II JornadaCientíficaEmbrapa Meio-Norte

Anais

Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Meio-Norte

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Embrapa Meio-NorteTeresina, PI

2016

Teresina, 14 e 15 de setembro de 2016

2

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Embrapa Meio-Norte

Jornada de Iniciação Científica da Embrapa Meio-Norte (2. : 2016 : Teresina, PI).

Anais da II Jornada Científica da Embrapa Meio-Norte / II Jornada Científica da Embrapa Meio-Norte, Teresina,

PI, 13 a 14 de setembro de 2016. – Teresina : Embrapa Meio-Norte, 2016. 126 p.

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1. Pesquisa científica. 2. Iniciação científica. 3. Agricultura. 4. Pecuária. 5. Tecnologia. I. Título. II. Embrapa

Meio-Norte.

CDD 607

© Embrapa 2016

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AVALIAÇÃO DE ENZIMAS POLIMERASES PARA

AMPLIFICAÇÃO DE DNA DE ESPÉCIES DO GÊNERO

Trichogramma WESTWOOD (HYMENOPTERA,

TRICHOGRAMMATIDAE)

Jéssica Barbara Vieira Viana1; Ranyse Barbosa Querino da Silva2; Paulo Sarmanho da Costa

Lima 3.

1Mestranda em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí, Teresina, PI, jessicabarbara-@hotmail.com 2Pesquisadora da Embrapa Meio-Norte, Teresina, PI, ranyse.silva@embrapa.br 3Pesquisador da Embrapa Meio-Norte, Teresina, PI.

RESUMO

Os problemas enfrentados ao se trabalhar com espécies do gênero Trichogramma

envolvendo técnicas de biologia molecular, estão relacionados às baixas concentrações do DNA

e sua qualidade inadequada. Para garantir reações em cadeia da polimerase (PCR) eficientes e

precisas com moldes de DNA que apresentem baixas concentrações e qualidade comprometida,

existem enzimas DNA polimerases capazes de superar tais problemas. As enzimas isoladas de

Pyrococcus furiosus apresentam alta fidelidade. Além desta, existem outras como as originárias

da bactéria termofílica Thermus aquaticus as quais podem sintetizar extensos segmentos de

DNA em curto prazo. Este trabalho teve como objetivo realizar um estudo comparativo da

eficiência da polimerase obtida de Thermus aquaticus e a polimerase isolada de Pyrococcus

furiosus. Os acessos de espécies de Trichogramma que não amplificaram em reações de PCR

com a polimerase obtida a partir de Thermus aquaticus, obtiveram resultados positivos quando

submetidos a PCRs com a polimerase purificada de Pyrococcus furiosus.

PALAVRAS-CHAVE: atividade exonucleásica, PCR, inibidores.

INTRODUÇÃO

As técnicas de biologia molecular têm se destacado no estudo de espécies crípticas de

Trichogramma (SAMARA et al., 2008). A reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica

que permite a duplicação de milhares de cópias de um segmento de DNA na presença da enzima

DNA polimerase; a eficiência da mesma depende da qualidade e da concentração dos ácidos

nucléicos (OLIVEIRA et al., 2007). As dificuldades na execução de estudos com

Trichogramma que aplicam técnicas de biologia molecular, estão associadas às baixas

concentrações de DNA extraídos destes organismos e sua qualidade inadequada, devido ao seu

tamanho diminuto.

Para garantir reações de PCR eficientes e precisas com moldes de DNA que apresentem

baixas concentrações, qualidade comprometida e presença de inibidores, existem enzimas DNA

polimerases com características que possibilitam superar esses fatores limitantes. A polimerase

isolada de Pyrococcus furiosus apresenta maior fidelidade na PCR quando comparada com

outras DNA polimerases, é considerada 50x mais precisa e possui atividade exonucleásica de

correção no sentido 3’-5’ (KIM et al., 2007). Outra DNA polimerase, isolada da bactéria

termofílica Thermus aquaticus, possibilita sintetizar uma fita de DNA com comprimento de mil

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bases em cerca de 30 segundos a 72°C, porém estas são desprovidas de atividade exonucleásica

de revisão 3’-5’ (HAKI; RAKSHIT, 2003; VIEILLE; ZEIKUS, 2001).

Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo realizar um estudo comparativo da

eficiência da polimerase obtida de Thermus aquaticus e a polimerase isolada de Pyrococcus

furiosus em PCR com DNA, extraído com a resina Chelex 100, de insetos do gênero

Trichogramma.

MATERIAL E MÉTODOS

A extração de DNA foi realizada por meio da resina Chelex 100 (5%) a partir de um

indivíduo inteiro. Em um tubo de 0,2mL contendo o exemplar acrescentou-se 80µL de Chelex,

8µL de proteinase K (20mg/ml) e incubou-se à 95ºC por 20 minutos. Decorridos 10 minutos as

amostras foram centrifugadas por 45s e posteriormente transferidas para um eppendorf e

armazenadas a -20ºC.

A quantificação foi realizada por meio da mensuração pelo espectrofotômetro

NanoDrop™, fluorímetro Qubit, e pela análise de gel de agarose a 0,8%, corado com GelRed,

sendo utilizado um marcador padrão (Lambda) com quantidade de DNA conhecida.

Para amplificação da região espaçadora ITS2 do rDNA, foram usados os iniciadores F –

5’ TGTGAACTGCAGGACACATG 3’ e R – 5’ GTCTTGCCTGCTCTGAG 3’. As reações

com a polimerase obtida de Thermus aquaticus foram realizadas em um volume final de 10µL

contendo, 2,4µL de amostra de DNA (concentração variável), 1µL de PCR (10x) buffer

(Tris·Cl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2), 1,5µL de MgCl2 (25mM), 0,8µL de dNTP (10mM),

0,1µL de solução Q (5x), 0,2µL de cada iniciador, 0,052µL de polimerase (5U/µL) e 3,748µL

de água ultra pura. O programa de amplificação para as reações consistiu de uma desnaturação

inicial do DNA a 94ºC por 3 minutos, seguido de 33 ciclos que incluiu 40 segundos a 94ºC

(desnaturação), 45 segundos a 55ºC (temperatura de anelamento) e 45 segundos a 72ºC

(polimerização). Decorridos os 33 ciclos ocorreu uma extensão final de 5 minutos a 72ºC. Os

acessos que não proporcionaram amplificação com a polimerase obtida de Thermus aquaticus

foram submetidos a reações contendo a polimerase originada de Pyrococcus furiosus em um

volume final de 10µL contendo, 2,4µL de amostra de DNA (concentração variável), 2 µL de

PCR (5x) buffer (Tris·Cl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2), 0,1µL de MgCl2 (25mM), 0,1 µL

de dNTP (10mM), 0,5µL de cada iniciador, 0,3µL de DMSO, 0,1µL de polimerase (5U/µL) e

3,9µL de água ultra pura. O programa de amplificação para as reações consistiu de uma

desnaturação inicial do DNA a 98ºC por 30 segundos, seguido de 30 ciclos que incluiu 10

segundos a 98ºC (desnaturação), 25 segundos a 55ºC (temperatura de anelamento) e 25

segundos a 72ºC (polimerização). Decorridos os 30 ciclos ocorreu uma extensão final de 5

minutos a 72ºC.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Observa-se que os acessos de espécies de Trichogramma que não amplificaram em

reações de PCR com a polimerase obtida a partir de Thermus aquaticus, obtiveram resultados

positivos quando submetidos a PCRs com a polimerase purificada de Pyrococcus furiosus

(Figura 1).

A resina Chelex 100 como método de extração de DNA tem como atividade quelar íons

que são catalisadores na quebra do DNA. Devido a essa característica, a resina Chelex 100 inibe

a atividade do MgCl2+ utilizado na PCR como cofator da enzima polimerase, consequentemente,

a enzima perde sua função de polimerização (BAREA et al., 2004). Diferente da enzima

polimerase obtida a partir de Thermus aquaticus, a enzima polimerase originada de Pyrococcus

furiosus apresenta uma atividade exonucleásica de correção no sentido 3’-5’ e são tolerantes à

inibidores de PCR, proporcionando maior confiabilidade e minimizando falhas de reação. A

mesma apresenta uma taxa de erro extremamente baixa, de aproximadamente 50x inferior à

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DNA polimerase obtida a partir de Thermus aquaticus. Além disso, esta polimerase apresenta

alta capacidade de processamento, as quais adicionam mais nucleotídeos por etapas de

polimerização em comparação a outras polimerases, com isso as mesmas exigem tempos de

extensão extremamente curtos e consequentemente tempos de protocolos reduzidos (THERMO

FISHER SCIENTIFIC, 2016).

a) b)

Figura 1. Perfis de amplificação obtidos em PCR utilizando enzimas polimerases obtidas a

partir de Thermus aquaticus (a) e de Pyrococcus furiosus (b).

CONCLUSÕES

As enzimas polimerases originadas de Pyrococcus furiosus são mais adequadas para

reações de PCR contendo como molde extrações de DNA de Trichogramma que apresentem

inibidores como os obtidos com a resina Chelex 100, por apresentarem uma alta fidelidade,

atividades exonucleásicas de correção no sentido 3’-5’ e serem tolerantes a inibidores de PCR.

Embora as enzimas polimerases extraídas de Thermus aquaticus tenham apresentado resultados

positivos em reações de PCR com DNA de Trichogramma, são ineficientes em alguns casos em

que o molde de DNA de Trichogramma contenha inibidores de PCR.

Agradecimentos: Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –

CNPq e a Embrapa Meio-Norte.

REFERÊNCIAS

BAREA, J. A. et al. Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas para utilização

em reação de polimerização em cadeia (PCR). Revista brasileira hematologia e hemoterapia,

Santos, v. 26, n. 4, p. 274-281, 2004.

HAKI, G. D.; RAKSHIT, S. R. Developments in industrially important thermostable enzymes:

a review. Bioresource Technology, Essex, v. 89, n. 1, p. 17-34, 2003.

KIM, Y. J. et al. Cloning, purification, and characterization of a new DNA polymerase from a

hyperthermophilic archaeon, Thermococcus sp. NA1. Journal of Microbiology and

Biotechnology, Seoul, v. 17, n. 7, p. 1090-1097, 2007.

OLIVEIRA, M. C de S. et al. Fundamentos teóricos-práticos e protocolos de extração e de

amplificação de DNA por mio da técnica de reação em cadeia da polimerase. São Carlos:

Embrapa Pecuária Sudeste, 2007. 38 p.

SAMARA, R. et al. Genetic divergence of Trichogramma aurosum Sugonjaev and Sorokina

(Hymenoptera: Trichogrammatidae) individuals based on ITS2 and AFLP analysis. Journal of

Applied Entomology, Berlin, v. 132, n. 3, p. 230-238, 2008.

THERMO FISHER SCIENTIFIC. Phusion DNA polymerases. Waltham, 2016. Disponível

em: < https://www.thermofisher.com/br/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/

thermo -scientific-molecular-biology-products/phusion.html#order>. Acesso em: 23 jul. 2016.

95

VIEILLE, C.; ZEIKUS, G. J. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular

mechanisms for thermostability . Microbiology and Molecular Biology Reviews, New York,

v. 65, n. 1, p. 1-43, 2001.