Graduação em Biotecnologia

Disciplina de Proteômica

Caroline Rizzi

Doutoranda em Biotecnologia -UFPel

Propriedades dos Aminoácidos

Sólidos

Cristalizáveis

Incolores

Hidrossolúveis

↑PF (↑200 C)

Ácidos e Bases fortes e fracos

A força das espécies varia conforme o grau de dissociação de H+ em solução aquosa

Ácidos e Bases Fortes

HA → H+ + A-

H+ + A- → HA

Ácidos e Bases Fracos

HA H+ + A-

H+ + A- HA

Ácido

Base

Par ácido fraco/base conjugada

Par base fraca/ácido conjugado

• pH neutro: íons dipolares

• Ionização:• grupos carboxílicos: em pH ~2,2 (pK1)

• grupos amínicos em pH ~9,4 (pK2)

• Podem agir como um ácido ou uma base: Anfóteros

H3N - C - H

COO -

R

Propriedades dos Aminoácidos

ácido

base

Esta propriedade mostra que a dissociação dos grupos aminoe carboxílico varia dependendo

da variação do pH do meio.

Caráter Anfótero dos AAS

pK: valor de pH onde a metade dos ácidos ou bases estão dissociados e a metade está associada

H A H+ + A-v1

v2

pK1

pK2

50% COOH50% COO-

50% NH3

50% NH2

Diferença de 7 unidades logarítmicas entre os pKs dos grupos α-amino e α-carboxila

NH3+ só se dissocia se o –COOH já estiver completamente dissociado em –COO-.

A afinidade por prótons do -NH (pk ~9) é 107 vezes maior que a do -COOH (pK ~2).

forma básica forma ácida forma neutra

DIFERENÇA DE AFINIDADE PELO H+→medida da tendência de ceder prótons

pK

Curva de Titulação

Representação gráfica do comportamento anfótero dos aas

Evidenciam a ação dos aas como tampão

Titulação: adição ou remoção gradual de H+Com base: parte-se do pH ácido até chegar ao alcalinoCom ácido: parte-se do pH alcalino até chegar ao ácido

• Um aminoácido em solução aquosa

H- C - NH2

COO

R

Dissociação dos Aminoácidos

H

3

H+

H+

H+

H+

H+

pH=1

Dissociação dos Aminoácidos

Um aminoácido em solução aquosa

H- C - NH

COO

R

HOH-

OH-

OH-

OH-

-

Hágua

pH=9

32

H

pH=2

De forma geral, ao fazer a titulação de um aa com uma

base, iniciando-se em pH=1 observa-se que o pH da

solução aumenta até aproximadamente pH=2 quando o

grupamento COOH começa a liberar íons H+ para o

meio, formando água.

H- C - NH3+

COO-

R

COOH

R

H- C - NH3+ + OH-

pK1

Dissociação dos Aminoácidos

H2O

íon dipolar

COO-

R

H-C-NH3+ + OH-

H-C-NH2

COO-

RpK2

Continuando a adição de base o pH irá progressivamente

se elevando até que o grupo NH3+ tenha condições de

liberar seu íon H+, o que ocorre próximo ao pH 9 .

Dissociação dos Aminoácidos

H2O

íon dipolar

A carga da molécula varia na dependência do

pH do meio e do pK de cada grupo

Carga +1 0 -1

Ambos gruposprotonados

Íon dipolarAmbos grupos desprotonados

Tampões

Solução que resiste a mudanças de pH

quando se adicionam pequenas

quantidades de ácido ou base.

Pode ser produzido pela mistura de um ácido

fraco (HA) e de sua base conjugada (A-).

Compostos devem ter grupos ionizáveis

capazes de doar e de receber prótons H+

Como funcionam os tampões?

Tampões

pH = pKaA-

HA+ log

Aceptor de H+

Doador de H+

(sal)

(ácido)

Equação de Hendersen-Hasselbalch

[HX]

[X -]= pKa + logpH

[HA]

[A-]

= pKa + logpH[HA]

[A-]

= pKa + logpH

A [H+] , e em decorrência, o pH, são determinados por doisfatores: o valor de pKa e a razão das concentração do par[A-] / [HA].

Tampões resistem mais eficazmente à variação de pH em qualquer sentido quando as concentrações de [A-] / [HA] são aproximadamente as mesmas.

pK

Tampões

Para que o tampão tenha pH de 7,4, a razão [base] / [ácido] deve ser igual a um

valor de 20.

pH = 6,1 + log10[HCO3

-]

CO2]

Tampões sanguíneos: bicarbonato e CO2

H AA- + H+

50% 50%

o poder tamponante é máximo no pK pois há igual

proporção das formas doadora e aceptora de prótons:

quando o pH do meio é igual ao pK do grupo ionizável, este está 50% dissociado

Qual é a relação dos tampões com

os aminoácidos???

Curva de titulação da

alanina

Aminoácido monoaminonomocarboxílico

Titulação: remoção gradual de prótons

Dois estágios distintos: desprotonação do –COOH e- NH3

pI: remoção do primeiro próton já cessou e há então o início da remoção do segundo próton

Fim da titulação: forma predominante sem nenhum próton

Duas regiões de ação tamponante

pI: pH onde 100% das moléculas possuem carga total neutra não há capacidade tamponante

Isoelétricas/isoiônicas

Ponto isoelétrico

O cálculo do pI baseia-se nas formas de

dissociação do aminoácido utilizando

os pKs anterior e posterior à forma

isoelétrica do aminoácido.

pK NH3+ = 9.60

pK COOH = 2.34

Cálculo do ponto isoelétrico

pI = 2.34 + 9.6 = 5.97

2

+1

-H+

+H+

-H+

+H++1

50%C

CH2

NH3

+

OHO

C

CH2

NH3+

OO

+

50%

pH 0 - 2 pH 2,34 pH 3.0 - pH 9.0 pH 9.6 pH 10 - 14

C

HC-H

NH3+

OHO

C

CH2

NH2

OO

-1

Para a glicina os valores de pK são:

-H+

+H+

-H+

+H+

Em pH < 2,34, todos os

grupos ionizáveis da glicina

estão protonados. A molécula

apresenta carga +1.

Aumentando o pH, -COOH começa a

desprotonar. No pH 2,34, metade das –

COOH desprotonaram, gerando a

glicina com carga zero.

Em pH 5,97 ocorre o ponto

isoéletrico da glicina. 100% das

moléculas estão com carga zero.

Aumentando mais o

pH, até o valor 9,6,

(pK do NH3+), haverá

50% de moléculas de

glicina com carga -1.

C

CH2

NH3+

OO

Em pH > 10

predomina a forma

de glicina com

carga -1.

C

CH2

NH3

+

OO

C

CH2

NH2

OO

+

50%

50%

-1

Cálculo do Ponto Isoelétrico

Valores pK dos grupos ionizáveis dos -aminoácidos a 250 C

-Amino Ácido pK1

-COOHpK2

-NH3+

pKR

Cadeia Lateral (R)

Alanina 2.35 9.87

Arginina 1.82 8.99 12.48 (guanidino)

Asparagina 2.1 8.84

Ácido Aspártico 1.99 9.90 3.90 ( -COOH)

Cisteina 1.92 10.78 8.33 (sulfidrila)

Ácido Glutâmico 2.10 9.47 4.07 ( - COOH)

Glutamina 2.17 9.13

Glicina 2.35 9.78

Histidina 1.80 9.33 6.04 (imidazol)

Isoleucina 2.32 9.76

Leucina 2.33 9.74

Lisina 2.16 9.18 10.79 ( -NH3+)

Metionina 2.13 9.28

Fenilalanina 2.16 9.18

Prolina 2.95 10.65

Serina 2.19 9.21

Treonina 2.09 9.10

Triptofano 2.43 9.44

Tirosina 2.20 9.11 10.13 (fenol)

Valina 2.29 9.74

Observe os valores de pKs da tabela abaixo.

Alguns aminoácidos

apresentam grupos

ionizáveis em suas

cadeias laterais

PKR

Quando o aminoácido apresenta mais de um grupo ionizável no

radical, este aminoácido possui mais um pK, o pKR

Como exemplo, veremos a

ionização da Lisina:

O

C

C - NH3+

(CH2)4

NH3+

HO

H

pK -COOH = 2.18

pK - = 8.95

pK R-

C

-NH3+

NH3+

OHO

todos os

grupos

protonados

predomínio

carga +2

pH < 2

pI = 8.85 + 10.53 = 9.69

2

(ponto isoelétrico)

(+2)

H+

C

-NH3+

NH3+

OO

predomínio

carga +1

pH 3 - 8

(+1)

H+

C

-NH2

NH3+

OO

ponto

isoelétrico

pH 9.69

100% (zero)todos os

grupos

desprotonados

predomínio

carga -1

C

-NH2

NH2

OO

H+

pH > 11

(-1)

H+

50% (+1)

C

-NH3+

NH3+

OO

50% (+2)

pH 2 .18

pK -COOH

pH 8.95

H+

C

-NH2

NH3+

OO

pK -NH3+

50% (zero)

50% (+1)

H+

C

-NH2

NH2

OO

pH 10.53

pK R- NH3+

50% (-1)

50% (zero)

Aminoácido diamino monocarboxílico

Aminoácido diamino

monocarboxílico

Aminoácido monoamino

dicarboxílico

pK1 pK2pKRpI

pK1: 2,19

pK2: 9,67

pKR: 4,25

pI = pK1 + pKR / 2

pI = 2,19 + 4,25/ 2

pI= 3,22

Aminoácidos essenciais

Lisina

Treonina

Triptofano

Fenilalanina

Leucina

Valina

Metionina

Histidina

Figura 1: Via do Chiquimato

Precursora de aminoácidos

aromáticos

L-glutamato

Superprodução de L-

glutamato por

Corynebacterium

glutamicum

Oxidação incompleta devido

à ausência de biotina

(cofator da enzima α-

cetoglutarato

desidrogenase)

Produção de mutantes

Produção de mutantes ou mutantes regulatórios que

superproduzem aminoácidos;

Alteração da ação do repressor ou atividade

regulatória de enzimas alostéricas, permitindo a

superprodução destes aas;

L-Ornitina

• Intermediário do ciclo da Uréia

• Superprodução por mutantes que não produzem L-citrulina a

partir de L-ornitina

• Mutantes defectivos na ornitina transcarbamilase

• L-ornitina: produção de medicamentos → hiperamoninemia ou

nutrição parenteral

L- Prolina

• Serratia marcescens: mutante que superproduz prolina a partir de

glutamato

• Enzima alostérica (glutamato quinase) não suscetível a inibição por

feedback pela prolina

(1) Glutamato quinase, (2) γ –semialdeído desidrogenase

glutâmica (3) 1- pirolina 5-carboxylato reductase

Utilizando-se enzimas

• Síntese enzimática em escala comercial

• Descarboxilação do L-Aspartato

• Descarboxilase de Pseudomonas dacunhae