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Desafios da Biologia Molecular

em Análises Clínicas

José Manuel Cabeda

Genefadi Farmacêutica, LdaUniversidade Fernando Pessoa

Centro Hospitalar do Porto

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Áreas de Aplicação

• Situações Congénitas– Genéticas

• Diagnóstico• Diagnóstico pré-natal

– Epigenéticas

• Farmacocinética– CYP450

• Doenças adquiridas– Microbiologia

• Diagnóstico• Diagnóstico pré-natal• Resistência Fármacos• Genotipagem agente• Genotipagem

hospedeiro• epidemiológico

– Oncologia• Diagnóstico• Prognóstico• Follow-up

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AplicaçõesIdentificação agentes Infecciosos

Vírus• HSV1/2• EBV• CMV• VZV• HHV-6• Enterovirus• HIV• HBV• HCV• HTLV-1• HPV• Poliomavirus (JCV e BKV)

Resistências• Meticilina• Glicopeptídeos• Rifampicina • Isoniazida• Antiretrovirais

Bactérias– Micobacterium

tuberculosis– Leptospira spp– Pneumonias atípicas

• Legionella pneumophila

• Micoplasma pneumoniae

• Chlamydia pneumoniae

– Staphylococcus spp.– Enterococcus spp.– Helicobacter pylori– Clostridium difficile

(tcdA,tcdB)– Bordetella pertussis– Borrelia burgdorferi– 16S rDNA

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AplicaçõesIdentificação Agentes Infecciosos(II)

Enterovírus

HSV

Positivas13%

Negativas87% Negativas

56%

Positivas44%

B.burgdorferi M.tuberculosis

M.pneumoniaeLeptospiras

C.PneumoniaeH.pylori

Leptospira Bordetella pertussis

C.Difficile tcdA/tcdB Micobactérias

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AplicaçõesIdentificação Resistências a drogas

Estirpe Tmelting (ºC)Wild - type 61.5

Mut (A2142C) 58.0Mut (A2142G) 53.0Mut (A2143G) 53.6

Claritromicina (23S rDNA)

BACTÉRIA RESISTÊNCIA MUTAÇÕES

Mycobacterium

tuberculosisRifampicina

rpoB 526(CACGAC) 531 (TCGTTG) 533 (CTGCCG)

IsoniazidakatG 315 (AGCACC) 315 (AGCAAC)

Helicobacter pylori

Claritromicina 23S rDNA

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AplicaçõesOncologia

• Quantificação Transcritos– bcr/abl

• Detecção Translocações– bcr/abl– pml/rar– aml/eto– Inv16– Bcl1/IgH– Bcl2/IgH

• Detecção Mutações oncológicas– BRCA1/BRCA2– P53– etc

• Resistência Drogas– Mutações bcr/abl

• Clonalidade– Linf. T (/ ou /)– Linf. B

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Alterações genéticas associadas a patologias onco-hematológicas

• Translocações envolvendo os genes do TCR e Ig

• Genes hibridos resultantes de translocções

• Delecções• Inversões• Mutações pontuais• Alterações do padrão de metilação

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Translocações envolvendo os genes TCR e Ig

Translocações envolvendo os genes do TCR e das Ig

Translocação Doença Gene afectado IgH t(8;14)(q24;q32) Burkitt C-Myc t(11;14)(q13;q32) LNH-manto bcl-1 (CCND1/PRAD1) t(14;18)(q32;q21) LNH-foliculares bcl-2 (apoptose) t(14;19)(q32;q13) LLC-B bcl-3 (ciclina?) t(3;14)(p27;q32) t(5;14)(q31;q32) LLA-pre B IL-3 (citocina)

IgK t(2;8)(p12;q24) Burkitt t(2;3)(p12;q27) LNH-célula grande bcl-6 (zinc-finger)

Ig t(8;22)(q24;q11) Burkitt

t(3;22)(q27;q11)

TCR- t(1;14)(p32;q11) Tal-1

t(10;14)(q24;q11) LLA-T TCL-3 (Hox11) t(11;14)(p14;q11) LLA-T Rhombotin 1 t(11;14)(p13;q11) LLA-T Rhombotin 2 (TCL-2) t(8;14)(q24;q11) LLA-T C-Myc

TCR-ß t(1;7)(p32;q35) LLA-T t(7;9)(p34;q32) LLA-T Tal-2 t(7;11)(p35;p13) dominio LIM t(7;9)(q34;q34.3) LLA-T & LNH TAN-1 t(;7)(q34;q34) LLA-T lck t(7;19)(q34;p13) LLA-T LYL1

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Genes hibridos resultantes de translocções

Translocação Doença Genes afectados t(9;22)(q34;q11) LMC;LLA adulto/LMA abl bcra t(15;17) (q22;q21) LMA-M3 PMLb RARd t(11;17)(q35;q21) LMA-M3 PLZFc RARd t(5;17)(q35;q21) NPMe RARd t(8;21)(q22;q22) LMA-M2 ETOc AML1 Inv(16)(p13;q22) LMA-M4Eo MYHf CBFBg t(6;9)(p23;q34) LMA,LMA-TdT+ DEK CAN inv(3)(q21;q26) LMA-M1 EVI1c t(3;3)(q21;q26) t(1;9)(q23;q13) LLA-pre B PBX1h E2A t(12;21)(p13;q22) LLA-prec.B infantis TEL AML1 t(2;5)(p23;q35) LNH-anaplásico ALKa NPMe t(4;11)(q21;q23) LLA-pre B ALLc AF4i t(1;11)(q32;q23) LAM AF1Pe t(6;11)(q27)(q23) LAM AF6i t(9;11)(p21;q23) LAM-M5,prec.B AF9i t(11;17)(q23;q21) LAM AF19 t(11;19)(q23;p13) LAM,LLA-prec. B ENLi t(8;13)(p11;q12) sindrome mieloproliferativo ZNF198 FGFR-1 a) tirosina cinase b) guanosina trifosfatase c) zinc finger d) receptor acido retinoico e) fosfoproteina f) gene da miosina g) factor de transcrição h) gene homeótico i) transdução de sinal

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Bcr/abl

Os genes BCR e ABL normais, e as translocações que originam as proteínas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. A proteína p210 é característica da CML, sendo a p190 a proteína BCR-ABL encontrada na maioria dos casos de ALL

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pml/rar

A localização cromossómica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocação t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.

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Doenças Monogénicas

• Hemocromatose (HFE)• -Talassémia (HBB)• -Talassémia (HBA)• Anemia falciforme

(HBB)• Doenças raras (IGM)• Paramiloidose• etc

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Doenças multifactoriais

• Trombose Venosa– FV-leiden– Protrombina

• Trombose Arterial– MTHFR– PAI-1

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Breve História

• Anos 70-80– Métodos Hibridização– Sequenciação

• Anos 90– Automat. Extracção– Boom PCR

• Sec XXI– Real-Time-PCR– Pirosequenciação– Lab-on-a-chip

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Desafios e SoluçõesPreparação de Ácidos

NucleicosRápida, sensível, automática, fluxo contínuo

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Desafios e Soluções

Amplificação de Ácidos Nucleicos

Rápida, sensível, automática, fluxo contínuoK.MullisPrémio Nobel Química1993

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

Num

ber o

f pub

licat

ions

1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004Year of publication

Number PCR related publications

PCR (Research) PCR (Diagnostics)Real-Time-PCR (Research) Real-Time-PCR (Diagnostics)

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Desafios e Soluções

Amplificação e detecção simultâneas:

Real-Time

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Desafios e Soluções

Quantificação e Genotipagem:Real-Time

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Desafios e SoluçõesSequenciação:

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Desafios e SoluçõesEstudos Epidemiológicos

estirpes(Caracterização global de

genomas)

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“Novos” Desafios

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Desafio #1Near Patient testing

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Desafio # 2Aplicação Generalista

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Microchips

Desafio # 2Aplicação Generalista

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Multiplexing

Desafio # 2Aplicação Generalista

ID-Tag Mass-Tag In-chip PCR

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Desafio # 2Volume da amostra

Miniaturização

Menor custo Maior rapidez

Menor Volume

Menos Amostra utilizada

Mais testes exequíveis

Resultado com Menor

significado clínico

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Desafio # 2Aplicação Generalista

Septifast 16S rDNA + Sequenciação

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Agradecimentos:

a equipa da UBM-HGSA

• José Manuel Cabeda• Ana Constança Mendes• Sandra Fernandes • Mónica Pereira• Cristina Correia• Paulo Brochado• João Rodrigues• Maria Luís Amorim

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Equipa sempre renovada

• Alexandra Estevinho (HUC)• Anabela Silva (INSA)• André Fernandes (UCP)• Angela Santos (IPO)• Angélica Ramos (UA/IPATIMUP)• António Amorim (ICBAS)• Carla Cardoso (Bioportugal)• Carla Simões (IBMC)• Dora Bastos(UCP)• Elsa Lima (UCP)• Fernando Branca (Iberlab)• Filipa Ferreira (Est.TSS)• Francisco Dias (HGSA)• João Paulo (UCP)• Sónia Esteves(Lab. Pes.

Moreira)• Patricia Trabulo (ESTS

Bragança)• Luisa Boaventura (HUC)• Bruno Costa (ESTS Bragança)• Cristina (Estag. TSS)• José Miguel Oliveira (Hol.)• Margarida Monteiro (HPH)• Maria João Pinho (UM)

• Mariana Moreira(Genefadi)• Paula Carneiro (HGSA)• Paula Santos (UCP)• Pedro Mendonça (Açores)• Ruben (UCP)• Lara (UCP)• Helena Sofia Domingues (ICBAS)• Susana Moreira (ICBAS)• Susana Rocha (U.Minho)• Tânia Simões (U.Aveiro)• Vitória (UCP)• Pedro (UCP)• Bruno Roma (U.Pernambuco)• Renata Arruda (U.Pernambuco)• Maria Claudia Vicalvi (U.Pern.)• Claudia Carvalho (ICBAS)• Teresa (UMinho)• Nuno Canhoto (H.Évora)• Luisa Cavaleiro (H.Pedro Hisp.)• Carina Valente (ESTS Porto)• Fernando Alves (UFP)• Agostinho Pedro (UFP)• David Nunes (UFP)

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Aplicações