Human-Human Hybridoma Autoantibodies with Both

Anti-DNA and Rheumatoid Factor Activities

Aluna: Paula Fernandes CarneiroProfessor: Michel Gantus

Artrite reumatóide• Artrite reumatóide (AR) - doença inflamatória crônica

caracterizada por poliartrite simétrica, principalmente das mãos, associada à rigidez matinal e fadiga.

• Em alguns casos outros órgãos e sistemas, além das articulações, podem estar envolvidos, como os olhos (uveíte), pulmões (pneumonite), glândulas salivares e lacrimais (síndrome de Sjögren) e sistema nervoso periférico (neuropatias).

• Cerca de metade dos pacientes com AR apresentam incapacidade para o trabalho após dez anos de doença.

• Nos casos de quadro clínico progressivo e inflamação persistente pode ocorrer morte prematura.

• Diagnóstico precosse – tratamento mais eficiente - impedir a incapacidade na maioria dos pacientes.

• 0,5% a 1% da população. • AR - início - qualquer idade - maior incidência: mulheres entre 40 e 50

anos. • 5 mulheres – 2 homens.• Membrana que envolve a articulação (sinovial) - processo

inflamatório intenso caracterizado por hipertrofia do tecido e transformação funcional das células componentes desta membrana, os sinoviócitos.

• membrana sinovial normal – 1 camada de tecido Inflamada – até 10 camadas (macrófagos e fibroblastos

transformados)

Lúpus eritematoso sistêmico• 2 formas: • 1) não apresentar erupções cutâneas, porém compromete os

órgãos internos e é a forma mais grave da doença.• O processo inflamatório sistêmico é capaz de afetar articulações,

pele, pleura, pericárdio, sistema nervoso central, rins, coração, pulmões e outros órgãos.

• lúpus eritematoso cutâneo crônico (discóide) - envolvimento cutâneo (geralmente na face) - erupção em forma de “asa de borboleta” e/ou pápulas eritematosas, escamosas, que formam lesões anulares na cabeça e/ou partes do corpo quando expostas ao sol.

• lúpus – início - febre, perda de peso, fadiga, mal-estar.• etiopatogenia do lúpus - conjugação de fatores genéticos e

ambientais envolvidos em sua eclosão.• fatores genéticos - hormônios sexuais e anormalidades

imunológicas. • fatores ambientais - drogas; luz ultravioleta (UV); infecções

viróticas e bacterianas; estresse , fatores étnicos e sócio-econômicos - colaborar para desencadear ou exacerbar o início da doença.

• Lúpus - quadro clínico crônico - longa duração e sem cura efetiva - alternando entre períodos de atividade e remissão do quadro.

Introdução• Fator reumatóide (FR) - anti-imunoglobulinas IgG – reação

com IgG autólogos e heterólogos.• FR - 70% dos pacientes com artrite reumatóide (AR), 30%

dos pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) e em pacientes com outras doenças do tecido conjuntivo.

• FR - pode ser encontrada em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, como tuberculose, hanseníase, sífilis, endocardite subaguda, e salmonelose, e em outros condições associadas com hipergamaglobulinemia ou imunocomplexos circulantes.

• A origem e a função dos anticorpos antiimmunoglobulinas (FR) - desconhecida.

• Estudos sobre FR monoclonais e policlonais isolado do soro têm mostrado que a FR pode reagir com uma variedade de outras substâncias que IgG, incluindo grupos de nitrofenil e desnaturar DNA (dDNA), nucleossomas, complexo nucleoproteíco DNA, as histonas, etc.

• A base do estes reação cruzada é difícil de explicar, uma vez que estes antígenos não parecem apresentar uma homologia estrutural significativa com IgG.

• Hibridoma de autoanticorpo Homem-humano, derivados de pacientes com AR e LES - isolar e analisar FR monoclonal individuais e determinar suas reatividade com outros antígenos.

• A natureza das reações cruzadas destes anticorpos hibridoma com diferentes antígenos pode fornecer informações importantes sobre as propriedades do sítio de ligação do antígeno e os mecanismos responsáveis pela produção e patogenia de tais anticorpos.

Métodosfusão

Seleção de hibridomas produtores de auto-anticorpos para dDNA, nDNA e Fc

RIA em fase sólida para a ligacao do anicorpo a dDNA e nDNA

Competição de ligação do FR hibridoma para tubos revestidos por Fc HIgG, dDNA e BSA

Preparação de imunoglobulinas

Purificação de fragmentos de Fac e Fc de IgG humana

RIA em fase sólida para IgG de FR

Focalização isoelétrica de hibridomas de auto-anticorpos

Resultados

• A fusão de LSP de 4 pacientes com AR e 5 pacientes com LES com o linfoblasto GM 4672 - 262 clones de hibridomas.

• AR - 4 fusões - 167 clones2 anti-DNA 1 FR6 anti-DNA e RF.

• LES - 5 fusões com - 95 clones3 anti-DNA0 FR5 anti-DNA e RF

• A freqüência de clones de produzir tanto anti-DNA e RF foi 6 / 167 (4%) para a AR e 5 / 95 (5%) para LES.

Produção anticorpos de hibridomas anti-DNA e

FR através de pacientes com LES e AR.

Ligação de anticorpos hibridoma para dDNA e nDNA

• RA8 dDNA2 nDNA

• SLE8 dDNA2 nDNA

RIA em fase sólida para anticorpos IgM e fragmentos Fc

• RA – 3 fracos• SLE – 1 náo vincula Fc

Competição de ligação do hibridoma RFpara tubos de Fc-

revestidopor hIgG, dDNA e BSA

• Competição HIgG e dDNA, mas não pela BSA.

• A) HIgG foi melhor competidor que dDNA.

• B) dDNA foi melhor competidor que HIgG.

• hibridoma que não reage com dDNA.

Focalização isoelétrica

Discussão• hibridoma humano - anti-DNA e FR. • Dos 262 hibridomas - pacientes com AR e LES - 17 hibridomas - dDNA e fragmento

Fc de IgG humano.• Ligação - dDNA e Fc – anticorpo monoclonal - focalização isoelétrica géis e

imunoabsorção .• A dupla reatividade dos auto-anticorpos - experimentos de competição. • Estes ensaios de competição apoiam a visão de que uma auto-anticorpos pode ter

reatividade dupla. • Os resultados do presente trabalho fornecer suporte para sitios de ligação de

antígenos para dDNA e HIgG que estão próximas e, eventualmente, se sobrepõem.

• A elucidação da base molecular da reação cruzada de anticorpos é essencial para a compreensão do potencial de reatividade antigênica desses anticorpos in vitro e in vivo.

• O uso de anticorpos hibridoma oferece o potencial para designar verdadeira reação cruzada desses anticorpos e, finalmente, definir o antígeno relevante nestas doenças auto-imunes.

Obrigada!