Idade Elegibilidade N %
Bonifácio da
Silva & Marim 2001
Brasil,
Ribeirão Preto
1997
61
< 5 anos
Creches
56
91,8
1 Hie, 6 Hib, 49 HiNT
Bricks et al.
2004
Brasil,
Taubaté
1998
987
< 6 anos
Creches
172
17,4
72 Hib
100 HiNT
Dabernat et
al. 2003
França 3 áreas distintas
1999
1683
< 3 anos
Creches
688
40,8
7 Hif, 10 Hif,
671 HiNT
Barbosa-
Cesnik et al. 2006
EUA,
Michigan
2001
198
< 3anos
Creches
127
90,4
127 HiNT
Jain et al.
2005
India
2000 -2002
2400
5 – 10 anos
Pré-
escola
1001
41,7
Não
realizado
Bonifácio da Silva et al.
2006
Brasil,
Ribeirão Preto
2002-2003
114
< 3anos
Creches
93
81,5
1 Hib; 1 Hid; 1 Hie; 3 Hif;
87 HiNT
Hashida et al.
2008
Japão, Fukoka
2004-2005
363
< 6 anos
Creches
172
47,4
Não
realizado
Oguzkaya-Artan et al.
2007
Turquia, Kayseri
2006
683
5- 6 anos
Creches
107
15,6
29 Hib
78 HiNT
Torun et al.
2007
Turquia, Istambul
2007
195
-
Creches
95
48,7
14 Hib, 16
outros sorotipos, 65 HiNT
Torun et al. 2009
Turquia, Istambul
2009
330
6 -10 anos
Pré-
escola
106
32,4
8 Hib, 7
outros tipos, 91 HiNT
Sekhar et al. 2009
Índia
Norte da Índia
2009
1000
< 2anos
-
112
11,2
77 Hib
35 HiNT
23
23
2. Justificativa
Haemophilus influenzae é uma relevante causa de morbidade e mortalidade
entre crianças menores de cinco anos nos países em desenvolvimento incluindo
países da América Latina (Andrade et al. 2001). O Hib foi o mais importante agente
etiológico das meningites e de outras doenças invasivas graves em lactantes. Após
a introdução da vacina conjugada a colonização assintomática pelo Hib em crianças
tem variado de 1% a 5% em diferentes regiões (Bonifácio da Silva et al. 2006;
Oguzkaya-Artan et al. 2007). Cepas não capsuladas, HiNT, fazem parte da
microbiota do trato respiratório superior e são responsáveis por infecções não-
invasivas em cerca de 20% a 30% de todos os episódios de otite média aguda
(Morris et al. 2008).
A vacinação contra o Hib nos programas nacionais de imunização em países
desenvolvidos e países na América Latina tem contribuído para a redução da
morbidade causada pelo Hi, diminuindo drasticamente as meningites em crianças, e
a colonização por este agente em crianças e adultos, por meio da imunidade de
grupo (Moulton et al. 2000). Uma consequência deste efeito pode ser o aumento da
colonização por tipos não cobertos pela vacina conjugada Hib (Lipsitch 1999). Nos
países da América Latina, a vacina conjugada Hib foi introduzida nos Programas
Nacionais de Imunização entre 1994 a 2003 (Landaverde et al.1999; Morris et al.
2008).
Estudos têm mostrado que crianças vacinadas com a vacina conjugada Hib
têm menores taxas de colonização por microrganismos deste sorotipo e
consequentemente levam a imunidade de grupo. A imunidade de grupo é um
benefício que tanto crianças, como adultos não vacinados ganham pela baixa
colonização da comunidade, que diminui o risco de exposição ao Hib (Morris et al.
24
24
2008). A diminuição da colonização por Hib leva ao aumento na colonização por
outros sorotipos ou por outras espécies. Portanto, a vigilância da colonização por
isolados de Hi é uma necessidade para monitorarmos a substituição do Hib por
outros sorotipos na nasofaringe e medir o potencial de impacto de outras vacinas,
pois a nasofaringe é também colonizada por outros microrganismos, como por
exemplo Streptococcus pneumoniae.
Andrade et al. (2004) em estudo de vigilância de base populacional sobre Hi e
S. pneumoniae na infância conduzido em crianças de Goiânia, detectaram que a
frequencia a creches é o maior fator de risco para pneumonia em crianças menores
de cinco anos.
Os estudos realizados nos EUA e em países da Europa demonstraram um
aumento da importância relativa dos números de casos de doença invasiva por
cepas de outros sorotipos de Hi (a, e, f) e por cepas HiNT nos anos após a
introdução da vacina conjugada Hib, sugerindo uma possível substituição do Hib
(Bajanca et al. 2004; Campos et al. 2004; Bruce et al. 2008).
O uso de técnicas de tipagem molecular na caracterização de sorotipos de Hi
colonizadores da nasofaringe podem contribuir com informações epidemiológicas
permitindo uma sistemática avaliação da vacina Hib e das próximas vacinas
comjugadas de S. pneumoniae e HiNT quando estas estiverem incluídas nos
programas de imunização brasileiro.
25
25
3. Objetivos
3.1. Geral
- Avaliar a prevalência do estado de portador de H. influenzae na
nasofaringe de crianças matriculadas em creches de Goiânia 6 anos
após a introdução da vacina conjugada Hib.
3.2. Específicos
- Caracterizar os sorotipos de H. influenzae presentes na nasofaringe das
crianças das creches de Goiânia pela técnica da PCR.
- Detectar pela PCR a presença dos genes relacionados à resistência a
beta-lactâmicos TEM1 e ROB-1 nos isolados de H. influenzae.
- Identificar potenciais fatores de riscos associados ao portador nasal de
Haemophilus influenzae.
- Construir uma linha de base para avaliações do efeito direto e indireto da
vacina pneumocócica 10-valente, que contém a proteína D do H.
influenzae não tipável.
26
26
4. Material e Métodos
4.1. População e área de estudo
Este estudo foi conduzido a partir de amostras clínicas coletadas no período
de agosto a dezembro de 2005 em Goiânia, capital do estado de Goiás, situada na
região central do Brasil. Goiânia possui uma população de 1.281.973 habitantes
(MS, DATASUS 2005), ocupa uma área de 739.492 km2 e na última década
apresentou acelerado ritmo de crescimento (IBGE 2009). Um estudo de corte
transversal de portadores de Haemophilus influenzae em nasofaringe foi conduzido
em crianças de dois a cinquenta e nove meses de idade, atendidas em 62 dos 70
Centros Municipais de Educação Infantil (CMEIs) do município. Oito CMEIs não
foram incluídos devido a reformas na ocasião do estudo. Crianças foram
consideradas não elegíveis se tivessem tomado antibiótico nos últimos sete dias e,
ou, apresentassem alguma doença que contra indicasse a coleta de swab em
nasofaringe. O protocolo de estudo foi aprovado pelo comitê de ética regional do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás (HC/UFG, protocolo número
054/2005), atendendo a resolução 196/96 do MS (Anexo I). O consentimento livre e
esclarecido, por escrito, foi obtido dos pais ou responsáveis pelas crianças (Anexo
II).
4.2. Coleta de dados
Informações sobre as características sócio-demográficas e potenciais fatores
de risco para colonização por Hi foram obtidas por meio de entrevista com pais ou
responsáveis pela criança, após obtenção do consentimento livre e esclarecido e
antes da coleta do swab. Foram obtidos dados sobre a criança, como idade, gênero,
tamanho da família, numero de irmãos, além de aspectos relacionados a saúde da
27
27
criança (como ocorrência de febre, uso de antibiótico, hospitalização, pneumonia,
asma, otite de repetição, gripe) e dados relacionados a família como uso prévio de
antibiótico por algum membro da família, internação prévia por algum membro da
família, tamanho da família, número de irmãos, irmão internado e escolaridade da
mãe além de aspectos relacionados à saúde dos membros da família. As entrevistas
foram realizadas utilizando um formulário padronizado (Anexo III). Os pesquisadores
foram previamente treinados para a condução da entrevista e aplicação do
questionário. O trabalho de campo foi conduzido utilizando manuais de
preenchimento das fichas e as variáveis foram codificadas para facilitar sua
digitação.
4.3. Amostragem e tamanho da amostra
O total de crianças que frequentavam os CMEIs do município compuseram a
população alvo do estudo. Cada CMEI forneceu a lista com a relação nominal das
crianças matriculadas. A seleção das crianças participantes do estudo foi realizada
por amostragem consecutiva, ponderada pelo tamanho da creche, até se alcançar o
número amostrado para aquela creche. Com base em publicação sobre Hi em
creches (Machado-Neto 2005) que estimou uma prevalência de crianças portadoras
de Hi na nasofaringe de 18,2%, estimou-se que uma amostra com aproximadamente
1200 crianças seria suficiente para estimar a prevalência de Hi e o risco de portador
de Hi com intervalo de 95% de confiança (efeito do desenho = 1,5).
28
28
4.4. Coleta de swabs de nasofaringe
Após as entrevistas, uma amostra da nasofaringe de cada criança foi
coletada. Os swabs foram coletados de acordo com a técnica de introdução
pernasal (figura IA), critério preconizados pela OMS (WHO), que consiste na
introdução de transwab calcium alginate, ultrafino, flexível (figura IB) à
aproximadamente 2/3 da distância entre o nariz e o lóbulo da orelha na direção
horizontal. Ao encontrar resistência na parede posterior da nasofaringe, foram
realizados movimentos giratórios de 180 graus. Um espécime de nasofaringe foi
coletado por criança. O material coletado foi acondicionado em meio modificado de
Stuart para transporte (TranswabTM, Medical Wire; Equipament,Wiltshire, United
Kingdom) e encaminhado, em até duas horas da coleta, ao Laboratório de
Bacteriologia Médica do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG,
onde as amostras foram processadas imediatamente. Os procedimentos técnicos
para obtenção e transporte do swab dos isolados de Haemophilus seguiram as
recomendações da OMS para detecção de portador de Hi de nasofaringe (WHO
1999).
Figura I: (A) Swab pernasal; (B) Esquema da técnica referida pela OMS para
coleta de material da nasofaringe. Desenho ilustrativo da obtenção das
amostras de nasofaringe (adaptado de OPAS 2005).
Swab Pernasal (A)
(B)
29
29
4.5. Isolamento e Identificação
Os procedimentos laboratoriais para isolamento e identificação de H.
influenzae foram realizados de acordo com as técnicas recomendadas pela OMS
(WHO 1999). O isolamento foi realizado pela semeadura das amostras de swabs em
ágar chocolate suplementado com bacitracina (300 µg para cada 100 mL) e
incubadas em condições de microaerofilia a temperatura de 37°C por 24 a 48 horas.
A identificação do Haemophilus influenzae baseou-se na morfologia colonial,
coloração de Gram, exigência de fatores V e X e teste de Satelitismo. Isolados com
as características de cocobacilos Gram-negativos foram repicados para re-
isolamento em ágar chocolate e incubados novamente em condições de
microaerofilia, a 37°C por 24 horas. O teste de satelitismo foi realizado estriando
Staphylococcus aureus em ágar sangue. Quando esses microrganismos estão
presentes nas culturas mistas, espécies de Haemophilus, que requerem o fator V
podem aparecer como pequenas colônias, na área de produção do NAD pelo S.
aureus, próxima a estria (Campos et al. 2003).
Ressuspenderam-se as colônias representativas de cada isolado em 1mL de
solução salina e foram encaminhadas para o Laboratório de Bacteriologia Molecular
do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG, para a realização de
PCR para a identificação e tipagem capsular.
4.6. Extração de DNA Cromossomal
Algumas colônias (4 a 5) de culturas confirmadas como Haemophilus sp ou
H. influenzae foram ressuspendidas em 100 µL de solução salina onde apenas 50
µL foram centrifugados em outro tubo, o sobrenadante descartado e o pellet
ressuspendido em 50µL de água MiliQ e fervido por 10 minutos. Após fervura as
30
30
amostras passaram por mais uma centrifugação 10.000 g por 5 minutos e 40 µL do
sobrenadante transferido para outro tubo e armazenado a -20oC (Pitcher et al.
1989). E os 50 µL restantes da salina bacteriana foram congelados a -20° C.
4.7. Confirmação da espécie e cápsula por PCR
A confirmação da espécie e identificação do gene para expressão da cápsula foi
realizada em PCR multiplex, que utilizou dois pares de primers P61/P62 e HI1/HI2
(para espécie e para cápsula, respectivamente, tabela II) em uma mesma reação em
cadeia da polimerase de acordo com van Ketel et al. (1990). Todas as cepas
capsuladas passaram por duas PCR multiplex, a primeira para os tipos a, d e f e
uma segunda PCR para os tipos b, c, e e. As sequências de oligonucleotídeos
usadas em todas as PCRs estão descritas na tabela II. Utilizaram-se as seguintes
cepas padrões como controle positivo para todas as PCRs: Hia ATCC9006; Hib
ATCC33533; Hic ATCC9007; Hid ATCC9332; Hie ATCC8142; Hif ATCC9833.
Todas as amostras confirmadas para espécie e que não resultaram em
amplificação da região bexA foram ainda analisadas quanto a presença do gene
capB, que codifica a cápsula tipo b e possibilita a identificação de Hi tipo b- na
população HiNT. As cepas HiNT b- são mutantes do Hi tipo b.
O produto da amplificação do DNA foi aplicado em gel de agarose 1,5%,
corado com brometo de etídio a 0,5 µg/mL e submetido a eletroforese por 1 hora a
100 volts. Como marcador molecular usou-se 1 kb Ladder (Invitrogen).
31
31
Tabela II: Sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação da região cápsula-específica, tipo específico do genoma e espécie do H. influenzae e os tamanhos dos produtos esperados (van Ketel et al. 1990; Falla et al. 1994; Tristam & Nichols 2006).
Nome dos iniciadores
Iniciadores (5’ para 3’) Alvo Tamanho (pb)
a1 a2
CTACTCATTGCAGCATTTGC AATATGACCTGATCTTCTG
cap a 250
b1 b2
GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA
cap b 480
cap c 250 c1 c2
TCTGTGTAGATGATGGTTCA CAGAGGCAAGCTATTAGTGA
d1 d2
TGATGACCGATACAACCTGT TCCACTCTTCAAACCATTCT
cap d 150
e1 e2
GGTAACGAATGTAGTGGTAG GCTTTACTGTATAAGTCTAG
cap e 1.350
f1 f2
GCTACTATCAAGTCCAAATC CGCAATTATGGAAGAAAGCT
cap f 450
Hi 1 Hi 2
CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC TGTCCATGTCTTCAAAATGATG
bex A 345
P6 1 P6 2
AATTTCCAGCTTGGTCTCCA AATGGTAGGTTGTGAGAGGCT
espécie H. influenzae
851
TEM1 Fwd TEM1 Rev
TGGGTGCACGAGTGGGTTAC TTATCCGCCTCCATCCAGTC
β-lactamase 526
ROB-1 Fwd ROB-1 Rev
ATCAGCCACACAAGCCACCT GTTTGCGATTTGGTATGCGA
β-lactamase 692
4.8. PCR para genes de resistência
A análise da resistência a ampicilina foi feita por PCR para os genes blaTEM e
blaROB, que aqui denominamos também por TEM1 e ROB-1 utilizando os
oligonucleotídeos inciadores descritos na tabela II (Tristam & Nichols 2006).
32
32
4.9. Análise dos dados
A base de dados foi construída no programa EpiInfo Windows 3.2 e os
possíveis fatores de riscos foram analisados pelo programa SPSS v.15.0 (Statistical
Package for the Social Sciences - Inc., Chicago. IL, EUA). A idade foi estratificada
em grupos de ≤ 23 meses e ≥ 23 meses. Para efeito de análise de dados os HiNT b-
foram agrupados ao HiNT. Regressão logística foi utilizada para analisar os fatores
de risco associados ao portador de Hi. Os resultados foram apresentados como
odds ratio (OR) com intervalo de 95% de confiança (IC 95%). Todas as variáveis
com valor de p menor que 0,05 em análise univariada foram incluídas no modelo
multivariado para identificar fatores independentes associados ao portador de Hi.
33
33
5. Resultados
5.1. Isolamento e Identificação molecular de H. influenzae por PCR
Do total de 1192 crianças participantes neste estudo e de acordo com a PCR,
383 estavam colonizadas pelo Hi, sendo que deste total, 105 eram Hi capsulados e
278 eram HiNT dos quais, 17 eram HiNT b-.
Assim, a prevalência de Hi encontrada na nasofaringe de crianças que
frequentavam as creches em Goiânia no período do estudo foi de 32,1%, sendo 105
(8,8%) Hi capsulados tipos; f (n = 55), a (n = 24), d (n = 17), b (n = 8), c (n = 1), e
(n = 0). A prevalência de HiNT foi de 23,3% e de Hint b- foi de 1,5% (tabela III).
Dentre as 383 cepas de Hi submetidas a PCR para os genes TEM1 e ROB-1
que induzem a produção de beta-lactamases, detectou-se 147 (38,4%) cepas
portadoras do gene TEM1 e nenhuma cepa positiva para o gene ROB-1. A
prevalência do gene TEM1 nas crianças das creches por tipo capsular encontra-se
na tabela III. Chama a atenção que 43,2% das cepas HiNT (120/278) apresentaram
o gene TEM1.
a b c d e f 0
10
20
30
40
50
Tipo de cápsula
No de
crianças portadoras em
nasofaringe
34
34
Tabela III: Prevalência de tipos capsulares de H. influenzae, HiNT e presença de genes de resistência para antibióticos beta-lactâmicos em secreções de nasofaringe de 1192 crianças de creches de Goiânia agosto – dezembro 2005.
Tipos Capsulados H. influenzae N (%)
TEM1 N (%)
a 24 (2,0) 6 (0,5)
b 8 (0,7) 2 (0,2)
c 1 (0,08) -
d 17 (1,4) 3 (0,3)
e 0 (0,0) -
f 55 (4,6) 16 (1,3)
Total 105 (8,8) 27 (2,3)
HiNTa 278 (23,3)
120 (10,1)
Não Haemophilus 809 (68) NAb a incluso 17 cepas HiNT b- bNA – não se aplica
5. 2. Fatores de Risco
As características clínicas e sócio-demográficas associadas ao portador de Hi
capsulados e não capsulados estão apresentadas na tabela IV. Uso de antibiótico
prévio nos últimos 6 meses pela criança e uso de antibiótico por algum membro da
família nos últimos 3 meses estiveram associados a proteção contra colonização
pelo HiNT em análise bivariada e multivariada (tabela V). Dos fatores associados ao
risco de colonização por Hi capsulados em análise univariada e multivariada
somente internação prévia da criança nos últimos 6 meses, permaneceu como fator
de risco em crianças colonizadas por Hi tipáveis. O número de irmãos mais velhos e
número total de irmãos (p= 0,013 e p= 0,001) estiveram associados com a
colonização nasofaríngea por Hi.
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35
Tabela IV: Características clínicas e demográficas da colonização por Haemophilus influenzae entre crianças de creches.
aúltimos 30 dias ;b últimos 3 meses; c últimos 6 meses
Hi Tipáveis HiNT
Fatores de risco Sim N= 105 (%)
Não N= 1087 (%) P
Sim N= 278
(%)
Não N= 914
(%) P
Fatores da criança Idade 4 - 23 meses 15 (14,3) 195 (17,9) 54 (19,4) 156 (17,1) > = 24 meses 90 (85,7) 892 (82,1) 0,336 224 (80,6) 758 (82,0) 0,371 Sexo Masculino 61 (58,1) 584 (5307) 148 (53,2) 497 (54,4) Feminino 44 (41,9) 503 (46,3) 0,390 130 (46,8) 417 (45,6) 0,739 Criança freqüentou outra creche Sim 97 (92,4) 958 (88,1) 247 (88,8) 808 (88,4) Não 8 (7,6) 129 (11,9) 0,170 31 (11,2) 106 (11,6) 0,838 Internação prévia c Sim 18 (17,1) 105 (9,7) 29 (10,4) 94 (10,3) Não 87 (82,9) 981 (90,3) 0,025 249 (89,6) 819 (89,7) 0,948 Uso de antibiótico prévio c Sim 95 (91,3) 932 (87,9) 223 (84,2) 804 (89,4) Não 10 (9,5) 128 (12,1) 0,428 42 (15,8) 95 (10,6) 0,023 Febre a Sim 28 (26,7) 317 (29,2) 80 (28,8) 265 (29,0)
Não 77 (9,1) 769 (90,9) 0,583 198 (71,2) 648 (71,0) 0, 936 Otite de repetição Sim 6 (5,7) 36 (3,3) 13 (4,7) 29 (3,2) Não 99 (94,3) 1049 (96,7) 0,238 264 (95,3) 884 (96,8) 0,246 Asma Sim 5 (4,8) 30 (2,8) 13 (4,7) 22 (2,4) Não 100 (95,2) 1055 (97,2) 0,283 264(95,3) 891 (97,6) 0,062 Pneumonia Sim 104 (99,0) 1071 (98,5) 272 (97,8) 903 (98,8) Não 1 (1,0) 16 (1,5) 0,650 6 (35,3) 11 (64,7) 0,626 Gripe Sim 44 (41,9) 466 (42,9) 107 (38,5) 403 (44,1) Não 61 (58,1) 620 (57,1) 0,842 171 (61,5) 510 (55,9) 0,094 Fatores da família Algum membro tomou antibiótico c Sim 82 (78,1) 809 (74,4) 175 (62,9) 716 (78,3) Não 23 (21,9) 278 (25,6) 0,402 103 (37,1) 198 (21,7) < 0,001 Algum membro internou b Sim 15 (14,3) 88 (8,1) 29 (10,4) 74 (8,1) Não 90 (85,7) 998 (91,9) 0,045 249 (89,6) 839 (91,9) 0,236 Algum membro internou c Sim 24 (22,9) 170 (15,6) 47 (16,9) 147 (16,1) Não 81 (77,1) 917 (84,4) 0,067 231 (23,1) 767 (76,9) 0,746 Irmão internado b Sim 8 (7,8) 42 (3,9) 8 (7,8) 42(3,9) Não 95 (92,2) 1031 (96,1) 0,092 95 (8,4) 1031 (97,6) 0,092 Escolaridade da mãe Analfabeta 0 (0) 8 (7) 2 (0,7) 6 (0,7) Ensino fundamental 64 (63) 632 (58,6) 179 (64,9) 517 (57,3) Ensino Médio 33 (32,7) 368 (34,1) 80 (29) 321 (35,5) Ensino Superior 4 (4,0) 70 (6,5) 2,103 15 (5,4) 59 (6,5) 0,156
36
36
37
37
6. Discussão
Este estudo analisou a prevalência e fatores de riscos para colonização por Hi
em crianças menores de cincos de idade que frequentaram creches da cidade de
Goiânia. Foi encontrado que 32,1% das crianças estavam colonizadas por Hi na
nasofaringe. Existe uma grande variação de prevalência de colonização de Hi entre
os 11 estudos com uma prevalência variando de 11 a 92%. Esta variação pode ser
explicada por diferenças na população investigada, como nível socioeconômico das
populações, diferenças culturais, aspectos epidemiológicos, assim como no
tamanho da amostra.
O principal fator de risco para colonização por Hi é a idade. A idade de dois
anos tem sido considerada como um marco para a alta prevalência de colonização
por patógenos respiratórios (Collet et al. 1991; Neto et al 2003). Os resultados deste
estudo corroboram com estes achados, em que 314 (82%) das 383 crianças
colonizadas por Hi eram menores de 24 meses de idade.
A aglomeração que normalmente ocorre em creches se reflete em uma maior
exposição e consequentemente pode ser a causa do aumento das taxas de
colonização por Hi capsulados e não capsulados, sendo este mesmo efeito sugerido
para explicar as maiores taxas de colonização em crianças com mais irmãos (Li et
al. 1986, Howard et al. 1988).
Dentre os fatores de risco analisados em nosso estudo, o uso prévio de
antibiótico pela criança e o uso prévio de antibiótico por algum membro da família foi
um fator protetor para a colonização nasofaríngea por Hi não tipável. Embora na
literatura não haja referências sobre estas observações, o uso de antibiótico pode
estar relacionado a eliminação da microbiota da nasofaringe, especialmente dos
HiNT que são sensíveis a maioria dos antimicrobianos.
38
38
Bricks et al. (2004), conduziram um estudo na cidade de Taubaté/SP um ano
antes do início da introdução da vacina Hib no Brasil, do qual participaram 987
crianças saudáveis, menores de 6 anos de idade, onde foi encontrada uma taxa de
prevalência de 7,4% (73/987) de crianças colonizadas pelo Hib. A prevalência de
portador de Hib encontrada em nosso estudo foi de 0,7%, evidenciado uma queda
acentuada da prevalência em função das sucessivas campanhas de vacinação
executadas no Brasil.
Estudos conduzidos em creches têm mostrado baixa taxa de colonização
pelos diferentes sorotipos de Hi encontrada após vacinação Hib. Um estudo francês
com 1.683 crianças saudáveis relatou 0,6% do tipo e e 0,4% do tipo f (Dabernat et
al. 2003). Um estudo americano, compreendendo 198 crianças e 404 isolados,
relata o isolamento de apenas uma cepa sorotipo f (Farjo et al, 2004). Semelhante
aos nossos achados, no estudo dinamarquês de Peerbooms et al. (2002) que
envolveu 535 crianças de creches, a prevalência encontrada foi de 0,7% (4/535)
isolados tipo b.
Após a introdução da vacina conjugada Hib, a maioria das doenças causadas
por este sorotipo desapareceu. Atualmente os sorotipos c e f e os HiNT são
responsáveis pela maioria das doenças causadas por este microrganismo (Peltola
2000). Hoje se pode dizer que o portador de Hib ou HiNT b- dentro da população
estudada ocorre por causa da vacinação incompleta, ou, resposta ruim à vacina ou
baixa resposta imune.
A prevalência de HiNT encontrada neste estudo foi de 23,3%. Pelos dados
sumarizados na tabela I, as taxas de portador de HiNT possuem uma variabilidade
grande (3,5 – 80%) dentro das populações investigadas. A prevalência de
colonização por HiNT encontrada em nosso estudo foi semelhante a dois estudos de
39
39
Torum et al. (2007 e 2009) ambos relatando cerca de 30% de prevalência de
portador nasofaríngeo por HiNT. A preocupação com HiNT tem aumentado, pelo
fato deste microrganismo ser a causa mais comum de otite média em crianças
menores de 5 anos e sinusite em crianças e adultos (Murphy 2009). As cepas de
HiNT, podem persistir na microbiota nasofaríngea criando assim uma oportunidade
de disseminar para outras crianças.
A resistência a antibióticos beta–lactâmicos mediada geneticamente é o
mecanismo mais comum de resistência em Hi, e neste estudo encontramos 147
(12,3%) cepas de Hi portadores do gene TEM1, o que sinaliza a possibilidade
destas cepas serem resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos. A prevalência de
cepas portadoras do gene TEM1 encontrada neste estudo é bem próxima a
encontrada no Japão por Hasegawa et al. (2006) de 11%, e bem maior que a
encontrada no mesmo país por Hasida et al. (2008), onde a taxa de cepas
portadoras do gene TEM1 foi de 0,8% (3/363).
Em nosso estudo, observamos que o gene TEM1 de resistência aos
antibióticos beta-lactâmicos estão presentes nas cepas de HiNT isoladas (43,2%)
em uma frequência 1,7 vezes maior do que a encontrada em Hi capsulados (25,7%)
evidenciando um risco adicional das crianças portadoras de HiNT.
A Proteína D (PD) tem demonstrado ser uma candidata promissora nas
vacinas experimentais contra HiNT. PD é o primeiro antígeno de HiNT a induzir
resposta protetora em humanos (Forsgren et al. 2008). Portanto, nosso estudo
justifica a introdução da vacinação PHiD-CV na população infantil do município de
Goiânia, como meio de imunização profilática. Espera-se que semelhantemente a
vacina Hib, a vacina PHiD-CV atue como redutora de colonização por HiNT na
nasofaringe. A eliminação do estado de portador, portanto, pode ter o maior impacto
40
40
global sobre a carga das doenças causadas pelo HiNT. Mudanças na ecologia da
nasofaringe, porém, pode ter consequências para outros microrganismos, incluindo
outros potenciais agentes patogênicos que habitam este nicho, criando uma
necessidade de monitoramento contínuo desta população.
Esse tipo de fonte de informação pode ser adquirida em sistemas de
vigilância de saúde por meio de “eventos sentinelas”, utilizando especialistas ou
clínicos gerais que formam redes de profissionais sentinelas, com a possibilidade de
estender seu uso para estudos epidemiológicos analíticos e descritivos. O estudo
em profundidade de áreas delimitadas, “áreas sentilenas”, pode possibilitar
procedimentos de análises de um grande número de variáveis, importantes para a
orientação dos processos de intervenção no campo da Saúde Pública. Entende-se,
portanto, que essa estratégia poderá contribuir para o redirecionamento e
aprimoramento das práticas de intervenção em saúde, como a profilaxia por vacinas
e seu impacto na população.
41
41
7. Conclusões
- A prevalência de Haemophilus influenzae colonizando a nasofaringe de crianças
encontrada foi de 32,1% e a prevalência dos sorotipos capsulados encontrados foi
4,6% para o sorotipo f, 2,0% para o sorotipo a, 1,3% para o sorotipo d, 0,1% para o
sorotipo c e 0,7% para sorotipo b e nenhuma cepa do sorotipo e foi encontrada.
- O gene TEM1 foi detectado em 43,2% das cepas não tipáveis e o gene ROB-1 não
foi detectado em nenhuma cepa analisada.
- As cepas não tipáveis (23,3%) predominam em crianças portadores de
Haemophilus influenzae que frequentam creches em Goiânia.
- Os fatores significativamente associados em análise univariada e multivariada
para colonização nasofaríngea por Hi capsulado em crianças de creche do
município de Goiânia foi: internação prévia da criança nos últimos 6 meses.
- O uso prévio de antibióticos nos últimos 6 meses e uso prévio de antibióticos por
algum membro da família nos 6 meses foram fatores protetores para colonização
por Hi.
42
42
8. Referências Bibliográficas
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Anexos
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Protocolo M 1 2 3 4 5 6 7 8 M
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TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Seu filho está sendo convidado(a) para participar, como voluntário, em uma pesquisa. Após ser esclarecido (a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de dúvida sobre a pesquisa, você poderá entrar em contacto com os pesquisadores responsáveis, Drª Cáritas Marquez Franco, telefone 202 7942. Em caso de dúvidas sobre os seus direitos como participante nesta pesquisa, você poderá entrar em contacto com o Comitê de Ética em Pesquisa do HC/ Universidade Federal de Goiás pelo telefone 2698338 ou 2698426.
Informações importantes sobre a pesquisa
A pesquisa está sendo conduzida pela Universidade Federal de Goiás, sob coordenação do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Coletiva em colaboração com as Secretarias de Saúde e de Educação do Município de Goiânia. O objetivo desta pesquisa é identificar se seu filho tem a bactéria pneumococo na região nasal, e se a bactéria é resistente à penicilina. Cerca de 1700 crianças residentes em Goiania com idade entre 2 meses e 2 anos de Goiania e que frequentam creches serão incluídas neste estudo.
Forma de participação
Uma amostra da secreção nasal de seu(sua) filho(a) será coletada para verificar a possibilidade de que seja portador(a) de bactérias resistentes à penicilina. Esta coleta será realizada na própria creche pela médica pediatra Drª Cáritas Marquez Franco por meio de uma haste flexível contendo algodão em sua extremidade e introduzida na narina de seu filho. Este procedimento não implicará em risco para seu filho(a) podendo apenas causar pequeno desconforto, tal como tosse e/ou espirro no momento da coleta. Voce poderá pleitear indenização em caso de dano decorrente da participação de seu filho(a) na pesquisa. O material coletado será enviado ao Laboratório de Bacteriologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás. O responsável pela criança deverá responder a um questionário com algumas perguntas sobre ela. Não haverá remuneração pela participação de sua criança. No entanto, os exames clínicos e laboratoriais serão inteiramente gratuitos. A participação de seu filho contribuirá para a identificação de áreas de alta prevalência de pneumococos resistentes. Estas áreas de risco devem ser priorizadas quando da introdução da vacina antipneumocócica no programa de imunização. Você pode recusar a participação de seu(a) filho(a) nesta investigação e você não será penalizado(a) ou sofrerá qualquer prejuízo por isso, tanto no atendimento no posto de saúde, quanto na permanência dele(a) na creche. Toda a informação coletada de seu filho será mantida em confidencialidade. Pedimos sua autorização para armazenar o material biológico de seu filho(a) para que possamos aprofundar as investigações utilizando novas tecnologias quando futuramente disponíveis.
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TERMO DE CONSENTIMENTO
Eu fui informado(a) sobre este estudo, assim como dos procedimentos que implicam na participação de meu(minha) filho(a). Declaro que fui devidamente esclarecido(a) pelo pesquisador sobre a pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi me garantido que posso recusar a participação de meu filho ou filha nesta investigação.
Responsável Parentesco com a criança: Nome:____________________________________ Ass: _____________________________________
Impressão digital
Médico Nome:____________________________________ Ass:______________________________________ Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimento sobre a pesquisa e aceite do sujeito em participar. Testemunha (não ligada à equipe de pesquisadores): Nome: ___________________________________Assinatura: ________________ Nome: ___________________________________Assinatura: ________________ Goiânia _______/_______/ ________
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QUESTIONÁRIO
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