iamê alves guedes -...
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Iamê Alves Guedes
DIVERSIDADE E DINÂMICA DE CIANOBACTÉRIAS E
PRODUÇÃO DE MICROCISTINAS NO RESERVATÓRIO DO
FUNIL-RJ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2013
i
Iamê Alves Guedes
DIVERSIDADE E DINÂMICA DE CIANOBACTÉRIAS E
PRODUÇÃO DE MICROCISTINAS NO RESERVATÓRIO DO
FUNIL- RJ
Dissertação de mestrado submetida à Universidade
Federal do Rio de Janeiro visando a obtenção do grau de mestre
em Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientadoras: Dra. Sandra Maria Feliciano de Oliveira e Azevedo
Dra. Ana Beatriz Furlanetto Pacheco
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2013
ii
Guedes, Iamê Alves
Diversidade e Dinâmica de cianobactérias e produção de microcistinas no Reservatório do Funil- RJ
/ Iamê Alves Guedes. Rio de Janeiro, 2013.
137 p.: il.
Dissertação de Mestrado– Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho / Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2013.
Orientadoras: Sandra Maria Feliciano de Oliveira e Azevedo
Ana Beatriz Furlanetto Pacheco.
1. Diversidade molecular. 2. cpcBA. 3. qPCR. 4. Microcistinas. 5. Fitoplâncton.
I. Sandra M.F.O e Azevedo, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica).
III. Título.
iii
“Andar com fé eu vou,
que a fé não costuma "faiá" “
Gilberto Gil
iv
Agradecimentos
Tenho certeza que este trabalho só foi possível com a colaboração de muitos. Nesses
breves dois anos de mestrado foram muitos momentos vividos, de grande aprendizado
e crescimento. E com momentos tão intensos, tenho que agradecer muito a muitas
pessoas.
Agradeço ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo que possibilitou a minha
dedicação a este trabalho
À minha orientadora, Profa. Sandra Azevedo, pela possibilidade de realizar este
projeto, apoio e incentivo ao longo da iniciação científica e mestrado. Sem dúvida a sua
ajuda foi fundamental para a realização deste trabalho e contribui muito para o meu
amadurecimento
A minha orientadora, Profa Ana Beatriz Pacheco, que sempre muito disposta, ajudou
muito na realização deste trabalho. Obrigada pelo apoio e pelas discussões ao longo
desses dois anos
A Profa Rosane Silva, pela revisão da dissertação.
À minha mãe, que desde sempre apoiou as minhas escolhas e permitiu que eu
chegasse até aqui.
Ao elcinho, meu p.p. querido, sempre presente
À minha irmã Maitê, grande companheira
Aos meus irmãos Gabi, Chris e Fábio e meus sobrinhos lindos
À minhas tias Cilene e Rose, que sempre me mimaram e me deram muito carinho!
À minha vó Adelaide e vô Abel, sempre dispostos, com seus bolinhos e pastéis.
À nininha, mel, toro e xangô, pelo amor incondicional
Aos queridos amigos da faculdade, que tornaram a Biologia muito mais divertida! Lívia,
Naná, Dani, Rafa, Mari, Mina, Rosa, Hugo, Henrique, Juarez e Suisso
Às queridas amigas da escola, com quem compartilhei muitos momentos, desde a
federal de química até hoje. Adriana, Gou e Patrícia.
À Nicoleta, companheira de todas as horas, com sua risada contagiante e com o lençol
sempre esticado.
v
À Bel, orientadora querida e incentivadora que me apresentou as cianobactérias e o
reservatório do funil!
Aos amigos do LABUP, onde passei grande parte da iniciação científica e aprendi
muito, principalmente com meu orientador Ulysses Lins.
As queridas amigas Fernanda e Thaís, que conheci no LABUP, mas que quero manter
pela vida toda.
Aos amigos do LETC, com quem compartilho todos os meus dias. Muito obrigada pelo
apoio ao longo de todo o trabalho. Ricardinho, Roberta F. Roberta G. Carol, Dedéia,
Priscila, Rosane, Fernanda, Adriana, Lorena, Daniel, Barbara, Elis, Ana Svoboda, D.
Mirian, Luciane, Thabata e Simone
Às Profas Raquel e Valéria, com quem o convívio é muito prazeroso e enriquecedor.
À Dedéia e Carol, queridas amigas do laboratório e também da vida.
Ao Pedro, pela ajuda em todas as coletas, pelas discussões dos mais diversos temas e
pela amizade.
Ao Daniel pela imensa paciência e ajuda na análise das sequências
A Larissa, pela ajuda na obtenção das sequências.
A todos os membros da Unidade Genômica, especialmente à Lívia, Carol e Letícia,
sempre muito dispostas em sanar minhas dúvidas.
A meu namorado querido e amado, que consegui me aguentar nessa reta final!
Obrigada pelos momentos de relaxamento e compreensão!
vi
Resumo
GUEDES, Iamê Alves – Diversidade e dinâmica de cianobactérias e produção de microcistinas no Reservatório do Funil – RJ. Rio de Janeiro (2013). Dissertação (mestrado em Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho- Universidade Federal do Rio de Janeiro. 2013
O reservatório do Funil é localizado no município de Resende e apresenta frequentes
florações de cianobactérias. O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade molecular e
de morfotipos de cianobactérias e sua dinâmica temporal durante um período de maior
incidência de florações no Reservatório do Funil, assim como a produção de microcistinas.
Foram realizadas coletas de outubro de 2011 a abril de 2012 e as maiores biomassas
fitoplanctônicas foram detectadas em amostras do mês de outubro (5,7 mm3.L
-1), dezembro
(7,6 mm3.L
-1) e fevereiro (5,8 mm
3.L
-1). As cianobactérias dominaram ao longo de todo o
período e sua contribuição variou de 88% a 99,8% da biomassa fitoplanctônica. Os
principais táxons encontrados foram Microcystis spp., Dolichospermum sp. e
Cylindrospermopsis raciborskii. Foi observada a alternância de dominância entre eles, e
Microcystis spp dominou em outubro e dezembro, C. raciborskii em janeiro e
Dolichospermum sp. em fevereiro. Foi detectada microcistina em amostras de todos os
meses, identificando-se 3 variantes, microcistina-LR, RR e YR e as concentrações
variaram de 589,9 a 13,6 ng.L-1
. Não foram detectadas células de Dolichospermum
potencialmente produtoras de microcistina, indicando que Microcystis foi o gênero
responsável pela produção de microcistina nas amostras analisadas. A proporção de
genótipos de Microcystis potencialmente produtores de microcistina foi avaliada por qPCR
e foi observada variação de 9 a 100%. A diversidade genética das cianobactérias foi
avaliada através das sequências cpcBA obtidas em cada mês. Foram sequenciados 204
clones e observou-se ao todo 58 genótipos. Desses, 48 foram genótipos de Microcystis, 7
de Cylindrospermopsis, 1 de Pseudoanabaena e 1 de Dolichospermum. Sequências únicas
corresponderam a 44 genótipos. Um genótipo de Microcystis ocorreu em todos os meses,
dois ocorreram em 5 meses e a maioria ocorreu em apenas 1 ou 2 meses. O marcador
cpcBA foi útil para diferenciar gêneros de cianobactérias e para revelar a variabilidade
intraespecífica, mas sua análise não concordou com a designação de espécies no gênero
Microcystis.
Palavras chave: Diversidade molecular. Cianobactérias. cpcBA. Microcistinas
vii
Abstract
GUEDES, Iamê Alves – Diversity and dynamics of cyanobacteria and microcystin production in the Funil Reservoir - RJ. Rio de Janeiro (2013). Master thesis (Master in Biophysics) – Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho- Federal University of Rio de Janeiro. 2013
The Funil reservoir is located in Resende, RJ and presents frequent cyanobacterial
blooms. The aim of this study was to analyze the diversity of cyanobacteria and their
temporal dynamics during a bloom in the Funil reservoir, as well as the production of
microcystins (MC), using different approaches. Water samples were collected from
October 2011 to April 2012 and the largest values of phytoplankton biomass were
detected in samples of October (5.7 mm3.L-1), December (7.6 mm3.L-1) and February
(5.8 mm3.L-1). Cyanobacteria dominated throughout the period and contributed with
88% to 99.8% of the phytoplankton biomass. The major taxa found were Microcystis
spp., Cylindrospermopsis raciborskii and Dolichospermum sp. We observed the
alternation of dominance between these three taxa, where Microcystis spp was
dominant on October and December, C. raciborskii samples on January and
Dolichospermum sp. on February samples. Phytoplankton biomass correlates positively
with Microcystis biomass , NH4+, chlorophyll and pH and negatively with NO3
- and DIN.
MC was detected in all samples, including three isoforms, MC-LR, RR and YR, and
concentrations ranged from 589.9 to 72.8 ng.L-1. The proportion of Microcystis
genotypes potentially producing MC was measured by qPCR and high variation was
observed , ranging from 9 to 100%. Genetic diversity of cyanobacteria was evaluated by
means of cpcBA sequences from each month. We sequenced 204 clones and observed
58 genotypes. Of these, 48 were genotypes of Microcystis, 7 Cylindrospermopsis 1,
Pseudoanabaena and 1 Dolichospermum; 44 unique sequences were found. One
Microcystis genotype was observed in all samples, 2 occurred in 5 months and the
majority only in 1 or 2 months. The cpcBA marker was useful to distinguish
cyanobacteria genera and to reveal intraspecific variability, but the analysis did not
support species assignment in the Microcystis genera.
Keywords: Molecular diversity, cyanobacteria, cpcBA, mycrocistin
viii
Lista de Figuras
Figura 1- Lista de fatores ambientais positivos e negativos relacionados às florações de
cianobactérias. ..........................................................................................................................18
Figura 2- Representação esquemática da via de biossíntese da microcistina. ..........................22
Figura 3 - Estrutura da molécula da microcistina .......................................................................24
Figura 4 –Grupamento gênico da microcistina. .........................................................................26
Figura 5- Representação esquemática do conjunto de genes da ficocianina. ...........................32
Figura 6 - Localização do Reservatório do Funil. ......................................................................39
Figura 7- Foto aérea da região da barragem do Reservatório do Funil .....................................39
Figura 8 - Floração de cianobactérias registrada próximo à barragem ......................................40
Figura 9- Conjunto de genes relacionados à síntese de microcistina em diferentes gêneros de
cianobactérias. ..........................................................................................................................47
Figura 10 - Resumo das etapas realizadas para a obtenção (A) e análise de sequências de
cpcBA (B) ..................................................................................................................................48
Figura 11 - Variação mensal (out 2011 - abril 2012) da temperatura média e precipitação no
município de Resende-RJ. ........................................................................................................55
Figura 12 - Variação de temperatura (a) e pH (b) na zona eufótica ao longo dos meses ( ........56
Figura 13 - Variação da concentração de clorofila e da biomassa fitoplanctônica. ....................59
Figura 14 - Principais morfotipos de cianobactérias encontrados no reservatório do Funil. .......60
Figura 15 - Variação mensal (2011-2012) da biomassa fitoplanctônica tota (A)l e contribuição
relativa dos principais táxons de cianobactérias ........................................................................62
Figura 16 - Variação mensal das concentrações dos três variantes de microcistinas................63
Figura 17 - Variação mensal (2011-2012) de valores de equivalentes de célula/mL para
cianobactéria total (cya), Microcystis (micr) e genótipos mcyB+ de Microcystis (mcyB) no
reservatório do Funil. ................................................................................................................66
Figura 18 - Variação mensal (2011-2012) da razão entre equivalente de células mcyB+ e
equivalente de células de Microcystis. ......................................................................................67
Figura 19 - Variação mensal dos valores de (a) equivalentes de células de Microcystis
potencialmente produtoras de microcistina (mcyB) e concentrações de microcistina. (b) cota
celular de microcistina por número de genótipos de Microcystis potencialmente ......................68
Figura 20 - Produtos da amplificação por PCR da região (a) rDNA16S (b) mcyE Microcystis e
(c) mcyE Dolichospermum. 1 - padrão de peso molecular de DNA, banda mais forte indica 1
kb; 2 - DNA cromossômico de uma linhagem isolada de M. aeruginosa; 3 a 9 - DNA
ix
cromossômico de amostras de água dos meses de: outubro, novembro, dezembro, janeiro,
fevereiro, março, abril; 10 - controle negativo, sem DNA molde. ...............................................69
Figura 21 - Produtos da amplificação por PCR da região cpcBA usando como molde DNA
cromossômico total de amostras ambientais. Gel de agarose 0,8% em TAE. À direita o padrão
de peso molecular de DNA 1KB gene Ladder. ..........................................................................70
Figura 22 - Variação mensal da ocorrência relativa de genótipos de cianobactérias, segundo a
região cpcBA. M, Microcystis; C, Cylindrospermopsis; A Dolichospermum; P,
Pseudoanabaena;UC genótipos únicos de Cylindrospermopsis; e UM, genótipos únicos de
Microcystis. ...............................................................................................................................72
Figura 23 - Minimmum spaning tree de todas as sequências obtidas. ......................................74
Figura 24 - Minimmum spanning tree das sequências do gênero Microcystis. ..........................75
Figura 25 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de outubro. ................................................................77
Figura 26 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de novembro. .............................................................78
Figura 27- Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de dezembro. .............................................................79
Figura 28 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de janeiro. ..................................................................80
Figura 29 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de fevereiro. ...............................................................81
Figura 30 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de março. ..................................................................82
Figura 31 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise
de distância (Neighbor-Joining) do mês de abril. ......................................................................83
Figura 32- Desenho esquemático da associação entre biomassa de Microcystis, proporção de
genótipos tóxicos, cota celular e concentração de microcistina. ............................................. 107
x
Lista de Tabelas
Tabela 1- Valores de DL50 de cianotoxinas ........................................................................................ 21
Tabela 2- Levantamento de dados da proporção de genótipos potencialmente produtores de
microcistina. ............................................................................................................................................. 28
Tabela 3 - Primers utilizados em ensaios de PCR quantitativo ........................................................ 44
Tabela 4 - Condições de amplificação para os primers utilizados nos ensaios de PCR
quantitativo ................................................................................................................................................ 45
Tabela 5 - Sequências dos primers utilizados para clonagem e sequenciamento da região
cpcBA ......................................................................................................................................................... 50
Tabela 6 - Variáveis limnológicas na amostra integrada da zona eufótica do ponto amostrado
do reservatório do Funil. . ....................................................................................................................... 58
Tabela 7 - Análise de correlação da biomassa de cianobactérias e de Microcystis com as
variáveis abióticas. . ..................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 8 - Parâmetros da curva de calibração do PCR quantitativo e temperatura de
desnaturação dos produtos gerados com cada par de primer utilizado. ......................................... 65
Tabela 9 - Estimativa de riqueza, cobertura da amostragem e índice de diversidade de
Shanonn dos genótipos de cianobactérias do reservatório do Funil ............................................... 73
xi
Lista de Abreviaturas
Ct – cycle threshold
cpcBA - genes que codificam para de ficocianina b e a
DGGE- Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante
DL 50 - dose letal mediana
dNTP – desoxirribonucleotídeos trifosfatados
IPTG - isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
kb – quilobases
LETC - Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias
MC - Microcistina
NID – Nitrogênio Inorgânico Dissolvido
pb – pares de base
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
qPCR – PCR quantitativo
rDNA – gene que codifica para RNA ribossomal
RFLP - Polimorfismo de Tamanhos de Fragmentos de Restrição
PCA - Análise de Componentes Principais
RDA – Análise de Redundância
SRP- Fósforo Solúvel Reativo
TAE - Tris Acetato EDTA
TP - Fósforo total
U - unidade
X-GAL- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-alfa-D-galactopiranosídeo
WHO- Organização Mundial de Saúde
.
xii
Sumário
1- Introdução ........................................................................................................................................... 14
1.1 Florações de cianobactérias .............................................................................................................. 15
1.2 Florações de cianobactérias em reservatórios brasileiros ................................................................ 19
1.3 Cianotoxinas ...................................................................................................................................... 20
1.4 Microcistinas ..................................................................................................................................... 22
1.5 Diversidade genética das cianobactérias .......................................................................................... 30
1.6 Ocorrência de cianobactérias no Reservatório do Funil ................................................................... 34
2. Objetivos ................................................................................................................................................. 37
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................................... 37
2.2 Objetivos específicos......................................................................................................................... 37
3. Área de estudo ........................................................................................................................................ 38
4. Materiais e Métodos ............................................................................................................................... 41
4.1 Amostragem ...................................................................................................................................... 41
4.2 Clorofila a e nutrientes ..................................................................................................................... 41
4.3 Fitoplâncton ...................................................................................................................................... 42
4.4 Análise de microcistinas .................................................................................................................... 43
4.5 Proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina ............................................. 43
4.6 Identificação de genótipos de cianobactérias .................................................................................. 47
4.7 Análise estatística ............................................................................................................................. 54
5. Resultados ............................................................................................................................................... 55
5.1 Dados Abióticos ................................................................................................................................ 55
5.2 Fitoplâncton ...................................................................................................................................... 58
5.3 Microcistinas ..................................................................................................................................... 63
5.4 Quantificação de genótipos potencialmente produtores de microcistina ....................................... 64
5.5 Diversidade de genótipos de cianobactérias. ................................................................................... 70
6 – Discussão ............................................................................................................................................... 84
Relação entre fatores abióticos e biomassa fitoplanctônica .................................................................. 84
Identificação e dinâmica de gêneros/espécies de cianobactérias .......................................................... 89
Quantificação de microcistina ................................................................................................................ 96
xiii
Genótipos potencialmente produtores de microcistina ......................................................................... 97
Cota celular de microcistina .................................................................................................................. 103
Dinâmica de genótipos de cianobactérias ............................................................................................ 108
7- Perspectivas .......................................................................................................................................... 115
8- Conclusões ............................................................................................................................................ 115
9 - Referências........................................................................................................................................... 117
Anexo 1 - Táxons identificados no reservatório do Funil .......................................................................... 133
Anexo 2- Sequências utilizadas nas árvores filogenéticas construídas neste trabalho ............................ 134
Anexo 3 – Curva de calibração dos primers utilizados nos ensaios de qPCR ............................................ 136
14
1- Introdução
As cianobactérias são procariotos fotossintetizantes amplamente distribuídos em
ecossistemas de água doce, marinho e estuarino. Este grupo possui uma longa história
evolutiva, e evidências fósseis indicam que já eram abundantes há mais de 2,5 bilhões
de anos , e podem ter surgido há 3,5 bilhões de anos (Schopf, 2000). As cianobactérias
foram os primeiros organismos primitivos conhecidos a produzir oxigênio através da
fotossíntese e possuem papel fundamental na produção primária global e fixação do
nitrogênio (Carey et al., 2012).
Este grupo apresenta características estruturais e metabólicas que lhe confere grande
plasticidade adaptativa, podendo ser encontrado também colonizando solos e rochas,
onde desempenha importante papel nos processos funcionais do ecossistema e na
ciclagem de nutrientes (Azevedo, 1998). As cianobactérias apresentam grande
variação morfológica, podendo ser unicelulares, coloniais ou filamentosas e estão
classificadas em aproximadamente 150 gêneros e mais de 2000 espécies (Van den
Hoek et al., 1995). Possuem clorofila-a, carotenóides e ainda outros pigmentos
acessórios como as ficobilinas: ficocianina, ficoeritrina e aloficocianina. Também
apresentam uma série de adaptações, descritas a seguir, que as auxiliam a sobreviver
em ambientes em que outros microrganismos fotossintetizantes não são capazes de
sobreviver (Yoo et al., 1995). Vários gêneros de cianobactérias possuem a capacidade
de fixar nitrogênio atmosférico (Gallon, 1992), estocar fósforo em vesículas
intracelulares (Carr & Whitton et al., 1992) e acumular ferro e outros metais. Outra
adaptação importante presente em algumas espécies são os acinetos, células de
15
resistência que permitem que as cianobactérias sobrevivam em momentos
desfavoráveis, mesmo na ausência de luz, e depois regenerem em melhores condições.
A presença de vacúolos gasosos é outra característica adaptativa importante que
permite que algumas cianobactérias flutuem na zona fótica e explorem de forma
otimizada a coluna d’ água (Padisák, 2004). As cianobactérias constituem um grupo
bastante antigo e diverso, incluindo espécies que apresentam estratégias
ecofisiológicas muito diferentes e algumas vezes até contrastantes.
A grande variedade de fenótipos observados nas cianobactérias permite que este
grupo ocupe tanto ambientes com escassez de nutrientes, como ambientes
enriquecidos (Paerl & Otten, 2013). Todas essas características permitem que algumas
espécies de cianobactérias formem florações nos ambientes aquáticos, principalmente
em ambientes eutrofizados. A eutrofização ocorre quando o enriquecimento por
nutrientes excede a capacidade de assimilação em um sistema (Reynolds, 2006). Esse
processo pode ser natural, ocorrendo ao longo de décadas, mas a crescente
urbanização, sem o devido avanço dos sistemas de tratamento de efluentes, tem
levado ao lançamento de esgoto em rios e outros sistemas aquáticos, o que aumenta a
carga de nutrientes e reduz a concentração de oxigênio na água, contribuindo para a
eutrofização artificial ou cultural.
1.1 Florações de cianobactérias
As florações de cianobactérias, resultado do crescimento massivo de células desses
microrganismos na coluna d’água, culminam em grandes alterações na qualidade da
16
água. As florações resultam na diminuição de transparência da água, que suprime o
crescimento de macrófitas aquáticas, afetando negativamente habitats de invertebrados
e peixes. Outro aspecto importante é a decomposição das florações de cianobactérias
por bactérias heterotróficas, levando à diminuição ou até mesmo esgotamento do
oxigênio, e consequentemente causando a mortandade de peixes. (Paerl & Otten,
2013). As florações também levam à diminuição da diversidade ecológica, alterações
nas cadeias alimentares, com potenciais efeitos na ciclagem de nutrientes e diminuição
da diversidade de espécies planctônicas (Pearl, 2008).
Além de profundas mudanças ecológicas no ambiente, as florações de cianobactérias
podem ser formadas por espécies produtoras de toxinas, que podem causar intoxicação
em organismos aquáticos e mamíferos (incluindo seres humanos), o que representa um
sério problema de saúde pública, principalmente quando da ocorrência dessas
florações em mananciais de abastecimento.
As principais espécies de cianobactérias formadoras de florações tóxicas em ambientes
de água doce são pertencentes aos gêneros Dolichospermum, Aphanizomenon,
Cylindrospermopsis, Microcystis e Planktothrix (Pearl, 2008).
Vários fatores relacionados às florações de cianobactérias são bastante explorados e
conhecidos (Figura 1) (Pearl, 2008, Paerl & Otten, 2013). O enriquecimento de
nutrientes dos ambientes aquáticos é sem dúvida o fator mais associado ao
aparecimento e persistência das florações de cianobactérias (Paerl & Otten, 2013).
Tradicionalmente, o fósforo tem sido considerado o principal elemento limitante ao
crescimento das cianobactérias e altas concentrações deste elemento são relacionadas
às florações, especialmente no caso daquelas formadas por espécies fixadoras de
17
nitrogênio, que podem suprir a sua demanda por este elemento através da fixação do
nitrogênio atmosférico (Downing et al., 2001). Entretanto, recentemente foi proposta a
revisão do paradigma de que somente o fósforo seria o fator preponderante para o
aparecimento de florações e diversos trabalhos têm demonstrado que a fixação de
nitrogênio não é suficiente para suprir as demandas por este elemento (Ferber et al.,
2004, Lewis & Wurtsbaugh, 2008). O alto custo energético deste processo, a inibição da
fixação de nitrogênio provocada pela produção de oxigênio durante a fotossíntese e a
necessidade de outros cofatores podem limitar a fixação de nitrogênio (Paerl & Otten,
2013).
Temperaturas elevadas também favorecem gêneros formadores de florações de
superfície, por estes possuírem taxas máximas de crescimento em temperaturas acima
de 25ºC (Paerl & Otten, 2013). A temperatura é um dos fatores ambientais que mais
afetam o crescimento das microalgas e cianobactérias, uma vez que influencia
diretamente processos metabólicos relacionados à fotossíntese e outras vias
biossintéticas (Robarts & Zohary, 1987; Davidson, 1991; Cole & Jones, 2000). Embora
a variação anual da temperatura nos trópicos não seja tão grande quanto na região
temperada, a ocorrência de cianobactérias em muitos sistemas brasileiros tem sido
relacionada a períodos de temperaturas mais elevadas (Branco & Senna, 1994; Bouvy
et al., 2000; Huszar et al., 2000; Marinho & Huszar, 2002).
18
A dominância das cianobactérias também é associada a algumas condições
ambientais características, tais como: regime de mistura com estratificação duradoura
da coluna d’água (Reynolds, 1987) ou diária (constância ambiental) (Ganf, 1974); baixa
disponibilidade de luz (Zevenboom & Mur, 1980; Smith, 1986); reduzida razão Zona
eufótica/Zona de mistura (Jensen et al., 1994); pH elevado com baixa disponibilidade de
CO2 (Caraco & Miller, 1998).
Quanto à pressão de herbivoria sobre o fitoplâncton, que seria um potencial fator
controlador de florações, esta tende a ser maior em ambientes oligotróficos do que em
ambiente eutróficos. Além disso, certas características morfológicas de espécies
formadoras de florações, como formação de colônias e grandes filamentos, dificultam a
herbivoria, apesar de alguns grupos zooplanctônicos possuírem a capacidade de
manipular filamentos de cianobactérias. (Paerl & Otten, 2013).
Figura 1- Lista de fatores ambientais positivos e negativos relacionados às florações de cianobactérias. ↑indicam fatores que favorecem as florações de cianobactérias e ↓ indicam condições desfavoráveis ao crescimento de cianobactérias. (Modificado de Paerl & Otten, 2013)
19
1.2 Florações de cianobactérias em reservatórios brasileiros
Os reservatórios são ecossistemas artificiais com grande potencial de eutrofização,
devido à liberação de matéria orgânica da área alagada, além da forte influência da
entrada de material alóctone da bacia de drenagem e, portanto, constituem um dos
ecossistemas mais favoráveis à expansão das florações de cianobactérias no Brasil
(Sant’Anna et al., 2008). A maioria dos reservatórios de água apresenta essas
características durante grande parte do ano, concorrendo para a intensificação e
ocorrência de florações. A disposição inadequada de rejeitos domésticos e industriais
nos mananciais de abastecimento tem contribuído para que a ocorrência destes
fenômenos seja cada vez mais comum nestes ambientes (Lapolli et al., 2011).
Florações de cianobactérias potencialmente tóxicas têm sido registradas em vários
ecossistemas aquáticos no Brasil (Costa et al, 2006), geralmente em épocas de maior
consumo de água, nos meses de verão, causando entupimento de filtros nas estações
de tratamento de água, problemas estéticos e muitas vezes levando à impossibilidade
de uso da água (Fernandes et al. 2009).
Segundo Sant’Anna et al. (2008) já foram descritas 32 espécies de cianobactérias
tóxicas no Brasil, distribuídas em vários estados, principalmente na região Sudeste.
Segundo esses autores, a região tropical no Brasil apresenta menor diversidade de
cianobactérias tóxicas (14 espécies) se comparada à região subtropical (27 espécies).
Provavelmente esta discrepância entre o número de espécies descritas em cada região
é relacionada ao maior esforço de amostragem nas regiões Sul e Sudeste. Os gêneros
com maior número de espécies tóxicas já estudadas são Microcystis (7 espécies) e
Dolichospermum (6 espécies) e as espécies potencialmente tóxicas Microcystis
20
aeruginosa e Cylindrospermopsis raciborskii foram as mais frequentemente registradas,
ocorrendo em áreas tropicais e subtropicais (Sant´Anna et al. 2008). Segundo Dorr et
al., (2010), florações de cianobactérias já foram registradas em 11 dos 26 estados
brasileiros, principalmente em reservatórios artificiais no Nordeste, mas também em
lagoas costeiras, estuários e rios. A maioria das florações tóxicas no Brasil é formada
por espécies produtoras de microcistina (Dorr et al., 2010).
1.3 Cianotoxinas
Alguns gêneros de cianobactérias são capazes de produzir metabólitos secundários
altamente prejudiciais à saúde humana e de animais (Tabela 1). Estas toxinas têm sido
classificadas, de acordo com os sintomas observados em vertebrados, em
hepatotoxinas (microcistinas e nodularina), neurotoxinas (anatoxina-a, anatoxina-a(S),
saxitoxinas e β-Metilamino-L-alanina - BMMA), citotoxinas (cilindrospermopsina) e
dermatotoxinas (lygyatoxina e aplysiatoxinas) (Carmichael, 2001; Dittman et al., 2013).
Ao longo das últimas três décadas, relatos de produção de substâncias tóxicas por
cianobactérias aumentaram, tanto em frequência quanto em distribuição global, ao
mesmo tempo intoxicações humanas têm ocorrido regularmente (Neilan et al., 2012).
21
Tabela 1- Valores de DL50 de cianotoxinas (Dittman et al., 2013)
Recentemente, vêm sendo descritas as bases genéticas para a biossíntese de diversas
cianotoxinas, com a identificação e caracterização dos genes envolvidos na sua síntese
(Figura 2) (Neilan et al., 2012). Algumas cianotoxinas, como microcistina e a nodularina
são sintetizadas por um mecanismo enzimático conhecido como síntese não-
ribossômica de peptídeos (Dittman et al., 2013). Este tipo de síntese utiliza uma grande
variedade de substratos e é catalisada por enzimas com atividade peptídeo sintetase
e/ou policetídeo sintase (Welker & von Döhren, 2006). Essas enzimas são encontradas
em fungos, cianobactérias e outras bactérias, e são capazes de sintetizar peptídeos
independentemente de ribossomos. A maioria dos peptídeos não ribossomais de
microrganismos é classificada como metabólitos secundários, o que significa que eles
não têm um papel no metabolismo primário, crescimento ou reprodução, mas de algum
modo beneficiam o organismo que o produz (Valerio et al, 2010).
DL50 para injeção intraperitonial em camundongos µg kg-1
Microcistina-LR 50–60
Microcistina-RR 500
Nodularina 30–50
Cilindrospermopsina 200
Anatoxina-a 375
Homoanatoxina-a 250
Saxitoxina 10
22
1.4 Microcistinas
A maioria das florações de cianobactérias tóxicas reportada em todo o mundo é
constituída por espécies produtoras dos cianopeptídeos microcistina e nodularina.
(Dittman et al., 2013). Microcistinas são heptapeptídeos cíclicos que possuem uma
estrutura básica comum (Figura 3). A estrutura química geral das microcistinas se
Figura 2- Representação esquemática da via de biossíntese da microcistina. Os nomes das enzimas caracterizadas bioquimicamente são mostrados em vermelho. As outras reações propostas são baseadas em análises de bioinformática. Cada círculo e retângulo representam domínios enzimáticos PKS (policetídeo sintase) e NPRS(enzimas peptídeo sintetase não-ribossômica) respectivamente (Dittman et al., 2013)
23
compõe de 5 D-aminoácidos conservados e 2 L-aminoácidos variáveis, formando uma
estrutura cíclica. Além da maior parte dos aminoácidos da molécula ser de isomeria D,
pouco comum em estruturas biológicas, há dois aminoácidos raros: 3-amino-9-metoxi-
2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-ácido dienóico (ADDA) e N-metildehidroalanina (Mdha)
(Harada et al., 1996; Soares, 2009b). A variação estrutural da microcistina pode ocorrer
em todos os sete aminoácidos, no entanto, mais substituições ocorrem nas duas
regiões variáveis de L-aminoácidos, nas posições X e Z (Figura 3). Essas variações
garantem à molécula maior ou menor hidrofilia e diferentes potenciais tóxicos. Mais de
80 variantes de microcistina já foram descritas, variando o grau de metilação,
hidroxilação, sequência peptídica e toxicidade (Tabela 1) (Welker & von Döhren, 2006).
As microcistinas inibem proteínas fosfatases 1 e 2A de eucariotos, ligando-se
covalentemente a um resíduo de cisteína presente no sítio catalítico destas enzimas
(Neilan et al., 2012). Esta inibição enzimática resulta na hiperfosforilação de diversos
alvos subcelulares. O efeito estrutural mais pronunciado dessa hiperfosforilação é a
desorganização do citoesqueleto e perda de forma celular (Falconer & Yeung, 1992).
As microcistinas são predominantemente produzidas por cianobactérias dos gêneros
Microcystis, Planktothrix e Anabaena (Sivonen & Jones, 1999), apesar de já terem sido
descritas em gêneros terrestres, como Nostoc e Hapalosiphon (Oksanen et al., 2004) e
bentônicos Phormidium (Izaguirre et al., 2007) e outros gêneros planctônicos como
Pseudoanabaena (Paerl & Otten, 2013).
24
A concentração de microcistinas no ambiente é usualmente determinada a partir de
amostras liofilizadas das florações de cianobactérias. A maior concentração de
microcistina na água já descrita foi de 7300 µg.L-1 (Zhang et al., 1991), e em florações
de superfície já foram detectados 2500 µg.L-1 (Chorus & Bartram, 1999). A maior parte
da microcistina é intracelular, e pouco ou quase nada é encontrada dissolvida na água.
Normalmente, as concentrações encontradas dissolvidas na água não excedem 1 µg.L-
1, valor máximo recomendado pela WHO (Organização Mundial de Saúde) para que
água possa ser usada para o consumo humano. Apesar disto, já foi detectada
dissolvida na água, após o colapso de uma floração, uma concentração de cerca de
1800 µg.L-1 de microcistina dissolvida (Jones & Orr, 1994). A bioacumulação já foi bem
caracterizada em zooplâncton, peixes, crustáceos e moluscos (Ferrão-Filho et al. 2002,
Magalhães et al. 2003, Soares et al. 2004, Vasconcelos 1995).
Microcistina
MC-LR L-Leu L-Arg CH3
MC-RR L-Arg L-Arg CH3
MC-YR L-Tyr L-Arg CH3
Figura 3 - Estrutura da molécula da microcistina (MC). Os aminoácidos X e Z e o grupo R1 são variáveis conforme tabela à direita. Os aminoácidos que formam a molécula de MC estão numerados de 1 a 7 (adaptado de Tanabe et al., 2009)
25
A elucidação dos genes envolvidos na síntese da microcistina iniciou-se com o estudo
comparativo de duas linhagens de Microcystis aeruginosa, uma produtora e outra não
produtora de microcistina (Dittmann et al., 1997). Posteriormente, o agrupamento
gênico completo de 55 kb, contendo 10 genes, foi descrito nesta espécie (Nishizawa et
al., 1999, Tillett et al., 2000). Os genes envolvidos na síntese de microcistina também
foram caracterizados em linhagens de Planktothrix agardhii (Christiansen et al., 2008) e
Anabaena sp. (Rouhiainen et al., 2004). Em todos os gêneros o agrupamento gênico é
semelhante, apesar de algumas diferenças como o arranjo dos genes, seu tamanho e
orientação (Figura 4) (Dittman et al, 2013).
Nem todas as linhagens de um gênero possuem a capacidade de produzir toxinas e,
portanto, linhagens tóxicas e não tóxicas podem coexistir no mesmo ambiente.
Inicialmente, a distribuição variável da capacidade de síntese de microcistina entre as
linhagens de um gênero era atribuída à transferência lateral de genes (Schwabe et al.,
1988), mas estudos filogenéticos vieram a demonstrar que a presença de genes para
produção de toxinas é uma característica ancestral das cianobactérias e que linhagens
não tóxicas aparecem devido a mutações e perda parcial ou completa destes genes
(Rantala et al., 2004). Portanto, pode-se supor que um número maior de gêneros de
cianobactérias do que os descritos até agora podem apresentar a capacidade de
produção de microcistina (Dittman et al, 2013) (Figura 4).
26
Atualmente, métodos baseados na detecção da presença de genes relacionados à
produção de toxinas são bastante utilizados para indicar o potencial de produção de
microcistina por cianobactérias no ambiente (Sivonen & Borner 2008). O PCR
quantitativo (qPCR) vem sendo cada vez mais utilizado para o monitoramento de
ambientes aquáticos e através desta técnica é possível quantificar o número total de
cianobactérias e também de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistina
Figura 4 - (a) Arranjos diversos do agrupamento de genes da microcistina apresentam origem monofilética e evoluíram de um ancestral comum. A organização dos genes e presença de domínios específicos varia de acordo com os gêneros produtores. (b) Diversificação dos genes envolvidos na síntese de microcistina. A diversificação ocorre pela recombinação dos genes e também por mutações pontuais. O processo de diversificação é refletido em mais de 80 variantes de microcistinas já descritos na literatura. Exemplos são mostrados para microcistina sintetase de Microcystis. (c) Perda da capacidade de produção de microcistina pela exclusão parcial ou total do conjunto de genes envolvidos na síntese de microcistina. Exemplos são mostrados para microcistina sintetase de Planktothrix (adaptado de Dittman et al, 2013).
27
(Koskenniemi et al, 2007; Briand et al. 2008; Rinta-Kanto et al. 2009; Orr et al. 2010).
Essas estimativas são importantes para avaliar a dinâmica de subpopulações com
capacidade de produção de microcistina assim como o risco potencial de ocorrência de
florações tóxicas, já que a maior parte da variação na concentração de microcistina
observada durante uma floração é devida à variação na proporção de células tóxicas
(Kurmayer et al, 2003).
Nos últimos anos, diversos trabalhos têm sido realizados para determinar a variação
espacial e temporal na proporção de genótipos potencialmente produtores de
microcistina em populações naturais (Hotto et al., 2008; Briand et al., 2009, Sabart et
al., 2010) e diferentes genes têm sido utilizados como marcadores para quantificar o
número de genótipos tóxicos, como mcyE (Vaitomaa et al., 2003), mcyA (Furukawa et
al., 2006), mcyD (Rinta-Kanto et al., 2005) e mcyB (Okello et al., 2010) (Tabela 2).
A variação observada na proporção de genótipos potencialmente produtores de
microcistina ao longo do tempo é muito grande na maioria dos trabalhos realizados
(Tabela 2). Por exemplo, Kurmayer & Kutzenberger, 2003 reportaram que a variação da
porcentagem de genótipos positivos para mcyB foi de1,7 a 71% do total da população
de Microcystis durante um ciclo sazonal. No Lago Erie, a variação da proporção de
genótipos positivos para mcyD variou de 0 a 48% do total de células de Microcystis.
Apesar do grande número de trabalhos neste tema, nenhum padrão geral de variação
sazonal pode ser determinado. Além disso, a variação da proporção de genótipos
tóxicos pode ser ainda maior espacialmente do que temporalmente (Martins &
Vasconcelos, 2011).
28
Diversos trabalhos tentaram relacionar a quantidade de genótipos potencialmente
produtores de microcistina com variáveis ambientais, mas ainda não foi observada uma
correlação clara. Por exemplo, Yoshida et al, 2007 correlacionaram positivamente o
número de cópias de mycA no ambiente com a disponibilidade de nitrogênio; Rinta-
Kanto et al, 2009 correlacionaram o número de cópias de mcyD com ortofosfato e Davis
et al, 2009 correlacionaram o aumento de cópias de mcyE com o aumento da
temperatura e disponibilidade de ortofosfato.
Tabela 2- Levantamento de dados da proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina. * genes mcy usados para quantificar genótipos tóxicos e genes cpc ou 16S rRNA usados para quantificar
o total de cianobactérias **Diferentes pontos amostrais abordados no mesmo trabalho
Cianobactéria dominate
Local Genes alvo* % células tóxicas
Referências
Microcystis sp. Lago Wannsee,
Alemanha mcyB, cpc 0,9 – 38,3 Kurmayer et al, 2003
Microcystis sp. Lago Champlain, Estados Unidos
mcyD, 16S rRNA 6 **Davis et al, 2009
Microcystis sp. Lago Agawam, Estados Unidos
mcyD, 16S rRNA 0,01 - 1,56 **Davis et al, 2009
Microcystis sp. Lago
Ronkonkoma, Estados Unidos
mcyD, 16S rRNA 12 - 100 **Davis et al, 2009
Planktothrix agardhii
Lago Viry-Châtillon, França
mcyA, cpc 31 - 93 Briand et al, 2008
Microcystis sp. Lago Erie,
Estados Unidos mcyD, 16S rRNA 0 - 59,5 Rinta-Kanto et al, 2009
Microcystis sp. Lago Oneida,
Estados Unidos mcyD, 16S rRNA 0 - 37 Hotto et al, 2008
Microcystis sp. Lago Hirosawa-no-ike, Japão
mcyA, 16S rRNA 80 Ha et al, 2009
29
Cianobactéria dominate
Local Genes alvo* % células tóxicas
Referências
Microcystis sp. Lago Mikata,
Japão mcyA, cpc 0,5 - 35 Yoshida et al, 2007
Microcystis aeruginosa
Lago Grangent, França
mcyB, cpc 6 - 93 Briand et al, 2009
Microcystis aeruginosa
Lago Sables, França
mcyB, cpc 9,2 – 27,6 **Sabart et al, 2011
Microcystis aeruginosa
Lago Place, França
mcyB, cpc 75,5 - 82 **Sabart et al, 2011
Microcystis aeruginosa
Cuzieu, França mcyB, cpc 81,9 - 100 **Sabart et al, 2011
Microcystis aeruginosa
Feurs, França mcyB, cpc 75 – 82,2 **Sabart et al, 2011
Microcystis aeruginosa
Reservatório Torrão, Portugal
mcyA, mcyB, 16SrRNA
2 - 100 Martins et al, 2011
Microcystis Estuário São Francisco, EU
mcyD,16SrRNA 0,37 - 20,2
Baxa et al, 2010
Microcystis Reservatório
Kranji, Cingapura mcyE, 16S rRNA 21,7 - 100 Te & Gin, 2011
Microcystis Baia de
Missisquoi, Canadá
mcyA, mcyE, mcyG, 16SrRNA
1,7 - 21,6 Ngwa et al, 2012
Microcystis e Anabaena
Lagoa Durgakund, Índia
mcyA, cpc 0,01 - 14,3 Srivastava et al, 2012
Microcystus Lago Taihu, China mcyE , cpc 11,1 - 42,6 Otten et al, 2012
Microcystis Reservatório
Roodeplaat, África do Sul
mcyD, mcyB, 16SrRNA
6,7 - 100 Conradie et al., 2012
30
1.5 Diversidade genética das cianobactérias
O estudo da diversidade molecular de bactérias iniciou-se nos anos 90 e revolucionou o
conhecimento acerca da diversidade de espécies e da estrutura de comunidades
bacterianas. A utilização de ferramentas moleculares, como a construção de bibliotecas
de clones seguida de sequenciamento de genes marcadores, hibridização in situ e
DGGE, possibilitou um rápido avanço do conhecimento nesta área (Case et al., 2007).
Apesar disso, nenhum dos métodos baseados na amplificação de uma região
específica do DNA de bactérias consegue, de forma acurada, representar
completamente a diversidade genética. As limitações destas metodologias estão
relacionadas à amostragem, preservação das amostras, extração de DNA e reação de
amplificação de DNA (de Lipthay et al., 2004). Apesar disso, a construção de bibliotecas
de regiões gênicas de rDNA 16S ainda é uma das abordagens mais utilizadas no
estudo da diversidade procariótica em ambientes aquáticos (Kemp & Aller, 2004).
A caracterização da estrutura das comunidades durante florações de cianobactérias
mostra-se problemática uma vez que vários gêneros ainda não têm a taxonomia
resolvida (Moustaka-Gouni et al. 2009). Apesar de as cianobactérias mostrarem maior
diversidade morfológica que outros grupos de bactérias, a discriminação no nível de
gênero ou de espécie é muitas vezes difícil. Além disso, vários caracteres morfológicos
utilizados na classificação dos grupos são influenciados por condições ambientais,
dificultando a correta identificação (Anagnostidis & Komarek,1988). Mesmo atualmente,
grande parte da taxonomia de cianobactérias é baseada em caracteres morfológicos, o
que já não se aplica aos outros grupos bacterianos. Segundo Oren, 2011,
pouquíssimas descrições de novos gêneros e espécies são publicadas no International
31
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, a publicação oficial para o registro
de novos taxa procarióticos, e a nomenclatura e classificação de cianobactérias ainda
não é completamente organizada. Esta situação tem evidenciado a necessidade de
métodos mais confiáveis de classificação e vem promovendo o uso de uma abordagem
polifásica, combinando dados morfológicos e moleculares (Gkelis et al. 2005).
Usualmente, uma floração de cianobactérias é formada por diversas linhagens de um
ou mais gêneros, apesar de uma ou poucas linhagens poderem predominar em algum
estágio. Somente a identificação microscópica não fornece informação acerca da
presença, diversidade ou abundância de linhagens ou de sua toxicidade (Saker et al,
2009). Técnicas moleculares baseadas na análise de sequências gênicas têm se
mostrado valiosas neste contexto e têm usado como alvos mais frequentes regiões
intergênicas de loci de rDNA 16S e regiões intergênicas de genes de ficocianina
(cpcBA) (Neilan et al., 1995). Desta forma, pode-se avaliar a composição e a dinâmica
de populações de cianobactérias temporal e espacialmente, e ainda tentar correlacionar
tal dinâmica a fatores ambientais, físicos e químicos ou biológicos. Durante o
desenvolvimento de florações, por exemplo, pode-se indicar se um, poucos, ou muitos
genótipos são selecionados em diferentes momentos ou locais no ecossistema (Briand
et al., 2009).
As primeiras descrições de estudos moleculares de diversidade de cianobactérias
foram publicadas por Nübel et al. 1997, tendo como alvo os genes rDNA 16S e também
por Neilan et al., 1995, tendo como alvo os genes que codificam ficocianinas. A
ficocianina é um pigmento presente em cianobactérias e, portanto, o uso dos genes
correspondentes como alvo é um bom marcador da diversidade de cianobactérias
32
mesmo em comunidades complexas como o fitoplâncton. Dentro do domínio Bacteria,
os genes de ficocianina são encontrados em ambientes de água doce exclusivamente
em cianobactérias (Bryant, 1982). O conjunto de genes envolvidos na síntese de
ficocianina contém genes que codificam para duas subunidades da bilina e três
polipeptídios ligadores. O espaçador intergênico entre os dois genes das subunidades
das bilinas, designados b (cpcB) e a (cpcA) (Figura 5), apresentam uma sequência
altamente variável, capaz de diferenciar linhagens (Neilan et al., 1995). Apesar da
região do rDNA 16S ser utilizada na taxonomia de cianobactérias (Wilmotte &Golubic,
1991; Nelissen et al., 1996), a divergência entre sequências dentro da uma espécie é
relativamente baixa, normalmente abaixo de 1% (Rudi et al., 1997; Otsuka et al., 1998).
Já a região intergênica do cpc tem se mostrado muito mais variável e pode ser uma
ferramenta mais adequada para avaliar a diversidade de linhagens (Bolch et al., 1996;
Bittencourt-Oliveira et al., 2001; Haande et al, 2007; Tan et al, 2010).
Figura 5- Representação esquemática do conjunto de genes da ficocianina. As regiões pretas indicam as regiões intergênicas e as cinzas as regiões codificantes. Neste exemplo, o tamanho total do fragmento obtido com os primers descritos neste trabalho é de 685 pb, com uma região intergênica de 94 pb. As setas indicam as posições relativas dos primers PCβF(Foward) e PCαR (Reverse) (Neilan et al, 1995).
33
A maioria dos trabalhos sobre identificação e ecologia de populações naturais de
cianobactérias no Brasil é baseada apenas em dados morfológicos (Mártires, 2012). Os
poucos estudos existentes associando dados morfológicos com técnicas moleculares,
têm sido desenvolvidos com linhagens isoladas (Bittencourt-Oliveira et al., 2009, Silva,
2010). Por exemplo, Bittencourt-Oliveira et al., 2010, detectaram a presença de genes
relacionados à síntese de microcistina em amostras de reservatórios do Nordeste;
Lorenzi, 2004 estudou amostras de populações naturais da Represa de Billings e
Guarapiranga, localizadas no estado de São Paulo, através de rDNA 16S por DGGE.
Mais recentemente, Mártires, 2012, utilizando como marcador rDNA 16S em DGGE no
estudo de quatro reservatórios do Rio Grande do Norte, identificou diferentes filotipos
de cianobactérias, principalmente dos gêneros Planktothrix e Microcystis. Portanto, há
uma escassez de trabalhos que utilizem técnicas moleculares visando não só a
identificação e a taxonomia de cianobactérias, mas também a sua diversidade espacial
e temporal, a partir da dinâmica de genótipos em ambientes brasileiros. Além dos
poucos trabalhos no Brasil que abordam a diversidade de cianobactérias em
populações naturais, não há registros de trabalhos que acompanhem a flutuação
temporal de genótipos de cianobactérias e a sua relação com fatores ambientais. O
entendimento mais aprofundado sobre a dinâmica de genótipos de cianobactérias
durante uma floração pode auxiliar na compreensão dos fatores relacionados ao
sucesso de uma espécie em detrimento de outra e também à variação de produção de
toxinas durante esses eventos.
34
1.6 Ocorrência de cianobactérias no Reservatório do Funil
O Reservatório do Funil é um ambiente bastante estudado pelo Laboratório de
Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC) já que apresenta frequentes
florações de cianobactérias. Estes eventos vêm sendo observados no reservatório nos
últimos 15 anos, sendo algumas florações formadas por espécies potencialmente
produtoras de toxinas. Estudos demonstram que desde a década de 90 este
reservatório já apresentava florações de cianobactérias potencialmente tóxicas (Ferrão-
Filho et al., 2009).
Estudos realizados em 1978/1979 indicavam uma baixa densidade e grande
diversidade de organismos fitoplanctônicos no reservatório, com predomínio de
clorofíceas. A abundância relativa deste grupo era da ordem de 50%, enquanto as
cianobactérias correspondiam a 17%. Estudos realizados em 1989 indicaram que as
cianofíceas passaram a ser dominantes em quase todo o ciclo anual, podendo atingir
abundância relativa superior a 90% no período de verão, quando foram registradas
florações intensas de Microcystis aeruginosa. Microcystis, Oscillatoria e Anabaena
foram os principais gêneros descritos neste período (FEEMA, 1991).
Já na década de 90, Bobeda (1993) relatou a produção de microcistinas em uma
floração de Microcystis neste reservatório. Branco et al. (2002), em coletas entre abril e
dezembro de 1995 registraram elevadas concentrações de clorofila a, associadas à
floração de Microcytis aeruginosa nos meses de novembro e dezembro. Rocha (2002),
em coletas mensais entre 2004 e 2006, relatou a dominância de Microcystis sp. durante
todo ano, com maiores densidades celulares nos meses mais quentes. Ferrão-Filho et
35
al. (2009), no período de novembro de 2002 a outubro de 2003, registraram florações
de cianobactérias, com dominância dos gêneros Anabaena, Microcystis e
Cylindrospermopsis. Os três gêneros estiveram presentes ao longo de todo o ano,
entretanto, houve uma tendência à dominância de Microcystis spp. nos meses quente-
chuvosos e codominância de A. circinalis e C. raciborskii no restante do ano. Deblois et
al. (2008) relataram a presença de microcistina no séston deste reservatório, além de
terem registrado a presença desta toxina em tecidos de peixes da espécies
Oreochromis niloticus coletados na localidade.
Estudos mais recentes continuam relatando as constantes florações de cianobactérias,
com destaque para os gêneros Anabaena, Cylindrospermopsis e Microcystis. Soares
(2009), em coletas mensais, observou dominância de cianobactérias ao longo de todo
ano, com biomassas mais elevadas nos meses de verão. Este estudo também relatou
um padrão de substituição de espécies ao longo do ano, com períodos de floração de
Microcystis aeruginosa sucedidos por florações de Anabaena circinalis e
Cylindrospermocis raciborskii. Rocha, 2012, observou elevadas densidades de
Sphaerocavum brasiliense, gênero até então não relatado neste ambiente, além da
dominância de Anabaena circinalis nos meses mais quentes.
A maioria desses estudos associou a dominância de cianobactérias às altas
concentrações de nutrientes encontradas neste reservatório. De maneira geral, maiores
densidades de cianobactérias foram observadas nos meses de outubro a fevereiro,
correspondendo aos meses de temperaturas mais elevadas. A preferência das
cianobactérias por temperaturas mais elevadas, mesmo nos trópicos, tem sido
36
extensivamente demonstrada (Huszar et al. 2000, Marinho & Huszar 2002, Reynolds
2006).
Além disso, verificou-se uma tendência ao aumento da densidade de cianobactérias ao
longo dos últimos anos, com Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e
Microcystis spp. como os principais táxons de cianobactérias presentes no Reservatório
do Funil. Apesar dos muitos estudos já realizados, ainda não estão completamente
estabelecidos os fatores associados à dinâmica de coexistência e substituição de
espécies e/ou linhagens dos três principais gêneros de cianobactérias presentes, além
da dinâmica de produção de microcistina neste reservatório.
37
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
- Analisar a diversidade de cianobactérias e sua dinâmica temporal durante um período
de floração no Reservatório do Funil, assim como a produção de microcistinas,
utilizando diferentes abordagens.
2.2 Objetivos específicos
- Analisar as variáveis limnológicas e sua relação com a dinâmica de espécies de
cianobactérias e produção de microcistinas.
- Avaliar a diversidade de genótipos de cianobactérias e sua variação temporal e
compará-la à diversidade de morfotipos de cianobactérias encontrados no mesmo
período.
- Avaliar a proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina e
relacioná-la à concentração de microcistina no ambiente.
38
3. Área de estudo
O Reservatório do Funil (22o30’S, 44o45’W) está localizado a 440 m de altitude, no
município de Resende (RJ). É a primeira barragem do Rio Paraíba do Sul em área
fluminense e possui uma área de 40 km2, volume de 8,90 x 106 m3, profundidade
máxima e média de 70 e 22 m, respectivamente, com tempo de residência médio de
41,5 dias (Rocha, 2012) (Figura 6). Este reservatório foi construído no final da década
de 1960, pelo barramento do rio Paraíba do Sul, com a finalidade de servir de fonte de
abastecimento para a cidade de Resende e produzir energia elétrica, mas também é
responsável pela regularização da vazão do Rio Paraíba do Sul, atenuando o impacto
de cheias e possibilitando a transposição de volume de água para o conjunto de
reservatórios do Sistema Light, que acabam por desaguar no Rio Guandu, a principal
fonte de abastecimento de água do município do Rio de Janeiro (Ferrão-Filho et al,
2009). A Usina Hidrelétrica de Funil tem importância para o sistema elétrico por fornecer
energia a grandes centros consumidores, como os estados do Rio de Janeiro e São
Paulo (Furnas, 2008) (Figura 7).
Devido à sua posição estratégica, o reservatório do Funil serve como um decantador
natural de sedimentos, sendo considerado uma verdadeira barragem à poluição
recebida do Vale do Paraíba Paulista, melhorando a qualidade das águas do rio
Paraíba do Sul a jusante do reservatório. Destaca-se ainda, como importante fator de
impacto sobre o reservatório, a reduzida cobertura vegetal dos solos da sua bacia de
drenagem (Figura 8).
39
Figura 6 - Localização do Reservatório do Funil. A direita o desenho esquemático do reservatório, indicando a localização da barragem (modificado de Soares et al, 2012).
Figura 7- Foto aérea da região da barragem do Reservatório do Funil (www.ana.gov.br)
40
Figura 8 - Floração de cianobactérias registrada próximo à barragem em fevereiro de 2010 no
Reservatório do Funil (Rocha, 2012).
41
4. Materiais e Métodos
4.1 Amostragem
Foram realizadas coletas mensais de água, de outubro de 2011 a abril de 2012, em um
ponto amostral, próximo à barragem do Reservatório do Funil (Figura 7). Foi realizada a
amostragem integrada da zona eufótica. Para tanto, com o auxílio da garrafa de Van
Dorn foram coletadas amostras a cada 0,5 m desde a subsuperfície até o fim da zona
eufótica, estimada como 2,7 vezes a profundidade de extinção do disco de Secchi
(Cole, 1994). Essas subamostras foram reunidas em um frasco e constituíram a
amostra integrada. Temperatura da água, pH e condutividade elétrica foram
determinados em campo com o emprego de uma sonda multiparamétrica Yellow Spring
modelo 600 QS. A turbidez foi determinada por um turbidímetro Hatch. A transparência
da água foi avaliada pela profundidade de extinção do disco de Secchi e a intensidade
luminosa subaquática foi determinada com o uso de radiômetro LiCor.
4.2 Clorofila a e nutrientes
Parte da amostra de água coletada foi filtrada em filtros Whatman GF/F (0,7µm) que
foram armazenados congelados até o momento da análise. A concentração de
clorofila-a foi determinada após a extração com acetona 90%, segundo APHA (1995).
Para a análise de nutrientes dissolvidos, alíquotas de água foram filtradas em filtros
Whatman GF/F (0,7µm) o filtrado armazenado em frascos de polipropileno, mantidos
congelados até o momento da análise. Os íons NO2-, NO3
- e NH4+ foram analisados
através de um cromatógrafo de íons Dionex ICS-1000. As condições cromatográficas
42
utilizadas na análise são descritas a seguir. Ânions: colunas AS-14A e AG-14A, eluente
8,0 mM de carbonato de cálcio e 1 mM de bicarbonato de cálcio, em condição
isocrática, com supressão de condutividade por supressora ASRS-300, associada à
supressora CRD-300, com fase móvel de hidróxido de sódio 200 mM. Cátions: colunas
CS-12A e CG-12A, eluente 20 mM de ácido metanosulfônico e supressora CSRS-300.
A análise de fósforo solúvel reativo foi feita por espectrofotometria, segundo Murphy e
Riley, 1962 (espectrofotômetro Shimadzu UV-VIS mini 1240). Para a análise de fósforo
total, alíquotas de água bruta foram tratadas com persulfato de potássio, seguido de
incubação em autoclave por 45 min a 120ºC. O ortofosfato liberado foi analisado da
mesma forma que o fósforo solúvel reativo (Murphy e Riley, 1962).
4.3 Fitoplâncton
Para análise quantitativa, alíquotas de água da amostra integrada foram armazenadas
em frasco de vidro âmbar de 250 mL contendo Lugol. A abundância fitoplanctônica foi
determinada pelo método de Utermöhl (1958) em um microscópio ótico invertido
Olympus BX-51. Os indivíduos (células, colônias, cenóbios, filamentos) foram
enumerados em campos aleatórios (Uhelinger, 1964), em número suficiente para
alcançar 100 indivíduos da espécie mais frequente ou 400 indivíduos totais, sendo o
erro inferior a 20%. A estimativa do biovolume (mm3.L-1) foi feita multiplicando-se, para
cada espécie, a densidade pelo volume médio dos organismos. Para análise qualitativa,
amostras coletadas em rede de 22 µm foram fixadas em Lugol para posterior análise
por microscopia ótica.
43
4.4 Análise de microcistinas
Um volume de 1,0 L da amostra integrada de água foi armazenado em frasco de vidro,
congelado e posteriormente liofilizado. O material liofilizado foi extraído com 10 mL de
metanol:butanol:água (20:5:75) por 30 min em sonicador, seguido de mais 30 min sob
agitação. Este procedimento foi repetido 2 vezes e o material extraído foi evaporado em
nitrogênio até 50% do volume inicial. Esse então passou por purificação em coluna C-
18 (Strat X 33 Polymeric Reverse Phase 500 mg/6mL), sendo eluído com 10 mL de
metanol 100%. O eluato foi completamente seco em nitrogênio e ressuspenso em 1,0
mL de solução de reconstituição de microcistina: Fase B (5 mM de acetato de amônio
em acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico): água (1:1). A identificação e a quantificação
das microcistinas foram feitas no equipamento de LC-MS-MS API 3200 Q-trap (Applied
Biosystems) nas seguintes condições: Coluna: Kinetex 2,6µ C18 100A (50 x 2,10 mm);
Fase A: 5 mM de acetato de amônio em água + 0,1% de ácido fórmico / Fase B: 5 mM
de acetato de amônio em acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico, com gradiente. Foram
analisadas as transições para microcistina LR, RR, YR, LA e LW. O limite de detecção
foi de 0,5 µg/L e o limite de quantificação de 1µg/L.
4.5 Proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina
Para a determinação dos genótipos potencialmente produtores de microcistina foi
utilizado PCR quantitativo (qPCR), com primers descritos por Martin et al, 2010.
As reações de qPCR foram realizadas no equipamento StepOnePlus Real Time PCR
(Applied Biosystems). Todas as reações foram feitas em triplicata, em um volume final
44
de 15 µL, contendo 3 µL de DNA molde, 0,4µM de cada primer (0,2µM para MCYA-
CD1F/CD1R) e 1 X Master Mix SYBR Green (Fermentas). Quatro pares de primers
foram utilizados neste ensaio. O par de primers CYA 359F/781R foi utilizado para
amplificar um fragmento de 422 pb do gene rDNA 16S comum a todas as
cianobactérias. O par MICR 184F/431R foi utilizado para amplificar uma região de 248
pb do rDNA 16S, específica do gênero Microcystis. O par MCYA CD1F/CD1R é capaz
de amplificar o gene mcyA dos gêneros Microcystis, Planktothrix e Anabaena e gera um
fragmento de 297 pb. O par MCYB 2959F/3278R amplifica uma região de 320pb do
gene mcyB, especificamente do gênero Microcystis. As sequências destes primers
estão descritas na tabela 2. (Figura 9)
Tabela 3 - Primers utilizados em ensaios de PCR quantitativo
Alvo Primers Sequência (5’-3’)
Tamanho
do produto
(pb)
Cianobacteria
16S rDNA
Cya 359F GGGGAATYTTCCGCAATGGG 422
Cya 781R GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT
Microcystis
16S rDNA
Micr 184F GCCGCRAGGTGAAAMCTAA 248
Micr 431R AATCCAAARACCTTCCTCCC
mcyA todos os
gêneros
mcyA CD1F AAAATTAAAAGCCGTATCAAA 297
mcyA CD1R AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT
mcyB
Microcystis
mcyB 2959F TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA 320
mcyB 3278R AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC
Para a construção da curva padrão foi utilizada uma linhagem de M. aeruginosa (MIRF-
01) isolada e mantida no banco de linhagens do LETC. A partir de uma cultura de
células desta linhagem cuja densidade celular foi determinada por contagem direta ao
45
microscópio, o DNA cromossômico foi extraído e submetido a diluições seriadas. A
curva padrão foi realizada com sete diluições e a partir disto, foi criada a relação entre a
concentração conhecida de DNA (em equivalentes de células) e os valores de Ct(cycle
threshold) das amostras diluídas. Assim, um volume de 20 mL de um cultivo a 2,47 x
106 células (determinada por contagem no microscópio) foi filtrado em filtros Whatman
GF/F (0,7 µm) e o DNA extraído como já descrito anteriormente (Jungblut et al 2006).
Foram utilizados como molde diluições de DNA variando de 1 a 1:106 (equivalente a
2,47x107 a 24,7 células respectivamente). As PCRs ocorreram conforme descrito na
tabela 3. A determinação dos valores de Ct foi feita automaticamente pelo programa
StepOne™ Software do equipamento StepOnePlus Real Time PCR.
Tabela 4 - Condições de amplificação para os primers utilizados nos ensaios de PCR quantitativo
Primers
Protocolo do PCR Desnaturação
inicial Desnaturação Anelamento Extensão
Número de ciclos
CYA 359F/781R
5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 15 s a 60 °C 30 s a 72 °C 50
Micr 184F/381R
5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 30 s a 52 °C 30 s a 72 °C 40
mcyA CD1F/CD1R
5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 30 s a 52 °C 30 s a 72 °C 40
mcyB 2959F/3278
R 5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 30 s a 52 °C 30 s a72 °C 40
A curva de melting foi realizada imediatamente após a amplificação com uma taxa de
transição de temperatura linear de 0,5 °C.s-1 de 55 a 95°C, com determinação contínua
da aquisição da fluorescência. O cálculo da eficiência de amplificação utilizando cada
par de primers foi feito segundo a fórmula abaixo.
E = (10–1/slope –1) × 100
46
Onde E é a eficiência de amplificação e slope é o valor de inclinação da reta obtida a
partir da relação entre concentração de DNA e o valor de Ct.
Ensaios de PCR convencional foram realizados no intuito de detectar genótipos
potencialmente produtores de microcistina, utilizando como alvo o gene mcyE
(Vaitomaa et al.,2003). Para isso, foram utilizados 3 primers denominados mcyE F2 (5’-
GAA ATT TGT GTA GAA GGT GC-3’) MicmcyE-R8 (5’-CAA TGG GAG CAT AAC GAG-
3’) AnamcyE-12R ( 5’-CAA TCT CGG TAT AGC GGC-3’). A combinação do primer
mcyEF2 com MicmcyE-R8 amplifica o gene mcyE de cianobactérias do gênero
Microcystis e a combinação do primer mcyEF2 com o primer AnamcyE-12R amplifica o
gene mcyE de cianobactérias do gênero Anabaena (Dolichospermum) (Figura 9). As
reações foram realizadas em 20 µl, contendo 0,5 U de GoTaq Flexi DNA polimerase
(Promega), tampão de reação (Promega), dNTPs 0,2mM (Fermentas), MgCl2 2,5mM
(Promega), 0,5 pmol dos primers foward e reverse e 1 µL de DNA. Foi utilizado como
controle positivo o DNA de uma linhagem de Microcistys aeruginosa produtora de
microcistina. As PCRs foram realizadas no termociclador PTC-200 (MJ Research) com
o programa a seguir: desnaturação inicial de 94ºC por 5 min, 25 ciclos de (94º 1 min,
47º 30s, 72º 1 min) e 72º por 5 min. Os produtos de reação foram visualizados por
eletroforese em gel de agarose 1% em sistema de tampão TAE 1X, corados com
brometo de etídeo (Sambrook et al. 2001).
47
4.6 Identificação de genótipos de cianobactérias
Uma visão geral de todas as etapas envolvidas nesta metodologia está representada na
Figura 10.
4.6.1 Extração de DNA. Alíquotas de água foram filtradas em filtros Whatman GF/F 0,7
µm e os filtros armazenados a -20ºC até o momento da extração de DNA. A extração de
DNA foi feita segundo Jungblut et al., 2006. Os filtros foram cortados em pequenos
pedaços e embebidos em solução de extração (metilxantonato de potássio 1%; acetato
de potássio 800 mM; EDTA 20 mM pH 8,0; SDS 1%; Tris–HCl 100 mM pH 7,4). A
mistura foi homogeneizada no vortex, incubada a 65ºC por 2 h e depois resfriada no
gelo por 10 min. Os debris foram retirados por centrifugação a 12000 x g por 10 min e o
sobrenadante passado para outro tubo. A este foi adicionado o mesmo volume de
Figura 9- Conjunto de genes relacionados à síntese de microcistina em diferentes gêneros de cianobactérias. Em diferentes cores, os genes alvos dos iniciadores utilizados neste estudo. Em laranja, o gene alvo do primer mcyA, comum as cianobactérias produtoras de microcistina. Em verde, o alvo do par de primers mcyE específico de Microcystis. Em Azul o gene alvo do par de primers mcyE de Anabaena e em vermelho o gene alvo do par de primers mcyB específico de Microcystis.
48
fenol:clorofórmio, a mistura homogeneizada por inversão e centrifugada a 12000 x g por
5 min, sendo recolhida a fase aquosa. Este procedimento foi realizado 2 vezes com
fenol:clorofórimio e uma vez com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Ao final,
adicionou-se à fase aquosa 1 volume de isopropanol 100%, com incubação a -20ºC
durante a noite. Após centrifugação a 12000 x g por 20 min, o pellet foi lavado com 500
µL de etanol 70%, seguido de centrifugação a 12000 x g por 5 min. Após a secagem do
pellet, o DNA foi ressuspenso em 100 µL de água MilliQ e armazenado a -20ºC.
Figura 10 - Resumo das etapas realizadas para a obtenção (A) e análise de sequências de cpcBA (B)
A
B
49
4.6.2 PCR da região cpcBA e purificação do produto. Para amplificar a região
intergência e parte da região codificante de 2 genes do operon da c-ficocianina (cpcBA),
utilizou-se os primers descritos por Neilan et al.,1995 (Tabela 4). As reações foram
realizadas em 20 µl, contendo 0,5 U de GoTaq Flexi DNA polimerase (Promega),
tampão de reação (Promega), dNTPs 0,2mM (Fermentas), MgCl2 2,5mM (Promega),
0,5 pmol dos primers foward (PCβF) e reverse (PCαR) e 1 µL de DNA. As PCRs foram
realizadas no termociclador PTC-200 (MJ Research) com o programa a seguir:
desnaturação inicial de 94ºC por 5 min, 40 ciclos de (94º 30 seg, 50º 30 seg, 72º 45
seg) e 72º por 2 min.
Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose 0,8% em TAE 1X
(Sambrook et al., 2001) corados com brometo de etídio e visualizados em
transiluminador de UV. Como parâmetro de migração aplicou-se no gel o padrão de
fragmentos de DNA 1 Kb Plus Ladder (Fermentas). A banda na região de interesse
(~700 pb) foi retirada do gel com um bisturi e o DNA purificado com o auxílio de kit de
purificação Silica Bead DNA Gel Extraction (Fermentas). Após purificação, o DNA
ressuspenso em água MilliQ foi precipitado por adição de 1/10 volume de acetato de
sódio 3M, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol absoluto, sendo incubado a -20°C por no
mínimo 1 h. Após centrifugar a 12.000 x g por 20 min e descartar o sobrenadante, o
precipitado foi lavado com etanol 70% gelado. Depois de seco, o DNA foi suspenso em
10 µl de H2O Milli-Q.
Este procedimento foi realizado repetidamente utilizando como molde na PCR DNA
extraído de cada mês amostrado, gerando produtos de cpcBA de amostras coletadas
de outubro a abril.
50
Tabela 5 - Sequências dos primers utilizados para clonagem e sequenciamento da região cpcBA
Primers Sequência (5’-3’ ) Referência
PCβF GGCTGCTTGTTTACGCGACA Neilan et al, 1995
PCαR CCAGTACCACCAGCAACTAA Neilan et al, 1995
SP6 ATTTAGGTGACACTATAG Primers comerciais
(Promega) T7 TAATACGACTCACTATAGGG
4.6.3 Clonagem do produto cpcBA. O produto de amplificação da região cpcBA
(obtido das amostras de DNA de cada mês) foi utilizado em reação de ligação com o
vetor pGEM-Teasy (Promega), realizada segundo instruções do fabricante, a 4ºC
durante a noite. Após este período, a enzima DNA ligase foi inativada a 65ºC por 5 min
e a reação dialisada contra água.
4.6.4 Preparo de células competentes e transformação. A partir de 100 mL de uma
cultura de Escherichia coli DH5-α em fase exponencial, as bactérias foram coletadas
por centrifugação a 10000 xg por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o
pellet ressuspenso. Este procedimento foi realizado 4 vezes, sendo que na primeira vez
o pellet foi ressuspenso em 100 mL de H2O MilliQ gelada estéril, da segunda vez em
50 mL de H2O MilliQ gelada estéril, da terceira vez em 10 mL de glicerol 10% estéril e
da quarta vez em 500 µL de glicerol 10% estéril. As células competentes foram
aliquotadas e armazenadas em nitrogênio líquido até o momento da transformação.
Após a retirada do nitrogênio líquido, as células foram acondicionadas no gelo por 20
min. Para cada transformação bacteriana foi adicionado a 60 µL de células
competentes 1 µL da ligação, seguindo-se de incubação por 20 min no gelo. O aparelho
utilizado para a eletroporação foi o Bio-Rad Gene Pulser com os seguintes parâmetros
51
1,5 volts; 1000; 25Faraday. Após a eletroporação, as bactérias foram transferidas
para 1 mL de meio SOB (Sambrook et al., 2001) e incubadas a 37°C por uma hora.
Após este período, 150 µL foram plaqueados em placas de LB com ampicilina (100
µg/L), IPTG (0,1 mM) e X-gal (20mg.mL-1) (Sambrook et al., 2001). Foram realizadas
transformações com os produtos das ligações cpcBA:pGEMTeasy de cada mês
amostrado.
4.6.5 Extração de DNA plasmidial. As minipreparações plasmidiais foram feitas
conforme descrito em Sambrook et al., 2001, com algumas alterações. Ao menos 50
colônias brancas oriundas de cada transformação (com amostras da região cpcBA de
cada mês amostrado) foram cultivadas em 0,5 mL de LB líquido com ampicilina (100
µg/L) por 4-6 hs a 37°C, sob agitação. As bactérias foram coletadas por centrifugação a
12000 x g por 5 min à temperatura ambiente e o pellet foi ressuspenso em 50 L de
solução 1 (EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0). Após a adição de 50 L de solução 2
(NaOH 200 mM, SDS 1%) a suspensão foi homogeneizada por inversão. Ao tubo foram
adicionados 150 L de solução 3 (acetato de potássio 3M pH 5,5). Após centrifugação a
12000 x g por 10 min o sobrenadante foi transferido para outro tubo, ao qual foi
adicionado 1 volume de isopropanol, sendo incubado por 20 min à temperatura
ambiente. A amostra foi novamente centrifugada a 12000 x g por 20 min, o
sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com 500 L de etanol 70%. Após secar a
temperatura ambiente, o DNA foi suspenso em 50 µL de água estéril e armazenado a -
20°C.
52
4.6.7 Seleção de clones e sequenciamento. Para identificar os produtos clonados
foram feitas PCRs com os primers PCβF e PCαR (Tabela 4), usando como molde os
DNAs plasmidiais. No caso dos clones positivos, foram feitas a seguir PCRs com os
primers SP6 e T7 (Tabela 4). Os produtos foram aplicados em gel de agarose e
purificados como descrito no item 4.5.2. O DNA resultante (50-100 ng) foi utilizado para
o sequenciamento, realizado com o primer PCαR (3,2 pmol) (Tabela 4). O
sequenciamento foi realizado no equipamento ABI PRISM 3130 na Unidade
Multidisciplinar de Genômica do Instituto de Biofísica.
4.6.8 Análise das sequências. A qualidade das sequências foi analisada pela
visualização dos cromatogramas no programa Chromas Lite 2.1
(http://technelysium.com.au). Sequências com qualidade das bases acima de 20
(probabilidade de erro de 1%) foram consideradas satisfatórias. Foi realizada a busca
por similaridade com sequências depositadas no GenBank utilizando a ferramenta
blastn. Foi feito o reverso complemento das sequências e estas foram alinhadas pelo
programa M-COFFEE (Moretti et al., 2007). Após o alinhamento, as regiões das
sequencias não utilizadas foram eliminadas manualmente, no programa Jalview 2.8
(Waterhouse et al., 2009).
4.6.9 Análise de clusters. A análise de cluster foi utilizada para obter o agrupamento
das sequências em genótipos. Para esta análise foram utilizadas parte da região do
gene cpcB (220 pb) e a região intergência entre cpcB e cpcA (de 65-120 pb). O
agrupamento foi realizado pelo programa FASTGRUP II (Yu et al.,2006) e foram
agrupadas no mesmo genótipo sequências com 99,7% ou mais de identidade. O
53
cálculo do índice de Shannon também foi feito pelo programa FASTGRUP II, segundo a
fórmula abaixo (Yu et al., 2006).
A estimativa de cobertura de amostragem foi feita utilizando o índice S Chao1 , segundo
a equação abaixo. (Kemp & Aller, 2004)
Onde Sobs é o número de genótipos observados, F1 e F2 são o número de genótipos
que foram observados uma e duas vezes, respectivamente.
4.6.10 Minimum spanning tree
Com o intuito de analisar a similaridade entre as sequências obtidas neste trabalho foi
utilizado o método de Median Joining Network. Este método possibilita, através da
construção de árvores denominadas minimumg spanning tree, avaliar as relações entre
sequências que apresentam baixa divergência. A análise de median joining e a
construção da minimum spanning tree foram realziadas através do programa Network
4.6 (fluxus-engineering.com), utilizando os parâmetros padronizados do programa.
4.6.11 Construção das árvores filogenéticas. Para a construção das árvores
filogenéticas foi utilizada a região codificante cpcB (220pb) das sequências obtidas.
54
Nesta análise, além das sequências geradas neste trabalho foram utilizadas sequências
disponíveis no GenBank dos gêneros que ocorrem no reservatório do Funil, com maior
contribuição de sequências de Microcystis (Anexo 2). Foi construída uma árvore para as
sequências obtidas de cada mês, totalizando sete árvores. Após o alinhamento das
sequências, foi calculado qual o modelo evolutivo mais adequado para o grupo de
sequências analisadas e partir disso, foi feita a construção das árvores filogenéticas
pelo método Neighbor Joining, no programa MEGA 5.10 (Tamura et al., 2011)
4.7 Análise estatística
Foram realizadas análises de correlação entre os dados abióticos, os dados de
biomassa fitoplanctônica, concentração de microcistina, proporção de genótipos
tóxicos, e diversidade de genótipos de cianobactérias. As análises de correlação foram
realizadas no programa Statistica 7.0
55
5. Resultados
5.1 Dados Abióticos
A temperatura atmosférica e a precipitação no município de Resende-RJ no período
estudado estão representadas na figura abaixo (Figura 11). Os maiores volumes de
precipitação ocorreram nos meses de dezembro, janeiro e março, com valores entre
200 e 300 mm/mês. A temperatura atmosférica média mensal sempre esteve acima de
20ºC, variando de 21,2oC em novembro a 25,3oC no mês de fevereiro.
A temperatura da água no reservatório do Funil variou de 24,7oC no mês de outubro a
29,2oC no mês de dezembro, com média de 27,0oC. As maiores temperaturas foram
Figura 11 - Variação mensal (out 2011 - abril 2012) da temperatura média e precipitação no município de Resende-RJ.
T
em
pe
ratu
ra (
oC)
56
registradas entre dezembro e fevereiro e em dezembro foi possível observar a
estratificação térmica da coluna d’ água (Fig. 12a).
A variação de pH no reservatório do Funil é mostrada na figura abaixo (Figura 12b). Os
menores valores de pH foram observados nos meses de março e abril, em torno de 6,5,
enquanto os maiores valores de pH foram observados entre dezembro e fevereiro
chegando próximo a 9,5. Não foi observada grande variação longitudinal do pH ao
longo da zona eufótica nos meses amostrados.
A turbidez no ponto amostrado variou de 2,84 NTU no mês de abril a 25 NTU no mês
de dezembro (Tabela 6). Os maiores valores de turbidez foram encontrados nos meses
com maior pluviosidade, quando o aporte de material particulado é maior. A
transparência do reservatório variou de 2,6 m em abril a 0,7 m em dezembro. Esta
variável está associada à turbidez, uma vez que quanto maior a turbidez da água,
a b
Figura 12 - Variação de temperatura (a) e pH (b) na zona eufótica ao longo dos meses (out 2011 - abril 2012) no Reservatório do Funil.
57
menores os valores de transparência. A condutividade elétrica variou de 74 µScm-1 em
outubro a 95 µScm-1 em dezembro. A condutividade elétrica está associada à
concentração de íons na água e se encontra mais elevada nos meses de maior
pluviosidade.
As análises das concentrações das diferentes formas de nitrogênio permitiram observar
que o íon amônio apresentou a menor concentração no mês de abril, 1,0 µgL-1, e a
maior no mês de dezembro, chegando a 102,6 µgL-1. Com exceção do mês de
dezembro, todos os outros meses apresentaram concentrações relativamente baixas do
íon amônio. A concentração máxima de nitrito foi observada no mês de outubro (85,1
µg.L-1). Os meses de novembro, dezembro e março, nos quais foram observados os
valores mais baixos, apresentaram concentrações de nitrito em torno de 20,0 µg.L-1. As
concentrações de nitrato estiveram elevadas em praticamente todos os meses
amostrados. A maior concentração de nitrato foi observada em abril (3014,5 µg.L-1) e a
menor em fevereiro 439,4 µgL-1.
A concentração de fósforo solúvel reativo sempre esteve abaixo de 10 µg.L-1. As
maiores concentrações deste íon foram detectadas nos meses de março e abril (8,5 e
9,3 µg.L-1) e a menor no mês de outubro (4,1 µg.L-1).
As maiores concentrações de fósforo total foram observadas nos meses de novembro e
janeiro (43,25 e 41,45 µg.L-1) e as menores nos meses de março e abril (14,41 e 7,21
µgL-1).
58
Tabela 6 - Variáveis limnológicas na amostra integrada da zona eufótica do ponto amostrado do reservatório do Funil. Turbidez (NTU); Transparência (m), Condutividade (µScm
-1); NO2
- (µgL
-1); NO3
-
(µgL-1
); NH4+ (µgL
-1); Fósforo Solúvel Reativo, SRP (µgL
-1); Fósforo total (TP).
Turbidez Transparência Condutividade NO2
- NO3
- NH4
+ SRP TP
Out 19,3 0,8 74 85,1 1714,9 49,0 4,1 34,24
Nov 9 1,2 80 24,5 1500,7 3,5 5,1 43,25
Dez 25 0,7 95 22,4 629,1 102,6 4,9 37,84
Jan 15 0,8 85 48,6 1324,7 12,8 6,3 41,45
Fev 14 0,8 91 32,7 439,4 5,0 6,9 32,44
Mar 4,12 1,8 87 25,7 2810,9 6,7 8,5 14,41
Abr 2,84 2,6 84 28,9 3014,5 1,0 9,3 7,21
5.2 Fitoplâncton
O fitoplâncton foi avaliado quanto à biomassa e também biomassa de clorofila. Os
valores de clorofila em geral coincidiram com os de biomassa fitoplanctônica, sendo os
mais elevados identificados nos meses de outubro, dezembro, janeiro e fevereiro
(Figura 13). A concentração de clorofila apresentou seu máximo no mês de dezembro,
38,9 µg.L-1, e os menores valores nos meses de março e abril, em torno de 2 µg.L-1.
59
Figura 13 - Variação da concentração de clorofila e da biomassa fitoplanctônica no reservatório do Funil.
Foram identificados por microscopia 22 táxons fitoplanctônicos ao longo do período
amostral, com maior contribuição de cianobactérias (12) e algas verdes (6). Anexo (1)
Na amostra para análise qualitativa, principalmente nos meses de outubro e novembro,
foi observada uma variedade de morfotipos coloniais de cianobactérias (Figura 14). A
identificação das espécies correspondentes a estes morfotipos foi feita de acordo com a
organização das células na colônia, presença de mucilagem e número de planos de
divisão. Foi possível distinguir 4 espécies: Radiocystis fernandoii, Microcystis
aeruginosa, Microcystys protocystis e Sphaerocavum brasiliense. Contudo, na análise
quantitativa (contagem do número de células), foi observada predominantemente a
ocorrência de células isoladas. Neste estado, a identificação em nível específico é
praticamente impossível, devido à falta dos caracteres citados acima. Portanto, para a
apresentação e discussão dos dados seguintes essa variedade de morfotipos foi
agrupada e definida como Microcystis spp.
60
Figura 14 –Microscopia ótica dos principais morfotipos de cianobactérias encontrados no reservatório do Funil a- Dolichospermum sp. e morfotipos coloniais de Microcystis ; b -Microcystis proctocystis, c e d - Dolichospermum sp.; e. Cylindrospermopsis raciborskii. f- Radiocystis fernandoii; g- morfotipos colônias de Microcystis.
c d
e f g
a
b
61
Ao longo de todo o período estudado houve dominância de cianobactérias, chegando
até a 99,8% da biomassa fitoplanctônica no mês de dezembro (Figura 15). A menor
contribuição de cianobactérias para biomassa foi observada no mês de abril, com
88,4%. Os gêneros que mais contribuíram para a dominância de cianobactérias foram
Microcystis, Dolichospermum e Cylindrospermopsis.
No mês de outubro observou-se a dominância de Microcystis spp., com contribuição de
Dolichospermum sp. e elevada biomassa total. Contudo, no mês de novembro, ocorreu
uma diminuição expressiva da biomassa fitoplanctônica, com codominância entre
Microcystis spp. e Dolichospermum sp. Em dezembro foi observado um acentuado
aumento da biomassa total, atingindo o maior valor do período estudado e ampla
dominância de Microcystis spp. A seguir, ocorreu uma mudança na composição de
espécies, com dominância e elevada biomassa de Cylindrospermopsis racibosrkii,
juntamente com a presença de Dolichospermum sp. em janeiro. Embora com biomassa
bem menor, Cylindrospermopsis racibosrkii se manteve presente nos meses seguintes.
No mês de fevereiro ainda foi possível observar uma biomassa elevada, com
dominância de Dolichospermum sp. e Microcystis spp. Nos meses de março e abril,
observou-se a diminuição da biomassa fitoplanctônica, mas permaneceram os mesmos
gêneros anteriormente encontrados e predominância de Microcystis spp.
62
Conforme descrito, o gênero Microcystis dominou entre o fitoplâncton na maior parte
dos meses estudados, estando presente em todo o período, mas apresentando
variação em relação à dominância e biomassa (Figura 15). Os meses de biomassa mais
elevada de Microcystis foram outubro e dezembro, em que este gênero foi responsável
por 98% da biomassa fitoplanctônica.
.
Figura 15 - Variação mensal (2011-2012) da biomassa fitoplanctônica total (A); e contribuição relativa dos principais táxons de cianobactérias (Cylindrospermopsis racibosrkii, Dolichospermum sp., Microcystis spp. e Pseudoanebaena minima) e outros grupos fitoplanctônicos (B).
63
5.3 Microcistinas
Foram detectadas três variantes de microcistina nas amostras analisadas, microcistina
LR, RR e YR. A microcistina predominante em todos os meses, com exceção de
janeiro, foi a LR e a maior concentração encontrada foi observada no mês de outubro,
com 530 ng.L-1 (Figura 16). A microcistina RR foi predominante no mês de dezembro
(67,8 ng.L-1) e janeiro, mas em baixa concentração (7,2 ng.L-1). No mês de janeiro a
concentração total de microcistinas foi a menor de todo o período, provavelmente
devido à dominância de Cylindrospermopsis racibosrkii, que não produz microcistinas, e
diminuição da biomassa de Dolichospermum sp. e Microcystis spp., gêneros
potencialmente produtores de microcistina. Com exceção de outubro, a concentração
de microcistina total não foi elevada, com valores próximos ou abaixo de 200 ng.L-1. As
concentrações de microcistina foram incluídas na análise de correlação, mas não foi
observada correlação significativa com nenhuma variável ambiental ou biomassa
fitoplanctônica.
Figura 16 - Variação mensal das concentrações das três variantes de microcistina detectadas no reservatório do Funil entre outubro de 2011 e abril de 2012.
64
5.4 Quantificação de genótipos potencialmente produtores de microcistina
Para realizar a quantificação dos genótipos potencialmente produtores de microcistina,
foram combinados os resultados da amplificação de sequências de genes que
codificam as enzimas da síntese de microcistina e de genes rDNA16S. Como estimativa
do número de células de cianobactérias utilizou-se como alvo o gene rDNA16S, sendo
que um par de primers teve como alvo os genes rDNA16S de cianobactérias em geral
(cya) enquanto outro teve como alvo o gene rDNA16S de Microcystis apenas (micr).
Como estimativa do número de células potencialmente tóxicas usou-se como alvo os
genes mcyA e mcyB, presentes no agrupamento de genes relacionados a síntese de
microcistinas, sendo o primeiro amplificado com primers gerais para cianobactérias e o
segundo com primers específicos para Microcystis.
Para todos os pares de primers foram realizadas curvas padrão relacionando
concentrações de DNA com valores de Ct das respectivas reações de amplificação
(Anexo 3). Em todos os casos foram obtidas relações lineares altamente significativas
entre a quantidade de DNA inicial (convertidas em equivalente de número de células) e
os valores de Ct. Os parâmetros das curvas padrão e as eficiências de amplificação de
cada par de primer estão resumidos na tabela 7. Apesar de uma boa correlação linear,
o par de primers mcyA (para amplificar este gene em diversos gêneros) não apresentou
resultados satisfatórios de acordo com a análise das curvas de amplificação
(fluorescência x número de ciclos de amplificação) e a eficiência de amplificação
calculada foi muito baixa. Por isso, os dados obtidos com este par de primers não serão
apresentados. Sem esta informação não foi possível estimar a quantidade de células
65
potencialmente produtoras de microcistina de outros gêneros que não Microcystis no
reservatório.
Os valores das temperaturas de desnaturação dos produtos de qPCR obtidos com cada
par de primer ao amplificar DNA cromossômico obtido das diferentes amostras de
campo foram semelhantes aos obtidos ao amplificar DNA cromossômico purificado de
uma linhagem isolada de Microcystis mantida em laboratório, demonstrando assim a
reprodutibilidade do ensaio (Tabela 7).
Tabela 7 - Parâmetros da curva de calibração do PCR quantitativo e temperatura de desnaturação dos produtos gerados com cada par de primer utilizado.
Primers
Eficiência
de
amplificação
Inclinação
(slope)
Interceptação
do eixo Y R2
Temperatura
de
desnaturação
16SrDNA
Cianobactéria
(cya)
100 -2,2819 30,846 0,9973 82,76 - 83,71 oC
16SrDNA
Microcystis
(micr)
100 -3,1252 29,751 0,9946 84,01 - 85,00 oC
mcyA
Cianobactéria 78,7 -3,966 42,806 0,995 77,54 - 78,04
oC
mcyB
Microcystis 99,54 -3,333 36,211 0,9945 77,30 - 77,56
oC
No caso de cada par de primer, a conversão dos valores de Ct das reações de qPCR
para “equivalentes de células” foi realizada calibrando a relação entre estes dois
parâmetros a partir da amplificação de DNA cromossômico de uma linhagem isolada de
Microcystis, cujo número de células foi quantificado por microscopia. No gráfico abaixo
66
são apresentados os valores de equivalentes de células por mL para cianobactérias
(cya), cianobactérias do gênero Microcystis (micr) e cianobactérias do gênero
Microcystis que possuem um dos genes para a produção de microcistina (mcyB) (Figura
17). Os maiores valores de densidade de células de cianobactérias foram observados
no mês de janeiro (1,2 x 104 células.mL-1) e os maiores valores de Microcystis no mês
de outubro (2,5 x 103 células.mL-1). As células potencialmente tóxicas de Microcystis
estiveram presentes em todos os meses de amostragem, com maiores densidades nos
meses de novembro e dezembro.
Com base nos valores apresentados acima foi calculada a proporção de células
potencialmente tóxicas de Microcystis ao longo dos meses (Figura 18). Esse cálculo foi
Figura 17 - Variação mensal (2011-2012) de valores de equivalentes de célula/mL para cianobactéria total (cya), Microcystis (micr) e genótipos mcyB+ de Microcystis (mcyB) no reservatório do Funil.
67
feito dividindo-se o equivalente de células de mcyB (Microcystis tóxica) pelo equivalente
de células totais de Microcytis. Nos meses de outubro e fevereiro aproximadamente
10% das células Microcystis eram potencialmente produtoras de microcistinas. Nos
meses de dezembro e janeiro cerca de 80% da população de Microcystis era formada
por células potencialmente produtoras de microcistina e nos meses de novembro,
março e abril 100% das células de Microcystis foram positivas para mcyB.
No gráfico abaixo são apresentados em conjunto os valores de equivalentes de células
de Microcystis mcyB+ e a concentração de microcistina (Figura 19a). É possível
observar que nem sempre estas medidas coincidiram. A amostra do mês de outubro,
com maior concentração de microcistina na água não foi a que apresentou o maior
Figura 18 - Variação mensal (2011-2012) da proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina, calculada a partir da razão entre equivalente de células mcyB+ e equivalente de células de Microcystis.
68
número de células com potencial de produção desta cianotoxina. De outubro para
novembro a concentração de microcistina decaiu, no entanto a densidade de células
mcyB+ aumentou. Em outros casos estas medidas foram mais concordantes. Em
novembro, observou-se o maior número de células que possuíam o gene para a síntese
de microcistina e concentrações relativamente altas de microcistina na água. A amostra
de dezembro teve valores intermediários tanto de genótipos mcyB+ como de
concentração dessa cianotoxina. Na amostra de janeiro foi observado baixo número de
genótipos mcyB+ e também baixa concentração de microcistina. Assim, o decréscimo
de genótipos mcyB+ acompanhou a diminuição das concentrações de toxina neste
período. As amostras dos meses de fevereiro, março e abril apresentam valores
relativamente baixos de microcistinas, e também baixo número de células
potencialmente tóxicas.
A partir dos destes dados foram calculados os valores de cota celular de microcistina
dividindo-se a concentração de microcistina por número de células potencialmente
a
a b
Figura 19 - Variação mensal dos valores de (a) equivalentes de células de Microcystis potencialmente produtoras de microcistina (mcyB) e concentrações de microcistina; (b) cota celular de microcistina, calculada a partir da razão entre concentração de microcistina e por número de genótipos de Microcystis potencialmente tóxicos (mcyB+).
69
produtoras (mycB) do gênero Microcystis (Figura 19b). A cota celular também
apresentou ampla variação ao longo dos meses. Os meses de outubro, fevereiro, março
e, em menor grau abril, apresentam elevados valores de cota celular de microcistina,
sendo que em fevereiro e março estes valores foram similares. Já nos meses de
novembro, dezembro e janeiro houve baixa concentração de microcistina por célula,
com valores similares.
Para verificar se nas amostras coletadas do reservatório do Funil havia linhagens de
Dolichospermum potencialmente produtoras de microcistina, foram realizadas PCRs
utilizando pares de primers capazes de amplificar especificamente o gene mcyE de
Dolichospermum ou o gene mcyE de Microcystis (Figura 20). Não foi possível observar
amplificação alguma utilizando o par de primers para mcyE de Dolichospermum,
indicando que este gênero não é potencialmente produtor de toxinas neste ambiente.
a b c
Figura 20 - Produtos da amplificação por PCR da região (a) rDNA16S (b) mcyE Microcystis e (c) mcyE Dolichospermum. 1 - padrão de peso molecular de DNA, banda mais forte indica 1 kb; 2 - DNA cromossômico de uma linhagem isolada de M. aeruginosa; 3 a 9 - DNA cromossômico de amostras de água dos meses de: outubro, novembro, dezembro, janeiro, fevereiro, março, abril; 10 - controle negativo, sem DNA molde.
70
5.5 Diversidade de genótipos de cianobactérias.
Com objetivo de analisar a diversidade genética de cianobactérias no reservatório do
Funil, foi obtido DNA total a partir de amostras de água e amplificado o fragmento da
região cpcBA. Este apresentou tamanho entre 650 e 700pb (Figura 21). A variação de
tamanho do fragmento é esperada, uma vez que o produto de amplificação inclui a
região intergênica que pode variar de tamanho nos diferentes gêneros de
cianobactérias.
Para cada mês foi construída uma biblioteca plasmidial de sequências cpcBA. Foram
sequenciados no total 204 clones, sendo que os meses de outubro, novembro, janeiro e
abril foram representados por 38, 29, 31 e 33 sequências respectivamente enquanto
que março, fevereiro e dezembro ficaram com menor número de sequências (23, 25 e
25 respectivamente). Considerando como mesmo genótipo aquelas sequências com
identidade maior que 99,7%, as sequências foram agrupadas em 58 genótipos. Dos 14
genótipos que apresentaram mais de uma sequência, 11 tiveram alta (> 98%)
Figura 21 - Produtos da amplificação por PCR da região cpcBA usando como molde DNA cromossômico total de amostras ambientais. Gel de agarose 0,8% em TAE. À direita o padrão de peso molecular de DNA, setas indicam marcadores em número de pb.
71
identidade com o gênero Microcystis, 1 com o gênero Cylindrospermopsis, 1 com o
gênero Dolichospermum e 1 com o gênero Pseudoanabaena. Dos 44 genótipos com
uma única sequência representante, 88,6% obtiveram identidade acima de 99% com
sequência do GenBank do gênero Microcystis e 11,4% com Cylindrospermopsis.
A Figura 22 demonstra a flutuação dos genótipos ao longo dos meses. O único
genótipo presente em todas as amostras foi o genótipo de Microcystis M1. Alguns
genótipos estiveram presentes em quase todos os meses de amostragem, como os
genótipos de Microcystis M2 e M4, a maioria dos genótipos esteve presente em apenas
poucos meses. O genótipo predominante de Cylindrospermopsis, C1, foi observado nos
meses de janeiro, março e abril e genótipos únicos de Cylindrospermopsis só foram
observados na amostra de abril.
72
Figura 22 - Variação mensal da ocorrência relativa de genótipos de cianobactérias, segundo a região cpcBA. M, Microcystis; C, Cylindrospermopsis; A Dolichospermum; P, Pseudoanabaena; UC genótipos únicos de Cylindrospermopsis; e UM, genótipos únicos de Microcystis.
Foi feita a estimativa de riqueza em cada mês utilizando o índice SChao para avaliar a
cobertura da amostragem (Tabela 8). A média da cobertura de amostragem foi de
45,61% e os meses com maior cobertura foram dezembro, fevereiro e março.
No mês de outubro, quando houve a predominância do genótipo de Microcystis M1, foi
observada a menor diversidade e a maior cobertura. Os meses com maior diversidade
de genótipos foram novembro e dezembro, nos quais houve maior ocorrência de
genótipos únicos. A partir de dezembro houve uma queda na diversidade de genótipos,
concomitante ao aparecimento dos genótipos de Cylindrospermopsis.
73
Tabela 8 - Estimativa de riqueza, cobertura da amostragem e índice de diversidade de Shanonn dos genótipos de cianobactérias do reservatório do Funil ao longo dos meses amostrados.
Riqueza
observada S(chao) Cobertura (%)
Índice de
Shannon
out 12 31 32,3 1,6
nov 17 39 43,6 2,4
dez 14 26,5 52,8 2,4
jan 8 20,5 39 1,6
fev 9 17,3 52,2 1,7
mar 12 19,3 62,3 1,9
abril 14 37,8 37,1 2,3
A partir da construção de diagramas de mininum spanning tree foi possível observar a
relação entre todas as sequências obtidas. Como esperado, sequências dos quatro
gêneros detectados formaram agrupamentos bem distintos e distantes (Figura 23). Na
Figura 24, há o destaque do agrupamento de sequências do gênero Microcystis. É
possível observar o agrupamento de diversas sequências, com destaque para os
genótipos M1 (círculos pretos), M2 (círculos verdes) e M3 (círculos laranjas) É importante
ressaltar que este programa só agrupa o mesmo genótipo sequências com 100% de
identidade. Juntos, estes genótipos respondem por 46% das sequências de Microcystis.
Também são observados diversos genótipos únicos, representados pelos círculos
menores e amarelos. A proximidade entre os círculos está relacionada a similaridade entre
as sequências e portanto observa-se um elevado número de sequências únicas muito
similares aos genótipos mais frequentes.
74
Microcystis
Temperatura
Dolichospermum
Cylindrospermopsis Pseudoanabaena
Figura 23 - Minimmum spaning tree de todas as sequências obtidas, utilizando parte do gene cpcB e a região intergênica (total 290 pb). Estão destacados os agrupamentos de sequências dos quatro gêneros detectados. O diâmetro dos círculos é proporcional ao número de genótipos. Os números representam a quantidade de sequências em cada grupo.
2
4
30
168
75
Figura 24 - Minimmum spanning tree das sequências do gênero Microcystis. Círculos maiores representam um maior número de sequências e os círculos menores e amarelos representam
sequências únicas ❶Genótipo M1 ❷Genótipo M2 ❸Genótipo M3 ❹ Genótipo M4 ❺ Genótipo M5 ❻
Genótipo M6 ❿Genótipo M10 ⓫Genótipo M11
76
Foram construídas árvores filogenéticas utilizando parte da sequência do gene cpcB (220
pb) dos indivíduos recuperados em cada mês, incluindo também sequências de gêneros
que ocorrem no reservatório do Funil, disponíveis no GenBank. Para cada mês foi
construída uma árvore com as sequências obtidas e com sequências de referência
(Figuras 25 a 31). As sequências de referência estão indicadas na árvore com o nome da
espécie e o número de acesso do GenBank ao lado. A lista completa das sequências de
referência utilizadas e seus respectivos números de acesso estão disponíveis no Anexo 2.
Em nenhum caso foi possível fazer distinção entre espécies de Microcystis, indicando que
o cpcB não é um bom marcador para distinguir espécies deste gênero. Além disso, as
sequências de Microcystis obtidas neste estudo não formaram um agrupamento distinto
das sequências de referência, indicando que não há uma distinção geográfica das
linhagens de Microcystis do resrvatório do Funil em relação a outras de distribuição
mundial.
77
Figura 25 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de outubro. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (O) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
Pseudoanabaena
O21
O15 (5)
Microcystis aeruginosa FJ80104
Sphaerocavum brasiliense FJ801047.1
O09
Microcystis aeruginosa AY56869
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa EU64382
O25 (2)
O16
O20
O40 (18)
O19
O04
O18
O06
O37
O03
Microcystis flosaquae AF195161
002
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis viridis AF385383.1
Microcystis aeruginosa AF19517
Microcystis aeruginosa EU44830
O29 (3)
O36
O10
Microcystis aeruginosa JN226766.1
Microcystis aeruginosa JQ93725
Microcystis aeruginosa JN22676
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis viridis JF798342.1
Microcystis aeruginosa JN688260
Microcystis aeruginosa EU01415
Microcystis aeruginosa JQ937254.1
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Cylindrospermopsis raciborskii AM502049.1
Raphidiopsis brookii ACYB01000
Aphanocapsa montana DQ010411.1
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Anabaena circinales AF426012.1
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena sp AF426015.1
Dolichospermum crassum JN90364
Pseudanabaena sp M99426.1
013
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.1100
96
92
84
83
52 64
99
76
54
59
97
71
69
58
53
60
Microcystis
78
Microcystis aeruginosa EU64382
Microcystis aeruginosa AY56869
N11
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa FJ80104
S brasiliense FJ801047.1
Microcystis flosaquae AF195161
Microcystis viridis AF385383.1
N13
N09 (5)
N03 (2)
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis aeruginosa JN226766
Microcystis aeruginosa AF19517
Microcystis aeruginosa EU44830
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis aeruginosa JQ93725
Microcystis aeruginosa JN22676
N12
N15
N21 (3)
Microcystis aeruginosa AM01486
Microcystis aeruginosa JQ937254
Microcystis aeruginosa AM04861
Microcystis viridis JF798342.1
Microcystis aeruginosa JN688260
Microcystis aeruginosa EU01415
N06
N26
N16
N18
N19
N38
N04 (7)
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanocapsa montana DQ010411.1
C raciborskii AM502049.1
Raphidiopsis brookii ACYB01000
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Anabaena circinales AF426012.1
Anabaena spiroides AY702234.1
Dolichospermum crassum JN90364
Anabaena sp AF426015.1
Pseudanabaena sp M99426.1
N27 (2)
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.1100
99
97
88
85
79
78
61
54
61
99
85
74
59
53
67
82
50
97
Figura 26 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de novembro. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (N) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
Pseudoanabaena
Microcystis
79
Microcystis
D11
D03 (2)
D22 (3)
D05
D01
D12 (2)
Microcystis viridis AF385383.1
Microcystis flosaquae AF195161
D10
Sphaerocavum brasiliense FJ801047.1
Microcystis aeruginosa FJ80104
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa EU64382
Microcystis aeruginosa AY56869
D33 (8)
D21
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis aeruginosa JN12267
Microcystis aeruginosa AF19517
Microcystis aeruginosa EU44830
Microcystis aeruginosa JQ19372
Microcystis aeruginosa JN16882
Microcystis aeruginosa JN22676
D09 (3)
Microcystis aeruginosa AM10486
Microcystis aeruginosa JQ93725
Microcystis aeruginosa AM04861
Microcystis viridis JF798342.1
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis aeruginosa EU01415
D30 (2)
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Cylindrospermopsis raciborskii AM502049.1
Raphidiopsis brookii ACYB01000
Aphanocapsa montana DQ010411.1
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Anabaena circinales AF426012.1
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena sp AF426015.1
Dolichospermum crassum JN90364
Pseudanabaena sp M99426.1
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.199
96
92
86
82
57
64
99
78
56
74
52
98
78
67
74
55
Figura 27- Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de dezembro. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (D) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
80
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis viridis JF798342.1
Microcystis aeruginosa EU01415
Microcystis aeruginosa AM04861
Microcystis aeruginosa AM10486
Microcystis aeruginosa JQ93725
J04 (8)
Microcystis aeruginosa JN12267
Microcystis aeruginosa JN22676
Microcystis aeruginosa JQ19372
Microcystis aeruginosa JN16882
Microcystis aeruginosa FJ80104
S brasiliense FJ801047.1
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa AY56869
Microcystis aeruginosa EU64382
Microcystis flosaquae AF195161
J16 (11)
Microcystis viridis AF385383.1
J10
J29 (2)
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis aeruginosa AF19517
Microcystis aeruginosa EU44830
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Anabaena sp AF426015.1
Dolichospermum crassum JN90364
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena circinales AF426012.1
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Aphanocapsa montana DQ010411.1
C raciborskii AM502049.1
J09 (7)
Raphidiopsis brookii ACYB01000
J17
J22
Pseudanabaena sp M99426.1
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.1100
93
86
80
58
67
9754
60
99
79
55
74
55
69
61
80
66
60
97
Microcystis
Cylindrospermopsis
Figura 28 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de janeiro. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (J) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
81
Microcystis flosaquae AF195161
F21
F09 (8)
F05
F17 (4)
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis viridis AF385383.1
Microcystis aeruginosa AF19517
Microcystis aeruginosa EU44830
Microcystis aeruginosa FJ80104
S brasiliense FJ801047.1
Microcystis aeruginosa EU64382
Microcystis aeruginosa AY56869
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa JN16882
Microcystis aeruginosa JN22676
Microcystis aeruginosa JQ19372
Microcystis aeruginosa JN12267
F23 (10)
Microcystis aeruginosa AM10486
Microcystis aeruginosa JQ93725
Microcystis aeruginosa AM04861
Microcystis aeruginosa EU01415
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis viridis JF798342.1
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Aphanocapsa montana DQ010411.1
C raciborskii AM502049.1
Raphidiopsis brookii ACYB01000
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Anabaena circinales AF426012.1
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena sp AF426015.1
Dolichospermum crassum JN90364
Pseudanabaena sp M99426.1
F07
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.1100
97
92
87
87
84
60
54
50
63
99
78
54
57
69
63
79
69
50
98 Microcystis
Pseudoanabaena
Figura 29 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de fevereiro. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (F) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
82
Microcystis aeruginosa EU01415
Microcystis viridis JF798342.1
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis aeruginosa AM04861
Microcystis aeruginosa JQ93725
Microcystis aeruginosa AM10486
M09
Microcystis aeruginosa JN12267
Microcystis aeruginosa JN22676
Microcystis aeruginosa JQ19372
Microcystis aeruginosa JN16882
S brasiliense FJ801047.1
Microcystis aeruginosa FJ80104
M23
Microcystis aeruginosa EU64382
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa AY56869
Microcystis flosaquae AF195161
Microcystis viridis AF385383.1
M07
M06
M04
M13 (7)
M02
M15 (6)
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis aeruginosa EU44830
Microcystis aeruginosa AF19517
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Raphidiopsis brookii ACYB01000
M14 (2)
C raciborskii AM502049.1
Aphanocapsa montana DQ010411.1
Aphanizomenon sp FJ234877.1
M18 (2),
Anabaena circinales AF426012.1
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena sp AF426015.1
Dolichospermum crassum JN90364
Pseudanabaena sp M99426.1
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.1100
97
93
82
100
73
63
94
99
90
54
52
81
52
56
77
54
86
77
50
75
63
83
62
100
Dolichospermum
Cylindrospermopsis
Microcystis
Figura 30 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de março. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (M) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
83
Microcystis aeruginosa FJ80104
S brasiliense FJ801047.1
A29
Microcystis aeruginosa AY56869
Microcystis aeruginosa HM02041
Microcystis aeruginosa EU64382
Microcystis flosaquae AF195161
Microcystis viridis AF385383.1
A15
A32
A28
Microcystis aeruginosa JN22676
Microcystis aeruginosa JN16882
Microcystis aeruginosa JQ19372
Microcystis aeruginosa JN12267
Microcystis aeruginosa AM10486
Microcystis aeruginosa JQ93725
Microcystis aeruginosa AM04861
Microcystis aeruginosa JN68826
Microcystis aeruginosa EU01415
Microcystis viridis JF798342.1
A03/140430/1290/1290/1-224
Microcystis wesenbergii AF3853
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis wesenbergii GQ3792
Microcystis aeruginosa AF19517
Microcystis aeruginosa EU44830
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN90
Anabaena sp AF426015.1
Dolichospermum crassum JN90364
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena circinales AF426012.1
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Aphanocapsa montana DQ010411.1
C raciborskii AM502049.1
A17
Raphidiopsis brookii ACYB01000
A26
A22
Pseudanabaena sp M99426.1
Cyanothece sp CP001344.1
Synechocystis sp CP003265.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp CP000097.1100
96
92
79
72
70
66
68
83
99
58
100
91
52
68
52
80
61
80
76
85
71
79
72
100
Microcystis
Cylindrospermopsis
Figura 31 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de abril. São mostrados os valores de bootstrap acima de 50%. As sequências obtidas neste estudo estão representadas pela inicial do mês de coleta (A) e o número da sequência. O valor entre parênteses representa o número de sequências do mesmo genótipo.
84
6 – Discussão
Relação entre fatores abióticos e biomassa fitoplanctônica
O Reservatório do Funil vem sendo intensamente estudado ao longo dos últimos 15
anos e muito já se conhece acerca da dinâmica sazonal e espacial das variáveis
limnológicas e da dinâmica fitoplanctônica. (Rocha, 2012 Soares et al., 2009, Rocha et
al., 2002, Branco et al., 2002). As elevadas temperaturas e pluviosidade observadas
nos meses de coleta (Figura 11) são características da estação chuvosa e quente,
compreendida principalmente entre os meses de novembro e março. Altas temperaturas
da água também são frequentemente observadas nesta localidade neste período e
podem contribuir para a estratificação da coluna d’água e para a dominância de
cianobactérias. Diversos trabalhos já reportaram as maiores temperaturas anuais e
também a maior incidência de florações no período estudado neste trabalho (Rocha,
2012; Ferrão Filho et al., 2009; Soares, 2008; Rocha, 2007). No presente estudo, a
amostragem da água foi realizada somente na zona eufótica e, portanto, não foi
possível determinar se a coluna d’água estava estratificada ao longo de todo o período
amostrado. Apesar disso, observou-se a estratificação térmica na zona eufótica no mês
de dezembro (Figura 12a).
Estudos anteriores relataram estratificação térmica neste reservatório em vários
períodos do ano, principalmente nos meses de temperatura mais elevada, padrão
também observado em outros reservatórios brasileiros (Soares et al., 2009; Branco et
al., 2002; Henry, 1995;). Além disso, o aumento na temperatura da água também
diminui sua viscosidade, diminuindo a resistência à migração. Nessas condições,
85
cianobactérias que possuem aerótopos se beneficiam por conseguirem manter-se nas
camadas mais superficiais da d’água, recebendo maior incidência luminosa. Assim, se
estabelecem em uma camada superficial, o que dificulta a penetração luminosa,
diminuindo a profundidade da zona eufótica e limitando o crescimento de outros
organismos fitoplanctônicos (Paerl & Paul, 2011). Portanto, a estratificação da coluna
d’água pode favorecer a formação de florações de cinaobactérias.
O pH da água no Reservatório do Funil tendeu a alcalino, variando de 6,5 a 9,5 (Figura
12b), o que não diferiu das condições avaliadas em outros trabalhos neste reservatório
(Soares et al., 2009, Branco et al., 2002; Rocha et al. 2002). Valores de pH elevados
costumam ser comuns em reservatórios dominados por cianobactérias (Bouvy et al.,
2001; Chellapa & Costa, 2003), estando relacionados ao aumento da atividade
fotossintética durante florações.
Com relação aos valores de condutividade observados neste estudo, eles são próximos
a valores anteriormente relatados neste reservatório (Ferrão Filho et al.; 2009, Rocha,
2012).A condutividade apresentou maiores valores no mês de janeiro (tabela 5), o que
pode estar relacionado ao aumento da pluviosidade.
Reservatórios são ambientes de transição entre rios e lagos e, portanto, apresentam
elevada heterogeneidade espacial. O Reservatório do Funil apresenta marcada
variação espacial, principalmente em relação ao fósforo total e transparência (Soares,
2012) e observa-se o aumento da biomassa fitoplanctônica ao longo do gradiente rio-
reservatório. Nos trabalhos que estudaram a dinâmica espacial do fitoplâncton no
Reservatório do Funil, as maiores biomassas fitoplanctônicas foram observadas
86
próximo à barragem (Soares, 2008; Rocha, 2012). Portanto, pela impossibilidade de
realizar amostragens em diversos pontos no presente estudo, foi escolhido somente um
ponto próximo à barragem.
Apesar de o reservatório do Funil ser classificado como eutrófico (Branco et al., 2002),
foram detectadas baixas concentrações de fósforo dissolvido nas amostras analisadas
(tabela 5, valor mínimo 4,1 ug.L-1 valor máximo 9,3 ug.L-1). Baixas concentrações de
fósforo dissolvido também foram observadas neste mesmo reservatório em outros
trabalhos: Rocha, 2012, detectou concentrações abaixo de 12 µg.L-1 em alguns meses,
Ferrão-Filho et al., 2009 detectou 9,3 µg.L-1 de fósforo solúvel reativo em uma amostra,
Rangel et al, 2012 e Branco et al, 2002, detectaram em algumas amostras
concentrações abaixo de 10 µg.L-1. O ponto de coleta do presente estudo, por estar
próximo à barragem, apresenta marcada característica de ambiente lêntico, e portanto,
a baixa concentração de fósforo solúvel reativo pode ser devida aos processos
sedimentação que ocorrem ao longo do reservatório. Segundo Reynolds, 2006,
concentrações de fósforo solúvel reativo abaixo de 10 µg.L-1 são limitantes ao
crescimento fitoplanctônico. Apesar disso, mesmo com baixas concentrações de fósforo
dissolvido, observou-se elevada biomassa fitoplanctônica (Figura 13). Também no caso
de Soares et al., 2012, em que durante um ano amostras incluíram 4 pontos de coleta
no reservatório do Funil, representando ambientes fluvial, intermediário e lêntico, foi
próximo à barragem que as maiores biomassas fitoplanctônicas foram registradas,
associadas às menores concentrações de fósforo e nitrogênio total. Este fenômeno foi
atribuído à diminuição da turbidez e consequente maior penetração de luz, favorecendo
o crescimento fitoplanctônico. Portanto, além de processos de sedimentação que
87
ocorrem ao longo do reservatório, a baixa concentração de fósforo dissolvido se deve a
assimilação por organismos fitoplanctônicos, resultando na elevada biomassa
observada. Além disso, as cianobactérias são capazes de acumular fósforo inorgânico
na forma de grânulos de polifosfato (Xiaoli et al., 2003) e portanto, períodos limitados de
baixa concentração de fósforo podem não interferir no seu crescimento. Associado a
isto, as elevadas concentrações fósforo total demonstram que a maioria do fósforo se
apresentava na forma orgânica, assimilada pela biomassa fitoplanctônica (tabela 5).
A concentração de nitrogênio inorgânico dissolvido (NID) foi elevada durante todo o
período amostrado, e a menor concentração de NID foi observada no mês de fevereiro,
cerca de 477 µg.L-1. Portanto, durante todo o período analisado não houve limitação por
nitrogênio, o que segundo Reynolds, 2006 ocorre abaixo de 100 µg.L-1. A forma mais
abundante de nitrogênio dissolvido foi o nitrato, com concentrações de até 2800 µg.L-1
(Tabela 5). Altas concentrações de nitrato inorgânico e baixas concentrações de fósforo
solúvel reativo também já foram observadas em outros reservatórios brasileiros,
eutróficos, submetidos à influência antropogênica, devido à alta deposição de
sedimentos orgânicos e à elevada biomassa fitoplanctônica. (Branco & Senna 1994;
Barbosa et al. 1995). O trabalho de Rangel et al. (2012) reuniu dados de vários
reservatórios brasileiros e apontou o Reservatório do Funil como o de maiores
concentrações de fósforo total e nitrogênio total. Os resultados foram para o período de
2006 e 2007 e concordam com outros trabalhos, como Soares (2008) e Rocha (2012).
Os valores de clorofila observados também foram próximos aos já descritos para esse
ambiente. Os maiores valores de clorofila foram observados entre outubro e fevereiro,
com máximo de 38,9 µg.L -1 em dezembro. Ferrão e Filho et al., (2009), em coletas
88
mensais, detectaram concentrações de até 78 µg.L-1 em dezembro de 2002 e Rocha,
(2012) reportou 189 μg.L-1 em julho de 2009, contudo, esses valores são excepcionais.
Wetzel (2001) considera que ambientes com concentrações de clorofila-a maiores que
11 µg.L -1 são eutróficos.
A biomassa fitoplanctônica mais elevada no período estudado foi observada no mês de
dezembro, alcançando 7,7 mm3.L-1. Comparativamente, Soares, et al., 2009,
reportaram nos meses de novembro e dezembro de 2002, biomassa fitoplanctônica
próxima a 130 mg.L-1 em amostras coletadas na superfície.
No presente estudo foi feita amostragem integrada na zona eufótica e, portanto, pode
ter ocorrido a diluição da amostra, acarretando na diminuição da biomassa final. Rocha
(2012), com coletas de água da subsuperfície, observou maiores biomassas em janeiro
e fevereiro, próximos a 9 e 20 mm3.L-1 respectivamente. Ferrão Filho et al., 2009
avaliou somente a densidade de células e encontrou os maiores valores em novembro
e fevereiro de 2006, chegando a 4x105 células.ml-1.
Na amostra coletada em novembro foi observada baixa biomassa de cianobactérias
(abaixo de 2 mm3.L-1), contrastando com os meses de outubro e dezembro. Apesar de
não dispormos de dados de FURNAS acerca da vazão diária do Reservatório do Funil,
a abertura da barragem, conhecida como vazão vertida, foi relatada por um morador, o
que pode ter promovido a perda da biomassa fitoplanctônica. Este fenômeno não é
raro, visto que este reservatório é voltado para geração de energia. Além disso, a vazão
vertida também ocorreu durante o período amostrado por Soares, (2008), ocasionando
drástica diminuição da biomassa fitoplanctônica. Além de novembro, também nos
meses de março e abril a biomassa fitoplanctônica esteve abaixo de 2 mm3.L-1. Neste
89
caso os baixos valores podem ser atribuídos ao fim do verão, com diminuição das
temperaturas e o fim do período de chuvas.
Identificação e dinâmica de gêneros/espécies de cianobactérias
Neste estudo, os principais gêneros, e em alguns casos, espécies, de cianobactérias
presentes durante o período amostrado foram identificados tanto com base na
morfologia, por exame microscópico, quanto com base em marcadores moleculares.
Neste último caso, usou-se como parâmetro uma região gênica/intergênica bastante
utilizada na detecção e identificação de cianobactérias, cpcBA (Neilan et al. 1995).
De acordo com a identificação de morfotipos, foram identificados doze táxons de
cianobactérias (anexo 1), com destaque para os morfotipos Microcystis aeruginosa,
Spaherocavum brasiliense, Dolichospermum sp e Cylindrospermopsis raciborskii.
O gênero Sphaerocavum foi descrito por Azevedo & Sant’Anna, (2003). A definição
desse novo gênero de cianobactéria foi baseada principalmente na morfologia da
colônia e no número de planos de divisão. S. brasiliense possui dois planos de divisão
ao passo que células do gênero Microcystis possuem três planos de divisão. S.
brasiliense possui ampla distribuição nos sistemas aquáticos no Brasil e é um táxon
importante na formação de florações nos reservatórios (Sant´Anna et al. 2008).
Contudo, a separação entre Sphaerocavum e Microcystis, com base apenas na
morfologia, é problemática pelos poucos caracteres distintos (Sant´Anna et al. 2004,
Cybis et al. 2006). No reservatório do Funil, a primeira identificação de S. brasiliense foi
feita por Rocha et al., 2012, ao passo que trabalhos anteriores identificaram a presença
90
de Microcystis aeruginosa e de Microcystis panniformis (Ferrão Filho, 2009, Soares,
2009; Silva et al., 2009).
Quanto à caracterização molecular de S. brasiliense Gomes, 2008, em sua tese de
doutorado, isolou da represa Vargem das Flores- MG 15 linhagens desta espécie e
sequenciou as regiões cpcBA e rDNA 16S. Todas as sequências de cpcBA tiveram
similaridade entre 97 e 99% com sequências de Microcystis disponíveis no GenBank e
as sequências de rDNA16S tiveram mais de 98% de identidade com sequências do
gênero Microcystis. Contudo, estas sequências não foram depositadas no GenBank, e
no momento a única sequência de S. brasiliense disponível é da região cpcBA, que
apresenta 100% de similaridade com uma sequência de Microcystis aeruginosa.
Na classificação de espécies dentro do domínio Bacteria, considera-se que organismos
que apresentam associação DNA-DNA acima de 70% pertencem à mesma espécie
(Wayne et al, 1987). Foi observado que sequências do gene rDNA 16S que apresentam
valores de identidade inferiores a 97,5% dificilmente apresentam reassociação de DNA-
DNA maior que 70%, e portanto, definem organismos de diferentes espécies
(Stackebrandt & Goebel, 1994). Portanto, são considerados da mesma espécie
organismos que apresentem identidade de rDNA 16S acima de 98% e do mesmo
gênero aqueles que apresentam identidade acima de 95% (Ludwig et al, 1998).
Assim, a separação de S. brasiliense de outra espécies do gênero Microcystis não é
suportada pela sequência de rDNA 16S e nem pelo marcador utilizado neste trabalho,
cpcBA. Portanto, devido à dificuldade de separar S. brasiliense de espécies de
Microcystis por caracteres morfológicos e pelo fato desta separação não ter base
91
molecular, neste trabalho, células identificadas morfologicamente como Sphaerocavum
brasiliense foram incluídas como parte de Microcystis spp.
Além de Sphaerocavum, os gêneros Cylindrospermopsis e Dolichospermum foram os
mais representados, de acordo com a análise morfológica, no período estudado.
Recentemente, Wacklin et al., 2009, revisaram o gênero Anabaena e as espécies de
Anabaena planctônicas foram classificadas em um novo gênero, nomeado
Dolichospermum. Essa separação foi baseada em características morfológicas, como a
presença de vesículas de gás, mas também na análise filogenética baseada na
sequência do rDNA 16S. Portanto, trabalhos anteriores a esta data descrevem apenas
o gênero como Anabaena, como nos estudos citados a seguir.
Ferrão Filho et al., 2009 observaram a presença de Microcystis spp,
Cylindrospermopsis raciborskii e Anabaena circinalis ao longo de todo o ano,
entretanto, houve uma tendência à dominância de Microcystis spp nos meses quente-
chuvosos e co-dominância de A. circinalis e C. raciborskii, no restante do ano. Contudo
os autores não discutem que fatores poderiam estar associados a essa alternância em
dominância.
Estudando a comunidade fitoplanctônica do Reservatório do Funil, Soares et al. (2009),
no período de 2002 e 2003, observaram a alternância de dominância entre M.
aeruginosa, C. raciborskii e A. circinalis. As duas últimas espécies dominaram a
biomassa fitoplanctônica do reservatório ao longo do ano, enquanto que M. aeruginosa
foi a espécie dominante em termos de biomassa quando a zona de mistura tornou-se
reduzida, durante os meses mais quentes do verão. Os autores associaram a
dominância de M. aeruginosa a estratificação da coluna d’água, aliada ao aumento da
92
temperatura, além do aumento da incidência luminosa, causada não somente pelo
período de maior insolação, como também pela redução da turbidez.
Um padrão semelhante ao relatado por esses estudos anteriores foi observado no
presente trabalho, por análise de microscopia. Em outubro, observou-se elevada
biomassa de Microcystis spp, mas também a presença de Dolichospermum sp, que
passou a dominar no mês seguinte. Contudo, como já relatado, houve uma queda
acentuada da biomassa em novembro, atingindo valores próximos de 2 mg.L-1. (Figura
14) Em dezembro, ocorreu o restabelecimento da floração, dominada amplamente por
Microcystis spp. No mês de janeiro, observou-se a dominância de C. raciboskii e
também a contribuição de Microcystis spp e Dolichospermum sp. Nas amostras de
março e abril, observou-se baixa biomassa, com a presença dos três gêneros.
Não foi observada correlação significativa entre as varáveis ambientais consideradas e
a biomassa de C. raciborskii e Dolichospermum sp. Já a biomassa de Microcystis spp
correlacionou-se positivamente com a concentração do íon amônio. Contudo, esse
resultado pode ser consequência da forte correlação entre a biomassa de Microcystis
spp e a biomassa total de cianobactérias (Tabela 6).
Soares, et al, 2008, propõe que a alelopatia poderia ter um papel importante na
dinâmica de sucessão de espécies observada no Reservatório do Funil. Sampaio, 2011
estudando linhagens de M. aeruginosa e C. raciborskii isoladas deste reservatório
identificou uma possível interação alelopática entre essas duas espécies. Em
experimentos de cultivo, foi observado que uma cepa de M. aeruginosa apresentou
diminuição do rendimento, aumento do tamanho de células e aumento na formação de
colônias quando cultivada na presença de exsudato de uma cepa de C. raciborskii.
93
Mello et al., 2012, utilizando as mesmas linhagens em cultivo identificaram a inibição do
crescimento de M. aeruginosa na presença de C. raciborskii. Contudo, uma vez que
esses resultados foram obtidos com linhagens isoladas, sua transposição para a
situação observada no Reservatório do Funil é ainda uma especulação.
De acordo com a análise molecular foram identificados os gêneros de cianobactérias:
Microcystis, Cylindrospermopsis, Dolichospermum e Pseudoanabaena.
A maior parte das sequências recuperadas, em todos os meses amostrados, foi do
gênero Microcystis (Figura 23). De fato, de acordo com a análise microscópica este
grupo esteve presente em grandes proporções ao longo de todo o período analisado
(Figura 14). Associado a isto, pode-se atribuir esta recuperação elevada de sequências
a uma alta eficiência de amplificação de sequências cpcBA deste gênero com os
primers utilizados.
Apesar da identificação de 4 gêneros pela análise molecular, alguns táxons observados
por microscopia não foram representados pela amostragem molecular. Esse memso
fato já foi relatado por outros estudos. Bozarth et al., 2010, estudando a diversidade de
genótipos de cianobactérias de dois reservatórios americanos, utilizando como
marcadores cpcBA e rDNA16S-23S, só detectaram sequências de Microcystis, apesar
da presença de células de Anabaena e Aphanizomenon ter sido detectada nestes
reservatórios por microscopia. Kim et al, 2006, estudando um reservatório na Coréia,
utilizando como marcador cpcBA também reportaram espécies presentes na análise
morfológica do fitoplâncton que não foram detectadas pela análise molecular.
94
No nosso estudo, dos 204 clones do gene cpcBA sequenciados, somente duas
sequências, recuperadas de amostras do mês de março, foram identificadas como do
gênero Anabaena (Figuras 23 e 30). De acordo com a análise microscópica foram
detectadas células do gênero Dolichospermum em praticamente todas as amostras.
Como já citado, houve em 2009 a revisão destes gêneros. Portanto, sequências no
banco depositadas anteriormente como Anabaena podem corresponder hoje a este
novo gênero, Dolichospermum. A baixa representação de sequências do gênero
Dolichospermum pode ser devida a limitações das técnicas utilizadas. Uma
possibilidade levantada foi a de que os primers “universais” para a região cpcBA
usados, poderiam ser pouco eficientes para amplificar sequências de Dolichospermum.
Porém, outros trabalhos já recuperaram sequências de Anabaena/Dolichospermum
utilizando estes primers (Neilan et al., 1995, Miller & McMohan, 2011). Ainda assim,
analisou-se sequências de Dolichospermum e Anabaena disponíveis no GenBank por
meio de alinhamento e não foram notadas diferenças marcantes nas sequências alvo
dos primers utilizados neste trabalho que justificassem a não amplificação (dados não
mostrados). Estes primers foram ainda testados com DNA cromossômico de linhagens
isoladas de Anabaena sp. e os produtos da amplificação resultaram em bandas fracas
na análise em gel de agarose, ao contrário do que ocorreu quando se usou DNA
cromossômico de linhagens isoladas de Microcystis, nas mesmas condições, indicando
possivelmente baixa eficiência de amplificação (dados não mostrados). Além disso, a
baixa recuperação de sequências deste gênero pode ser devida a baixa eficiência na
extração de DNA de células deste gênero na mistura de complexa de células de uma
amostra ambiental.
95
Wintzingerode et al., 1997, discutiram as dificuldades inerentes às técnicas de
determinação da diversidade microbiana através de métodos baseados em PCR. Em
estudos com amostras ambientais há uma mistura de moléculas de DNA que serão
utilizadas como molde para o PCR. A amplificação do DNA só refletirá a abundância
relativa de cada espécie se a eficiência de amplificação da região for igual para todos
os moldes, o que é bastante improvável de ocorrer. Portanto, a escolha dos primers
utilizados pode influenciar na recuperação de sequências. Apesar disso, limitações são
observadas em qualquer método de estudo. Portanto, a diversidade de sequências de
cpcBA obtidas neste estudo representa somente os organismos que podem ser
amplificados com os primers utilizados. Embora os primers utilizados tenham sido
descritos em 1995 (Neilan et al., 1995) , ainda hoje são usados na maioria dos estudos
que utilizam essa região (cpcBA) como alvo. Esses primers são descritos como
capazes de amplificar a maioria de gêneros de cianobactérias, mas não todos (Miller &
McMohan, 2011).
Para a construção das árvores filogenéticas foi utilizada somente a região gênica cpcB
das sequências obtidas. Essa escolha foi feita devido à elevada variabilidade observada
na região intergênica, principalmente entre sequências de gêneros diferentes.
Abordagens semelhantes foram utilizadas em outros trabalhos (Kim et al., 2011, Miller &
McMohan, 2011). Através da análise das árvores filogenéticas foi possível identificar,
nas amostras de cada mês, além dos gêneros presentes, a sua relação filogenética
com cianobactérias cujas sequências estão depositadas no GenBank. Assim, como
descrito para o rDNA 16S, o gene cpcB se mostrou um bom marcador para diferenciar
gêneros de cianobactérias, mas ele não pode ser utilizado como marcador molecular na
96
separação de espécies de Microcystis (Figuras 25-31). O gênero Microcystis apresenta
sua taxonomia ainda problemática devido ao elevado número de morfotipos, que são
diferenciados principalmente pela forma e arranjo das células em colônia (Otsuka et
al.2001). Segundo Komárek, et al, 2010, o gênero Microcystis pode ser claramente
distinguido de outros gêneros através da análise da sequência do rDNA 16S, mas não é
possível a distinção em espécies utilizando marcadores moleculares. Ou seja, a
filogenia das espécies do gênero Microcystis utilizando o rDNA 16S demonstra que a
classificação morfológica não é suportada por este marcador molecular. Aliado a isso,
provavelmente existem sequências depositadas no GenBank erroneamente
identificadas, já que a identificação de linhagens isoladas de Microcystis é mais difícil,
principalmente devido à perda de organização em colônias quando isoladas no cultivo.
Recentemente, Ngwa et al., 2012 estudaram 31 linhagens de Microcystis de 10
morfoespécies e observaram elevada similaridade na sequência do rDNA 16S (99,2–
100%). Portanto, como observado nas árvores de cada mês, os baixos valores de
bootstrap não suportam a separação das sequências em diferentes espécies (Figuras
25-31).
Quantificação de microcistina
Foi detectada a presença de microcistina em todas as amostras analisadas, porém as
concentrações não foram elevadas, estando sempre abaixo de 1 µg.L-1 , concentração
recomendada pela WHO para água de consumo humano (Figura 16). Ferrão Filho et
al., 2009 reportaram para o reservatório do Funil, em amostras de séston analisadas
97
por ELISA, concentrações de 1,2 e 4,5 µg.L-1 de microcistina-LR (MC-LR), em
novembro e dezembro de 2002, respectivamente. Deblois et al, 2008, a partir de
amostras concentradas em rede de 22 µm detectaram, através de ensaios de inibição
de fosfatase, até 2,2 µg.L-1 de MC-LR em janeiro de 2003, neste mesmo reservatório. O
presente trabalho descreve pela primeira vez a identificação das variantes MC-RR e
MC-YR neste reservatório. Com exceção de dezembro, a variante predominante foi a
MC-LR, enquanto que em dezembro foi MC-RR. Amé et al., 2010 detectaram no Lago
Los Padres, na Argentina, as variantes MC-LR, RR, YR e LA. Neste ambiente a
principal variante detectada foi a MC-RR, correspondendo a até 90% da microcistina
total. Prakash et al, 2009, em estudos em lagoas na Índia também reportaram a
dominância de MC-RR, em relação as formas MC-LR, MC-AR e MC-WR,
correspondendo a até 70% da microcistina total. Esses autores reforçam que ambientes
com temperaturas mais elevadas tendem a apresentar a predominância de MC-RR, ao
passo que em ambientes temperados há a predominância de MC-LR. Experimentos em
laboratório com uma cepa de Anabaena produtora de MC-LR e RR indicaram maior
produção de MC-LR em temperaturas mais baixas e maior produção de MC-RR em
temperaturas elevadas (Rapala et al., 1997). Contudo, no reservatório do Funil, não foi
encontrada correlação positiva entre a temperatura do reservatório e a proporção de
MC-RR. Apesar disso, as maiores proporções de MC-RR foram observadas nos meses
de dezembro e janeiro (52 e 55% respectivamente), que apresentaram elevadas
temperaturas médias (Figuras 11 e 16).
Genótipos potencialmente produtores de microcistina
98
Neste estudo, dentre os genótipos potencialmente produtores de microcistina tentou-se
investigar se somente o gênero Microcystis seria responsável pela produção dessa
cianotoxina no reservatório ou se linhagens do gênero Dolichospermum também
participariam dessa síntese. Para isso, realizou-se um ensaio de PCR quantitativo
(qPCR) tendo como alvo o gene mcyA com primers capazes de amplificá-lo a partir de
qualquer cianobactéria que contenha este gene. Porém, este par de primers apresentou
baixa eficiência de amplificação no ensaio de qPCR (próxima a 78%), inviabilizando o
aproveitamento dos resultados (tabela 7).
A descrição desses primers foi feita por Hisbergues et al., 2003, em ensaios de
amplificação da região mcyA de cepas de Microcystis, Planktothrix e Anabaena
produtoras de microcistina. Esses mesmos primers foram utilizados, em ensaios de
qPCR, por Martins & Vasconcelos, 2011 e os autores obtiveram eficiência de
amplificação de 87,6%, muito acima do observado no nosso ensaio. Além disso, no
nosso estudo, testes realizados com esses primers com cepas de Anabaena sp.
demonstraram amplificação inespecífica (dados não mostrados).
Desta forma, para detectar genótipos produtores de microcistina, passamos a contar
apenas com o ensaio de qPCR tendo como alvo mcyB, com primers específicos para
Microcystis. Com o intuito de verificar se o gênero Dolichospermum seria
potencialmente produtor de microcistina neste reservatório, foi realizado PCR tendo
como alvo o gene mcyE, com primers capazes de diferenciar os gêneros (Vaitomaa et
al., 2003) (Figura 9). Não foi detectada a presença de gene mcyE de Dolichospermum
em nenhuma amostra, indicando que no período amostrado a capacidade de produzir
microcistina pode ser atribuída apenas a Microcystis (Figura 20).
99
A proporção de genótipos de Microcystis potencialmente produtores de microcistina no
reservatório do Funil variou consideravelmente ao longo do período amostrado, indo de
9% a 100% das células (Figura 18). Essa grande variação na proporção de genótipos
tóxicos é descrita em diversos trabalhos, como exemplificado por dados obtidos de 13
trabalhos, resumidos na tabela 2. Nestes, foram utilizados diferentes genes como alvo,
como mcyA, mcyB, mcyD e mcyE. Como exemplo, Kurmayer & Kutzenberger, 2003 em
uma série temporal de Junho de 99 a Outubro de 2000, no lago Wannsse na Alemanha,
observaram variação de 0,9 a 38,3% de genótipos tóxicos de Microcystis; Yoshida et
al., 2007, detectaram de 0,5 a 35% de genótipos potencialmente produtores de
microcistina. Te & Gin, 2011 detectaram proporções de genótipos produtores de
microcistina de 21,9 a 100% em coletas mensais durante 8 meses em 3 pontos
amostrais em um reservatório em Cingapura.
A proporção de genótipos tóxicos não foi correlacionada significativamente com a
concentração de microcistina em diversos trabalhos. Por exemplo, Srivastava et al,
2012 encontraram baixas proporções de genótipos potencialmente produtores de
microcistina (de 0,01% a 14,3%), em coletas quinzenais de março de 2010 a abril de
2011 utilizando como alvo o mcyA e apesar disso, as concentrações de toxina foram
bastante elevadas, chegando até a 584 µg.L-1. Martins & Vasconcelos, 2011 também
não encontraram relação entre a proporção de genótipos tóxicos e a produção de
microcistina. Quando foi observada a maior concentração de microcistina (7,2 µg.L-1), a
proporção de genótipos tóxicos foi de cerca de 20%. No nosso caso, esta relação
também não pode ser estabelecida, o que ficou claro a partir da análise de amostras do
mês de outubro e dezembro. Enquanto em outubro a concentração de microcistina foi
100
alta e a proporção de genótipos tóxicos de apenas cerca de 10%, em dezembro, a
concentração de toxina foi bem mais baixa com 80% de genótipos tóxicos.
Provavelmente a proporção de genótipos tóxicos isoladamente não é o melhor
parâmetro para explicar a quantidade de microcistina no ambiente, como discutido a
seguir.
De acordo com nossos dados, a abundância de genótipos potencialmente produtores
de microcistina foi calculada, em algumas amostras, como maior do que o número de
equivalentes de células de Microcystis, portanto sua proporção excedeu 100% (Figura
18). Da mesma forma, diversos trabalhos já reportaram a mesma situação (Rinta-Kanto
et al., 2005; Há et al., 2009; Baxa et al., 2010, Martins & Vasconcelos, 2011).
Esses resultados se devem a artefatos de técnica e podem ser explicados pela escolha
do gene rDNA 16S como normalizador. Nesse caso, desvios podem ser gerados porque
esse não é um gene de cópia única, ao contrário do gene alvo para produção de
microcistina, e também porque sua sequência pode variar em amostras de populações
naturais de cianobactérias e a amostragem é limitada pela capacidade dos primers
reconhecerem seus alvos. Finalmente, já foi apontado que as células podem apresentar
diversos graus de ploidia durante o crescimento, o que torna o número de cópias do
gene variável. (Vaitomaa, et al., 2003)
Apesar do grande número de estudos sobre a dinâmica de genótipos potencialmente
produtores de microcistina, ainda não é claro o que causaria a alternância de padrões
de dominância entre genótipos tóxicos e não tóxicos. Briand et al., 2008 sugeriram a
seleção de genótipos não tóxicos em condições favoráveis ao crescimento de
Microcystis, e portanto baixas proporções de genótipos tóxicos seriam observadas em
101
condições de elevada abundância de células de Microcystis. De acordo com esses
dados, Martins & Vasconcelos, 2011 encontraram maiores proporções de genótipos
produtores de microcistina no estabelecimento da floração e também uma correlação
negativa entre a proporção de genótipos tóxicos e a densidade celular de Microcystis,
sugerindo a seleção de genótipos não tóxicos em condições favoráveis ao crescimento.
No presente estudo, na amostra de outubro, quando foi detectada elevada biomassa de
Microcystis, de fato observou-se baixa proporção de genótipos potencialmente
produtores de microcistina (13%) (Figuras 15 e 18). Na amostra de novembro, quando
houve acentuada diminuição da biomassa de Microcystis, houve elevada proporção de
genótipos potencialmente produtores de microcistina, o que poderia estar associado ao
estabelecimento da floração, como sugerido por Martins & Vasconcelos, 2011.
Contudo, na amostra de dezembro, observou-se a quase completa dominância de
Microcystis, e também foi detectada elevada proporção de genótipos tóxicos. Em
janeiro, quando ocorreu dominância de C. raciborskii, também foi detectada elevada
proporção de genótipos tóxicos (Figuras 15 e 18).
Sabart et al., 2010 relataram que células tóxicas tendem a dominar quando Microcystis
não é o gênero dominante e portanto, a capacidade de produzir microcistina poderia
estar associada à competição entre espécies. Porém, na amostra de fevereiro,
dominada por Dolichospermum sp, a proporção de genótipos tóxicos observada foi
baixa (Figuras 15 e 18).
Nas amostras de março e abril, quando já se observou menores biomassas de
cianobactérias, houve dominância de genótipos tóxicos (Figuras 15 e 18), novamente
102
em consonância com o expresso por Briand, et al, 2008, ou seja, em momentos não
favoráveis ao crescimento há a predominância de genótipos tóxicos.
Contudo, apesar de alguns casos de concordância, não foi possível no presente
trabalho estabelecer de relações claras entre a proporção de genótipos produtores de
microcistina e a dinâmica da floração de cianobactérias. Esta relação também não está
estabelecida na literatura. (Te & Gin 2011, Ngwa et al., 2012). Deve-se considerar que
analisar a dinâmica da floração de cianobactérias por amostragens mensais limita a
interpretação dos fenômenos observados, visto que provavelmente o intervalo entre as
amostragens é grande em relação ao período de alternância entre linhagens em
decorrência de competição.
Não foi observada correlação positiva significativa entre a concentração de microcistina
e número de cópias de mcyB, como esperado e como observado em outros estudos
(Martins & Vasconcelos, 2011, Te & Gin 2011). Já de acordo com outros trabalhos que
obtiveram resultados similares aos nossos, esta falta de correlação entre a
concentração de microcistina e quantificação de mcyB pode ser devida à presença do
operon de microcistina incompleto, o que leva a superestimar o número de células com
capacidade de produzir toxina (Sabart et al., 2011, Baxa et al, 2010). Além disso, no
nosso estudo, foi determinada a concentração de microcistina total, que representa a
soma de intracelular e dissolvida na água, o que pode ter dificultado a correlação entre
esses parâmetros. Também não pode ser descartada a possibilidade de outras
espécies no Reservatório do Funil possuírem a capacidade de produzir microcistina,
como Pseudanabaena e Synechoccystis, já descritas como potencialmente produtoras
(Neilan et al., 2012). Contudo, esta última possibilidade é muito pouco provável, já que,
103
segundo nossos dados, Dolichospermum não apresentou linhagens produtoras de
microcistina e porque observou-se correlação positiva entre o marcador do gênero
Microcystis (micr) e microcistina.
Cota celular de microcistina
A estimativa de valores de cota celular de microcistina em amostras de campo é muito
difícil porque nem todas as células de uma espécie potencialmente produtora são
capazes de produzir toxina ou a estão produzindo num dado momento, já que esta
propriedade é influenciada por uma série de fatores ambientais, possivelmente em
sinergismo, de forma ainda não estabelecida (Neilan et al,2012).
Mesmo entre os trabalhos que avaliam a produção de toxinas em linhagens isoladas
ainda não houve um consenso acerca dos fatores reguladores da síntese de
microcistina. Com base em experimentos com linhagens em cultura, sob limitação de
nitrogênio, foi observada uma relação direta entre produção de microcistina e taxa de
crescimento, sugerindo que a produção de microcistina é regulada indiretamente por
fatores ambientais, e diretamente pela taxa de crescimento (Orr & Jones, 1998, Ohh et
al., 2000). Long et al., 2001 desenvolveu um modelo onde a produção de microcistina é
constitutiva e linhagens produtoras de microcistina sempre produzirão uma
concentração mínima de microcistina, e o máximo de produção ocorrerá quando
existirem condições ótimas de nutriente, temperatura e luminosidade. Esse modelo foi
aplicado e consegui predizer a concentração de microcistina a partir da densidade de
células e também foi aplicado a amostras ambientais. (Kurmayer & Kutzenberger, 2003)
104
De uma forma geral, observou-se em vários experimentos em laboratório uma variação
de 2 a 3 vezes na cota celular de microcistina em resposta a alterações ambientais
como temperatura, intensidade luminosa, nutrientes etc (Kardinaal & Visser, 2005,
PEPCY, 2006). Portanto, em populações naturais, essa variação na produção de
microcistina é atribuída tanto à proporção de genótipos tóxicos quanto a variações na
taxa de síntese da toxina por influência de fatores abióticos (PEPCY, 2006).
Para fins de monitoramento, há um grande interesse na possibilidade de prever se uma
floração de cianobactérias será tóxica ou não e também a dinâmica de produção de
toxina ao longo da duração da floração. Recentemente, a disponibilidade de métodos
moleculares de detecção representou uma abordagem promissora para este tipo de
diagnóstico. Contudo, como mencionado acima, poucos trabalhos conseguiram
relacionar a concentração de microcistina com a presença e/ou proporção de genótipos
tóxicos no ambiente (Martins & Vasconcelos, 2011). No nosso caso, avaliando os sete
meses amostrados, não foi possível estabelecer uma relação direta entre a
concentração de microcistina e a proporção de genótipos tóxicos (calculada por
mcyB/micr), nem entre a concentração de microcistina e o número de células
potencialmente tóxicas (calculados por equivalentes de células mcyB+), ou mesmo
entre a concentração de microcistina e os valores de cota celular de microcistina
(calculados por concentração de microcistina/mcyB). Por isso, fizemos uma tentativa
de analisar todas as variáveis relevantes em conjunto: biomassa de Microcystis,
proporção de genótipos tóxicos, cota celular e concentração de microcistina, no intuito
de entender melhor a dinâmica de produção de microcistina neste reservatório (Figura
32).
105
Na amostra de outubro, na qual foi observada a maior concentração de microcistina,
pode ter resultado dos seguintes fatores: apesar da proporção de genótipos tóxicos ter
sido baixa, a biomassa total de Microcystis foi alta, o que somado a valores de cota
celular de toxina elevados teria resultado na alta concentração de microcistina
observada (Figura 32).
Já na amostra de novembro, foi detectada uma concentração relativamente alta de
microcistina. De fato, 100% das células de Microcystis eram potencialmente tóxicas,
mas a biomassa de Microcystis foi muito baixa. Mesmo assim, se a cota celular fosse
elevada, explicaria esta situação. Porém, estes valores foram baixos. Além disso, os
valores de equivalentes de células totais e de Microcystis não coincidiram com os dados
de contagem microscópica, nos quais foi encontrada reduzida biomassa, e muito menos
os valores de mcyB+, que foram os mais altos de todo o período analisado (Figuras 15
e 17). Portanto, estes resultados discrepantes podem ter sido decorrentes de algum
problema metodológico, ou na quantificação microscópica ou no ensaio de qPCR deste
mês.
Na amostra de dezembro, a concentração de microcistina decaiu em relação aos meses
anteriores. Nesse caso foi observada uma elevada dominância de Microcystis spp e
elevada proporção de genótipos potencialmente produtores de toxina (80%), mas a cota
celular foi baixa. Portanto, apesar de a maioria das células presentes possuir a
capacidade de produzir toxina, a produção foi baixa, resultando em baixos valores de
microcistina.
Em janeiro, foi quando se observou a menor concentração de microcistina de todo o
período. Neste mês houve dominância de Cylindrospermopsis raciborskii e reduzida
106
biomassa de Microcystis spp. A cota celular de microcistina foi baixa, apesar de cerca
de 80% das Microcystis serem potencialmente tóxicas. Com isso, a baixa concentração
de toxina observada seria resultado da baixa produção de toxina por célula. Em
fevereiro, houve dominância de Dolichospermum e baixa biomassa de Microcystis. A
concentração e toxina foi de cerca de 76 µg.L-1. Apesar da baixa proporção de
genótipos tóxicos, este fato pode ter sido compensado pela elevada produção de toxina
por célula.
Finalmente, março e abril apresentaram dinâmicas semelhantes. Nessas amostras a
biomassa de Microcystis spp foi baixa, mas todas as células eram potencialmente
tóxicas, e estavam produzindo toxina, resultando em uma elevada cota celular.
107
Figura 32- Desenho esquemático da associação entre biomassa de Microcystis (↑ indicam biomassa acima de 3 mm
3.L
-1) proporção de genótipos tóxicos (↑ indicam proporção de células tóxicas acima de
80 %), cota celular (↑ indicam cota celular acima de 0,5 ng de microcitina/10 cels) e concentração de
microcistina.
Amostragem Biomassa de
Microcystis
Proporção de
genótipos tóxicos
Cota celular por
Microcystis mcyb+
Concentração de
microcistina (ng/L)
108
Dinâmica de genótipos de cianobactérias
No Brasil, este é o primeiro trabalho que analisa a dinâmica temporal de genótipos de
cianobactérias em um reservatório. Outros trabalhos já foram realizados investigando a
diversidade de cianobactérias, por diferentes técnicas moleculares, mas não a
sucessão temporal de genótipos no ambiente. Lorenzi, 2004, utilizando DGGE para
rDNA 16S, e biblioteca de clones de rDNA 16S e cpcBA observou baixa diversidade
genética de cianobactérias. Através da análise de DGGE rDNA16S de 11 amostras
coletadas das Represas Guarapiranga e Billings – SP, em diferentes localidades e dias,
observou-se um número baixo de bandas, menor do que o número de espécies
descritas para as localidades. Através do sequenciamento de bandas excisadas do gel,
foram identificadas 15 sequências, que apresentaram identidades próximas aos dos
gêneros Microcystis, Cylindrospermopsis, Geitherinema e Synechococcus. A
construção da biblioteca de clones foi feita a partir do DNA extraído de um ponto
amostral da Represa Billings e o sequenciamento de dois clones gerados na construção
da biblioteca de clones rDNA 16S indicou a clonagem de produtos de Actinobacteria e
portanto, os dados desconsiderados. A análise da biblioteca de 84 clones de cpcBA
através de RFLP identificou sete padrões distintos de bandas. O sequenciamento de
sete clones identificou cinco genótipos de Microcystis e dois de Anabaena. Silva, 2006,
estudando 59 isolados de cianobactérias de ambientes brasileiros só obteve sucesso
na amplificação da região cpcBA de 25 linhagens, justificando esse resultado na
incapacidade dos primers descritos por Neilan et al., 1995 de amplificar a região cpcBA
de algumas linhagens brasileiras. Mártires, 2012, utilizando DGGE para rDNA16S
identificou 63 diferentes bandas, correspondendo a 17 filotipos de Planktothrix, 11
109
filotipos de Microcystis, além filotipos de Calotrix, Nostoc, Cylindrospermum,
Cylindrospermopsis e Sphaerospermopsis, a partir de amostras únicas coletadas no
período chuvoso em quatro reservatórios do Rio Grande do Norte. Neste trabalho,
identificou-se uma diversidade de filotipos maior do que os morfotipos de cianobactérias
identificados, porém 12 dos 18 morfotipos não foram reconhecidos através do DGGE
rDNA16S. Todos esses trabalhos tinham como objetivo a identificação molecular de
cianobactérias e não o estudo da dinâmica de genótipos de cianobactérias presentes
no ambiente.
Os diversos trabalhos que avaliam a diversidade molecular de cianobactérias em
ambientes naturais aplicam diferentes conceitos de genótipo. Por exemplo,
Lymperopoulou et al, 2011, e Miller & McMohan, 2011, utilizando rDNA 16S,
consideraram o mesmo genótipo sequências com mais de 98% de identidade. Já
Briand et al, 2009 e Bozarth et al., 2010, utilizando como marcador a região 16S-23S
ITS, consideraram o mesmo genótipo somente sequências com 100% de identidade,
enquanto Kim et al., 2006, utilizando cpcBA, adotaram 98% de identidade para agrupar
sequências. No presente trabalho, foram consideradas como pertencentes ao mesmo
genótipo sequências com identidade acima de 99,7%. Este valor foi escolhido ao invés
de 100%, de forma a admitir que algumas diferenças podem se dever a erros nos
processos de amplificação e sequenciamento. Considerando a região de sequência
utilizada nos alinhamentos e análise de cluster, 99,7% corresponde a até 2 pares de
base distintos. Portanto, foram agrupados no mesmo genótipo sequências com até 2
pares de base diferentes.
110
A escolha dos marcadores utilizados e do grau de identidade adotado nos diferentes
trabalhos está intimamente relacionada aos objetivos de cada estudo. Trabalhos que
buscam fazer a identificação molecular de cianobactérias presentes em um dado
ambiente, usualmente agrupam sequências com identidade de até 98%. Já trabalhos
que buscam, como este, avaliar a dinâmica temporal ou espacial de genótipos de
cianobactérias durante florações utilizam critérios mais restritos, justamente com o
intuito de revelar a diversidade intraespecífica.
Foi observada baixa cobertura de amostragem nas amostras dos diferentes meses. A
baixa cobertura de amostragem é bastante comum em bibliotecas de clones de
procariotos, devido à elevada diversidade de genótipos procarióticos (Kemp & Aller,
2004). Lymperopoulou et al., 2011, estimaram uma cobertura da diversidade de
cianobactérias presentes através da análise de rDNA16S próxima a 90%. Miller &
McMohan, 2011, estudando 4 lagos americanos, recuperaram 271 sequências de
cpcBA e estimaram uma cobertura de amostragem elevada, de 74 a 100%.
A diversidade de genótipos encontrada também foi avaliada utilizando o índice de
Shannon-Winner. As amostras onde foi observada a maior diversidade foram as de
novembro, dezembro e abril (2,41, 2,4 e 2,03 respectivamente), devido ao elevado
número de sequências únicas e os menores valores foram observados em amostras de
outubro e janeiro (1,57 e 1,62). Os valores encontrados neste estudo são próximos ao
descrito por Lymperopoulou et al., 2011, que reportou índices de 1,2 a 2,5 e mais
elevados dos que o reportado por Bozarth et al., 2011, que encontrou índices variando
entre 0,48 a 1,93. Portanto, a baixa cobertura de amostragem se deve a elevada
diversidade de genótipos presentes no reservatório do Funil.
111
No presente trabalho, foram identificados no total 58 genótipos de cianobactérias.
Comparado a outros trabalhos que avaliam a diversidade de cianobactérias a partir de
amostras ambientais, pode-se considerar o número de genótipos encontrados em único
ponto, em sete coletas mensais, elevado.
Vareli et al., 2009, identificaram, através de DGGE da sequência intergênica (ITS)
rDNA16S-23S, a partir de coletas mensais durante um ano em um reservatório na
Grécia, 72 bandas distintas. Kardinaal et al., 2007 no estudo de três lagos
hipereutróficos, com coletas quinzenais, utilizando DGGE ITS rDNA 16S-23S,
identificaram no total 106 bandas distintas. Destas, 40 foram extraídas e sequenciadas
e 20 obtiveram elevada similaridade com sequências do gênero Microcystis,
correspondendo a 12 genótipos distintos. Lymperopoulou et al., 2011, também
estudando um reservatório na Grécia, identificaram através de duas coletas em quatro
pontos amostrais, utilizando rDNA 16S, 63 filotipos. Yoshida et al., 2009, em três
amostras coletadas em diferentes momentos de um lago no Japão reportaram a
presença de 12 genótipos de Microcystis, a partir da construção da biblioteca de clones
de rDNA16S específico para Microcystis. Miller &McMahon et al., 2011 estudando
quatro lagos nos Estados Unidos descreveram a presença de 24 distintos genótipos de
cianobactérias. Bozarth et al., 2010 a partir de 6 amostras coletadas em diferentes
datas de um reservatório na Carolina do Norte, EU, identificaram 61 genótipos de
Microcystis. Contudo, alguns trabalhos, que utilizam como marcador o ITS (16S-23S)
reportam diversidade de genótipos superior a encontrada no presente trabalho. Xu et
112
al.,2011 reportou a presença de 236 genótipos de Microcystis identificados a partir de
30 amostras coletadas em um rio na China. Briand et al., 2009, a partir de amostras
coletadas quinzenalmente em seis pontos durante quatro meses, identificaram a
presença de 306 genótipos de Microcystis.
A maior parte das sequências recuperadas, em todos os meses amostrados, foram do
gênero Microcystis, cerca de 82% (Figura 23) De acordo com a análise microscópica
este gênero está presente em grandes proporções ao longo de todo o período
analisado (Figura 15). Associado a isto, pode-se atribuir esta recuperação elevada de
sequências, uma alta eficiência de amplificação de sequencias cpcBA deste gênero,
utilizando estes primers.
Através do diagrama gerado pela análise de médium joining foi possível observar a
relação entre as sequências de Microcystis identificadas neste estudo (Figura 24).
Formaram-se 3 grandes grupos de genótipos distintos (M1, M2 e M3), e vários
genótipos únicos intimamente relacionados a estes três. Outros trabalhos que utilizaram
esta análise também reportam a presença de diversos genótipos únicos relacionados
aos genótipos dominantes (Briand et al., 2009, Bozarth et al., 2011). Briand et al., 2009
atribuíram esse fato a possíveis artefatos da PCR, mas também como reflexo da
elevada microdiversidade dentro de populações de Microcystis. Komárek (2010)
destaca a elevada diversidade de espécies do gênero Microcystis, tanto em relação à
morfologia, quanto à fisiologia e genética. A elevada microdiversidade já foi descrita em
cianobactérias do gênero Prochlorococcus, associando essa característica à presença
de diferentes ecotipos, capacitando esse gênero a sobreviver em diferentes condições
ambientais (Moore et al., 1998).
113
A sucessão temporal de genótipos de Microcystis já foi acompanhada em diversos
trabalhos. (Briand et al., 2009, Bozarth et al., 2010, Xu et al., 2011, Pobel et al.,2012).
Como observado no presente estudo, coexistem e alternam-se ao longo de uma
floração diferentes genótipos de Microcystis. Briand et al., 2009 observaram a
predominância de quatro genótipos e a mudança na proporção entre esses genótipos
ao longo do tempo. Antes do estabelecimento da floração, havia a dominância de dois
genótipos, ao passo que no pico da floração a dominância foi de outro genótipo. Pobel
et al., 2012 em amostragens semanais, observaram elevada variação temporal nos
genótipos presentes. Contudo, não foi observada a seleção de genótipos ao longo da
floração, apesar de detectarem uma estabilidade da população no platô da floração de
Microcystis. A coexistência de diferentes genótipos ao longo das florações sugere que
exista um processo de seleção balanceadora, que permite a manutenção da elevada
diversidade em populações de Microcystis.
Os genótipos M1, M2 e M3 foram os genótipos presentes em maior número de
amostras (Figura 22). O genótipo M1 esteve presente em todas as amostragens, com
grande contribuição na amostra de outubro. A presença e abundância deste genótipo
foram correlacionadas positivamente com a concentração de microcistina, indicando
que potencialmente este pode ser um genótipo tóxico de Microcystis (0,77 p<0,05). Não
foi possível associar a presença e abundância de um genótipo à dominância de
Microcystis, Cylindrospermopsis ou Dolichospermum. Os genótipos M2 e M3 estiveram
presentes na maioria das amostras analisadas enquanto os outros genótipos estiveram
presentes somente em algumas amostras.
114
O genótipo predominante de Cylindrospermopsis , esteve presente em janeiro, março e
abril. Em janeiro, quando se observou dominância de C. raciborskii, alcançando elevada
biomassa (Figura 15), só foi identificada a presença de um único genótipo, ao passo
que em abril, quando a biomassa fitoplanctônica foi baixa, identificou-se 6 diferentes
genótipos de Cylindrospermopsis (Figura 15). Com isso, pode-se levantar a hipótese de
que o estabelecimento da floração de C. raciborskii estaria associado ao sucesso de
um genótipo característico. De nosso conhecimento, não existem trabalhos que
descrevam a variação de genótipos de Cylindrospermopsis ao longo de uma floração e
a maioria de trabalhos nesta área são relacionados a florações de Microcystis.
Finalmente, a elevada diversidade de genótipos e a falta de correlação destes com
variáveis ambientais pode estar relacionada a diversos fatores. Um deles é o grande
intervalo entre as amostragens, o que dificulta a compreensão de fenômenos que no
ambiente ocorrem de forma muito dinâmica. Pobel et al., 2012 realizaram coletas
semanais e observaram grande diferenças entre a diversidade de genótipos de
Microcystis das amostras, revelando que a substituição de genótipos é um processo
bastante dinâmico. Além disso, não foi avaliada a interação com outras comunidades
planctônicas, como zooplâncton, bactérias heterotróficas e cianofagos, que podem
influenciar na densidade e composição de genótipos de populações de cianobactérias.
115
7- Perspectivas
O presente trabalho, mais do que avaliar dinâmica de cianobactérias no Reservatório
do Funil, levanta a importância na análise de florações de cianobactérias através de
diferentes abordagens. As florações de cianobactérias são fenômenos complexos e
existe a necessidade de se dedicar maiores esforços em estudos da dinâmica de curto
prazo e também acerca da interação entre diferentes espécies/linhagens. Neste
contexto, o estudo da dinâmica de coexistência e substituição de espécies e/ou
linhagens de cianobactérias deve ser explorado levando-se em consideração o efeito
de variáveis bióticas, como a influência da comunidade bacteriana e viral, além das
interações interespecíficas de cianobactérias.
8- Conclusões
- Foi observada dominância de cianobactérias ao longo de todo o período estudado. A
elevada biomassa de cianobactérias esteve positivamente correlacionada com o pH e a
concentração do íon amônio e negativamente correlacionada com a concentração de
nitrogênio inorgânico dissolvido.
- A identificação de morfotipos revelou 12 táxons de cianobactérias, sendo que os
gêneros mais abundantes ao longo de todo o período foram Microcystis,
Cylindrospermopsis, Dolichospermum, que se alternaram em dominância em diferentes
momentos. Em concordância, através da análise molecular, foram identificados 4
116
gêneros/espécies de cianobactérias: Microcystis, Cylindropermopsis raciborskii e
Dolichospermum e Pseudoanabaena.
- Foi detectada microcistina em todas as amostras, incluindo 3 variantes: LR, RR e YR.
- Não foram detectadas células de Dolichospermum potencialmente produtoras de
microcistina, indicando que Microcystis foi o gênero responsável pela produção de
microcistina no Reservatório do Funil neste período.
- Observou-se elevada variação temporal da proporção de genótipos de Microcystis
potencialmente produtores de microcistina, com variação de 9 a 100%.
- Não foi encontrada correlação positiva entre a concentração de microcistinas e
proporção de genótipos potencialmente tóxicos nem abundância de células mcyB+.
- O uso da abordagem molecular foi interessante pois revelou a diversidade genética
dos grupos dominantes de cianobactérias formadoras de floração no Reservatório do
Funil.
- A maior diversidade de genótipos foi observada no gênero Microcystis, o que permitiu
acompanhar sua dinâmica temporal, revelando genótipos prevalentes e numerosos
assim como genótipos únicos e mais raros.
- O marcador molecular cpcBA mostrou-se útil para distinguir gêneros e para revelar a
diversidade intraespecífica, porém não separou espécies no gênero Microcystis.
117
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Anexo 1 - Táxons identificados nas amostras coletadas no
reservatório do Funil
Aphanocapsa delicatissima
Aphanocapsa incerta
Chrococcus minimus
Cyanodictyon imperfectum
Cyanogranis ferruginea
Cylindrospermopsis raciborskii
Dolichospermum sp.
Microcystis aeruginosa
Planktolyngbya limnetica
Pseudanabaena minima
Sphaerocavum brasiliense
Synechococcus nidulans
Cryptomonas brasiliense
Trachelomonas volvocina
Aulacoseira cf. granulata
Cyclotella meneghiniana
Chlorella minutissima
Chlorycistissp
Chlorophyceae NI 1
Monoraphidium circinale
Monoraphidium contortum
Scenedesmus sp
134
Anexo 2- Sequências utilizadas nas árvores filogenéticas construídas
neste trabalho
Espécie Número de acesso GenBank
Anabaena circinalis AF426012.1
Anabaena spiroides AY702234.1
Anabaena variabilis AY768465.1
Aphanizomenon ovalisporum JN903640.1
Aphanizomenon sp FJ234877.1
Aphanocapsa montana DQ010411.1
Cyanothece sp CP001344.1
Cylindrospermopsis raciborskii AM502049.1
Dolichospermum crassum JN903641.1
Microcystis aeruginosa AF195174.1
Microcystis aeruginosa AM048615.1
Microcystis aeruginosa AM048616.1
Microcystis aeruginosa AY568690.1
Microcystis aeruginosa EU014151.1
Microcystis aeruginosa EU448302.1
Microcystis aeruginosa EU643825.1
Microcystis aeruginosa FJ801041.1
135
Microcystis aeruginosa HM020416.1
Microcystis aeruginosa JN226766.1
Microcystis aeruginosa JN226766.1
Microcystis aeruginosa JN688260.1
Microcystis aeruginosa JQ937254.1
Microcystis flosaquae AF195161.1
Microcystis sp AY524851.1
Microcystis viridis AF385383.1
Microcystis viridis JF798342.1
Microcystis wesenbergii AF385389.1
Microcystis wesenbergii GQ379237.1
Microcystis wesenbergii GQ379244.1
Microcystis wesenbergii GQ379249.1
Pseudanabaena sp M99426.1
Raphidiopsis brookii ACYB01000020.1
Sphaerocavum brasiliense FJ801047.1
Synechococcus sp CP000097.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechococcus sp FR715492.1
Synechocystis sp CP003265.1
136
Anexo 3 – Curva de calibração dos primers utilizados nos ensaios de
qPCR