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Resumo Geral

A genética da conservação é uma nova abordagem no estudo da biodiversidade e utiliza as

análises genéticas moleculares para elucidar aspectos relevantes da biologia das espécies para

fins de manejo e conservação. Neste trabalho, foi avaliada a diversidade genética, utilizando

marcadores RAPD e STR, de duas espécies de canídeos que ocorrem no Parque Nacional das

Emas – GO (PNE), o lobo-guará(Chrysocyon brachyurus) e o cachorro-do-mato(Cerdocyon

thous). O lobo-guará está classificado pela IUCN (2004) como espécie LR/nt, ou seja, com

pequeno risco de extinção, mas próximo a ser considerado vulnerável à extinção, além de estar

incluído na lista de espécies brasileiras ameaçadas de extinção do IBAMA. Enquanto que, o

cachorro-do-mato é o canídeo mais comum e com maior distribuição no Brasil. Os resultados

deste estudo foram divididos em quatro capítulos. O capítulo 1, mostrou um grande potencial de

transferibilidade de marcadores STR entre espécies evolutivamente mais próximas. No capítulo 2,

os resultados obtidos com os marcadores STR e RAPD não indicaram uma significativa redução

da variabilidade genética e nem uma endogamia elevada em ambas espécies. No capítulo 3, a

associação entre a similaridade genética e a similaridade espacial para a população de lobo-guará

mostrou uma estruturação espacial da similaridade genética apenas para os machos, a partir dos

dados RAPD. Enquanto que, os dados gerados pelos marcadores STR mostraram uma

estruturação espacial da similaridade genética de acordo com o padrão de filopatria feminina.

Finalmente, no capítulo 4 a avaliação do tempo de extinção nestas duas espécies, considerando

diferentes cenários sócio-econômico-ambiental da região sudoeste de Goiás, no qual o PNE está

inserido, mostrou que ambas populações podem persistir por um tempo razoável, mesmo quando

considerado o pior cenário. No entanto, sugere-se que estudos posteriores baseados em

parâmetros mais realistas da viabilidade destas populações, bem como do cenário de

desenvolvimento sócio-econômico-ambiental da região, sejam realizados, afim de se obter

avaliações mais precisas da persistência destas populações no PNE e entorno.

Palavras-chave: Genética da Conservação, lobo-guará, Cachorro-do-mato, Parque Nacional das

Emas, Cerrado.

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Abstract

Conservation Genetics is a new approach concerning biodiversity studies. It uses

molecular genetic analysis to uncover relevant biological aspects of the species for its

management and conservation. This paper evaluated the genetic diversity using RAPD and STR

markers, of two canid species from Ema’s National Park (Parque Nacional das Emas – GO),

Maned wolf (Chrysocyon brachyurus) and Crab-eating fox (Cerdocyon thous). The maned wolf

was classified as an LR/nt species by IUCN (2004); this means that it has a lower probability of

extinction, although susceptible to it. As a matter of fact the Maned wolf is in IBAMA’s list of

Brazilian species that are threatened by extinction. The Crab-eating fox is the most common

canid with the widest distribution in Brazil. The results of this study were divided in 4 chapters.

Chapter one, showed big transferability potential of STR markers among evolutionary related

species. Chapter 2, showed that most results obtained with STR and RAPD markers didn’t

indicate reduction on the genetic variability neither high endogamy in either species. Chapter 3,

the association between genetic and territorial similarities for the Maned wolf population, was

present only among males by the usage of RAPD data. The data generated by STR markers

showed a special structure according to the female philopatry. Chapter 4, analyzed the extinction

time of both species considering different social-economic-environmental sceneries of the

southwest region Goiás where the ENP is located. The results showed that both species could

resist for a reasonable time even if the worst scenery is considered. New studies using more

realistic parameters should be considered to test the viability of these populations. The social

economic environmental development of the region should be studied also, so that a more precise

evaluation of the persistence of these populations at ENP and region are made.

Key words: Conservation Genetics, Crab-eating fox, Maned wolf, Ema’s National Park, Tropical

Savanna (Cerrado).

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APRESENTAÇÃO

A genética da conservação é uma nova abordagem no estudo da biodiversidade e utiliza as

análises genéticas moleculares para elucidar aspectos relevantes da biologia das espécies para

fins de manejo e conservação (Frankham et al., 2002). Dentre os vários campos da genética da

conservação podemos destacar a detecção dos efeitos deletérios do endocruzamento (depressão

endogâmica), a perda da diversidade genética e conseqüentemente da capacidade de respostas a

mudanças ambientais, a fragmentação das populações e redução do fluxo gênico, processos

estocásticos como a deriva genética, o acumulo de mutações deletérias, problemas enfrentados

pelas populações em cativeiro, sucesso da introdução de novos indivíduos nas populações

naturais, a resolução de incertezas taxonômicas, uso das análises genéticas moleculares na área

forense e definição de unidades de manejo (Frankham et al., 2002; Hedrick, 2001; DeSalle e

Amato, 2004).

Myers et al. (2000) definiu Hotspots como, “ecossistemas que cobrem uma pequena

parcela da superfície da Terra, mas que abrigam uma alta porcentagem da biodiversidade global,

com ênfase às florestas tropicais”. O Cerrado é um dos hotspots e o segundo maior bioma

brasileiro em extensão, ocupando 21% do território brasileiro (Klink e Machado, 2005; Myers et

al., 2000). O Cerrado atualmente é o bioma brasileiro que mais tem sofrido com as pressões

antrópicas impostas pelo avanço das fronteiras agropecuárias (Klink e Moreira, 2002). As

principais ameaças à biodiversidade no Cerrado são fragmentação de habitats, invasões de

espécies exóticas, erosão dos solos, poluição de aqüíferos, alterações nos regimes de queimadas,

desequilíbrios no ciclo do carbono e possivelmente modificações climáticas regionais (Klink e

Machado, 2005).

No Cerrado brasileiro ocorrem 38 espécies de mamíferos de médio e grande porte, sendo

que destes 45% estão classificadas na ordem Carnivora (Marinho-Fillho et al. 2002). A maioria

das espécies da ordem Carnivora possui grandes áreas de vida, de forma que a fragmentação do

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habitat tem reduzido suas populações a tamanhos que não são viáveis a médio e longo prazo

(Costa et al., 2005). Uma outra ameaça comum aos carnívoros é a mortalidade acidental por

colisão com veículos nas estradas que atravessam o Cerrado do Brasil Central, principalmente em

espécies que percorrem grandes distâncias, como o lobo-guará (Rodrigues et al., 2002). Os

carnívoros representam espécies chaves para os ecossistemas, pois ocupam diversos nichos

disponíveis no ambiente sendo reguladores de populações de presas animais e importantes

dispersores de sementes, e destes uma grande proporção é ameaçada (28%) (IBAMA, 2003;

Costa et al., 2005).

A IUCN (União Internacional para Conservação da Natureza) reconhece a necessidade de

se conservar a diversidade genética devido a dois motivos principais. Primeiro, porque as

mudanças ambientais são processos contínuos e a diversidade genética é importante para que a

população tenha a capacidade de se adaptar a estas mudanças. Segundo, porque a perda da

diversidade genética geralmente está associada com o endocruzamento e com a redução nas taxas

de reprodução e sobrevivência (fitness) (Frankham et al., 2002). No entanto, a falta de

informações genéticas para a maioria das espécies nativas constitui uma das limitações para as

ações conservacionistas e de manejo.

Neste trabalho foi avaliada a diversidade genética de duas espécies de mamíferos

carnívoros (ordem Carnívora) da família Canidae que ocorrem no Parque Nacional das Emas –

GO (PNE), o lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) e o cachorro-do-mato(Cerdocyon thous). O

PNE possui uma alta riqueza de espécies e uma boa preservação dos habitats, que pode permitir a

manutenção de populações estáveis de muitas destas espécies. No entanto, a eliminação de

habitats naturais, a interrupção de corredores naturais de dispersão, incêndios, caça ilegal,

atropelamento dos animais e assoreamento de cursos d’água que atingem a sua fauna ameaçam a

sua conservação (Silveira e Jácomo, 1998).

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O lobo-guará(Chrysocyon brachyurus) é o maior canídeo sul americano, e quando adulto

pode pesar cerca de 25 kg e medir 90 cm de altura nos ombros, com comprimento total entre 145

a 190 cm, sendo a cauda responsável por 45 cm (Eisenberg e Redford, 1999; Rodden et al., 2004).

Vivem em áreas de vegetação aberta, são territoriais, monógamos facultativos e onívoros.

Apresenta um número diplóide de 76 cromossomos e é uma das espécies de carnívoros mais

populares do cerrado brasileiro. Tem orelhas largas e eretas, membros alongados e caminhar

peculiar. Até os três meses apresenta pelo marrom-escuro quase negro, mas após essa idade sua

pelagem muda para castanho-avermelhado, pernas e dorso torna-se pretos, coloração negra

também na extremidade das patas e no focinho e a ponta da cauda permanece esbranquiçada

(Fletchall et al., 2000) (Figura 1).

Figura 1. lobo-guará(Chrysocyon brachyurus) no Parque Nacional das Emas – GO.

A espécie é onívora, abrangendo uma grande variedade de itens na sua dieta, que varia

sazonalmente. Dentre esses itens, a lobeira ou fruta-do-lobo (Solanum lycocarpum) é bastante

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consumida por este canídeo (Rodden et al., 2004). Além de comer outros tipos de frutos, o

animal se alimenta ainda de pequenos mamíferos (roedores, tatus), ovos de aves, insetos e répteis

(Rodden et al., 2004; Motta-Junior et al., 1996, 2002; Juarez e Marinho-Filho, 2002)

A área de ocorrência original desta espécie compreende a região central do Brasil, o

Paraguai, Bolívia, nordeste da Argentina e Uruguai, sempre em regiões de vegetação aberta,

como campos e Cerrados (Figura 2). São animais territorialistas e ocupam grandes áreas de vida,

variando entre 25 e 115 km² (Rodden et al., 2004).

Figura 2. Área de distribuição do Lobo-gurá. (Fonte: Rodden et al., 2004)

Os Lobos Guará são animais solitários, que formam pares no período de acasalamento. O

número de filhotes varia tipicamente de 1 a 5, sendo cuidados geralmente pela mãe, com um

período de gestação em torno de 65 dias (Rodden et al., 2004; Eisenberg e Redford, 1999). São

animais territorialistas, que ocupam grandes áreas de vida, variando entre 25 a 115 km2 e utilizam

diversos recursos, como fezes, urina e uma vocalização característica para demarcar seu território

diante de outros indivíduos da mesma espécie (Silveira e Jácomo, 1998). Suas populações têm

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sofrido um considerável declínio, principalmente devido à perda de habitat, como conseqüência

do avanço das fronteiras agrícolas (Rodden et al., 2004; Fonseca et al., 1994; Silveira e Jácomo,

1998). É classificada pela IUCN (2004) como espécie LR/nt, ou seja, com pequeno risco de

extinção, mas próximo a ser considerado vulnerável à extinção. A espécie também está incluída

na lista de espécies brasileiras ameaçadas de extinção do IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio

Ambiente e Recursos Naturais Renováveis (IBAMA, 2003).

O cachorro-do-mato(Cerdocyon thous), vulgarmente também conhecido como ‘raposa’ ou

‘graxaim’, é um canídeo de porte médio e seu peso varia entre 5 e 7 kg, com 70 cm de

comprimento na idade adulta e apresenta um número diplóide de 74 cromossomos. Tem a cauda

peluda de cor escura, seu focinho é comprido, apresenta uma cabeça relativamente pequena. Há

uma grande variação de cor da pelagem, de marrom acinzentado ao cinza escuro e alguns a

apresentam áspera e grossa por todo o corpo, as patas podem ser pretas ou cinza escuro, algumas

vezes apresenta manchas amarelo-laranjada (Courtenay e Mafei, 2004) (Figura 3).

Figura 3. cachorro-do-mato(Cerdocyon thous) no Parque Nacional das Emas – GO.

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Tem hábito preferencialmente noturno e desloca-se solitariamente, aos pares ou mesmo

em grupos maiores (Rocha et al., 2004). É onívoro e é o canídeo mais comum e com maior

distribuição no Brasil, exceto nas áreas baixas da bacia amazônica (Courtenay e Maffei, 2004;

Rocha et al., 2004). Tem uma ampla distribuição geográfica, habita áreas florestais, cerrados,

campos e áreas alteradas e habitadas pelo homem. Ocorre também da Colômbia ao Paraguai e

Uruguai (Figura 4). Está amplamente distribuído no Pantanal, tanto na planície quanto na área de

entorno, na bacia do Alto Paraguai (Courtenay e Maffei, 2004). Podem ser observados nas

margens de estradas, onde procuram restos de animais atropelados e, por isso, são também

vítimas de atropelamentos (Rocha et al., 2004)

Figura 4. Área de distribuição do cachorro-do-mato(Fonte: Courtenay e Maffei, 2004)

Sua dieta inclui insetos, pequenos mamíferos, frutos, plantas, répteis, anfíbios, aves, ovos

e, em regiões litorâneas e no Pantanal, os caranguejos (Juarez and Marinho-Filho, 2002). O

acasalamento ocorre nos meses de Novembro e Dezembro e a gestação é de 52 a 59 dias, onde

nascem de 3 a 6 filhotes, com 120-160 gramas cada (Courtenay e Maffei, 2004, Rocha et al.,

2004). Apesar de ser uma espécie classificada pela IUCN (2004) como espécie LR/lc, ou seja,

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com pequeno risco de extinção e não dependente de esforços para sua conservação, merece ser

estudada antes que entre na lista de espécies ameaçadas. Os estudos com estas espécies podem

ser importantes, pois elas podem funcionar como espécies-chave no monitoramento do nível de

degradação dos habitats que elas ocupam.

Assim sendo, neste estudo analisamos a diversidade genética, utilizando marcadores

moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e Microssatélites, ou STR (Short

Tandem Repeats), nestas duas espécies de canídeos. No Capítulo 1, foi testada a transferibilidade

de 29 marcadores STR, desenvolvidos originalmente para bovinos, búfalos, cachorro doméstico e

gato doméstico para amostras de lobo-guará e Cachorro-do-mato. Essa avaliação inicial permitiu

definir a metodologia básica utilizada nas análises genéticas apresentadas nos Capítulos 2 e 3. Do

total de locos testados, 21% foram transferidos com sucesso e observamos então um grande

potencial de transferibilidade, principalmente entre espécies evolutivamente mais próximas (i.e.

cachorro doméstico).

No Capítulo 2, foi estimada a diversidade genética nestes dois canídeos, utilizando

marcadores RAPD e STR, além de correlacionarmos os dados gerados por estes dois marcadores.

Os resultados obtidos não indicaram uma significativa redução na variabilidade genética e nem

uma endogamia elevada em nenhuma das espécies analisadas. Em relação à associação dos dois

marcadores, as baixas correlações encontradas são corroboradas por outros estudos e devem ser

explicadas pela base genética diferente entre estes, bem como pelo baixo nível da hierarquia

evolutiva analisada (i.e., variabilidade dentro de populações).

No Capítulo 3, foi analisada a associação entre a similaridade genética, baseada nos dados

gerados pelos marcadores RAPD e STR, e a similaridade espacial baseada em dados da área de

vida do lobo-guará no Parque Nacional das Emas e entorno. Os resultados obtidos com os dados

RAPD mostraram uma estruturação espacial da similaridade genética significativa apenas para os

machos. Os resultados obtidos com os marcadores STR mostraram uma estruturação espacial da

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similaridade genética de acordo com o padrão de filopatria feminina, ou seja, as fêmeas mais

próximas geneticamente tendem a ocupar áreas de vida mais próximas. Como os resultados

obtidos com os marcadores STR são mais esperados, considerando as informações disponíveis

sobre ecologia e história-de-vida da espécie, e os marcadores STR são mais adequados para esse

tipo de análise intra-populacional, acredita-se que os resultados obtidos com os marcadores

RAPD sejam artefatos.

Finalmente, no Capítulo 4 avaliou-se o tempo de extinção nestas duas espécies de

canídeos do PNE, assumindo-se que combinações de efeitos da depressão endogâmica sob

estocasticidade ambiental seriam os possíveis fatores que levariam à extinção organismos em

populações isoladas. Em média, o tempo de extinção foi afetado pelos três parâmetros analisados

e suas interações (taxas de redução da capacidade de suporte, coeficientes de endogamia e

flutuação no tamanho da população). Os cenários foram discutidos em relação à realidade sócio-

econômico-ambiental da região sudoeste do Estado de Goiás, no qual o PNE está inserido. Uma

análise comparativa com base em uma combinação semelhante de parâmetros mostrou que a

população de lobo-guará diminui sempre mais rapidamente do que a população de Cachorro-do-

mato. Porém, os resultados mostraram que as duas populações podem persistir por um tempo

razoável, mesmo quando considerado o pior cenário, ou seja, uma combinação entre elevada

perda de habitat, alta endogamia e grande flutuação populacional. Porém, deve-se levar em

consideração que este estudo é apenas um ponto de partida para estudos posteriores. Esses

estudos deverão ser baseados em parâmetros mais realistas tanto da viabilidade destas populações

quanto do cenário de desenvolvimento sócio-econômico-ambiental da região sudoeste do Estado

de Goiás e, portanto, os resultados podem permitir avaliações mais precisas da persistência destas

populações.

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CAPÍTULO 1

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Artigo Submetido: Genetics and Molecular Research

Transferibilidade de Marcadores STR para duas Espécies de

Canídeos do Cerrado Brasileiro

FLÁVIA MELO RODRIGUES1,5, MARIANA PIRES DE CAMPOS TELLES2, LUCILEIDE

VILELA RESENDE2, THANNYA NASCIMENTO SOARES2, JOSÉ ALEXANDRE

FELIZOLA DINIZ-FILHO3, 4, 5, ANAH TEREZA DE ALMEIDA JÁCOMO 4 E LEANDRO

SILVEIRA4. 1Universidade Estadual de Goiás, Departamento de Biologia, Anápolis-G0; 2Universidade

Católica de Goiás, Laboratório de Genética e Melhoramento, Departamento de Zootecnia; 3Universidade Federal de Goiás, Departamento de Biologia geral; 4Fundo para a Conservação

da Onça-Pintada (FCOP); 5 Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais – UFG.

e-mail: flavia.melo@ueg.br

Resumo

O lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) e cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) são duas

espécies de canídeos que ocorrem no cerrado brasileiro. O lobo-guará é uma espécie que está

incluída na lista de espécies brasileiras ameaçadas de extinção, enquanto o cachorro-do-mato é

um canídeo muito comum e abundante nas áreas do cerrado. O objetivo deste trabalho foi testar a

amplificação cruzada de 29 locos STR para amostras de lobo-guará e cachorro-do-mato,

provenientes do Parque Nacional das Emas. Para testar a transferibilidade foram utilizados dois

indivíduos de cada espécie. Em seguida, foram montadas reações de PCR utilizando uma

amplitude de variação na temperatura de anelamento dos primers entre 45 a 65ºC. Os produtos da

amplificação foram separados em gel de poliacrilamida 4% e visualizados por coloração com

nitrato de prata. Os locos transferidos foram utilizados para uma análise com 38 indivíduos de

cada espécie. Do total de locos avaliados, seis foram transferidos com sucesso para as duas

espécies (CSSM-038, PEZ-05, PEZ-20, PEZ-12, PEZ-13 e PEZ-15) . Para o cachorro-do-mato,

foi obtida uma média de 7,8 alelos por locos e para o lobo-guará 4,5 alelos por loco. O loco

CSSM-038 foi monomórfico para as duas espécies e os outros cinco locos apresentaram alto

polimorfismo, permitindo a estimativa de alguns parâmetros genéticos, incluindo a

heterozigosidade média esperada (He = 0.676 para o cachorro-do-mato e He = 0,533 para lobo-

16

guará), e o índice de fixação médio (f = 0,0326 para cachorro-do-mato e f = -0,09078 para lobo-

guará). Com estes resultados, pôde-se confirmar que o potencial de transferibilidade de

marcadores STR é maior entre as espécies evolutivamente mais próximas (i.e. cachorro

doméstico). Essas informações podem ser úteis para outros pesquisadores que trabalham com

estas espécies, pois diminuem os custos e agilizam o processo de obtenção de dados moleculares

para o estudo das populações naturais

Palavras-chave: Marcadores STR, Transferibilidade, Cerdocyon thous, cachorro-do-mato,

Chrysocyon brachyurus, lobo-guará

Enviar correspondência para FM Rodrigues. Universidade Estadual de Goiás, Departamento de

Biologia, Unidade Universitária de Ciências Extas e Tecnológicas, BR 153, Km 3, Campus

Anápolis, CEP: 75110-390, Caixa Postal: 459, Anápolis, GO, Brasil. E-mail: flavia.melo@ueg.br

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Abstract

The Maned-Wolf (Chrysocyon brachyurus) and the Crab-eating fox (Cerdocyon thous)

are two canid species found in Brazilian Cerrado. Maned-Wolf is the largest canid of South

America and is typical of Brazilian Cerrado, whereas Crab-eating fox is a relatively small,

abundant and widely distributed species found in many habitats in Brazil. In this note, we tested

cross-amplification and transferability of 29 STR loci originally developed for cattle and

domestic dogs and cats to these two species, using a total of 38 individuals of each species,

collected in Emas National Park, which is the largest National Park in the Cerrado region. Out of

the 29 STR primers tested, 6 were successfully transferred (CSSM-038, PEZ-05, PEZ-20, PEZ-

12, L-13 and L-15) and 5 showed polymorphism in the population analyzed. The genetic

parameters estimated (number of alleles per loci, expected and observed heterosigosity and

fixation indices) are within the expectation for other canid population wordwide.

Keywords: STR markers, cross-amplification, transferability, canids, Cerdocyon thous,

Chrysocyon brachyurus, Cerrado

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No cerrado brasileiro ocorrem 38 espécies de mamíferos de médio e maior porte e destas,

45% correspondem a ordem Carnivora (Marinho-Filho et al. 2002). Apesar de sua

representatividade na comunidade faunística do Cerrado, as espécies de Carnivora têm sido

pouco estudadas (Alho, 1990; Garcia-Perea, 1994; Silveira & Jácomo, 1998) e a maioria dos

trabalhos publicados enfocam apenas aspectos ecológicos de uma única espécie (Dietz, 1984;

Dalponte, 1997; Facure, 1996). Dentre os 12 Parques Nacionais no Bioma Cerrado (Brasil), o

Parque Nacional das Emas (PNE) é o que apresenta maior riqueza e abundância faunística de

médios e grandes mamíferos (Erize, 1977; Eisenberg & Redford, 1999). O lobo-guará, ou

simplesmente Guará (Chrysocyon brachyurus), uma das espécies que ocorrem no PNE, é o maior

representante da família dos canídeos da América do Sul. Esta espécie possui uma grande

importância para a manutenção da diversidade do bioma por sua função ecológica de predador de

topo de cadeia e dispersor de sementes, sendo, portanto, importante para a estabilidade deste

ecossistema. Atualmente está classificado pela IUCN (2004) como espécie LR/nt, ou seja, com

pequeno risco de extinção, mas próximo a ser considerado vulnerável à extinção. A espécie

também está incluída na lista de espécies brasileiras ameaçadas de extinção do IBAMA (Instituto

Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis) (IBAMA, 2003). Outra espécie de

canídeo encontrada no PNE é o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), que é um mamífero de

porte médio, cuja distribuição estende-se do sul da Amazônia até o Paraguai (EMBRAPA, 2005).

No Brasil, é o canídeo mais comum e com maior distribuição, ocupando uma grande variedade de

habitats. Porém, parece ser mais abundante nas áreas de cerrado do que em áreas de matas

fechadas (Rocha et al. 2004).

Estudos de conservação de espécies nativas freqüentemente requerem o conhecimento da

diversidade genética entre as populações e fluxo gênico. Os marcadores microssatélite ou STR

(Short Tandem Repeats) têm sido freqüentemente escolhidos para quantificar a variabilidade

genética em populações naturais devido ao seu alto índice informativo, quando comparado a

19

outras classes de marcadores moleculares, e pela facilidade com que o polimorfismo pode ser

detectado (Brondani et al. 2003; Wandeler et al. 2003; Li et al. 2002). Os STR’s, estão se

tornando cada vez mais a ferramenta escolhida para estudos de genética de população, fluxo

gênico e análise de paternidade (Iyengar et al. 2005; Klukowska et al. 2003; Wright & Bentzen

1994). Entretanto, avanços no uso dos marcadores STR se tornam difíceis devido ao alto custo e

ao tempo relativamente grande necessários para o desenvolvimento prévio dos marcadores, que

normalmente são desenvolvidos para cada espécie que se pretende estudar. O sucesso na

amplificação cruzada ou transferibilidade de regiões de STR entre espécies, pela Reação em

Cadeia da Polimerase (PCR), tende a estar inversamente relacionada à distância evolutiva entre

as duas espécies consideradas (Navani et al. 2002; Tong et al. 2002; Williamson et al. 2002;

Zucchi et al. 2002). Diversos estudos têm mostrado a possibilidade de se usar alguns marcadores

desenvolvidos para uma outra espécie pertencente ao mesmo gênero (Brondani et al.2003;

Cipriani et al. 1999; Isagi & Suhandono 1997; Zucchi et al.2002), ou até mesmo entre gêneros

diferentes (Roa et al. 2000; Write & Powell 1997).

Neste estudo foi testada a transferibilidade cruzada de marcadores STR desenvolvidos

originalmente para bovinos, búfalos, cachorro doméstico e gato doméstico (Barker et al. 1997,

Cãnón et al. 2001, Denise et al. 2004, Fries et al. 1993, Halverson et al. 1995, Kapes et al. 1997,

Menotti-Raymond et al. 1999, Sunden et al. 1993) (Tabela 1), para duas espécies de canídeos do

cerrado, o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) e o lobo-guará (Chrysocyon brachyurus). O

DNA genômico foi extraído do sangue de 38 indivíduos de cada uma das duas espécies

capturadas no PNE, Goiás, Brasil. No total foram testados 29 primers com dois indivíduos de

cada população e destes, 6 pares de primers (21%) foram transferidos com sucesso e selecionados

para serem utilizados na genotipagem das duas populações (Tabela 2). Para as reações de PCR, o

seguinte protocolo foi utilizado: 5 µl de DNA (~3 ng/µl); 2,2 µl do primers A (~5 ng/µl); 2,2 µl

20

do primers B (~5 ng/µl); 1,3 µl de BSA (10 mg/ml); 1,5 µl tampão da enzima (10 X); 0,5 µl de

MgCl2 (50 mM); 1,3 µl de d’NTP (2,5 mM); 0,2 µl da enzima Taq- Polimerase (5 unidades/µl) e

completando o volume com 0,8 µl de H2O Milli-Q, para um volume final de 15 µl. A

amplificação via PCR foi realizada no termociclador MJ, utilizando o seguinte protocolo: 1º)

desnaturação inicial do DNA a 94ºC por 5 minutos; 2º) 94ºC por 1 minuto; 3º) anelamento dos

“primers” a diferentes temperaturas por 1 minuto; 4º) extensão da molécula pela enzima Taq

polimerase (fornecida pela Amersham Pharmacia Biotech) a 72ºC por 1 minuto; 5º) 30 ciclos

seguindo do 2º ao 4º passos; 6º) etapa final da extensão por 7 minutos a 72ºC para finalizar os

produtos amplificados. Para cada primer foram utilizadas temperaturas de anelamento que

variaram entre 45ºC e 65ºC (Tabela 1). Os fragmentos amplificados foram separados em cuba de

seqüênciamento vertical (BIORAD) em gel de poliacrilamida 4%, utilizando TBE 1X. A

eletroforese teve duração de 2 horas com potência de 90W sob corrente elétrica constante, e

corados com nitrato de prata (Bassan et al. 1991). O padrão de peso molecular, o marcador

Ladder 10bp (Amersham Pharmacia Biotech), foi usado para estimar os tamanhos dos produtos

de PCR

Tabela 1- Identificação dos locos, seqüência dos primers, temperaturas de anelamento (TA) testadas e fontes dos primers utilizados para amplificação cruzada para Cerdocyon thous e Chrysocyon brachyurus. As siglas (F) e (R) significam Forward e Reverse, respectivamente.

Locos Seqüência dos Primers (5’→ 3’) TA (°C) Fontes BOVINOS E BÚFALOS

BM 2113 (F) GCTCCTTCTACCAAATACCC (R) CTTCCTGAGAGAAGCAACACC 45, 48, 52, 54, 56, 60 Sunden et al.1993

MAF (F) ATTGACACTTCAGTAAGTTAACAATGG (R) CAGACACAACTGAGCAACTAGCGC 45, 48, 50 Kappes et al.1997

CSN 032 (F) ATGACACCTTAACCTAATCCC (R) GCACTTTATAAGCACCACAGC 48, 52, 54, 56, 60 Barker et al. 1997

INRA 006 (F) AGGAATATCTGTATCAACCTCAGTC (R) CTGAGCTGGGGTGGGAGCTATAAATA 45, 48, 50 Cãnón et al.2001

INRA 092 (F) GGTTTGACTTCAACTTCAACC (R) GGGAGTATGTGGAGAATGCAAG 45, 48 Cãnón et al.2001

TEXAN 02 (F) ACATTGTCATGTGGTTGCTAAC (R) ACTATGGGTATGTATATGTGCTGCAAG 45, 48 Barker et al. 1997

CSSM 046 (F) TGCACAATCGGAACCTAGAATATT (R) GGCTATTAACTGTTTTCTAGGAAT 45, 48 Barker et al. 1997

21

Tabela 1 (Continuação) Locos Seqüência dos Primers (5’→ 3’) TA (°C) Fontes

BOVINOS E BÚFALOS CSSM 038 (F) TTCATATAAGCAGTTTATAAACGC

(R) ATAGGATCTGGTAACTTACAGATG 45, 48 Barker et al. 1997

BMS 2523 (F) TGAAGTAAGTAAGCACACAAGCA (R) TTGATCATCTTTAGGTCCATCC 48, 52, 54, 56, 60 Cãnón et al.2001

ETH 225 (F) GATCACCTTCGGACTATTTCCT (R) ACATGACAGCCACGTGCTACT 45, 48 Fries et al.1993

CACHORRO DOMÉSTICO PEZ-7 (F) ATCCTGGAGACCTGGGATTG

(R) GATTGAGTCATCAATAGATG 45, 48, 52, 54, 56, 60 Halverson et al.1995

PEZ-5 (F) GCTATCTTGTTTCCCACAGC (R) TCACTGTATACAACATTGTC

45, 48, 52, 54, 56, 58, 60 Halverson et al.1995

PEZ-20 (F) CCTAAATTAGAGGTCTAAACCC (R) TAAGCGGGAATGTGCTCCTC

45, 48, 52, 54, 56, 58, 60 Halverson et al.1995

Loco-11 (F) CTCAGCACCGAGTCTGCTTG (R) CCTGTTCTAGGAACCCTATG 54, 56, 58, 60, 62 Halverson et al.1995

PEZ-13 (F) AGTCTGGTGATTTAATTCGG (R) TCTAGTCCCCAGTCTAGTTCACTGCCC 54, 62 Halverson et al.1995

PEZ-15 (F) TGGGGCTTAACTCCAAGTTC (R) GTACAGAGTCTGCTTATC 54, 58, 62 Halverson et al.1995

PEZ-8 (F) TATCGACTTTATCACTGTGG (R) ATGGAGCCTCATGTCTCATC 50, 54 Halverson et al.1995

PEZ-12 (F) GTAGATTAGATCTCAGGCAG (R) TAGGTCCTGGTAGGGTGTGG 54, 58 Halverson et al.1995

PEZ-16 (F) GCTCTTTGTAAAATGACCTG (R) GTGGGAATCGTCCTAAAACCC 50, 52, 54 Halverson et al.1995

GATO DOMÉSTICO

FCA 005 (F) CCTAAGGAAACAGTAATCCTGGC (R) TGGAGGCATACCAGGAT 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 026 (F) GGAGCCCTTAGAGTCATGCA (R) TGTACACGCACCAAAAACAA 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 077 (F) GGCACCTATAACTACCAGTGTGA (R) ATCTCTGGGGAAATAAATTTTGG 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 090 (F) ATCAAAAGTCTTGAAGAGCATGG (R) TGTTAGCTCATGTTCATGTGTCC 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 096 (F) CACGCCAAACTCTATGCTGA (R) CAATGTGCCGTCCAAGAAC 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 126 (F) GCCCCTGATACCCTGAATG (R) CTATCCTTGCTGGCTGAAGG 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 193 (F) TATCTGGTAAGCCCCTGGG (R) CCCTGTTTTTATGCCTCTGC 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 211 (F) TGTAGAACATAATGCCTCAGCC (R) TCTTGAACCTATTTCCCCACA 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 220 (F) CGATGGAAAATTGTATCCTGG (R) GGAATGAAGGCAGTCACAAACTG 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

FCA 441 (F) ATCGGTAGGTAGGTAGATATAG (R) GCTTGCTTCAAAATTTTCAC 45 Menotti-Raymond et

al. 1999

22

Tabela 2- Locos transferidos para Cerdocyon thous (Ct) e Chrysocyon brachyurus (Cb),

identificando o tipo de repetição, a variação no tamanho dos alelos encontrados, e temperatura de

anelamento (TA oC) ideal para cada loco.

Variação no tamanho dos alelos (bp) TA (oC) Locos

Motivo de

Repetição Ct Cb Ct e Cb

CSSM-038 CA 162 162 48

PEZ-05 AAAG 112-78 116-100 60

PEZ-20 AAAT 230-202 173-153 60

PEZ-12 AAAG 302-222 265-261 58

PEZ-13 AAAG 312-246 267-235 62

PEZ-15 AAAG 214-190 211-195 62

Todos os primers testados foram classificados de acordo com a qualidade dos produtos de

PCR obtidos: 48% (14 pares de primers) não tiveram nenhuma amplificação, 31% (9 pares de

primers) exibiram amplificações inespecíficas, e os 21% restantes (6 pares de primers) foram

transferidos com sucesso para as duas espécies. Os 38 indivíduos de cada uma das populações

(lobo-guará e Cachorro de Mato) foram analisados com base em cinco locos altamente

polimórficos (83%), gerando uma média de 7,8 alelos por loco no cachorro-do-mato e 4,5 alelos

no lobo-guará. A Figura 1 apresenta todos os alelos obtidos nas duas populações para os cinco

locos polimórficos, com exceção dos primers PEZ-15 e PEZ-13, para os quais faltaram um e dois

alelos, respectivamente.

Os parâmetros genéticos para o cachorro-do-mato foram: heterozigosidade média

esperada, He = 0,676; a heterozigosidade média observada, Ho = 0,654; e o índice de fixação

médio, f = 0.0326. Para o lobo-guará, os parâmetros genéticos obtidos foram, He = 0,533; Ho =

0,564; e f = -0.09078 (Tabela 3).

23

Figura 1- Escada alélica dos cinco locos polimórficos (PEZ-05, PEZ-20, LOCO-13 ou PEZ-13,

LOCO-15 ou PEZ-15 e PEZ-12) nas duas espécies analisadas, cachorro-do-mato (Ct) e lobo-

guará (Cb). M indica o padrão de peso molecular 10 bp ladder, Pharmacia.

24

Tabela 3- Número de alelos por loco (A), Heterozigosidade esperada (He), Hetrozigosidade

observada (Ho) nos locos que amplificaram com Cerdocyon thous (Ct) e Chrysocyon brachyurus

(Cb).

A He Ho Loco STR

Ct Cb Ct Cb Ct Cb

CSSM-038 1 1 --- --- --- ---

PEZ-05 6 5 0,770 0,627 0,757 0,697

PEZ-20 6 6 0,747 0,712 0,812 0,560

PEZ-12 13 2 0,875 0,478 0,909 0,658

PEZ-13 14 8 0,890 0,817 0,697 0,914

PEZ-15 7 5 0,775 0,564 0,750 0,553

Os resultados obtidos indicam que há um grande potencial de transferibilidade de

marcadores STR entre gêneros de canídeos diferentes. Este é um resultado importante, pois o alto

custo e um longo período de testes necessários para o desenvolvimento de primers específicos de

microssatélite dificulta muito os estudos de caracterização da variabilidade genética nas

populações.

25

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29

CAPÍTULO 2

30

Artigo a ser submetido: Genetics and Molecular Biology

Diversidade Genética do lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) e

cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) Utilizando Marcadores RAPD

e STR

FLÁVIA MELO RODRIGUES1, 6, MARIANA PIRES DE CAMPOS TELLES4, 5, JOSÉ

ALEXANDRE FELIZOLA DINIZ FILHO2, 3, 5, 6, LUCILEIDE VILELA RESENDE4, ANAH

TEREZA DE ALMEIDA JÁCOMO5, LEANDRO SILVEIRA5 E THANNYA NASCIMENTO

SOARES4 1Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Goiás (UEG), Anápolis, GO; 2Departamento de Biologia, Universidade Católica de Goiás (UCG); 3Departamento de Biologia

Geral, ICB, Universidade Federal de Goiás (UFG); 4Laboratório de Genética e Melhoramento,

Departamento de Zootecnia/ITS, Universidade Católica de Goiás (UCG); 5Fundo para a

Conservação da Onça-Pintada (FCOP),6 Programa de Pós-Graduação em Ciências

Ambientais – UFG.

e-mail: flavia.melo@ueg.br

Resumo

Quanto maior é a variação genética de uma espécie, maior será a sua chance de sobreviver

a mudanças do ambiente e, por isso, maiores são as suas chances de evitar a extinção. Os

marcadores moleculares, tais como, RAPD e os STR’s, são técnicas da biologia molecular que

têm sido amplamente utilizadas no monitoramento da variabilidade genética das populações. O

objetivo deste trabalho foi estimar a diversidade genética de populações de cachorro-do-mato

(Cerdocyon thous) e de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) do Parque Nacional das Emas

(PNE), Goiás, utilizando os marcadores STR e marcadores RAPD. Foram coletadas amostras de

sangue para as análises genéticas de 38 indivíduos de cada uma das duas espécies estudadas. Para

as análises RAPD foram utilizados nove primers da OPERONTM e em seguida os fragmentos

amplificados foram separados em gel de agarose 1,4%, visualizados por coloração com brometo

de etídio. Para as análises com os marcadores STR, foram utilizados seis primers nas reações de

PCR. Os produtos amplificados foram submetidos a uma eletroforese em gel de acrilamida 4% e

31

este foi corado com nitrato de prata para a obtenção dos genótipos. Em seguida, foram realizadas

as estimativas de diversidade genética. Para estimar a correlação entre os resultados gerados

pelos dois marcadores utilizados, os genótipos obtidos com os dados STR foram transformados

em dados binários. Em média, o número total de locos e número de locos polimórficos por

primer, foi maior no cachorro-do-mato do que no lobo-guará . A similaridade genética obtida

com os marcadores RAPD foi em média maior na população de lobo-guará (0,75) do que na

população de cachorro-do-mato (0,68). Dentre os primers STR, 83% foram altamente

polimórficos. O índice de fixação médio estimado para cada população foi 0,032 e -0,091 para o

cachorro-do-mato e lobo-guará , respectivamente. As correlações matriciais entre as

similaridades genéticas obtidas pelos dois marcadores foram significativas pelo teste de Mantel,

porém com valores de r baixos, 0,242 (P = 0,0056) na população de lobo-guará e 0,2465 (P =

0,0126) na população de cachorro-do-mato. A baixa correlação entre os dois marcadores

moleculares utilizados corrobora outros estudos o que pode ser explicado pela base genética

diferente entre eles. Nossos dados não indicam uma significativa redução na variabilidade

genética e nem endogamia elevada em nenhuma das espécies estudadas. Portanto, deve-se pensar

em propostas adequadas de conservação e manejo destas espécies, principalmente do lobo-guará ,

que é uma espécie vulnerável a extinção, a fim de aumentar a viabilidade das mesmas em longo

prazo.

Palavras-chave: lobo-guará , cachorro-do-mato, Marcadores STR, Marcadores RAPD,

Diversidade Genética.

Enviar correspondência para FM Rodrigues. Universidade Estadual de Goiás, Departamento de

Biologia, Unidade Universitária de Ciências Extas e Tecnológicas, BR 153, Km 3, Campus

Anápolis, CEP: 75110-390, Caixa Postal: 459, Anápolis, GO, Brasil. E-mail: flavia.melo@ueg.br

32

Abstract

High genetic variability of a species gives it a higher chance of avoiding extinction.

Molecular markers RAPD and STR are molecular biology techniques that have been widely used

in order to monitor genetic variability of the populations. This research’s goal was to estimate the

genetic diversity of the Crab-eating fox (Cerdocyon thous) population and the Maned wolf

(Chrysocyon brachyurus) population from Ema’s National Park in Goiás. Blood samples of 38

individuals of each species were drawn for genetic analysis. For the RAPD analysis, nine

OPERONTM primers were used and the amplified fragments were separated in Agaroses gel 1,4%,

with bromite etidium coloration. For the STR markers, six primers were used on the PCR

reations, the amplified fragments were submited to eletrphorese in actilamida gel 4%, colored

with silver nitrate, to obtain the genotypes. Then the estimates of the genetic diversity were

calculated. To estimate correlation between the results found with the markers, the genotypes

obtained by STR markers were transformed in binary data. In average, the toral number os locus

and the number of polimorph locus for each primer was higher for the Crab-eating fox. The

genetic similarity obtained with the RAPD market was in average higher for the Maned Wolf

(0,75) and (0,68) for the Crab-eating fox. Comparing primers, 83% of the STR was highly

polimorphic. The average fixation iundex estimated for the population was 0.032 for the Crab-

eating fox and 0,091 for the Maned wolf. The matricial correlations between genetic similarities

were significant with the Mantel test but the values of r were low, r=0,242 (p=0,0056) for Maned

wof population and r=0,2465 (p=0,0126) for Crab-eating fox population. The low correlation

between the two markers agrees with other studies, and can be explained by the different genetic

base between them. The data doesn´t indicate a reduction in the genetic variability, neither high

endogamy in either species. One should think of proper ways to conserve and manage these

species, specially the Maner wolf, which is vulnerable to extinction, so that they become viable in

the long run.

Key words: Maned Wolf, Crab-eating fox, STR marker, RAPD marker, genetic diversity.

33

INTRODUÇÃO

Cada vez mais o conhecimento genético e ecológico das espécies se torna importante para

sua conservação, porque é na variação de seus genes que está a possibilidade de sobrevivência

das espécies. Uma nova abordagem no estudo da biodiversidade, a genética da conservação,

surgiu há alguns anos atrás e se tornou importante em programas de conservação (DeSalle e

Amato, 2004; Manel et al., 2003; Soulé e Wilcox, 1980; Schonewald-Cox et al., 1998). A

genética da conservação prevê o estudo da variabilidade genética das populações naturais e

artificiais com fins de determinar o potencial adaptativo e evolutivo de uma espécie (DeSalle e

Amato, 2004). A genética da conservação é uma área bastante ampla, abrangendo desde estudos

de expressão gênica, adaptações locais, genética quantitativa e de populações, até fatores

ecológicos de seleção. Os aspectos ecológicos da genética da conservação são fundamentais, pois

deles provêm à paisagem seletiva e demográfica que, combinada com a história evolutiva,

produziram os padrões de variação dentro das espécies (Moran, 2002).

Quanto maior é a variação genética de uma espécie, maior será sua chance de sobreviver

se adaptando a um novo ambiente e evitando a extinção (Hedrick, 2001). A genética da

conservação, bem como os outros campos interessados na conservação biológica, está sendo

motivada pela necessidade de se reduzir a atual taxa de extinção e preservar a biodiversidade.

Para atingir tal objetivo, são estudados os fatores genéticos que afetam o risco de extinção e o

controle genético que é necessário para minimizar esse risco (Frankham et al., 2002).

Os efeitos do tamanho das populações são alguns dos grandes problemas enfrentados na

conservação biológica das espécies ameaçadas. Pequenas populações sofrem com o

endocruzamento e a perda da variabilidade genética mais rapidamente, resultando em um elevado

risco de extinção. Conseqüentemente, o principal objetivo do estudo genético é minimizar esse

endocruzamento e a perda da variabilidade genética (DeSalle e Amato, 2004; Frankham et al.,

2002; Hedrick, 2001). O endocruzamento reduz a fecundidade, a sobrevivência e acaba

34

diretamente aumentando o risco de extinção (Frankham et al., 2002). Já a redução da

variabilidade genética compromete as espécies na sua habilidade de persistir frente à mudanças

ambientais, reduzindo suas chances de sobrevivência e persistência em um dado ambiente.

Estudos em genética da conservação tentam identificar as populações onde o endocruzamento e a

variabilidade genética podem interferir nas suas perspectivas de sobrevivência em longo prazo

(DeSalle e Amato, 2004; Frankham et al., 2002; Manel et al., 2003).

As técnicas moleculares têm sido amplamente utilizadas para monitorar a variabilidade

genética das populações (Parker et al., 1998). Os avanços na biologia molecular abriram novas

perspectivas para a pesquisa em conservação de espécies e para estudos de biologia populacional

como um todo. A partir desses avanços as variações encontradas nas espécies naturais podem ser

analisadas em nível de DNA. Vários estudos nesse sentido vem sendo desenvolvidos no Brasil e

no mundo (De Mattos et al., 2004; Farrel et al., 2000; Iyengar et al., 2005; Mengoni et al., 2000;

Ratnayeke et al., 2002; Zucchi et al., 2002).

Os marcadores moleculares compõem essas técnicas da biologia molecular e existe hoje

uma grande variedade de classes de marcadores moleculares (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Em

adição as técnicas baseadas em RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Bostein et

al., 1980), muitas tecnologias baseadas na reação em cadeia da polimerase, a PCR (Polymerase

Chain Reaction) (Mullis e Faloona, 1987), que permite a síntese enzimática de milhões de cópias

de um segmento específico de DNA, têm sido desenvolvidas. Essa técnica provocou uma

verdadeira revolução na genética molecular, facilitando bastante os trabalhos desenvolvidos nos

laboratórios. Desde então, várias técnicas baseadas em PCR vêm sendo desenvolvidas e dentre

elas se destacam os Microssatélites (Tautz, 1989) e o polimorfismo de DNA amplificado ao acaso,

o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990; Welsh e McClelland,

1990). A preferência por estas duas técnicas em relação ao RFLP é justificada devido a grande

35

quantidade de DNA exigida pela técnica de RFLP, bem como pelo elevado tempo e custo

despendido pelo desenvolvimento do procedimento (Mengoni et al., 2000)

Marcadores Microssatélite ou STR (Short Tandem Repeats), são definidos como

seqüências repetidas em tandem compostas de números variáveis de motivo com 1 a 6 pares de

bases (pb) encontrados no genoma de vertebrados, insetos e outros animais (Charlesworth et al.,

1994; Mengoni et al., 2000, Li et al., 2002). São marcadores genéticos codominantes

multialélicos e evolutivamente neutros. No entanto, alguns estudos discutem o papel dos

marcadores STR em regiões codificantes do genoma tais como, regulação da expressão gênica,

regulação da replicação e recombinação do DNA, organização da cromatina, etc (Li et al., 2002).

As seqüências que flanqueiam os STR são conservadas, o que permite a seleção de um par de

pequenos fragmentos de nucleotídeos iniciadores (Pimers), compostos de 20 a 30 pares de bases

e sua amplificação via PCR.

Os polimorfismos dos marcadores STR são detectados nos comprimentos das seqüências

dos fragmentos amplificados, pois o número de repetições em cada microssatélite é altamente

variável. Essas regiões possuem taxas elevadas de mutações, geralmente do tipo adição e deleção

das repetições, que podem chegar até um a cada 1000 pb (Tautz, 1989). Devido ao alto grau de

polimorfismo, os STR´s tornaram-se marcadores ideais para estudos de mapeamento genético,

discriminação entre acessos e cultivares de bancos de germoplasma, determinação de grau de

parentesco entre indivíduos e estrutura genética entre indivíduos, populações e espécies (Denise

et al., 2004; Francisco et al., 1996; Neff et al., 1999; Yang et al., 1994). Contudo, todas as

facilidades deste marcador dependem da disponibilidade das seqüências de DNA que flanqueiam

os STR, os primers. Por esta razão, o uso destes marcadores é limitado, pois são escassas as

informações sobre seqüências de DNA de espécies naturais e pelo alto custo e trabalho

envolvidos na construção de bibliotecas genômicas, clonagens e sequenciamentos necessários

para o isolamento de STR e desenvolvimento dos primers (Zucchi et al., 2002). No entanto,

36

diversos estudos têm mostrado a possibilidade de se usar alguns marcadores STR (primers)

desenvolvidos para uma outra espécie pertencente ao mesmo gênero (Brondani et al., 2003;

Cipriani et al., 1999; Isagi e Suhandono 1997; Zucchi et al., 2002), ou até mesmo entre gêneros

diferentes (Roa et al., 2000; Write e Powell 1997).

Os marcadores RAPD também têm sido bastante empregados no estudo de populações

naturais, pois são tecnicamente mais simples de se obter do que outros marcadores, tais como o

RFLP e STR, o que facilita o estudo de um grande número de locos, e fornece uma amostragem

aleatória maior do DNA (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Estes marcadores são gerados pela

amplificação de segmentos desconhecidos do genoma, utilizando um simples e curto primer de

seqüência arbitrária, contendo 10 pb. São inúmeras as vantagens dos marcadores RAPD tais

como, não utilizar radioatividade, necessita de pequenas quantidades de DNA, não requerem um

conhecimento prévio da seqüência alvo a ser amplificada, e ser aplicável a qualquer espécie, etc

(Ferreira e Grattapaglia, 1998). Entretanto o uso do RAPD também tem limitações, pois são

marcadores de caráter dominante, ou seja, ele não permite a identificação do genótipo

heterozigoto, limitando a estimativa de parâmetros genéticos. Alguns trabalhos discutem alguns

problemas quanto à sua reprodutibilidade (Karp et al., 1996; Lynch e Milligan, 1994). No entanto,

alguns estudos têm demonstrado que os marcadores RAPD tendem a fornecer marcas

relativamente específicas de populações, raças e espécies, o que o torna um importante marcador

para estudos de populações visando à conservação genética (Powell et al., 1996).

O presente trabalho teve por objetivo utilizar os marcadores STR e marcadores RAPD

para estimar a diversidade genética de uma população de cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) e

uma população de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) do Parque Nacional das Emas (PNE),

Goiás. O lobo-guará , ou simplesmente guará (Chrysocyon brachyurus), uma das espécies que

ocorrem no PNE, é o maior representante da família dos canídeos da América do Sul. Atualmente

está classificado pela IUCN (2004) como espécie LR/nt, ou seja, com pequeno risco de extinção,

37

mas próximo a ser considerado vulnerável à extinção. A espécie também está incluída na lista de

espécies brasileiras ameaçadas de extinção do IBAMA (Instituo Brasileiro do Meio Ambiente e

Recursos Naturais Renováveis) (IBAMA, 2003). O cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), que é

um mamífero de porte médio, cuja distribuição estende-se do sul da Amazônia até o Paraguai

(EMBRAPA, 2005). No Brasil, é o canídeo mais comum e com maior distribuição, ocupando

uma grande variedade de habitats. Porém, parece ser mais abundante nas áreas de cerrado do que

em áreas de matas fechadas (Rocha et al.,2004). O conhecimento dos níveis de variabilidade

genética nessas espécies é importante a fim de estabelecer estratégias de conservação e manejo na

região, que venham a minimizar posteriores riscos de extinção ligado à perda da diversidade em

nível genético.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta do Material Animal e Extração de DNA

Os indivíduos das duas espécies estudadas, lobo-guará e o cachorro-do-mato, foram

capturados no Parque Nacional das Emas (PNE) situado no extremo sudoeste do Estado de Goiás,

próximo ao limite com o Mato Grosso do Sul e Mato Grosso, a 18o19’S e 52o45’E. A maior parte

do PNE é pertencente ao município de Mineiros (GO) e o restante, aos municípios de Chapadão

do Céu (GO), Costa Rica (MS) e Alto Taquari (MT) (Figura 1).

38

Figura 1- Localização do Parque Nacional das Emas - GO.

No período compreendido entre janeiro de 2001 a junho de 2004 efetuou-se a coleta de 38

indivíduos de cada uma das duas populações estudadas (cachorro-do-mato e lobo-guará )

(Tabelas 1 e 2). Esta coleta de dados faz parte de um programa maior de monitoramento

populacional destas e de outras espécies realizado pela ONG “Fundo para a Conservação da

Onça-Pintada” (FCOP) (ver www.jaguar.org.br).

39

Tabela 1- Indivíduos amostrados da população de cachorro-do-mato (Cerdocyon thous),

indicando o sexo, idade e data da coleta realizada no Parque Nacional das Emas (PNE).

INDIVÍDUO SEXO IDADE DATA 1 Fêmea Adulto 19/1/2001 2 Macho Adulto 26/4/2001 3 Macho Adulto 14/7/2001 4 Fêmea Adulto 4/1/2002 5 Fêmea Adulto 8/2/2002 6 Fêmea Adulto 10/4/2002 7 Fêmea Adulto 18/4/2002 8 Macho Sub-adulto 20/4/2002 9 Fêmea Sub-adulto 21/4/2002 10 Fêmea Adulto 21/4/2002 11 Fêmea Sub-adulto 24/4/2002 12 Macho Adulto 27/4/2002 13 Fêmea Adulto 29/4/2002 14 Macho Adulto 30/4/2002 15 Macho Adulto 1/5/2002 16 Macho Adulto 1/5/2002 17 Fêmea Sub-adulto 6/6/2002 18 Macho Adulto 9/6/2002 19 Fêmea Sub-adulto 15/6/2002 20 Fêmea Sub-adulto 17/6/2002 21 Macho Adulto 21/8/2002 22 Macho Sub-adulto 24/8/2002 23 Fêmea Adulto 31/8/2002 24 Macho Adulto 2/9/2002 25 Fêmea Sub-adulto 3/9/2002 26 Fêmea Sub-adulto 5/9/2002 27 Fêmea Adulto 8/9/2002 28 Fêmea Adulto 19/9/2002 29 Macho Adulto 5/3/2003 30 Fêmea Adulto 22/4/2003 31 Fêmea Sub-adulto 23/4/2003 32 Macho Adulto 24/4/2003 33 Macho Adulto 9/5/2003 34 Macho Adulto 21/7/2003 35 Macho Jovem 3/8/2003 36 Fêmea Adulto 11/8/2003 37 Macho Adulto 19/4/2004 38 Fêmea Sub-adulto 29/6/2004

40

Tabela 2- Indivíduos amostrados da população de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus),

indicando o sexo, idade e data da coleta realizada no Parque Nacional das Emas (PNE).

INDIVÍDUO SEXO IDADE DATA 1 Fêmea Adulto 7/7/2001 2 Macho Adulto 12/7/2001 3 Macho Sub-adulto 1/4/2002 4 Macho Adulto 6/4/2002 5 Macho Adulto 21/7/2002 6 Macho ---- 4/9/2002 7 Fêmea ---- 10/9/2002 8 Fêmea ---- 15/9/2002 9 Fêmea ---- 21/9/2002

10 Fêmea Lactante 21/9/2002 11 Macho ---- 22/9/2002 12 Macho Adulto 1/11/2002 13 Macho Sub-adulto 17/1/2003 14 Fêmea Adulto 8/4/2003 15 Fêmea Adulto 8/4/2003 16 Macho Adulto 13/4/2003 17 Macho Adulto 19/4/2003 18 Macho Adulto 13/5/2003 19 Fêmea Sub-adulto 15/5/2003 20 Fêmea Sub-adulto 18/5/2003 21 Macho Adulto 3/7/2003 22 Macho Adulto 21/7/2003 23 Macho Adulto 25/7/2003 24 Fêmea Adulto 31/7/2003 25 Macho Adulto 3/8/2003 26 Fêmea Adulto 15/8/2003 27 Fêmea Adulto 16/8/2003 28 Macho Adulto 23/8/2003 29 Fêmea Adulto 24/8/2003 30 Fêmea Sub-adulto 24/8/2003 31 Fêmea Adulto 13/11/2003 32 Macho Adulto 30/3/2004 33 Fêmea Adulto 13/6/2004 34 Macho Adulto 8/6/2004 35 Macho Adulto 26/3/2004 36 Macho Adulto 24/3/2004 37 Fêmea Adulto 27/3/2004 38 Fêmea Adulto 30/3/2004

---- Dado não informado

Após a imobilização dos animais, utilizando o anestésico Zoletil (250 mg), as amostras

de sangue foram coletadas com vacutainer contendo EDTA e conservadas em tampão Easy blood

41

(12,114g de Tris, 37,224g de EDTA e 20g de SDS) a 4°C. Em seguida foi realizada a extração do

DNA através do Kit de purificação de DNA (GFX) da Amersham Pharmacia Biotech. Este

procedimento pode processar mais de 300µl de sangue, com um rendimento de 4,5 a 7,5µg de

DNA, proveniente de 300µl de sangue total (o qual contém aproximadamente 3x106 de células

nucleadas). As etapas do procedimento de extração do DNA são descritas a seguir:

1- Lise das células

- Adicionou-se 3X do volume da amostra de tampão RBC Lysis Solution e misturou-se por

inversão;

- Incubou-se a mistura de lise por 5 minutos em temperatura ambiente e em seguida centrifugou

(entre 1200 e 16000 rpm) em microcentrífuga por 20 segundos;

- Removeu-se o sobrenadante e o resíduo (aproximadamente 20-50µl) utilizou-se para

ressuspender as células antes da extração.

2- Extração

- Ressuspendeu-se as células brancas do sangue, no mesmo tubo de lise e adicionou 500µl de

tampão de extração (Extraction Solution), pré aquecido a 70oC, e misturou com o auxílio de um

vortex;

- Incubou-se a mistura de extração por 5 minutos em temperatura ambiente.

3- Recuperação do DNA

- Transferiu-se toda a mistura da extração para uma coluna (GFX Column) e em seguida

centrifugou-se a 8000rpm por 1 minuto;

- Descartou-se o líquido do tubo coletor e repetiu a etapa de extração.

4- Lavagem

- Descartou-se o líquido do tubo coletor e adicionou-se 500µl de solução de lavagem (Wash

Solution) e em seguida, centrifugou-se a 12000-16000rpm por 3 minutos;

42

- Descartou-se o tubo coletor e transferiu a coluna para outro tubo.

5- Eluição

- Adicionou-se 100 µl de tampão de eluição (TE) pré-aquecido a 70oC e incubou a amostra a

temperatura ambiente por 1 minuto;

- Centrifugou-se a 8000rpm por 1 minuto para recuperar o DNA purificado.

A quantificação do DNA foi realizada com o auxílio do marcador de peso molecular Low

DNA Mass, e diluído para a concentração ideal de uso. O DNA foi utilizado para a realização de

diversas reações de PCR utilizando os marcadores RAPD e STR.

Condições de Amplificação dos Marcadores RAPD

Primeiramente, foi realizada uma seleção dos melhores marcadores utilizando o DNA de

três indivíduos de cada uma das duas espécies. Os testes de amplificação foram realizados com

119 primers das séries OPA, OPB, OPC, OPH, OPM e OPP desenvolvidos pela OPERON.

Destes, um total de nove marcadores apresentaram um melhor padrão de amplificação e foram

selecionados para as reações de PCR com os 38 indivíduos de cada espécie.

As reações de PCR foram montadas da seguinte forma: 3 µl de DNA (~3 ng/µl); 2,0 µl de

primer (~10 ng/µl); 2,6 µl tampão da enzima (10 X); 0,78 µl de MgCl2 (50 mM); 2,08 µl de

d’NTP (2,5 mM); 0,2 µl da enzima Taq-Polimerase (5 unidades/µl) e completando o volume com

9,34 µl de H2O Milli-Q. Foram utilizadas as seguintes condições nas reações de amplificação: (1º)

2’ a 94°C; (2º) 1’30’’ a 92°C, (3º) 1’ a 37°C, (4º) 2’30’’ a 72°C, (5º) 40 ciclos (da 2º a 4º) e (6º)

5’ a 72°C para a extensão final. Os fragmentos de DNA amplificados foram separados através de

eletroforese em gel de agarose 1,5% e em seguida corados com brometo de etídeo. Foi utilizado o

marcador de peso molecular ladder 100 bp (Gibco), para estimar o tamanho dos fragmentos. Os

fragmentos, nos géis, foram visualizados através de um transluminador de luz ultravioleta e

43

fotografados com auxílio do fotodocumentador KODAK EDAS – 120, (Ferreira e Grattapaglia,

1998).

Condições de Amplificação dos Marcadores STR

Após a realização dos testes de transferibilidade dos marcadores STR (ver Capítulo 1), os

locos selecionados foram utilizados nas reações de PCR. Para as reações de PCR o seguinte

protocolo foi utilizado: 5 µl de DNA (~3 ng/µl); 2,2 µl do primers A (forward) (~5 ng/µl); 2,2 µl

do primers B (reverse) (~5 ng/µl); 1,3 µl de BSA (10 mg/ml); 1,5 µl tampão da enzima (10 X);

0,5 µl de MgCl2 (50 mM); 1,3 µl de d’NTP (2,5 mM); 0,2 µl da enzima Taq- Polimerase (5

unidades/µl) e completando o volume com 0,8 µl de H2O Milli-Q, para um volume final de 15 µl.

Para cada reação, realizada no termociclador MJ Research Inc, utlizou-se o seguinte

programa: (1º) desnaturação do DNA a 94ºC por 5 minutos e (2º) a 94ºC por 1 minuto; (3º)

anelamento dos “primers” a XºC por 1 minuto; (4º) extensão da molécula pela enzima Taq

polimerase (fornecida pela Amersham Pharmacia Biotech) a 72ºC por 1 minuto; (5º) 30 ciclos

seguindo do 2º ao 4º passos; (6º) passo final de extensão de 7 minutos a 72ºC para finalizar os

produtos amplificados. Para cada primer foram testadas temperaturas de anelamento que

variaram entre 45ºC e 65ºC, pois este é um dos fatores críticos nas análises com estes marcadores

(Hillis et. al, 1996; Ferreira e Grattapaglia, 1998) e após os resultados dos testes foi utilizado a

temperatura de anelamento específica de cada primer (ver cap. 1).

Em uma primeira etapa dos testes de amplificação realizamos uma eletroforese horizontal,

utilizando o gel de agarose 4% com tampão de corrida TBE 1X, com o intuito de verificar se

houve ou não amplificação de algum fragmento. Os fragmentos foram corados em uma solução

contendo brometo de etídeo visualizados no transiluminador de luz ultravioleta e fotografados

com o fotodocumentador KODAK EDAS 120.

44

As amostras que amplificaram foram, em seguida, submetidas à eletroforese em gel de

poliacrilamida a 4% em TBE 1X durante 2 horas, mantendo a corrente elétrica em 90W constante.

Nesse gel são aplicados 3µl do produto da PCR previamente desnaturado (94°C por 5 min),

contendo o tampão de carregamento. O padrão de peso molecular, o marcador Ladder 10bp

(Amersham Pharmacia Biotech) foi usado para estimar os tamanhos dos produtos de PCR. Após

a eletroforese, o gel de acrilamida foi corado com nitrato de prata (Bassan et al., 1991). Após a

revelação das bandas e a secagem das placas, estas foram colocadas sobre a luz branca para a

obtenção dos genótipos.

Análises dos Dados

Dados RAPD e STR

A partir dos produtos amplificados via RAPD, foi construída uma matriz de dados

binários obtida pela codificação dos géis em genótipos, no qual o valor 1,0 indica presença de

banda no indivíduo e zero a sua ausência. Em seguida, foi realizada uma análise descritiva destes

dados, anotando-se o número total de locos e número de locos polimórficos.

As matrizes binárias contendo dados dos nove primers selecionados foram combinadas a

fim de se obter uma única matriz, na qual foi estimada a similaridade entre os indivíduos para

cada uma das duas populações separadamente e conjuntamente. A similaridade genética entre os

pares de indivíduos foi estimada com base no coeficiente de Jaccard (J) (Sneath e Sokal, 1973)

que é dado por

PMJ =

onde M é o número de bandas em comum e P é o número total de bandas, excluindo-se as bandas

ausentes nos dois indivíduos comparados. Essas análises foram realizadas utilizando a rotina

SIMQUAL (similarity for qualitative data) do programa NTSYS-PC, versão 1.8 (Rohlf, 1991).

45

A partir da interpretação dos genótipos gerados pelos marcadores STR, foram obtidas as

freqüências alélicas (p) e genotípicas em cada loco para cada espécie. Estas freqüências foram

submetidas a estatísticas descritivas, tais como número de alelos observados por loco (na),

número efetivo de alelos (ne), calculados de acordo com Crow e Kimura (1970), e a proporção de

locos polimórficos (lp) para cada espécie analisada.

Para a verificação da hipótese nula de aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)

foi feito o Teste Exato de Fisher por meio do método de cadeias de Markov, utilizando 10

batches com 1000 permutações por batch, utilizando o programa TFPGA 1.3 (Miller, 1997).

Para estimar a diversidade genética foi calculada a heterozigosidade média observada (Ho),

obtida pela média aritmética das proporções do número de heterozigotos em relação ao número

total de indivíduos entre os locos analisados. A Heterozigosidade esperada por locos (He), foi

calculada por

∑−= 21 ipHe

onde p é a freqüência populacional do i-ésimo alelo de cada loco.

Com base nas estimativas das heterozigosidades esperadas e observadas (He e Ho),

calculou-se o índice de fixação ou coeficiente de endogamia (F) para cada população, como

medida da deficiência ou excesso de heterozigotos, dada pela fórmula ( )He

HoHeF −= . Todas

essas análises foram realizadas no programa GENEPOP 3.3 (Raymond e Rousset, 1995).

Correlação Matricial

A fim de se verificar a associação entre a similaridade genética obtida a partir dos dois

marcadores utilizados para cada espécie, os genótipos gerados pelos marcadores STR foram

transformados em uma matriz binária, onde a presença do alelo no genótipo foi indicada por 1 e a

46

ausência por zero (Kosman e Leonard, 2005). A transformação foi feita de acordo com o exemplo

abaixo:

Genótipos Indivíduos

Primer 1 Primer 2

1 A B A A

2 B B A D

3 A C B C

Alelos / Primer 1 Alelos / Primer 2 Indivíduos

A B C D A B C D

1 1 1 0 0 1 0 0 0

2 0 1 0 0 1 0 0 1

3 1 0 1 0 0 1 1 0

Para avaliar a correlação entre as matrizes de similaridade obtidas a partir dos dados

RAPD e STR das espécies foi utilizado o teste de Mantel (Manly, 1991), que é dado por:

( )∑ ∑ ⋅=i ijijj

MEZ

onde Eij e Mij são o i-ésimo e j-ésimo elementos das matrizes E e M a serem comparadas. A

significância da relação entre as matrizes pode ser testada recalculando o valor de Z diversas

vezes, permutando aleatoriamente, em cada uma delas, a ordem dos elementos de uma das

matrizes. Deste modo, é possível obter uma distribuição de probabilidades à qual o valor de Z

observado pode ser comparado (Manly, 1991). O valor de Z não possui amplitude de variação

definida, mas de fato ele possui uma relação monotônica com o r de Pearson calculado entre as

matrizes. Assim, pode-se utilizar o Z de Mantel para testar a significância da correlação matricial,

Genótipos gerados pelos

locos STR.

Genótipos transformados em

dados binários para cada loco

analisado.

47

que varia entre 1,0 e –1,0. Foram utilizadas 5000 permutações aleatórias para estabelecer a

significância de cada correlação matricial. Essas análises foram realizadas utilizando a rotina

MXCOMP (Matrix Comparison-Graphics) do programa, NTSYS-PC 1.8 (Rohlf, 1991).

RESULTADOS

Dados RAPD

Dentre os 119 primers testados foram selecionados nove para as análises posteriores, por

apresentarem um melhor padrão de amplificação. Os critérios adotados para seleção dos

marcadores foram: 1º) número razoável de locos; 2º) o máximo possível de bandas fortes; 3º)

presença de polimorfismo. Estes critérios facilitam o processo de codificação e maximizam a

chance de obtenção de dados com maior qualidade, repetibilidade e menor custo. Portanto, com

base no padrão de amplificação e da resolução das bandas no gel, foram selecionados os

seguintes primers: OPH-04, OPH-19, OPP-07, OPP-08, OPP-09, OPC-05, OPC-11, OPA-18,

OPP-15 (Figuras 2 e 3). O primer OPH-05 não foi selecionado devido a pouca quantidade.

Figura 2- Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados para ilustrar alguns dos primers selecionados (OPH-04, OPH-05, OPH-19, OPP-07, OPP-08, OPP-09), exceto OPH-05, utilizando três amostras de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus). As colunas “M 100bp” indicam o marcador de peso molecular (100 bp ladder, Pharmacia).

48

Figura 3- Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados para ilustrar alguns dos

primers selecionados (OPH-05, OPH-19, OPP-07, OPP-08, OPP-09 e OPP-15), exceto OPH-05,

utilizando três amostras de cachorro do Mato (Cerdocyon thous). As colunas “M 100bp” indicam

o marcador de peso molecular (100 bp ladder, Pharmacia).

Nas Figuras 4 e 5 pode se observar um exemplo do perfil de amplificação, usando o

primer OPC-11 com a população de cachorro-do-mato e OPA-18 com a população de lobo-

guará . O número total de locos para o lobo-guará foi 94, variando de 8 a 14 locos por primer, e

106 para o cachorro-do-mato, variando de 10 a 15 locos por primer (Tabela 3). Entre os 94 locos

observados para o lobo-guará , 64% foram polimórficos, e entre os 106 locos para o cachorro-do-

mato, 78% foram polimórficos (Tabela 3). Em média, o número total de locos e número de locos

polimórficos por primer foi maior no cachorro-do-mato do que no lobo-guará (Tabela 3).

49

Figura 4- Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o primer OPC-11

com alguns indivíduos da população de cachorro-do-mato. As colunas M 100bp, indicam o

marcador de peso molecular (100 bp ladder, Pharmacia).

Figura 5- Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o primer OPA-18

com alguns indivíduos da população de lobo-guará . As colunas M 100bp, indicam o marcador de

peso molecular (100 bp ladder, Pharmacia).

50

Tabela 3- Relação do número de locos e do número de locos polimórficos, por primer, em

amostras de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) e cachorro-do-mato (Cerdocyon thous).

Número de Locos Número de Locos Polimórficos (%) Primer

Cb Ct Cb Ct

OPH-04 14 11 12 (86) 10 (91)

OPH-19 8 11 5 (62) 7 (64)

OPP-07 9 10 6 (67) 7 (70)

OPP-08 9 12 6 (67) 10 (83)

OPP-09 8 11 6 (75) 10 (91)

OPP-15 10 12 6 (60) 8 (67)

OPC-11 13 15 5 (38) 14 (93)

OPC-05 12 13 8 (67) 13 (100)

OPA-18 11 11 6 (55) 8 (73)

TOTAL 94 106 60 (64) 78 (74)

Média 10,44 11,77 6,70 9,7

DP 2,18 1,48 2,18 2,5

Cb = Chrysocyon brachyurus; Ct = Cerdocyon thous; DP = Desvio Padrão.

O índice de similaridade de Jaccard, entre os pares de indivíduos, variou de 0,36 a 0,97

para a população de lobo-guará , e 0,35 a 0,91 para a população de cachorro-do-mato. Em média,

a similaridade genética foi ligeiramente maior na população de lobo-guará (0,75) do que na

população de cachorro-do-mato (0,68) (Figura 6).

51

Figura 6- Distribuição das similaridades de Jaccard, obtidas a partir dos dados RAPD para as

duas espécies estudadas, lobo-guará (A) e cachorro-do-mato (B).

(A)

(B)

52

Dados STR

Um total de 29 marcadores STR desenvolvidos originalmente para búfalos, bovinos,

cachorro doméstico e gato doméstico (Barker et al., 1997, Cânon et al., 2001, Denise et al., 2004,

Fries et al., 1993, Halverson et al., 1995, Kapes et al., 1997, Menotti-Raymond et al., 1999,

Sunden et al., 1993) foram testados e destes, seis primers (21%), amplificaram nas duas espécies

estudadas (ver Capítulo1).

As freqüências alélicas estimadas nas duas espécies são apresentadas nas Figuras 7 e 8. O

número de alelos encontrados por loco foi semelhante nas duas espécies, com exceção do loco

PEZ-12, para o qual a população de cachorro-do-mato apresentou 12 alelos (Figura 7) enquanto

que, na população de lobo-guará apenas dois alelos foram observados (Figura 8).

A média do número de alelos por loco foi de 7,8 na população de cachorro-do-mato e 4,5

na população de lobo-guará , sendo o máximo de alelos observados igual a 14 (PEZ-13 no

cachorro-do-mato) e o mínimo igual a um (CSSM-038 nas duas populações). Os Locos PEZ-05 e

PEZ-12 representam bem a variabilidade alélica existente entre as duas espécies (Figuras 9 e 10).

Enquanto que o primeiro loco apresentou uma pequena variação (seis alelos no cachorro-do-mato

e cinco alelos no lobo-guará ), no segundo loco, a variação foi maior, tendo sido detectados 12

alelos no cachorro-do-mato e apenas dois alelos na população de lobo-guará .

53

Figura 7- Freqüências alélicas dos seis locos STR, PEZ-05, PEZ-20, PEZ-13 (L-13), PEZ-15 (L-

15), CSSM-038 e PEZ-12, estimadas a partir de 38 indivíduos da população de cachorro-do-mato.

PEZ-05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

A B C D E F

alelos

freq

. alé

lica

PEZ-20

0

0,050,1

0,15

0,20,25

0,3

0,350,4

0,45

A B C D E F

alelos

freq

. alé

lica

L-13

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

A B C D E F G H I J K L M N

alelos

freq

. alé

lica

L-15

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

0,45

A B C D E F G

alelos

freq

. alé

lica

CSSM038

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

A

alelos

freq

. alé

lica

PEZ-12

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

a b c d e f g h i j k l m

alelos

freq

. alé

lica

54

Figura 8- Freqüências alélicas dos seis locos STR, PEZ-05, PEZ-20, PEZ-13 (L-13), PEZ-15 (L-

15), CSSM-038 e PEZ-12, estimadas a partir de 38 indivíduos da população de lobo-guará .

PEZ-05

00,10,20,30,40,50,60,7

A B C D E

alelos

freq

. alé

lica

PEZ-20

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

A B C D E F

alelos

freq

. alé

lica

L-13

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

A B C D E F G H

alelos

freq

. alé

lica

L-15

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

A B C D E

alelos

freq

. alé

lica

CSSM-038

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

A

alelos

freq

. alé

lica

PEZ-12

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

A B

alelos

freq

. alé

lica

55

Figura 9- Perfil eletroforético de um gel de poliacrilamida com marcadores STR, utilizando o

primer PEZ-05 com as duas populações analisadas: A = cachorro-do-mato e B = lobo-guará . M

indica o padrão de peso molecular 10 bp ladder, Pharmacia.

100 bp

120 bp

M M

M M Indivíduos 1 → 38

Indivíduos 1 → 38

A

B

80 bp

100 bp

56

Figura 10- Perfil eletroforético de um gel de poliacrilamida com marcadores STR, utilizando o

primer PEZ-12 com as duas populações analisadas: A = cachorro-do-mato e B = lobo-guará . M

indica o padrão de peso molecular 10 bp ladder, Pharmacia.

Os principais índices de diversidade gênica por loco, bem como as heterozigosidades

observadas e esperadas e o índice de fixação, são apresentados na Tabela 4. Desconsiderando o

primer CSSM-038, que foi monomórfico nas duas populações, a heterozigosidade observada

variou de 0,697 a 0,909, na população do cachorro-do-mato e de 0,553 a 0,914 na população de

lobo-guará . Já para a heterozigosidade esperada, a variação foi de 0,746 a 0,890 e 0,478 a 0,817

nas populações de cachorro-do-mato e lobo-guará , respectivamente. O índice de fixação

M M

M M Indivíduos 1 → 38

Indivíduos 1 → 32

A

B

M M

B

302 bp

230 bp

270 bp

250 bp 270 bp

250 bp

57

estimado em cada espécie através das heterozigosidades (Ho e He) em média foi igual a 0,032 no

cachorro-do-mato e -0,091 no lobo-guará , mas com grande variação entre os locos (Tabela 4).

Tabela 4- Estimativas de parâmetros de diversidade genética nas duas populações: cachorro-do-

mato (Ct) e lobo-guará (Cb), incluindo o Número de alelos observados (Na), Número efetivo de

alelos (Ne), Heterozigosidade observada (Ho), Heterozigosidade esperada (He) e o Índice de

fixação ou Coeficiente de Endogamia (F).

Na Ne Ho He F Locos

Ct Cb Ct Cb Ct Cb Ct Cb Ct Cb

PEZ-05 6 5 4,2 2,6 0,757 0,697 0,770 0,627 0,004 -0,129

PEZ-20 6 6 3,8 3,3 0,813 0,560 0,746 0,712 -0,011 0,197

PEZ-13 14 8 8,1 5,1 0,697 0,914 0,890 0,817 0,205 -0,135

PEZ-15 7 5 4,2 2,3 0,750 0,553 0,775 0,564 0,018 0,007

CSSM-038 1 1 1 1 0,000 0,000 0,000 0,000 ---- ----

PEZ-12 13 2 7,2 1,9 0,909 0,658 0,876 0,478 -0,055 -0,394

Média

DP

7,8

4,9

4,5

2,6

4,7

2,6

2,7

1,4

0,654

0,3

0,564

0,3

0,676

0,3

0,533

0,3

0,032

0,1

-0,091

0,2

DP = Desvio padrão.

Através do Teste Exato de Fisher verificou-se que, para a maioria dos locos estudados, as

duas populações se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg, com exceção do PEZ-13 na

população de cachorro-do-mato, e do PEZ-12 na população de lobo-guará (Tabela 5). Portanto,

na população de cachorro-do-mato existe uma deficiência de heterozigotos em relação ao PEZ-13

e um excesso de heterozigotos na população de lobo-guará , em relação ao PEZ-12.

58

Tabela 5- Probabilidades do Teste Exato de Fisher para aderência ao equilíbrio de Hardy-

Weinberg.

Locos Cachorro-do-Mato Lobo-Guará

PEZ-05 0,4913 0,4422

PEZ-20 0,5534 0,2679

PEZ-13 0,0000 0,8984

PEZ-15 0,6062 0,9376

CSSM-038 ---- ----

PEZ-12 0,6056 0,0343

Correlação entre as similaridades genéticas obtidas pelo RAPD e STR

O teste de Mantel mostrou que as correlações entre as similaridades genéticas obtidas a

partir dos dados RAPD e dos dados STR foram significativas, porém com valores de r de Pearson

muito baixos, evidenciando que os dois marcadores avaliam as relações existentes entre os

indivíduos de forma diferente (Tabela 6).

Tabela 6- Valores da correlação matricial (r) e o nível de significância (P) obtido a partir do

Teste de Mantel, associando a similaridade genética obtida a partir dos dados RAPD e dados STR

nas duas populações.

População r P

lobo-guará 0,2422 0,0056

cachorro-do-mato 0,2465 0,0126

59

DISCUSSÃO

Variabilidade Genética nas duas espécies estudadas

A interferência do Homem tem levado a um aumento significativo do isolamento de

populações naturais e, conseqüentemente, à perda de diversidade genética (Ceballos e Ehrlich,

2002; Frankhan, 1995). Portanto, a estimativa da diversidade genética em populações naturais,

principalmente naquelas que são consideradas vulneráveis à extinção, como o lobo-guará (IUCN,

2004), é essencial no que diz respeito à adoção de estratégias adequadas de manejo e conservação

de espécies. Vários estudos utilizando marcadores moleculares, como o RAPD e STR, têm

mostrado que estes são ferramentas bastante eficientes para monitorar a variabilidade genética

das populações (Klukowska et al., 2003; Parker et al., 1998; Wandeler et al., 2003).

Neste estudo pode-se observar que a amplitude de variação na similaridade genética

obtida com os dados RAPD foi muito próxima nas duas espécies estudadas, com valores de

similaridade de Jaccard variando de 0,36 a 0,97 no lobo-guará e entre 0,35 a 0,91 no cachorro-

do-mato. Porém, mesmo que a diferença tenha sido pequena, um maior número de indivíduos

com alto índice de similaridade genética (entre 0,8 e 0,9) foi observado na população de lobo-

guará (Figura 6). Este resultado é esperado, uma vez que densidade populacional do lobo-guará

é presumivelmente menor do que a do cachorro-do-mato, o que limita o fluxo gênico entre os

indivíduos, favorecendo a maior semelhança entre os mesmos. Por outro lado, na população de

cachorro-do-mato, que é uma espécie muito comum e abundante em todo o bioma cerrado e no

Parque Nacional das Emas, a proporção de indivíduos com alta similaridade foi menor e foram

observados índices menores do que na população de lobo-guará (Figura 6).

A diversidade genética obtida com os dados de STR, apresentou um nível relativamente

alto de multialelismo nos seis locos analisados, confirmando o elevado conteúdo de informação

genética esperado para este tipo de marcador. Para a população de lobo-guará a média foi igual

4,5 alelos por loco e, se desconsiderarmos o loco CSSM-038, (que foi monomórfico), essa média

60

aumenta para 5,2 alelos por loco. Esse valor foi maior do que o encontrado por De Mattos et al.,

(2004) em um estudo similar com o lobo-guará , onde a média de alelos por loco foi igual a 1,2,

porém utilizando marcadores isoenzimáticos. A média de heterozigosidade observada também foi

maior neste estudo, 56,4% do que a encontrada no estudo de De Mattos et al., (2004) que foi

igual a 5,7% e bem maior do que a encontrada no estudo de Rodrigues (2002), que foi igual a

1,4%, ambos utilizarando marcadores isoenzimáticos. Percebe-se que a escolha do marcador é

bastante crítica para avaliar o nível de variabilidade genética pois, os marcadores isoenzimáticos

evoluem mais lentamente. Portanto, em estudos em nível de população e/ou indivíduos, é

esperada pouca variabilidade e uma saturação de plesimorfias nos dados obtidos com isoenzimas,

ou seja, as semelhanças observadas são devidas a ancestralidade dos alelos e não há eventos

novos o bastante para discriminar os indivíduos estudados (Sole-Cava, 2001).

Quando se compara as estimativas de diversidade genética obtidas neste estudo com

vários estudos com populações de canídeos levantados da literatura, usando diferentes tipos de

marcadores moleculares (Microssatélites, M; Isoenzimas, I e Polimorfismos de Simples

Nucleotídeos, SNP), percebe-se uma grande semelhança entre estes resultados e os obtidos neste

trabalho (Tabela 7). Tanto o número médio de alelos por locos, como as heterozigosidades

esperadas e observadas e o coeficiente de endogamia (F) foram próximos, mesmo levando em

consideração os dados dos marcadores isoenzimáticos que tendem a diminuir a estimativas. O

número médio de alelos por locos obtidos neste estudo foi de 7,8 para o cachorro-do-mato e 4,5

para a população de lobo-guará , valores muito semelhantes aos apresentados na Tabela 7.

Quando considera-se os dados apenas dos marcadores STR, a média de alelos por locos será igual

a 4,3, valor bem próximo ao encontrado no lobo-guará . O mesmo ocorreu para os resultados das

médias das Heterozigosidades esperadas e observadas (He e Ho, respectivamente) e do Índice de

Fixação médio (F). Portanto, existe uma grande aproximação dos resultados obtidos,

61

principalmente para a população de lobo-guará , com os resultados de vários outros estudos com

canídeos na literatura (Tabela 7).

Em canídeos, a diversidade genética parece estar relacionada com o tamanho do corpo das

espécies, ou seja, em espécies menores, (exceto àquelas que estão ameaçadas de extinção), a

diversidade genética tende a ser maior do que em espécies maiores (Wayne, 1996). Esse padrão

pode ser explicado em função da área de ocupação dos indivíduos, onde espécies maiores terão

conseqüentemente uma área de vida mais restrita e portanto, uma menor diversidade genética em

decorrência do menor fluxo gênico. Considerando os resultados apresentados na Tabela 7 e

também os resultados obtidos neste estudo, percebe-se este padrão. Por exemplo, a espécie

Vulpes vulpes na qual em média o tamanho do corpo é de 40 cm, a diversidade genética média

(He = 0,7) foi maior que a observada no Canis lupus (120 cm) que apresentou He = 0,6 e bem

maior que a diversidade genética (He = 0,3) obtida para a espécie Cuon alpinus (90 cm), todos

resultados obtidos com marcadores STR (Sillero-Zubiri et al., 2004) (Tabela 7). Neste trabalho, o

cachorro-do-mato é uma espécie menor (em torno de 66 cm) que o lobo-guará (em torno de

105cm) (Sillero-Zubiri et al., 2004) e apresentou uma maior diversidade genética (He = 0,7).

O valor médio obtido de F pode ser considerado nulo ou muito baixo nas duas espécies

estudadas, indicando que as freqüências alélicas dessas espécies correspondem ao esperado pelo

modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg, neste momento. No entanto, o PEZ-13 e o loco PEZ-12,

no cachorro-do-mato e no lobo-guará , respectivamente, sugerem uma certa endogamia na

primeira e um excesso de heterozigotos na segunda população, significativos no Teste Exato de

Fisher. Como dito anteriormente, o cachorro-do-mato é uma espécie que costuma viver em

bandos, o que provavelmente favorece o cruzamento entre indivíduos aparentados e pode explicar

a endogamia detectada pelo PEZ-13. Já na população de lobo-guará , mesmo sendo uma espécie

vulnerável a extinção, ou seja, com um tamanho populacional mais restrito que a do cachorro-do-

mato, o excesso de heterozigotos detectado pelo primer PEZ-12 pode ser justificados pelo hábito

62

solitário da espécie, ou seja, os encontros ocorrem apenas no período reprodutivo e também

devido às áreas de vida serem grandes, favorecendo encontros aleatórios e não necessariamente

entre indivíduos aparentados geneticamente.

Como pode ser observada na Tabela 7, a maioria dos valores de F das populações de

canídeos são próximos de zero, o que corrobora os resultados obtidos neste estudo. Uma exceção

foi o Canis lupus, cuja população de museu apresentou endogamia elevada (F = 0,183). No

entanto, esse resultado pode ser devido um artefato do próprio processo de amostragem, uma vez

que nas outras populações os valores de F foram próximos de zero (Vilà et al., 2002). E para a

espécie Vulpes vulpes pode se observar um excesso de heterozigotos (F = -0,24) na população

urbana do oeste e endogamia (F = 0,10) na população urbana do leste (Wandeler et al., 2003).

Neste caso, a redução no tamanho das populações devido, por exemplo à fragmentação de

habitats, poderia explicar esses resultados.

Tabela 7- Estimativas de diversidade genética de várias populações de canídeos, usando

diferentes tipos de Marcadores Moleculares, incluindo o número médio de alelos por locos (Na),

Heterozigosidade esperada (He) Heterozigosidade observada (Ho), Índice de Fixação (F), tipo de

marcador e fonte.

População Na He Ho F Marcador Fonte Canis lupus Alaska a Quebec México

4,5 2,7

0,62 0,42

---- ----

---- ----

M Wayne, 1996

Canis lupus Escandinávia Finlândia

---- ----

0,36 0,34

0,35 0,31

0,027 0,088

SNP Seddon et al., 2005

Canis lupus Escandinávia Finlândia e Rússia Amostras de museu

3,8 8,0 5,7

0,55 0,77 0,71

0,59 0,70 0,58

-0,072 0,090 0,183

M Vilà et al., 2002

Canis latrans Alaska

5,9

0,68

----

---- M Wayne, 1996

Canis rufus Cativeiro

5,3

0,55

----

---- M Wayne, 1996

Canis aureus Kenya

4,8

0,52

----

---- M Wayne, 1996

63

Tabela 7 (Continuação). População Na He Ho F Marcador Fonte Canis mesomelas Kenya

5,0

0,67

----

---- M Wayne, 1996

Canis Simensis Etiópia

2,4

0,24

----

----

M Wayne, 1996

Lycaon pictus Leste da África Sul da África Botswana

3,3 3,5 3,6

0,54 0,56 0,59

---- ---- ----

---- ---- ----

M Wayne, 1996

Urocyon littoralis San Miguel Santa Rosa Santa Cruz San Nicolas Santa Catalina San Clemente

1,1 1,2 1,1 1,0 1,0 1,1

0,01 0,06 0,04 0,00 0,00 0,01

---- ---- ---- ---- ---- ----

---- ---- ---- ---- ---- ----

I Wayne, 1996

Urocyon littoralis San Miguel Santa Rosa Santa Cruz San Nicolas Santa Catalina San Clemente

1,8 2,1 2,4 1,0 2,6 2,4

0,20 0,29 0,31 0,00 0,36 0,29

---- ---- ---- ---- ---- ----

---- ---- ---- ---- ---- ----

M Wayne, 1996

Urocyon cinereoargenteus Continente Norte Americano

1,4

0,10

----

---- I Wayne, 1996

Urocyon cinereoargenteus Continente Norte Americano

6,1

0,69

----

---- M Wayne, 1996

Cuon alpinus Sul da Índia Leste da Indonésia

3,8 1,4

0,52 0,15

0,54 0,14

-0,038 0,066

M Iyengar et al., 2005

Vulpes vulpes Urbana do Leste Urbana do Oeste Rural do Leste Rural do Oeste Rural do Norte

6,6 5,4 6,9 7,0 7,2

0,70 0,54 0,75 0,75 0,76

0,63 0,67 0,68 0,71 0,73

0,100 -0,240 0,093 0,053 0,039

M Wandeler et al., 2003

Crysocyon brachyurus Nordeste de SP

1,2

0,055

0,06

-0,035 I De Mattos et

al., 2004 Média DP

3,55 2,18

0,40 0,27

0,51 0,22

0,027 0,10 ---- ----

DP = Desvio Padrão; M = Microssatélites; I = Isoenzima; SNP = Polimorfismo de Simples Nucleotídeos.

A alta diversidade genética encontrada nas duas espécies estudadas (lobo-guará e

cachorro-do-mato) pode ser função tanto de eventos históricos como de processos evolutivos

64

recentes. Como pouco se sabe sobre a história evolutiva das espécies aqui estudadas, as

explicações para os altos níveis de diversidade genética se assentam em inferências. Por exemplo,

uma explicação para a alta diversidade genética tanto no lobo-guará como no cachorro-do-mato

é que ambas são espécies altamente dispersivas, com áreas de vida grandes (ver capítulo 3) e

portanto, com níveis menores de estruturação populacional do que animais sedentários. Uma

outra situação que poderia ser avaliada em estudos futuros nestas duas espécies, principalmente

no lobo-guará , é a possibilidade de que o excesso de heterozigotos seja uma conseqüência do

processo de deriva genética recente, ou seja, em uma população recentemente reduzida, cuja

diversidade genética observada será maior que a esperada em equilíbrio (Luikart e Cornuet,

1998). É importante a identificação de populações que foram submetidas a uma redução drástica

do seu tamanho populacional. Assim sendo, será maior a probabilidade de que os possíveis

efeitos deletérios sejam evitados ou minimizados, através de procedimentos mitigadores de

manejo, como por exemplo a preservação adequada da área de ocupação da espécie, como a

criação de corredores ecológicos favorecendo um maior fluxo gênico entre populações vizinhas

(Luikart et al., 1998).

Outro aspecto importante a ser considerado é que esta alta diversidade genética

encontrada nas duas espécies foi baseada em marcadores considerados neutros (RAPD e STR).

Porém, em termos de variabilidade adaptativa e deletéria, que são difíceis de mensurar, a

variabilidade genética nestas espécies pode ser baixa (Hedrick, 2001). No entanto, seria

interessante em outros estudos quantificar a extensão do efeito evolutivo que se detecta com

marcadores neutros e assim avaliar se é provável que esta alta diversidade tenha conseqüências

biológicas importantes, ou se é devido simplesmente ao alto poder estatístico desses marcadores.

Hedrick (2001), descreve alguns estágios possíveis de associação da significância estatística dos

marcadores moleculares neutros e a importância biológica detectada por estes. Pode acontecer de

não haver diferenças biológicas importantes e não haver significância estatística ou haver uma

65

diferença estatisticamente significante entre os indivíduos, refletindo uma diferença biológica

importante Neste caso, as estatísticas baseadas nestes marcadores moleculares resultam em uma

apropriada avaliação da real situação biológica das espécies (Hedrick, 2001). Porém, os

problemas aparecem quando a significância estatística não reflete a insignificância biológica, ou

vice versa. Por exemplo, pode ocorrer do marcador neutro não detectar significância estatística

entre indivíduos com uma diferença biológica importante, devido à ocorrência de alto fluxo

gênico ou fortes forças seletivas. Portanto, a interpretação dos resultados de marcadores

altamente variáveis, como os estudados neste trabalho (STR’s), deve ser realizada com algumas

precauções, pois as diferenças estatisticamente significantes podem deixar de refletir diferenças

biologicamente importantes (Balloux et al., 2000; Hedrick, 2001; Hedrick, 1999).

Comparação entre os Marcadores RAPD e STR

Existem certas dificuldades em adotar as técnicas moleculares mais eficientes, do ponto

de vista evolutivo, a fim de mensurar a diversidade genética das espécies. Por exemplo, sabe-se

que os marcadores STR e RAPD evoluem rapidamente, portanto são mais úteis para estimativas

de diversidade genética em nível de indivíduos, famílias e populações, enquanto que marcadores

que evoluem mais lentamente, como as Isoenzimas, são melhores utilizados no estudo de

espécies ou táxons supra-espeíficos. No caso dos marcadores RAPD, em termos de custo,

especificidade do primer, quantidade de amostra (DNA) e tempo despendido no procedimento, é

uma técnica mais simples, o que facilita o estudo. No entanto, o caráter dominante do marcador

limita o seu uso na estimativa dos parâmetros genéticos. Há alguns trabalhos que também

discutem a baixa repetência do RAPD, devido a sensibilidade da técnica à fatores como qualidade

e concentração do DNA (Ellsworth et al., 1993).

Os marcadores STR constituem uma poderosa ferramenta para este nível de estudo, ou

seja, a detecção da diversidade genética em nível de populações. No entanto, o alto custo e tempo

66

gastos no desenvolvimento de primers específicos dificultam bastante o uso dos mesmos. Porém,

diversos estudos têm mostrado a possibilidade de amplificação cruzada entre diferentes espécies

e gêneros (Cipriani et al., 1999; Colevati et al., 1999; Roa et al., 2000; Tong et al., 2002;

Williamson et al., 2002; Zucchi et al., 2002, ver capítulo 1). Outro aspecto importante do

marcador STR é a alta taxa de mutação quando comparada com outros marcadores dentro do

mesmo genoma, que são causadas primariamente por alterações no comprimento das unidades de

repetição. Esta alta taxa de mutação constitui, por outro lado, uma limitação do marcador, pois

pode aumentar substancialmente o poder estatístico do marcador e superestimar o nível de

diversidade genética entre os indivíduos de uma população com baixas diferenças biológicas

importantes (Hedrick, 2001). Pode-se, portanto, fazer suposições enganadas de medidas de

conservação das espécies estudadas. Por exemplo, no caso de uma população apresentar alta

diversidade genética (detectada pelos marcadores RAPD ou STR’s) pode-se inferir que esta

população num dado momento não necessita de intervenções para fins de manejo e conservação

adequados. No entanto, pode existir uma alta proporção de alelos deletérios “escondidos” nos

indivíduos heterozigotos ou uma baixa variabilidade adaptativa que não são detectados por estes

marcadores. Portanto, esses resultados podem afetar a tomada de decisões a cerca do manejo e

conservação das espécies.

Neste estudo, foram utilizados os dois marcadores, RAPD e STR, na análise da

variabilidade genética em duas espécies de canídeos do cerrado, para em seguida comparar a

informação gerada por cada um destes marcadores. Estudos que realizaram uma comparação

direta entre dados gerados por RAPD e STR em espécies animais são limitados. Entretanto, pode

ser bastante interessante realizar esta comparação a fim de enriquecer as informações geradas por

cada técnica.

Neste estudo, o teste de Mantel mostrou baixas correlações significativas (em torno de

0,24) entre as similaridades genéticas obtidas com RAPD e STR, o que pode ser parcialmente

67

explicado pela base molecular diferente dos dois marcadores. Alguns eventos genéticos, tais

como recombinação e inserção, não influenciam no polimorfismo gerado pelos marcadores STR

(Mengoni et al., 2000). Ao contrário, a variação observada por meio do RAPD reside em muitos

tipos diferentes de eventos mutacionais, com diferentes implicações evolutivas que ocorrem no

local de anelamento do primer e entre os dois locais adjacentes responsáveis pela amplificação

(Mengoni et al., 2000). Ou seja, os dois marcadores detectaram alta diversidade genética nas duas

espécies estudadas, no entanto de maneiras diferentes, ou seja, baseado em informações genéticas

de regiões diferentes do genoma e que provavelmente terá implicações evolutivas diferentes. No

caso dos marcadores RAPD, as regiões amplificadas são desconhecidas, ou seja, não se sabe se

trata de regiões codificantes ou não do genoma, havendo vários estudos que discutem esta

questão. Mas, de um modo geral esses marcadores são classificados como neutros (Mengoni et

al., 2000). Já para os marcadores STR existem numerosos estudos que demonstram uma

significância funcional dos mesmos, como por exemplo regulação da recombinação e replicação

do DNA, regulação da atividade gênica e do ciclo celular e organização estrutural dos

cromossomos (Gur-Arie et al., 2000; King e Soller, 1999; Li et al., 2002).

Uma outra possível explicação para as diferenças observadas neste estudo está no

procedimento de análise dos dados gerados pelos marcadores STR como caracteres simples, não

permitindo um tratamento de acordo com o modelo mutacional stepwise, usado para estes

marcadores, onde a mutação para um novo alelo de um determinado marcador STR ocorre em

passos, assim alelos com tamanhos mais próximos são considerados mais similares do que alelos

com tamanhos mais distantes (Mengoni et al., 2000).

Vários outros estudos confirmam essa baixa correlação entre os dados gerados por RAPD

e STR (Mengoni et al., 2000; Pejic et al., 1998; Powell et al., 1996; Russell et al., 1997). Porém

alguns estudos mostram que a combinação dos dois marcadores foi eficiente para demonstrar o

relacionamento esperado entre variedades de Alfafa (Medicago sativa) (Mengoni et al., 2000).

68

Portanto, a combinação dessas duas tecnologias pode ser vantajosa para elucidar relacionamentos

genéticos entre populações naturais, principalmente em estudos que consideram escalas menores

de relacionamento entre indivíduos, como este estudo entre variedades de Alfafa.

Estratégias de Conservação e Manejo

A melhor estratégia para proteção em longo prazo da diversidade biológica é a

preservação de populações no ambiente selvagem (preservação in situ) (Primack e Rodrigues,

2001). No entanto, para espécies que exigem grandes áreas de vida, como as estudadas aqui, uma

maneira alternativa para evitar que estas sejam extintas, são programas de criação em cativeiro,

ou ainda o monitoramento intensivo destas espécies em pequenas áreas protegidas conectadas

com corredores de dispersão, que são faixas de habitats que ligam dois ou mais fragmentos

(Rodrigues, 2002). O lobo-guará é uma espécie de difícil manutenção em cativeiro (Primack e

Rodrigues, 2001), de modo que a preservação da área ocupada por esta espécie parece ser a única

alternativa eficiente para sua conservação.

As duas espécies aqui estudadas distribuem-se amplamente pelos cerrados brasileiros

(Sillero-Zubiri et al., 2004). A principal causa do declínio das populações destas espécies,

principalmente do lobo-guará , é a redução drástica do ambiente em que vivem, sendo que na

maioria das vezes suas áreas de distribuição já foi ocupada por empreendimentos agropecuários

(Fonseca et al., 1994). A fragmentação de habitats é hoje uma das maiores ameaças à diversidade

biológica, tanto pela redução dos ambientes naturais como pela divisão dos habitats

remanescentes em fragmentos menores (Meffe e Carroll, 1997; Soulé e Kohm, 1989). No caso do

lobo-guará , além das ameaças inerentes ao pequeno tamanho populacional, devido a fatores

demográficos e genéticos, esta espécie está sujeita a outras ameaças externas, que são importantes

causas de mortalidade e conseqüentemente diminuição do tamanho populacional. Essas ameaças

69

incluem atropelamentos, abates por chacareiros do entorno da área de ocupação da espécie e a

introdução de espécies exóticas, patógenos e parasitas.

Os canídeos estão entre os mamíferos que mais sofrem com atropelamentos (Rodrigues,

2002; Silveira, 1999; Vieira, 1996). Vários estudos identificam os atropelamentos como a

principal causa de mortalidade de Lobos Guarás, e possivelmente do cachorro-do-mato ( Silveira,

1999; Silva et al., 2000; Rocha et al., 2004). A grande mobilidade destas espécies e o

comportamento de comer carcaças de outros animais atropelados, aliado ao excesso de

velocidade dos motoristas, justifica essa alta suscetibilidade. Rodrigues (2002) encontrou em seu

estudo na Estação Ecológica de Águas Emendadas-DF, uma média de 4,5 atropelamentos de

Lobos Guarás por ano, sendo que essa média pode estar subestimada, pois alguns indivíduos

atropelados podem conseguir sair da estrada e mover para dentro da reserva sem serem

detectados. A solução para os problemas de atropelamentos em unidades de conservação envolve

vários segmentos da sociedade, desde o governo à própria população. As principais medidas a

serem adotadas para a redução das mortes por atropelamentos são: redução do limite de

velocidade permitida nos limites com as reservas, instalação de meios de controle desta

velocidade, como radares, limpeza periódica da beira da estrada possibilitando uma melhor

visibilidade dos animais e dos motoristas e campanhas de educação dos motoristas e da

comunidade do entorno, etc (Rodrigues, 2002; Silveira, 1999).

Vários estudos também mostram que os Lobos Guarás são mortos por chacareiros nos

limites das reservas, por predarem animais domésticos, porém parece que esta causa de

mortalidade é menos importante que os atropelamentos (Rodrigues, 2002; Silveira, 1999). No

entanto, é necessário instituir um plano de Educação Ambiental na região a fim de mostrar a

importância destas espécies para os ecossistemas e para o ser humano.

A invasão de animais domésticos, principalmente cachorros, é outra fonte de risco de

mortalidade destas espécies. Segundo Primack e Rodrigues (2001), a introdução de espécies

70

exóticas é uma séria ameaça à vida silvestre e tem levado várias espécies nativas a extinção. No

caso do cachorro doméstico, ele interage com espécies nativas, como o lobo-guará e o cachorro-

do-mato, através da predação, competição por recursos limitados e introdução de doenças

(Primack e Rodrigues, 2001; Rodrigues, 2002). Marinho-Filho et al., (1998), relatou vários casos

de ataques de matilhas a animais silvestres na Estação Ecológica de Águas Emendadas-DF. Em

outros estudos foi observada a competição entre canídeos domésticos e lobos (Canis lupus), que

poderia estar relacionada a causas de extinção destas populações (Boitani e Ciucci, 1995;

Mendelssohn, 1983). Rodrigues (2002), indica que uma possível solução para a minimização dos

problemas causados pela introdução de cachorros domésticos em áreas protegidas seria a

esterilização em massa desses cães domésticos, mas que provavelmente não seria facilmente

aceita pela população humana. Uma outra solução alternativa seria instituir um programa de

vacinação e acompanhamento sanitários dos animais, a fim de minimizar os efeitos da

transmissão de doenças letais que também ocorrem freqüentemente (Primack e Rodrigues, 2001).

Se levado em consideração os parâmetros genéticos estimados no presente trabalho (alta

diversidade genética nas duas espécies estudadas), é interessante considerar a questão da validade

e necessidade de se realizar translocações de animais com o objetivo de elevar a diversidade

genética. Existem estudos (Campbell, 1980) que mostram os efeitos negativos dos translocações,

como por exemplo à impossibilidade de adaptação dos animais ao local que foram introduzidos, a

diluição da freqüência de genes adaptados, introdução de doenças, etc (Hedrick, 2001).

Rodrigues (2002) testou o translocação de três Lobos Guarás na Estação Ecológica de Águas

Emendada-DF e após poucos dias, nenhum dos indivíduos foi registrado na área. Assim sendo, a

translocação de animais em função principalmente de seus pontos negativos parece não ser uma

ferramenta de manejo efetiva. Como os dados obtidos neste trabalho não indicam uma

significativa redução na variabilidade genética e nem endogamia elevada, talvez esta estratégia

71

não seja necessária para estas espécies no PNE, pelo menos no sentido de ampliar a variabilidade

genética existente atualmente.

Contudo, o maior impacto humano nas populações de canídeos silvestres, é a redução e

fragmentação de habitats causados principalmente pelo avanço das fronteiras agrícolas que não

tem demonstrado uma preocupação como o desenvolvimento sustentável da região. São nítidos

os efeitos ecológicos e genéticos da fragmentação de habitats e estes devem ser estudados para

serem incorporados em planejamentos de manejos de espécies ameaçadas (ver capítulo 4). Por

exemplo, a conectividade entre reservas é um fator importante a ser manejada, pois pequenas

populações têm alta probabilidade de extinção. Mas, se este fator for contrabalançado por

recolonização de subpopulações existentes em um sistema de áreas protegidas (ligar o Parque

Nacional das Emas a outras reservas) a metapopulação poderá existir por muito mais tempo

(Meffe e Carroll, 1997). Neste sentido, fica clara a grande necessidade de se desenvolver estudos

mais específicos sobre a ecologia e principalmente sobre o padrão de dispersão destas espécies,

aliado a uma educação ambiental eficiente das populações do entorno do PNE, para que

estratégias de conservação sejam mais bem estabelecidas.

72

AGRADECIMENTOS

Aos colegas do Laboratório de Genética e Melhoramento da Universidade Católica de Goiás –

UCG, Gabriela C. Pádua, Nicole C. L. Dutra, Prof. Dr. Breno de Faria e Vasconcellos, Lorenna L.

de Souza, Luciana M. Bossois e os demais estagiários que nos ajudaram nas análises genéticas. A

todo o pessoal do Parque Nacional das Emas - PNE, principalmente os estagiários que realizaram

os trabalhos de campo. Ao CNPq pelo financiamento de nossas pesquisas dentro do programa

PRONEX para análise de áreas prioritárias para conservação da biodiversidade no Cerrado e em

Goiás. (CNPq/SECTEC-GO, Proc. No. 23234156). JAFD-F recebe uma bolsa de Produtividade

em Pesquisa nível 1B do CNPq.

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CAPÍTULO 3

84

Artigo a ser submetido: Genetics and Molecular Biology

Relacionamento Genético e Organização Espacial em uma

População de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus, Illiger, 1815) do

Parque Nacional das Emas - Goiás

FLÁVIA MELO RODRIGUES1, 8, JOSÉ ALEXANDRE FELIZOLA DINIZ FILHO2, 3, 5, 8,

MARIANA PIRES DE CAMPOS TELLES4, 5, LUCILEIDE VILELA RESENDE4, NATÁLIA

MUNDIM TÔRRES5, 7, ANAH TEREZA DE ALMEIDA JÁCOMO5, LEANDRO SILVEIRA5,

THANNYA NASCIMENTO SOARES4, CYNTIA K. KASHIVAKURA5, MARIANA M.

FURTADO5, CLAUDIA FERRO5 E SAMUEL ASTETE5 1Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Goiás (UEG), Anápolis, GO; 2Departamento de Biologia, Universidade Católica de Goiás (UCG); 3Departamento de Biologia

Geral, ICB, Universidade Federal de Goiás (UFG); 4Laboratório de Genética e Melhoramento,

Departamento de Zootecnia/ITS, Universidade Católica de Goiás (UCG); 5Fundo para a

Conservação da Onça-Pintada (FCOP); 7Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal,

Universidade de Brasília (UnB); 8Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais – UFG.

Resumo

O lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) é o maior canídeo sul americano, estando incluído

entre as espécies de mamíferos ameaçadas de extinção desta região, principalmente devido à

transformação da paisagem natural em áreas de sua ocorrência por atividades de desmatamento,

queimadas, agricultura e urbanização. Suas áreas de vida costumam ser grandes e com grandes

variações. O objetivo deste trabalho foi analisar a associação entre a similaridade genética,

mensurada através de marcadores RAPD e STR, com a sobreposição de áreas de vida da

população de lobo-guará do Parque Nacional das Emas, GO (PNE). Entre abril/2002 e

novembro/2003, foram capturados 27 Lobos Guarás, colocados os rádio-colares e coletado

sangue para as análises genéticas. Após as análises genéticas via PCR, os fragmentos

amplificados com os marcadores RAPD foram separados em gel de agarose 1,4% e visualizados

por coloração com brometo de etídio, e aqueles fragmentos obtidos com os marcadores STR

foram separados em gel de poliacrilamida a 4% e visualizado por coloração com nitrato de prata.

Os dados binários foram utilizados para o cálculo do índice de similaridade de Jaccard. Os dados

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ecológicos foram coletados a partir do monitoramento destes animais por rádiotelemetria no PNE

e as áreas de vida foram estimadas através do método Mínimo Polígono Convexo (MPC),

considerando 80, 90 e 100% dos pontos. Para testar a relação entre a similaridade genética e o

padrão espacial de dispersão dos indivíduos foi utilizado o teste de Mantel, com 5000

permutações. Os nove primers utilizados nas reações RAPD produziram um total de 91 locos,

sendo 42 polimórficos. Um total de 27 locos foi obtido com os marcadores STR e destes 89 %

foram polimórficos. Em média, o tamanho da área de vida dos Lobos Guarás do PNE foi muito

grande, 74,18 ± 44,18 km2 (n = 13) para os machos e 89,70 ± 54,11 km2 (n = 14) para as fêmeas.

A associação entre as similaridades genéticas e espaciais, medidas pelo teste de Mantel, foi

significativa apenas entre os machos (r = 0,247, P = 0,02 para MPC 80% e r = 0,23, P = 0,02 para

MPC 90%), quando considerados os dados gerados pelos marcadores RAPD. Já a associação

entre a similaridade genética, obtida com os marcadores STR, e a similaridade espacial foi

significativa entre os indivíduos de ambos os sexos e entre as fêmeas (r = 0,182, P = 0,03 para

MPC 80%, r = 0,197, P = 0,03 para MPC 90%, r = 0,248, P = 0,002 para MPC 100%

considerando os indivíduos de ambos os sexos e r = 0,236, P = 0,049 para MPC 100%

considerando apenas as fêmeas). Os resultados baseados nos marcadores RAPD, mostraram uma

estruturação espacial da similaridade genética apenas para os machos, concordando com a

hipótese de que a distribuição espacial entre os machos não é aleatória. Isso sugere que este

padrão pode ter sido gerado pela associação da disponibilidade de recursos críticos (i.e. água)

com o nível de parentesco genético. Enquanto, que os resultados obtidos com os marcadores STR

mostraram uma estruturação espacial da variabilidade genética de acordo com o padrão de

filopatria feminina. Como o padrão obtido com os marcadores STR é mais esperado, e possível

que os resultados com os marcadores RAPD sejam artefatos.

Palavaras-Chave: lobo-guará, Área de vida, Rádiotelemetria, Marcadores RAPD, Marcadores

STR.

Enviar correspondência para FM Rodrigues. Universidade Estadual de Goiás, Departamento de

Biologia, Unidade Universitária de Ciências Extas e Tecnológicas, BR 153, Km 3, Campus

Anápolis, CEP: 75110-390, Caixa Postal: 459, Anápolis, GO, Brasil. E-mail: flavia.melo@ueg.br

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Abstract

The Maned wolf (Chrysocyon brachyurus) is the biggest canid of south america included

in the mammal species threatened by extincition list in the region. One of the main reasons is the

transformation of its natural habitat caused by deforestation, fires, agriculture and urbanization.

It’s living areas are usually big and varied. The goal of this paper was to analyse the association

of genetic similarities measured by RAPD and STR markers with the overlap of areas in the life

of the Maned wolves from Ema’s National Park (GO). Between April 2002 and November 2003,

27 individuals were captured, radio-collars were placed on them and their blood was drawn for

genetic analysis. After the analysis via PCR, the amplified fragments with RAPD were separated

in agarosis gel 1.4% and colored with bromite etidium, the fragments obtained with STR were

separated in poliacrilamide gel 4% and colored with silver nitrate. The binary data was used to

find Jaccard’s similarity index. The ecological data was obtained by monitoring these animals

through radiotelemetry and its living areas were estimated by the Minimum Convex Poligon

(MCP) method, considering, 80, 90 and 100% of the points. To test the relation between genatic

similarity and living area deviation standard for the animals, the Mantel test with 5000

permutations was used. The nine primers used in RAPD reactions produced 91 locus, 42 of them

polimorphic. A total of 27 locus was obtained with STR markers and 89% of these were

polimorphic. In average, the size of the area for the Maned wolf in the ENP was of 78,18 +

44,18km2 (n=13) for males and 89,70 + 54,11km2 (n=14) for females. The association between

the genetic and territorial similarities was significant amongst both genders. Between females

( r=0,182, p=0,03 for MPC 80%; r=0,197, p=0,03 for MPC 90%; r=0,248, p=0,002 for MPC

100%). The results using RAPD markers showed a territorial structure based on genetic

similarities only for males, which coincided with the hipothesis that territorial distribution od

males isn´t random. This suggests that this pattern could have been generated by the associaition

of critical resourse avalability (i.e. water) with the level of genetic links. The data from the STR

presented territorial genetic variability according to the females, as the standard obtained by the

STR markers is most expected, it is probable that the results obtained by RAPD are artifacts.

Key words: Maned wolf, living areas, territorial distribution, tadiotelemetry, RAPD markers ,

STR markers.

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INTRODUÇÃO

O lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) é o maior canídeo sul americano, e quando adulto

pode pesar cerca de 25 Kg e medir 90 cm de altura nos ombros e comprimento total entre 145 a

190 cm, sendo a cauda responsável por 45 cm (Mantovani, 2001; Einsenberg e Redford, 1999).

Está incluído entre os mamíferos sul-americanos ameaçados de extinção, principalmente em

função da transformação da paisagem natural, em áreas de sua ocorrência por atividades de

desmatamento, queimadas, agricultura e urbanização (IBAMA, 2003) e também devido à

perseguição dos pecuaristas, principalmente porque acreditam que os Lobos Guarás predam seus

animais domésticos (De Mattos et al., 2004; Fonseca et al., 1994; Silva e Talomi, 2004). A área

de ocorrência original desta espécie compreende a região central do Brasil, o Paraguai, Bolívia,

extremo leste do Peru, nordeste da Argentina e Uruguai, sempre em regiões de vegetação aberta,

como campos e Cerrados. (Dietz, 1985). Está extinto no Uruguai e na Argentina ao sul do Rio da

Prata (Kimberley, 1998). A alimentação consiste principalmente de pequenos animais (roedores,

aves, répteis, etc) e de alguns frutos (fruta do lobo – lobeira e guabiroba) (Motta-Junior, 1996;

Lombardi e Motta-Júnior, 1993; Consorte-McCrea, 1994; Maia e Gouveia, 2002; Mota-Junior,

2002; Jácomo et al., 2004). Esta espécie apresenta funções ecológicas imprescindíveis para a

estabilidade do ecossistema do cerrado, principalmente por ser topo de cadeia alimentar e pela

função como dispersor de sementes, dada a característica onívora de sua dieta (De Mattos, 2003).

O lobo-guará é territorialista, isto é, principalmente na época de reprodução, o casal

demarca uma área geográfica onde não admite a presença de outros indivíduos, e portanto

delimita o seu território. É monógamo facultativo, sendo comum à manutenção do par

reprodutivo, e se apresenta mais ativo ao entardecer e à noite (Dietz, 1984). São animais

solitários e interações entre o casal ocorrem apenas no período reprodutivo que, em cativeiro, se

concentra nos meses de dezembro a junho (Ginsberg e Mcdonald, 1990). Espécies solitárias são

aquelas que têm encontros raros com adultos co-específicos e estão geralmente sozinhos durante

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períodos de atividade, tal como o forrageamento (Ratnayeke et al., 2002; Waser e Jones, 1983).

No entanto, um estudo realizado com a população de lobo-guará do Parque Nacional das Emas

(PNE) em Goiás, observou alguns casais forrageando juntos, onde sempre era registrado que os

machos defecam sobre as fezes das fêmeas para demarcar território (Silveira, 1999).

A área de vida do lobo-guará costuma ser grande, variando de 21 a 30 km2 na Serra da

Canastra, MG (Dietz, 1984), entre 54 e 115 km2, no município de Águas de Santa Bárbara, SP

(Carvalho e Vasconcellos, 1995) e de 4,67 a 79 km2 no Parque Nacional das Emas, GO (Silveira,

1999). A população do PNE apresenta dois picos de atividade, sendo um entre 8:00 e 10:00h da

manhã e outro entre 20:00 e 22:00h. No entanto, observou-se que o período de atividade da

espécie é mais dependente da umidade relativa do ar e temperatura do que do horário do dia

(Jácomo et al., 2004). Em tempos de clima frio, céu nublado ou após chuva, é possível observar

lobos guará forrageando a qualquer hora do dia (Silveira, 1999).

Geralmente, a área de vida de um animal compreende uma área heterogênea, determinada

por fatores físicos e biológicos, explicando algumas desproporcionalidades no uso de espaço por

algumas espécies (Silva e Talamoni, 2004). A área de uso intensivo tem sido considerada a área

central do home range do animal, que pode estar altamente relacionada com a disponibilidade de

recursos, como o alimento (Silva e Talamoni, 2004). Portanto, são as áreas mais freqüentemente

usadas pelo animal, que são baseadas na média harmônica de uma área de distribuição, também

definidas como centro de atividade (Dixon e Chapman, 1980; Tanaka, 1980). Identificar estas

áreas é de fundamental importância para entendermos a biologia de muitas espécies, incluindo a

interação entre os indivíduos e entre estes com o meio ambiente (Silva e Talamoni, 2004).

Estudos com outros carnívoros solitários, como o guaxinim (Procyon lotor) mostram uma maior

dispersão entre os machos e a filopatria feminina foi uma observação comum. Entretanto,

dispersão entre fêmeas jovens foi também relatado (Cowan, 1973, Ratnayeke, 1997; Ratnayeke et

al., 2002). Para fêmeas de mamíferos que investem muito nos cuidados de seus descendentes,

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benefícios ecológicos e sociais são fortes fatores a favor da filopatria feminina (Ratnayeke et al.,

2002).

A criação e manutenção de unidades de conservação em áreas de ocorrência do lobo-

guará representam uma estratégia para a conservação da espécie. Embora existam unidades de

conservação implantadas em áreas de cerrado, a área total destas unidades compreende apenas

2% da área total do bioma em questão (Myers, 2000). Ao mesmo tempo, é importante lembrar

que áreas de preservação não oferecem todas as condições necessárias ao estabelecimento de uma

população mínima viável e, portanto não garantem a manutenção da mesma em longo prazo. Um

problema comum é o isolamento das populações em áreas de preservação, que é agravado na

proporção em que estas áreas tornam-se menores e mais distantes entre si, em uma paisagem cujo

uso do solo encontra-se bastante modificado e inadequado para as espécies animais existentes.

Shaffer (1981) definiu que uma população mínima viável para qualquer espécie em um

determinado habitat é a menor população isolada que tenha 99% de chances de continuar

existindo por 1000 anos, a despeito dos efeitos previsíveis de estocasticidadades genética,

ambiental e demográfica, e de catástrofes naturais (Primack e Rodrigues, 2001). No entanto,

pouco se sabe a respeito de informações demográficas e genéticas da maioria das espécies,

dificultando a definição deste número mínimo viável.

Alguns marcadores moleculares, tais como, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

e Microssatélites, também conhecidos por marcadores STR (Short Tandem Repeats), têm sido

bastante utilizados para se realizar uma caracterização inicial da variabilidade genética presente

nas populações, a fim de monitorar a variabilidade genética nas espécies, objetivando subsidiar

estratégias de acasalamento e introdução de novos indivíduos na população (Rodrigues et al.,

2004). Assim, a manutenção da diversidade e conseqüentemente o aumento da probabilidade de

viabilidade desta população ao longo do tempo são garantidos, uma vez que pequenas populações

sujeitas à deriva genética são mais suscetíveis a efeitos genéticos deletérios, tais como depressão

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endogâmica, perda de flexibilidade evolucionária e depressão exogâmica (Ellstrand e Elam, 1993;

Frankham et al., 2003).

O objetivo deste trabalho foi analisar a associação entre a similaridade genética coma a

similaridade espacial (sobreposição de área de vida) e distância espacial (área central) em uma

população de lobo-guará do Parque Nacional das Emas-GO. Deste modo, foram levantadas

informações da espécie no que diz respeito a sua variabilidade genética e estrutura populacional,

fornecendo informações que podem vir a ser relevantes em futuros processos de manejo e

preservação da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de estudo

O estudo foi realizado na maior área de cerrado conservado do sistema de Parques

Nacionais Brasileiros, o Parque Nacional das Emas (PNE). São 132.000 hectares localizados no

sudoeste do Estado de Goiás, próximo ao limite com o Mato Grosso do Sul e Mato Grosso, a

18o19’S e 52o45’E (Figura 1) (Silveira, 1999). Sua altitude varia de 650 a 1000m e possui um

clima seco acentuado, de abril a setembro, com temperaturas podendo atingir a marca de 0o C

onde, é comum a ocorrência de geadas (IBDF/FBCN, 1981). A vegetação do parque corresponde

a aproximadamente 95% de área com predomínio do campo sujo, além de outras vegetações

menos comuns como, mata ciliar, campo úmido, vereda, campo limpo, campo cerrado, cerrado

“Strictu sensu”, cerradão, dentre outras (IBDF/FBCN, 1981).

91

Figura 1. Localização do Parque Nacional das Emas - GO.

Aproximadamente doze espécies de mamíferos ameaçadas de extinção, conforme

classificação da IUCN (International Union for the Conservation of Nature) e CITES

(Convention on International Trade in Endangered Species) (Fonseca et al., 1994) são protegidas

no PNE, como por exemplo o tamanduá bandeira (Myrmecophoga tridactyla), o veado campeiro

(Ozotocerus bezoarticus), o cachorro do mato vinagre (Speothos venaticus) e o lobo-guará

(Chrysocyon brachyurus) (Silveira, 1999). A vegetação nativa do entorno do Parque, devido os

programas de incentivo do Governo Federal para a abertura de novas fronteiras agrícolas, deu

lugar a extensas lavouras de grãos, como soja e milho, isolando o PNE do contato direto com

92

outras áreas nativas (Silveira, 1999). Outro problema grave sofrido pelo PNE é o manejo

inadequado de agrotóxicos nas lavouras do seu entorno, nas cabeceiras dos Rios Formoso e

Jacuba, além do atropelamento de animais do Parque na rodovia GO-341, que margeia 25

quilômetros de seu limite oeste (Silveira e Jácomo, 1998).

Dados da Área de Vida

Entre abril de 2002 e novembro de 2003, foram armadas 71 armadilhas em vários pontos

do PNE, sendo 45 do tipo “gaiola” com compartimento para isca viva e 26 do tipo “trampa”. As

armadilhas tipo “gaiola” foram dispostas a cada 1,5 km e iscadas com galinhas ou pombos vivos

e as “trampas” iscadas com um produto comercial feito de extrato de glândulas de cheiro de

carnívoros. Os esforços acumulados foram de 291 armadilhas-noite para as gaiolas e 77

armadilhas-noite para as “trampas”.

Foram capturados 38 Lobos Guarás, dos quais 27 foram considerados nas análises por

apresentarem disponibilidade dos dados de área de vida. A contenção química dos animais foi

feita através da aplicação intramuscular do anestésico Zoletil (250 mg), sendo que a dose

variou de 0,5 a 1,5 ml, de acordo com o peso do animal. Para cada animal capturado foi feita a

biometria, análise clínica, estimativa de idade através de desgaste dentário, coleta de

ectoparasitos, urina, esfregaço vaginal, sangue e colocação de rádio-colares. Foi coletado ao

menos 10 mL de sangue, utilizando tubos vacutainer contendo EDTA, que foram utilizados para

análises de doenças, dosagem hormonal e análise genética. Depois de coletado, o sangue foi

acondicionado em um volume igual de um tampão denominado Easy Blood e armazenado em

geladeira, que auxilia na conservação do material até chegar ao laboratório para a extração do

DNA.

Os rádio-receptores e colares utilizados (Advanced Telemetry Systems, Inc.) nos

indivíduos funcionam através de ondas de rádio VHF (faixa de 150 a 152 MHz), com baterias de

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duração de 36 a 42 meses. Todos os colares possuem uma freqüência individual e emitem sinais

(pulso), captados pelo rádio-receptor. Os rádios transmissores utilizados são sensíveis às

variações de movimentos dos animais, indicando se o animal está se movimentando (ativo), se

está parado (inativo), ou morto. O monitoramento por rádiotelemetria foi feito de carro, a pé, ou

de avião (Cessna 172), conforme a necessidade e acessibilidade em campo. Foi utilizado o

método da triangulação (White e Garrot, 1990), no qual são tomadas pelo menos duas direções

(azimute) do sinal do transmissor, cada direção tomada de um ponto diferente no terreno, de

modo a formar um triângulo, com o auxílio de uma bússola e GPS (Sistema de Posicionamento

Global) permitindo a identificação da localização. O resultado do estudo de área de vida é

apresentado na forma numérica, geralmente em km2, e na forma geométrica da área sobre um

mapa do local de estudo (Jacob e Rudran, 2003). Para estimar as coordenadas finais da

triangulação foi usado o programa Locate II, versão 2.82 (Nams, 2001).

O cálculo da área de vida dos animais foi feito através do método do Mínimo Polígono

Convexo – MPC (Mohr, 1947), que consiste basicamente na união dos pontos mais extremos da

distribuição de localizações, de forma a fechar o menor polígono possível sem admitir

concavidades (Jacob e Rudran, 2003). Foram considerados 80, 90 e 100% dos pontos, a fim de

estimar o efeito dos outliers, na determinação da área de vida. Foram construídas as matrizes de

sobreposição separadas, de tal modo que uma continha a informação de todos os indivíduos

simultaneamente e outras duas matrizes separadas por sexo. Paras estas análises foi utilizado o

programa Ranges6 versão 1.2 (Kenward et al., 2003).

Dados Genéticos

O DNA dos 27 indivíduos foi extraído a partir das amostras de sangue total, utilizando o

kit de purificação de DNA GFX fornecido pela Amersham Pharmacia Biotech. Após a

quantificação, com o auxílio do marcador de peso molecular Low DNA Mass, e diluição para a

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concentração ideal de uso, o DNA foi utilizado para a realização de diversas Reações em Cadeia

da Polimerase (PCR), através de reações de amplificação do DNA Polimórfico Amplificado ao

Acaso (RAPD) (Welsh e McClelland 1990; Williams et al. 1990) e reações de amplificação com

os marcadores STR (Tautz, 1989).

As reações de RAPD foram montadas da seguinte forma: 3 µl de DNA (~3 ng/µl); 2,0 µl

de primer (~10 ng/µl); 2,6 µl tampão da enzima (10 X); 0,78 µl de MgCl2 (50 mM); 2,08 µl de

d’NTP (2,5 mM); 0,2 µl da enzima Taq-Polimerase (5 unidades/µl) e completando o volume com

9,34 µl de H2O Milli-Q. Foram utilizadas as seguintes condições nas reações de amplificação:

primeira etapa 2’ a 94°C; segunda etapa 1’30’’ a 92°C, terceira etapa 1’ a 37°C, quarta etapa

2’30’’ a 72°C, quinta etapa 40 ciclos (de 2 a 4) e sexta etapa 5’ a 72°C para a extensão final.

Primeiramente foi realizada uma seleção dos melhores marcadores utilizando o DNA de apenas

três indivíduos para a amplificação com 119 primers (desenvolvidos pela OPERON), seguido

de reações RAPD com todos os 27 indivíduos, usando os marcadores selecionados.

Para as reações com os marcadores STR, o seguinte protocolo foi utilizado: 5 µl de DNA

(~3 ng/µl); 2,2 µl do primers A (forward) (~5 ng/µl); 2,2 µl do primers B (reverse) (~5 ng/µl);

1,3 µl de BSA (10 mg/ml); 1,5 µl tampão da enzima (10 X); 0,5 µl de MgCl2 (50 mM); 1,3 µl de

d’NTP (2,5 mM); 0,2 µl da enzima Taq- Polimerase (5 unidades/µl) e completando o volume

com 0,8 µl de H2O Milli-Q, para um volume final de 15 µl. Para cada reação, realizada no

termociclador MJ Research Inc, utlizamos o seguinte programa: (1º) desnaturação do DNA a

94ºC por 5 minutos e (2º) a 94ºC por 1 minuto; (3º) anelamento dos “primers” a XºC por 1

minuto; (4º) extensão da molécula pela enzima Taq polimerase (fornecida pela Amersham

Pharmacia Biotech) a 72ºC por 1 minuto; (5º) 30 ciclos seguindo do 2º ao 4º passos; (6º) passo

final de extensão de 7 minutos a 72ºC para finalizar os produtos amplificados. Para cada primer

foram testadas temperaturas de anelamento que variaram entre 45ºC e 65ºC, pois este é um dos

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fatores críticos nas análises com estes marcadores (Hillis et. al, 1996; Ferreira e Grattapaglia,

1998) e após os resultados dos testes foi utilizado a temperatura de anelamento específica de cada

primer (ver capítulo 1).

Os fragmentos de DNA amplificados via marcadores RAPD foram separados através de

eletroforese em gel de agarose 1,5% e em seguida corados com brometo de etídeo. Os fragmentos,

nos géis, foram visualizados através de um transluminador de luz ultravioleta e fotografados com

auxílio do fotodocumentador KODAK EDAS – 120, (Ferreira e Grattapaglia, 1998).

Os produtos de amplificação via marcadores STR foram submetidos à eletroforese em gel

de poliacrilamida a 4% em TBE 1X durante 2 horas, mantendo a corrente elétrica em 90W

constante. Foram aplicados 3µl do produto da PCR, contendo o tampão de carregamento,

previamente desnaturado (94°C por 5 min). O padrão de peso molecular, o marcador Ladder

10bp (Amersham Pharmacia Biotech) foi usado para estimar os tamanhos dos produtos de PCR.

Após a eletroforese, o gel de acrilamida foi corado com nitrato de prata (Bassam et al., 1991).

Após a revelação das bandas e a secagem das placas, estas foram colocadas sobre a luz branca

para a obtenção dos genótipos.

Em seguida foi construída uma matriz de dados binários obtida pela codificação dos géis

em genótipos, para cada conjunto de dados gerados (RAPD e STR). No capítulo 2 é apresentado

um exemplo de como foram transformados os genótipos gerados pelos marcadores STR em

dados binários. Essa matriz binária foi utilizada para estimar a similaridade genética entre os

pares de indivíduos com base no coeficiente de Jaccard (J) (Sneath e Sokal, 1973) que é dado por

PMJ =

onde, M é o número de bandas em comum e P é o número total de bandas, exceto as bandas

ausentes nos dois indivíduos comparadas.

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Foram obtidas três matrizes de similaridade genética baseadas no índice de Jaccard, para

cada marcador molecular separadamente. A primeira contendo os dados de todos os indivíduos, a

segunda contendo apenas os dados dos machos e a terceira contendo os dados das fêmeas. Essas

matrizes foram construídas utilizando a rotina SIMQUAL (similarity for qualitative data) do

programa NTSYS-PC, versão 1.8 (Rohlf, 1991).

Correlação Genética e Espacial

O teste de Mantel (Manly, 1991) tem sido bastante utilizado para avaliar a correlação

matricial entre duas matrizes simétricas quaisquer E e M comparadas pelo valor de Z, dado por

( )∑ ∑ ⋅=i ijijj

MEZ

onde Eij e Mij são o i-ésimo e j-ésimo elementos das matrizes E e M a serem comparadas. A

significância da relação entre as matrizes pode ser testada recalculando o valor de Z diversas

vezes, permutando aleatoriamente, em cada uma delas, a ordem dos elementos de uma das

matrizes. Deste modo é possível obter uma distribuição de probabilidades à qual o valor de Z

observado pode ser comparado (Manly, 1991). O valor de Z não possui amplitude de variação

definida, mas de fato ele possui uma relação monotônica com o r de Pearson calculado entre as

matrizes. Assim pode-se utilizar o Z de Mantel para testar a significância da correlação matricial,

que varia entre 1,0 e –1,0.

O teste de Mantel requer a construção de duas matrizes de similaridade ou dissimilaridade

simétricas a serem comparadas. Neste estudo, este teste foi utilizado para comparar a similaridade

genética (matriz de Jaccard) com similaridade espacial (matriz de sobreposição), obtidas a partir

dos dados de telemetria para 80, 90 e 100% dos pontos. No entanto, as matrizes de sobreposição

geradas eram assimétricas, portanto estas tiveram que ser previamente transformadas em matrizes

97

simétricas. O modelo é basicamente a estimativa de uma taxa de sobreposição média (Om), que é

dado por

21 OOOm ⋅=

onde O1 é a medida de sobreposição de área do indivíduo A sobre o indivíduo B e O2 a

sobreposição de área do indivíduo B sobre A (Krebs, 1998).

Ainda a partir dos dados de área de vida dos indivíduos, foram construídas também as

matrizes de distâncias espaciais simétricas, usando o índice de distância euclidiana entre os

centros de área, e as mesmas foram usadas para a correlação matricial com as similaridades

genéticas. O cálculo da distância espacial foi realizada no programa NTSYS-PC, versão 1.8, na

rotina SIMINT (Similarity Interval) (Rohlf, 1991).

Foram utilizadas 5000 permutações aleatórias para estabelecer a significância de cada

correlação matricial. Essas análises foram realizadas utilizando a rotina MXCOMP (Matrix

Comparison-Graphics) do mesmo programa, NTSYS-PC, versão 1.8 (Rohlf, 1991).

RESULTADOS

Áreas de Vida

Dos 27 animais analisados, 13 eram machos e 14 eram fêmeas e destes apenas três fêmeas

e um macho eram sub-adultos, sendo os demais adultos. A quantidade total de radiolocalizações

obtidas foi de 2113, com uma média de 78,26 ±94,97 por indivíduo. O número mínimo de

localizações foi 10, para a fêmea no 503 e o máximo foi de 452 localizações para a fêmea no 501.

A área de vida dos indivíduos (machos e fêmeas) calculada com 80% dos pontos variou de 8,8 a

156 km2, para 90% dos pontos, variou de 14,6 a 165,7 km2 e para 100% dos pontos a variação foi

de 23 a 561 km2. As áreas de vida dos machos foram menores que a das fêmeas (Tabelas 1 e 2).

Em média, o tamanho da área de vida dos Lobos Guarás do PNE foi muito grande, 74,18 ± 44,18

98

km2 (n=13) para os machos e 89,70 ± 54,11 km2 (n=14) para as fêmeas (Tabelas 1 e 2). As áreas

de vida dos indivíduos no 799 e no 872 (fêmeas) foram muito maiores que as demais, elevando

assim a média geral (Tabela 1). Entre os machos, os indivíduos 743, 810 e 762 foram os que

apresentaram as maiores áreas de vida (Tabela 2). Entretanto, a variação relativa das áreas de

vida média entre os machos e entre as fêmeas foram praticamente da mesma magnitude, com um

coeficiente de variação em torno de 60% em ambos os casos.

Tabela 1- Áreas de vida (km2) de 14 fêmeas de lobo-guará do Parque Nacional das Emas,

considerando 80, 90 e 100% dos pontos, através do MPC (Mínimo Polígono Convexo).

INDIVÍDUO 80% (km2) 90% (km2) 100% (km2)

170 22.98 35.86 58.57

872 156.48 165.67 495.64

799 127.21 164.48 561.21

852 20.22 23.62 32.75

603 29.06 51.15 53.06

820 8.81 14.59 37.47

783 21.50 33.20 84.35

886 138.29 158.26 280.82

503 15.78 17.61 27.65

316 63.76 70.51 158.73

532 9.90 17.34 23.00

831 32.22 38.42 40.48

501 57.80 66.33 220.63

888 39.42 40.93 51.68

Média ± desvio-padrão 53.10±50.37 64.14±56.06 151.86±178

99

Tabela 2- Áreas de vida (km2) de 13 machos de lobo-guará do Parque Nacional das Emas,

considerando 80, 90 e 100% dos pontos, através do MPC (Mínimo Polígono Convexo)..

INDIVÍDUO 80% (km2) 90% (km2) 100% (km2)

743 70.69 72.28 211.92

104 21.61 24.85 134.97

659 24.12 44.43 88.14

772 21.03 23.45 45.42

641 39.80 65.59 114.34

5011 53.43 64.44 94.79

810 58.06 71.67 203.56

8721 43.74 56.02 82.40

762 42.91 57.93 209.80

840 71.32 78.56 183.83

892 43.94 57.25 90.19

202 32.11 34.94 82.08

862 36.87 49.85 90.85

Média ± desvio-padrão 43.05±16.75 53.94±17.74 125.56±57.17

As taxas de sobreposição média (Om) entre os indivíduos variaram de 0 a 71% para as

fêmeas e entre 0 e 88% para os machos (Tabela 3). A Figura 2, mostra a sobreposição de área de

vida para os machos, fêmeas e ambos os sexos, baseado nos dados do MPC para 80, 90 e 100%

dos pontos, em função das coordenadas (latitude e longitude). A sobreposição entre as fêmeas

aumentou à medida que se considerou uma maior proporção de pontos (100%) da área de vida.

Entretanto, para os machos a sobreposição foi maior quando se considerou uma menor proporção

de pontos (80%) (Tabela 3), confirmando uma maior dispersão entre as fêmeas do que entre os

machos.

100

Tabela 3. Taxas de sobreposição média (Om) entre os indivíduos de lobo-guará (Chrysocyon

brachyurus).

No de Pontos (%) Indivíduos Variação (%)

Fêmeas 0 – 61

Machos 0 – 88 80

Machos e Fêmeas 0 – 88

Fêmeas 0 – 68

Machos 0 – 81 90

Machos e Fêmeas 0 – 81

Fêmeas 0 – 71

Machos 0 – 75 100

Machos e Fêmeas 0 – 85

101

8014471

8004324

7994176

7984028

286569 296717 306865 317012

Latitude

Long

itude

a- Sobreposição de machos

MPC 80%

8014847

8004927

7995007

7985087

283712 293632 303552 313472

LatitudeLo

ngitu

de

d- Sobreposição de fêmeas

MPC 80%

8014587

8004418

7994234

7984057

283968 294145 304321 314498

Latitude

Long

itude

g- Sobreposição de machos e fêmeas

MPC 80%

8014471

8004324

7994176

7984028

286199 296347 306495 316642

Latitude

Long

itude

b- Sobreposição de machos

MPC 90%

8014847

8004927

7995007

7985087

281829 291749 301669 311589

Latitude

Long

itude

e- Sobreposição de fêmeas

MPC 90%

8014587

8004410

7994234

7984057

282085 292262 302438 312615

LatitudeLo

ngitu

de

h- Sobreposição de machos e fêmeas

MPC 90%

8025655

8012711

7999768

7986824

285684 298628 311571 324515

Latitude

Long

itude

c- Sobreposição de machos

MPC 100%

8016617

8006254

7995892

7985529

282271 292634 302996 313359

Latitude

Long

itude

f- Sobreposição de fêmeas

MPC 100%

8025655

8012711

7999768

7986824

284852 297796 310739 323683

Latitude

Long

itude

i- Sobreposição de machos e fêmeas

MPC 100%

Figura 2. Áreas de vida entre indivíduos de lobo-guará, considerando machos e fêmeas

separadamente e todos os indivíduos simultaneamente, para 80, 90 e 100% dos pontos do MPC

(Mínimo Polígono Convexo).

102

Variabilidade Genética e Associação com as Áreas de Vida

Dos 119 primers testados nas reações RAPD, nove deles (OPH-04, OPH-19, OPP-07,

OPP-08, OPP-09, OPP-15, OPC-11, OPC-05, OPA-18) mostraram um bom padrão de

amplificação e apresentaram um total de 91 locos, sendo 42 deles polimórficos (46%) (Tabela 4).

O índice de similaridade genética (coeficiente de Jaccard), entre os pares de indivíduos, variou de

0,66 a 0,97 entre as fêmeas, de 0,84 a 0,97 entre os machos e 0,66 a 0,99, quando considerado

ambos os sexos simultâneamente.

Tabela 4. Relação do número de locos e do número de locos polimórficos, por primer, em lobo-

guará (Chrysocyon brachyurus), utilizando marcadores RAPD.

Primer Número de Locos Número de Locos Polimórficos

OPH-04 14 7

OPH-19 8 3

OPP-07 9 4

OPP-08 9 5

OPP-09 7 4

OPP-15 11 4

OPC-11 12 5

OPC-05 11 4

OPA-18 10 4

TOTAL 91 42

Dentre 29 primers de STR testados (ver capítulo 1), desenvolvidos originalmente para

outras espécies, seis (21%) amplificaram com sucesso: PEZ-05, PEZ-20, PEZ-12, LOCO-13,

103

LOCO-15 e CSSM-038 (Denise et al., 2004; Halverson et al., 1995, Barker et al., 1997). Um

total de 27 locos foi obtido e destes 24 (88,88%) foram polimórficos. A similaridade genética

entre os pares de indivíduos variou de 0,09 a 0,80 quando considerado ambos os sexos

simultaneamente.

A associação entre os centros de áreas de vida (distância espacial) e similaridade genética

não foi significativa em nenhuma das condições analisadas (entre machos e fêmeas

separadamente e ambos os sexos simultaneamente), baseado nos dados RAPD (Tabela 5). Já a

associação entre as similaridades genéticas e espaciais foi significativa, apenas entre os machos

quando considerado 80 e 90% dos pontos, com base nos dados RAPD (Tabela 6). Assim,

indivíduos do sexo masculino com áreas mais sobrepostas são mais similares geneticamente.

Com base nos marcadores STR, observou-se uma associação significativa (para 80, 90 e 100%

dos pontos) entre os indivíduos de ambos os sexos simultaneamente e entre as fêmeas (para 100%

dos pontos) (Tabela 6). Portanto, indivíduos (ambos os sexos) mais similares geneticamente

ocupam áreas de vida mais próximas, sendo que existe uma maior tendência de associação entre

as fêmeas, como mostra a Tabela 6.

Tabela 5- Valores da correlação matricial (r ) e o nível de significância (P) obtidos a partir do

Teste de Mantel, comparando a similaridade genética (RAPD) e distância espacial entre os 27

indivíduos da população de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus).

Indivíduos R P

Machos e Fêmeas -0,00934 0,41

Machos -0,01514 0,42

Fêmeas 0,05839 0,44

104

Tabela 6- Valores da correlação matricial (r ) e o nível de significância (P) obtidos a partir do

Teste de Mantel, comparando a similaridade genética com a sobreposição espacial (80, 90 e

100% dos pontos) do lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), com base nos dados dos marcadores

RAPD e STR.

RAPD STR Indivíduos No de Pontos (%)

r P r P

80 0,015 0,44 0,182 0,003

90 0,013 0,44 0,197 0,003 Machos e Fêmeas

100 0,091 0,20 0,248 0,002

80 0,247 0,02 -0,109 0,199

90 0,230 0,02 -0,104 0,224 Machos

100 0,030 0,44 -0,112 0,267

80 -0,045 0,36 0,172 0,092

90 -0,011 0,45 0,194 0,061 Fêmeas

100 0,160 0,15 0,236 0,049

DISCUSSÃO

Áreas de vida

Os valores de área de vida obtidos para os Lobos Guará no PNE foram maiores do que os

encontrados por Silveira (1999), no mesmo local (PNE) (média de 48,98 ± 31,75 km2, n=5) e do

que os valores obtidos por Rodrigues (2002), na Estação Ecológica de Águas Emendadas - DF

(média 57 km2, n=5) e bem maiores que os dados de área de vida para a população de lobo-guará

do parque Nacional da Serra da Canastra (média 25,21± 4,45 km2, n=3). Os valores encontrados

105

neste estudo se aproximaram mais daqueles encontrados por Carvalho e Vasconcelos (1995), em

fragmentos de cerrado de São Paulo (média 75,03 ± 34,63 km2, n=3).

A variação no tamanho da área de vida de Lobos Guarás pode estar relacionada às

diferenças na disponibilidade alimentar, dentre outros fatores. Uma maior heterogeneidade

espacial e densidade de arbustos e árvores pode refletir uma maior disponibilidade de alimentos.

Como o entorno do Parque Nacional das Emas, área bastante utilizada por esta espécie e muitas

outras que habitam o mesmo, apresenta novas oportunidades de disponibilidade de alimentos,

visto que tratam-se de áreas de lavoura, pastagem e ainda reservas legais, esta podem ser uma

explicação do aumento da área de vida dos indivíduos deste local. Outro fator que poderia

explicar a variação no tamanho da área de vida desta espécie seria a densidade populacional,

onde locais com densidades maiores forçariam uma redução nas áreas individuais. Assim sendo,

grandes reservas são importantes na conservação dos Lobos Guarás, mas estas só serão efetivas

quando há conexão com outras reservas, favorecendo um acréscimo de indivíduos nas populações,

ou disponibilizando recursos alimentares suficientes para a população.

Alguns trabalhos (Rodrigues, 2002) indicam uma alta sobreposição de área de vida entre

indivíduos de diferentes populações de lobo-guará. Os casais de lobo-guará possuem áreas de

vida exclusivas, o que permite a participação do macho no cuidado parental (Dietz, 1984). Os

resultados deste trabalho corroboram parcialmente esta estruturação, mas foi observado uma

maior sobreposição de áreas entre os machos (em média 81%) do que entre as fêmeas (em média

67%). Porém, quando foi estimada a sobreposição considerando os indivíduos de ambos os sexos

simultaneamente, esta foi maior (em média 85%) (Tabela 3). Estas altas taxas de sobreposição

podem justificar a estruturação em pares, que acarreta vantagem ao casal, pois defendem sua área

de outros casais. A troca de parceiros sexuais pode ser facilitada pelas fêmeas por possuírem

áreas de vida maiores, fator que favorece a população por gerar um aumento da variabilidade

genética.

106

Correlações genéticas e espaciais

O grau de polimorfismo genético obtido com os marcadores RAPD (46%) e com os

marcadores STR (89%) foram razoavelmente altos, se comparados com outros estudos usando

marcadores protéicos, como o trabalho de De Mattos et al., (2004), que observou um

polimorfismo médio de 20% para a população de lobo-guará da região nordeste de São Paulo.

Nos trabalhos de Kennedy et al., (1991) e Waine et al., (1991) com lobos cinzentos (Canis lupus),

usando marcadores protéicos, a variabilidade genética mensurada foi de 13,5% e 20%,

respectivamente. Moreira et al., (1998), usando marcadores protéicos, em uma parcela bastante

representativa da população de lobo-guará (Sudeste e Centro-Oeste do Brasil), estimou uma

heterozigosidade média de 1,4 a 8,3%. De Mattos et al., (2004), em seu estudo com 28 Lobos

Guarás do Nordeste de São Paulo, usando também marcadores protéicos, mostrou ausência de

endocruzamento e de estruturação populacional, como conseqüência dos baixos valores de

distância genética. Estes estudos são corroborados pelos resultados deste trabalho no PNE, no que

diz respeito à diversidade genética, que em média foi alta baseando-se no alto polimorfismo

encontrado e na grande variação da similaridade genética observada entre os indivíduos, tanto

para os marcadores STR quanto para os marcadores RAPD. Isto indica que possivelmente uma

medida importante para a conservação do lobo-guará seria a preservação adequada da área que a

espécie ocupa, diminuindo a necessidade de introdução de novos animais no local, visto os

aspectos negativos das translocações e de densidades populacionais muito elevadas. A introdução

de novos animais pode acarretar problemas à população como, por exemplo, a introdução de

doenças infecciosas, diluição da freqüência de genes adaptados, etc (Campbell, 1980; Hedrick,

2001).

Em muitas espécies de mamíferos, a estrutura espacial da variabilidade genética em

pequenas escalas espaciais é determinada pela fidelidade dos indivíduos ao seu local de

nascimento ou grupo social, dependendo de alguns fatores, como sexo e idade (Roff e Fairbairn,

107

2001; Murren et al., 2001; Templeton, 1987; Greenwood, 1980). Em chipanzés (Pan troglotydes),

os grupos familiares tendem a ser patrilineares e as fêmeas têm uma maior dispersão (Wrangham,

1979).

Os resultados obtidos neste estudo, com base nos marcadores RAPD, mostraram uma

estruturação espacial da similaridade genética apenas para os machos, concordando com a

hipótese de que a distribuição espacial entre os machos não é aleatória e está associada com o

grau de parentesco genético. Esta estruturação poderia ser explicada pelo baixo padrão de

dispersão dos machos em relação às fêmeas nesta população, além da distribuição e

disponibilidade de recursos. Portanto, a alta taxa de sobreposição de área de vida entre os machos

aparentados pode estar sendo influenciada pela distribuição de recursos críticos, e não

necessariamente devido o grau de parentesco genético.

Um outro padrão espacial mais comum em mamíferos sociais é a filopatria natal e a

filopatria feminina, que também é um padrão observado em algumas espécies de mamíferos

solitários, como o guaxinim (Procyon lotor) (Ratnayeke et al., 2002). Os jovens freqüentemente

demonstram filopatria natal (Waser e Jones 1983), ou seja, eles permanecem dentro ou próximos

da área natal, dividindo espaço e recursos alimentares com os progenitores, e presumivelmente se

beneficiam desta maior familiaridade, favorecendo o forrageamento, obtenção de melhores

abrigos e maiores chances contra espécies predadoras. Para as fêmeas de mamíferos que investem

muito nos cuidados da prole, os benefícios ecológicos e sociais tendem a favorecer fortemente a

filopatria feminina (Wrangham, 1980). Este padrão espacial tem vantagens e custos. Ao mesmo

tempo em que o grau de parentesco entre as fêmeas aumenta o risco de endogamia,

conseqüentemente da redução da variabilidade genética, a consangüinidade pode favorecer a

seleção de genes que determinam uma boa adaptação a um determinado habitat.

Os resultados obtidos neste estudo com os marcadores STR corroboram a estruturação

espacial da similaridade genética entre os indivíduos de ambos os sexos, com uma maior

108

tendência entre as fêmeas (filopatria feminina), ou seja, as fêmeas mais similares geneticamente

tendem a ocupar a mesma área de vida ou áreas bem próximas. Como esse padrão é mais

esperado do que o observado com os dados RAPD, pode-se levantar a possibilidade de que os

resultados com os marcadores RAPD sejam artefatos. De fato, algumas estimativas de

diversidade genética com marcadores RAPD são questionáveis, devido principalmente a natureza

dominante do marcador.

Alguns estudos mostram que a filopatria não necessariamente é influenciada pelo sexo e

pode ser direcionada pela idade e, neste caso é mais comum entre machos e fêmeas adultos

ocupando a mesma área de vida dos machos (Gompper e Wayne, 1996). No entanto, não está

claro, para mamíferos solitários como o lobo-guará, se indivíduos filopátricos que dividem

espaço têm uma maior tolerância em conseqüência do grau de parentesco genético. Ratnayeke

(1997) observou em outro estudo que a variação no relacionamento genético foi independente da

interação espacial e temporal entre fêmeas de guaxinim. Em algumas espécies, como esquilos

(Van Staaden et al., 1994) a filopatria foi mais fortemente determinada pela sobreposição

espacial do que pela seleção de sociabilidade entre parentes. Neste trabalho, mesmo tendo sido

observada uma associação genética e espacial significativa, entre os indivíduos de ambos os

sexos e entre as fêmeas, com base nos marcadores STR e entre os machos com base nos

marcadores RAPD, os valores de r obtidos foram baixos, em torno de 0,23. Portanto, deve-se

levar em consideração que quando ambos indivíduos são beneficiados com a divisão de espaço,

aumenta-se à chance de tolerância entre eles e, neste caso, a estrutura populacional varia muito

mais em decorrência da demografia local e distribuição de recursos do que devido ao grau de

relacionamento genético entre os indivíduos.

109

AGRADECIMENTOS

Aos colegas do Laboratório de Genética e Melhoramento da Universidade Católica de Goiás -

UCG tais como, Profo. Breno de Faria Vasconcellos, Nicole C. L. Dutra, Gabriela C. Pádua,

Lorenna L. de Souza, Luciana M. Bossois e todos os demais estagiários que nos ajudaram nas

análises genéticas. A todo o pessoal do Parque Nacional das Emas - PNE, principalmente os

estagiários que realizaram os trabalhos de campo. Ao CNPq pelo financiamento de nossas

pesquisas dentro do programa PRONEX para análise de áreas prioritárias para conservação da

biodiversidade no Cerrado e em Goiás. (CNPq/SECTEC-GO, Proc. No. 23234156). JAFD-F

recebe uma bolsa de Produtividade em Pesquisa nível 1B do CNPq.

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117

CAPÍTULO 4

118

Artigo submetido: Genetics and Molecular Biology

Extinção por Depressão Endogâmica sob Estocasticidade Ambiental

em uma População de lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) e outra

de cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) no Sudoeste do Estado de

Goiás: Um Estudo de Simulação

FLÁVIA MELO RODRIGUES1,2 E JOSÉ ALEXANDRE FELIZOLA DINIZ-FILHO3,4* 1Universidade Estadual de Goiás, Departamento de Biologia; Anápolis-G0; 2Programa de Pós-

Graduação em Ciências Ambientais, UFG; 3Departamento de Biologia Geral, ICB,

Universidade Federal de Goiás (UFG); 4 Departamento de Biologia, MCAS, Universidade

Católica de Goiás (UCG);

Resumo

A perda de variabilidade genética e a depressão endogâmica são os dois principais fatores

genéticos que podem levar uma população à extinção. Populações pequenas têm níveis mais

baixos de diversidade genética do que populações grandes, devido à ocorrência de deriva

genética. A extinção de uma população é uma conseqüência de um feedback positivo entre o

declínio do tamanho populacional e aumento de endogamia, sendo este fenômeno conhecido por

“vortex” de extinção. Flutuações no tamanho populacional devido a estocasticidade ambiental

interagem com a depressão endogâmica e reforçam o vortex de extinção. O Cerrado do sudoeste

goiano, no qual está inserido o Parque Nacional das Emas, está extremamente fragmentado e com

um intenso processo de ocupação humana, principalmente devido à atividade agrícola, que

provoca fortes ameaças à diversidade biológica. O objetivo deste trabalho foi estimar o tempo de

extinção em duas populações de canídeos do Parque Nacional das Emas, o lobo-guará e o

cachorro-do-mato, utilizando um modelo teórico que assume que a combinação dos efeitos da

depressão endogâmica sob estocasticidade ambiental são os possíveis fatores que levam a

extinção dos organismos em populações isoladas. As simulações das dinâmicas populacionais das

duas espécies se basearam em três equações que avaliam a dinâmica da média da freqüência

alélica de genes deletérios (q), o coeficiente de endogamia (F) e o tamanho da população (N). A

heterozigosidade média esperada foi calculada partir dos dados de seis locos STR e usada para

estimar o tamanho efetivo das populações, com base no processo mutacional passo-a-passo

119

(Stepwise). Assim sendo, as simulações para cada espécie foram realizadas usando 12

combinações de três variáveis, i.e., as taxas de redução da capacidade de suporte do ambiente (K),

os coeficientes de endogamia (F) e o desvio-padrão do tamanho da população (sN). Em seguida,

foi realizada uma Análise de Variância Fatorial (ANOVA) para modelar a variação no tempo de

extinção em função dos parâmetros usados e suas interações. A média do tempo de extinção foi

afetado pelos três parâmetros analisados e suas interações, principalmente K e sN. Quando

considerado um pior cenário, ou seja, maior flutuação populacional, alta endogamia e altas taxas

de diminuição da capacidade de suporte, o tempo médio de extinção do lobo-guará foi igual a 363

anos, e para o cachorro-do-mato esse tempo foi igual a 431 anos. Uma análise comparativa,

utilizando uma combinação semelhante de parâmetros para as duas espécies, mostrou que a

diminuição da população de lobo-guará é sempre mais rápida que a da população de cachorro-do-

mato. Este resultado é coerente com expectativas baseadas em parâmetros demográficos e

história de vida diferentes nas duas espécies. Estes resultados mostram que as populações podem

persistir por um tempo razoável mesmo no pior cenário. Porém, deve-se estar atento para estes

resultados, uma vez que este estudo é uma projeção teórica baseada em muitas suposições, e é

bastante liberal principalmente quanto ao tamanho efetivo inicial. Sendo assim, este estudo deve

ser um ponto de partida para futuras avaliações mais precisas da persistência destas populações,

que possam gerar resultados baseados em parâmetros mais realistas da viabilidade destas

populações na região sudoeste do Estado de Goiás.

Palavras-chave: Análise de viabilidade populacional, Extinção, Canídeos, Marcadores STR,

Parque Nacional das Emas.

Enviar correspondência para FM Rodrigues. Universidade Estadual de Goiás, Departamento de

Biologia, Unidade Universitária de Ciências Extas e Tecnológicas, BR 153, Km 3, Campus

Anápolis, CEP: 75110-390, Caixa Postal: 459, Anápolis, GO, Brasil. E-mail: flavia.melo@ueg.br

120

Abstract

A typical question addressed by modern programs in conservation biology and the basis

of the so called population viability analysis (PVA) is what is the chance that a population

persists for a given number of years, given certain conditions of habitat and human activities.

Modern PVA analysis must combine factors at genetic, demographic and landscape levels to

create more realistic and precise models predicting population persistence. In this study, we used

Tanaka’s (2000) model of extinction in stochastic environments under inbreeding depression to

mode time to extinction in populations of two canid species living in Emas National Park (ENP)

and surroundings, the maned wolf (Chysocyon brachiurus) and the crab-eating fox (Cerdocyon

thous). Initial estimation of some genetic parameters in the population were based on 6 STR loci,

furnishing estimates of the effective population size, under a stepwise mutation model based on

heterozygosis, and of inbreeding levels of the two species. Our simulations were defined using 12

scenarios, allowing variations in variable rates of habitat loss, magnitude of population

fluctuation and initial inbreeding levels. ANOVA of simulation results showed that times to

extinction were better explained by demographic parameters, and based on large (probably

overestimated) population sizes, the variation in these times for the large-bodied maned wolf

ranged, on average, from 352 to 844, in the worst and best scenario, respectively. For the small-

bodied crab-eating fox, these same estimates are 422 and 974 years. Variations among

simulations are within expectation based on knowledge about species’ life-history, genetics and

demography. Although our simulations show that the populations can persistence through a

reasonable time (i.e., more than 100 years), these results are probably sensitive to unrealistic

assumption on initial population sizes. Despite this, our analyses are a starting point for a more

focused evaluation of persistence in these populations and can drive future research towards

obtained better estimates of parameters that can, in turn, be used to fuel more appropriate and

realist PVA models.

Key words: Population persistence, Population Viability Analysis, Canids, STR markers, Emas

National Park

121

INTRODUÇÃO

A perda de variabilidade genética e a depressão endogâmica são os dois principais fatores

genéticos que podem levar uma população à extinção (Lynch e Lande, 1993; Barret e

Charlesworth, 1991; Soule, 1986). Possivelmente, a contribuição recente mais importante em

relação à genética da conservação seja o reconhecimento da importância da depressão

endogâmica quando se trata de espécies ameaçadas, de modo que a redução da endogamia tem se

tornado uma prioridade em programas de conservação in situ e ex situ (Hedrick, 2001). A

depressão endogâmica resulta no aumento da homozigosidade de mutações deletérias recessivas

em pequenas populações e, portanto, um número menor de descendentes, ou descendentes

estéreis são algumas das características da depressão endogâmica (Charlesworth e Charlesworth,

1987; Ralls et al., 1988). Populações pequenas têm níveis mais baixos de diversidade genética do

que populações grandes. Isto se deve à ocorrência de deriva genética, onde alguns alelos podem

aumentar sua freqüência, outros diminuem e alguns alelos podem ser perdidos completamente

(Frankham et al., 2002). Alguns mecanismos presentes em grandes populações evitam a

endogamia, ou seja, os indivíduos não acasalam com parentes próximos porque eles se dispersam

do seu local de nascimento ou o acasalamento entre parentes é inibido por odores ou outras pistas

sensoriais (Primack e Rodrigues, 2001). Entretanto, em populações com baixas densidades

demográficas, estes mecanismos não conseguem evitar a endogamia. Assim sendo, este fator

(endogamia) pode contribuir para um declínio no tamanho da população e conseqüentemente

favorecer a probabilidade de extinção (Ellstrand e Elam, 1993).

A extinção de uma população é uma conseqüência de um feedback positivo entre o

declínio do tamanho populacional e aumento de endogamia, sendo este fenômeno é conhecido

por “vortex” de extinção (Frankham et al., 2002; Hedrick, 2001). Vortex de extinção é um

sistema de retroalimentação, envolvendo diversos processos genéticos e demográficos. Faz com

que o tamanho populacional, uma vez reduzido abaixo de um dado valor crítico, tenda a se

122

reduzir cada vez mais, levando a população (e, em segundo momento, toda a espécie) à extinção.

Porém, as interações entre fatores genéticos, demográficos e ambientais fazem com que seja

extremamente difícil identificar as causas imediatas para qualquer evento particular de extinção

(Frankham et al., 2002).

Correlações entre aptidão (fitness), heterozigosidade e taxa de endogamia estimadas de

populações naturais fornecem evidências indiretas de depressão endogâmica na natureza (Britten,

1996; Tanaka, 2000a). Não é muito clara a interpretação das estimativas de heterozigosidades

para o processo de extinção. Primeiro, porque existem poucos exemplos de extinção populacional

devido à depressão endogâmica, e segundo porque as investigações das propriedades teóricas do

vortex de extinção por depressão endogâmica tornam difícil avaliar o risco genético de extinção

baseada em dados empíricos (Tanaka, 2000a). Alguns estudos têm considerado o vortex de

extinção usando modelos genéticos e populacionais e sugerem que a rápida extinção devido à

depressão endogâmica é restrita, porém possível com os parâmetros genéticos observados

(Tanaka, 1997, 1998, 2000b).

Se a depressão endogâmica for causada por mutações deletérias recessivas que estão

“escondidas” nos heterozigotos, as grandes populações estão mais sujeitas à depressão

endogâmica do que as pequenas populações. Isso porque, uma grande população que no passado

passou por um efeito “bottleneck” e manteve uma alta heterozigosidade conterá mais mutações

deletérias do que as populações pequenas (Hedrick, 2001). Em pequenas populações, por outro

lado, a maioria das mutações deletérias são rapidamente eliminadas pela seleção, que é mais

eficiente em baixas taxas de heterozigosidades (Tanaka, 1997). Sendo assim, a história

demográfica de uma população pode ter uma importante relação com a extinção, uma vez que a

endogamia pode ser induzida por distúrbios demográficos, genéticos e estocasticidade ambiental

(Tanaka, 1997).

123

As flutuações no tamanho populacional devido a estocasticidade ambiental, tais como

temperatura, disponibilidade de alimento, competição, interagem com a depressão endogâmica e

reforçam o vortex de extinção (Tanaka, 2000b). Segundo Primack e Rodrigues (2001), as maiores

ameaças à diversidade biológica que resultam da atividade humana são: destruição, fragmentação

e degradação do habitat, superexploração das espécies para uso humano, introdução de espécies

exóticas e aumento de ocorrência de doenças. Dentre as principais causas de ameaças de extinção

em mamíferos estão a perda de habitat, responsável por 68%, e a superexploração, que inclui a

caça comercial, esportiva e de subsistência, responsável por 54 % (Reid e Miller, 1989).

O Cerrado da região sudoeste do Estado de Goiás, no qual está inserido o Parque Nacional

das Emas (PNE), está extremamente fragmentado, e com um intenso processo de ocupação

humana. Por exemplo, apenas cerca de 27% do entorno do PNE, em um raio de 30 Km, possui

áreas de remanescentes florestais (Figura 1). Fazem parte desta região extensas lavouras de milho,

soja e pastagem (Pedroso, 2004). Basicamente, o que impulsionou a inserção dos Cerrados nas

áreas produtivas e, conseqüentemente, o desenvolvimento agrícola do Centro-Oeste, foram

alguns programas específicos implementados nessa região ainda nos anos 1950-1960. Dentre os

principais, destacam-se o Programa de Desenvolvimento dos Cerrados (POLOCENTRO) e o

Programa de Cooperação Nipo-Brasileira para Desenvolvimento dos Cerrados (PRODECER)

(Bezerra e Cleps-Júnior, 2004).

O sudoeste goiano teve um desenvolvimento diferenciado das demais regiões do Estado

por ser uma área agropecuária de ocupação bastante antiga, próxima ao Triângulo Mineiro e São

Paulo. Inicialmente, a principal atividade econômica na região era a criação de gado. A partir de

1960, a região passa a vivenciar uma nova fase de desenvolvimento agrícola, incentivada pelo

pacote tecnológico da Revolução Verde e principalmente, pela intervenção do Estado por meio

de políticas desenvolvimentistas (Pedroso, 2004). Com isto ocorre uma desenfreada ocupação

humana no cerrado goiano, em especial na região Sudoeste de Goiás, provocando o

124

desmatamento, afetando dentre outros processos a infiltração da água fluvial e assim o

abastecimento de vários lençóis freáticos, diminui drasticamente. Como conseqüência, vários rios

já secaram nos domínios do cerrado, além de erosões e compactação do solo, devido à pesada

mecanização (Pedroso, 2004; Rodrigues et al., 2001).

Figura 1. Remanescentes florestais no entorno do Parque Nacional das Emas (Adaptado de

Mário Barroso Neto, 2005)

O objetivo deste trabalho foi estimar o tempo de extinção em duas populações de

Canídeos do sudoeste do Estado de Goiás, o lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) e o cachorro-

do-mato (Cerdocyon thous), utilizando o modelo de Tanaka (2000a), que considera a depressão

endogâmica e estocasticidade ambiental como possíveis fatores que levam a extinção dos

organismos. O cenário ecológico começou com uma análise genética de populações de cada uma

dessas duas espécies, situadas no Parque Nacional de Emas e usando dados de marcadores

125

moleculares Microssatélites ou STR (Short Tandem Repeats) (Rodrigues et al., 2005; ver capítulo

2). O valor da heterozigosidade esperada (He) foi utilizado para estimar o tamanho efetivo da

população, sob um modelo mutacional stepwise e os marcadores STR foram utilizados para uma

estimativa inicial dos coeficientes de endogamia (F) nas populações. Para a realização das

simulações, foram obtidos outros parâmetros, utilizando abordagens macroecológicas, e os

resultados foram discutidos segundo o conhecimento global da região estudada e a história de

vida das espécies. Nas simulações, assumiu-se que a combinação dos efeitos de isolamento, perda

de hábitat (redução na capacidade de suporte da região) e estocasticidade ambiental podem levar

as populações à extinção.

MATERIAL E MÉTODOS

O modelo genético

As simulações da dinâmica populacional das duas espécies estudadas se basearam em

Tanaka (2000a), que descreve um modelo de extinção por depressão endogâmica sob

estocasticidade ambiental. Assume-se, portanto, que a depressão endogâmica envolve genes

deletérios recessivos, distribuídos entre os n locos autossômicos bi-alélicos, com taxas de

mutação, coeficientes de seleção e dominância semelhantes. O modelo também assumiu que os

efeitos do desequilíbrio de ligação e interações epistáticas são desprezíveis. Os genótipos AA, Aa

e aa, em cada loco, têm um fitness médio igual a 1, 1 e 1 – s, respectivamente, onde s é o

coeficiente de seleção.

O modelo de Tanaka (2000a) se baseia em três equações dinâmicas recorrentes, para a

média da freqüência alélica q de genes deletérios, o coeficiente de endogamia F e o tamanho da

população N. Estas equações são

qt+1 = qt – s[q2 + Ft q (1 – q)] + µ + γ (eq. 1)

126

Ft+1 = ( 1/2Nt + (1 – 1/2Nt)Ft] (1 – 2µ) (1 – sqt) (eq. 2)

Nt+2 = Nt+1 exp[rmax (1 – (Nt+1/ Kt+1) + ε] δ (eq. 3)

Na equação (1), µ é a taxa de mutação e γ é uma variável aleatória com média 0 e desvio

padrão igual a (q (1 - q)/ 2nN)1/2, onde n é o número de locos. A equação (3) mostra que o

tamanho da população N cresce de acordo com um modelo logístico discreto no tempo t, com

capacidade de suporte K e uma flutuação em torno da média de N com o desvio padrão ε. O

parâmetro Maltusiano (taxa de crescimento intrínseca) é dado por rmax, assim sendo um aumento

discreto de N por geração, λ, é determinado por

λ = exp [(rmax)(1 – Nt/Kt)] (eq. 4)

Porém, a população também está sofrendo efeitos de eventos externos, e assim pressupõe-

se que a capacidade de suporte K varia com o tempo e está sendo reduzida com uma taxa h por

unidade de tempo t (em anos, que é a escala da taxa de crescimento λ). Assim, temos que

Kt+1 =Kt - hKt (eq. 5)

O modelo original de Tanaka (2000a) assume uma diminuição exponencial, mas neste

estudo assumiu-se uma diminuição linear e constante através do tempo, gerando uma diminuição

mais rápida em K. Devido os intervalos relativamente pequenos de N (veja abaixo), esta pequena

mudança fará pouca diferença em relação ao modelo original. Além disso, o tamanho da

população é reduzido pelo fator δ, que é uma função das freqüências alélicas q e de como os

genes deletérios afetam a taxa de crescimento da população. Assim, o crescimento da população

está relacionado com a carga genética L e é dado como λδ, onde

δ = (1 – L) = 1 – nsq2 (eq. 6)

Os cálculos descritos acima foram implementados no programa GLOADRUN, escrito em

linguagem Q-BASIC e que será disponibilizado aos interessados mediante solicitação (Apêndice

1).

127

Contexto ecológico e Parametrização do Modelo

O modelo descrito acima foi utilizado para avaliar a dinâmica populacional dentro da

população de lobo-guará e de cachorro-do-mato do Parque Nacional das Emas - GO e regiões do

entorno (Figura 2). A partir das análises de variabilidade genética, utilizando seis locos STR

(Rodrigues et al., 2005; ver capítulo 2) obteve-se a heterozigosidade média esperada para cada

população, iguais a 0,533 e 0,676 para lobo-guará e cachorro-do-mato, respectivamente. Para o

processo mutacional, foi utilizado o modelo Stepwise (SMM – Stepwise Mutation Model, Nei e

Kumar, 2000) a fim de se estimar o tamanho efetivo da população, com base na seguinte equação

He = 1 - [1/(1 + 8Nu)1/2] (eq. 7)

onde He é a heterozigosidade esperada, N é o tamanho efetivo, u é a taxa de mutação por

geração.

O modelo SMM é o mais aceito para marcadores STR e admite que a mutação nos alelos

resultam da perda ou ganho de uma única unidade de repetição, de modo que os alelos poderiam

variar apenas através de estados alélicos anteriormente presentes na população. Assim sendo,

pode-se então aproximar o tamanho efetivo da população de lobo-guará e cachorro-do-mato de

toda região (não necessariamente dentro do PNE) como sendo Ne ≈ 500 e Ne ≈ 1000,

respectivamente. Multiplicando-se estes valores por um fator conservador igual a 2 (Morris &

Doak, 2002), obtem-se uma estimativa inicial razoável do tamanho da população N na região, na

ausência de estimativas empíricas melhores.

O desvio padrão do tamanho da população (sN) foi fixados em 5 ou 10 indivíduos, e assim

este parâmetro pode causar pequenos efeitos em densidades populacionais altas, mas grandes

efeitos em pequenas densidades populacionais, promovendo um vortex de extinção.

128

Figura 2. Localização do Parque Nacional das Emas - GO.

Uma vez que, estamos simulando processos dinâmicos populacionais em uma unidade de

reserva relativamente grande (o PNE), as simulações foram rodadas com duas taxas de

diminuição da capacidade de suporte K relativamente baixas, igual a 0.005 e 0.01 indivíduos por

ano. Note-se que isto indica que mesmo que a área global do PNE seja mantida ao longo do

tempo, a capacidade de suporte da população estará reduzida, assumindo efeitos de borda

indiretos, tais como redução no tamanho das populações de presas, poluição ou perda de habitats

satisfatórios dentro do parque.

Como não há nenhum dado disponível para se estimar a taxa de crescimento das duas

espécies, foi utilizada a seguinte equação empírica (Alroy, 2001)

129

rmax = exp[ 1.4967 – 0.37 (logM)] (eq. 8)

Onde logM é o logaritmo natural da massa corpórea das espécies, definido como sendo

igual a 24 Kg para o lobo-guará e 6 Kg para o cachorro-do-mato (Einsenberg e Redford, 1999).

Assim, a taxa de crescimento intrínseca máxima para as duas espécies foi igual a 0,10 e 0,17 para

o lobo-guará e cachorro-do-mato, respectivamente.

Devido à grande variação nos coeficientes de endogamia (F) calculados por loco para as

duas espécies (ver capítulo 2) usando os seis locos STR, que variaram de -0,394 a 0,197 (média

igual a -0,091) para o lobo-guará e -0,055 a 0,205 (média igual a 0,032) no cachorro-do-mato,

decidiu-se correr as simulações com três valores iniciais baixos de F, iguais a 0.01, 0.05 e 0.10.

Os outros parâmetros de carga genética foram iguais àqueles utilizados por Tanaka (2000a), de

tal forma que µ = 10-6 , n = 15000 locos e coeficiente de seleção s igual a 1.

Assim sendo, as simulações para cada espécie foram realizadas usando 12 combinações

dos três parâmetros: “baixa” e “alta” taxas de redução da capacidade de suporte K (0.005 e 0.01);

“baixos” “médios” e “altos” coeficientes de endogamia F (0.01, 0.05 e 0.10) e “baixo” e “alto”

desvio padrão do tamanho da população sN (5 e 10 indivíduos) (Tabela 1). Para cada combinação

de parâmetros, foram executadas 500 simulações e o tempo de extinção Te foi obtido.

Para avaliar como a combinação dos parâmetros utilizados afetam Te, uma análise de

variância fatorial (ANOVA) (Sokal & Rohlf, 1985) foi usada para modelar a variação em Te

como uma função dos parâmetros usados e suas interações.

130

Tabela 1- Identificação dos 12 cenários simulados, a partir das combinações dos três parâmetros

utilizados, que incluem variações na capacidade de suporte (K), no desvio padrão no tamanho das

populações (sN ) e no coeficiente de endogamia (F).

Cenários Combinações

1 K = 0,005; sN = 5; F = 0,01

2 K = 0,005; sN = 5; F = 0,05

3 K = 0,005; sN = 5; F = 0,10

4 K = 0,005; sN = 10; F = 0,01

5 K = 0,005; sN = 10; F = 0,05

6 K = 0,005; sN = 10; F = 0,10

7 K = 0,01; sN = 5; F = 0,01

8 K = 0,01; sN = 5; F = 0,05

9 K = 0,01; sN = 5; F = 0,10

10 K = 0,01; sN = 10; F = 0,01

11 K = 0,01; sN = 10; F = 0,05

12 K = 0,01; sN = 10; F = 0,10

131

RESULTADOS

De acordo com a Análise de Variância (ANOVA), a média do tempo de extinção, Te, para

as duas espécies (Tabela 2) foi afetada pelos três parâmetros analisados e suas interações,

principalmente pela taxa da redução na capacidade de suporte e pelo desvio padrão do tamanho

da população.

Tabela 2- Valores de F e nível de significância (P), obtidos a partir da Análise de Variância

(ANOVA), dos três parâmetros analisados: redução na capacidade de suporte (K); desvio padrão

no tamanho das populações (sN) e coeficiente de endogamia (F) e suas interações, em relação ao

tempo de extinção (Te) nas duas espécies estudadas.

F e (P) Fontes de Variação

lobo-guará cachorro-do-mato

K 271470 (0.000) 353855 (0.000)

sN 21113 (0.000) 19756 (0.000)

F 0.680 (0.507) 0.912 (0.402)

K* sN 2241 (0.000) 2128 (0.000)

K*F 0.574 (0.563) 3.239 (0.039)

sN *F 1.586 (0.205) 1.548 (0.213)

K* sN *F 0.299 (0.742) 3.732 (0.024)

Como esperado, os piores cenários (i.e., Te mais curto) ocorreram para ambas as espécies

quando as populações flutuaram mais e apresentaram alta endogamia, vivendo em ambientes com

alta taxa de diminuição na capacidade de suporte (Tabelas 3 e 4).

Para o lobo-guará, os valores de Te variaram de 413 a 291 anos, quando considerado o

pior cenário (cenário 12), e entre 932 a 756 anos, quando considerado o melhor cenário (cenário

1) (Tabela 3). Os principais fatores que afetaram o Te nesta espécie foram a redução na

132

capacidade de suporte e o desvio padrão do tamanho da população, e a ANOVA explicou 98% da

variância total em Te (Tabela 2).

Para o cachorro-do-mato, os valores de Te variaram de 486 a 359 anos, quando

considerado o pior cenário, e entre 1099 a 849 anos, quando considerado o melhor cenário

(Tabela 4). Para esta espécie, os três fatores analisados afetaram significativamente o Te, mas o

efeito do coeficiente de endogamia só foi significativo quando considerado a interação com K e

com K* sN . O modelo da ANOVA também explicou 98% da variância total em Te (Tabela 2).

Tabela 3- Tempo de extinção para o lobo-guará, considerando todos os cenários analisados.

Cenário Máximo Mínimo Médio Desvio Padrão

1 932 756 848 34

2 947 688 846 36

3 939 754 850 33

4 799 594 707 36

5 805 570 709 33

6 812 591 708 34

7 492 362 435 20

8 493 378 435 19

9 487 370 436 21

10 428 296 364 20

11 412 313 364 19

12 413 291 363 20

133

Tabela 4- Tempo de extinção para o cachorro-do-mato, considerando todos os cenários

analisados.

Cenário Máximo Mínimo Médio Desvio Padrão

1 1099 849 981 37

2 1060 856 979 37

3 1078 880 985 35

4 925 718 839 34

5 934 726 843 35

6 934 726 842 35

7 552 442 502 20

8 559 434 501 21

9 575 435 500 21

10 482 369 431 20

11 494 366 430 21

12 486 359 431 20

A realização de uma única simulação, usando o pior e o melhor cenário (cenário 1 e

cenário 12, respectivamente) para cada espécie, é mostrada nas Figuras 3 e 4 para efeito de

comparação e visualização dos padrões em N e F. É possível ver que, quando utilizado uma

combinação semelhante de parâmetros, a diminuição da população de lobo-guará é sempre mais

rápida que a da população de Cachorro do mato. As diminuições no tamanho das populações, em

ambas espécies, são devidas à redução da capacidade de suporte, além dos efeitos da depressão

endogâmica.

134

0 200 400 600 800 1000 1200

Te

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

F

0 200 400 600 800 1000 1200

Te

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

N

Figura 3. Resultado de uma simulação para a variação nos valores de F (A) e no tamanho

populacional (B) ao longo do tempo, para a população de cachorro-do-mato, nos dois cenários

extremos. A linha sólida mostra a trajetória do melhor cenário (1) e a linha tracejada indica a

trajetória do pior cenário (12).

(A) (A)

(B)

135

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Te

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

F

0 200 400 600 800 1000 1200

Te

0

200

400

600

800

1000

1200

N

Figura 4. Resultado de uma simulação para a variação nos valores de F (A) e no tamanho

populacional (B) ao longo do tempo, para a população de lobo-guará, nos dois cenários extremos.

A linha sólida mostra a trajetória do melhor cenário (1) e a linha tracejada indica a trajetória do

pior cenário (12).

(A)

(B)

136

DISCUSSÃO

Há um tempo atrás, considerava-se que a contribuição de fatores genéticos para o destino

de espécies em extinção era um fator secundário. Sugeria-se que flutuações demográficas e

estocasticidade ambiental causariam extinção antes que a deterioração genética se tornasse uma

séria ameaça as populações naturais. Porém, as respostas evolutivas de populações frente à

estocasticidade ambiental e demográfica não são independentes da endogamia e da diversidade

genética. A endogamia, em média, reduz as taxas de natalidade e aumentam os índices de

mortalidade e pode influenciar nas relações sexuais entre os indivíduos (Frankham et al., 2002)

Neste estudo, os principais fatores analisados que afetaram o tempo de extinção (Te) nas

duas espécies foram a taxa de redução na capacidade de suporte (K) e o desvio padrão no

tamanho da população (sN). Porém, para a população de cachorro-do-mato, o coeficiente de

endogamia (F) foi um fator importante quando considerado a interação com K e com sN . No

entanto, é importante salientar que a ausência de significância estatística do coeficiente de

endogamia nas analises de extinção para a população de lobo-guará observada neste estudo não

significa que este fator não é importante, e sim que o intervalo de variação utilizado aqui talvez

não tenha sido o bastante para gerar variação no Te final, especialmente considerando uma

variação estocástica ao redor de N. Além disso, alguns estudos com grandes mamíferos mostram

que estas espécies podem não estar sujeitas à depressão endogâmica por conterem baixas taxas de

heterozigosidade, provavelmente devido a um antigo “bottleneck” (Vilà et al., 2002; Merola,

1994; O’Brien et al., 1983; Sage e Wolff, 1986).

Segundo Tanaka (1997), populações muito pequenas provavelmente sofrem grande risco

de extinção devido outros fatores. Alguns estudos mostram que a estocasticidade ambiental e

demográfica colocam em grande risco as populações muito pequenas (Leigh, 1981; Goodman,

1987, Iwasa e Mochizuki, 1988; Lande, 1993). Assim sendo, provavelmente estes efeitos

estocásticos interagem com a depressão endogâmica no estágio final da extinção (Tanaka, 1997).

137

Existem algumas evidências empíricas de que a depressão endogâmica é reforçada em função da

deterioração ambiental, ou seja, o risco de extinção devido à endogamia é mais acelerado em

ambientes deteriorados (habitats fragmentados, devido extensas lavouras, como no PNE) do que

em ambientes ideais (Liberg et al. 2005; Templeton e Read, 1983; Soule e Kohn, 1989; Pray et

al., 1994).

A análise comparativa dos fatores nas duas populações são coerentes com expectativas

baseadas em parâmetros demográficos e história de vida diferentes nas duas espécies (Wayne,

1996). O lobo-guará é uma espécie com o tamanho do corpo maior do que o cachorro-do-mato,

ou seja, ocupam grandes áreas de vida, assim sendo as taxas de crescimento são mais baixas e

estas espécies são mais rapidamente extintas em escalas regionais do que as espécies de pequeno

porte (Henle et al., 2004). Por outro lado, em espécies de porte menor, tais como o cachorro-do-

mato, as taxas de crescimento demográfico são mais elevadas, embora essas sejam usualmente

mais variáveis e estejam mais sujeitas a extinções locais. Entretanto, a extinção total é difícil em

função dos eventos constantes de recolonização (Rocha et al., 2004; Rodrigues et al., 2002;

Beissinger, 2000; Raup, 1991; Silveira e Jácomo, 1998).

Espécies mais generalistas e abundantes, como o cachorro-do-mato, geralmente são

beneficiadas pela fragmentação de habitats, tal como a induzida, por exemplo, pela expansão

agrícola, pois freqüentemente estes animais possuem grande mobilidade, são hábeis para o uso de

diversos habitats e itens alimentares, sendo capazes de explorar também as bordas (Gehring e

Swihart, 2003). Por outro lado, espécies, como o lobo-guará, com alto requerimento individual de

área de vida, baixa abundância, alta flutuação populacional, baixo potencial reprodutivo e certa

especialização de habitat, mostram-se mais sensíveis à fragmentação (Henle et al., 2004).

É claro que as simulações executadas neste estudo só devem ser vistas como avaliações

muito preliminares dos riscos de extinção e viabilidade dessas populações, devido a muitos

fatores. Primeiro, as simulações foram baseadas em algumas suposições que podem ser, em

138

primeira instância, irreais. Por exemplo, não há nenhuma informação detalhada sobre a carga

genética destas populações e como esta pode afetar alguns parâmetros populacionais básicos, tais

como a taxa de mortalidade e fecundidade. Até mesmo uma boa descrição dos parâmetros

populacionais, como taxa de crescimento e flutuação de populacional, não foi realizada. Outra

questão é que foram utilizados diferentes valores de F nas simulações. No entanto, mesmo que

estas estimativas sejam instáveis (mas, normalmente baixas), de um modo geral são obtidos de

fato baixos níveis de endogamia nas duas espécies e em outras espécies de canídeos em

condições semelhantes (De Mattos et al., 2004; Wayne, 1996).

Para este trabalho, nós estimamos o tamanho inicial das populações N com base nas

heterozigosidades esperadas (He), calculadas a partir dos dados de STR. No entanto, a relação

entre o tamanho observado e o tamanho efetivo das espécies é desconhecida. Assumir uma

população de 1000 indivíduos para o lobo-guará e 2000 indivíduos para o cachorro-do-mato em

toda a região (não necessariamente apenas no PNE) não é irrealista, e estas estimativas seriam

muito menores se utilizássemos equações alométricas baseadas na massa corpórea das espécies

(Alroy, 2001, Diniz-Filho, 2004). Mesmo assim, estas estimativas iniciais de 1000 e 2000

indivíduos para as duas espécies podem estar muito superestimadas. Essas estimativas seriam

mais adequadas como um valor inicial da população reprodutiva antes da ocupação humana

acentuada, em equilíbrio genético. Esse valor pode ter sido consideravelmente reduzido nos

últimos 50 anos, especialmente considerando o alto nível de perda de hábitat e ocupação humana

na região sudoeste do Estado de Goiás (apesar da presença do PNE). O modelo utilizado aqui não

assumiu diretamente a fragmentação de hábitat, um componente importante na paisagem da

região, embora este componente possa ser indiretamente capturado pela taxa global de perda de

hábitat (capacidade de suporte).

Uma análise considerando valores mais reais do tamanho destas populações (Leandro

Silveira, comunicação pessoal) no PNE e regiões do entorno foi realizada. Foi estimada uma

139

população com 80 indivíduos para o lobo-guará e 150 indivíduos para o cachorro-do-mato.

Obviamente, o Te foi bem menor neste cenário do que nas análises considerando 1000 e 2000

indivíduos. Para estas estimativas empíricas do tamanho populacional, em média o tempo de

extinção considerando o pior cenário (12) para o lobo-guará foi igual a 116 anos (desvio padrão =

18), com um máximo de 157 anos e mínimo igual a 57 anos, enquanto que para o cachorro-do-

mato o Te médio foi igual a 172 anos (desvio padrão = 19), com um máximo de 231 anos e um

mínimo igual a 106 anos. Quando foi analisado o melhor cenário (1) as estimativas do Te médio

foi igual a 346 anos (desvio padrão = 36), para o lobo-guará e 465 anos (desvio padrão = 35),

para o cachorro-do-mato.

Tanaka (1997), sugere que o tamanho efetivo de uma população pode não reduzir-se

rapidamente, se a heterozigosidade é alta e a taxa intrínseca de crescimento populacional é

suficientemente alta para compensar a endogamia. Uma rápida diminuição no tamanho efetivo da

população pode induzir o vortex de extinção, devido à depressão endogâmica. Vários fatores

podem diminuir o tamanho efetivo de uma população. Alguns estudos mostram que, se a

população está geograficamente subdividida, com restrição na migração entre as subpopulações,

o tamanho efetivo da população pode diminuir rapidamente, sem alterar o tamanho atual da

população (Blanco et al., 2005; Crow e Aoki, 1984).

Assim sendo, os resultados das simulações realizadas aqui mostram que estas populações

podem persistir por um tempo razoável no pior cenário (12), em média 363 anos o lobo-guará e

431 anos o cachorro-do-mato (assumindo 1000 indivíduos de lobo-guará e 2000 indivíduos de

cachorro-do-mato) (Tabelas 3 e 4). Porém, deve-se estar atento para estes resultados, uma vez

que este estudo é uma projeção teórica baseada em muitas suposições, possivelmente irreais dos

processos populacionais que dirigem as populações para a extinção. Sendo assim, este estudo é

um ponto de partida para futuras avaliações mais precisas da persistência destas populações, onde

melhores estimativas dos parâmetros devem ser avaliadas, a fim de se obter resultados mais

140

adequados e modelos mais realistas da viabilidade destas populações na região sudoeste do

Estado de Goiás.

141

AGRADECIMENTOS

Nós agradecemos a Mariana Pires de Campos Telles, Leandro Silveira e Anah T. A. Jácomo

pelas valiosas discussões sobre a genética de populações e conservação de canídeos do Parque

Nacional das Emas - GO. Ao CNPq pelo financiamento de nossas pesquisas dentro do programa

PRONEX para análise de áreas prioritárias para conservação da biodiversidade no Cerrado e em

Goiás. (CNPq/SECTEC-GO, Proc. No. 23234156).

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147

APÊNDICE 1

CLS PRINT "GLOADRUN - Program for simulating extinction vortex" PRINT "by inbreeding depression (see Tanaka 2000)" PRINT PRINT PRINT "DEMOGRAPHIC PARAMETERS" INPUT "1. Initial population size (K)"; n1 LET k1 = n1 REM INPUT "2. Carrying capacity (K)"; k1 INPUT "2. Rate of decreasing carrying capacity K"; rk INPUT "3. Maximum growth rate (r max)"; rmax INPUT "4. Standard deviation of time variation in population size"; dp2 PRINT PRINT "GENETIC PARAMETERS" REM INPUT "5. Effect of inbreeding on growth rate (INB)"; inb INPUT "5. Initial F value"; F1 REM INPUT "6. Average allele frequency (q)"; q1 REM INPUT "7. Number of loci (nl)"; nl REM INPUT "8. Mutation rate (u)"; mu REM INPUT "9. Selection coeficient (s)"; s LET q1 = .001 LET nl = 15000 LET mu = .000001 LET s = 1 PRINT PRINT "SIMULATION PARAMETERS" INPUT "6. Maximum number of generations (t)"; tm LET sim = 1000 INPUT "7. Number of simulations"; sim INPUT "8. Output file (final step)"; out$ REM INPUT "15. Detailed output file"; outsim$ LET outsim$ = "out" OPEN out$ FOR OUTPUT AS #1 OPEN outsim$ FOR OUTPUT AS #2 PRINT CLS PRINT PRINT "********************************************************" PRINT PRINT "SIMULATING...(1000 times)" PRINT PRINT "********************************************************" PRINT PRINT PRINT PRINT #1, " Simulation time q F N K " PRINT #2, " Simulation time q F N K "

148

APÊNDICE 1 (Continuação) FOR j = 1 TO sim LET K = k1 LET N = n1 LET q = q1 LET F = F1 CONST pi = 3.14159265359# RANDOMIZE (TIMER) FOR i = 1 TO tm IF q > 1 THEN LET q = .999999 md = 0 dp1 = ((q * (1 - q)) / (2 * N * nl)) ^ (1 / 2) u1 = RND u2 = RND x1 = md + SQR(-2 * LOG(u1)) * COS(2 * pi * u2) * dp1 x2 = md + SQR(-2 * LOG(u1)) * COS(2 * pi * u2) * dp2 load = 1 - (q * q * s * nl) LET q = q - (s * ((q * q) + (F * q * (1 - q)))) + mu + x1 IF q < 0 THEN LET q = .00001 LET F = ((1 / (2 * N)) + ((1 - (1 / (2 * N))) * F)) * (1 - (2 * mu)) * (1 - (s * q)) K = (1 - rk) * K REM mort = inb * F IF i >= 2 THEN N = N + (N * (EXP(rmax) * load) * (1 - ((N - 1) / K))) + x2 PRINT #2, USING " ########.### "; j; i; q; F; N; K REM PRINT USING " #######.### "; i; q; F; N; K IF N = 0 THEN GOTO xf: IF N < 0 THEN GOTO xf: NEXT i xf: IF N < 0 THEN LET N = 0 PRINT #1, USING " ########.### "; j; (i - 1); q; F; N; K NEXT j CLS PRINT PRINT "End of simulations" PRINT PRINT "Final simulation, time, q, F, N and K in the file "; out$ PRINT "(Detailed simulation results in the file "; outsim$; ")" CLOSE #1 CLOSE #2 PRINT PRINT PRINT

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APÊNDICE 1 (Continuação) PRINT INPUT "Do you wish a new simulation? (Y/N)"; g$ IF g$ = "Y" OR g$ = "y" THEN RUN PRINT PRINT "End of data processing..." STOP

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CONCLUSÕES

- Os marcadores STR (Short Tandem Repeats), são freqüentemente escolhidos para estimar a

variabilidade genética em populações naturais por serem altamente informativos. No entanto, o

uso destes marcadores é limitado, devido, o alto custo e elevado tempo necessário para o

desenvolvimento prévio dos marcadores. Neste estudo, constatou-se um elevado potencial de

transferibilidade de marcadores STR entre canídeos. Do total de 29 locos testados, 21% (6 pares

de primers) foram transferidos com sucesso, sendo que 83% (cinco pares de primers) foram

altamente polimórficos. Estes resultados são importantes uma vez que, permite a caracterização

da variabilidade genética destas populações e conseqüentemente subsidia estratégias de manejo

em populações naturais;

- Utilizando marcadores STR e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) estimou-se a

diversidade genética das populações de lobo-guará e de cachorro-do-mato do Parque Nacional das

Emas (PNE). Em média, a similaridade genética estabelecida com base no RAPD foi maior entre

os indivíduos da população de lobo-guará do que entre indivíduos da população de cachorro-do-

mato. No entanto, de um modo geral, os resultados do STR não indicaram uma significativa

redução na variabilidade genética e nem endogamia elevada, em nenhuma das duas populações

estudadas, e os parâmetros estão dentro da faixa de variação observada em populações de

canídeos no mundo. Portanto, deve-se pensar em propostas adequadas de conservação e manejo

destas espécies, principalmente do lobo-guará, que é uma espécie ameaçada de extinção, a fim de

aumentar a viabilidade das mesmas em longo prazo. Assim sendo, considerando que as principais

ameaças a estas espécies são a redução drástica do habitat, devido principalmente a ocupação

agropecuária, além dos atropelamentos, abates por chacareiros do entorno do PNE, introdução de

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espécies exóticas, etc, torna-se necessário uma educação ambiental mais eficiente para que

estratégias de conservação sejam mais bem estabelecidas.

- A associação entre a similaridade genética com a similaridade espacial, baseada nos dados de

área de vida do lobo-guará, permitiu constatar que a estruturação espacial da similaridade

genética foi significativa para os machos, quando considerado os dados obtidos com os

marcadores RAPD. Essa estruturação possivelmente seria explicada pelo baixo padrão de

dispersão entre os machos em relação às fêmeas nesta população. No entanto, os resultados

obtidos com os marcadores STR mostraram uma estruturação espacial da similaridade genética

entre as fêmeas, de acordo com um padrão de filopatria feminina. Uma vez que este padrão é mais

comum nestas espécies, pois para as fêmeas de mamíferos que investem muito no cuidado da

prole os benefícios ecológicos e sociais tendem a favorecer a filopatria feminina, acredita-se que

os resultados obtidos com os marcadores RAPD sejam artefatos. Entretanto, de um modo geral

como os valores das associações foram baixos (correlações matriciais em torno de 0,23), desse

modo acredita-se que quando ambos os indivíduos são beneficiados com a divisão de espaço,

aumenta-se a tolerância entre eles e assim sendo, a estruturação espacial varia muito mais devido

a demografia local e distribuição de recursos do que devido o grau de parentesco genético entre os

indivíduos.

- Quando foi avaliado o tempo de extinção (Te) nestas duas espécies de canídeos do PNE,

assumindo um modelo teórico que combinou os efeitos da depressão endogâmica sob

estocasticidade ambiental, constatou-se que os três parâmetros analisados e suas interações (taxas

de redução da capacidade de suporte, coeficientes de endogamia e flutuação no tamanho da

população), afetaram o Te médio. Uma combinação semelhante de parâmetros para as duas

espécies mostrou que a diminuição da população de lobo-guará é sempre mais rápida que a da

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população de cachorro-do-mato. Este resultado, é coerente com expectativas baseadas em

parâmetros demográficos e história de vida das duas espécies. Como o lobo-guará ocupa grandes

áreas de vida, possui baixa abundância populacional e certa especialização de habitat em relação

ao cachorro-do-mato, é esperado que esta espécie seja mais sensível a estes parâmetros,

principalmente a fragmentação de habitats. Porém, este estudo é apenas um ponto de partida para

estudos futuros que considerem parâmetros mais realistas da viabilidade destas populações e do

cenário sócio-econômico-ambiental da região sudoeste de Goiás, permitindo assim avaliações

mais precisas da persistência destas populações no PNE e entorno.