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Extração Líquido-Líquido
Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em
uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os entre fases líquidas parcialmente solúveis ou
insolúveis.
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PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS
Purificação
Clarificação
Rompimento Celular
Separação de Células
Bioprodutos Intracelulares
Bioprodutos Extracelulares
Acabamento
BIOPRODUTO
ELLBio
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Sistemas Poliméricos (PEG)
de Duas Fases Aquosas
(SPDFA)
Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas
(SMDFA)
Sistemas Micelares Reversos
(SMR)
ELLBio
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS
Vantagens comuns aos 3 métodos
• Rápidos
• Baixo custo
• Biocompatíveis
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- massa
Fase Líquida Inicial
Meio inicial: solução e/ou suspensão
Fase Líquida II(inferior)
Fase Líquida I(superior)
Sistema de duas fases
transferência de massa
Processo de separação de fases
A FI
AFII
K =
FP =Ae(fase ext)
Ae(inicial)
R(%) =AFI
Ainicial
. 100
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separação – em função da diferença de solubilidade da biomolécula nas fases
1) Dois polímeros não-iônicos:
PEG x Dextrana
PEG x Polivinil álcool
PPG x Dextrana
Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana
2) Polieletrólito x Polímero não-iônico
Sulfato dextrana de sódio x polipropileno-glicol
Carboximetilcelulose de sódio x metil celulose
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3) Dois polieletrólitos
Sulfato dextrana de sódio x carboximetildextrana de sódio
Carboximetildextrana de sódio x carboximetilcelulose de sódio
4) Polímero não-iônico x Composto de baixa massa molar
PPG x fosfato de potássio
PEG x fosfato de potássio
metoxipolietileno glicol x fosfato de potássio
PPG x glicose
PEG x glicose
PEG x sulfato de magnésio
PEG x citrato de sódio
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PEG x Dextrana
PPG x Dextrana
PEG x fosfato de potássio
PEG x sulfato de magnésio
PEG x citrato de sódio
• Rápida separação de fases
• Baixo custo
• Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade
Fase de fundo
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Diagrama de fases:
• ordenada: composição da molécula de maior concentração na fase de
TOPO (PEG, por exemplo)
• abscissa: composição da molécula de maior concentração na fase de
FUNDO (Fosfato, por exemplo)
• ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases
• o diagrama pode ser construído, determinando-se a composição das fases
em equilíbrio de uma série de sistemas
• pontos acima da curva binodal: formação de duas fases
• pontos abaixo da curva binodal: única fase
Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema
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PEG (%massa)
T
M
B
Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato
Fosfato (%massa)
Composição inicial
Composição da fase Topo
Composição da fase de Fundo
Linha de amarração ou “tie line”Curva binodal
C
Ponto crítico
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Linha de amarração sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final
• As relação de volumes entre as fases varia com a composição -
de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM
• Segmento TM – proporcional ao volume da fase de FUNDO
• Segmento BM – proporcional ao volume da fase de TOPO
• C - Ponto crítico – composições e volumes da fase TOPO e FUNDO são iguais. Sistema instável.
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VOLUMES DAS FASES EM FUNÇÃO DAS
CONCENTRAÇÕES DOS COMPONENTES DO
SISTEMA DE EXTRAÇÃO POR SPDFA
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0 5 10 15 20 250
10
20
30
40
50
pH 6,5 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0
PE
G 6
00 (%
p/p
)
Fosfato de Potássio (% p/p)
Curvas binodiais de sistemas com PEG 600 em diversos valores de
pH
0 5 10 15
0
10
20
30
40
50
pH 5,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0
PEG
600
0 (%
p/p
)
Fosfato de Potássio (% p/p)
Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos
valores de pH
A variação do pH altera a razão H2PO4-/HPO4
-2
varia a composição o equilíbrio entre as fases
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0 5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
PEG 600 PEG 1500 PEG 4000 PEG 6000
PE
G (%
p/p
)
Fosfato de Potássio (% p/p) pH 8,0
Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000 em pH 8,0
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fórmula geral: HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH.
Massas molares:
Abaixo de 1000 Daltons: líquido
Acima de 1000 Daltons: sólido (pó, flocos)
Prática:
Soluções-Estoque 50% m/m
Não se trabalha com
volume devido à alta viscosidade
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FATORES QUE INFLUENCIAM NO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (K) DE BIOMOLÉCULAS
Interações HidrofóbicasCargas superficiais / pHDiferença de Potencial Elétrico entre as FasesEfeito de “Salting-Out” da fase salinaDiferenças de ViscosidadeDiferenças de DensidadeInterações BioespecíficasDiagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex.)Massa molar da biomolécula
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Fatores Ambientais
1 Concentração de Polímeros2 Tipo e Concentração de Sal3 Ligantes4 Massa Molar do PEG5 pH6 Temperatura7 Tempo de Mistura e Separação
Fatores Estruturais
1 Resíduos hidrofóbicos
2 Massa molar da Biomolécula
3 Formato da biomolécula
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FiCTiC
K =
Coeficiente de Partição
CTi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de topo
CFi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de fundo.
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100VCVC
(%)Rinicialinicial
topotopotopo
Rtopo = rendimento na fase de topo (%)
Ctopo = concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L ou U/mL)
Cinicial = concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração
(g/L ou U/mL)
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totaisproteínas
alvoabiomolécul
KKS
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100).VC
VCVC(BM
inicialinicial
fundofundotopotopo
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Extração de retamicina (fase de topo) de meio contendo células de Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).
PEG/Sodium Citrate PEG/Potassium Phosphate
Clarificação simultânea à purificação
células na interface células no fundo
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• Têm como base a capacidade que as biomoléculas têm de reconhecer e se ligar a outras moléculas, especificamente
• Interações por afinidade: aumentam a partição - K Kaf
• O ligante é ligado covalentemente ao polímero – em geral PEG
formação do complexo polímero-ligante-biomolécula
• O PEG reage facilmente com ligantes, pois contém hidroxilas substituíveis
• O ligante pode ser natural ou sintético
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• custo x benefício deve ser favorável
•o ligante deve ser bifuncional – um sítio de ligação para afinidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero
• deve ser estável durante a imobilização
• deve ser estável durante o processo de extração
•não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula
• não deve ser tóxico
• disponível
• fácil rompimento da interação polímero/biomolécula.
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Exemplos de material purificado por partição de afinidadeSistema Material purificado LigantePEG/Dextrana -galactosidase APGP
PEG/palmitato BSA e -lactalbumina Ácidos graxos
PEG/fosfato Proteína A IgG humana
PEG/fosfato Penicilina acilase Trimetilamina
PEG/Dextrana Tripsina Inibidor de tripsina
PEG/Dextrana Lipossomos Avidina
Dext./Hidropropildextrana.
Quimosina pepstatina
PEG/Dextrana Módulos de carbohidrolases Domínios de ligação da celulose
PEG/Dextrana Membranas da glândula lacrimal Aglutinina de trigo
PEG/fosfato Amido Glicoamilase
PEG/Dextrana Aglutinina de germe de trigo Membrana plasmática de fígado de rato
PEG/Dextrana Ácidos graxos de cadeia entre C2 à C18 Albumina do soro humano, ß-lactoglobulina, hemoglobulina, mioglobina
PEG/Dextrana Ácidos graxos saturados de cadeia entre C2 à C18 e insaturados de 18:1, 18:2 e 18:3, grupos acila e Benzoatos
Albumina, lizozima, ribonuclease, α2- macroglobulina
PEG/Dextrana IgG com fluído de ferro magnetizado Proteína A
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Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a molécula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.
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Processo de reciclagem do polímero
![Page 31: Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os](https://reader038.vdocuments.com.br/reader038/viewer/2022102623/570638401a28abb8238f13a5/html5/thumbnails/31.jpg)
Proteínas purificadas por partição de metal-afinidade em SDFA
Proteína MetalCitocromo c de Candida krusei CobreHemoglobina bovina Cobre, FerroEritrócitos Cobre, Zinco2macroglobulina Cobre, Zinco
Hemoglobina humana CobreFosvitina FerroOxinitrilase CobreDesidrogenases alcoólicas, lactato e malato desidrogenase
Cobre, Níquel, Zinco e Cádmio
Linfócitos Cobre, Níquel, Zinco
Lactato desidrogenase CobreCélulas de mamíferos Cobre Peroxidase de nabo CobrePeroxidase de soja CobreProteina de membrana: citocromo bo(3) ubiquinol oxidase c
Cobre
Lactato desidrogenase acoplada a resíduo de polihistidina
Cobre
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Biomoléculas nucleotídeo-dependentes purificadas em SDFA com afinidade a corantes.
SistemaBiomolécula Ligante acoplado
ao PEG
PEG/Dextrana
Lactato desidrogenase Corante triazina Cibacron Blue F3G-A
PEG/fosfato
Lactato desidrogenase Eudragit-Cibacron Blue
PEG/Dextrana
Fosfofrutoquinase de levedura
Cibacron Blue F3G-A-PEG
PEG/Dextrana
Isoenzimas de fosfatase alcalina
Procion Yellow H-E3G-PEG
PEG/Dextrana
Fosfoglicerato quinase Cibacron Blue-PEG
PEG/Dextrana
Formato desidrogenase Cibacron Blue-PEG
PEG/fosfato
Xilose redutase Drimaren
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)(
)(
ligantesemPEG
ligantePEGaf K
KK
![Page 34: Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os](https://reader038.vdocuments.com.br/reader038/viewer/2022102623/570638401a28abb8238f13a5/html5/thumbnails/34.jpg)
Equipamentos para extração com sistemas de duas fases aquosas
Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas funções:
1. Estabelecer o contato entre as duas fases líquidas do sistema para possibilitar a transferência de massa
2. Separar os dois líquidos após a extração
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Equipamento por estágios
• Misturador – decantador*• Misturador – decantador em cascata vertical
Equipamentos de contato diferencial• Coluna de extração por estágios
• Coluna de extração spray*
• Coluna de extração com recheio
• Extrator de discos rotativos perfurados
• Extrator Graesser
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![Page 37: Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os](https://reader038.vdocuments.com.br/reader038/viewer/2022102623/570638401a28abb8238f13a5/html5/thumbnails/37.jpg)
![Page 38: Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os](https://reader038.vdocuments.com.br/reader038/viewer/2022102623/570638401a28abb8238f13a5/html5/thumbnails/38.jpg)
Equipamentos centrífugos
Mais importante: extrator Podbielniak
Tambor cilíndrico com placas concêntricas
Fase pesada é alimentada no centro do tambor enquanto a fase leve é alimentada na periferia do extrator
Escoamento contra-corrente