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GABRIEL BOER GRIGOLETTI LIMA
NEUROGÊNESE E ESTRUTURA DENDRÍTICA HIPOCAMPAIS EM RATOS
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTEICA DURANTE A ONTOGÊNESE
ENCEFÁLICA: ESTUDO COMPORTAMENTAL E INFLUÊNCIAS DO AMBIENTE
ENRIQUECIDO
Campinas
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
GABRIEL BOER GRIGOLETTI LIMA
NEUROGÊNESE E ESTRUTURA DENDRÍTICA HIPOCAMPAIS EM RATOS
SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTEICA DURANTE A ONTOGÊNESE
ENCEFÁLICA: ESTUDO COMPORTAMENTAL E INFLUÊNCIAS DO AMBIENTE
ENRIQUECIDO
Orientador: Prof.Dr. José Antonio Rocha Gontijo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE A VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO GABRIEL BOER GRIGOLETTI LIMA E ORIENTADO
PELO PROF. DR. JOSE ANTONIO ROCHA GONTIJO
Assinatura do Orientador
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Campinas
2015
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em
Ciências.
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Agradecimentos
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Em primeiro lugar agradeço meus pais, Patrícia Aline Boer e Ricardo Grigoletti
Pereira Lima, pela eterna confiança e amor ao longo dos meus 27 anos de idade.
Vocês são a parte mais importante de mim. Muito obrigado pela dedicação e
carinho. Sem vocês, nada disso seria possível. Vocês são o maior amor da minha
vida!
Agradeço meu orientador, José Antônio Rocha Gontijo, pela paciência, carinho
e imensurável conhecimento durante este processo de formação. Muito mais que
um orientador, você foi um amigo durante esta jornada. Espero, um dia, poder
contribuir com a ciência da mesma forma que você tem feito e, ter a mesma
simplicidade e humildade para formar muito mais que cientistas, mas pessoas éticas
e de bom coração. Tenho muito orgulho de ser seu aluno!
Agradeço a professora Patrícia pela imensa ajuda e contribuição a este
trabalho. Por direcionar os meus passos ao longo deste caminho. Você me ajudou a
entender todos os assuntos e temáticas que o curso de psicologia não me
proporcionou, como as especificidades das ciências biológicas. O entendimento e a
técnica que adquiri durante o mestrado passam pelo teu crivo. Obrigado por me
ajudar em todos os atos deste trabalho!
Agradeço meus amigos que, durante toda minha vida foram a melodia para
esta canção um tanto desafinada. Vocês trouxeram alegria quando eu menos
suspeitava ser possível. Em especial, agradeço Leandro Doblas e Henoch Pedro
Rodrigues Junior. Nossa amizade será eterna!
Agradeço toda a minha família pelos pilares que sempre me sustentaram ao
longo dos anos. Em especial, meus avós, Oswaldo Boer, Mara Boer, Antônio Carlos
Pereira Lima e Sirlei Barbosa, pelo carinho que me deram desde sempre. Eu amo
muito vocês!
Agradeço minha namorada, Mell Rossi Veloso, pelo apoio nessa reta final.
Suas palavras fizeram com que eu ganhasse mais força. Quando um sonho é
compartilhado com alguém, acaba por se tornar mais forte. Este sonhar tornou-se
sustentável com você ao meu lado. Muito obrigado. Eu amo você!
Agradeço meus professores da graduação, Abrahão dos Santos e Marcos
Peres, pelos ensinamentos que levarei comigo em todos os caminhos e
conjunturas. Vocês foram fonte de grande inspiração para minha formação crítica e
meus devaneios. Obrigado por tirarem os meus pés do chão!
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Agradeço meus colegas de laboratório, em especial, Agnes e Daniel, pela
importante ajuda nos experimentos e fundamental descontração, respectivamente.
Todos vocês fazem parte desta conquista.
Agradeço ao Prof. Eduardo Scabora pela disposição em nos ajudar com a
técnica do fracionamento. Muito obrigado!
Agradeço a UNICAMP pela oportunidade e estrutura para que este trabalho
fosse realizado.
Agradeço a CAPES pelo apoio financeiro ao longo desses dois anos.
Agradeço, enfim, a todos que de alguma maneira fizeram parte da minha vida
e, com demasiada certeza, contribuíram para minha formação enquanto pessoa,
cidadão e cientista. Muito Obrigado!
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Dedico este trabalho aos meus pais.
Meus maiores amores!
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RESUMO
O estresse gestacional afeta diversas regiões neurais incluindo hipocampo,
amígdala, corpo caloso, neocortéx, cerebelo e hipotálamo e frequentemente resulta
em redução no volume dos tecidos que compõem estas estruturas. A formação
hipocampal tem sido alvo de diversos estudos devido a sua importância na
plasticidade neural, na neurogênese e na regulação de processos cognitivos. Dessa
forma, este estudo buscou avaliar os efeitos da restrição proteica, durante a
gestação e amamentação, sobre a estrutura do hipocampo e o comportamento
relacionado à memória e emoções (ansiedade/medo) bem como sobre a
composição celular desta estrutura cerebral e, a influência sobre estes parâmetros
morfológicos e comportamentais, da exposição da prole de ratos machos ao
ambiente enriquecido. Os achados deste estudo representam o impacto pré e
perinatal da desnutrição proteica correspondente à situação de estresse nutricional,
no hipocampo que está envolvido no comportamento emocional bem como na
memória e no aprendizado. O estudo revelou dissociação entre a resposta do teste
comportamental e alterações no número de neurônios hipocampais, como
consequência da programação fetal. A ausência de alterações basais no
desempenho destes testes, ocorreram a despeito de redução no número de
neurônios no giro denteado do hipocampo. Vários autores têm sugerido que a atrofia
observada no hipocampo pode ser uma resposta compensatória para proteger o
hipocampo de danos adicionais. Nós demonstramos, pela primeira vez, que a
exposição materna a restrição proteica durante o desenvolvimento neural da prole
causa importantes mudanças morfológicas no hipocampo podendo tornar estes
animais vulneráveis a distúrbios neurais na idade adulta. O presente estudo pelo
menos sob aspecto morfológico ponderal confirma a teoria do "cérebro egoísta", um
paradigma recente que postula que, para manter estável seu próprio fornecimento
de energia, o cérebro modula o metabolismo da energia na periferia regulando tanto
a alocação quanto a ingestão de nutrientes. Neste trabalho, a ausência de
alterações ponderais encefálicas não está associada às intensas modificações na
composição citológica, particularmente hipocampal, nos diferentes grupos
experimentais. Embora pareça que as alterações nutricionais promovam alterações
irreversíveis ponderais na massa corporal, mas não no encéfalo e algumas de suas
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estruturas fundamentais, a composição e estrutura neuronal e sua recuperação a
partir de células primordiais, são profundamente modificadas pela restrição dietética
materna e, surpreendentemente, pela exposição ao ambiente enriquecido. Assim,
podemos afirmar que a teoria do cérebro egoísta explica a manutenção da massa
encefálica entretanto, a proporção dos diferentes tipos celulares é profundamente
alterada o que pode expandir nosso entendimento sobre a adaptação ao estresse e
a neuro-regeneração em estados neuro-comportamentais tidos como anormais.
Além disso, devemos ressaltar que, embora tenhamos observado redução
significativa no número de neurônios após o período de amamentação,
demonstramos pela primeira vez que este parâmetro é revertido pelo estimulo em
ambiente enriquecido.
Palavras-chave: Hipocampo; fracionamento; Neurogênese; Desenvolvimento Fetal;
Dieta com Restrição de Proteinas.
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ABSTRACT
The stress affects neural regions including gestational hippocampus, amygdala, corpus callosum, neocortex, cerebellum and hypothalamus and often results in a reduction in the volume of the tissues that make up these structures. The hippocampal gyrus training has been the subject of several studies due to its importance in neural plasticity in neurogenesis and regulation of cognitive processes. Thus, this study sought to assess the effects of protein restriction, during pregnancy and breastfeeding, on the structure of hippocampus, their duties on the memory and emotions (anxiety/fear) as well as on the cellular composition of this brain structure and influence over these morphological and behavioral parameters, the exposure of the offspring of male rats to the enriched environment. The findings of this study represent the pre and perinatal impact of malnutrition protein corresponding to situation of nutritional stress in the hippocampus, which is involved in emotional behavior as well as in memory and learning. The study revealed decoupling the behavioral test response and changes in the number of hipocampais neurons, as a consequence of fetal programming. The absence of basal changes in performance of these tests, occurred in spite of reduction in the number of neurons in the dentate gyrus of the hippocampus. Several authors have suggested that the observed atrophy in the hippocampus may be a compensatory response to protect the hippocampus of additional damage. We have demonstrated, for the first time, that maternal exposure to protein restriction during neural development of offspring cause important morphological changes in hippocampus may make these animals vulnerable to neural disorders in adulthood. The present study at least under morphological aspect by confirming the "selfish brain" theory, a recent paradigm that posits that in order to keep stable its own energy supply, the brain modulates the energy metabolism in the periphery by regulating both the allocation as the intake of nutrients. In this work, the unmodified brain mass, do not match with the intensity of cytological composition changes, particularly of the hippocampal nucleus, in different experimental groups. Although it seems that the nutritional changes promote irreversible changes in body mass, but not in the brain and some of its fundamental structures, composition and neuronal structure and its recovery from primordial cells, are deeply modified by the maternal dietary restriction and, surprisingly, by exposure to oxygen-enriched environment. Thus, we can affirm that the selfish brain theory explains the maintenance of brain matter however, the proportion of the different cell types is profoundly changed what can expand our understanding of the adaptation to stress and neuro-regeneration in neuro-behavioral States regarded as abnormal. Moreover, we must emphasize that, while we have observed a significant reduction in the number of neurons after the period of breastfeeding, we demonstrate for the first time this parameter is reversed by stimulus in enriched Keywords: neural ontogenesis, Cell Fractionation, gestational protein-restriction, rats offspring, fetal development
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Lista de Abreviaturas
11-HSD2 - 11--hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2
ACTH - Adrenocorticotrofina
AE - Ambiente Enriquecido
CEMIB - Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas
CEUA - Comissão de Ética na Experimentação Animal
COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DCX - Doublecortina
DG - Giro Denteado
GC - Glicocorticoides
GR - Receptores Glico-
HD - Hipocampo Dorsal
HHPA - Eixo Hipocampo-Hipotálamo-Pituitária-Adrenal
HPA - Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal
HV - Hipocampo Ventral
LCE - Labirinto em Cruz Elevado
LP - Low Protein (ração hipoproteica)
LPP - LP Submetidos ao Ambiente Padrão
MR - Mineralocorticoide
NP - Normal Protein (ração normoproteica)
NPCs - Células Progenitoras Neuronais
NPE - NP Submetidos ao Ambiente Enriquecido
NPV – Núcleos paraventriculares
SGZ - Zona Subgranular
SNC - Sistema Nervoso Central
SVZ - Zona Subventricular
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Lista de Figuras
Figura 1.a – Anatomia do Hipocampo
Figura 1.b – Histologia Hipocampal
Figura 2 – Curvas de Crescimento Neural
Figura 3 – Desenho Experimental
Figura 4.a – Primeiro Modelo de Ambiente Enriquecido
Figura 4.b – Segundo Modelo de Ambiente Enriquecido
Figura 5 – Monitor de Atividades
Figura 6 – Labirinto em Cruz Elevado
Figura 7 – Discriminação de Objetos
Figura 8 – Massa dos Animais
Figura 9 – Massa do Encéfalo
Figura 10 – Massa do hipocampo
Figura 11 – Número de núcleos
Figura 12 – Porcentagem de Neurônios e Células da Glia
Figura 13 – Gráfico Representativo do Giro Denteado
Figura 14 – Imunoistoquímica no Giro Denteado
Figura 15 – Imunoistoquímica nas Regiões Subventriculares
Figura 16 – Resultados Monitor de Atividade
Figura 17 – Taxa de Variação
Figura 18 – Movimentos Estereotipados
Figura 19 – Deslocamento
Figura 20 – Resultados Labirinto em Cruz Elevado
Figura 21 – Bolos Fecais
Figura 22 – Resultados Discriminação de Objetos
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Lista de Tabelas
Tabela 1 – Ingredientes da Ração
Tabela 2 – Valores do Monitor de Atividade
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Sumário
Resumo......................................................................................................... xi
Abstract......................................................................................................... xiii
1. Introdução................................................................................................. 1
1.1 Hipocampo........................................................................................... 5
1.2. Neurogênese no Hipocampo de Roedores Adultos............................ 7
1.3 Eixo Hipocampo-Hipotalamo-Pituitaria-Adrenal (HHPA)...................... 9
1.4. Ambiente Enriquecido.......................................................................... 10
2. Justicativa e Objetivos............................................................................. 13
2.1 Objetivos Específicos............................................................................ 14
3. Materiais e Métodos.................................................................................. 15
3.1 Animais................................................................................................. 15
3.2 Composição dos Grupos...................................................................... 15
3.3 Ambiente Enriquecido...........................................................................16
3.4 Teste do Monitor de Atividades............................................................ 18
3.5 Teste do Labirinto em Cruz Elevado.................................................... 19
3.6 Teste de Discriminação de Objetos...................................................... 20
3.7 Fracionamento...................................................................................... 21
3.8 Imunoistoquímica.................................................................................. 22
3.9 Análise estatística................................................................................. 23
4. Resultados................................................................................................. 25
4.1 Imunoistoquímica.................................................................................. 28
4.2 Teste do Monitor de Atividades............................................................. 33
4.3 Teste do Labirinto em Cruz Elevado..................................................... 36
4.4 Bolos Fecais......................................................................................... 37
4.5 Teste de Discriminação de Objetos...................................................... 38
5. Discussão................................................................................................... 39
6. Conclusão................................................................................................... 59
7. Referências Bibliográficas........................................................................ 63
xxii
1
1. INTRODUÇÃO
A desnutrição em todas as suas formas (subnutrição, deficiências de micronutrientes
e excesso de peso e obesidade) impõe custos econômicos e sociais inaceitavelmente
elevados para os países, independentemente dos níveis de renda e regimes de governo.
Estimativas mais recentes da FAO indicam que 12,5% da população mundial (868
milhões de pessoas) apresentam subnutrição calórica, no entanto, estes números
representam apenas uma fração dos níveis globais de desnutrição em populações
humanas. Estima-se que 26% das crianças do mundo apresentam raquitismo, 2 bilhões
de pessoas sofrem deficiência de um ou mais micronutrientes e 1,4 bilhão de pessoas
apresentam excesso de peso, dos quais 500 milhões são obesas (FAO, 2013). Além dos
efeitos diretos às pessoas que sofrem desnutrição, no caso de gestantes, efeitos
dramáticos sobre a prole alteram o desenvolvimento embrionário e fetal, determinando a
suscetibilidade de doenças na idade adulta. Este fenômeno, denominado programação
fetal, é o processo pelo qual modificações ambientais intrauterinas ou durante a tenra
infância, molda, em longo prazo, a fisiologia de órgãos e tecidos e, a homeostase
corporal (LANGLEY-EVANS, 2004). Assim, tem sido proposto a associação entre o baixo
peso ao nascer, o crescimento infantil e manifestações subsequentes de doenças
principalmente, na idade adulta, como processo pelo qual um estímulo ou injúria durante
períodos críticos do crescimento e desenvolvimento afetam permanentemente, estruturas
e funções teciduais (LUCAS, 1991).
As primeiras evidências de programação datam de 1964, quando Rose descreveu
alto risco de isquemia cardíaca em indivíduos cujos irmãos foram abortados ou morreram
na infância. Fordshal, em 1967 observou que em regiões da Noruega com alto índice de
mortalidade infantil os índices de morte por doenças cardiovasculares eram também
elevados. A década de 1980 é rica em estudos associando mortalidade por doenças
cardiovasculares e eventos adversos ocorridos na primeira fase da infância. No entanto,
o termo “programação fetal” foi usado pela primeira vez em 1991, por Alan Lucas, que
define programação como “resposta permanente de um organismo a um estímulo ou
insulto durante um período crítico do desenvolvimento”.
Observações feitas a partir do período histórico conhecido como Fome Holandesa
permitiram examinar a relação entre a exposição pré-natal à restrição alimentar e sua
associação com doenças psiquiátricas, incluindo transtornos afetivos. Provocada pelo
2
bloqueio nazista no último ano da Segunda Guerra Mundial, a fome grassou a partir de
outubro de 1944, se agravando gradativamente ao longo dos meses seguintes, afetando
principalmente, cidades da Holanda ocidental. De fevereiro à abril de 1945, a fome
atingiu o seu pico causando elevada mortalidade, e estando associada a futura baixa
fertilidade e comprometimento de nascimentos viáveis (STEIN et al., 1975). A
disponibilidade de extensa documentação sobre os hábitos alimentares e uma excelente
base de dados médicos sobre desordens psiquiátricas, tem permitido uma avaliação
epidemiológica inédita da subnutrição associada a transtornos psiquiátricos (BROWN et
al., 2000). Brown et al (2000) relacionou a exposição pré-natal à fome com transtornos
afetivos na idade adulta. Susser e Lin, 1992, deste mesmo grupo, apresentaram um
relatório sobre transtornos psiquiátricos estabelecendo um risco duas vezes maior de
desenvolvimento de esquizofrenia na população exposta a fome severa no início da
gestação.
O desequilíbrio nutricional materno leva a alterações que permitem a
sobrevivência da prole, embora seus efeitos, em longo prazo, promovam alterações na
função cardiovascular, renal, respiratória, endócrina e em componentes do sistema
nervoso central (BARKER, 1995; FOWDEN et al., 2006). Assim, evidências demonstram
que algumas doenças no adulto podem ser induzidas pela manipulação do ambiente fetal
(BARKER, 1998; NYIRENDA et al., 1998) e ainda comprovam que, quando um feto ou
neonato é exposto a um ambiente não usual durante rápida fase de crescimento, as
respostas adaptativas podem se tornar permanentes. Desta forma, tem sido estabelecido
que não somente fatores genéticos, mas também mecanismos epigenéticos orquestrados
pelo ambiente moldam desde a fase intrauterina, o perfil de saúde e a propensão às
doenças ao longo da vida. Estudos apontam ainda que as implicações da manipulação
do ambiente fetal podem não estar limitadas à primeira geração, prolongando os efeitos
da programação pelas gerações subsequentes (DRAKE et al., 2004).
Embora alguns efeitos nutricionais sejam consequência direta da alteração na
disponibilidade de substrato, parte desses resultados se deve à mediação hormonal, que
pode alterar o desenvolvimento de tecidos fetais específicos em períodos críticos do
desenvolvimento, levar a mudanças permanentes na secreção hormonal ou à
sensibilidade tecidual a hormônios (BARKER, 1998).
Os glicocorticoides são os principais hormônios relacionados à homeostase em
condições de estresse físico, psicológico ou nutricional. Muitas características da
exposição excessiva a glicocorticoides sugerem seu possível papel na programação de
3
desordens metabólicas e cardiovasculares. Os receptores de glicocorticoides são
altamente expressos em quase todos – senão todos – os tecidos fetais a partir do
segundo trimestre gestacional (DIAZ et al., 1998; COLE et al., 1995), assim como na
placenta e nas membranas fetais. O tratamento de ratas prenhas com baixas doses de
dexametasona, glicocorticoide sintético usado na prática da obstetrícia, reduz o peso ao
nascer e eleva a pressão arterial sanguínea na prole adulta (BENEDIKTSSON et al.,
1993).
Embora os glicocorticoides sejam em sua maioria lipofílicos e rapidamente
atravessem a placenta, normalmente o feto tem níveis fisiológicos muito menores de
glicocorticoides do que sua progenitora (CAMPBELL e MURPHY, 1977). Essa diferença
é garantida pela enzima 11--hidroxiesteróide desidrogenase do tipo 2 (11-HSD2)
placentária, que catalisa o rápido metabolismo do cortisol e da corticosterona para
inativá-las nas formas 11-ceto cortisona e 11-desidroxicorticosterona, respectivamente
(MURPHY et al., 1974; LOPEZ-BERNAL et al., 1980). Essa barreira enzimática
placentária garante que a maioria, mas nem todos os glicocorticoides maternos sejam
inativados, de forma que o cortisol fetal circulante seja, em teoria, apenas aquele
derivado das adrenais do feto (BENEDIKTSSON et al., 1997). No entanto, a eficiência da
11-HSD2 placentária varia consideravelmente tanto em humanos quanto em ratos
(BENEDIKTSSON et al., 1993; STEWART et al., 1995). Sugere-se que em diferentes
modelos de programação fetal ocorra deficiência relativa de 11-HSD2 placentária,
permitindo o acesso ao feto aos glicocorticoides maternos, promovendo assim retardo no
crescimento da prole e, uma possível resposta de programação relacionada a doenças
cardiovasculares, metabólicas e psiquiátricas futuras (EDWARDS et al., 2005). De fato,
experimentos em ratos, tem confirmado que uma menor atividade da 11-HSD2
placentária, e presumivelmente, a maior exposição fetal a glicocorticoides resulta em
fetos menores com placentas maiores.
A associação entre o peso ao nascer e a 11-HSD2 placentária foi verificada em
humanos (STEWART et al., 1995), embora nem todos os estudos tenham confirmado
essa observação (ROGERSONET al., 1997). No entanto, mutações deletérias do gene
da 11-HSD2, em humanos, estão associadas com baixo peso ao nascer (DAVE-
SHARMAET al., 1998). Além disso, marcadores bioquímicos de exposição fetal a
glicocorticoides estão relacionados com a redução da função da 11-HSD2 placentária
próximo ao nascimento (BENEDIKTSSONET al., 1995).
4
Em mamíferos, a organização morfológica e funcional do sistema nervoso central
(SNC) é estabelecida durante os períodos pré e pós-natais, envolvendo síntese de
componentes celulares, neurogênese, gliogênese, diferenciação e migração celular.
Estes processos são afetados por diversos fatores ambientais, tais como a nutrição
materna e aspectos comportamentais, podendo acarretar, em longo prazo, alterações na
função cerebral da prole (MATOS et al., 2011). Crianças expostas a má nutrição em
períodos perinatais apresentam déficits cognitivos (GALLER AND RAMSEY, 1989;
WALKER et al., 2000) e elevado risco de desenvolverem desordens psiquiátricas, tais
como depressão (BROWN et al., 2000; COSTELLO et al., 2007) e esquizofrenia
(WAHLBECK et al., 2001; BROWN AND SUSSER, 2008).
A grande plasticidade da população neuronal durante o desenvolvimento pós-natal
sugere que os mecanismos de regulação que geram as diversas populações neuronais
adultas em evolução não estão restritos ao período embrionário (BANDEIRA et al., 2009).
No homem, a ontogênese encefálica cessa após o nascimento, entretanto, no rato, ela
continua até o 14° dia de vida. (AVISHAI-ELINER et al, 2002; ROMIJN et al, 1991)
Segundo a literatura vem mostrando, uma dieta adequada e equilibrada é um dos
principais fatores para a maturação do sistema nervoso central (SNC), e por conseguinte,
do estabelecimento de padrões comportamentais (MORGANE et al., 1993;
WAINWRIGHT, 2001). Muitos estudos têm sido realizados para compreender os efeitos
da desnutrição materna durante a gestação e, durante a lactação, sobre o
desenvolvimento físico, neuroquímico, neurofisiológico e comportamental da prole na
idade adulta. Esse estudos afirmam que quanto mais cedo o insulto dietético, mais grave
e permanente serão os seus efeitos (MORGANE et al., 1992).
Estudos mostram que o stress materno durante o desenvolvimento do cérebro fetal
humano provoca profundos efeitos neurobiológicos sobre o desenvolvimento pós-natal,
levando ao atraso do crescimento fetal (CLIVER et al., 1992) e do desenvolvimento motor
(HUIZINK et al., 2003), aumentando a susceptibilidade de perturbações afetivas em
crianças e adolescentes (WADHWA et al, 2001; WALKER et al, 2008)
Estudos em modelos animais submetidos a má nutrição gestacional, têm
demonstrado que a prole adulta apresenta significativo déficit de aprendizado e memória
(TONKISS AND GALLER, 1990; FUKUDA et al., 2002). Adicionalmente, estes animais
apresentam excessiva resposta a fatores estressantes (TRZCTNSKA et al., 1999; LEVAY
et al., 2008) e predisposição à adição de drogas psicotrópicas (LAINO et al., 1993;
5
ALMEIDA et al., 1996). Ainda não são conhecidos os mecanismos celulares e
moleculares envolvidos nestes distúrbios neuro-comportamentais.
Sabemos que a desnutrição proteica no início da vida acarreta mudanças
duradouras na estrutura e na neuroquímica no sistema nervoso central, assim como
anomalias comportamentais (DOBBING, 1987: WIGGINS et al., 1984; MORGANE et al.,
1978). Estudos em ratos indicam que, quando a desnutrição é imposta durante o período
embrionário, esta pode alterar o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC),
especialmente a plasticidade do hipocampo (CINTRA et al., 1997; KEHOE et al., 2001;
DURAN et al., 2006). Sabemos também, que a desnutrição proteica pode causar um
decréscimo no número de receptores de glicocorticoides no hipocampo, alterar a
sensibilidade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e, consequentemente, a
resposta do organismo ao estresse (KEHOE et al., 2001; MESQUITA et al., 2002;
LISTER et al., 2005; SAMPAIO et al., 2008).
1.1 Hipocampo
A formação hipocampal é funcional e anatomicamente dividida em porção dorsal,
cuja função está relacionada à memória, e porção ventral relacionada com as emoções
(BANNERMAN et al., 2004, figura 1a). Recentemente, Bannerman e colaboradores
(2014) demonstraram que a porção ventral está relacionada com a manifestação de
ansiedade (figura 2). Histologicamente o hipocampo é dividido nos subcampos CA1, CA3
e giro denteado (SCHARFMAN, 2007, figura 1b)
6
Figura 1: Em A, temos um esquema representativo da divisão funcional do hipocampo. Em
B, uma fotomicrografia de um corte histológico mostrando os diferentes subcampos
histológicos hipocampais (BANNERMAN et al., 2014 figura 1a; Neal Melvin 2007, figura 1b).
Em roedores o desenvolvimento do hipocampo persiste após nascimento
até a terceira semana de vida (MORGANE et al., 1993, figura 2) embora, a
diferenciação e organização de seus neurônios ocorra entre o 17º e o 22º. De
gestação (BAYER, 1980). No giro denteado a neurogênese continua até a vida
adulta (ALTMAN e DAS, 1965).
Figura 2. Curvas de crescimento representando o aparecimento dos diversos tipos celulares
neurais em ratos (adaptado de Morgane et al, 2002).
CA1
CA3Giro
Dorsal:memória espacial
Ventral: ansiedade
A B
7
1.2 Neurogênese no hipocampo de roedores adultos
A formação hipocampal e a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais
são regiões onde grandes números de novos neurônios continuam a ser produzidos
na vida adulta. As células que originam no SVZ migram para o bulbo olfatório e se
diferenciam em interneurônios locais, enquanto que no hipocampo, novos neurônios
tem origem na zona subgranular (SGZ) do giro denteado (DG) a partir de uma
população local de células radiais que, atuam como células progenitoras neuronais
(NPCs). Através de processos de proliferação, diferenciação neuronal, migração,
crescimento dos dendritos e do axônio e formação de sinapses, em três semanas
as NPCs se apresentam integradas à rede neuronal do DG como células granulares
e estendem projeções axonais ao longo das fibras de Mossy para a região CA3
hipocampal (STANFIELD AND TRICE, 1988; HASTINGS AND GOULD, 1999).
Embora a importância da neurogênese hipocampal no adulto não seja totalmente
compreendida, várias linhas de evidência indicam que ela contribui para a formação
da memória e pode estar envolvida no desenvolvimento de desordens psiquiátricas
(DAVID et al., 2010; DENG et al., 2010).
A neurogênese é a formação de novos neurônios e pode ser dividida em diversos
processos independentes. Estes processos incluem a proliferação de células
progenitoras, a diferenciação destas progenitoras em neurônios, a maturação dos
neurônios recém-nascidos e a integração desses neurônios à circuitos neurais pré-
existente (CHRISTIE e CAMERON, 2006; KEMPPERMANN, 1997). Em todas estas
etapas pode ocorrer morte celular (PETREANU e ALVAREZ-BUYLLA, 2002). A
proliferação e a morte celular são dois processos regulados de forma independente,
porém o balanço entre estes dois eventos determinam a taxa de geração dos novos
neurônios e da renovação de circuitos neurais (CHRISTIE e CAMERON, 2006).
O hipocampo é uma estrutura cerebral relacionada com: a emoção, memória e
aprendizado espacial. Sua estrutura é dividida em duas porções: o hipocampo
ventral (HV) e o hipocampo dorsal (HD). Esta separação é feita de acordo com sua
funcionalidade descrita na literatura (FANSELOW e DONG, 2010). No
processamento de informações, o HD seria responsável pela memória espacial,
enquanto o HV seria responsável pelas respostas ao estresse e emoções
(FANSELOW e DONG, 2010). O hipocampo consiste no corno de Ammon (CA, de 1
a 4) e no GD (CAMPBELL e MACQUEEN, 2004). O GD encontra-se ao longo de
8
todo o hipocampo e a neurogênese ocorre em todo GD, portanto, qualquer parte do
hipocampo pode ser utilizada para avaliação da neurogênese (AIMONE et al.,
2010).
A proliferação é a divisão celular de células progenitoras pode dar origem a
células-filhas idênticas às progenitoras (para revisão ver ALVAREZ-BUYLLA et al.,
2002). A diferenciação é o comprometimento da célula-filha com o fenótipo ao qual
dará origem, glia ou neurônio. Cada uma dessas células diferencia-se, passando a
expressar proteínas específicas e, nesta fase, os neurônios expressam a
doublecortina (DCX). A DCX é uma proteína associada a microtúbulos, que é
expressa em precursores neuronais e neurônios imaturos, tanto no cérebro em
desenvolvimento quanto no adulto (BROWN et al., 2003). Depois das células já
estarem comprometidas com o fenótipo neuronal, elas migram para a região alvo
onde irão amadurecer e integrar-se à circuitos neurais já existentes (PETREANU e
ALVAREZ-BUYLA, 2002). Assim, as células formadas na ZSV migram para camada
granular do bulbo olfatório, enquanto as células formadas na ZSG do GD migram
para camada granular do GD do hipocampo. A maturação é o amadurecimento
dessas células. Nesta fase, o neurônio recém-formado desenvolve a árvore
dendrítica e inicia as conexões sinápticas com os neurônios já existentes.
Geralmente esta fase se dá dos 20 aos 30 dias após o nascimento desses
neurônios (BOHLEN AND HALBACH, 2007). Para que os neurônios possam
integrar-se à circuitos neurais existentes, é necessário sua sobrevivência em todas
estas etapas. PETREANU e ALVAREZ-BUYLLA (2002) verificaram um declínio na
contagem desses neurônios entre 15 e 45 dias após o nascimento, e que após 1
ano, apenas um terço destes são encontrados na camada granular. Para estudar
cada uma das fases da divisão a diferenciação celular foram desenvolvidos vários
marcadores celulares para identificação dessas etapas (para revisão ver BOHLEN
AND HALBACH, 2007). Com o desenvolvimento destas técnicas para detecção de
marcadores foi possível acompanhar as diferentes etapas da neurogênese. As
diversas fases da neurogênese no GD do hipocampo de ratos e camundongos
adultos são afetadas por eventos externos ao organismo, tais como, o
enriquecimento ou empobrecimento ambiental (KEMPERMANN et al., 1998; MESHI
et al., 2006, LLORENS-MARTÍN et al., 2007).
A exposição a um ambiente enriquecido (AE) estimula (induz) a neurogênese
hipocampal em camundongos adultos (KEMPERMANN et al., 1998; MESHI et al.,
9
2006, LLORENS-MARTÍN et al., 2007) e produz efeitos comportamentais
semelhantes ao de fármacos antidepressivos (MESHI et al., 2006). Desta forma,
parece que a neurogênese hipocampal é um importante fenômeno associado a
modificações do comportamento em camundongos adultos expostos a estímulos
aversivos (SANTARELLI et al., 2003; SURGET et al., 2008). No entanto, não está
bem determinado se a exposição a ambiente enriquecido modifica a resposta
depressiva e/ou afeta a neurogênese que ocorre no GD do hipocampo de
camundongos adultos. Ou ainda se, este processo, é importante para os efeitos
comportamentais em ratos originários de mães submetidas à desnutrição proteica
durante a gestação.
1.3 Eixo Hipocampo-Hipotalamo-Pituitaria-Adrenal (HHPA)
Em ratos, existem evidências de que a função pós-natal do eixo hipocampo-
hipotalamo-pituitaria-adrenal (HHPA) pode ser alterada por eventos intrauterinos.
Tais alterações podem ocasionar, no adulto, exposição cronicamente aumentada a
elevados níveis de glicocorticoides (GC) ou exacerbação na resposta ao estresse.
Essas alterações são geralmente atribuídas à modificações na taxa de
realimentação de esteroides, condicionado pelo nível de expressão de genes para
receptores de GC, incluindo receptores glico- (GR) e mineralocorticoide (MR)
hipocampais. Paralelamente, ocorrem alterações em outros neurotransmissores em
várias outras partes do cérebro (para revisão ver WELBERG, 2001).
O hipocampo contém grande quantidade de receptores corticosteroides que são
importantes reguladores de seu processo de realimentação negativa (DE KLOET et
al, 1998; JACOBSON e SAPOLSKY, 1991). Alterações na expressão destes
receptores podem causar, em longo prazo, modificações dos níveis centrais de
CRH causando elevação dos níveis plasmáticos de adrenocorticotrofina (ACTH) e
de GC.
Estudos têm demonstrado que a exposição de animais ao estresse crônico pode
promover alterações permanentes na formação hipocampal, como atrofia de corpos
neuronais e remodelamento dendrítico, morte neuronal e gliose, especialmente na
região C3. Estes efeitos observados no hipocampo são dependentes da ação de
glicocorticoides e expressão de seus receptores, o que desencadeará efeito em
10
cascata alterando a expressão de neuroaminoácidos que atuam como mediadores a
jusante do remodelamento dendrítico (RADLEY et al., 2005).
Os corticosteroides, atuando através de dois receptores distintos, influenciam não
somente a proliferação e morte celular, mas também, provavelmente, a
diferenciação celular. A ocupação dos MR parece ser essencial para a
sobrevivência dos neurônios granulares gerados. Em contrapartida, enquanto os
GR podem induzir perda de neurônios na ausência de ativação de MR, parece que
a ação de mineralocorticoides ligados a seus receptores normalmente, promove
menos efeitos drásticos sobre a estrutura hipocampal envolvendo apenas atrofia
dendrítica e perda de contatos sinápticos (Revisto em SOUSA E ALMEIDA 2002).
Recentemente, estudos em nosso laboratório demonstraram que ratos machos
adultos, cujas mães foram submetidas à restrição proteica durante toda a gestação,
apresentam alterações na expressão hipocampal de GR e MR paralelamente ao
aumento na concentração sérica de corticosterona nos levando a supor que estes
estão envolvidos na resposta exacerbada do eixo HHPA observada neste modelo.
Adicionalmente, este estudo mostrou uma redução no hipocampo da expressão de
receptores AT1 o que nos leva a supor que ocorra uma adaptação
contrarregulatória no sentido de atenuar a resposta exacerbada ao estresse.
Recentemente, observamos ainda redução na expressão de 5HT1A e aumento de
5HT2A no hipocampo e aumento do comportamento de ansiedade (dados não
publicados). Estas alterações neuroquímicas podem induzir consequências
importantes na gênese de distúrbios de ansiedade e de humor bem como da
depressão. Matos et al. (2011) examinaram o processo de neurogênese no
hipocampo de ratos adultos expostos a restrição de nutrientes (50% da quantidade
de ração consumida pelos animais controle) nos períodos pré-natal e/ou neonatal
e encontraram redução na proliferação celular mas não na diferenciação das
novas células geradas.
1.4 Ambiente enriquecido
O ambiente enriquecido (AE) é composto por uma combinação de estímulos
inanimados e sociais complexos. Animais em ambientes enriquecidos são criados
em grandes grupos e mantidos em grandes espaços com uma variedade de
11
objetos ofertados (por exemplo, brinquedos, túneis, material de nidificação e
escadas) e que são frequentemente modificados na sua disposição. Um
componente importante do ambiente enriquecido é a oportunidade de alcançar
altos níveis de atividade física voluntária em rampas ou rodas giratórias
(HOSSEINY et al., 2014)
Muitos estudos mostram que o AE provoca mudanças no cérebro em nível
molecular, anatômico e funcional (Sale et al. 2009). A exposição ao AE promove
aparecimento de efeitos benéficos em modelos animais de desordens do sistema
nervoso, incluindo as doenças neurodegenerativas, lesão cerebral e mutações que
comprometem a plasticidade sináptica e ao aprendizagem. (Young et al. 1999; Ilin
e Richter-Levin 2009; Nithianantharajah e Hannan 2006; Baroncelli et al. 2010).
O AE vem demonstrando ter um efeito benéfico sobre uma variedade de
processos fisiológicos, como a melhora da aprendizagem e da memória, assim
como a redução do declínio cognitivo, tipicamente associado com o
envelhecimento (Sale et al., 2009).O ambiente enriquecido também contribui para
o aumento da sinaptogênese no hipocampo, o aumento do número de espinhas
dendríticas e de sinapses em algumas populações neuronais (Moser et al 1994;.
Rampon et al 2000).
Estudos mostram que perturbações da 4ª a 6ª semana de vida, em ratos, são
cruciais para determinar a função do hipocampo na idade adulta (Guo et al. 2013).
O AE promove uma série de mudanças no hipocampo que, por ser uma estrutura
cerebral altamente adaptável, desempenha um papel crucial no aprendizado. Foi
visto também, no giro denteado do hipocampo, que a exposição ao AE aumenta a
neurogênese e reduz a morte celular por apoptose (Nithianantharajah e Hannan
2006;. Kempermann et al 1997, 2002).
Assim, no presente trabalho estamos interessados em investigar se a prole
de ratas submetidas à restrição proteica gestacional apresenta alterações
comportamentais e se estas estão associadas a modificações da neurogênese do
hipocampo de ratos adultos in vivo. Além disso, queremos investigar se o
enriquecimento ambiental, outro estímulo indutor de neurogênese hipocampal,
modificaria estas possíveis alterações comportamentais e a própria neurogênese
12
13
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Tendo em vista a fundamentação apresentada acima o desenvolvimento do
presente projeto se JUSTIFICA pela:
Prevalente desnutrição materno-infantil, com evidentes repercussões sobre a saúde
de populações e, a merecida preocupação para o desenvolvimento de políticas de
saúde publica que minimizem os efeitos desta em países desenvolvidos e em
desenvolvimento;
Conhecida repercussão fetal da desnutrição materno-infantil em períodos críticos do
desenvolvimento ontogênico, vinculada à manifestação programada de alterações
no desenvolvimento morfológico e funcional de órgãos e sistemas;
A programação fetal por desnutrição altera a função pós-natal do eixo HHPA
podendo ocasionar, no adulto, exposição aumentada cronicamente a
glicocorticoides (GC) ou exacerbação na resposta ao estresse;
Essas alterações são geralmente atribuídas a modificações na taxa de
realimentação de esteroides, condicionado pelo nível de expressão de genes para
receptores de GC;
O hipocampo e contêm MR e GR que são ativadas por estresse e contribuem para
o controle neural da resposta endócrina e comportamental de adaptação ao
estresse
Os corticosteroides modulam alterações estruturais tanto no volume quanto na
estrutura fina (por ex: número de sinapses e morfologia dendrítica) hipocampais e
do MPFC;
Evidências que tais alterações estão relacionadas a modificações definitivas da
modulação do sistema nervoso central.
Assim, são OBJETIVOS GERAIS do presente projeto estudar, em ratos
submetidos in útero a desnutrição comparativamente aos seus controles:
Os efeitos da restrição proteica gestacional sobre a neurogênese constitutiva e
induzida e no número de neurônios e gliócitos no hipocampo relacionando estes
achados ao comportamento da prole de ratos machos. Adicionalmente
14
observaremos se estes parâmetros são modificados pela exposição dos animais
ao ambiente enriquecido.
2.1. Objetivos Específicos
1. Avaliar os efeitos da desnutrição proteica materna sobre:
- O comportamento dos animais estudado por testes específicos;
- O número de células em proliferação e dos neurônios novos no giro
denteado do hipocampo;
2. Avaliar os efeitos do tipo de ambiente sobre:
- O comportamento dos animais estudado por testes específicos;
- O número de células em proliferação e dos neurônios novos no giro
denteado do hipocampo.
3. Correlacionar os resultados dos testes comportamentais com o número de células
em proliferação celular e o número de neurônios.
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar HanUnib machos e fêmeas (250-300 g)
provenientes do Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas, SP
(CEMIB). Os experimentos estavam de acordo com as normas do Colégio Brasileiro
de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão de Ética na
Experimentação Animal (CEUA #3634-1) da Universidade Estadual de Campinas.
Os animais foram mantidos no biotério com temperatura e umidade
controlada com ciclo de luz 12h/12h, com água e ração padrão para roedores ad
libitum até completarem onze semanas de idade, quando teve início o período de
acasalamento. Os mesmos foram acasalados em sistema de harém (dois ou três
fêmeas para cada macho) por 12 horas em ambiente escuro. A presença de
espermatozoide no lavado vaginal foi utilizada como indicativo de prenhez.
3.2. Composição dos grupos experimentais
Após a confirmação da prenhez as fêmeas foram divididas em dois grupos.
Um grupo recebeu ração normoproteica (NP – Normal protein), contendo 17% de
caseína (n=40) e outro grupo recebeu ração hipoproteica (LP – Low protein)
contendo 6% de caseína (n=40) (veja Tabela 1 para composição da Dieta). As
fêmeas foram alocadas em caixas individuais. As dietas normoproteica e
hipoproteíca foram produzidas pela Pragsoluções Biociências, Jaú, SP. Após o
nascimento a ninhada foi reduzida mantendo oito filhotes por rata e somente os
machos foram utilizados. Durante a amamentação as ratas continuaram a ser
alimentadas com as rações NP e LP. Após o desmame, após a terceira semana do
nascimento, os animais passaram a ser alimentados com dieta padrão do biotério e
foram formados os seguintes grupos: (1) animais do grupo NP submetidos ao
ambiente padrão (NPP, n=20); (2) animais do grupo NP submetidos ao ambiente
enriquecido (NPE, n=20); (3) animais do grupo LP submetidos ao ambiente padrão
(LPP, n=20) e, (4) animais do grupo LP submetidos ao ambiente enriquecido (LPE,
n=20, figura 4). Após 21 dias no ambiente padrão ou enriquecido os animais foram
submetidos aos testes comportamentais como descrito abaixo.
16
3.3. Ambiente enriquecido
Nos primeiros 41 dias de vida, após amamentação, os animais permaneceram
em gaiolas para “pets” coloridas e compostas por diversos tubos, rampas e rodas
para exercício de animais. Objetos de madeira coloridos eram ofertados para
exploração (Figura 4A). Aos 53 dias de vida os ratos já haviam crescido e, por este
motivo foram transferidos para gaiolas com tubos e brinquedos maiores, nas quais
permaneceram por mais dez dias (Figura 4).
Figura 3. Esquema do desenho experimental
17
Figura. 4 Ambientes enriquecidos utilizados nos primeiros 11 dias (A) e nos próximos 10 dias (B).
Tabela 1: Quantidade para 1 kg de dieta.
INGREDIENTES NORMAL PROTEIN 17% BAIXA PROTEÍNA 6%
Amido de milho 410,10 484,80
Caseína 188,90 66,70
Amido dextrinizado 130,50 159,00
Sacarose 100,00 121,00
Óleo de soja 70,00 70,00
Celulose microcristalina 50,00 50,00
Mix mineral AIN 93 35,00 35,00
Mix vit AIN 93 10,00 10,00
L cistina 3,0 3,0
Bitartarato de colina 2,5 2,5
BHT 0,014 0,014
18
Testes Comportamentais
3.4. Teste de Monitoramento de Atividade
Como no teste do campo aberto esse equipamento é apropriado para
demonstrar possíveis diferenças entre animais normais e animais com alterações no
sistema nervoso central (SNC), em termos de suas habilidades para adquirir e
utilizar informação espacial, bem como para habituação a um novo ambiente que
impõe situação de medo e estímulo à emoções. As caixas de atividade (INSIGHT®)
são dotadas de seis barras com 16 sensores infravermelhos que detectam e
monitoram a posição relativa do animal nestas caixas (Figura 5). Durante o
experimento o registro e posição dos animais ponto a ponto e registrado e
armazenado por software especifico, permitindo análise detalhada do
comportamento destes animais. As principais análises efetuadas foram: distância
percorrida pelo animal, velocidade média, tempo de repouso, movimentos
ambulatórios, movimentos instáveis (ou estereotipados), movimentos rotacionais e o
número de pulos e de permanência em posição ortostática.
Para a adequada observação comportamental, os animais foram colocados
em ambiente com completo silêncio e baixa luminosidade, no centro do monitor
durante 5 minutos e seus movimentos foram registrados por 5 minutos. Ao final de
cada sessão experimental, foi também verificado o número de bolos fecais (também
definido como evidência de ansiedade ou medo) (HILL, 2006; LAUND, 2005) e, em
seguida o equipamento foi higienizado com álcool etílico 5% v/v, para retirar o
cheiro do animal anterior.
19
FIGURA 5. Monitor de atividades
3.5. Teste em Labirinto em cruz elevado
O estado de ansiedade dos animais foi avaliado no labirinto em cruz elevado
(LCE) em ambiente com completo silêncio e baixa luminosidade. Este teste
comportamental foi descrito por Pellow & Chopin (1985), e convalidado por Pellow &
File (1986), para o estudo de drogas ansiolíticas e ansiogênicas em ratos. Este teste
fundamenta-se na aversão dos roedores a espaços abertos e altos, o que acarreta
estimulação tanto dos centros do medo como da exploração, sendo interpretado
como indutor da ansiedade. Os animais foram colocados na arena central do
labirinto (Figura 6) com a cabeça voltada para o espaço fechado e sensores
localizados nos diferentes seguimentos dos braços, detectam o número de vezes e
o tempo em segundos que o animal entrava e permanecia nos braços abertos e
fechados e na arena central durante período de 5 minutos de observação. O índice
de ansiedade é definido e corresponde à razão entre o número de entradas e tempo
de permanência nos braços abertos e o número total de entradas e tempo de
permanência nos dois braços (Pellow, 1985). Os resultados obtidos foram
armazenados e analisados por software específico para o experimento. Ao final de
cada sessão, o aparelho era higienizado com álcool etílico 5% v/v, para retirar o
cheiro do animal anterior.
20
Figura 6. Labirinto em Cruz Elevado
3.6. Teste de discriminação de objeto novo:
No primeiro dia foi executada a ambientação dos animais que permaneceram
em uma caixa acrílica durante 3 minutos no período da manhã e mais 3 minutos no
período da tarde. No dia seguinte, pela manhã, os animais foram colocados na
mesma caixa contendo dois objetos iguais (fase de familiarização, figura 7 A)
durante 5 minutos. Para testar a memória de curto prazo, após um período de 3
horas um dos objetos foi trocado por um novo objeto (de cor e formato diferentes)
(Figura 7 B) e, durante 5 minutos, a exploração dos objetos foi filmada. Após 24
horas testamos a memória de longo prazo mantivemos um dos objetos familiar e
adicionamos outro objeto novo, também distinto em relação àqueles do teste
anterior (Figura 7 C), sendo a exploração filmada durante 5 minutos. Ao final de
cada sessão, o aparelho era higienizado com álcool etílico 5% v/v, para retirar o
cheiro do animal anterior. Consideramos que o animal estava explorando o objeto
quando este se aproximava com o focinho a uma distância de cerca de 1 centímetro
do objeto. O tempo (t) de exploração de cada objeto foi registrado e a razão de
discriminação (D) foi calculada como: a razão entre o tempo de exploração do
objeto novo subtraído do tempo de exploração do objeto familiar em relação ao
21
tempo total de exploração dos dois objetos e expressado percentualmente, (Stuart
et al., 2013), de acordo com a seguinte fórmula:
D= (t [novo]-t [familiar]) / (t [novo] +t [familiar]) *100
Figura 7. Teste de discriminação de objeto novo. As figuras A, B e C
representam os objetos utilizados nos períodos de familiarização, memória de curto
e longo prazo, respectivamente.
3.7. Fracionamento Isotrópico
Para avaliar o número de células do hipocampo, especificamente a
quantidade de neurônios, utilizamos a técnica denominada fracionamento
isotrópico (HERCULANO-HOUZEL, S e LENT, R. 2005).
Três filhotes machos de cada grupo, com idade de 42 dias de vida,
foram perfundidos com salina heparinizada e, em seguida, com solução de
paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4. Os hipocampos foram
dissecados, pesados e submetidos ao fracionamento em um vidro
homogeinizador com 3mL de solução de dissociação (40mM de citrato de
sódio e 1% de triton X-100). Assim que o tecido apresentou-se perfeitamente
homogeneizado na solução de dissociação, com auxilio de uma pipeta
Pasteur foi transferido para tubos de centrifugação graduados e o volume
final (vf) foi precisamente ajustado com PBS 0,1M para 14mL.
Para determinar o número total de núcleos e de núcleos de neurônios,
homogeneizamos, manualmente, 20 vezes a solução por tombamento,
imediatamente uma alíquota de 1mL foi retirada e centrifugada por 5’ a
22
6000rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi suspendido para 1mL
com PBS. Este procedimento foi repetido três vezes.
Após a última lavagem o pellet foi suspendido e encubado à
temperatura ambiente por 24hr com anti-NeuN mouse lgG (1:200 em PBS;
Chermicon, Temecula, CA). No dia seguinte a alíquota foi lavada três vezes e
os núcleos foram encubados com anticorpo secundário, Alexa Fluor® 488
goat Anti-Mouse lgG 3 (y3) (1:200 em 40% PBS, 10 NGS (normal Goat
Sorum) e 50% DAPI) por 2 horas. Novamente, os núcleos foram lavados e
suspendidos em 200µl de PBS para contagem dos núcleos de neurônios em
microscópio de fluorescência.
Após a homogeneização mecânica, uma alíquota de 10µl foi aplicada à
câmera de Neubauer. Após 5’ de espera, foi feita a leitura, contando
primeiramente os núcleos marcados com DAPI, tendo em vista que este
reagente marca todos os núcleos indiscriminadamente (endotélio, células da
glia, neurônios). Em seguida, trocou-se o filtro azul do microscópio pelo filtro
verde, realizando a contagem dos núcleos marcados com Alexa 488
(marcador de núcleos de neurônios).
A contagem do núcleo de neurônios só foi considerada válida para
marcações (DAPI e Alexa 488) que se sobrepunham. Para cada animal,
todos os núcleos, bem como os núcleos marcados por NeuN, foram contados
em 176 quadrantes. Cada quadrante contém 4nL, desta forma, o volume final
foi de 704nL. O número total de células e neurônios por grama de hipocampo
foi calculado da seguinte forma: Número total de núcleos * 1000000/704 =
núcleos em 2 ml. Dividindo por 2, teremos o total de núcleos por ml. Em
seguida, dividimos o número de células por ml pela massa do hipocampo,
obtendo assim, o número de células por grama.
3.8. Imunoistoquímica
Os animais (n = 3 por grupo) de cada grupo (NPP, NPE, LPP, LPE)
foram anestesiados com ketamina (75mg/kg) e xilasina (10mg/kg), através de
aplicação intraperitoneal. Os níveis de anestesia foram controlados pelo
monitoramento do reflexo corneal. A perfusão foi realizada com o auxílio de
uma bomba peristáltica de perfusão, mantendo-se a pressão média de
120mmHg. Cada animal foi perfundido por 15 minutos com solução salina
23
heparinizada a 5% em temperatura ambiente e 20 minutos com solução de
paraformoldeído a 4%.
Após a perfusão, os encéfalos foram fixados por imersão em
paraformoldeído a 4% por 2 horas. Após a fixação, o material foi incluído em
paraplast e, através de um micrótomo rotativo, cortes de 5 µm foram
coletados em lâminas silanizadas. Os cortes histológicos, aderidos em
lâminas silanizadas foram desparafinizados e posteriormente submetidos a
recuperação antigênica no vapor, em tampão citrato, pH 6,0 por 30 min. Após
as lâminas esfriarem, foram realizadas lavagens em PBS (0,1M, pH 7,4) por
três vezes (5 minutos cada).
Findado este processo, os cortes foram incubados com anticorpos
primários SOX 2 Mouse (Sta. Cruz) com diluição de 1:200 e Ki-67 rabbit
(Abcam) com diluição de 1:200, diluídos em BSA 1%, overnight, sob
refrigeração. Após lavagem com PBS (4 vezes com intervalos de 5 minutos),
os cortes foram expostos ao anticorpo secundário específico, conjugado com
fluorocromos (Alexa 555 e 488) em temperatura ambiente, durante 2 horas.
Após lavagens sucessivas com PBS, a lâmina foi montada com vectashield
contendo DAPI. A análise das imagens foi realizada em microscópio confocal
a laser.
3.9. Análise Estatística dos Resultados
Os resultados experimentais foram expressos como média ± EPM.
Estabelecida à distribuição gaussiana dos resultados obtidos, procedeu-se a analise
estatística dos resultados utilizamos teste t de Student, teste de rank ou ANOVA
com post-hoc de Bonferroni quando apropriado para as comparações,
respectivamente de dois grupos ou mais de dois grupos analisados
simultaneamente. Em todos os testes o nível de significância adotado foi de 5% (P <
0,05).
24
25
4. RESULTADOS
A prole de animais oriundos de mães submetidas à restrição proteica
gestacional, grupo LP, apresentou menor massa corporal no dia do nascimento
comparativamente aos animais NP (6.28 ± 0.57 g, n=76 vs. 6.19 ± 0.5 g, n=70) ,
no entanto, esta diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 8). A partir
do sétimo dia de vida a diferença de peso entre os grupos foi significativa, sendo
que em LP o ganho de peso foi menor, comparativamente a NP, como mostra os
resultados de massa corporal no 7º (17.36 ± 2.06 g, n=34 vs. 10.84±1.9g, n=32),
14º (28.64 ± 4.5 g, n=67 vs. 16.06 ± 1.9 g, n=62) e 21º (49.58 ± 7.58 g, n=71
vs.22.27 ± 3.19 g, n=63) dia de vida (Figura 8). No 42º dia a diferença de peso foi
mantida, sendo que os animais NP submetidos ao ambiente enriquecido
apresentaram redução significativa da massa corporal comparativamente àqueles
mantidos no ambiente padrão (181.8 ± 5.5 g vs. 158.5 ± 7.3 g). Entre LPP e LPE
não houve diferença significativa (118.5 ± 2.4 g vs. 112.7 ± 3.9 g).
Quanto à massa encefálica, quando ponderada pela massa corporal dos
animais as diferenças relativas são significativas, já que o peso dos animais LP é
significativamente menor (NPP: 0.53 ± 0.04g; NPE: 0.63 ± 0,04g; LPP: 0.76 ±
0.06g; LPE: 0.79 ± 0.07g). Entretanto, quando comparamos somente os valores
absolutos da massa encefálica não são observadas diferenças estatísticas
significativas (NPP: 0.86 ± 0.07g; NPE: 0.93 ± 0.06 g; LPP: 0.93 ± 0.06 g; LPE:
0.93 ± 0.07 g, Figura 9) entre todos os grupos estudados.
Não houve diferença na massa hipocampal ponderada pela massa encefálica
(NPP: 0.039 ± 0.008g; NPE: 0.035 ± 0.006g; LPP: 0.038 ± 0.01g; LPE: 0.039 ±
0.008g). Também na massa hipocampal absoluta não observamos diferença entre
os grupos (NPP: 0.05 ± 0.01g; NPE: 0.04 ± 0.008 g; LPP: 0.046 ± 0.016 g; LPE:
0.046 ± 0.01 g, Figura 10).
26
Figura 8. Massa dos animais NP e LP do dia do nascimento até o final do período de
amamentação (A). Repare nas fotos, a diferença de tamanho entre os animais no período de
amamentação (C-E). Após exposição aos diferentes ambientes durante 21 dias esta diferença
ainda foi mantida (B).*P<0.05; *** P<0.0005.
Figura 9. Massa do encéfalo no 42º dia de vida, dividida pela massa dos animais e massa
absoluta do encéfalo dos animas dos quatro grupos . *P<0.05; ** P<0.005.
27
Figura 10. Massa do hipocampo esquerdo no 42º dia de vida, dividida pela massa do encéfalo e
massa hipocampal absoluta.
Pela técnica de fracionamento isotrópico observamos que não houve
diferença significativa no número de células totais nos hipocampos dos animais
estudados (NPP: 9269.409 x 103 ± 3055.642 x 103; NPE: 12033.14 x 103 ±
3730.842 x 103; LPP: 10399.97 x 103 ± 843.5232 x 103; LPE: 11563.06 x 103 ±
1172.047 x 103, N=3, Figura 11). Já o número de neurônios foi significativamente
reduzido nos animais do grupo LPP quando comparado aos outros três grupos,
entretanto, a permanência no ambiente enriquecido durante 3 semanas (LPE)
levou ao reestabelecimento do número de neurônios (NPP: 6253.068 x 103 ±
2198.868 x 103; NPE: 6521.314 x 103 ± 732,4741 x 103; LPP: 3324.018 x 103 ±
763.3779 x 103; LPE: 5344.112 x 103 ± 551.5624 x 103, N=3, Figura 11).
Figura 11. Número de núcleos totais e de núcleos de neurônios em relação à massa do
hipocampo. *P<0.05; ** P<0.005.
Assim, observamos que a restrição proteica durante a gestação e a
amamentação acarretou em alteração a proporção entre neurônios e outros tipos
celulares presentes no hipocampo (células da glia e endoteliais) e esta foi
NPP
NPE
LPPLPE
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
Massa h
ipo
cam
po
(g)
NPP
NPE
LPPLPE
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Massa h
ipo
cam
po
/en
céfa
lo(g
)
28
parcialmente reestabelecida àquela observada nos animais controle após
permanência no ambiente enriquecido (Figura 12).
Figura 12. Porcentagem de neurônios e células da glia e endoteliais em relação à massa do
hipocampo.
4.1 Imunoistoquímica
A formação hipocampal e a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos
laterais são regiões onde grandes números de novos neurônios continuam a ser
produzidos na vida adulta. As células que originam na SVZ migram para o bulbo
olfatório e se diferenciam em interneurônios locais, enquanto que no hipocampo,
novos neurônios tem origem na zona subgranular (SGZ) do giro denteado (DG) a
partir de uma população local de células radiais que atuam como células
progenitoras neuronais (NPCs).
A figura 13 apresenta o número de mitoses, de células tronco (stem cells)
e de mitoses de células tronco observadas na zona subgranular (SGZ) e na
camada granular (GL) do giro denteado hipocampal (GD) na prole de animais dos
29
grupos NPP, NPE, LPP e LPE avaliados. Os resultados mostram inicialmente,
uma expressiva e significante redução de células em mitose, de células tronco e
de mitoses de células tronco na prole de animais cujas mães foram submetidas à
restrição proteica gestacional (LP), seja na camada granular bem como
subgranular do giro denteado.
Os estudos evidenciam claramente, que a exposição dos animais ao
ambiente enriquecido promove expressiva recuperação do processo de
proliferação celular, particularmente de células tronco. Estas observações podem
ser evidenciadas, por imunoistoquimica do giro denteado (Figura 14) e da zona
subventricular (Figura 15) próximo aos ventrículos laterais e, pelas representações
gráficas da Figura 13.
30
Figura 13. O gráfico representa o número de mitoses, de células tronco (stem cells) e de mitoses
de células tronco observadas nas camadas subgranular (SGL) e granular (GL) do giro denteado
hipocampal (GD) na prole de animais NP. NPE, LP e LPE avaliados. *P< 0.05; ** P<0.005.
GIRO DENTEADO
31
Figura 14. Imagens representativas obtidas pela técnica de imunoistoquimica de regiões do
hipocampo avaliando o número de mitoses e de células tronco, nas regiões subgranular e granular
do giro denteado. A esquerda dos painéis são apresentados os grupos das proles estudadas cujas
mães foram submetidas (LPP) ou não (NPP) a restrição proteica na gestação e amamentação e
expostas a ambiente enriquecido após amamentação (LPE e NPE).
Sox 2 DAPI
Sox 2
Sox 2
Sox 2
Ki67
DAPI
DAPI
DAPI
Ki67
Ki67
Ki67
merge
merge
merge
merge
NPP
NPE
LPE
LPP
GIRO DENTEADO
32
Figura 15. Imagens representativas obtidas pela técnica de imunoistoquimica de regiões
subventriculares próximas aos ventrículos laterais, avaliando o número de mitoses e de células
tronco. A esquerda dos painéis são apresentados os grupos das proles estudadas cujas mães
foram submetidas (LPP) ou não (NPP) a restrição proteica na gestação e amamentação e
expostas a ambiente enriquecido após amamentação (LPE e NPE).
Sox 2 DAPI
Sox 2
Sox 2
Sox 2
Ki67
DAPI
DAPI
DAPI
Ki67
Ki67
Ki67
merge
merge
merge
merge
NPP
NPE
LPE
LPP
SUBVENTRICULAR
33
TESTES COMPORTAMENTAIS
4.2 Teste de Monitoramento de Atividade: A distância percorrida pelos
animais foi considerada como a somatória dos diversos deslocamentos de
posições monitoradas pelo equipamento. Os resultados demonstraram que nos
animais NP o ambiente enriquecido aumentou significativamente a atividade
locomotora dos animais. Já no grupo LP, embora tenhamos observado um
discreto aumento em LPE, a diferença não foi significativa comparativamente, a
LPP (Figura 16, tabela 2).
A velocidade média dos animais foi calculada como a distância percorrida de
um determinado ponto a outro, dividida pelo tempo gasto pelo animal para
percorrer esta distância. Também com relação à velocidade, houve aumento
significativo nos animais NPE comparativamente aos NPP e não foi significativa
entre LPP e LPE (Figura 16, tabela 2).
Figura 16. Resultados obtidos pelo monitor de atividades. Nas imagens superiores temos
representados exemplos dos deslocamentos de animais NP e LP da mesma prole um mantido em
ambiente padrão e outro em enriquecido. Nos gráficos temos os valores da distância e velocidade
de deslocamento de cada grupo. *P<0.05; ** P<0.005.
Quanto à atividade, pulos, movimentos ambulatórios e vezes que ficou em pé,
em posição exploratória ortostática, o padrão de diferenças observadas foram as
mesmas encontradas nos resultados anteriores, ou seja, maior na prole NP
submetida ao EA, comparada a animais controles e a LPE. Assim, observa-se
aumento significativo destes parâmetros somente nos NP submetidos ao
34
ambiente enriquecido (Figura 17, tabela 2). Somente a quantidade de vezes que o
animal ficou em posição ortostática apresentou um decréscimo significativamente
menor no LPP quando comparado ao NPP (Figura 17, tabela 2).
O software considera movimentos estereotipados sempre que ocorre detecção
de movimentos repetitivos em leituras seguidas, sem que o centro de massa do
animal seja alterado. Estes movimentos representam atitudes dos animais quando
estes estão se coçando, ou com movimentos repetitivamente mastigatórios ou da
cauda. Os animais LP apresentaram redução significativa dos movimentos
estereotipados e o ambiente enriquecido não promoveu qualquer alteração
significativa neste parâmetro (Figura 18, tabela 2).
A diferença entre o tempo que os animais permaneceram no centro ou nas
bordas da arena foi significativamente diferente. Desta forma, a prole LP
apresentou tendência em permanecer maior tempo nas a bordas e evitar o centro
da arena (Figura 19, tabela 2). O ambiente enriquecido aumentou
significativamente os movimentos de rotação dos animais NP e LP (Figura 19,
tabela 2).
Tabela 2. Valores obtidos no monitor de atividades NPP NPE LPP LPE
Distância 7608±839 11000±732 6944±736 8050±953
Velocidade 25.36±2.8 36.67±2.4 23.15±2.4 26.83±3.2
Atividade 67.5±6.9 89.9±5.7 61.22±6.5 65.16±7.3
Movimentos ambulatórios 52±5.7 73.31±4.7 46.94±4.9 53.58±6.3
Em pé 25.2±2.9 34.5±2.9 16.9±1.7 20.3±2.2
Pulos 3.9±0.8 7.3±0.6 3.3±0.4 5.2±0.6
Movimentos estereotipados 713±33 721±17 626±27 610±35
Movimentos rotacionais 7.2±1.2 14.2±1.4 7.9±1 11.3±1.5
Tempo nas bordas 294±1.4 293±1 296±0.9 295±0.9
Tempo no centro 5.5±1.4 6.4±1 2.9±0.9 4.4±0.9
Os valores representam as médias ± DP.
35
Figura 17. Nas imagens superiores temos exemplos da taxa de variação das atividades por
segundo, obtidas pelo monitor de atividades, nos animais dos grupos NP e LP provenientes das
mesmas mães. Nos gráficos temos os valores da atividade (em segundos) e o número de pulos,
movimentos ambulatórios e de vezes que ficaram em pé. *P<0.05; ** P<0.005; ***P<0.0005.
NPP
NPE
LPPLPE
0
50
100
150**
****
Ati
vid
ad
e
NPP
NPE
LPPLPE
0
50
100
150
***
**
Mo
vim
en
tos a
mb
ula
tóri
os
NPP
NPE
LPPLPE
0
20
40
60
80
******
*
**
Em
pé
NPP NPE LPP LPE
36
Figura 18. No gráfico temos os valores obtidos no monitor de atividades, de movimentos
estereotipados apresentados pelos animais. *P< 0.05; ** P<0.005.
Figura 19. Nas imagens superiores temos exemplos do deslocamento dos animais obtido pelo
monitor de atividades. Os gráficos representam o tempo que os animais permaneceram nas
bordas e no centro, bem como o número de rotações. *P< 0.05; ** P<0.005; ***P<0.0005.
4.3 Teste em Labirinto em cruz elevado: Os animais do grupo NPP
permaneceram percentualmente, um tempo (%) significativamente maior na arena
central (NPP: 23 ±1.2 %; NPE: 16.8 ± 1%; LPP: 15 ± 1.8%; LPE: 14.3 ± 1%,
Figura 20). Embora não tenhamos observado diferença significativa entre NPP e
37
LPP quanto à permanência e entrada nos braços abertos, o ambiente enriquecido
aumentou significativamente estes parâmetros nos dois grupos (NPP: 13.8 ± 9%;
NPE: 21.7 ± 11%; LPP: 14.8 ± 10%; LPE: 26.3 ± 7.2%, Figura 20). Indicando
diminuição significativa no comportamento que reflete ansiedade.
Consequentemente, os resultados nos braços fechados foram opostos a estes
(NPP: 86.18±9; NPE: 78.2± 11; LPP: 85± 10; LPE: 73.6± 7, Figura 20).
Figura 20. Os gráficos representam os resultados comportamentais obtidos no Labirinto em Cruz
Elevado. *P< 0.05; ***P<0.0005.
4.4 Quantidade de bolos fecais: Não observamos alteração quanto ao
número de bolos fecais entre NPP e LPP durante os cinco minutos de
observação, entretanto, o ambiente enriquecido diminuiu significativamente este
número indicando redução no comportamento que reflete medo (Figura 21).
38
Figura 21. O gráfico representa o número de bolos fecais apresentado pelos quatro grupos avaliados. *P< 0.05; ** P<0.005; ***P<0.0005.
4.5 Teste de discriminação de objeto novo: O ambiente enriquecido modificou
significativamente a razão de discriminação elevando a habilidade dos animais NP
(708 ± 166% vs. 1562 ± 180%) e LP (725 ± 263% vs. 1672 ± 388%) em
discriminar o objeto novo e o familiar em curto prazo de tempo (Figura 22). Já em
longo prazo não observamos diferença significativa entre os grupos (NPP: 1074 ±
197%; NPE: 1105 ± 219%; LPP: 1123 ± 352%; LPE: 1343 ± 398%).
Figura 22. O gráfico representa a razão de discriminação de objeto novo e familiar apresentadas
pelos quatro grupos avaliados. *P< 0.05; ** P<0.005.
39
5. DISCUSSÃO
Em países desenvolvidos e em desenvolvimento a desnutrição
materno-infantil está associada às importantes repercussões sobre a saúde
de suas populações. Déficit nutricional em diferentes graus e períodos da
vida perinatal modifica consideravelmente o desenvolvimento e a maturação
de tecidos e órgãos chaves (TONKISS et al 1988) envolvidos no bem-estar
dos indivíduos. Isto se deve a alterações no desenvolvimento ontogênico,
vinculada à manifestação programada de alterações no desenvolvimento
morfológico e funcional de órgãos e sistemas. A programação fetal por
desnutrição ou restrição proteica, leva a exposição fetal aumentada aos
glicocorticoides maternos. Os corticosteroides modulam alterações
estruturais no sistema nervoso atuando tanto no volume quanto na estrutura
fina podendo alterar o número de sinapses e a morfologia dendrítica
neuronal.
A organogênese em diferentes espécies é altamente controlada e
fatores adversos podem alterar o desenvolvimento dos órgãos e sistemas
promovendo desordens morfológicas e funcionais que repercutem sobre a
saúde do indivíduo adulto. Assim, as alterações impostas pelo ambiente
durante a ontogênese podem ter efeitos, deletérios ou adaptativos
permanentes que em situações específicas aumentam o risco de
manifestação de doenças, principalmente, metabólicas e cardiovasculares na
idade adulta (BARKER, 2005; GLUCKMAN, 2006).
O desenvolvimento do sistema nervoso em mamíferos é dependente
de fatores internos e externos ao próprio sistema. No entanto os fatores
externos têm recebido cada vez mais atenção, devido a sua grande influência
na neuroplasticidade. Assim, a deficiência de nutrientes durante a gestação
pode resultar em anormalidades estruturais e/ou funcionais no sistema
nervoso central bem como em déficits cognitivos na prole (REYES-CASTRO
et al., 2010, ANDRADE et al., 1991, DIAZ-CINTRA et al., 1991).
O estresse gestacional afeta diversas regiões neurais incluindo
hipocampo, amígdala, corpo caloso, neocortéx, cerebelo e hipotálamo e
frequentemente resulta em redução no volume dos tecidos que compõem
estas estruturas. A formação hipocampal tem sido alvo de diversos estudos
40
devido a sua importância na plasticidade neural, na neurogênese e na
regulação de processos cognitivos. Dessa forma, este estudo buscou avaliar
os efeitos da restrição proteica, durante a gestação e amamentação, sobre a
estrutura do hipocampo, suas funções sobre a memória e emoções
(ansiedade/medo) bem como sobre a composição celular desta estrutura
cerebral e, a influência sobre estes parâmetros morfológicos e
comportamentais, da exposição da prole de ratos machos ao ambiente
enriquecido.
Os resultados do presente estudo confirmaram a redução da massa
corporal ao nascer dos animais do grupo LP, como já descrito por nosso
grupo neste modelo de estresse nutricional (restrição proteica gestacional)
(MESQUITA et al, 2010a; 2010b). Adicionalmente, aos 42º dia de vida, a
diferença de peso foi mantida, sendo que os animais NP submetidos ao
ambiente enriquecido (AE) apresentaram redução expressiva da massa
corporal comparativamente àqueles mantidos no ambiente padrão. Por outro
lado, entre LPP e LPE não houve diferença significativa na massa corporal.
Desde a primeira semana de vida os machos da prole de ratas submetidas à
restrição proteica gestacional apresentaram massa corporal reduzida em
comparação às ninhadas controle, sendo que esta diferença se acentuou
progressivamente até o final dos experimentos, no 42o dia de vida. Para
entender tal diferença, incluindo o período de lactação, devemos considerar a
deficiência de conteúdo proteico no leite materno, em função das mães terem
sido alimentadas ainda com ração pobre em proteína (6% de proteína), o que
tem sido associado á redução no desenvolvimento físico dos animais
(ROCINHOLI et al., 1997; FUKUDA et al., 2002 e FUKUDA et al., 2007).
Os resultados da prole de ratos submetidos à ambiente enriquecido
por 3 semanas após o término da amamentação reproduz resultados
contraditórios observados na literatura. Sejam os animais controles ou
aqueles oriundos de mães submetidas á restrição proteica durante a
gestação/amamentação, estes apresentam massa corporal significantemente
menor quando expostos ao ambiente enriquecido. Dados semelhantes na
literatura, consideram o fato dos animais trocarem de ambiente e interagirem
mais entre si, o que poderia explicar tal diferença de peso. Estes dados não
foram confirmados por Lima (1992), onde não houve influência da
41
estimulação sobre aspectos ponderais dos ratos estudados. No entanto,
vários estudos não confirmam os estudos de Lima e confirmam o que é
descrito no presente estudo, ou seja, que a desnutrição proteica quando
imposta no período de desenvolvimento embrionário, promove redução
significativa da massa corporal da prole estudada (de OLIVEIRA e ALMEIDA,
1993; SILVA e ALMEIDA, 2006; FRANÇOLIN-SILVA et al, 2006;
HERNANDES et al 2007 e CABRAL e ALMEIDA, 2008). Assim, os dados
apresentados no presente trabalho confirmam estudos prévios mostrando
que a desnutrição quando imposta durante o período do desenvolvimento do
SNC, tanto no período pré-natal quanto durante a lactação, pode acarretar
efeitos irreversíveis particularmente, sobre a massa corporal,
independentemente do ambiente ao qual o animal é submetido
posteriormente (de OLIVEIRA E ALMEIDA, 1983; MORGANE et al, 2002;
SILVA E ALMEIDA, 2006).
Além dos prejuízos relacionados ao desenvolvimento físico de ratos, a
desnutrição proteica poderia acarretar comprometimento no desenvolvimento
do sistema nervoso central (SNC), reduzindo ramificações dendríticas
(LOPES et al., 2013), o número de terminais sinápticos, e a mielinização em
todo SNC (LIMA et al, 1999). A literatura tem mostrado que tanto o estresse
crônico quanto o tratamento farmacológico com corticosteroides (p.ex.,
dexametasona) induzem a atrofia de dendritos dos neurônios piramidais de
CA3 (FUCHS et al., 1995; MAGARINOS e MCEWEN, 1995; WOOLLEY et al.,
1990). Mais especificamente, as alterações estruturais na região CA3 do
hipocampo dorsal têm sido relatadas como consequência neural de estresse
crônico (WATANABE et al, 1992b. MAGARIÑOS et al 1996; MCEWEN e
MAGARIÑOS, 1997; LAMBERT et al, 1998. VYAS et al., 2002;
MCLAUGHLIN et al, 2009. CHRISTIAN et al., 2011). Por outro lado, diversos
estudos têm relatado que quando estas condições são impostas no início da
vida pós-natal, ocorre diminuição no comprimento e nos pontos de
ramificação dos neurônios apicais de CA1 e CA3 (SOUSA et al., 2000;
WATANABE et al., 1992). Estes efeitos podem ser suprimidos por inibidores
químicos (LUINE et al., 1993; MAGARINOS e MCEWEN, 1995a,b;
WOOLLEY et al., 1990) sugerindo que os hormônios do eixo HHPA podem
modular a morfologia dendrítica no hipocampo (SOUSA et al., 2000). Estudos
42
que avaliam a celularidade (número e composição) no modelo de restrição
proteica gestacional, são desconhecidos.
Alterações na regulação do eixo HHPA são componentes consistentes
em vários tipos de transtornos afetivos, como depressão, transtornos de
pânico e transtorno obsessivo-compulsivo (GREEN et al., 2011). Os
esteroides adrenais parecem ser fator crucial na remodelação estrutural do
hipocampo (MCEWEN, 1999). Os receptores de mineralocorticoides
hipocampais medeiam a neurogênese do hipocampo enquanto que os
receptores de glicocorticoides estão envolvidos na supressão da sua
morfologia (FUJIOKA et al., 2006). O estresse induz a retração dendrítica de
CA3, no entanto estes efeitos podem ser prevenidos bloqueando a síntese de
esteroides (MAGARIÑOS e MCEWEN, 1995). Em estudo prévio no nosso
laboratório observamos aumento significativo, de cerca de 130%, na
concentração sérica de corticosterona em ratos com 16 semanas de idade
que sofreram restrição proteica gestacional (TORRES et al., 2012) e este
pode ser um fator crucial envolvido na remodelação estrutural do hipocampo,
como observado neste estudo. No entanto, nosso estudo não foi capaz de
responder se a atrofia dendrítica de CA3, vista anteriormente, associada á
expressiva redução no número de neurônios observadas aqui, está
relacionada com subdesenvolvimento in utero ou é resultante de uma
adaptação pós-natal para a fisiologia programada na vida adulta. Estudos
posteriores devem ser realizados para avaliar, os níveis de corticosterona e
sua ação sobre a formação hipocampal em diferentes fases do
desenvolvimento.
Em ratos, existem evidências de que a função pós-natal do eixo HHPA
pode ser alterada por eventos pré-natais. Tais alterações podem ocasionar,
no adulto, exposição cronicamente aumentada a glicocorticoides bem como
resposta exacerbada a estímulos estressantes. Essas alterações são
geralmente atribuídas a modificações na capacidade de retroalimentação
hipotálamo-hipofisária de esteroides, decorrente de um down-regulation de
receptores condicionado por alterações na expressão de genes reguladores
para receptores de glicocorticoides (para revisão ver WELBERG e SECKL,
2001). Alterações na expressão destes receptores podem levar, em longo
prazo, à disfunção na regulação da concentração plasmática de ACTH e de
43
glicocorticoides. Em fetos de porcos, foi determinada a presença de RNAm
para GR por todo o cérebro, sendo a maior concentração encontrada nos
núcleos paraventriculares (NPV) hipotalâmicos. Já o RNAm para MR está
presente exclusivamente no sistema límbico (hipocampo, amígdala, e giro
dentado) ocorrendo maior concentração no hipocampo (LINGAS, et al.,
1999). Estes autores demonstraram, em porcos, que a restrição nutricional
materna altera a expressão destes receptores em períodos gestacionais
relacionados ao maior desenvolvimento neural. Já em ratos, do 5º ao 8º dia
de vida ocorre extensa maturação neuroendócrina com rápida expressão de
MR e GR (DOBBING e SANDS, 1979).
Particularmente no presente estudo, a desnutrição materna
gestacional não ocasionou modificações significativas na massa encefálica e
hipocampal dos animais LP, independentemente da submissão dos mesmos
a ambiente enriquecido. Como descrito acima com relação ao peso cerebral,
mas não confirmado aqui, estudos prévios relataram aumento do peso dos
cérebros de animais submetidos a diferentes protocolos de AE
(ROSENZWEIG, KRECH et al., 1962; ISO, SIMODA et al., 2007). O presente
estudo pelo menos sob aspecto morfológico ponderal confirma a teoria do
"cérebro egoísta", um paradigma recente que postula que, para manter
estável seu próprio fornecimento de energia, o cérebro modula o
metabolismo de energia na periferia regulando tanto a alocação quanto a
ingestão de nutrientes. Apresentaremos entretanto neste trabalho, a
constatação de que as alterações ponderais observadas, não correspondem
as intensas modificações na composição citológica, particularmente
hipocampal, dos diferentes grupos experimentais. Embora pareça que as
alterações nutricionais promovam redução ponderal irreversível na massa
corporal, e não no encéfalo e em algumas de suas estruturas fundamentais, a
composição e estrutura neuronal e sua recuperação a partir de células
primordiais, são profundamente modificadas pela restrição dietética materna
e, surpreendentemente, pela exposição ao ambiente enriquecido. Assim,
como veremos a frente a teoria do cérebro egoísta pode expandir nosso
entendimento sobre a adaptação ao estresse e a neuro-regeneração em
estados neuro-comportamentais tidos como anormais. Não podemos afastar
a possibilidade que a redução da massa corporal dos animais LP decorra dos
44
excessivos níveis de corticosteroide circulante nesta linhagem (ADLARD E
SMART, 1972) bem como da redução da secreção hipotalâmica hipofisária
de hormônio de crescimento.
O recurso do ambiente enriquecido vem sendo utilizado
terapeuticamente em diversas doenças neurológicas. A formação hipocampal
e a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais são regiões onde
grandes números de novos neurônios continuam a ser produzidos na vida
adulta. As células originadas no SVZ migram para o bulbo olfatório e se
diferenciam em interneurônios locais, enquanto que no hipocampo, novos
neurônios tem origem na zona subgranular (SGZ) do giro denteado (DG) a
partir de uma população local de células radiais que, atuam como células
progenitoras neuronais (NPCs). No presente estudo, como mostra a figura
17, constatamos que o número de mitoses, de células tronco (stem cells) e
de mitoses de células tronco nas camadas subgranular (SGL) e granular (GL)
do giro denteado hipocampal (GD) na prole de animais NP, NPE, LP e LPE
avaliados apresentam diferenças significativas. Inicialmente, redução
expressiva e significante de células em mitose, tanto de células tronco quanto
de outras células na prole de animais cujas mães foram submetidas à
restrição proteica gestacional (LP), seja na camada granular bem como na
zona subgranular do giro denteado. Adicionalmente, nossos resultados
mostram que neste modelo de estresse nutricional materno, a exposição da
prole de ratos machos ao ambiente enriquecido, promove aumento
expressivo da proliferação celular, particularmente, de células precursoras
neuronais. Estas observações podem ser evidenciadas, por imunoistoquimica
do giro denteado e da zona subventricular, próximo aos ventrículos laterais e,
pelas representações gráficas.
Nossas observações vão ao encontro de estudos realizados nas
últimas décadas, em diferentes modelos de camundongos knockout para
doenças genéticas como síndrome do X-frágil (WILL, GALANI et al., 2004) e
camundongos Ts65Dn parcialmente trissômicos, usados como modelo para
estudo da síndrome de Down (MARTINEZ-CUE, BAAMONDE et al., 2002),
que evidenciam melhora em testes cognitivos quando expostos ao AE.
Modelos experimentais para estudo de doenças neuro-degenerativas como
esclerose lateral amiotrófica (STAM, NITHIANANTHARAJAH et al., 2008),
45
doença de Parkinson (JADAVJI, KOLB et al., 2006) e doença de Alzheimer
(JANKOWSKY, MELNIKOVA et al., 2005), além modelos de ratos
transgênicos para doença de Huntington (VAN DELLEN, BLAKEMORE et al.,
2000), mostram diminuição da perda celular encefálica e maior tempo para
início dos sintomas motores quando os animais foram expostos ao ambiente
enriquecido. Uma série de estudos relata melhora na recuperação motora e
cognitiva dos animais que sofreram injúrias cerebrais isquêmicas e foram
submetidos ao AE, além de demonstrarem diminuição da área cortical
infartada, aumento nas células progenitoras de astrócitos e oligodendrócitos,
bem como de células-tronco neurais (JOHANSSON e BELICHENKO, 2002;
RISEDAL, MATTSSON et al., 2002; KOMITOVA, MATTSSON et al., 2005).
Nos modelos experimentais em epilepsia o ambiente enriquecido demonstrou
aumentar a resistência a crises e diminuir déficits cognitivos associados, além
de levar a inúmeras alterações a nível celular (YOUNG, LAWLOR et al.,
1999; FAVERJON, SILVEIRA et al., 2002; KOH, CHUNG et al., 2005), como
veremos especificamente mais adiante.
Como citado acima, pela técnica de fracionamento isotrópico
observamos que não houve diferença significativa no número de células
totais nos hipocampos dos animais estudados, independentemente do grupo
experimental. Por outro lado, de modo inédito, demonstramos que o número
de neurônios foi significativamente reduzido nos animais do grupo LPP
quando comparado aos outros três grupos. Assim, percentagem significativa
das células encontradas no hipocampo deste animais corresponde a células
da glia. No entanto, a exposição deste grupo ao ambiente enriquecido
durante 3 semanas (LPE) levou ao reestabelecimento do número de
neurônios para percentuais próximos ao dos grupos controles. Desta forma, o
presente estudo demonstra que a restrição proteica durante a gestação e a
amamentação causa alterações expressivas na proporção entre neurônios e
outros tipos celulares presentes no hipocampo (células da glia e endoteliais),
sendo que esta proporção foi reestabelecida àquela observada nos animais
controle após permanência no ambiente enriquecido. Pelo que sabemos esta
é a primeira vez que se demonstra alterações da constituição citológica e da
recuperação destas alterações pela exposição dos animais a ambientes
enriquecidos.
46
Embora estes resultados sejam inéditos quando considerado o modelo
de estresse nutricional utilizado no presente estudo, investigações anteriores
sobre AE têm demonstrado a ocorrência de modificações tais como aumento
da massa cerebral e espessamento das camadas corticais, além de aumento
na proteína total encefálica (BENNETT, ROSENZWEIG et al., 1969). Estudos
posteriores a estes, demonstraram alterações decorrentes do AE a nível
bioquímico e celular (VAN PRAAG, KEMPERMANN et al., 2000). Uma
grande variedade de parâmetros de plasticidade foi demonstrada, como
aumento da neurogenêse (KEMPERMANN E GAGE, 1999; VAN PRAAG,
KEMPERMANN et al., 2000), da gliogênese e das arborizações dendríticas
(NAKAMURA, KOBAYASHI et al., 1999). Kemperman et al., (1997),
demonstraram aumento da camada granular secundário ao ganho de 15% de
neurônios granulares no GD de camundongos submetidos ao AE. Outros
autores relataram aumento significativo da densidade sináptica e do número
total de sinapses nos animais ambientalmente estimulados (ROSENZWEIG e
BENNETT, 1996; IP, GIZA et al., 2002), além de importante aumento da
plasticidade cortical relacionada à maior expressão de genes como o gene
Arc, envolvido no processo molecular da plasticidade celular (PINAUD,
PENNER et al., 2001). Estas alterações induzidas pelo AE foram associadas,
pelo menos em parte, a alterações como a inibição da morte celular por
apoptose na região hipocampal e ao aumento de fatores neurotróficos, como
o fator neurotrófico derivado da glia, fator neurotrófico derivado do cérebro,
neurotrofina 3 e fator de crescimento do nervo (YOUNG, LAWLOR et al.,
1999). Além disso, diversos autores descreveram que o ambiente enriquecido
possui efeito protetor no envelhecimento celular (NAKAMURA, KOBAYASHI
et al., 1999; WILL, GALANI et al., 2004; LORES-ARNAIZ, BUSTAMANTE et
al., 2006). No entanto, estudos até o momento utilizando diferentes modelos
experimentais não demonstraram alterações na composição celular (relação
glia/neuronal) de áreas do SNC, como descrita no presente estudo no
hipocampo, bem como a sugestão aventada aqui de que parte importante
desta regeneração ocorra por um aumento de mitoses de células tronco
advindas de áreas granulares e sub-granulares do giro denteado.
47
Procurando associar possíveis alterações morfológicas descritas acima,
encontradas na prole de animais programados pelo estresse nutricional, a
alterações de atividade, memória, cognição e comportamentais, os animais
foram submetidos a testes de monitoramento de atividade, ao labirinto em
cruz elevado e ao teste de discriminação de objeto novo.
Sabe-se que o sistema límbico, particularmente o hipocampo exerce
papel central no processo de memória/cognição e no controle das emoções
(SQUIRE e ZOLA, 1996). Para avaliar as funções de aprendizado e memória
utilizamos o teste de discriminação de objeto novo. O ambiente enriquecido
modificou significativamente a razão de discriminação elevando a habilidade
dos animais NP e LP em discriminar o objeto novo e o familiar em curto prazo
de tempo. Este efeito discriminatório foi mais acentuado nos animais
programados. Já em longo prazo não foi observada qualquer diferença entre
os grupos estudados.
O primeiro estudo propondo medir a preferência espontânea de ratos
em explorar elementos novos data da década de 50, quando Berlyne
observou que ratos gastam mais tempo explorando novos objetos do que
objetos familiares (BERLYNE, 1950). Ennaceur e Delacour, na década de 80,
associaram a preferência dos animais pela novidade à memória de
reconhecimento (ENNACEUR, DELACOUR, 1988), fazendo com que os
animais explorem demoradamente os objetos nunca vistos. A técnica
experimental aqui utilizada apresenta vantagens, dentre as quais não
requerer treinamento prévio ou a exposição a estímulos aversivos, pode ser
conduzido em sessões de curta duração e, não requer privação de água ou
alimento e utiliza equipamentos e objetos simples (BEVINS, BESHEER,
2006). Diversos modelos experimentais avaliando memória de
reconhecimento são descritos em animais (DIX, AGGLETON, 1999;
ENNACEUR et al, 2005; FERNANDES, 2005; FORWOOD et al, 2007;
REGER, HOVDA, GIZA, 2009). Dix e Aggleton (1999), em estudos de
discriminação entre objetos novos observaram que os animais despendem
mais tempo explorando objetos novos ou em localizações e contextos não
reconhecidos fazendo com que elementos e situações que antes constituíam
novidades passam a ser familiares no final do procedimento. Ennaceur et al.,
48
(2005), demonstraram que animais possuem preferência espontânea por
objetos novos e por objetos em localizações diferentes daquelas previamente
encontradas, enquanto Forwood et al., (2007), constataram que ratos
discriminam estímulos visuais novos daqueles já encontrados previamente,
mesmo quando os estímulos utilizados referem-se ao uso de imagens
bidimensionais para a discriminação.
Estudo realizado por Reger, Hovda e Giza (2009) investigou a
preferência de ratos em diferentes idades (20-23 dias; 29-40 dias; acima dos
50 dias) no sentido de reconhecer se a capacidade de memória é
influenciada pelo amadurecimento cerebral. Os testes confirmaram que
mesmo os animais jovens (20-23 dias) gastam mais tempo explorando o
objeto novo, em comparação à exploração do objeto previamente
encontrado. Baseando-se nesses estudos que avaliaram a preferência dos
animais em explorar elementos novos, trabalhos foram desenvolvidos a fim
de verificar se o dano na região hipocampal pode afetar a memória de
reconhecimento, já que o comprometimento do hipocampo, pode
comprometer o desempenho de animais nas tarefas que medem a memória
de reconhecimento através da preferência espontânea (VNEK, ROTHBLAT,
1996; CLARK, ZOLA, SQUIRE, 2000; ROSSATO et al, 2007; GOOD et al,
2007; CACERES et al, 2010; BROADBENT et al, 2010).
Vnek e Rothblat (1996), estudando animais com lesões do hipocampo
dorsal em tarefas de discriminação visual demonstraram que os animais
lesionados tiveram desempenho inferior comparado aos animais controles na
tarefa descrita. Mais tarde, Clark et al (2000) também demonstra que ratos
submetidos a lesões hipocampais por radiofrequência tiveram menor
desempenho em testes de reconhecimento de objetos. Em 2007, Rossato et
al., (2007), analisaram se a infusão hipocampal de inibidor da síntese de
proteínas em ratos causaria comprometimento na retenção de informações
necessárias para a memória de reconhecimento de objetos em diferentes
tarefas. Concluíram que o déficit na síntese proteica hipocampal alterou a
capacidade dos animais em relação à memória de reconhecimento, indicando
o papel fundamental do hipocampo na estocagem da informação e no
processo da memória.
49
Coincidente com as alterações citológicas observadas no presente
estudo, Good et al (2007), promoveram morte neural pela injeção da toxina
ácido ibotênico em ratos e em seguida expuseram os animais a testes de
memória de reconhecimento. A análise histológica dos cérebros mostraram
perda igual ou superior a 70% de neurônios na região hipocampal. Os
resultados indicaram que a lesão hipocampal comprometeu a memória de
reconhecimento. Em 2010, Caceres et al., (2010) realizaram lesões
hipocampais através da administração de radiação nos primeiros três dias de
vida de ratos. Os animais testados 30 dias depois demonstraram associados
ás alterações histológicas hipocampais, déficits comportamentais avaliados
através do teste de esquiva inibitória e de memória de reconhecimento. Estes
animais apresentaram menor índice de reconhecimento de objetos
comparados ao grupo controle.
A despeito das alterações histológicas identificadas na prole de
animais cujas mães foram submetidas a dieta hipoproteica (redução no
número de neurônios) e, das evidencias experimentais mostrando que a
lesão hipocampal com redução do número de células promove alterações de
memória, o presente estudo não mostrou diferença significativa
comparativamente ao grupo controle normoprotéica. Entretanto, a exposição
dos animais ao AE promoveu elevação na capacidade de memória de
reconhecimento, mais acentuada no grupo LP. Esta maior capacidade de
reconhecimento nos animais programados pode estar relacionado ao
aumento expressivo da diferenciação e do número de neurônios no giro
denteado. É importante ainda destacar o papel da atividade motora e
capacidade de exploração na fase de aquisição dos testes que envolvem
memória de reconhecimento. Problemas relacionados a atividade motora,
como aqueles efetivamente identificados nos animais LP ou a pouca
exploração por parte destes animais durante esta fase podem ter
comprometido o incremento da memória de reconhecimento.
Os dados relativos a avaliação da distância percorrida pelos animais
demonstraram que nos animais NP o ambiente enriquecido aumentou
significativamente a atividade locomotora dos animais. Já no grupo LP,
embora tenhamos observado um discreto aumento em LPE, a diferença não
foi significativa comparativamente, a LPP. A velocidade média calculada dos
50
animais mostrou aumento significativo nos animais NPE comparativamente
aos NPP e não foi significativa entre LPP e LPE. Os animais LP também
apresentaram redução significativa dos movimentos estereotipados e o
ambiente enriquecido não promoveu qualquer alteração significativa neste
parâmetro. Adicionalmente, o ambiente enriquecido aumentou
significativamente os movimentos de rotação dos animais NP e LP. Estas
observações não mostram alterações relevantes da atividade locomotora
induzida pela exposição materna a restrição proteica, entretanto, o AE elevou
significativamente a atividade motora dos animais NP e em menor proporção
da prole LP em relação aos seus controles. Estes resultados sugerem que as
diferenças nos padrões hipocampais citológicos observado em NP e LP não
modificam a resposta motora ou estas observações histológicas do
hipocampo não têm qualquer relação com a modulação desta atividade neste
modelo experimental.
Como comprovado neste estudo, trabalhos experimentais prévios
utilizando ambiente enriquecido evidenciaram melhora significativa nos testes
comportamentais e de memória, provavelmente de forma secundária às
alterações anatômicas e citológicas como descritas aqui e por outros autores
(ROSENZWEIG e BENNETT, 1996; BROWN, COOPER-KUHN et al., 2003).
Xu e colaboradores (Xu, Ye et al., 2009) estudaram o efeito do AE em ratos
Sprague-Dawley submetidos à insulto isquêmico cerebral. O AE teve
consequências benéficas nos animais testados no labirinto em cruz elevado e
levou ao aumento do número de sinapses parietais e da densidade pós-
sináptica do hipocampo e do córtex parietal. Veena et al (2009)
demonstraram melhora nos sintomas depressivos concomitantemente ao
aumento de células hipocampais em ratos Wistar submetidos a estresse
crônico seguido de exposição ao AE. Na área comportamental demonstrou-
se que o AE melhora o desempenho de animais nos mais variados testes
cognitivos, sensoriais, motores e afetivos (ROSENZWEIG E BENNETT,
1996; YOUNG, LAWLOR et al., 1999; RUTTEN, VAN ALBADA et al., 2002;
VEENA, SRIKUMAR et al., 2009), como na habituação avaliada através do
teste de campo aberto (KOH, CHUNG et al., 2005; AMARAL, VARGAS et al.,
2008), reflexo de sobressalto (ISO, SIMODA et al., 2007) e, labirinto em cruz
elevado e labirinto radial de oito braços (LORES-ARNAIZ, BUSTAMANTE et
51
al., 2007). Não esta claro qual o tempo necessário de exposição ao AE para
gerar benefícios e em que momento de início à exposição ocorre maior
ganho cognitivo. Amaral et al., (2008) demonstraram que um período curto,
de uma semana apenas (aqui submetemos os animais a 3 semanas
continuas ao AE), já leva a benefícios no campo cognitivo. Os autores
também relataram que os benefícios podem perdurar durante vários meses, e
que esse tempo é diretamente proporcional ao tempo de exposição ao
ambiente enriquecido. Ademais, os pesquisadores enfatizaram que os
achados dos efeitos do ambiente enriquecido no cérebro são diversificados,
pois há inúmeros modelos de AE, e que variam quanto ao tempo de
exposição e de duração e quanto a idade de início da exposição.
O teste do labirinto em cruz elevado (LCE) é um dos testes animais para
o estudo de medo/ansiedade mais utilizados por diversos grupos de pesquisa
em todo o mundo. O teste, validado inicialmente por Handley e Mithani em
1984, é baseado no comportamento natural dos animais, não oferecendo
nenhum tipo de punição aos mesmos. O equipamento utilizado neste teste é
constituído por dois braços abertos unidos perpendicularmente a dois braços
circundados por paredes (braços fechados) e foi a princípio utilizado para
avaliar o comportamento de ratos. Os autores do teste observaram que os
animais, ao serem colocados no centro do aparelho, demonstravam clara
tendência a explorar os braços fechados, em detrimento dos abertos. A
exposição dos ratos a situações naturalmente ameaçadoras, representadas
pela altura e pelo espaço aberto, explicaria a maior aversão para explorar os
braços abertos. No presente estudo os animais do grupo NPP permaneceram
percentualmente, um tempo (%) significativamente maior na arena central.
Embora não tenhamos observado diferença significativa entre NPP e LPP
quanto à permanência e entrada nos braços abertos, o ambiente enriquecido
aumentou significativamente estes parâmetros nos dois grupos (NPE e LPE),
indicando redução significativa do comportamento de medo/ansiedade, nas
proles, independentemente de LP ou NP, submetidas ao AE.
Avalizando os resultados obtidos no teste do labirinto em cruz elevado,
aqui não observamos resultados diferentes quanto ao número de bolos fecais
das proles NPP e LPP durante os cinco minutos de observação, entretanto, o
ambiente enriquecido diminuiu significativamente este número indicando
52
redução no comportamento de medo e ansiedade. O teste do labirinto em
cruz elevado tem sido amplamente utilizado tanto para a descoberta de
novos agentes ansiolíticos, quanto para investigar as bases psicopatológicas
e neuroquímicas da ansiedade. Sua ampla utilização por pesquisadores de
todo o mundo se deve a simples e rápida utilização; utilizar equipamento
barato, podendo ser construído facilmente; ser eficaz na detecção de
modificações comportamentais, sem que seja necessário o condicionamento
aversivo, como ocorre com testes como o teste de punição da pressão à
barra ou o teste do beber punido de Vogel. É considerado, portanto, um teste
baseado em respostas naturais dos animais. Assume-se que os braços
abertos do labirinto combinam dois componentes naturalmente aversivos aos
animais: ser um ambiente novo e ser um espaço aberto, uma vez que não
possuem paredes protetoras. Em contraste, os braços fechados por paredes
altas representam, ao animal, um ambiente que oferece proteção contra
estímulos potencialmente nocivos, tais como a presença de predadores.
Quando o animal é colocado no labirinto para que o explore livremente
durante um período de tempo determinado, o animal tende a explorar os
braços abertos somente durante 20 a 25% do tempo, sugerindo que a
possível aversão causada por esses braços realmente exista. Esse
parâmetro (tempo total de permanência nos braços abertos do modelo),
portanto, representa um forte índice relacionado à ansiedade. Este foi
sensivelmente atenuado em nosso estudo pelo AE, predominantemente no
grupo LP. Contrariamente a esta resposta, quando os animais são tratados
com compostos conhecidos por aumentar os níveis de ansiedade (compostos
ansiogênicos), acabam passando mais tempo acuados nos braços fechados
do que explorando os braços abertos.
Com relação aos parâmetros observados, além do tempo total de
permanência em cada um dos braços e do número total de entradas alguns
pesquisadores também consideram na análise outras medidas, consideradas
comportamentais, tais como o número de vezes que o animal explora a
extremidade dos braços abertos, número de vezes que se levanta contra as
paredes dos braços fechados, entre outras medidas. Este teste, entretanto,
possui algumas limitações. Uma delas é o fato de que seu valor como teste
preditivo para a ação de determinadas drogas, p.e. agonistas serotonérgicos,
53
ainda permanece incerto. Isso sugere que, na verdade, o teste produz
diferentes tipos de ansiedade.
A literatura tem mostrado que a desnutrição pode provocar alterações
no sistema nervoso central (SANTUCCI et al, 1994; CINTRA et al, 1997;
ALMEIDA et al, 1996; MORGANE et al, 2002). Entretanto, diferente de
estudos na literatura, nossos experimentos em ratos submetidos à
desnutrição proteica intrauterina, não apresentaram em estado basal,
modificações no percentual de entradas e de tempo de permanência nos
braços abertos do LCE, quando comparados a prole que não foi submetida à
restrição proteica gestacional. Estudos prévios já demonstraram que os
animais desnutridos entram mais e permanecem mais tempo nos braços
abertos do LCE (ALMEIDA et al, 1993 e FRAÇOLIN-SILVA et al, 2006),
sugerindo que animais apresentam menor resposta de ansiedade e/ou uma
maior impulsividade. Esta redução da ansiedade, não observada no presente
estudo pela técnica de avaliação utilizada, pode estar associada a um
possível efeito da desnutrição proteica neonatal em estruturas cerebrais
como o septo, amígdala e hipocampo, estruturas estas envolvidas na inibição
comportamental (GRAY e MCNAUGHTON, 2000). Assim, no presente estudo
utilizando modelo de programação fetal pelo estresse gestacional, embora
tenhamos observado extensa alteração citológica hipocampal, esta não
refletiu em alterações comportamentais. Por outro lado, a prole de mães
submetidas a restrição proteica gestacional e ao enriquecimento ambiental
permaneceram menos tempo nos braços fechados quando comparados com
animais não estimulados. A estimulação neste caso produziu efeito protetor
ás possíveis alterações comportamentais induzidas pela desnutrição proteica.
Reiterando esta possibilidade, demonstramos alterações significativas na
composição neuronal pós ambiente enriquecido e, outros autores observaram
que a estimulação ambiental, pode ter papel importante na plasticidade
cerebral (CANCEDDA, et al, 2004; ARTOLA, et al, 2006) e
concomitantemente, no comportamento (MORGAN e WINICK, 1980; WILL et
al 2004).
Como referido acima, nossos estudos confirmando dados da literatura,
demonstraram que a prole de mães submetidas á desnutrição proteica
apresentam menor atividade locomotora (ALMEIDA et al, 1991 e 1993).
54
Assim animais estimulados, independente do tipo de estimulação,
apresentaram maior locomoção e comportamento exploratório quando
comparados com os ratos não estimulados, mostrando que a estimulação
pode influenciar a atividade locomotora e consequentemente a resposta ao
teste do LCE.
Trabalhos prévios realizados em nosso laboratório, utilizando o teste
do labirinto aquático de Morris, já haviam demonstrado que a memoria
espacial de referência é também hipocampo-dependente (LOPES et al.,
2013). Este teste foi adaptado para verificar também a memória de trabalho
por usar o mesmo modelo experimental e por recrutar as mesmas
habilidades para a execução do teste (KESNER, 2000). Tanto o hipocampo
quanto o córtex pré-frontal estão envolvidos no processamento da memória
espacial (LEE e KESNER, 2003). A aquisição da memória de referência
requer estrutura e funções hipocampais para formar associações espaciais
que permanecem constantes, enquanto que a memória de trabalho pode ser
descrita como um sistema de capacidade limitada que permite processar e
armazenar informações temporariamente (GOLDMAN-RAKIC, 1995) pelo
córtex pré-frontal. Como nos resultados do presente estudo, não
encontramos diferenças significativas entre os grupos LP e NP, em qualquer
um dos parâmetros analisados, sugerimos que tais funções de hipocampais
não foram alteradas com a restrição de proteína gestacional ou os testes não
foram capazes de descriminar alterações comportamentais, claramente
associadas as modificações citológicas encontradas. Em um modelo similar
de restrição proteica gestacional Tonkiss et al., (1994; 1997), também não
encontraram alterações na memória espacial e no aprendizado, nem
tampouco na memória de trabalho (TONKISS e GALLER, 1990). Entretanto
não podemos descartar a hipótese de que, em outros tipos de testes
comportamentais, possamos encontrar alterações nestes parâmetros. Nós já
tínhamos detectado esta dissociação entre função e forma, uma vez que em
estudos anteriores, através da aplicação da análise tridimensional por
coloração de Golgi-Cox no hipocampo dorsal, região ligada ao aprendizado e
à memória demonstramos que a restrição proteica gestacional leva a
diminuição em cerca de 30% no comprimento total de dendritos basal e no
número de intersecções dos dendritos apicais, em um raio entre 50-120 µm
55
do pericário, de neurônios piramidais de CA3. Neste estudo, a arquitetura
dendrítica dos neurônios do giro denteado e de CA1 manteve-se inalterada
(LOPES et a., 2013).
Estudos demonstram que a exposição gestacional ao estresse
(WEINSTACK et al., 1992), ou a administração de hormônios do estresse
(FAMELI et al 1994), durante a gestação levam ao aumento na concentração
plasmática de corticosterona na prole. Além disso, diversos estudos vêm
demonstrando que o estresse pré-natal está associado às alterações do eixo
HHPA da prole (para revisão ver CHARIL et al., 2010). Wellman (2001)
verificou que a injeção de corticosterona em ratos adultos, diariamente
durante 3 semanas, provocou reorganização da arborização dendrítica e
redução no comprimento dos dendritos distais de neurônios do córtex pré-
frontal. No entanto, pelo que verificamos não há na literatura qualquer
referencia ás modificações encontradas aqui com relação as modificações do
número e da razão neurônio/glia em estruturas do SNC, particularmente no
hipocampo.
Não existe sincronicidade no desenvolvimento das diferentes
estruturas neurais sendo que cada uma tem seu padrão e tempo específicos
de desenvolvimento durante os períodos pré e pós-natais. Estes processos
envolvem “janelas” diferentes e parcialmente sobrepostas de vulnerabilidade
ao estresse. Assim é difícil determinar o período de maior suscetibilidade á
estressores durante a gestação, desde que a maioria dos estudos com
animais sobre efeitos do estresse gestacional no desenvolvimento do cérebro
envolve roedores e estresse de fêmeas prenhas durante a última semana
gestacional, que é um período de desenvolvimento ativo de várias regiões do
cérebro de roedores. Além disso, estudos em macacos Rhesus feitos por Col
e colaboradores (2003) sugerem que o estresse gestacional pode ter efeitos
neurais similares aos obtidos em roedores. Estes resultados sugerem que se
a proliferação é afetada, os eventos subsequentes como migração podem
também ser afetados. Finalmente, a diferenciação celular pode também estar
afetada neste modelo experimental (RICE e BARONE, 2000).
O presente estudo revelou dissociação entre a resposta do teste
comportamental e alterações no número de neurônios hipocampais, como
56
consequência da programação fetal. Assim o significado funcional destas
alterações em termos de impacto absoluto sobre o hipocampo permanece
uma incógnita. A ausência de alterações basais no desempenho destes
testes, ocorreram a despeito de redução no número de neurônios no giro
denteado do hipocampo. Vários autores têm sugerido que a atrofia observada
no hipocampo pode ser uma resposta compensatória para proteger o
hipocampo de danos adicionais (OHL e FUCHS, 1999; MCEWEN, 2001;.
BARTOLOMUCCI et al., 2002; de QUERVAIN et al., 2009).
Os achados deste estudo representam o impacto pré e perinatal da
desnutrição proteica correspondente à situação de estresse nutricional, no
hipocampo que está envolvido no comportamento emocional bem como na
memória e no aprendizado. Nós demonstramos, pela primeira vez, que a
exposição materna a restrição proteica durante o desenvolvimento neural da
prole causa importantes mudanças morfológicas no hipocampo podendo
tornar estes animais vulneráveis a distúrbios neurais na idade adulta. O
presente estudo pelo menos sob aspecto morfológico ponderal confirma a
teoria do "cérebro egoísta", um paradigma recente que postula que, para
manter estável seu próprio fornecimento de energia, o cérebro modula o
metabolismo da energia na periferia regulando tanto a alocação quanto a
ingestão de nutrientes. Neste trabalho, há evidente constatação de que as
alterações ponderais observadas, não correspondem as intensas
modificações na composição citológica, particularmente hipocampal, dos
diferentes grupos experimentais. Embora pareça que as alterações
nutricionais promovam alterações irreversíveis ponderais na massa corporal,
mas não no encéfalo e algumas de suas estruturas fundamentais, a
composição e estrutura neuronal e sua recuperação a partir de células
primordiais, são profundamente modificadas pela restrição dietética materna
e, surpreendentemente, pela exposição ao ambiente enriquecido. Assim,
podemos afirmar que a teoria do cérebro egoísta explica a manutenção da
massa encefálica entretanto, a proporção dos diferentes tipos celulares é
profundamente alterada o que pode expandir nosso entendimento sobre a
adaptação ao estresse e a neuro-regeneração em estados neuro-
comportamentais tidos como anormais. Além disso, devemos ressaltar que,
embora tenhamos observado redução significativa no número de neurônios
57
após o período de amamentação, demonstramos pela primeira vez que este
parâmetro é revertido pelo estimulo em ambiente enriquecido.
58
6.
59
6. CONCLUSÃO
Á análise dos resultados do nosso trabalho permite tirar as seguintes
conclusões:
A. Aspectos Morfométricos:
1. A prole de ratos machos de mães submetidas a restrição proteica
gestacional apresentou redução significativa na massa corporal que
persistiu durante todo o período de acompanhamento e, não foi
revertido pela exposição ao ambiente enriquecido (AE); Ao contrário,
os animais submetidos ao AE apresentaram, independente de
pertencerem ao grupo LP ou NP, incremento na perda ponderal;
2. Esta redução ponderal não foi acompanhada por redução ponderal da
massa encefálica e hipocampal;
3. Não houve diferença significativa no número de células totais nos
hipocampos dos animais estudados, independente do grupo
experimental;
4. Entretanto, o número de neurônios foi significativamente reduzido nos
animais do grupo LPP quando comparado aos outros três grupos. A
manutenção da celularidade hipocampal no grupo LPP se deu por
aumento expressivo de células da glia;
5. A redução neuronal no hipocampo foi associada à redução da
atividade mitótica e do numero de células tronco no giro denteado;
6. A exposição do grupo LP ao ambiente enriquecido durante 3 semanas
(LPE) levou ao reestabelecimento do número de neurônios para
percentuais próximos ao encontrados nos grupos controles;
7. Portanto, o presente estudo demonstra que a restrição proteica
durante a gestação e a amamentação causa alterações expressivas
na proporção entre neurônios e outros tipos celulares presentes no
hipocampo (células da glia e endoteliais), sendo que esta proporção
foi reestabelecida àquela observada nos animais controle após
permanência no ambiente enriquecido;
60
B. Aspectos Comportamentais:
1. O presente estudo revelou dissociação entre a resposta aos teste
comportamentais e alterações no número de neurônios hipocampais,
como consequência da programação fetal e neonatal;
2. Os resultados demonstram que a prole de animais LP apresenta
atividade motora semelhante aos controles (NP); entretanto, os
animais NP expostos a ambiente enriquecido aumentam
significativamente a atividade locomotora e capacidade de exploração.
Já no grupo LP, embora tenhamos observado aumento discreto em
LPE, esta diferença não foi significativa comparativamente, a LPP.
3. Quanto a velocidade média dos animais, os resultados demonstram
aumento significativo nos animais NPE comparativamente aos NPP e
ausência de modificações significativas nos grupos LPP e LPE;
4. Embora o estudo não tenha demonstrado diferença significativa entre
NPP e LPP quanto à permanência e entrada nos braços abertos, o
ambiente enriquecido aumentou significativamente estes parâmetros
nos dois grupos, indicando diminuição significativa no comportamento
que reflete medo/ansiedade em ambos os grupos;
5. A redução do medo e ansiedade dos animais expostos a ambiente
enriquecido foi confirmada pela redução do número de bolos fecais
nos grupos NPE e LPE;
6. O ambiente enriquecido elevou significativamente a habilidade dos
animais NP em discriminar o objeto novo em curto prazo de tempo. Já
a memoria de longo prazo não sofreu qualquer modificação nos
grupos estudados.
Desta forma podemos concluir que os achados deste estudo representam
o impacto pré e perinatal da desnutrição proteica correspondente à situação
de estresse nutricional no hipocampo, estando envolvido no comportamento
emocional, bem como na memória e no aprendizado. Nós demonstramos,
pela primeira vez, que a exposição materna a restrição proteica durante o
desenvolvimento neural da prole causa importantes mudanças morfológicas
no hipocampo podendo tornar estes animais vulneráveis a distúrbios neurais
61
na idade adulta. Neste trabalho, há evidente constatação de que a ausência
de alterações ponderais do hipocampo não se associa as intensas
modificações na composição citológica dos diferentes grupos experimentais.
Embora pareça que as alterações nutricionais promovam alterações
irreversíveis da massa corporal, mas não no encéfalo e algumas de suas
estruturas fundamentais, a composição e estrutura neuronal e sua
recuperação a partir de células primordiais, são profundamente modificadas
pela restrição dietética materna e, surpreendentemente, pela exposição ao
ambiente enriquecido.
62
63
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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deprivation in early life. J Endocrinol. 1972 Jul;54(1):99-105. AIMONE, J. B.; DENG, W.; GAGE, F. H. Adult neurogenesis: integrating theories
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