guião do aluno versão b

8/7/2019 Guio do aluno verso B

1/34

Guio do aluno

VERSO B


2/34

Guio do Aluno

2

NDICE:

Introduo... 3

Parte I Enquadramento terico da actividade 4

Parte II Problematizao da actividade... 9

Parte III Procedimentos protocolares........................................... 12

Parte IV Anlise e discusso dos resultados.. 16

Parte V Actividades complementares... 17

Parte VI Glossrio. 26

Apndices. 28

Referncias Bibliogrficas.... 34


3/34

Guio do Aluno

3

Introduo

O kit BioExperimentando uma actividade prtica, de laboratrio, que se baseia numa

simulao de uma triagem gentica numa famlia que possui uma doena hereditria fictcia. Nesta

actividade pretende-se que se integre a compreenso de processos genticos, com as tcnicas associadas,

e as respectivas questes ticas.

Os alunos tero que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente,

atravs da anlise das amostras de DNA, aps restrio e separao electrofortica.

O kitBioExperimentando vai permitir que o aluno:

estude a transmisso de determinada caracterstica hereditria, atravs de tcnicas de

Engenharia Gentica;

analise e interprete casos de mutao, sua gnese e consequncias;

explore procedimentos laboratoriais de manipulao do DNA;

compreenda a importncia e modo de funcionamento das enzimas de restrio;

manipule o material de laboratrio de forma autnoma e responsvel;

desperte a curiosidade relativa metodologia desta investigao;

compreenda a utilidade de algumas tcnicas utilizadas em Engenharia Gentica no

quotidiano dos cidados;

use o pensamento crtico para resolver problemas;

discuta algumas questes ticas inerentes manipulao do DNA.

Este kitfoi concebido para alunos do Ensino Secundrio do Curso de Cincias e Tecnologias do

12ano, no mbito da disciplina de Biologia.

KitBioExperimentando (verso B)

Etapas de implementao Vantagens da utilizao Ajuda a ensinar

Cultura de bactrias

Extraco do DNA

plasmdico

Introduo aos perfis de

DNA

Restrio das amostras

de DNA

Electroforese em gel de

agarose

Anlise e interpretao

de resultados

Preparao e manuteno de culturas

de bactrias.

Aquisio de tcnicas laboratoriais na

rea da microbiologia e da biologia

molecular.

Uso de enzimas de restrio reais e

realizao de electroforese com

fragmentos de DNA real.

A actividade pode ser realizada em trs

sesses de 90 minutos (no entanto o

professor poder reajustar o tempo).

Material suficiente para 23 alunos.

Preparar meios de cultura

Extrair DNA plasmdico

Estrutura do DNA

Hereditariedade clssica

Mendeliana (autossmica ou

ligada ao sexo)

Anlise de restrio do DNA

Preparar um gel de agarose para

electroforese

Determinar o tamanho molecular.

Simulao de perfis de DNA

Anlise de mapas de restrio

Questes ticas inerentes aos

testes genticos.


4/34

Guio do Aluno

4

Medidas de segurana

No permitido comer, beber ou fumar no laboratrio/rea de trabalho.

recomendado a utilizao de luvas e de uma bata de algodo.

Os alunos devem lavar as mos com gua e sabo antes e depois da actividade.

Se alguma soluo entrar em contacto com os olhos, estes devem ser imediatamente lavados

com gua.

Parte I Enquadramento terico da actividade

A anlise de DNA humano tem aplicaes em duas grandes reas:

1. Cuidados de sade inclui o diagnstico de doenas hereditrias, mutaes cromossmicas e cancro.

2. Sistema judicial identificao de suspeitos em casos criminais (homicdio, rapto, roubo) e anlise

de relaes familiares em casos de disputa da paternidade e de imigrao.

Na presente actividade simula-se o diagnstico de uma doena fictcia, que afecta vrios membros de uma

famlia. So vrios os conceitos e tcnicas inerentes implementao e compreenso da actividade:

Cultura de bactrias

As bactrias so conhecidas desde 1674, sendo a sua estrutura ainda objecto de estudo. So os

seres vivos mais simples do ponto de vista estrutural, e os de menor tamanho. As bactrias so

microorganismos unicelulares, procariontes.

A cultura de bactrias o crescimento de colnias de microorganismos induzida pelo Homem

para facilitar o seu estudo. Para a realizao de uma cultura bacteriana, precisamos de um inoculo e deum meio de cultura. Os meios de cultura podem ser de dois tipos: meios lquidos ou meios slidos. Os

meios lquidos so normalmente utilizados para enriquecimento das bactrias, enquanto que os meios

slidos so utilizados para o seu isolamento. O meio de cultura permite a nutrio, o crescimento e a

multiplicao dos microorganismos do inoculo. Os meios de cultura so seleccionados consoante o tipo

de bactria. As bactrias multiplicam-se em meios de cultura apropriados desde que sejam respeitadas

as condies de temperatura, pH, humidade e composio.

Um bom meio de cultura deve possuir as seguintes caractersticas:

- Um teor de humidade entre os 75% e os 95%.

- Os nutrientes necessrios- Possuir um pH adequado

- Ser estril

- Possuir as propriedades fsicas desejveis (lmpido, lquido, slido)

Os meios de cultura podem ser usados na seleco e crescimento de um determinado microrganismo

ou na identificao de uma espcie em particular. Desta forma, a funo de um dado meio depende da

sua composio. O isolamento de uma determinada estirpe bacteriana pode ser feito atravs do recurso

e/ou combinao dos seguintes tipos de meios:


5/34

Guio do Aluno

5

Meios selectivos suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefcio de

outros.

Meios diferenciais permitem a distino entre diferentes grupos de microrganismos com base

na capacidade de metabolizar componentes especficas do meio de cultura ou na morfologia

(aparncia) das colnias. Permitem, por vezes, a identificao de microrganismos com base nassuas caractersticas biolgicas.

No apndice I Guia prtico de microbiologia, ou no site www.bioexperimentando.blogspot.com

encontra-se informao necessria preparao de diferentes meios de cultura para estirpes

de E.coli.

Manuteno de estirpes de E. coli

H diferentes mtodos para manuteno de estirpes de E.coli, dependendo do tempo de

armazenamento que se deseje. Os stocks de glicerol e as culturas Stab permitem um longo tempo de

conservao das bactrias, enquanto que placas de agar podem ser usadas para um perodo de

manuteno mais curto.

O kitBioExperimentando fornece as bactrias em cultura Stab. Para que possa implementar o

trabalho experimental do kitvrias vezes, com menos custos, necessrio manter as culturas de bactrias

viveis. Para tal, aps a recepo das primeiras bactrias em cultura Stab, proceda como sugerido no

ponto 1 dos procedimentos protocolares. Aps a incubao das bactrias em meio lquido durante a noite,

poder manter novas culturas em placas de agar, ou em cultura Stab. Os procedimentos para a

realizao dos meios de cultura para placas de agar ou cultura Stab encontram -se no apndice I Guia

prtico de microbiologia, ou no site:www.bioexperimentando.blogspot.com

Extraco de DNA plasmdico

A lise enzimtica, tambm denominada Mtodo de fervura ou Boiling lysis um mtodo rpido

utilizado para extraco do DNA plasmdico, especialmente recomendado para um grande nmero de

culturas de E.coli de volume reduzido. A qualidade do DNA plasmdico isolado inferior do que a obtida

por lise alcalina, mas suficiente para anlise de restrio. As bactrias sofrem lise atravs do tratamento

com lisozima, Triton-X-100 e calor. A lisozima enfraquece a parede das clulas bacterianas e o calor

rompe-as. Tambm pela aco do calor desnaturado o DNA cromossmico e as protenas. As cadeias do

DNA plasmdico circular fechado no se separam uma da outra devido forma como esto entrelaadas.

O DNA cromossmico permanece ligado membrana bacteriana, e juntamente com as protenas, removido por centrifugao. O DNA plasmdico fica no supernadante, o qual precipitado com

isopropanol. Este procedimento eficaz com plasmdios pequenos (tamanho inferior a 15 kb), e com a

maioria das estirpes de Escherichia coli(excepo das estirpes de E.colique expressem a endonuclease A,

a qual no completamente inactivada pelo calor, e de que resulta a degradao do plasmdio durante a

incubao na presena de Mg2+).
http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/http://www.bioexperimentando.blogspot.com/


6/34

Guio do Aluno

6

Enzimas de restrio

As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta cidos nucleicos) ou enzimas de

restrio so enzimas que reconhecem sequncias especficas de bases no DNA e so capazes de

hidrolisar as cadeias de DNA.

Uma enzima de restrio liga-se a uma molcula de DNA e desliza ao longo da hlice at reconhecer

sequncias especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta

ento quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrio. Se um local de restrio especfico

ocorrer em mais do que um local numa molcula de DNA, a enzima de restrio ir cortar em cada um

desses locais, resultando mltiplos fragmentos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localizao

dos locais de restrio na molcula de DNA.

Quando as enzimas de restrio so usadas para cortar cadeias de plasmdios circulares de DNA, tal

como acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos so produzidos. O DNA que se cortou pode

ser observado usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose.

O gel de agarose

O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspenso de agarose numa soluo tampo e

deixando arrefecer num recipiente apropriado. A agarose deve ser previamente pesada para a

concentrao pretendida do gel e deve ser dissolvida na soluo tampo com a ajuda de uma fonte de

calor (em banhomaria ou no microondas). Assim que a soluo levantar fervura deve ser retirada da

fonte de calor, pois se deixarmos ferver a malha do gel pode ficar laxa, o que poder trazer implicaes na

electroforese e nos resultados que deveremos obter.

A soluo deve ser vertida num molde apropriado (figura 1) quando atinge uma temperatura de

cerca de 50C (ou seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mo sem nos

queimarmos).

Antes de vertermos a soluo de agarose no molde, devemos colocar as borrachas adaptadoras e

um pente junto da extremidade orientada para o plo negativo da tina de electroforese (uma vez que o

DNA ir migrar para o plo positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poos.

Aps solidificao do gel, vertemos tampo de electroforese sobre o gel, e cuidadosamente

retiramos o pente, tendo o cuidado de no danificar os poos (nunca retirar o pente sem o gel estar

submerso em tampo de electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de tampo de

electroforese sobre os poos para eliminar eventuais resduos de agarose que no tenha sido

polimerizada.

Figura 1 Gel de agarose


7/34

Guio do Aluno

7

Electroforese

A electroforese consiste em fazer migrar biomolculas por uma matriz, sob a influncia de um

campo elctrico, permitindo separ-las segundo os seus tamanhos. Esta tcnica permite analisar

fragmentos de DNA e determinar o seu tamanho.

O DNA antes de ser carregado nos poos tem que ser tratado com tampo de amostra que tem

vrias funes: d cor amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose

ou glicerol) e mantm o pH alcalino. Os fragmentos de DNA so ento descarregados em poos, no gel de

agarose, que colocado numa tina cheia de tampo de electroforese (TAE ou TBE). O tampo de

electroforese fornece condutibilidade elctrica e mantm o pH que necessrio para a manuteno da

carga e estabilidade das molculas. O carregamento dos poos um procedimento que deve ser feito com

muito cuidado para no danificar os poos do gel (figura 2). O contedo deve ser expelido da pipeta

devagar e continuamente, carregando no mbolo da pipeta at ao primeiro ponto de resistncia. Quando

sentida esta primeira resistncia, deve-se aguardar uns breves segundos antes de retirar, lentamente, a

ponta da pipeta do poo.

Aps o carregamento dos poos, ligam-se os elctrodos fonte de alimentao, determinando

previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).

A corrente elctrica passada entre os elctrodos que esto nos terminais da tina de electroforese. Desde

que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vo avanar para o plo positivo

(ctodo) quando estiverem sujeitos a um campo elctrico. No decorrer da electroforese, verifica-se junto

extremidade que contm o elctrodo negativo a libertao de H 2. Na extremidade que contm o plo

positivo observa-se a libertao de O2. Se no estiver a ocorrer a electroforese no h formao deste

gases, pelo que a observao da libertao destes gases sob a forma de bolhinhas um bom indicador

da ocorrncia ou no deste processo.

A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular atravs da qual cada fragmento

pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razo entre o que

cada fragmento de DNA migra atravs do gel inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de

bases. Aps um determinado perodo de tempo, os fragmentos menores de DNA vo migrar at mais

longe do que os maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa nica banda de

DNA. Estas bandas iro ser vistas posteriormente no gel aps o DNA ser corado.

Figura 2 Carregamento dos poos Figura 3 A electroforese


8/34

Guio do Aluno

8

Visualizao do DNA

O DNA incolor, por isso os fragmentos no gel no podem ser vistos durante a electroforese.

Corando as bandas de DNA possvel a sua localizao no gel. Habitualmente nas escolas utiliza-se o

corante Azure A: 100% incuo, e com um grau de eficcia muito elevado, j que permite uma boa

visualizao do DNA, num espao de tempo reduzido (figura 4).

Testes genticos

Um teste gentico o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar

alteraes genticas, e envolve a anlise directa do DNA.

As finalidades dos testes genticos podem ser o diagnstico, o rastreio ou a monitorizao. Os testes

genticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doena gentica, para determinar se um indivduo

portador de uma doena associada a uma mutao, para prever o desenvolvimento de uma doena

gentica, para determinar a susceptibilidade de um indivduo para uma determinada doena, ou ainda

para aplicaes na cincia forense.

Actualmente so realizados centenas de testes genticos e muitos outros esto em desenvolvimento.

Quando o gel imerso no corante Azure A, as molculas do

corante atacam o DNA que se encontram na malha do gel de

agarose. Quando as bandas ficam visveis, possvel comparar

os padres de restrio do DNA em diferentes amostras de

DNA.

Dada a relao qualidade/preo/segurana, o corante

seleccionado para esta actividade o Azure A. No caso daescola possuir transiluminador UV sugere-se a utilizao do

corante GelRed. No caso da escola possuir uma fonte de luz

azul, pode optar-se pela utilizao do GelGreen.Figura 4 Corante para o visualizao do

DNA - Azure A


9/34

Guio do Aluno

9

Parte IIProblematizao da actividade

O problema apresentado turma o seguinte:

D. Maria Sr Joaquim

Ana Andr

Paulo

Vera

Jos Rosa ManuelAgostinhoElisabete Helena Joana Antnio

MartaDianaSerafimJosefinaRuiTiagoRita

Carlos Pedro

Filho A Filho B

Figura 5 rvore genealgica da famlia Antunes

Transmisso da doena Raritose

A famlia Antunes afectada h quatro geraes sucessivas pela doena Raritose. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim,casou com o Andr, e pretendem ter um filho. Tendo o Andr conhecimento de que a famlia de Ana tem problemas com essadoena, este sugere a Ana que faam um teste gentico para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentesou portadores da doena. A rvore genealgica desta famlia encontra-se disponvel na figura 6.

Questo- problema: Ser possvel pela anlise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e Andr sero doentes?

Mulher

Homem

SexoIndefinido

Legenda


10/34

Guio do Aluno

10

Para simplificao de identificao, a cada membro da famlia ser atribudo um nmero, como mostra a

figura 6.

Parte III Procedimentos protocolares

Trabalho laboratorial:

- Material/Mtodos

- Notas para o professor

- Informao adicionalPipetagem

Electroforese

Parte IV Anlise e discusso dos resultados

Membros da famlia Antunes:

No sentido de dar resposta questo formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de

cada um dos membros da famlia Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contm parte do

gene responsvel pela doena, amplificado previamente por PCR (Reaco de Polimerizao em Cadeia).

Existem apenas dois alelos diferentes para o locus que est ser investigado. Um indivduo que seja

homozigtico para o alelo dominante (gentipo RR) ter apenas DNA do tipo R. Um indivduo que seja

homozigtico para o alelo responsvel pela doena (gentipo rr) ter apenas DNA do tipo r. Por sua vez,

1 2

20 21

5

23

3 4 876 9 10 11

18171615141312

19 22

Filho A Filho B

Figura 6 rvore genealgica da famlia Antunes

1 D. Maria2 Sr. Joaquim3 Jos

4 Rosa5 Paulo6 Elisabete7 Agostinho8 Manuel

9 Helena10 Joana11 Antnio

12 Rita13 Tiago14 Rui15 Josefina16 - Serafim

17 Diana18 Marta19 Carlos

20 Ana21 Andr22 Pedro23 Vera


11/34

Guio do Aluno

11

um indivduo que seja heterozigtico (gentipo Rr), ter DNA dos dois tipos. A amplificao da regio de

interesse do DNA origina fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.

O objectivo detectar que formas de DNA esto presentes em cada amostra, e para isso

sujeitam-se as amostras a restrio com a enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes, no

gel de electroforese.

A diferena na sequncia de DNA dos alelos R e r tal que, no alelo r existe uma sequncia de

bases que pode ser reconhecida e cortada pela enzima de restrio BamHI. O alelo R no possui local de

restrio para a enzima BamHI e assim no vai ser cortada pela enzima.

Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos,

sujeito a electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais

pequenos obtidos, quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).


12/34

Guio do Aluno

12

Parte IIIProcedimentos protocolares

Segue-se o trabalho de laboratrio que implica o cumprimento de todas as regras de segurana

j mencionadas na introduo deste guio. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre

em ateno que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular

ateno s pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mos ou entrar em contacto

com material no esterilizado, para que no haja contaminao do DNA.

1. Cultura de bactrias para extraco de DNA plasmdico

a) Seleccionar um conjunto de culturas em stock (em placa petri, cultura Stab, ou meio lquido LB

mais Ampicilina), dependendo de como so mantidas as bactrias no laboratrio, e proceder propagao

das bactrias atravs de cultura lquida, transferindo perto da chama, para um tubo estril que continha j

10 mL de meio de cultura (tabela 4):

- uma colnia de cada cultura de bactrias no caso de estarem em meio slido;

- uma picada de cada cultura de bactrias caso sejam retiradas da cultura Stab;

- 10 L de cada cultura de bactrias, no caso de estarem em meio lquido.

b) Agitar de modo a provocar a disperso das bactrias no meio.

c) Incubar a 37C durante a noite.

2. Extraco do DNA plasmdico

a) Perto da chama, transferir 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos de 1,5 mL

estreis.

b) Centrifugar velocidade mdia durante 3 minutos para recolher as bactrias no fundo do tubo, e

verter o sobrenadante.

c) Perto da chama transferir novamente 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos

de 1,5 mL.

d) Centrifugar velocidade mdia durante 3 minutos para recolher as bactrias no fundo do tubo, e

verter o sobrenadante.

e) Ressuspender os sedimentos em 300 de STET e adicionar 4 uL de lisozima (50mg/mL) a cada

tubo.

f) Incubar temperatura ambiente durante 5 minutos.

g) Ferver durante 45 segundos.

h) Centrifugar durante 5 minutos velocidade mxima, para que as estruturas celulares sedimentem

no fundo.

i) Remover o sedimento de cada tubo com um palito.j) Adicionar a cada tubo 300 L de isopropanol (insolubiliza o DNA) e agitar.

Culturas

(meio LB+Ampicilina)pCR2.1 pUC 18 pCard

Volume final da

cultura10mL 10mL 10mL

Tabela 4: Cultura de bactrias seleccionadas para extraco deDNA plasmdico


13/34

Guio do Aluno

13

k) Centrifugar os tubos velocidade mxima, durante 10 minutos, para sedimentar o DNA.

l) Eliminar o sobrenadante e deixar secar at desaparecer o odor de isopropanol, evitando que os

sedimentos sequem em demasia.

m) Adicionar 100 L de etanol, a 70% e deixar evaporar.

n)Ressuspender os sedimentos em 30-40 L de gua destilada estril, agitando a base dos tubos com

os dedos.

o) Utilizar o DNA dissolvido directamente, ou conservar a preparao de DNA a -20C para posterior

utilizao.

3. Preparao das amostras de DNA

Nesta actividade experimental, se o corante de DNA a utilizar for o Azure A, ser necessrio 0,3 g de

DNA para cada banda visvel num volume de 20 L a carregar nos poos.

As solues de plasmdios so normalmente fornecidas em concentraes de 1 g/L, que necessitam de

ser diludas para uma concentrao de 0,06 g/L (ver tabela 5). 5 L dessas solues contm 0,3 g de

DNA.

Para este trabalho, necessrio preparar 3 misturas diferentes de plasmdios, que vo posteriormente ser

utilizadas. A tabela 6 indica as quantidades de cada mistura que so necessrias para a realizao da

actividade experimental. As amostras de DNA vo conter 20 L de uma das misturas, pelo que a

quantidade de DNA em cada amostra vai ser 0,3 g, 0,9 g, ou 0,6 g, dependendo se contem a mistura

A (1 plasmdio), a mistura B (3 plasmdios) ou a mistura C (2 plasmdios).

Plasmdio

(1 g/L)gua

Volume Final

(0,06 g/L)

3 L 47 L 50 L6 L 94 L 100 L

9 L 141 L 150 L

15 L 235 L 250 L

Amostra de DNA AAmostra de DNA

BAmostra de DNA C

Volume necessrio

de plasmdio

(o,o6 g/L)

pUC 18 ------------------------ 60 L 20 L 80 L

pCR 2.1 ------------------------ 60 L 20 L 80 LpCArd 45 L 60 L ----------------------- 105 L

gua 135 L 60 L 40 L

Volume total 180 L 240 L 80 L

N de amostras

de 20 L

necessrias

8 tubos 11tubos 3 tubos

Tabela 6 - Preparao das misturas de plasmdios (amostra de DNA A, B e C)

Tabela 5 - Preparao das solues de plasmdios para aconcentrao final de 0,06 g/L


14/34

Guio do Aluno

14

4. Distribuio das amostras de DNA

a) No topo de cada um dos tubos que contm enzima liofilizada, proceder identificao dos mesmos

com os nmeros de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).

b) Colocar 20 L de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (figura 8) que

continha j enzima de restrio liofilizada (9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a

amostra de DNA B, e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).

c) Proceder mistura da soluo de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no

fundo do tubo.

5. Restrio enzimtica

a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37C,

durante cerca de 40 minutos.

6. Preparao do gel de agarose

a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampo TAE (1x) (ver nota para o

professor 2).

b) Tapar o matraz com pelcula aderente, e furar a pelcula antes de o levar ao microondas (no

utilizar parafilme).

c) Proceder sua dissoluo no microondas durante 2 minutos (ter ateno para a soluo no

levantar fervura, uma vez que se ferver a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicaes na

electroforese).

d) Retirar o matraz do microondas com o auxlio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de

que toda a agarose se encontrava totalmente dissolvida.

e) Deixar arrefecer at temperatura aproximada de 60C.

f) Colocar o pente junto ao elctrodo negativo da tina de electroforese.

g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a

criao de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.

h) Aguardar a polimerizao da agarose durante cerca de 20 minutos.

Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22

Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23

Tubos que recebem a amostra de DNA C: tubos 7, 11, 15Figura 8 Distribuio dasdiferentes amostras de DNA


15/34

Guio do Aluno

15

7. Carregamento do gel

a) Aps a solidificao do gel de agarose, cobrir toda a

sua superfcie com TAE (0,25x).

b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como

as placas laterais.

c) Adicionar 2 L de tampo de amostra que contm azul de

bromofenol a cada um dos tubos que contem as amostras de DNA.

d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampo de

amostra com a soluo de DNA.

e) Pipetar 5 L do marcador molecular Lambda DNA/HindIII e adicionar

2L de tampo de amostra.

f) Carregar 5 L da soluo anterior no primeiro poo do gel.

g) Pipetar 20 L de cada amostra de DNA, pela ordem numrica dos tubos, e carregar nos poos do

gel (figura 9).

8. A electroforese

a) Verificar se os elctrodos esto bem colocados.

b) Regular a voltagem para os 120 volts.

c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 a 30 minutos (figura 10).

d) Interromper a electroforese quando o azul do tampo alcanar o

fim do gel.

9. Colorao do DNA

a) Remover a soluo tampo TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizaes (tem que se ter

o cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).

b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfcie do gel .

c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.

d) Retirar o corante da superfcie do gel e guarda-lo para posterior reutilizao, anotando no frasco o

n de vezes que este j tinha sido utilizado.

e) Retirar o corante da superfcie do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.

f) Eliminar o lcool e lavar o gel com gua corrente, durante 3 ou 4 minutos, no deixando gua no

gel, para que no seja removido do gel a totalidade do corante.

g) Aguardar at que as bandas se tornem visveis.

h) Observar os resultados.

i) Registar o nmero de bandas na respectiva rvore genealgica.

Figura 10 - Electroforese

Figura 9 Carregamento do gel deagarose


16/34

Guio do Aluno

16

Parte IVAnlise e discusso dos resultados

Parte VIActividade complementar

Parte V - Actividade complementarMapeamento de plasmdios (Plasmid Mapping)

Plasmdios e enzimas de restrio

O mapeamento de plasmdios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a indstria da

biotecnologia. Esta tcnica permite aos bilogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso deexperincias de clonagem assim como identificar facilmente plasmdios e tratamentos associados em

diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA

genmico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmdico para simular como os verdadeiros perfis de

DNA so analisados.

Aps o corte dos plasmdios pelas enzimas de restrio, estes podem ser ligados a um fragmento de DNA

proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrio. O

1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poos devidamenteassinalados (apndice II).

2. Na rvore genealgica fornecida (apndice III), registe o nmero de bandas obtido em cadaindivduo (para cada amostra de DNA poder visualizar uma, duas ou trs bandas).

3. Indique, justificando, qual o modo de transmisso da doena.

4. Identifique os indivduos que so portadores da doena.

5. Refira os indivduos que podem ter falecido devido doena Raritose.

6. Indique o gentipo e o fentipo dos indivduos 1, 15 e 22.

7. Comente a seguinte afirmao: A probabilidade de o Andr e a Ana terem um filho doente igual probabilidade de terem um filho portador. (Sugesto: Faa um xadrez mendeliano).

8. A Ana e o Andr optaram na realidade pela realizao de um teste gentico, antes de terem filhos,para saberem se h a possibilidade de terem um filho doente. Alguns membros da famlia apoiam adeciso tomada pelo casal, mas h outros membros que se opem. Enumera dois argumentos quepossam ter sido referidos a favor da realizao do teste gentico e dois argumentos que possam tersido referidos contra.

9. Complete oV de Gowinrelativo actividade experimental desenvolvida (apndice IV).

10. Elabore uma resposta para a questo-problema formulada inicialmente Ser possvel pelaanlise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e Andr sero doentes?


17/34

Guio do Aluno

17

Parte VActividades complementares

Actividade complementar 1Mapeamento de plasmdios

Plasmdios e enzimas de restrio

O mapeamento de plasmdios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a

indstria da biotecnologia. Esta tcnica permite aos bilogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso

de experincias de clonagem assim como identificar facilmente plasmdios e tratamentos associados em

diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA

genmico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmdico para simular como os verdadeiros perfis de

DNA so analisados.

Aps o corte dos plasmdios pelas enzimas de restrio, estes podem ser ligados a um fragmento

de DNA proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrio. O

plasmdio resultante que possui DNA hbrido pode ser incorporado em clulas bacterianas (transformao).

O plasmdio hbrido replica-se na bactria da mesma forma que o plasmdio original, incluindo o fragmento

de DNA estranho que foi introduzido. Assim, cada plasmdio hbrido contm uma cpia do DNA estranho

incorporado. Diz-se que o fragmento de DNA foi clonado e o plasmdio de DNA que o transporta

designado vector.

Os plasmdios podem ser descritos em termos de localizao dos locais de restrio usando

simples procedimentos e lgica. O procedimento geral digerir um plasmdio com duas enzimas de

restrio separadamente e com as duas em simultneo (digesto dupla). Os tamanhos dos fragmentos de

DNA resultantes so determinados usando a lgica para determinar a localizao relativa dos locais de

restrio.

Uma vez que os plasmdios so circulares, o nmero de fragmentos representam o nmero de

cortes ou locais de restrio.

Ler um mapa de um plasmdio

Um mapa de um plasmdio contm informaes relativas ao tamanho do plasmdio, aos genes

presentes, origem do local de replicao, e aos locais de restrio para as enzimas de restrio. Os

plasmdios utilizados nesta actividade laboratorial foram o plasmdio pUC 18, o plasmdio pCR2.1.TOPO, e

o plasmdio pCard (resulta da adio de um insertde 1500bp no plasmdio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a

enzima de restrio BamHI, embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes

plasmdios (exemplo da enzima HindIII). Os locais de restrio so marcados no mapa com um nmero

que indica o local de restrio. Uma vez que o plasmdio circular, existe um local zero arbitrrio. Todos

os locais de restrio so indicados com um nmero entre zero e o nmero total de pares de base do

plasmdio. O tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela simples subtraco (e nalguns casos

adio) entre pontos do plasmdio.

Plasmdios utilizados neste kit

O mapa de um plasmdio mostra as posies (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos

locais onde o plasmdio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrio. O nome do plasmdio e o

seu tamanho em pares de base de DNA mostrado dentro do crculo, assim como a Origem de Replicao


18/34

Guio do Aluno

18

(Ori). Dois dos plasmdios utilizados neste kitso plasmdios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 10 e

11).

Figura 10 Plasmdio pUC 18Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

Figura 11: Plasmdio pCR2.1Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml


19/34

Guio do Aluno

19

Questes:

1. A partir do mapa do plasmdio pCR2.1 enumere as enzimas de restrio que podem cortar o plasmdio.

2. Qual dos plasmdios, pUC 18 ou pCR2.1, o maior e qual o seu tamanho?

3. Utilizando o plasmdio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrio para a enzima AvaII.

Quantos locais de restrio existem? Se a enzima AvaII for usada para restrio deste plasmdio, quantos

fragmentos iremos obter?

4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrio do plasmdio pUC18 com a enzima AvaII.

Confirme que a soma dos fragmentos obtidos igual ao tamanho total do plasmdio.


20/34

Guio do Aluno

20

Actividade complementar 2 Restrio e anlise do gel, virtual, utilizando o software

pDrwa32

Para se realizar restries virtuais em plasmdios, e visualizar o padro de restrio obtido num gelvirtual, pode-se utilizar um software gratuito: opDRAW32 DNA analysis software,AcaClone software.

1. Proceda instalao do software pDRAW32 DNA analysis, acedendo ao sitehttp://www.acaclone.com/e seguindo todas as instrues.

Figura 1:Instalao do programa Pdraw32 DNA analysis software

2. Abra o programa j instalado pDRAW32 DNA analysis. De seguida, clique em File (ficheiro),New (novo) e Enter new sequence (introduzir nova sequncia).

Figura 2: Menus de abertura do programa pDRAW32
http://www.acaclone.com/http://www.acaclone.com/http://www.acaclone.com/


21/34

Guio do Aluno

21

3. Acedendo ao site https://www.lablife.org/ escolha a sequncia do plasmdio que pretendeanalisar (sugere-se que escolha a sequncia do plasmdio pCR2.1). De seguida cole a sequnciaseleccionada no local indicado no programa pDRAW.

Figura 3: Seleco da sequncia de nucleotdios do plasmdio pCR2.1

4. Clique em Edit (editar), e seleccione a opo Edit Sequence.

Figura 4: Sequncia do plasmdio pCR2.1 linearizada, mostrando tambm os locais de restrio de dezenas de enzimasde restrio. Est indicado tambm o comprimento da sequncia do DNA.
https://www.lablife.org/https://www.lablife.org/https://www.lablife.org/


22/34

Guio do Aluno

22

5. Clique em Edit, seleccione DNA name, properties and annotations, e registe os dados como seindica no exemplo abaixo:

Figura 5: Designao do nome correcto do plasmdio (pCR2.1), e indicao da forma que se pretende visualizar o DNA(forma circular)

6. Clique em Preview, e aparecer no ecr o plasmdio pretendido pCR2.1, com todos os locais derestrio enzimtica.

Figura 6: Mapa do plasmdio pCR2.1, circular, com locais de restrio das respectivas enzimas


23/34

Guio do Aluno

23

7. Clique em Settings (opes), e seleccione Enzime selection (seleco das enzimas).

Figura 7: Menu de opo para seleco das enzimas

8. Introduza a informao que deseja relativamente s enzimas que pretende utilizar para a

restrio do plasmdio.

Figura 8: Seleco das enzimas e das caractersticas pretendidas

Nota: no exemplo apresentado foram seleccionadas algumas caractersticas, podendo no entanto

serem seleccionadas outras.


24/34

Guio do Aluno

24

9. Aps ter clicado em Apply, vai aparecer no ecr o plasmdio pCR2.1 apenas com os locais derestrio para as enzimas que apresentam as caractersticas anteriormente definidas.

Figura 9: Mapa do plasmdio pCR2.1 com os locais de restrio das enzimas anteriormente definidas

10.Uma vez que aparecem ainda muitos locais de restrio para as enzimas anteriormenteseleccionadas, a melhor opo ser seleccionar as enzimas que s cortam duas vezes oplasmdio.

Figura 10:Mapa do plasmdio pCR2.1 com os locais de restrio das enzimas que cortam apenas duas vezes


25/34

Guio do Aluno

25

11. Obtido o mapa virtual do plasmdio pCR2.1. com os respectivos locais de restrio para enzimas ques cortam duas vezes, pode-se agora realizar a restrio virtual e respectiva electroforese em gel virtual.Clique em View agarose gel electrophoresis.

Figura 11:Mapa de restrio do plasmdio pCR2.1, em gel virtual

Discusso:

Que concluses se podem retirar, aps observao do padro de restrio do plasmdio pCR2.1, com

enzimas que apenas cortam duas vezes?


26/34

Guio do Aluno

26

Parte VI -Glossrio

Glossrio

cido desoxirribonucleico vulgarmente conhecido por DNA, um polmero orgnico complexo formado por duascadeias de nucletidos emparelhadas entre si, com uma disposio antiparalela. Cada nucletido que constitui o DNA composto por um acar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina,guanina e citosina).

cido ribonucleico vulgarmente conhecido por RNA, um polmero orgnico formado por uma cadeia simples denucletidos. Cada nucletido que constitui o RNA composto por um acar, a ribose, um grupo fosfato e uma dasquatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).

Adenina base azotada prica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA.

Agarose polmero constitudo por unidades de galactose. Aps dissoluo em gua a ferver, seguido dearrefecimento, toma uma consistncia gelatinosa.

Alelos formas diferentes de um determinado gene.

Base Azotada molculas que entram na constituio dos cidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro basesazotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina so bases complementares, emparelhando entresi. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.No RNA encontram-se tambm quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As basesemparelham do mesmo modo que no DNA excepo da adenina que vai emparelhar com o uracilo.

Caritipo conjunto dos cromossomas presentes nas clulas de cada ser vivo.

Centrmero parte central dos cromossomas. O centrmero importante no processo de mitose e de meiose para aseparao dos cromossomas.

Citosina base azotada pirimdica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA.

Co-dominncia situao em que h expresso individual dos dois alelos de um locus, num heterozigtico.

Cromatdio componente de um cromossoma contendo uma molcula de DNA.

Cromatina denso material do ncleo constitudo principalmente por DNA e protenas.

Cromossoma estrutura filamentosa constituda por DNA associado a protenas estruturais (histnicas e nohistnicas). Os cromossomas encontram-se no ncleo das clulas eucariticas.

Cromossoma homlogo cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idnticos, que apresenta osmesmos loci genticos. Cada cromossoma de um desses pares homlogo do outro e emparelha com ele durante ameiose.

DNA ver cido desoxirribonucleico.

DNA fingerprinting tcnica de separao de segmentos de DNA que permite a identificao gentica dos

indivduos.DNA polimerase enzima presente nas clulas procariticas e eucariticas, responsvel pela polimerizao das novascadeias de DNA.

Dominante refere-se a um carcter que se exprime quando h heterozigotia para o gene que o determina. Aexpresso ocorre na presena de uma cpia normal do alelo.

Enzimas de restrio - enzimas responsveis por cortar o DNA. Estas enzimas so produzidas por bactrias erecebem o nome da espcie da bactria de onde foram extradas. Enzimas de restrio diferentes reconhecem e cortamDNA em diferentes sequncias de bases.

Electroforese uma tcnica que permite a separao de molculas (DNA, protenas) de acordo com o tamanho,carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente elctrica. As molculas vo movimentar-se no meio desuporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as caractersticas queapresentam (tamanho, carga e forma).

Engenharia gentica manipulao do material gentico.


27/34

Guio do Aluno

27

Feniltiocarbamida a feniltiocarbamida (PTC) uma protena, descoberta na dcada 30,

Fentipo caractersticas observveis num organismo. O fentipo resulta da combinao de factores genticos eambientais.

Gene a unidade bsica da hereditariedade. Corresponde a uma sequncia nucleotdica de DNA que codifica umadeterminada sequncia polipeptdica, responsvel por determinada caracterstica ou funo no organismo. Cada geneencontra-se num local especfico de um cromossoma (locus) e pode apresentar vrias variantes (alelos) quedeterminam uma forma particular dessa caracterstica (exemplo: a caracterstica cor dos olhos pode ter vrios alelos:alelo que determina a cor azul, alelo que determina a cor castanha, etc).

Gentica cincia que estuda os genes e a hereditariedade.

Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.

Gentipoconstituio gnica de um indivduo no que diz respeito aos alelos de um locus.

Guanina - base azotada prica presente nos nucletidos que constituem o DNA e o RNA

Hereditariedade mecanismo atravs do qual as caractersticas genticas passam dos progenitores para osdescendentes.

Heterozigtico um indivduo diz-se heterozigtico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.

Histona protenas bsicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Tm baixo peso molecular, e so ricas nosaminocidos lisina ou arginina.

Homozigtico um indivduo diz-se homozigtico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.

Locuslocalizao de um gene num cromossoma.

Primer pequena sequncia especfica de oligonucletidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o incio da sntese dacadeia complementar pela DNA polimerase.

Reaco de polimerizao em cadeia (PCR) - reaco que permite a amplificao de pores especficas de DNAque estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades.

Recessivo gene ou carcter que s se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presena de um nico alelo no

genoma).RNA ver cido ribonucleico.

SNP (Single nucleotide polymorphism) variao numa sequncia de DNA que envolve uma alterao num niconucletido.

Southern blot mtodo descrito por E.Southern em que fragmentos de restrio so separados num gel deelectroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana posteriormentetratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequncia de bases conhecida, e complementar ao DNAcontido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA marcada radioactivamente para permitir a sua deteco.

Taq polimerase uma DNA polimerase termoestvel, utilizada na amplificao de fragmentos de DNA atravs datcnica de PCR. O seu nome devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactria Thermus aquaticus. A Taqpolimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimtica de 40 minutos (a 94C).

Teste gentico teste que permite detectar a presena, ausncia ou alterao, num gene particular, cromossoma ounum produto gentico.

Timina base azotada pirimdica presente nos nucletidos que constituem o DNA (ausente no RNA).

Uracilo base azotada pirimdica encontrada nos nucletidos do RNA.


28/34

Guio do Aluno

28

Meio Liquido

Culturas lquidas de E.coli, podem geralmente fazer-se crescer no meio LB (Luria-Bertani). H diferentes

meios LB, com diferentes composies. Frmulas diferentes contm diferentes concentraes de NaCl e

do origem a quantidades variadas de DNA plasmdico. Para obter grande quantidade de DNA plasmdico

a composio LB recomendada a seguinte:

Composio do meio LB por litro

Triptona 10 g

Extracto delevedura

5 g

NaCl 10 g

Preparao do meio LB

Para preparar um litro de meio LB, adicione 10g de NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extracto de levedura a

950 mL de gua destilada e desionizada, e agite at se dissolver. Ajuste o volume da soluo para um litro

com gua destilada e desionizada. Decante para pequenos reservatrios e esterilize na autoclave.

Esterilizao do meio

Esterilize o meio lquido ou slido na autoclave, utilizando uma presso e um perodo de tempo adequado

ao tipo de meio, tamanho do frasco, e tipo de autoclave.

Apndices:

Apndice IGuia prtico de Microbiologia

Nota 1: aconselhvel autoclavar o meio lquido em vrios frascos pequenos, do que apenas num frascogrande, para evitar uma possvel contaminao de todo o meio. Depois de autoclavar, no utilizar o meio

durante 24 h para garantir que est devidamente esterilizado e livre de contaminao por microorganismos.

Nota 2: Encha apenas da capacidade dos frascos com meio, e solte as rolhas antes de autoclavar paraevitar que o meio a ferver verta para fora. Aperte as rolhas quando o meio estiver frio (por volta dos 40C)

para o manter completamente estril.

Nota 3: Os antibiticos e os nutrientes como os aminocidos so inactivados pelas altas temperaturas de

uma autoclave. Eles devem ser adicionados ao meio frio e autoclavado a partir de solues stock

adequadas.

Tabela 1: Composio do meio LB por litro


29/34

Guio do Aluno

29

Meio slido

Estirpes de E. colipodem geralmente ser riscadas e armazenadas em placas de petri com meio LB que

contenham 1,5% de agar e o antibitico apropriado.

Preparao: prepare o meio LB de acordo com a composio dada na tabela acima. Mesmo antes deautoclavar, adicione 15 gramas de agar por litro e misture. Depois de autoclavar, agite o meio suavemente

para distribuir o agar dissolvido por toda a soluo. Tenha o cuidado para que o lquido quente no verta

para fora enquanto o agita.

Seque as placas directamente quer aps a solidificao ou logo antes de usar removendo as tampas e

colocando as placas na cmara de fluxo laminar durante 1 hora. Em alternativa, se no houver cmara de

fluxo laminar, as placas podem ser secas com as tampas ligeiramente abertas numa estufa a 37C durante

30 minutos, ou deixe-as invertidas com as tampas temperatura ambiente durante 2-3 dias.

Antibiticos

Estirpes bacterianas que contm plasmdios ou genes com marcadores selectivos de antibiticos devem

sempre ser postas num meio de cultura liquido ou slido que contenha o agente selectivo. Os antibiticos

devem ser adicionados ao meio apenas quando este estiver a uma temperatura abaixo dos 50C.

Antibitico Solues stock Concentraes a utilizar (diluidas)Concentrao Armazenamento

Ampicilina50 mg/mL em gua -20C 100 ug/mL (1/500)

Clorofenical 34 mg/mL em etanol -20C 170 ug/mL (1/200)

Kanamycin 10 mg/mL em gua -20C 50 ug/mL (1/200)

Streptomycin 10 mg /mL em gua -20C 50 ug/mL (1/200)

Tetraciclina 5 mg/mL em etanol -20C 50 ug/mL (1/100)

Nota 4: Deixe arrefecer o meio de agar autoclavado at aos 50C, antes de adicionar antibiticos e nutrientes

sensveis ao calor. Misture muito bem.

Nota 5: Faa o plaqueamento das placas com o meio numa cmara de fluxo laminar, ou numa superfcie

limpa, prximo de uma chama. Use 30-35 mL de meio para placas de petri de 90mm de dimetro (1 litro de

meio d para cerca de 30 placas).

Nota 6: Aps o plaqueamento, quaisquer bolhas de ar podem ser removidas passando rapidamente uma

chama perto da superfcie da placa. No se deve demorar com a chama pois esta pode destruir os

antibiticos.

Nota 7: Guarde as placas invertidas a 4C, protegidas da luz, para preservar os antibiticos sensveis luz.

No guarde as placas por perodos superiores a 3 meses, j que os antibiticos podem degradar-se.

Tabela 2: concentra es de antibiticos fre uentemente utilizados


30/34

Guio do Aluno

30

Culturas Stab

As estirpes de E.coli podem ser mantidas durante um ano em cultura Stab. As culturas Stab so

utilizadas para transportar bactrias de uns laboratrios para outros.

Preparao das culturas Stab:

1. Preparar e autoclavar o meio LB como descrito anteriormente,

tendo em conta que se pretende um meio LB que contenha 0,7% de agar.

2. Arrefecer o meio LB at cerca dos 50C, e adicionar o

antibitico apropriado. Enquanto o agar ainda estiver lquido,

adicionar 1 mL de agar para um tubo de 2 mL, em condies estreis,

e deixar solidificar.

3. Com uma ansa esterilizada, retirar uma nica colnia

de bactrias de uma placa de petri e introduzir a ansa no fundo do frasco

com agar diversas vezes (figura 1).

4. Incubar o tubo a 37C durante 8 a 12 h deixando a tampa

do tubo ligeiramente aberta.

5. Aps incubao, retirar o tubo, apertar muito bem a tampa,

e guardar no escuro a uma temperatura de 4C.

Placas de agar

Placas com riscado de bactrias podem ser seladas com Parafilme, e guardadas invertidas a 4C

durante vrias semanas.

O riscado de bactrias deve ser sempre feito em placas que contenham o antibitico apropriado.

Para se obter colnias de bactrias bem isoladas, riscar uma placa de agar como se descreve de seguida:

1. Passar uma ansa de inoculao pela chama, e arrefece-la

numa placa esterilizada que contem agar, mas que no v ser utilizada.

2. Utilizando a ansa, proceder ao riscado de bactria

(a partir de uma cultura stock em glicerol, cultura Stab ou de uma

colnia isolada de outra placa) a partir de uma canto da placa de

agar fresco.

3. Passar a ansa pela chama mais uma vez e arrefece-la.

Passar a ansa sobre o primeiro riscado e riscar de novo a partir

de um canto fresco da placa.

4. Repetir o processo at formar o padro visvel na figura 2.

5. Incubar a placa invertida a 37C durante 12 a 24 h, at as colnias

se desenvolverem.

Figura 2: Riscado de bactrias emplacas de agarFonte da imagem: www.qiagen.com

Figura 1-Inoculao de uma cultura StabFonte da imagem: www.qiagen.com


31/34

Guio do Aluno

31

Apndice IIRegisto das bandas de DNA resultantes no gel de agarose


32/34

Guio do Aluno

32

Apndice III rvore genealgica

Mulher

Homem

SexoIndefinido

Legenda


33/34

Guio do Aluno

33

Apndice IVV de Gowin


34/34

Guio do Aluno

Referncias Bibliogrficas

(1)Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da EducaoBsica, Orientaes Curriculareshttp://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

(2) Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular

http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Para mais informaes consultar:

Bailey J (1995) A Gentica A Nova Enciclopdia das Cincias, Crculo de Leitores.

Regateiro F (2003) Manual de Gentica Mdica - Imprensa da Universidade de Coimbra.

Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor: Cold Spring Harbor Laboratory.

Videira A (2001) Engenharia Gentica Princpios e Aplicaes, Lidel.

Corantes

Biotiumwww.biotium.com

Carolinahttp://www.carolina.com

BioRadhttp://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/

Biotecnologia conceitos e tcnicas

The European Initiative for Biotechnology Educationhttp://www.eibe.info/

Learn.Genetics - Science Learning Centerhttp://learn.genetics.utah.edu/

Roy J. Carver Biotechnology Centerhttp://www.biotech.uiuc.edu/

Orientaes curriculares do Ministrio da Educao

Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricularhttp://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Ministrio da Educao, Direco-Geral de Inovao e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da EducaoBsica, Orientaes Curriculares

http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdfKitscomerciaisNature`s dice Teacher`s guidehttp://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/DNA/PDF/DiceTG.pdf

Bio-Rad Laboratorieshttp://www3.bio-rad.com

Testes genticosUnderstanding Gene Testinghttp://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php

Software:pDraw32 DNA Analysishttp://www.acaclone.com/

Microbiologia

QIAGEN Newswww.qiagen.com

Plasmdios

Invitrogenwww.invitrogen.com

Source BioScience ImaGeneshttp://www.imagenesbio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

LabLifehttps://www.lablife.org/
http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/

guião do aluno versão b

Documents