fagocitose de células apoptóticas por macrófagos humanos análise por citometria de fluxo
TRANSCRIPT
Fagocitose De Células Apoptóticas Por Macrófagos
Humanos
Análise Por Citometria De Fluxo
Células apoptóticas são fagocitadas pelos
macrófagos humanos?
Materiais
Populações de• Macrófagos
• Neutrófilos
• Células apoptóticas
Marcadores:• CMFDA (5-cloromethylfluorescein diacetate)
• CD 14
• CD 15
• CD 16
• CD 62
Métodos
Citometria de Fluxo
Microscopia
Fluorescência
Problemas
Lavagem dos macrófagos – perda de células
Dificuldade na discriminação de células interiorizadas e periféricas
Quantificação microscópica demorada e pode conter erros significativos
Métodos
Amostra em fases – Percoll• Sangue periférico
• Células mononucleares
• Células polimorfonucleares
Separar os polimorfonucleares (95% neutrófilos)
• Ressuspender
• Centrifugar
• Incubar
Métodos
Neutrófilos são marcados com CMFDA
Macrófagos incubados com neutrófilos
Promove-se a fagocitose
Análise por citometria
Resultados – CMFDA
CMFDA marca os neutrófilos sem afectar o processo de apoptose.
• Não altera a velocidade da fagocitose
• Não interfere na superfície da célula
• Não altera a viabilidade dos macrófagos
Resultados – Fluorescência
Duas populações distintas de neutrófilos• Uniformidade da marcação
• Intensidade da fluorescência
Resultados – Fagocitose
R1 analisado por fotomicroscopia• 96% macrófagos
fagocitaram.
R2 e R3 percentagem reduzida (3%)
Resultados – Taxa Fagocítica
Variações da taxa de fagocitose com estímulos exteriores
Resultados – Resposta Fagocítica
Resposta fagocítica máxima demorada
Subestimada
Resultados – Lavagens
Perda de células
Diminuição da capacidade fagocítica
Subestimada
Discussão
Apoptose e remoção das células apoptóticas é fundamental
A quantidade de ensaios aumenta a hipótese de erros
Discussão
A citometria de fluxo é um importante mecanismo:
• Na distinção das células interiorizadas, das periféricas,
• Remoção do erro do observador,
• Elevado número de amostras,
• Não necessita de lavagens.
Ciência Viva
Sara Jorge
Julho 2010