03/03/2017

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Diagnose de Doenças de PlantasFitopatologia Aplicada

Daniel Diego Costa Carvalho

Mestre em Fitopatologia (UFLA)

Doutor em Fitopatologia (UnB)

F2v004

Cada método é utilizado para diagnosticar?

Diagnose tradicional de doenças de plantas?

Diagnose baseada em sorologia e testes bioquímicos?

Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?

Diagnose baseada em técnicas moleculares?

1. Diagnose tradicional de doenças de plantas

1.1. Diagnose de doenças conhecidas (já descritas)

SINTOMA x SINAL

SINTOMAS: manifestação das reações da planta a um agentenocivo

SINAIS: Estruturas do patógeno, ou o próprio patógeno, presentesnas plantas doentes

Agrios, 2005.

Lobo Júnior et al., 2009.

Sclerotinia sclerotiorum Heterodera glycines

Agrios, 2005.

Citrus tristeza virus

Carvalho, 2015.Agrios, 2005.

Ralstonia solanacearum

Diagnose tradicional de doenças de plantas

Como as doenças de plantas são diagnosticadas?

SINTOMAS SINAIS

Carvalho, 2015.

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Descrição da sintomatologia de doenças:

Chaves de identificação publicadas em livros

Comparação entre as ilustrações e as plantas doentes

São suficientes para o diagnóstico de uma doença

Ex: antracnose em Jiló (Colletotrichum acutatum)

Carvalho, 2015.

Procedimentos para a diagnose de doenças conhecidas

Procedimento para a análise de laboratório

Informações de campo +

Teste laboratoriais para identificação do patógeno

Literatura

Doença conhecida

Doença desconhecida

1.2. Diagnose de doenças desconhecidas:

Nenhuma evidência de doenças conhecidas nomaterial analisado, o que fazer?

Postulados de Kock: Teste de patogenicidade

POSTULADOS DE KOCH

1. ASSOCIAÇÃO CONSTANTEO microrganismo deve estar associado à doença em todas as plantas examinadas.

2. ISOLAMENTO E CULTIVOO microrganismo deve ser isolado da planta doente, cultivado em cultura pura e suas características descritas.

3. INOCULAÇÃO (Teste de patogenicidade)O microrganismo em cultura pura deve ser inoculado sobre plantas sadias (mesma espécies ou variedade) e produzir a mesma doença.

4. REISOLAMENTOO microrganismo deve ser novamente isolado em cultura pura e exibir as mesmas características.

Regras para análise de sementes, 2009.

1.3. Diagnose de doenças em sementes contaminadas

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Aspergillus spp. e Cladosporium spp.

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blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro – após 7 diasa 20ºC.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Aspergillus sp. Cladosporium sp.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Figura 1. Cladosporium herbarum provenientes de sementes de feijão cv. ‘Pérola’. A.Hilo da semente de feijão comum colonizado por C. herbarum. B. Dentículo (cicatriz)nos conídios (seta).

Guimarães & Carvalho, 2014.

Guimarães & Carvalho, 2014.

Aspergillus sp.

Cladosporium sp.

- Lâminas microscópicas semi-permanentes

- para confirmação de cada gênero fúngico

Guimarães & Carvalho, 2014.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

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1.4. Diagnose de doenças que requer o isolamento dopatógeno

Schwartz et al., 2005.

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Foto: D.D.C.Carvalho (2009).Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Foto: D.D.C.Carvalho (2009). Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

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Foto: D.D.C.Carvalho (2009).

Carvalho et al., (2008).

Vasconcelos et al., (2014).

Vasconcelos et al., (2014).

1.5. Exemplos de Doenças de fácil Diagnose

Alternaria porri em cebola

Foto: E.Alves (2007).Carvalho, 2015.

Bolor (Penicillium sp)

Foto: E.Alves (2007).

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Acidovorax

Foto: D.Carvalho (2017).

1.6. Extração de nematóides para diagnóstico

Nematóide das galhas em FeijoeiroMeloidogyne sp.

Schwartz et al, 2005.

Agrios, 2005.

Pratylenchus sp.Tomate

Agrios, 2005.

Bean golden mosaic virus

Schwartz et al, 2005.

2. Diagnose baseada em sorologia

2.1. Enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA)

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3. Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica

3.1. Microscopia eletrônica de transmissão para auxílio na diagnose de vírus

Tobacco mosaic virusAlfalfa mosaic virus

Cucumber mosaic virus

Agrios, 2005.

Citrus tristeza virus

Cell inclusion bodies observed with an electron microscope.

Indicative of the presence of one or more viruses and, often, are diagnostic of the genus of the virus.

Typical pinwheel-like inclusion bodies diagnostic of potyviruses

Agrios, 2005.Agrios, 2005.

Nanismo do milho: Spiroplasma kunkelii

3.2. Microscopia eletrônica de transmissão e varredura para auxílio na diagnose de micoplasmas.

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4. Diagnose baseada em técnicas moleculares

4.1. Hibridização molecular

Imobilização do ácido nucléico em um suporte sólido e formação de híbridos

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Ácido Nucléico Imobilizado

Ácido Nucléico Imobilizado

Sonda

Sonda

Sondas Radioativas ** ** * * *

nucleotídeo radioativo (P-32)

DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTASHibridização molecular

Membrana

Membrana

Sondas Não Radioativas Digoxigenina/PA

EY YYE EE YEY

Revelar

NBT-BICPColorimetria

ECLQuimioluminescência

4.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Desenvolvido por Kary Mullis (Mullis & Faloona, 1987)

Amplifica fragmentos de DNA in vitro milhares de vezes

Reação:

DNA genômico

Tampão

Primers (~20 bases) “forward” e “reverse”

dNTPs (nucleotídeos A, T, C, G)

Taq (polimerase de DNA)

MgCl2 (Cofator da Taq)

H2O ultra pura

http://www.bio-rad.com/en-us/product/mj-mini-thermal-cycler

http://biomol.com.br/produto/amplitherm-termociclador-sem-gradiente-96-microtubos

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http://pt.depositphotos.com/45206661/stock-photo-loading-samples-into-gel-for.htmlhttp://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php

VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA

CF4 forward 5’-CACAGCCACCTACATGC 3’

CF5 reverse 5’- ATCGGGAGTCCGAG 3’

Detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens em sementes de feijão ( Phaseolus vulgaris)

(PCR)

Regras para análise de sementes, 2009.Análise eletroforética em gel de agarose (1%) dos produtos amplificados por PCR para confirmação da identidade dos isolados de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

Regras para análise de sementes, 2009.

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Aplicações da PCR:

Detecção

Identificação

Quantificação (PCR real time)

Fitopatógenos

Cada método é utilizado para diagnosticar?

Diagnose tradicional de doenças de plantas?Doenças conhecidas e doenças não conhecidasFungos, Bactérias, Micoplasmas, vírus, nematóides

Diagnose baseada em sorologia e testes bioquímicos?ELISA (vírus), testes bioquímicos (bactérias)Fungos, Bactérias, vírus

Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?MEV e METMicoplasmas (Spiroplasmas), vírus...

Diagnose baseada em técnicas moleculares?Fungos, Bactérias, vírus...

Bibliografia citada e recomendada:

AGRIOS, G.N. Plant Pathology. 5 ed. San Diego, Academic Press,2005, 948p.

CARVALHO, D.D.C.; ALVES, E.; BATISTA, T.R.S.; CAMARGOS, R.B.;LOPES, E.A.G.L. Comparison of methodologies for conidia production byAlternaria alternata from citrus. Brazilian Journal of Microbiology, v.39,p.792-798, 2008.

CARVALHO, D.D.C. Herbário de Doenças de Plantas – FitopatologiaAplicada. Ipameri: Universidade Estadual de Goiás, 2017, 32 p.

GUIMARÃES, G.R.; CARVALHO, D.D.C. Incidência e caracterizaçãomorfológica de Cladosporium herbarum em feijão comum cv. ‘Pérola’.Revista Brasileira de Biociências, v.12, n.3, p.137-140, 2014.

LOBO JUNIOR, M.; GERALDINE, A.M.; CARVALHO, D.D.C.; COBUCCI,T. Uso de cultivares de feijão comum com arquitetura ereta e cic loprecoce para escape do mofo branco ( Sclerotinia sclerotiorum).Embrapa Arroz e Feijão, Comunicado técnico, 182, 2009, 4p.

REGRAS PARA ANÁLISE DE SEMENTES. Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária.Mapa/ACS, Brasília, 2009, 399p.

SCHWARTZ, H.F.; STEADMAN, J.R.; HALL, R.; FOSTER, R.L.Compendium of bean diseases , 2nd ed. APS Press, St. Paul. 2005.

VASCONCELOS, C.V.; SILVA, D.C.; CARVALHO, D.D.C. Ocorrência deAlternaria alternata (Fr.:Fr) Kessil. em tubérculos de batata, no Brasil.Pesquisa Agropecuária Tropical , v.44, n.2, p.219-222, 2014.

Leitura Obrigatória:

REZENDE, J.A.M.; MASSOLA JUNIOR, N.S.; BEDENDO, I.P.;KRUGNER, T.L. Conceito de doença, sintomatologia e diagnose. In:AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual deFitopatologia: Princípios e conceitos . 4ed, Piracicaba, AgronômicaCeres, v.1, 2011, p.37-60.

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