Citometria de FluxoCitometria de Fluxo

Citometria: Citometria: Análise quantitativa de parâmetros celulares Análise quantitativa de parâmetros celulares

(células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc)(células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc)

Citometria de Fluxo:Citometria de Fluxo: Análise multiparamétrica de Análise multiparamétrica de

partículas (uma a uma) em suspensão.partículas (uma a uma) em suspensão.

Princípio:Princípio: Fazer passar as partículas em suspensão, de uma Fazer passar as partículas em suspensão, de uma

forma alinhada, por um feixe de luzforma alinhada, por um feixe de luz

A interacção das partículas com o feixe gera sinais A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são captados por detectores apropriados que são captados por detectores apropriados

A informação produzida pode ser gerada:A informação produzida pode ser gerada:- Pela dispersão do feixe de luzPela dispersão do feixe de luz- Pela luz emitida por fluorocromos após excitação Pela luz emitida por fluorocromos após excitação

pelo feixe de luzpelo feixe de luz

O que é um Citómetro de O que é um Citómetro de Fluxo?Fluxo?

Requisitos Básicos num Requisitos Básicos num Citómetro de FluxoCitómetro de Fluxo

• Suspensão de partículasSuspensão de partículas• Fluxo laminarFluxo laminar• Fonte de iluminação Fonte de iluminação • Câmara de FluxoCâmara de Fluxo• Filtração da dispersão de luz e Filtração da dispersão de luz e

fluorescência fluorescência • Captação da dispersão de luz e Captação da dispersão de luz e

fluorescênciafluorescência• Conversão dos sinais em valores Conversão dos sinais em valores

analógico-digitaisanalógico-digitais• Aquisição, Processamento, Análise e Aquisição, Processamento, Análise e

Armazenamento no computadorArmazenamento no computador

FluídosFluídosFluídosFluídos

ÓpticaÓpticaÓpticaÓptica

ElectrónicaElectrónicaElectrónicaElectrónica

Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath fluid)Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath fluid), , passando por um pequeno orifício central do fluxo (50-300 µm)passando por um pequeno orifício central do fluxo (50-300 µm)

As partículas fluem no centro, não se misturando com o restante As partículas fluem no centro, não se misturando com o restante líquido de envolvimentolíquido de envolvimento

A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação da pressão são A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação da pressão são conseguidas através:conseguidas através:

- Pressão Diferencial- Pressão Diferencial - Velocidade de Fluxo- Velocidade de Fluxo

- Fluxo Contínuo- Fluxo Contínuo

FluídosFluídos

Agulha deinjecção

Dispersão laserDispersão laser

Líquido de envolvimento

Ponto de HidrofocagemPonto de Hidrofocagem

LaserLaser

Câmara de FluxoCâmara de Fluxo

ÓpticaÓptica

Fontes de iluminação: Fontes de iluminação: – Lâmpadas de MercúrioLâmpadas de Mercúrio

– LasersLasers

Emite num Emite num comprimento de onda comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), (ex: 488 nm- azul), monocromático.monocromático.

Produz um feixe de Produz um feixe de luz coerenteluz coerente

LaserLaser

Fotosensor de Dispersão Frontal Fotosensor de Dispersão Frontal (FS)(FS)

Capta a intensidade da dispersão frontalCapta a intensidade da dispersão frontal

A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao tamanho e forma das A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao tamanho e forma das

partículaspartículas. .

Sensor de FS

Laser

Fotosensor de Dispersão Lateral Fotosensor de Dispersão Lateral (SS)(SS)

Capta a intensidade e luz dispersa a 90Capta a intensidade e luz dispersa a 90oo

A intensidade dessa dispersão é proporcional ao A intensidade dessa dispersão é proporcional ao

tamanho, granularidade e forma das partículastamanho, granularidade e forma das partículas

Laser

Sensor de FS

Sensor SS 900

Dispersão da FluorescênciaDispersão da Fluorescência A fluorescência emitida é detectada por fotosensores que recebem o A fluorescência emitida é detectada por fotosensores que recebem o

comprimento de onda seleccionadocomprimento de onda seleccionado A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela

selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de filtros e de espelhos.filtros e de espelhos.

Laser

Sensor de FS

Detectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)

Tipos de fluorocromosTipos de fluorocromos

Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)

Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)

FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667

Espectros de Excitação / Espectros de Excitação / EmissãoEmissão

488488

EthidiumEthidium

PEPE

Texas RedTexas Red

PIPI

FITCFITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm

457350 514 610 632

Características dos fluorocromos:

1) Emissão adequada (> 600 nm) de forma a minimizar problemas de autofluorescência

2) Emissâo de intensidade significativamente maior que a de autofluorescência

3) Espectro não sobreposto com outros fluorocromos

4) Facilmente conjugável com anticorpos

Fuorescências derivadas de Energias de Transferência

• Sobreposição de emissão de luz dos fluocromos• Tranferência dessa luz entre o 1º e o 2º fluorocromo • O segundo emite num comprimento de onda superior ao primeiro

Filtro ou Espelho Dicrónico Filtro ou Espelho Dicrónico Colocado a Colocado a 4545oo

Luz Luz ReflectiReflecti

dada

Luz TransmitidaLuz TransmitidaFonte de LuzFonte de Luz

PMT

PMT

PMT

PMT

Filtros Dicróicos

Filtros Bandpass

Laser

1

2

3

4

Câmara deFluxo

Fotosensores

Captação dos Parâmetros Captação dos Parâmetros de Análise:de Análise:

ElectrónicaElectrónica

Processamento Processamento

electrónico do sinal electrónico do sinal

gerado nos sensores gerado nos sensores

que é traduzido num que é traduzido num

histograma ou scatter histograma ou scatter

plotplot

O que pode então dizer um Citómetro de O que pode então dizer um Citómetro de fluxo de uma célula?fluxo de uma célula?

Tamanho (FSC)Tamanho (FSC)Complexidade (SSC)Complexidade (SSC)

Fluorescência relativa.Fluorescência relativa.(FL1, FL2, FL3(FL1, FL2, FL3, ,

MetabolismosMetabolismos

ReceptoresReceptores DNADNA CitocinasCitocinas

EnzimasEnzimas

Antígenos celularesAntígenos celularesTamanhoTamanho

ComplexidadeComplexidade

AplicaçõesAplicações

ImunologiaImunologia HematologiaHematologia Anatomia patológicaAnatomia patológica Biologia celularBiologia celular OncologiaOncologia

Aplicações diversasAplicações diversas

• Detecção de apoptose

• Permeabilidade membranar

• Mudanças do conteúdo

•de DNA

• Estudos enzimáticos

• funcionais

• Resistência a fármacos 0 200 600 800 1000

GG00 /G/G11

SSGG22/M/M

DNA content2N2N 4N4N

Imunologia - Aplicações Imunologia - Aplicações práticaspráticas

• Separação de células sanguíneas• Diferenciação de sub populações de linfócitos T• Diferenciação linfócitos B• Diferenciação de células NK• Quantificação antigénica• Variações linfoproliferativas (idade,•, imunodeficiências, neoplasias, transplantes, •doenças autoimunes, inflamações)• Fagocitose

Granulócitos

Monocitos

Linfocitos

• Separação de células Separação de células sanguíneassanguíneas

Diferenciação da subpopulação de Diferenciação da subpopulação de linfócitoslinfócitos

Os linfócitos T, originados no Timo experimentam Os linfócitos T, originados no Timo experimentam maturação que resulta de um processo de selecção positiva e maturação que resulta de um processo de selecção positiva e negativa, durante o qual se formam as células CD4 e CD8. negativa, durante o qual se formam as células CD4 e CD8. Os linfócitos B originados na medula óssea vão expressando Os linfócitos B originados na medula óssea vão expressando sequencialmente antigénios específicos CD19+, CD10+ e sequencialmente antigénios específicos CD19+, CD10+ e CD20+, até se diferenciarem terminalmente CD20+, até se diferenciarem terminalmente

em Igs.em Igs.

As células NK carecem de marcadoresAs células NK carecem de marcadores

das células T ou B, mas são constitutivamentedas células T ou B, mas são constitutivamente

citotoxicas. Na sua diferenciação citotoxicas. Na sua diferenciação

associam-se a marcadores de funçõesassociam-se a marcadores de funções

linfocitárias: CD16linfocitárias: CD16

• Quantificação antigénica/ maturação

FACSFluorescence-activated cell sorter

• Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas diferentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8)

• Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente.

• O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser

488 nm laser

+Placas CarregadasPlacas Carregadas

Tubos para Recolha do Tubos para Recolha do Produto SeparadoProduto Separado

Sensor FsSensor Fs

Detectores de Detectores de FluorescênciasFluorescências

-

FACS: desenhado para a análise FACS: desenhado para a análise computarizada de células e computarizada de células e separaçaõ das mesmasseparaçaõ das mesmas

No exemplo, uma população celular mista é marcada com 2 anticorpos No exemplo, uma população celular mista é marcada com 2 anticorpos específicos de antigénios de superfície : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-específicos de antigénios de superfície : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-A são marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a A são marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a população é introduzida na camara de FACS. As células vão ser expelidas população é introduzida na camara de FACS. As células vão ser expelidas pelo “nozzle” gerando microgotas, cada contendo uma única célula. Cada pelo “nozzle” gerando microgotas, cada contendo uma única célula. Cada microgota assim que expelida recebe uma pequena carga eléctrica-microgota assim que expelida recebe uma pequena carga eléctrica-excitação do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a excitação do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a intensidade da fluorescência emitida e detectada no computador. Esta carga intensidade da fluorescência emitida e detectada no computador. Esta carga eléctrica dirigida por 2 placas de deflecção faz que cada microgota possa eléctrica dirigida por 2 placas de deflecção faz que cada microgota possa ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar as populações com perfis diferentes- População A e População B. No as populações com perfis diferentes- População A e População B. No computador cada “dot” representa uma célula, e as células que “caem” à computador cada “dot” representa uma célula, e as células que “caem” à esquerda inferior do quadrante do scatter são consideradas background- esquerda inferior do quadrante do scatter são consideradas background- não reagiram c/ anti-A ou anti-B.não reagiram c/ anti-A ou anti-B.

Aplicações clínicas: são Aplicações clínicas: são múltiplas principalmente na múltiplas principalmente na detecção de antigénios “target” detecção de antigénios “target” nas células sanguíneasnas células sanguíneas Classificação de leucemiasClassificação de leucemias Detecção de HIVDetecção de HIV Marcadores tumoraisMarcadores tumorais Na previsão da evolução do curso de doençaNa previsão da evolução do curso de doença Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas

e víruse vírus Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e

antigénios viraisantigénios virais Teste de susceptibilidade a drogasTeste de susceptibilidade a drogas