UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentos rea de Bromatologia

Alfa e beta-amilase no metabolismo do amido durante o amadurecimento da banana: clonagem, expresso e caracterizao molecular

Adair Vieira Jnior

Tese para obteno do grau de DOUTOR Orientador: Prof. Dr. Franco Maria Lajolo Co-Orientador: Prof. Dr. Joo Roberto O. do Nascimento

So Paulo 2006

Ficha Catalogrfica Elaborada pela Diviso de Biblioteca e Documentao do Conjunto das Qumicas da USP.

V657a

Vieira Jnior, Adair Alfa e beta-amilase no metabolismo do amido durante o amadurecimento da banana: clonagem, expresso e caracterizao molecular / Adair Vieira Jnior. -- So Paulo, 2006. 91p. Tese (doutorado) Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo. Departamento de Alimentos e Nutrio Experimental. Orientador : Lajolo, Franco Maria 1. Amilase : Cincia dos alimentos 2. Banana : Bioqumica dos alimentos I. T. II. Lajolo, Franco Maria, orientador 641.12 CDD

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Adair Vieira Jnior

Alfa e beta-amilase no metabolismo do amido durante o amadurecimento da banana: clonagem, expresso e caracterizao molecular

Comisso Julgadora da Tese para obteno do grau de Doutor

Prof. Dr. Franco Maria Lajolo orientador/presidente

Carlos Alberto Labate 1o. examinador

Antnio Vargas de Oliveira Figueira 2o. examinador

Glucia Mendes Souza 3o. examinador

Joo Roberto Oliveira do Nascimento 4o. examinador

So Paulo, 24 de maro de 2006.

Alfa e beta-amilase no metabolismo do amido durante o amadurecimento da banana: clonagem, expresso e caracterizao molecular.

RESUMOA converso do amido, armazenado nas frutas durante seu

desenvolvimento, em acares, desempenhada por vrias enzimas, constituindose em um dos principais processos do amadurecimento. A funo das enzimas hidrolticas, alfa-amilase e beta-amilase, no metabolismo amido-sacarose durante o amadurecimento de bananas, foi avaliada atravs da determinao dos perfis de transcrio e traduo dos seus genes. Utilizando-se da expresso heterloga de clones de cDNA das amilases, foi possvel obter as protenas recombinantes, inclusive na sua forma enzimaticamente ativa, bem como induzir a produo de anticorpos policlonais em coelhos, com os quais pode-se acompanhar a variao nos nveis de expresso de cada uma das duas enzimas. O tratamento de bananas com o hormnio etileno induziu a antecipao dos processos de degradao do amido e sntese de acares em relao ao grupo de frutas controle. Enquanto no grupo controle, as variaes nos nveis de protena e transcrio relativos alfaamilase sugerem que h reduo na expresso do gene, no grupo tratado com etileno no foi possvel detectar a expresso da protena, apesar dos incrementos na transcrio e atividade. Tal fato pode ser associado degradao do grnulo de amido e conseqente solubilizao de protenas ligadas sua superfcie e ao provvel aumento no turnover de protenas promovidos pelo etileno. Em resposta ao tratamento com etileno, houve antecipao dos picos de atividade relacionados especificamente com a beta-amilase, o mesmo ocorreu na deteco do transcrito e sua protena. Tais resultados sugerem que em bananas, os padres de expresso e atividade da beta-amilase esto diretamente relacionados degradao do amido, respondendo tambm s variaes hormonais na fruta, no sendo possvel afirmar o mesmo para alfa-amilase.

Alpha and beta-amylase in the starch metabolism during banana ripening: cloning, expression and molecular characterization.

SUMMARYThe starch breakdown in plants is accomplished by several enzymes and pathways and it is the main feature of the ripening in climacteric fruits, such as banana. The function of the hydrolytic enzymes, alpha-amylase and beta-amylase, in the starch-to-sugar metabolism during banana ripening, was evaluated through the determination of the profiles of transcription and translation of its genes. Using the heterologous expression of amylases cDNA clones, was possible to get recombinant proteins in its enzymatically active form, as well as inducing the production of the polyclonal antibodies in rabbits, and use this to evaluate the expression profile of each one enzyme. The treatment of bananas with the hormone ethylene induced the anticipation of the processes of degradation of starch and synthesis of sugars in relation to the control group. While in the control group the variations of protein and transcription levels for alpha-amylase suggests a reduction in the gene expression, in the ethylene group was not possible to detect the expression of the protein, despite the increments in the transcription and activity. Such fact can be associated with the degradation of the starch granules and the resultant surface protein solubilization, and the probable increase in the protein turnover promoted by ethylene treatment. In response to the ethylene, the peak related to beta-amylase activity has been anticipated and the same was occurred with the transcription and translation of this enzyme. These results suggest that the profile of expression and activity of beta-amylase are directly related to the degradation of starch and do respond to hormonal treatment of banana fruits, which could not be affirmed for the enzyme alpha-amylase.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Modelo de interconverso da sacarose em amido....................................... 15 Figura 2: Modelos de degradao de amido ............................................................ 17 Figura 3: Perfis metablicos para frutas utilizadas ................................................... 37 Figura 4: Representao esquemtica dos stios de anelamento dos primers ............... 43 Figura 5: SDS-PAGE, aps colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250 ................... 44 Figura 6: SDS-PAGE do precipitado de bactrias da expresso piloto de MAmyS1 ........ 46 Figura 7: SDS-PAGE a 12% de acrilamida do precipitado de bactrias ........................ 46 Figura 8: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para amilases ............. 49 Figura 9: Western blotting contra clones de amilases de banana em Pichia pastoris ..... 51 Figura 10: Ensaio da atividade enzimtica de clones de e -amilase de banana......... 52 Figura 11: SDS-PAGE a 8,0% de acrilamida dos extratos totais de protenas............... 54 Figura 12: SDS-PAGE a 7,5% de acrilamida do precipitado de bactrias ..................... 57 Figura 13: Western blotting com soros anti-MAmyS1 e anti-MBmyS1 ......................... 57 Figura 14: Western blotting com soros anti-amilase contra protenas de bananas ........ 59 Figura 15: Eletroforese em gel de agarose com amostras de RNA total....................... 64 Figura 16: Curvas padro para determinao do limite de deteco e da eficincia ...... 67 Figura 17: Curvas tpicas obtidas em realt-time RT-PCR ........................................... 68 Figura 18: Quantificao da expresso relativa de genes por RT-PCR em tempo real de acordo com o modelo proposto por Livak e Schmittgen (2001) ................ 70 Figura 19: Quantificao da expresso relativa de genes por RT-PCR em tempo real de acordo com o modelo proposto por Pfaffl (2001). ................................... 72 Figura 20: Eletroforese em gel de agarose com produtos da qRT-PCR relativa ............. 74 Figura 21: Comparao da quantificao da expresso relativa de genes de -amilase . 76 Figura 22: Perfis metablicos e de expresso da -amilase....................................... 79 Figura 23: Perfis metablicos e de expresso da -amilase ....................................... 80

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LISTA DE ABREVIATURAS

AIA BPNPG7 BMGY BMMY BSA cDNA ddNTP DNA dNTP dpc DTT HEPES IPTG kb kDa LB mRNA ORF pb PBS PCR PNPG5 PVP 40.000 RNA rRNA RT-PCR SDS Tris UDG YPDS

cido indol-3-actico p-nitrofenil maltoeptaosdeo bloqueado na extremidade no redutora buffered glycerol-complex medium buffered methanol-complex medium albumina de soro bovino DNA complementar 5-trifosfato de 2,3-didesoxirribonucleosdeo cido desoxirribonuclico 5-trifostato de 2-desoxirribonucleosdeo dias ps-colheita tio-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol cido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfnico isopropil-1-tio--D-galactopiranosdeo quilobases ou quilopar de bases quilodalton meio de cultura Luria-Bertani RNA mensageiro open reading frame par de bases tampo fosfato salino reao em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction) p-nitrofenil -D-maltopentaosdeo polivilpirrolidona de peso molecular mdio 40.000 g/mol cido ribonuclico cido ribonuclico ribossomal transcrio reversa seguida da PCR dodecil sulfato de sdio tris(hidroximetil)aminometano uracila-DNA glicosilase yeast extract peptone dextrose medium

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11.1 1.2 1.2.1 1.2.2

Introduo.Descrio e caracterizao do amido. Atividade enzimtica relacionada ao metabolismo amido-sacarose. Biossntese do amido. Degradao do amido e amilases. Alfa-amilases. Beta-amilases. Enzimas desramificadoras, glicosidases e enzimas fosforolticas.

1011 12 13 16 18 20 22 23

1.2.2.1 1.2.2.2 1.2.2.3 1.3

Amadurecimento de frutas.

2 3 44.1 4.2

Justificativa. Objetivos. Material.Frutas. Vetores, clulas hospedeiras e animais de experimentao.

25 26 2727 27

55.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12

Mtodos.Determinao dos teores de acares, CO2, etileno e amido. Extrao de protenas de banana. Extrao de DNA genmico e RNA total. Sntese de cDNA. Planejamento dos primers. Amplificao, clonagem e seqnciamento. Expresso da -amilase em sistema heterlogo. Eletroforese de protena em gel de poliacrilamida. Atividade de -amilase e -amilase. Preparo de soro antiamilase. Western blot. Anlise da expresso de genes por qRT-PCR e real-time RT-PCR.

2828 28 29 29 29 30 30 31 31 32 32 33

66.1 6.2 6.2.1 6.2.2 6.3 6.3.1 6.3.2 6.4 6.4.1 6.4.2

Resultados e Discusso.Perfil de respirao, etileno, carboidratos e atividade enzimtica. Expresso heterloga das amilases em modelo procarioto. Expresso das ORFs de -amilase e -amilase. Expresso de clones parciais de -amilase e -amilase. Expresso heterloga das amilases em modelo eucarioto. Clonagem das ORFs de e -amilase para expresso heterloga. Expresso da protena recombinante e ensaio enzimtico. Western blot com soros anti-amilases de banana. Extrao de protenas totais da polpa de banana. Western blot com soro anti-MAmyS1 e anti-MBmyS1.

3535 41 41 44 47 48 50 54 54 55

9 6.5 6.5.1 6.5.2 6.5.2.1 6.5.2.2 6.5.3 6.6 Expresso relativa dos genes da e -amilase. Clonagem de um gene da GAPDH de banana. Eficincia da amplificao e quantificao por RT-PCR em tempo real. Quantificao da expresso relativa: modelo Ct. Quantificao da expresso relativa: modelo Pfaffl. Quantificao da expresso por qRT-PCR relativa. Alfa e beta-amilase no metabolismo de carboidratos em bananas. 60 61 63 69 71 73 77

7

Concluso.

82 83 91

Referncias Bibliogrficas. Anexos.

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1

Introduo.

As frutas climatricas, ao serem colhidas, evoluem naturalmente para o amadurecimento, perodo no qual ocorrem vrias reaes qumicas e transformaes bioqumicas associadas a um metabolismo complexo que se processa de maneira altamente coordenada e esto relacionadas atividade de enzimas e a expresso ou supresso de genes especficos, resultando em modificaes em sua composio e estrutura. O amadurecimento requer sntese de novas protenas e mRNA, assim como de pigmentos e componentes do aroma e sabor (DILLEY, 1972; SPEIRS e BRADY, 1991; LAJOLO e CORDENUNSI, 1997). As cultivares de banana (Musa spp.), economicamente importantes, so

principalmente triplides e derivados de duas espcies selvagens diplides, Musa acuminata (genoma A) e Musa balbisiana (genoma B). Devido impossibilidade de nomear qual a espcie da banana cultivada, desenvolveu-se um sistema de

nomenclatura chamado de grupamento genmico, caracterizado pelas letras A e B. As frutas consumidas in natura so cultivares do grupo AAA e subgrupo Cavendish, derivados exclusivamente da M. Acuminata, como as bananas nanica, nanico e grande naine, constituindo a base do comrcio mundial da fruta. Outras cultivares de bananas, tambm importantes comercialmente, porm consumidas aps serem cozidas ou assadas, incluem os pltanos, como a banana da terra, do grupo AAB, ou a banana figo, do grupo ABB (ISRAELI e LAHAV, 1986; SEYMOUR, 1993; EMBRAPA, 2005). Os carboidratos, armazenados em muitas frutas principalmente na forma de amido, esto entre as molculas que mais sofrem alteraes ao longo do

amadurecimento, as quais so promovidas por reaes enzimticas de sntese e degradao. Isto implica em importantes mudanas na fruta, como por exemplo, o amolecimento e adoamento, relevantes para o seu consumo como alimento ou produto de comercializao (MACRAE et al., 1992). Em bananas, o amido corresponde a aproximadamente 20-25% do peso da polpa fresca da fruta na fase pr-climatrica e

11 rapidamente degradado durante o amadurecimento para menos de 1% no psclimatrio. Os acares, que representam 1-2% na fruta verde, so acumulados, chegando a 15-20% do peso fresco na fruta madura. A sacarose, predominante na fruta madura, aumenta de 0,2% para um mximo de 15%, precedendo o acumulo de glicose e frutose (AREAS e LAJOLO, 1981; MAO E KINSELLA, 1981; MARRIOTT et al., 1981; MOTA et al., 2000).

1.1

Descrio e caracterizao do amido.

O amido pode ser armazenado em diferentes rgos e tecidos vegetais, como em plastdeos de folhas, frutos e no endosperma de cereais em uma estrutura bastante complexa, formando grnulos com dimetro que pode variar de 0,1 a 50 m. Duas diferentes macromolculas podem compor o amido, amilose e amilopectina, sendo que ambas so polmeros da glicose (BALL e MORREL, 2003). Os grnulos formados pelo amido so estruturas semicristalinas com diversos tipos polimrficos, o grau e o tipo da cristalinidade presentes so dependentes, principalmente, das caractersticas estruturais da amilopectina, sendo esta, o principal componente de amido, embora a retrogradao da amilose, possa produzir um tipo especfico de estrutura cristalina (ZHANG et al., 2005). Amilose e amilopectina podem assumir diferentes conformaes, as quais podem ser encontradas em estado cristalino ou amorfo (BULON et al., 1998). A amilopectina composta por -1,4-glicanos, arranjados em grupos e

entremeados por -1,6-glicanos, sendo portanto, uma macromolcula ramificada de alto peso molecular, com grau de polimerizao de 105 a 106 unidades de glicose (BALL e MORREL, 2003). A estrutura da amilose compostas por unidades de glicose em arranjo essencialmente linear, com grau de polimerizao de 1000 a 5000 unidades, onde os monmeros de glicose so ligados atravs de ligaes -1,4-glicosdicas, podendo conter ainda, 0,1% de ligaes -1,6-glicosdicas. As longas cadeias da amilose so estruturas espirais, flexveis em meio aquoso e tm alta afinidade por iodo; cadeias de 200

12 unidades de glicose podem ligar, temperatura ambiente, at 20% do seu peso em iodo, o complexo resultante tem colorao azul escuro com mximo de absoro a 620 nm. A amilopectina, por sua vez, tem baixa capacidade de ligao ao iodo, 0,2% (p/p) e o complexo formado tem mximo de absoro a 550 nm (KOSSMANN e LLOYD, 2000). Esta capacidade de ligao de iodo, diminui proporcionalmente com a diminuio do tamanho da cadeia do polissacardeo. A natureza qumica da amilose, permite ainda, a formao de complexos com pequenas molculas de natureza hidrofbica, como no amido de cereais, onde est complexada com lipdios; j a amilopectina, pode ligar-se covalentemente com grupos fosfato, os quais no esto ausentes na amilose

(KOSSMANN e LLOYD, 2000; BALL e MORREL, 2003). Existem trs tipos distintos de estruturas cristalinas para os grnulos de amido, A, B e C, os quais, diferem quanto forma dos cristais e ao contedo de gua e geram diferentes padres de difrao em raios-X. O amido tipo A pode ser encontrado principalmente em cereais, enquanto o amido presente em tubrculos de batatas apresenta o padro tipo B. O amido tipo C encontrado em amidos de legumes e em alguns tubrculos de espcies tropicais, o padro tipo C resulta da combinao dos amidos tipo A e B (BULON et al., 1998; KOSSMANN e LLOYD, 2000). O padro de difrao do tipo B mais comumente relacionado ao amido de banana, todavia, podendo ocorrer tambm os tipos A e C, tal observao pode resultar da anlise de amidos de diferentes cultivares ou mesmo das condies de cultivo e da tcnica utilizada para obteno dos grnulos isolados (ZHANG et al., 2005).

1.2

Atividade enzimtica relacionada ao metabolismo amido-sacarose.

Plantas, algas verdes e cianobactrias sintetizam polissacardeos de reserva por vias similares, utilizando ADPglicose. O amido sintetizado exclusivamente por eucariotos fotossintetizantes ou em organismos derivados, existindo assim, dois tipos de

13 amido. O primeiro, encontrado no citoplasma de algas vermelhas e o outro, em plastdeos de algas verdes e plantas superiores (BALL e MORREL, 2003). Vrias so as vias metablicas e enzimas nos tecidos vegetais capazes de metabolizar o amido. Durante sua sntese, ocorre a participao de diversas isoformas da amido sintase, havendo ainda, a participao de enzimas ramificadoras e

desramificadoras em etapas subseqentes (MUKERJEA et al., 2002). O conjunto destas enzimas uma funo da origem botnica de cada amido, assim, a mesma planta pode sintetizar diferentes tipos de amido, como o amido transitrio, sintetizado em folhas, ou aquele encontrado em rgos vegetativos ou ainda sintetizado em amiloplastos de rgos e estruturas de armazenamento ou frutos (KOSSMANN e LLOYD, 2000). A converso do amido a acares solveis (sacarose, glicose e frutose) envolve vrias enzimas em mais de uma via metablica, representando um exemplo clssico de heterogeneidade da atividade enzimtica (AREAS e LAJOLO, 1981). Enzimas das vias de degradao hidroltica e fosforoltica, alm da sacarose sintase (SuSy, EC 2.4.1.13) e sacarose fosfato sintase (SPS, EC 2.4.1.14), vm sendo identificadas e estudadas em frutas como a banana, contudo a exata contribuio de cada uma no processo da degradao do amido durante o amadurecimento ainda permanece como uma questo a ser resolvida (MEDINA-SUAREZ et al., 1997; ZHANG et al., 2005).

1.2.1

Biossntese do amido.

O amido a principal molcula de armazenamento de carbono em plantas e a fonte principal da energia para animais, incluindo seres humanos. O amido produzido nas folhas durante o dia a partir dos produtos da fotossntese, sendo acumulado de maneira transiente nos cloroplastos, sob a forma de grnulos insolveis. Ao cair da noite, as vias de acmulo do lugar a degradao do amido, e os carboidratos so exportados a partir do plastdeo, predominantemente como maltose e em menor proporo como glicose (NIITTYLA et al., 2004).

14 Dentro da clula vegetal, no citosol, a maltose convertida a hexose-fosfato, podendo ser consumida pela via glicoltica ou utilizada para sntese de sacarose, a qual exportada para outras clulas. A sacarose transportada a partir dos tecidos fotossintetizantes (tecidos fonte), atravs do floema, at outros tecidos da planta (tecidos consumidores). Os tecidos consumidores podem ser tecidos em crescimento, tais como meristemas e as folhas novas, que catabolisam a sacarose para produzir energia, ou rgos do armazenamento, tais como razes, tubrculos, cascas de rvores e frutas, os quais ressintetizam amido nos plastdeos. Este amido armazenado muito importante para as plantas e degradado em seqncia a variaes sazonais ou estgios de desenvolvimento especficos, tais como o comeo da primavera para razes e cascas de rvores e o incio de amadurecimento em muitos frutos (SMITH et al., 1997; BALL e MORELL, 2003). Em plantas superiores, a biossntese do amido nos plastdeos envolve a participao de uma sria de enzimas (figura 1), incluindo ADPglicose pirofosforilase (AGPase), amido sintase (SS), enzima ramificadora do amido (SBE) e enzima desramificadora do amido (SDBE). As cadeias de -glicanos de ambos os tipos de polmeros, amilose e amilopectina, so elongadas pela amido sintase (ADP-glucose: 1,4-D-glicano 4--D-glicosiltransferase; EC 2.4.1.21). A amido sintase catalisa a

transferncia de resduos de D-glicose oriundos de unidades de difosfato de glicosilnucleotdeos (ADPglicose) extremidade no redutora de uma molcula precursora ou um aceptor protico (amilogenina), produzindo ligaes do tipo -1,4. Cinco subfamlias da amido sintase j foram identificadas em plantas superiores, amido sintase ligada ao grnulo (GBSS) e outras quatro isoformas solveis de amido sintase (SSI, SSII, SSIII e SSIV). A GBSS essencial para a sntese de amilose e exclusivamente ligada ao grnulo de amido. As isoformas SSI, SSII, SSIII e SSIV, esta ltima chamada SSV em dicotiledneas, so responsveis pela sntese e elongao das cadeias de amilopectina (SMITH et al., 1997; MYERS et al., 2000; BALL e MORELL, 2003; JAMES et al., 2003).

15

Figura 1: Modelo de interconverso da sacarose em amido para clulas de tecidos de reserva e endosperma em desenvolvimento. A sacarose captada pela clula hidrolisada no citosol, convertida em ADPglicose, a qual, transportada para o interior do amiloplasto e utilizada na sntese da amilose e amilopectina pelas diferentes isoformas da amido sintase. Adaptado de Kossmann e Lloyd (2000) e Emes et al. (2003).

16 1.2.2 Degradao do amido e amilases.

Acredita-se que somente com a ao conjunta da -amilase (EC 3.2.1.1), amilase (EC 3.2.1.2), enzima desramificadora (EC 3.2.1.41) e -glicosidase (EC 3.2.1.20), pode-se obter in vivo, a completa hidrlise do amido. Entretanto, o processo de degradao do amido vem sendo estudo, sob aspectos mais amplos, ao longo da germinao de sementes de cereais, enquanto as vias de degradao em clulas de tecidos vegetais vivos e a participao de cada uma destas enzimas na hidrlise do amido, permanecem indefinidas (BECK e ZIEGLER, 1989; SARIKAYA et al., 2000). Diferenas marcantes so encontradas quando comparados os modelos de degradao de amido encontrado em rgos de armazenamento de cereais como sementes de cevada e arroz, de leguminosas como o feijo e a ervilha e em tubrculos de batatas, ou ainda aquele acumulado de forma transiente em cloroplastos de clulas de folhas durante o dia, o qual conhecido como amido transitrio (KOSSMANN e LLOYD, 2000; LLOYD et al., 2005; SMITH et al., 2005). Na figura 2, esto representados alguns modelos propostos para a degradao do amido de diferentes origens vegetais. Em sementes de cereais, o estabelecimento da degradao do amido acontece durante a germinao, mediado pela intensa sntese de novo da -amilase, a aqual sinalizada pelas giberelinas (figura 2A), acompanhado pela ao da -amilase e glicosidase nas dextrinas liberadas. O amido armazenado em cotildones de leguminosas ou em tubrculos parece ser degradado principalmente por vias fosforolticas. Em batatas, um fenmeno conhecido como adoamento pelo frio acompanhado pelo aumento da expresso de enzimas fosforolticas, glicano gua-diquinase e fosforilase (figura 2B). Foi proposto que, o amido acumulado em cloroplastos de folhas de Arabidopsis e espinafre, est sujeito a aes da -amilase e da glicano gua-diquinase, enquanto a -amilase no determinante no processo (figura 2C), este conceito parece ser aplicvel degradao do amido em folhas de outras espcies vegetais (KOSSMANN e LLOYD, 2000; LLOYD et al., 2005; SMITH et al., 2005).

17

Figura 2: Modelos de degradao de amido em cotildones de cereais e leguminosas e em folhas. (A) Via pela qual o amido convertido em maltose e glicose no endosperma de cereais. A membrana plasmtica e o envelope do amiloplasto so degradados no incio da germinao. (B) Converso do amido em acar nos cotildones de leguminosas. A membrana do amiloplasto desintegrada e a degradao do amido catalisada por enzimas citoslicas. (C) Principal via pela qual o amido convertido em maltose e exportado para o citosol em folhas. GWD, glicano gua-diquinase; MEX1, transportador de maltose. Adaptado de Smith et al. (2005).

18 1.2.2.1 Alfa-amilases.

A -amilase (1,4--D-glicano glicanoidrolase, EC 3.2.1.1), possui atividade endohidroltica e atua aleatoriamente sobre ligaes glicosdicas -1,4, produzindo uma mistura de glicose, maltose e dextrinas, podendo ser encontrada em animais, plantas, fungos e bactrias. -Amilases so membros da famlia das amilases ou famlia 13 das glicosdeo hidrolases (GH-13), classificao esta, baseada na similaridade das seqncias de aminocidos (HENRISSAT e BAIROCH, 1996) e cuja relao estrutural e evolucionria com outros membros da famlia das glicosdeo hidrolases vem sendo amplamente investigada (JANEEK, 1997; PUJADAS e PALAU, 2001). As -amilases compartilham a estrutura barril (/)8, similar a encontrada para a triose fosfato isomerase (TIM, E.C. 5.3.1.1) e ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, E.C. 2.4.1.19), apresentando no entanto, caractersticas distintas em sua estrutura primria que as diferem da TIM e CGTase (JANEEK et al., 1995; VIEIRA-JUNIOR, 2001). O tipo de arranjo estrutural encontrado nas -amilases pode ser evidenciado tambm nas famlias GH-70 e GH-77 das glicosdeo hidrolases, desta forma, as famlias GH-13, GH-70 e GH-77 foram organizadas em um novo grupo, GH-H, que reflete aspectos evolutivos mais prximos entre seus membros, como por exemplo, os resduos catalticos e a disposio espacial dos mesmos. Embora diferentes tipos de enzimas sejam capazes de liberar, in vitro, glicanos solveis a partir de grnulos de amido purificados, acredita-se que a nica enzima capaz faz-lo in planta, seja a -amilase. Ela parece apresentar papel central no processo de hidrlise do amido e por possuir atividade endo-amiloltica, a -amilase promove alteraes marcantes no gro de amido, fornecendo ou aumentando a disponibilidade de substrato para outras enzimas degradativas, sendo a enzima responsvel pelo ataque inicial aos grnulos nos cereais, capaz ainda de degrad-los inteiramente (PREISS, 1982; BECK e ZIEGLER, 1989; IRVING, 1999).

19 Em cereais, a expresso da -amilase e a sua regulao so temas bastante estudados. A degradao do amido tem papel central entre os eventos bioqumicos na germinao de sementes, fornecendo a energia necessria ao embrio. Esta degradao iniciada pela induo da -amilase, responsvel pela clivagem das ligaes -1,4endoglicolticas da amilose e amilopectina. No entanto, a completa degradao do amido requer ainda a ao de outras enzimas glicolticas (HUANG et al., 1990; SUTLIFF et al., 1991; SUBBARAO et al., 1998). Estudos sobre o desenvolvimento e regulao hormonal da expresso de genes em plantas revelam que a induo da -amilase resulta na sua sntese "de novo", sendo acompanhada por um aumento pronunciado no mRNA para a protena. Nos cereais esta induo responde positivamente s giberelinas (GA) e negativamente ao cido abscsico (O'NEILL et al., 1990; HAMABATA et al., 1994), tendo sido verificado um aumento da transcrio do gene da -amilase em protoplastos da camada de aleurona de cereais tratados com GA (SKADSEN, 1993; YAMAMOTO, 1995). Em bananas, o cido abscsico pode induzir a iniciao do amadurecimento (SEYMOUR et al., 1993), enquanto o GA parece causar um atraso significativo no estabelecimento do climatrio (ROSSETTO et al., 2003), contrastando assim com o padro dos cereais. Os genes de -amilase de arroz, cevada e trigo, apresentam um motivo chamado BOX pirimidnico, encontrado em genes que sofrem induo por GA (SUTLIFF et al., 1991), no existindo informaes a esse respeito para genes de frutas. Investigaes sobre o mecanismo de induo do cido giberlico avanaram no sentido de analisar as regies promotoras em camadas de aleurona de arroz. Contudo detalhes no processo de transferncia do sinal para a expresso dos genes permanecem incertos (YAMAMOTO, 1995). O GA secretado pelo embrio para as camadas do aleurona e escutelo, induzindo a sntese de mRNA da -amilase que aumenta em paralelo com a atividade de sntese da enzima no cotildone (BECK e ZIEGLER, 1989). Quando a degradao do amido supera a capacidade de utilizao de acares pela semente em desenvolvimento, o aumento na concentrao dos acares solveis reprime a expresso de genes da -amilase, atuando como mecanismo de feedback

20 negativo, que pode ser encontrado regulando outros genes responsivos concentrao de acar ou de outros produtos do metabolismo de carbono (TERASHIMA et al., 1996). Em kiwis, a atividade -amilsica aumenta paralelamente ao contedo de amido durante o desenvolvimento da fruta, tendo seus valores mximos entre 134 dias psantese (momento em que o contedo de amido mximo), havendo um aumento de 2 vezes na atividade -amilsica associada ao sistema de degradao do amido. Ao longo do amadurecimento os valores da atividade da -amilase permanecem constantes at a quase totalidade da converso do amido em acares, decrescendo 4 a 5 vezes neste ponto (WEGRZYN e MACRAE, 1995). Wegrzyn et al. (2000), demonstraram que em mas amadurecidas sob baixa temperatura (0,5 C), o transcrito da -amilase se acumulou temporariamente at os primeiros dias do amadurecimento, com altos nveis de mRNA sendo observados do dia 3 ao 9 e no sendo detectado posteriormente. A associao da mobilizao do amido com o incremento do mRNA, no pode, no entanto, ser evidenciada, concluindo que a expresso da -amilase foi uma resposta ao frio.

1.2.2.2

Beta-amilases.

A -amilase (1,4--D-glicano maltoidrolase, EC 3.2.1.2) pode ser encontrada em vegetais superiores e em algumas bactrias gram-positivas (PUJADAS et al., 1996), classificada na famlia 14 das glicosdeo hidrolases (GH-14) e atua como exo-hidrolase na penltima ligao -1,4-glicosdica do amido, glicognio e oligossacardeos relacionados, removendo a partir da extremidade no redutora da cadeia, sucessivas unidades de maltose, com inverso da configurao do carbono anomrico inicial do acar liberado. As -amilases apresentam no seu arranjo tridimensional a estrutura barril (/)8, descrita tambm nas -amilase, todavia, os aminocidos catalticos e a disposio espacial destes, difere daqueles encontrados na famlia 13, revelando a divergncia evolutiva entre as duas famlias de enzimas.

21 A -amilase participa do processo de mobilizao do amido durante a germinao das sementes de cereais. Esta acumulada durante o processo de desenvolvimento das sementes de cevada e permanece ligada aos grnulos de amido, sendo considerada a isoforma especfica do endosperma, havendo tambm uma isoforma ubqua, presente em rgos vegetativos como folhas e razes (ZIEGLER, 1999). Em sementes de arroz, a forma especfica do endosperma ausente, ocorrendo a sua sntese na camada de aleurona durante a germinao e ao contrrio do que se observa para a -amilase, a induo da expresso e sntese "de novo" da -amilase no esto sob controle de giberelinas (YAMAGUCHI et al., 1999). Em batata doce, acreditava-se que a -amilase desempenhava uma funo de protena de reserva nas razes, conceito este, estendido por muito tempo a outros tecidos vivos (KOCH, 1996). A expresso desta enzima em rgos vegetativos, como folhas e talos, induzida por altas concentraes de sacarose e outros acares metabolizveis, esta regulao acontece por uma complexa rede de transduo de sinal (MAEO, et al., 2001), podendo responder ainda, em tubrculos de batata, ao frio (VIKSONIELSEN et al., 1997; NIELSEN et al., 1997; GANA et al., 1998) e estresse hdrico em cotildones de Cucumis sativus (TODAKA et al., 2000). Em folhas de batata, espinafre e Arabidopsis, foram identificadas isoformas de -amilase com peptdeos de endereamento especfico para plastdeos, s quais atribuda a degradao do amido transitrio, acumulado nos cloroplastos, at maltose, principal fonte de carbono exportada atravs da membrana do plastdeo para o citosol, sendo este aporte de maltose, utilizado como fonte de carbono durante o perodo noturno (SMITH et al. 2003; WEISE et al., 2005). Purgatto et al. (2001) investigaram o efeito do tratamento de bananas com o cido indol-3-actico (AIA) durante a ps-colheita, demonstrando que o AIA pode atrasar a degradao do amido em bananas e que, da mesma forma, o incremento na atividade e transcrio da -amilase tambm foi atrasado, sugerindo estreita correlao entre expresso da enzima e o metabolismo amido-sacarose ao longo do amadurecimento das frutas.

22 1.2.2.3 Enzimas desramificadoras, glicosidases e enzimas fosforolticas.

Enzimas desramificadoras do amido (DBE), como a pululanase (-dextrina-endo1,6--glicosidase, EC 3.2.1.41), hidrolisam ligaes -1,6-glicosdicas no pululano e amido formando maltotriose. A isoamilase, (EC 3.2.1.68), outra enzima desramificadora, hidrolisa ligaes -1,6-D-glicosdicas em cadeias ramificadas da amilopectina e suas dextrinas limites. Esta distingui-se da pululanase, por sua incapacidade de atacar o pululano e por sua ao limitada em -dextrinas limite (HENKER et al., 1998; NAKAMURA et al., 1996). A atividade de isoamilase em bananas mantm-se praticamente estvel durante o amadurecimento, no sendo observadas mudanas significativas na expresso do seu gene (BIERHALS et al., 2004). A hidrlise do terminal no redutor dos polissacardeos pode ser feita por duas enzimas: as -amilases, descritas anteriormente, e as -glicosidases (EC 3.2.1.20). As glicosidases liberam -D-glicose a partir do terminal -1,4 da cadeia glicosdica, acreditase que sua funo primria seja de degradar os produtos de outras enzimas que agem diretamente sobre o amido, podendo atuar sobre glicanos de cadeia curta como a maltose ou maltotriose e ainda diretamente sobre a amilopectina (BAIROCH, 2000a, 2000b). Apesar de serem descritas principalmente em endosperma de cereais, esto amplamente distribudas em plantas, apresentando-se mltiplas isoformas. Konishi et al. (2001) sugerem que as -glicosidases, na sua isoforma cida, so enzimas chaves no processo de degradao do amido em bananas. A 4--glicanotransferase (EC 2.4.1.25), tambm conhecida com enzima-D ou enzima desproporcionadora (DPE), catalisa a transferncia de, principalmente, grupos maltosil a partir de um -1,4-D-glicosdeo doador para uma nova posio em outro glicosdeo aceptor ou para a glicose. As molculas aceptora e doadora podem ser glicanos de mesmo tamanho de cadeia, causando a desproporo na serie de glicanos que tm seu tamanho aumentado. Acredita-se que a converso de oligossacardeos de cadeia curta em glicosdeos de cadeia longo prov mais substrato para enzimas como amilase e amido fosforilase.

23 Enzimas da via fosforoltica, podem ter funo determinante na degradao do amido, dependo da sua natureza qumica e origem biolgica. A amido fosforilase (EC 2.4.1.1) atua na ligao -1,4 das extremidades no redutoras de oligossacardeos, liberando glicose-1-fosfato, podendo degradar toda a amilose. Em bananas, a atividade das fosforilases aumenta antes do incio da degradao do amido e decresce durante o perodo climatrico (AREAS e LAJOLO, 1981; MOTA et al., 2002), este comportamento pode significar uma acentuada participao da fosforilase durante etapas iniciais da degradao dos grnulos de amido. Estudos recentes mostram que uma enzima at ento desconhecida, a glicanogua-diquinase ou GWD (EC 2.7.9.4), atuaria na sntese e degradao do amido, como demonstrado em tubrculos de batatas e em folhas de Arabidopsis, onde a GWD transfere o grupo -fosfato do ATP para a posio 3 ou 6 dos resduos glicosdicos da amilopectina, influenciando na susceptibilidade da ao de outras enzimas na superfcie do grnulo (SMITH et al., 2005).

1.3

Amadurecimento de frutas.

A biologia molecular trouxe importante contribuio ao estudo do metabolismo de carboidratos em das da frutas, qumica fornecendo e as ferramentas ps-colheita. necessrias Novas para o

acompanhamento

bioqumica

tcnicas

para

manipulao e acompanhamento de processos e reaes envolvendo enzimas e cidos nuclicos, permitem avaliar com maior grau de confiana qual o comportamento destas molculas, definindo as bases genticas do controle do metabolismo de carboidratos, podendo assim, contribuir de forma significativa para o entendimento das bases moleculares do amadurecimento e adoamento e como estes processos podem influenciar na conservao e valor nutricional das frutas. Informaes a respeito destes processos podem ser obtidas pelo estudo e investigao do turnover de protenas e cidos nuclicos, sendo verificada a continuidade

24 de sua sntese em muitos frutos. Alm da continuidade da sntese protica, estas tambm passam a ser redirecionadas. Assim, as anlises de mRNA e espcies proticas, mostraram haver sntese de protenas relacionadas distintamente com o

amadurecimento. Isto mostra serem estes eventos controlados primariamente pela expresso de genes (SEYMOUR et al., 1993). A partir de clulas do tecido vegetal, possvel a extrao de protenas, RNA total e DNA genmico. Partindo deste material isolado pode-se realizar o acompanhamento da transcrio e traduo, manipulao e modificao de genes para a produo de plantas transgnicas e anlise de seqncias que podero alimentar bancos de dados ou servir para a construo de modelos moleculares para futuras investigaes (BECK e ZIEGLER, 1989; KOCH, 1996; BIRCH, 1997). Trabalhos recentes procuraram descrever a participao dos eventos que envolvem a transcrio e a traduo de genes diretamente relacionados ao processo de sntese e degradao do amido em bananas. Foi demonstrando que a ativao da transcrio e traduo dos genes da SPS e SuSy de banana so eventos importantes durante o desenvolvimento e amadurecimento da fruta, havendo relao direta entre os nveis de mRNA, protena e atividade enzimtica (NASCIMENTO et al., 1997 e 2000). Enquanto os nveis de expresso da DBE em bananas amadurecidas sob controle e tratadas com etileno mostraram-se constantes (BIERHALS et al., 2004), a infiltrao de cido indol-3-actico em fatias verdes de banana, atrasou a degradao do amido e conseqente formao de sacarose, atrasando tambm o incremento nos nveis de atividade e transcrio da -amilase (PURGATO et al., 2001)

25

2 Justificativa.

Apesar da importncia atribuda -amilase e -amilase so poucas as informaes a respeito dessas enzimas em frutos, principalmente com relao funo desempenhada, propriedades moleculares e cinticas e regulao gnica. No que se refere ao padro de expresso no tecido pouco se conhece sobre os agentes envolvidos nessa regulao e variao temporal. Deste modo, um aprofundamento dos estudos genticos, utilizando tcnicas de biologia molecular, procurou contribuir para uma melhor compreenso da funo das amilases em frutas, particularmente em bananas, bem como dos fatores determinantes para a regulao das suas atividades. A obteno da seqncia dos mRNA dos genes das amilases e a sua expresso heterloga, procuraram fornecer substrato para etapas importantes de muitos estudos cinticos e moleculares. Estes por sua vez, tiveram o intuito de contribuir para tornar mais claros os mecanismos de atuao destas enzimas na banana, possibilitando o desenvolvimento e aplicao de novas tecnologias envolvendo a manipulao e conservao ps-colheita de frutas.

26

3 Objetivos.

Clonar, seqnciar e induzir a expresso da -amilase e -amilase de banana em sistema heterlogo procarioto e eucarioto. Acompanhar a atividade e a expresso da -amilase e -amilase durante o amadurecimento da banana atravs da determinao dos perfis de expresso de protena e mRNA e sua relao com os padres de respirao (liberao de CO2), produo de etileno, degradao de amido e sntese de acares solveis, de modo a contribuir para o entendimento da funo destas enzimas no metabolismo do amido na fruta.

27

4 Material.

4.1

Frutas.

Bananas pr-climatricas (Musa sp., grupo genmico AAA, subgrupo Cavendish, cultivar Nanico) colhidas com maturidade comercial, aproximadamente 110-120 dias ps-antese, adquiridas na CEAGESP, foram lavadas em soluo de hipoclorito de sdio 5% e separadas em dois grupos. Um grupo foi deixado amadurecer naturalmente, constituindo-se no grupo controle. Outro grupo foi submetido a tratamento com etileno a 100 ppm por 12h. As frutas foram armazenadas em cmara com temperatura de 20 2 C e umidade de 80 5 %. Foram tomadas amostras diariamente para medida da produo de etileno e CO2. Amostras dos dois grupos foram coletas periodicamente, fatiadas, congeladas em nitrognio lquido e armazenadas em freezer a 80 C.

4.2

Vetores, clulas hospedeiras e animais de experimentao.

Utilizaram-se

os

vetores

pCRT7/NT-TOPO,

pCR4-TOPO,

pPICZB,

pPICZB,

pPICZC (Invitrogen) e pGEM-T (Promega) para transformao de bactrias E.coli TOP10, TOP10F ou BL21(DE3)pLysS (Invitrogen). Foram utilizadas leveduras Pichia pastoris GS115 (Invitrogen) e coelhos machos da raa Nova Zelndia, brancos, com peso aproximado de 2,8 a 3,0 kg.

28

5 Mtodos.

5.1 Determinao dos teores de acares, CO2, etileno e amido.

Os teores de sacarose, glicose, frutose foram determinados por cromatografia a lquido segundo Purgatto et al. (2002) e Rossetto et al. (2003), utilizando-se coluna de troca inica e detector amperomtrico pulsado (HPAEC-PAD). O teor de amido foi determinado enzimaticamente como descrito por Cordenunsi e Lajolo (1995). Para anlise dos nveis de CO2 e etileno produzidos, amostras compostas por trs grupos de trs frutas cada, foram acondicionadas e mantidas em frascos fechados. Decorrido o perodo de 1h, os gases foram determinados por cromatografia a gs em coluna HP-Plot Q, utilizando-se os detectores de condutividade trmica (TCD) para CO2 e de ionizao em chamas (FID) para etileno (PURGATTO et al., 2002; ROSSETTO et al., 2003). As determinaes dos teores de carboidratos foram feitas em triplicata. Todos os resultados foram expressos como mdia mais o erro padro da mdia.

5.2

Extrao de protenas de banana.

Cerca de 500 mg de polpa de banana foram homogeneizadas em 2 mL de tampo de extrao (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, 2 % de SDS e 2-mercaptoetanol a 5 %). A mistura foi aquecida em banho fervente por 10min e ento centrifugada por 60min a 3000 x g. O sobrenadante constituiu o extrato total de protenas. Para determinao das atividades enzimticas, cerca de 500 mg de amostra foram homogeneizadas em 2 mL de tampo de extrao composto por fosfato de sdio 0,1 M (pH 7,0), cistena 20 mM neutralizada, polivinilpirrolidona (PVP 40.000) a 1 % e benzamidina 1 mM. O homogenato foi centrifugado a 12000 x g por 40min e o sobrenadante considerado o extrato enzimtico bruto.

29 Os teores de protena dos extratos foram determinados pelos mtodos de Lowry (1951) modificado por Peterson (1977), Bradford (1976) e Henkel e Bieger (1994), tendo BSA como padro.

5.3 Extrao de DNA genmico e RNA total.

O DNA genmico foi extrado de folhas jovens de bananeira pelos mtodos descritos por Ausubel et al. (1997), Clark (1997) e Dellaporta et al. (1983) com modificaes (VIEIRA-JUNIOR, 2001). O RNA total foi extrado da polpa de frutas congeladas atravs de metodologia descrita por Lpez-Gmes e Gmez-Lim (1992) com modificaes (NASCIMENTO, 1997; VIEIRA-JUNIOR, 2001).

5.4

Sntese de cDNA.

A primeira fita do DNA complementar (cDNA) foi sintetizada a partir de 10 g de RNA total (First-Strand cDNA synthesis Kit, Amersham Biosciences) ou a partir de 5 g de RNA total em um volume final de 21L (SuperScript First Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen) utilizando primers oligo(dT)12-18 ou especficos para genes de banana.

5.5

Planejamento dos primers.

Foram utilizados primers delineados a partir das regies de consenso dos alinhamentos definidos atravs do programa ClustalX (THOMPSON et al., 1997), entre seqncias de DNA dos genes de interesse disponveis na base dados do GenBank (BENSON et al., 2005) ou a partir do seqenciamento de clones de genes de banana.

30 Todos os primers foram avaliados quanto ao autopareamento, temperatura de hibridizao e formao de dmeros com uso dos programas OLIGO (RYCHLIK et al., 1990), NetPrimer (PREMIER Biosoft International, 2005) e FastPCR (KALENDAR, 2005).

5.6

Amplificao, clonagem e seqnciamento.

As amplificaes do cDNA atravs da reao em cadeia da polimerase (PCR) foram feitas de acordo com Sambrook et al. (1989). Os fragmentos de DNA amplificados por PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% em tampo TPE (SAMBROOK et al., 1989), purificados a partir do gel utilizando resina de afinidade (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, Amersham Biosciences), ligados a vetores de clonagem e utilizados para transformao de bactrias quimicamente competentes (CLARK, 1997). A identificao dos clones positivos foi por PCR e seqnciamento do inserto. As amostras de DNA clonadas foram seqenciadas de acordo com o mtodo de Sanger (1977) utilizando didesoxinucleotdeos (ddNTP) marcados com corante

fluorescente Cy5. Foram utilizados o seqenciador automtico ALF ExpressII e o kit para seqnciamento Thermo Sequenase Cy5 Dye Terminator (Amersham Biosciences).

5.7

Expresso da -amilase em sistema heterlogo.

Clones contendo as seqncias completas das ORFs (open reading frame) da amilase (MAmy) e -amilase (MBmy), foram obtidos utilizando-se PCR com combinaes de primers delineados a partir das regies amino-terminal (Nt) e carboxi-terminal (Ct) das seqncias dos seus cDNAs. Clones de ambas enzimas foram utilizados para expresso da protena recombinante em sistema de expresso procarioto (pCR T7 TOPO TA Expression Kit, Invitrogen) e eucarioto (EasySelect Pichia Expression kit, Invitrogen). Os insertos foram adequadamente clonados em vetores de expresso e as construes

31 de DNA plasmidial resultantes foram utilizadas para transformao e propagao em bactrias E. coli TOP10F'. A correta orientao e seqncia das construes foi verificada por seqnciamento automtico de DNA. O preparado dos meios de cultura, a manipulao e armazenamento das cepas utilizadas, seguiram as recomendaes do fabricante.

5.8

Eletroforese de protena em gel de poliacrilamida.

As

amostras

de

protena

foram

submetidas

eletroforese

em

gis

de

poliacrilamida, em sistema de tampo descontnuo, sob condies dissociantes (SDSPAGE), com base no mtodo de Laemmli (1970), utilizando gis de poliacrilamida a 8% em tampo contendo Tris 25 mM, glicina 192 mM (pH 8,3) e SDS 0,1%. Os gis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 (0,1%) em soluo aquosa de metanol e cido actico na proporo 5:5:2 e descoradas em soluo aquosa de cido actico 7,5% e etanol 5% (HAMES e RICKWOOD, 1990). Extratos enzimticos foram submetidos eletroforese sob condies nativas (PAGE), como descrito acima, excluindo-se o SDS do preparo dos gis e tampes.

5.9

Atividade de -amilase e -amilase.

As atividades -amiloltica e -amiloltica foram determinadas utilizado-se, respectivamente, os mtodos CERALPHA e BETAMYL (Megazyme) conforme proposto por Bassinello et al. (2002). Foram incubados 50 L de extrato enzimtico bruto com 50 L de substrato especfico a 37 C por 60min ou 30min, para -amilase e -amilase respectivamente. Decorrido o tempo de reao, foram adicionados ao meio 750 L de uma soluo de Tris-base a 1 %, procedendo-se medida da absorbncia a 410 nm. A atividade especfica foi expressa em funo da quantidade de p-nitrofenol liberada pela massa de protena contida no extrato bruto ao longo do tempo de reao. As

32 determinaes de atividade foram feitas em triplicata e os resultados expressos como mdia mais o erro padro da mdia. A atividade hidroltica em gel foi avaliada em PAGE-substrato (Zeeman et al., 1998) e SDS-PAGE-substrato (Martinz et al., 2000) utilizando-se amilopectina a 0,1% ou amido a 0,2%, previamente solubilizados por fervura e incorporados ao gel de poliacrilamida como descrito por Vieira-Junior et al. (2006). Os gis foram lavados duas vezes por perodos de 15min em 50 mL de tampo Tris-HCl 100 mM (pH 7,0), contendo MgCl2 1mM, DTT 1mM e CaCl2 1mM e deixados incubando no mesmo tampo a 37C por 6 a 12h sob agitao constante. Aps incubao a atividade amilsica foi revelada com soluo de iodo (I2 10 mM e KI 14 mM) e visualizada como faixas claras no gel corado em azul.

5.10

Preparo de soro antiamilase.

Cerca de 100 g de protena recombinante foram homogeneizados em adjuvante completo de Freund e a emulso foi administrada por injeo subcutnea no dorso de coelhos. Esse procedimento foi repetido por duas ou mais vezes utilizando-se adjuvante incompleto, a intervalos de 3 semanas. Uma semana aps cada injeo de reforo, foram coletadas amostras de sangue. O soro foi separado por centrifugao a 1000 x g por 2min e testado em ensaios de Western blot. O controle negativo das anlises consistiu nas amostras de soro obtidas antes da imunizao (NASCIMENTO et al., 1997).

5.11

Western blot.

Amostras de protena total, separadas em PAGE ou SDS-PAGE, foram transferidas para membranas de nitrocelulose (TOWBIN et al., 1979) em tampo Tris 25 mM, glicina 192 mM (pH 8,3). As membranas foram incubadas por 2 horas em tampo TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e NaCl 150 mM) contendo 0,02 % de Tween 20 (TTBS) e leite desnatado

33 a 5 % ou casena a 0,5%, procedendo-se incubao por 2 horas no mesmo tampo adicionado do antisoro na diluio 1:100. Em seguida foram feitas trs lavagens com tampo TTBS, por 10min cada, e a membrana foi incubada por 1h com anticorpo de cabra anti-coelho (Sigma), conjugado com peroxidase (HRP) ou fosfatase alcalina (AP). Aps novas lavagens as bandas foram reveladas por incubao em substrato de reao cromognico (SAMBROOK et al., 1989, AUSUBEL et al., 1997) ou quimioluminescente para a enzima conjugada (ECL, Amersham Biosciences; Lumi-Phos e SuperSignal, Pierce).

5.12

Anlise da expresso relativa de genes por qRT-PCR e real-time RT-PCR.

Para a anlise quantitativa da expresso relativa dos genes da e -amilase utilizaram-se dois mtodos que empregam a reao em cadeia da polimerase combinada transcrio reversa ou RT-PCR. A deteco do produto de reao se deu por anlise em gel de agarose, para o mtodo conhecido como RT-PCR quantitativa relativa ou qRT-PCR relativa (BURLEIGH, 2001) e por deteco de fluorescncia em tempo real produzida a partir do produto da RT-PCR, ou real-time RT-PCR (HIGUCHI et al., 1992, 1993; HEID et al., 1996), na qual, h a incorporao do corante fluorescente SYBR Green I nas duplas fitas de DNA recm sintetizadas com a concomitante medida da fluorescncia emitida pelas mesmas (MORRISON et al., 1998). As reaes de qRT-PCR relativa foram realizadas em um volume final de 20 L contendo 0,6 U de Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 3 mM, dNTP 200 M cada, 240 ng de cDNA, 300 nM do primer sentido e 300 nM do primer reverso. As condies de amplificao foram: 94C por 2min seguidos de ciclos de 94C por 10s, 62C por 20s e 72C por 30s, repetidos tantas vezes quanto necessrio para cada seqncia da DNA analisada. Foi utilizado o sistema de real-time RT-PCR em dois passos, com duas enzimas em dois diferentes tubos de reao (BUSTIN, 2000, 2002), no qual alquotas de 0,5 L das

34 amostras de cDNA, equivalentes a transcrio reversa de aproximadamente 120 ng de RNA total, foram amplificadas por PCR utilizando-se Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) no termociclador Rotor-Gene 3000 four channel

Multiplexing System (Corbett Research). A quantidade de produto da PCR presente nas amostras a cada ciclo foi medida pela incorporao do fluorforo SYBR Green I durante a etapa de extenso da cadeia de DNA. Foram realizadas trs determinaes com reaes em duplicata, cada reao continha: 0,6 U de Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 3 mM, dGTP 200 M, dATP 200 M, dCTP 200 M, dUTP 200 M, 0,4 U de UDG, 120 ng de cDNA, 300 nM do primer sentido e 300 nM do primer reverso em um volume final de 20 L. As condies de amplificao foram: 50C por 2min, 95C por 2min seguidos de 45 ciclos de 95C por 15s, 63C por 30s e 72C por 30s.

35

6 Resultados e Discusso.

6.1

Perfil de respirao, etileno, carboidratos e atividade enzimtica das amostras.

Convencionalmente, as frutas podem ser classificadas em climatricas e noclimatricas, de acordo com os padres de respirao e produo de etileno durante o seu amadurecimento. Nos frutos climatricos, a atividade metablica intensificada ao longo do processo do amadurecimento, pode ser representada pela intensa respirao das frutas, avaliada pela produo de CO2 e a presena de um pico na sua liberao, o que geralmente, acompanhado pelo incremento na produo endgena de etileno, sendo esta uma caracterstica do climatrio (BIALE e YOUNG, 1981). Nos frutos climatricos, pode-se identificar diferentes fases do amadurecimento, antes do seu incio, os frutos pr-climatricos produzem baixos nveis de etileno (sistema 1), evoluindo para o climatrio, no qual h aumento nos nveis de produo de etileno (sistema 2) e a regulao da sua produo se torna autocataltica. Nestes frutos, o etileno est relacionado com importantes mudanas fisiolgicas e bioqumicas que ocorrem ao longo do amadurecimento. Aps o estabelecimento do climatrio, a produo de etileno diminui significativamente e o fruto evolui para a fase ps-climatrica (GIOVANNONI, 2001). Os frutos no climatricos, por sua vez, no exibem aumentos significativos nos padres respiratrio e de sntese de etileno, apresentando declnio gradual na respirao ao longo do amadurecimento. Em frutas climatricas, como a banana, o etileno desempenha importante funo no amadurecimento, perodo no qual ocorre intensa produo deste hormnio

concomitantemente com o climatrio respiratrio (PURGATTO et al., 2001; PURGATTO et al., 2002; ROSSETTO et al., 2003), podendo a aplicao exgena de etileno, induzir o amadurecimento (CORDENUNSI, 2004). Paralelamente, observa-se a produo de etileno endgeno, que tende a acompanhar o perfil descrito pela respirao (PURGATTO et al.,

36 2001; PURGATTO et al., 2002; ROSSETTO et al., 2003), enquanto o amido acumulado nas bananas ao longo do seu desenvolvimento, que pode chegar a 20% do peso fresco da fruta, quase totalmente degradado durante o amadurecimento, com subseqente converso em acares solveis, principalmente sacarose (AREAS e LAJOLO, 1981; GARCIA e LAJOLO, 1988). A figura 3 apresenta os resultados obtidos na determinao da liberao de gases CO2 e etileno, na determinao dos teores de amido e acares solveis e atividade e -amiloltica para amostras dos grupos controle e tratadas com 100 ppm de etileno. Com base nos resultados da figura 3, foram escolhidos cinco pontos

representativos de cada grupo, com os quais procedeu-se s determinaes dos perfis de expresso da -amilase e -amilase, atravs das anlises por Western blot, qRT-PCR relativa e real-time RT-PCR. Os pontos escolhidos, os quais esto indicados na figura 3C e tm estreita relao com os valores dos teores de amido, foram: 1, 2, 4, 5 e 7 DPC para amostras do grupo tratado e 3, 9, 14, 16 e 18 DPC para o grupo controle, mais o ponto 0 DPC para ambos os grupos.

37

Figura 3: Perfis metablicos para frutas utilizadas nos trs grupos experimentais. (A) Produo de etileno, (B) respirao (liberao de CO2), (C) degradao de amido, (D) sntese de acares (sacarose, glicose e frutose), (E) atividade -amilsica e (F) atividade -amilsica total de bananas dos grupos ( ) controle e ( ) tratado com 100 ppm de etileno, ao longo do amadurecimento em dias ps-colheita (DPC). Resultados expressos como mdia da triplicata de anlise mais o erro padro da mdia. As setas em C, indicam os pontos escolhidos, de cada grupo, para as anlises por Western blot, qRTPCR relativa e real-time RT-PCR. Os resultados das determinaes de gases (A e B) e carboidratos (C e D), foram gentilmente cedidos pela professora Beatriz Rosana Cordenunsi e fazem parte da sua tese de Livre-Docncia (CORDENUNSI, 2004). Os resultados das determinaes das atividades e -amilsica total em E e F, foram gentilmente cedidos pela doutoranda Janana A. Mainardi.

38 A ao do etileno e sua correlao com o incio do amadurecimento de frutas, descrita na dcada de 60 por Burg e Burg (1962, 1965, 1967), hoje um fenmeno bem estabelecido. Em plantas superiores, o etileno biossintetizado a partir da metionina, em uma via metablica na qual a cido-1-aminociclopropano-1-carboxlico (ACC) sintase e a ACC oxidase, catalisam as reaes da S-adenosilmetionina para ACC e do ACC para etileno (CHANG e BLEECKER, 2004). Contudo, enquanto os mecanismos de ao sobre os diversos processos relacionados ao amadurecimento, ainda no so bem entendidos, a percepo do etileno durante processos de desenvolvimento, germinao de sementes e elongao celular, so objeto de pesquisas correntes em espcies vegetais modelo como Arabidopsis thaliana, na qual se descreve uma famlia de receptores de membrana (CHEN et al., 2005). A aplicao de etileno exgeno, em bananas pr-climatricas, induz a biossntese autocataltica deste hormnio e acentua o perfil dos eventos relacionados ao

amadurecimento (CORDENUNSI, 2004; NASCIMENTO et al., 2006). O pico na liberao CO2 (figura 3B) foi antecipado do dia 15 DPC, nas frutas do grupo controle, para o dia 4 DPC, nas frutas do grupo tratado e a produo de etileno endgeno (figura 3A), teve seu pico adiantado do dia 14 DPC para o segundo dia ps-colheita, mantendo-se em nveis elevados ao longo de todo o tempo necessrio para a degradao do amido. A degradao do amido (figura 3C), em frutas que receberam etileno exgeno, teve incio j nas primeiras horas que se sucederam ao tratamento, enquanto no grupo controle, o fenmeno acentuou-se somente aps o ponto 14 DPC, o mesmo comportamento pde ser observado na produo e acmulo de acares (figura 3D). O teor de amido residual nas frutas controle (4,1%), tambm foi maior que aquele encontrado para frutas tratadas com etileno (1,3%). A rpida degradao do amido e acmulo de acares nas frutas do grupo tratado, apontam para a diminuio do tempo de vida das mesmas, assim, a senescncia ocorre em menos da metade do tempo se comparada a bananas que no receberam o tratamento, de 21 para 9 dias ps-colheita, demonstrando, os efeitos da exposio sobrecarga do hormnio. Este intenso fluxo de carbono, do amido para acares, uma

39 das mudanas mais significativas ocorridas em bananas ao longo do seu

amadurecimento, o qual depende de um eficiente sistema cataltico, justificando o uso da banana como modelo para estudos de enzimas e fatores de regulao do processo de degradao do amido. A escolha da metodologia para ensaiar as atividades de -amilase e -amilase levou em considerao o fato de que os mtodos que empregam substratos cromognicos, como BPNPG7 e PNPG5, para determinao das atividades e amilolticas, constituem boa alternativa quando se tem extratos proticos complexos, como os extratos de bananas, tendo boa especificidade de reao (BASSINELLO et al., 2002). Os ensaios de atividade envolvem a determinao do melhor tempo de incubao, atravs da construo de uma curva de atividade em funo do tempo. Procurando-se acompanhar a cintica de reao ao longo do tempo e sem a necessidade de interrupo pela adio da soluo de Tris-base, foi testado um procedimento no qual os ensaios eram feitos em microplacas de 96 celas e o progresso da reao acompanhado pela leitura da absorbncia em espectrofotmetro do tipo multicanal. No entanto, alguns problemas ocorridos ao longo do experimento levaram a descartar este procedimento. O desenvolvimento de cor pelo p-nitrofenol liberado ao longo da degradao do substrato acentuado em pH alcalino, desta forma, alm de interromper a reao, o Tris-base intensifica a colorao do produto da reao de hidrlise do substrato pelas amilases e no caso da cintica em microplacas, este no poderia ser adicionado, j que a reao seria interrompida. necessria ainda, a determinao da absorbncia de um branco de reao, com adio da soluo de Tris-base antes da adio do substrato ao meio de reao, para eliminar o efeito da presena de p-nitrofenol livre no substrato, assim, uma vez que a leitura das amostras seria feita sem alterao do pH do meio, poder-se-ia obter valores subestimados para as atividades. Como demonstrado pelos resultados da figura 3, as atividades -amiloltica (figura 3E) e -amiloltica (figura 3F) descrevem um perfil inversamente proporcional ao contedo de amido (figura 3C) e diretamente relacionado ao incremento nos teores de

40 acares (figura 3D), como descrito por Nascimento et al. (2006), sugerindo relao direta entre o aumento das atividades amilolticas e a degradao do amido armazenado em bananas.

41

6.2

Expresso heterloga das amilases em modelo procarioto.

Para expresso heterloga foi utilizado o vetor pCR-T7/NT-TOPO, cuja expresso por bactrias E.coli BL21(DE3)pLysS resulta em uma protena que carrega um peptdeo de fuso na poro amino-terminal, o qual, contm uma seqncia de 6 histidinas (6xHis) que possibilita a deteco da protena recombinante com anticorpo monoclonal antipoli-histidina por Western blot ou a sua purificao por cromatografia de afinidade em resina do tipo metal-quelante.

6.2.1

Expresso das ORFs de -amilase e -amilase.

A clonagem, transformao e induo da expresso em sistema piloto com o inserto completo da regio codificadora ou ORF de clones das enzimas -amilase (MAmy; Vieira-Junior et al., 2006; nmero de acesso AF533648) e -amilase (MBmy; Nascimento et al., 2006; nmero de acesso DQ166026), obtidas por PCR do cDNA com pares de primers especficos para extremidades carboxi-terminal e amino-terminal das protenas (figura 4, tabela 1), no resultou na produo das protenas recombinantes (rMAmy e rMBmy) a partir do protocolo padro para expresso. A eficcia do sistema foi testada utilizando uma construo controle (pCRT7/NT-E3), cujo inserto de quinase humana produziu uma protena de aproximadamente 58 kDa (figura 5). Resultado semelhante foi obtido quando se realizou a induo temperatura de 30 C. Como demonstrado na figura 5, a presena da protena recombinante no foi detectada no lisado celular, obtido em condies desnaturantes, ou na frao do meio de cultura (sobrenadante), para bactrias incubadas a 30 C ou 37 C. Da mesma forma, Juge et al. (1996) relatam o insucesso nas tentativas de obteno de expresso da amilase de cevada em E. Coli.

42

Tabela 1: Primers especficos usados nas amplificaes das seqncias de cDNAs das amilases de banana para obteno dos insertos utilizados na expresso heterloga em bactrias. Primers -amilase Nome alfa-S1 alfa-R9 alfa-Nt alfa-Ct Seqncia 5'-gcc gac atY gtS atY aac ca-3' 5'-gtc tgc gca acg atg gtt gat-3' 5'-atg ttt ctg ctt ctg ttt ctt gtc att-3' 5'-tta tct ctt ctc cca cac gca gta gtc-3'

Primers -amilase Nome beta-S1 beta-R2 beta-R4 beta-Nt2 beta-Ct Seqncia 5'-gcc ggc ctt cgc ctc cgc gtc tcc c-3' 5'-agg gta acg gag ctc gcc att tgg-3' 5'-gag acg cgg agg cga agg c-3' 5'-atg gag gaa gcg gtc gat tca-3' 5'-tta tgc tga ctg cag ctc tcg gtc att-3'

Cdigos ambguos IUPAC: N = qualquer base M = A ou C; R = A ou G; W = A ou T; S = C ou G; Y = C ou T; K = G ou T; B = C ou G ou T; D = A ou G ou T; H = A ou C ou T; V = A ou C ou G;

43

alfa-S1 afa-R9

1

alfa-Nt

alfa-Ct1248 pb 951 pb

A

1971

333 pb

beta-Nt2

beta-S1 beta-R4

beta-R2

1

beta-Ct1155 pb

B

1826

309 pb 323 pb 609 pb

1455 pb

Figura 4: Representao esquemtica dos stios de anelamento dos primers conforme descrito na tabela 1. Tamanhos em pares de bases para produtos de PCR esperados nas amplificaes a partir do cDNA de (A) -amilase (AF533648) e (B) -amilase (DQ166026).

44

A205 116 97 66

P

0h

0h-I

2h

2h-I

4h

4h-I

6h

6h-I

B205 116 97 66

P

0h

0h-I

2h

2h-I

4h

4h-I

6h

6h-I

E345

rMAmy

45 29

C94 67 43 30

P

0h

0h-I

2h

2h-I

4h

4h-I

4h* 4h-I*

D

0h

0h-I

2h

2h-I

4h

4h-I

P 94 67

rMAmy

43 30

20

20

Figura 5: SDS-PAGE, aps colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250, das fraes lisado celular ou meio de cultura das expresses piloto das ORFs. (A) lisado celular da cultura para expresso da rMAmy induzida a 37 C, (B) lisado celular do controle positivo de expresso quinase humana (E3) induzida a 37 C, (C) lisado celular da expresso da rMAmy a 30 C e (D) meio de cultura da expresso da rMAmy a 30 C. O padro de pesos moleculares em kDa esta na linha P, os tempos de induo so indicados pelo nmero de horas, a letra I indica que foi adicionado o indutor IPTG, o asterisco denota as amostras no tempo 4h da expresso piloto a 37 C. A regio onde se localiza a protena recombinante esta indicada por uma seta.

6.2.2

Expresso de clones parciais de -amilase e -amilase.

Clones parciais da ORF da -amilase foram obtidos utilizando-se as combinaes de primers alfa-Ct com alfa-S1 (MAmyS1) e alfa-Nt com alfa-R9 (MamyR9), segundo a figura 4A. Ambas construes resultaram na expresso da protena recombinante. A primeira, MAmyS1 (Ala101-Arg416), com 316 aa e peso molecular de ~35 kDa (figura 6A) e a segunda, MAmyR9 (Met1-Asp111), com 111 aa e ~12 kDa (figura 6B). Utilizando-se as combinaes de primers de acordo com a figura 4B, foram obtidas as seguintes construes parciais da ORF da -amilase: MBmyR4 (beta-Nt2 com beta-R4), MBmyR2 (beta-Nt2 com beta-R2), MBmyS1R2 (beta-S1 com beta-R2) e

45 MBmyS1 (beta-S1 com beta-Ct). Apenas a ltima construo resultou na expresso de uma protena recombinante, MBmyS1 (Ala101-Ala484), com 384 aa e peso molecular de ~42 kDa (figura 7). Aps eletroforese e confirmao da expresso das protenas recombinantes em sistema piloto, as mesmas foram purificadas a partir de um volume de cultura de 50 mL utilizando-se cromatografia com resina de afinidade para poli-histidina (ProBond Resin, Invitrogen). Entretanto, no foi possvel a obteno da protena MAmyR9 purificada e aps sucessivas tentativas de purificao. Foi evidenciado que a cultura de bactrias transformadas com a construo plasmidial aparentemente no estava expressando a protena recombinante ou esto passou a express-la em quantidades muito baixas, mantendo ainda a sua viabilidade em meio de cultura contendo antibitico. Uma nova transformao com a construo plasmidial MAmyR9 foi realizada e obteve-se resultado idntico ao primeiro, no sendo obtida protena purificada. Com o objetivo de certificar a presena das protenas MAmyS1 e MBmyS1 e a ausncia de produto de expresso dos clones das ORFs completas de ambas amilases, foi realizado um Western blot com anticorpo monoclonal antipoli-histidina conjugado com fosfatase alcalina (Invitrogen), no qual estes resultados se confirmaram. As solues de MAmyS1 e MBmyS1 foram dialisadas contra tampo PBS para eliminar a uria e corrigir o pH do tampo usado na eluio da protena durante o processo de purificao. Estas protenas recombinantes foram utilizadas para imunizao de coelhos e produo de anti-soro contra e -amilase de banana, conforme discutido no item 6.4.2.

46

AP 205 116 97 66 45 29 0h 0h-I 2h 2h-I 4h 4h-I 6h 6h-I

BP 94 67 43 0h 0h-I 2h 2h-I 4h 4h-I 6h 6h-I

MAmyS1

30 20 14

MAmyR9

Figura 6: (A) SDS-PAGE do precipitado de bactrias da expresso piloto de MAmyS1 a 9,0% de acrilamida e (B) MAmyR9 a 12,0% de acrilamida aps colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250. O padro de pesos moleculares em kDa esta na linha P, os tempos de induo so indicados pelo nmero de horas, a letra I indica que foi adicionado o indutor IPTG. A regio onde se localiza a protena recombinante esta indicada por uma seta.

A94 67 43 30 20 14

P

0h

0h-I

4h

4h-I

0h

0h-I

4h

4h-I

B94 67 43 30

P

0h

0h-I

4h

4h-I

0h

0h-I

4h

4h-I

MBmyS1

20 14

MBmyR2

MBmyR4

MBmyS1

MBmyS1R2

Figura 7: SDS-PAGE a 12% de acrilamida do precipitado de bactrias. Expresso de (A) MBmyR2 e MBmyR4 e (B) MBmyS1 e MBmyS1R2 aps colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250. O padro de pesos moleculares em kDa esta na linha P, os tempos de induo so indicados pelo nmero de horas, a letra I indica que foi adicionado o indutor IPTG. A regio onde se localiza a protena recombinante esta indicada por uma seta.

47

6.3

Expresso heterloga das amilases em modelo eucarioto.

Os produtos obtidos por amplificao em PCR a partir do cDNA de banana e dos primers listados na tabela 2 foram clonados nos vetores pPICZB, pPICZB e pPICZC para transformao de leveduras Pichia pastoris (EasySelect Pichia Expression kit, Invitrogen) a fim de se obter clones capazes de expressar a protena recombinante com atividade enzimtica. Os primers foram delineados de forma a introduzir nas

extremidades 5 e 3 das ORFs das amilases, stios nicos para enzimas de restrio, tornando possvel a ligao do inserto ao vetor de expresso de forma direcional, adequada para manuteno do sentido da traduo nas construes de DNA plasmidial. Durante as amplificaes por PCR, foi utilizada uma mistura de duas enzimas, Taq polimerase e GB-D polimerase (Platinum Taq DNA Polymerase HiFi, Invitrogen), cuja atividade conjunta resulta em produto amplificado com maior fidelidade ao DNA molde.

Tabela 2: Primers especficos usados nas amplificaes das seqncias de e -amilase de banana para clonagem e expresso em leveduras. As regies em negrito ressaltam os stios para enzimas de restrio, necessrios para clonagem nos vetores de expresso e os segmentos sublinhados so as regies homlogas s ORFs, necessrias para o correto pareamento com os cDNAs das enzimas. Primer ZBalfa-NT-Sfu ZBalfa-NT-Pst Alfa-CT-taa-Xba Alfa-CT-Xba-6xHis ZBbeta-NT-Sfu ZCbeta-NT-Cla Beta-CT-taa-Xba Beta-CT-Xba-6xHis seqncia gagagattcgaaacgatgtttctgcttctgtttct gagagagctgcaggacagatactcttccagggctt ctctctctctagaaattatctcttctcccacacgc ctctctctctagaaatctcttctcccacacgcagt gagagattcgaaacgatggaggaagcggtcgattc gagagagcatcgatggaggaagcggtcgattc ctctctctctagaaattatgctgactgcagctctc ctctctctctagaaatgctgactgcagctctcggt Enzima de restrio SfuI PstI XbaI XbaI SfuI ClaI XbaI XbaI

48 6.3.1 Clonagem das ORFs de e -amilase para expresso heterloga.

Com os primers listados na tabela 2, foram desenhadas as construes de DNA plasmidial montadas de acordo com as combinaes da tabela 3. Pretendeu-se assim, obter clones que expressassem a protena recombinante na forma intracelular ou secretria, existindo ainda a possibilidade de haver na poro carboxi-terminal, um peptdeo de fuso contendo 6 resduos de histidina seqenciais (6xHis), modificao til para posterior purificao por cromatografia em resina de afinidade do tipo metalquelante. O sistema de expresso escolhido faz uso de uma levedura metilotrfica, Pichia pastoris, capaz de utilizar metanol como fonte de carbono. O primeiro passo na metabolizao do metanol a sua oxidao a formaldedo, usando oxignio pela enzima lcool oxidase, a qual, por ter baixa afinidade por O2, produzida em grandes quantidades pela levedura. O promotor que regula a produo da enzima lcool oxidase (AOX1) e que responde de maneira altamente eficiente natureza da fonte de carbono, utilizado para promover a expresso heterloga na levedura (CREGG et al., 1985; ELLIS et al., 1985; CEREGHINO e CREGG, 2000). Os produtos de PCR a partir do cDNA de banana com as combinaes primers listados na tabela 3, foram purificados a partir do gel de agarose (figura 8), submetidos digesto por um perodo de 6h com cada uma das enzimas de restrio conforme a tabela 2 e ento, clonados em trs diferentes vetores, previamente linearizados por dupla digesto com o mesmo conjunto de enzimas de restrio do inserto e com suas extremidades 5 desfosforiladas, procurando desta forma, manter a coesividade das extremidades e a orientao das seqncias de DNA clonadas. Obtiveram-se 8 construes de DNA plasmidial, sendo 4 plasmdios para amilase e 4 para -amilase, os quais, foram linearizados com a enzima de restrio PmeI (digesto por 8h) para subseqente transformao de leveduras Pichia pastoris GS115 tornadas quimicamente competentes pelo mtodo Pichia EasyComp (Invitrogen).

49 Tabela 3: Construes de DNA plasmidial para -amilase e para -amilase. Enzima: -amilaseConstruo MAmy1 MAmy2 MAmy3 MAmy4 Primer sentido ZBalfa-NT-Sfu ZBalfa-NT-Sfu ZBalfa-NT-Pst ZBalfa-NT-Pst Primer reverso alfa-CT-taa-Xba alfa-CT-Xba-6xHis alfa-CT-taa-Xba alfa-CT-Xba-6xHis vetor pPICZB pPICZB pPICZB pPICZB Tipo de expresso intracelular intracelular extracelular extracelular Modificao carboxi-terminal Cdon terminal Poli-histidina Cdon terminal Poli-histidina

Enzima: -amilaseConstruo MBmy1 MBmy2 MBmy3 MBmy4 Primer sentido ZBbeta-NT-Sfu ZBbeta-NT-Sfu ZCbeta-NT-Cla ZCbeta-NT-Cla Primer reverso beta-CT-taa-Xba beta-CT-Xba-6xHis beta-CT-taa-Xba beta-CT-Xba-6xHis vetor pPICZB pPICZB pPICZC pPICZC Tipo de expresso intracelular intracelular extracelular extracelular Modificao carboxi-terminal Cdon terminal Poli-histidina Cdon terminal Poli-histidina

1

2

3

4

1

2

3

4

P2000 1500 1000 750 500 300 150

Figura 8: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para amilases. 1 a 4 se referem aos insertos das construes MAmy1 a MAmy4 para -amilase e 1 a 4 se referem aos insertos das construes MBmy1 a MBmy4 para -amilase, listadas na tabela 3. P indica padro de pesos moleculares PCR marker (Sigma).

50 Foram utilizados 3 g de cada construo linearizada para transformao de alquotas de 50 L de leveduras quimicamente competentes. Como controle positivo de transformao e negativo de expresso foram utilizados os trs vetores (pPICZB, pPICZB e pPICZC) linearizados e sob as mesmas condies de manipulao que as construes obtidas. A utilizao da construo de DNA plasmidial na forma linear procurou estimular a integrao por recombinao homloga entre as regies

flanqueadoras 5 e 3 do gene AOX1 do genoma da levedura e de cada construo utilizada (CREGG et al., 1985; ELLIS et al., 1985; CEREGHINO e CREGG, 2000). Aps a transformao, as culturas de leveduras foram plaqueadas em meio YPDS contendo 100 g/mL de zeocina e incubadas em estufa a 28-30 C por 3 a 4 dias. Obteve-se um nmero variado de colnias para cada transformao, exceto para as construes MAmy2 e MBmy2, que no apresentaram colnias. A integrao das construes e dos vetores foi testada por PCR das colnias utilizando primers flanqueadores das regies 5 e 3 do gene AOX1 (BURDYCHOVA et al., 2002; ASCACIOMARTINEZ e BARRERA-SALDANA, 2004).

6.3.2

Expresso da protena recombinante e ensaio enzimtico.

Duas colnias de leveduras transformantes, selecionadas de placas YPDS/Zeocina e cuja presena do inserto pde ser confirmada por PCR, foram utilizadas para proceder induo da expresso da protena recombinante e seleo de clones transformantes para ensaio funcional da atividade enzimtica. Estas foram inoculadas em meio BMGY e incubadas em banho a 30 C por 18h sob agitao constante. A biomassa de leveduras foi coletada por centrifugao a 2000 x g por 5min e ressuspendida em um volume de 25 mL do meio de induo da expresso BMMY. As culturas foram incubadas em banho a 30 C sob agitao constante e amostras foram coletadas periodicamente durante 4 dias a intervalos de 6-12h a fim de avaliar o nvel de expresso e o tempo necessrio para obteno de quantidade satisfatria de protena. De

51 posse das alquotas coletadas em cada ponto, procedeu-se ao seu fracionamento, por centrifugao, nas pores precipitado celular e meio de cultura, para posterior identificao da expresso intracelular ou secretria por SDS-PAGE e Western blot com soros anti-amilase de banana. Foram identificados dois clones com reatividade aos soros anti-amilase, MAmy1-2, transformado com a construo MAmy1 e MBmy4-2, transformado com MBmy4 (figura 9). Estes clones foram reinoculados em meio BMGY a fim de produzir a biomassa de leveduras necessria para o ensaio funcional da atividade amilsica. Foram utilizados 60 mL de meio BMMY, aos quais foram adicionados a cada 24h, 250 L de metanol, durante trs dias. Foram utilizados como controle negativo de expresso os clones transformados com os respectivos vetores de cada construo, pPICZB para MAmy1-2 e pPICZC para MBmy4-2.

A

1P

3P

5P

7P

RW

1M

3M

5M

7M

B250 150 110 90

1P

3P

5P

7P

RW

1M

3M

5M

7M

60

Figura 9: Western blotting contra clones de amilases de banana em Pichia pastoris com soros (A) anti-MAmyS1 e (B) anti-MBmyS1. Os nmeros 1, 3, 5 e 7 indicam os pontos de amostragem em 6, 25, 52 e 91h de induo; P corresponde frao do precipitado celular, M ao meio de cultura e RW ao padro de pesos moleculares em kDa, a seta indica a posio esperada para a banda de protena reativa ao antisoro.

Cada cultura foi fracionada, por centrifugao, nas pores precipitado celular e meio de cultura. A partir do precipitado foi preparado um lisado celular, segundo recomendaes do fabricante, que deveria conter a protena expressa na forma intracelular enquanto que a expresso secretria deveria ser identificada no meio de cultura. No caso especfico da construo MAmy1-2, o inserto clonado corresponde ORF completa da enzima -amilase descrita por Vieira-Junior (2001), sendo assim, ele

52 carrega um provvel peptdeo de trnsito, que, se processado eficientemente pela levedura, deveria promover a exportao da protena recombinante para fora da clula. A poro do meio de cultura foi submetida precipitao fracionada com sulfato de amnio (DAWSON, 1995) em trs faixas de concentrao do sal, 1: 0 a 30%, 2: 30 a 70% e 3: 70 a 100%. Cada um dos trs precipitados foi retomado em tampo Hepes-NaOH (20 mM, pH 7,0) contendo 10 mM de cistena, 1mM de CaCl2 e 1mM de benzamidina e colocados para dialisar contra o mesmo tampo. As fraes do lisado celular e precipitados do meio de cultura foram utilizadas para ensaiar a atividade em gel por PAGE-substrato (figura 10).

ALC1 30 70 100 Z1 Z2 Z30 Z70 Z100

BLC1 30 70 100 Z1 Z2 Z30 Z70 Z100

Figura 10: Ensaio da atividade enzimtica de clones de e -amilase de banana em Pichia pastoris. Atividade amiloltica em gel (indicada pelas setas) dos clones (A) MAmy1-2 e (B) MBmy4-2. LC corresponde ao lisado celular, 30, 70 e 100 so as faixas de concentrao de sulfato de amnio e Z indica o controle negativo de expresso.

O clone MAmy1-2 apresentou boa atividade amiloltica, quando comparada quela verificada para o clone MBmy4-2, a qual foi bastante superior a atividade amiloltica endgena da levedura, conforme a figura 10. Nota-se ainda que, houve atividade tambm nas fraes do precipitado do meio de cultura, principalmente na faixa de 30 a 70% de saturao em sulfato de amnio. Tal atividade pode ser atribuda enzima presente no meio extracelular devido ao processamento ps-traduo das amilases. Este resultado, confirma a hiptese da presena de um peptdeo de trnsito no clone de amilase de banana descrito por Vieira-Junior (2001), verificada apenas atravs de ferramentas e modelos de bioinformtica. Como exposto anteriormente, o clone MBmy4-

53 2 apresentou maior atividade amiloltica, que se deveu principalmente protena recombinante expressa de forma intracelular. A insero da ORF da -amilase em tandem com a seqncia sinal fator-, um eficiente peptdeo de transito nativo do Saccharomyces cerevisiae, levou o produto da expresso da construo a ser exportado em boa quantidade, o que, concorda com o perfil de expresso esperado para o clone MAmy1-2 e portanto, pode ser atribudo s condies de cultivo da levedura e induo da expresso. O conjunto dos resultados de expresso dos clones MAmy1-2 e MBmy4-2, confirma a identidade das seqncias clonadas como enzimas amilolticas, uma vez que a intensa hidrlise da amilopectina vista nas culturas transformadas com as construes MAmy1 e MBmy4, mas no nas culturas transformadas com os respectivos vectores, pPICZB e pPICZC. O correto processamento da rMAmy pela P. pastoris indica que esta pode ser direcionada para o meio extracelular ou para plastdeos em clulas da polpa de banana. Como observado por Chen et al. (2004), a -amilase do arroz pode ser direcionada para o meio extracelular ou para plastdeos, dependendo da situao fisiolgica, pela presena de um peptdeo sinal bi-funcional; o mesmo poderia ocorrer na banana. Conforme discutido por Vieira-Junior et al. (2006), uma -amilase extracelular indicaria que a enzima e o substrato esto em clulas diferentes, assim, o acesso ao substrato dependeria da descompartimentalizao do amido, como no existem evidncias a respeito da perda de integridade pelas clulas da polpa de banana ao longo do amadurecimento, provvel que, o peptdeo sinal direcione a -amilase para o amiloplasto.

54

6.4

Western blot com soros anti-amilases de banana.

6.4.1

Extrao de protenas totais da polpa de banana.

Foram feitas diversas tentativas de extrao das protenas totais de bananas na proporo de 0,5 g de polpa para 1,0 mL de tampo de extrao (1:2), sempre com geleificao nas amostras verdes devido ao seu alto contedo de amido e presena de pectina. Tentou-se variar a proporo para 1:4, no entanto, o mesmo comportamento ainda foi observado. Um procedimento alternativo, invertendo-se a ordem das etapas de aquecimento e centrifugao, resultou na alterao do perfil de protenas quando separadas por SDS-PAGE, fato que se deve no extrao de protenas aderidas aos grnulos de amido bem como daquelas constituintes de membranas (figura 11), denotando as dificuldades relativas extrao de protenas de polpas de frutas, comentadas recentemente por Carpentier et al. (2005), que descreve a extrao de protenas a partir de tecidos recalcitrantes, como a banana. Assim sendo, optou-se pela utilizao da proporo entre polpa e tampo na razo de 1:4.

A

3

9

12

14 15 16 18

P

0

1

2

3

4

5

7

B

3

9

12 14

15 16 18

P

0

1

2

3

4

5

7 94 67

94 67

43 30 20

43 30 20

Figura 11: SDS-PAGE a 8,0% de acrilamida dos extratos totais de protenas de bananas aps colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250. Extrato de amostras fervidas aps centrifugao a 3000 x g (A). Extrato de amostras fervidas antes da centrifugao a 3000 x g (B). O padro de pesos moleculares em kDa est na linha P. Os nmeros de 3 a 18, no lado esquerdo de cada figura, se referem aos dias pscolheita das amostras controle e os nmeros de 0 a 7, no lado direito, das amostras tratadas com etileno.

55 6.4.2 Western blot com soro anti-MAmyS1 e anti-MBmyS1.

A fim de descrever o comportamento da e -amilase,

ao longo do

amadurecimento da banana, foram produzidos e ensaiados os soros obtidos pela imunizao de coelhos com as protenas recombinantes MAmyS1 e MBmyS1, obtidas pela expresso de clones parciais de -amilase e -amilase de banana, descrita no item 6.2.2., contra extratos de protenas de polpa de bananas dos grupos controle e submetido a tratamento com etileno, em vrios estgios de amadurecimento, de acordo com os perfis de atividade enzimtica, carboidratos, liberao de CO2 e etileno relacionados na figura 3. A reatividade do antisoro s protenas recombinantes foi boa, diluies da ordem de 1:2000 produziram bandas intensas contra quantidades reduzidas protena, cerca de 10 ng. Por outro lado, houve divergncia entre os resultados nos ensaios com as protenas recombinantes ou com o extrato total de protenas de banana, no sendo verificada, neste ltimo caso, a mesma reatividade para aos antisoros. Pode-se supor, que tal fato deveu-se ao antgeno utilizado nas imunizaes dos coelhos. Durante a purificao da protena recombinante utilizando-se cromatografia de afinidade para polihistidina (ProBond Resin; Invitrogen), foram empregadas solues contendo altas concentraes de cloreto de guanidina (6 M) e uria (8 M). Neste meio, as protenas podem vir a sofrer modificaes qumicas, resultando em alteraes na conformao ou caractersticas moleculares dos resduos de aminocidos. Desta forma, os anticorpos reconhecem bem as protenas recombinantes, j que so os antgenos que lhes deram origem, enquanto as protenas da banana teriam baixa antigenicidade. Trabalhos anteriores, que obtiveram bons resultados no ttulo dos soros contra protenas de banana, utilizaram como antgenos para imunizao de coelhos amostras obtidas a partir de gis nativos com extratos purificados de protenas da prpria banana (NASCIMENTO et al., 1997; MOTA et al., 2002). Tentou-se ainda, fracionar o antisoro com base no mtodo descrito por Mckinney e Parkinson (1987), no qual a poro IgG das protenas do soro sangneo precipitada

56 e ressuspendida em tampo para minimizar a interferncia de outras protenas constituintes do sangue dos coelhos, porm isto no resultou em melhora nos ensaios de Western blot. Visando contornar os problemas descritos, foram feitas novas imunizaes, utilizando-se para tal, outros animais e protenas recombinantes separadas por SDSPAGE unicamente, tentando assim, minimizar as etapas de manipulao do antgeno. Conforme apresentado na figura 12, os extratos totais de E. coli foram separados por eletroforese e corados. A regio correspondente s protenas recombinantes MAmyS1 e MBmyS1 foi recortada, homogeneizada com adjuvante de Freund e utilizada para imunizao de coelhos. A partir da primeira dose de reforo com os antgenos, foram coletadas amostras do soro dos coelhos, estes foram utilizados em Western blot para avaliar sua reatividade. A reatividade do soro anti-MAmyS1, obtido com a imunizao de coelhos utilizadose a protena MAmyS1 purificada a partir do SDS-PAGE, no permitiu identificar a presena da protena em qualquer um dos extratos. Neste caso, os resultados foram de qualidade inferior se comparados aos obtidos com o soro do coelho imunizado com a protena recombinante purificada por cromatografia de afinidade (figura 13A). Este resultado sugere a hiptese de que os fragmentos da protena no foram suficientemente antignicos para a produo do antisoro. O soro anti-MBmyS1 apresentou boa reatividade (figura 13B), reconhecendo bandas distintas atribudas reao especfica com a enzima -amilase, a reao foi mais intensa nas protenas da banana comercial, que pode ser atribuda s diferenas no manuseio da cultura e ps-colheita. Houve reao tambm nas protenas do amido de banana, indicando a presena da -amilase no grnulo, este foi extrado da polpa de frutas verdes e se comparada com a reao das amostras 0 e 1, pode-se supor que, pelo menos na fruta verde, ela se deve s protenas aderidas ao grnulo.

57 A B

Figura 12: SDS-PAGE a 7,5% de acrilamida do precipitado de bactrias. (A) Induo da expresso da MBmyS1 com IPTG 0,8 mM e incubao a 37C por 5h, aps colorao com Coomassie Brilliant Blue R-250. (B) Gel aps exciso da faixa correspondente protena super-expressa. A mesma abordagem foi usada para obteno da protena MAmyS1.

A0 1 2 3 4 5 7 RW

B0 1 2 3 4 5 7 RW250 150 110 90 60

44 34

Figura 13: Western blotting com soros (A) anti-MAmyS1 e (B) anti-MBmyS1. Foram utilizados ~50 g de protenas totais de polpa de bananas e do amido isolado da polpa de banana verde e diluies do antisoro a 1:100. 1 a 7: bananas tratadas com 100ppm de etileno; AM: amido de banana; BN: banana madura obtida em mercado; RW: padro de pesos moleculares RAINBOW em kDa.

Como o sistema de expresso utilizado no permitiu a obteno de produtos a partir dos clones completos das amilases, poder-se-iam utilizar outros vetores e outras cepas de bactrias ou ainda o produto da expresso em leveduras. Neste ltimo caso, vale ressaltar que a quantidade de protena que se obtm vrias vezes menor quando comparada com a expresso em bactrias e que leveduras produzem protenas recombinantes altamente glicosiladas, de forma que, o uso da expresso em levedura poderia acrescentar novas dificuldades para a produo dos antisoros. Houve tambm diferenas nos resultados obtidos com membranas de

nitrocelulose de diferentes fornecedores (Hybond-C extra e Hybond ECL, Amersham Biosciences; Trans-Blot Transfer Medium, Bio-Rad) e quando submetidas

58 etetrotransferncia por 15h a 30 V ou 1h a 100 V, sendo que estas diferenas estavam relacionadas intensidade das bandas e presena de manchas na superfcie da membrana aps revelao com substrato cromognico ou quimioluminescente, porm no foi possvel estabelecer quais as melhores condies de ensaio para maximizar a intensidade da deteco das protenas. O soro anti-MAmyS1 foi ensaiado contra cerca de 100 g de extrato protico total de polpa de bananas, amostradas em vrios estgios do amadurecimento sob condies controle e no tratamento com etileno. Foi utilizado o anticorpo secundrio conjugado conjugado com HRP na diluio 1:8.000. Os resultados obtidos aps incubao com substrato quimioluminescente ECL (Amersham) podem ser vistos na figura 14, demonstrando a reao do antisoro com uma nica faixa de protenas de

aproximadamente 45 kDa. Nas amostras controle (figura 14A), a quantidade de protena reativa ao antisoro decresceu aps o ponto 9 DPC, sendo este, o ponto com maior intensidade na reao ao longo do amadurecimento da banana. Os resultados obtidos com 100 g de protenas das amostras do grupo tratado com etileno (figura 14B) reproduzem o observado na figura 13A, no sendo observada a reao com qualquer protena. Os ensaios com o soro anti-MBmyS1 foram realizados contra cerca de 50 g de extrato protico, sendo utilizadas amostras de polpa de frutas tratadas e controle. Para o Western blot com amostras tratadas com etileno (figura 14E) foi utilizado anticorpo secundrio conjugado com AP na diluio 1:30.000, este foi revelado por incubao com substrato cromognico Lumi-Phos (Pierce); para as amostras controle (figura 14D) as condies de incubao e revelao foram iguais s descritas para a -amilase. A r