1. DELCIO SANDI EXTRAO DO LEO E DITERPENOS DO CAF COM CO2 SUPERCRTICOTese apresentada Universidade Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps- Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos para obteno do ttulo de Doctor Scientiae.VIOSA MINAS GERAIS BRASIL 2003

2. A Deus.Aos meus pais Ari e Gesira. Aos meus irmos Gery, Jarbas e Fernanda. Patrcia.ii 3. AGRADECIMENTOSA Deus, fonte de toda a fora. Aos amigos de Viosa, em especial a lan, Jnior, Leonardo, Renato, Viviane, Kiu, Frederico, Alexandre, Henrique, Paulo, Luiza, e a todos que de alguma forma estiveram comigo nesta conquista. Ao professor Jlio, pela orientao e sugestes, e por possibilitar o meu enriquecimento profissional. Aos professores Marco Tlio e Jane, pelas contribuies, conselhos, apoio e incentivo. Aos amigos do Laboratrio de Anlise de Alimentos pelo constante incentivo, Tarso, Marcondes, Srgio, Baltazar, Maurcio, Everaldo, Mrcio, Cludia, Fabiana, Paula e Vivian. Aos funcionrios do DTA, Ado, Z Raimundo, Z Geraldo, Jos Toms, Valente, Manoel, Geralda, Tito, Maria Rita, Vnia, Sueli, Valrio e Lgia, pela ateno, pelo convvio e ajuda dispensadas. Universidade Federal de Viosa ao DTA e ao CNPq, pela oportunidade e pelo auxlio financeiro. A Companhia de Caf Trs Coraes, especialmente a Gustavo do Vale pela doao do caf utilizado neste trabalho. Igualmente, a Companhia Cacique de Caf e ao Sr. Edenir Gualtieri, pelo fornecimento do leo de caf utilizado no desenvolvimento das metodologias de anlise. Aos meus pais, por terem me dado a oportunidade de crescer em todos os sentidos, pelo apoio constante, fora, sensatez e preocupao em todos os momentos. Aos meus irmos, pela ajuda e incentivo constantes. Patrcia, namorada, s vezes me e irm, companheira e amor, em todas as horas, pela compreenso, pelo carinho e pacincia em todos os momentos desta jornada.iii 4. LISTA DE SMBOLOS:CO2-SC = dixido de carbono supercrtico DTP tot = diterpenos totais = cafestol + caveol FCO2 = fluxo de CO2 (mL/min) GC = granulometria do caf (mm) P = presso do CO2 (bar) Pc = presso crtica PR = (P/Pc) = presso reduzida MSE = massa de caf submetida extrao (mg) T = temperatura de extrao (C) Tc = temperatura crtica TED = tempo de extrao dinmico (min) TEE = tempo de extrao esttico (min) TR = (T/Tc) = temperatura reduzida = densidade do CO2 (g/mL) c = densidade do CO2 no ponto crtico (g/mL) R = (/c) = densidade reduzida AFB1 = aflatoxina B1 AFBO = aflatoxina B1-8,9-epxido BHA = 3-tert-butil-4-hidroxianisole DMBA = 7,12-dimetilbenz[]antraceno GCS = glutamilcistena sintetase GSH = glutationa GST = glutationa-S-transferase PhIP = 2-amino-1-metil-6-fenilimidazol [4,5-b] piridina iv 5. NDICEPginaRESUMO viii ABSTRACTx INTRODUO1 REVISO BIBLIOGRFICA 4 1. Teoria dos fluidos supercrticos 5 1.1. Dixido de carbono como fluido supercrtico (CO2-SC)11 2. Aplicaes dos fluidos supercrticos12 2.1. Extrao de leos vegetais com fluidos supercrticos15 3. O caf16 4. O leo de caf17 4.1. Teor de leo17 4.2. Composio do leo18 5. Aplicaes do leo de caf verde na indstria de alimentos e20farmacutica 6. Aplicaes do leo de caf torrado na indstria de alimentos25 7. Aplicaes na indstria de cosmticos 26 8. Propriedade hipercolesterolmica e hiperlipidmica do leo de caf28 CAPTULO 1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA E DO33 LEO EXTRADO COM SOLVENTE 1.1. INTRODUO33 1.2. MATERIAL E MTODOS34 1.2.1. Preparo da matria-prima35 1.2.2. Teor de umidade da matria-prima35 1.2.3. Determinao do extrato etreo35 1.2.4. Perfil de cidos graxos e teor de diterpenos do leo36 1.2.4.1. Preparo das amostras36 1.2.4.2. Determinao do perfil dos cidos graxos36 1.2.4.3. Determinao do teor de diterpenos36 1.3. RESULTADOS E DISCUSSO37 1.3.1. Obteno do caf triturado37 1.3.2. Teores de umidade e de leo 38 1.3.3. Perfil de cidos graxos do leo do caf 39 1.3.4. Determinao do teor de diterpenos do leo40 1.3.4.1. Determinao do ndice de recuperao do mtodo 40 1.3.4.2. Teor de diterpenos42 1.4. CONCLUSES44 CAPTULO 2 EXTRAO DO LEO DE CAF VERDE COM CO245SUPERCRTICO 1.1. INTRODUO46 1.2. MATERIAL E MTODOS49 1.2.1. Preparo da matria-prima49 1.2.2. Extrao do leo com solvente 49 1.2.3. Extrao do leo com CO2 supercrtico 49 1.2.4. Determinao da quantidade de leo extrada 52 1.2.5. Perfil de cidos graxos e teor de diterpenos do leo52v 6. 1.2.5.1. Preparo das amostras 52 1.2.5.2. Determinao do perfil dos cidos graxos 53 1.2.5.3. Determinao do teor de diterpenos 53 1.3. RESULTADOS E DISCUSSO 54 1.3.1. Perfil dos cidos graxos 54 1.3.2. Curva de calibrao e ndice de recuperao do mtodo56 utilizado na determinao dos diterpenos 1.3.3. Estudos preliminares para a otimizao do rendimento em58leo pelo CO2-SC 1.3.4. Etapa 1 Rendimento em leo em funo da temperatura e60da densidade de extrao 1.3.4.1. Efeito da presso - comportamento retrgrado 63 1.3.5. Etapa 1 Teor de diterpenos em funo da densidade e65 temperatura de extrao 1.3.6. Etapa 2 Rendimento em leo e respectivo teor de diterpenos 70de acordo com o tempo de extrao esttica; fluxo de CO2;quantidade de caf submetida extrao; granulometria docaf; e tempo de extrao dinmica 1.3.6.1. Rendimento em leo e respectivo teor de diterpenos de72acordo com o tempo de extrao esttica (TEE)1.3.6.2. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com a73 quantidade de caf submetida extrao (QSE)1.3.6.3. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com o fluxo74de CO2 (FCO2)1.3.6.4. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com a76 granulometria do caf (Gc)1.3.6.5. Rendimento em leo de acordo com o tempo de extrao80dinmica (TED)1.3.6.6. Teor de diterpenos de acordo com o tempo de extrao85 dinmica (TED) 1.4. CONCLUSES 88 CAPTULO 3 EXTRAO DO LEO DE CAF TORRADO COM 90CO2 SUPERCRTICO 1.1. INTRODUO 91 1.2. MATERIAL E MTODOS 92 1.2.1. Preparo da matria-prima 93 1.2.2. Extrao do leo por solvente93 1.2.3. Extrao do leo pelo CO2 supercrtico 93 1.2.4. Determinao da quantidade de leo extrada96 1.2.5. Perfil de cidos graxos e teor de diterpenos do leo 96 1.2.5.1. Preparo das amostras 96 1.2.5.2. Determinao do perfil dos cidos graxos 96 1.2.5.3. Determinao do teor de diterpenos 97 1.3. RESULTADOS E DISCUSSO 98 1.3.1. Perfil dos cidos graxos 98 1.3.2. Curva de calibrao e ndice de recuperao do mtodo99 utilizado na determinao dos diterpenos 1.3.3. Estudos preliminares para a otimizao do rendimento em101leo pelo CO2-SCvi 7. 1.3.4. Etapa 1 Rendimento em leo em funo da temperatura e103da densidade de extrao 1.3.4.1. Efeito da presso - comportamento retrgrado 107 1.3.5. Etapa 1 Rendimento em leo em funo da temperatura e109da densidade de extrao 1.3.6. Etapa 2 Rendimento em leo e respectivo teor de diterpenos 113de acordo com o tempo de extrao esttica; fluxo de CO2;quantidade de caf submetida extrao; granulometria docaf; e tempo de extrao dinmica 1.3.6.1. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com o 114 tempo de extrao esttica (TEE) 1.3.6.2. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com a 116 quantidade de caf submetida extrao (QSE) 1.3.6.3. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com o fluxo 117de CO2 (FCO2) 1.3.6.4. Rendimento em leo e respectivo teor de acordo com a 119 granulometria do caf (Gc) 1.3.6.5. Rendimento em leo de acordo com o tempo de extrao 122dinmica (TED) 1.3.6.6. Teor de diterpenos de acordo com o tempo de extrao 126 dinmica (TED) 1.4. CONCLUSES 128 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS130 vii 8. RESUMOSANDI, DELCIO. D.S. Universidade Federal de Viosa, janeiro de 2003. Extrao do leo e diterpenos do caf com CO2 supercrtico. Orientador: Jlio Maria de Andrade Arajo. Conselheiros: Marco Tlio Coelho da Silva, Jane Slia dos Reis Coimbra.Foi testada a viabilidade tcnica para a extrao dos leos de caf verde e caf torrado pelo CO2-SC. Foram avaliados o perfil dos cidos graxos e os teores de cafestol e caveol, diterpenos presentes exclusivamente no caf. Foram determinadas as condies operacionais para obter a maior quantidade de leo para ambos os tipos de caf, entretanto, com o maior teor de diterpenos possvel no leo de caf verde, e o menor, no leo de caf torrado. Para isso, foram otimizadas primeiramente a temperatura de operao (60 C, 70 C, 80 C e 90 C) e a densidade do CO2 (0,68 g/mL, 0,71 g/mL, 0,74 g/mL, 0,77 g/mL, 0,81 g/mL, 0,84 g/mL e 0,88 g/mL), tanto para o caf verde quanto para o torrado, mantendo-se constantes as variveis tempo de extrao esttica (5 min); granulometria do caf (0,297 mm a 0,35 mm); massa de caf submetida a extrao (200 mg); fluxo do CO2 (1,5 mL/min), e tempo de extrao dinmico (20 min). Para cada temperatura e densidade, foram escolhidas as trs condies de extrao para as quais os objetivos pr estabelecidos foram alcanados. Foram ento otimizados, o tempo de extrao esttica (0 min, 2 min e 5 min); a granulometria do caf (0,297 mm a 0,35 mm; 0,35 mm a 0,42 mm, 0,42 mm a 0,50 mm); a massa de caf submetida extrao (100 mg, 150 mg e 200 mg); o fluxo do CO2 (1,5 mL/min, 2,0 mL/min e 2,5 mL/min), e o tempo de extrao dinmico (5 min, at a extrao de leo mxima). Os resultados obtidos para o teor de leo, o perfil de cidos graxos e o seu contedo de diterpenos, foram comparados com o leo obtido por extrao em equipamento de Soxhlet, utilizando hexano como solvente. O perfil de cidos graxos foi semelhante para os dois mtodos extrativos. As diferentes densidades e temperaturas utilizadas na extrao por CO2-SC no proporcionaram diferenas no perfil dos cidos graxos. O CO2-SC proporcionou a extrao de todo o leo presente no caf, determinado pela extrao com hexano. As caractersticas da matria-prima e as condies utilizadas foram, respectivamente, para o leo de caf verde e torrado: umidade do caf de 9,98viii 9. % e 2,40 %; granulometria do caf de 0,297 mm a 0,35 mm, para ambos os casos; massa de caf submetida extrao igual a 200 mg, para ambos os casos; fluxo do CO2 de 1,5 mL/min e 2,0 mL/min; no utilizao de extrao esttica e emprego de 5 min de extrao esttica. Para o leo de caf verde, a temperatura da extrao e a densidade do CO2 mais eficientes, em termos de quantidade de leo obtida e consumo de CO2 foram de 90C e 0,77 g/mL, respectivamente. Estas condies promoveram a completa extrao do leo em 20 min, consumindo 28,6 g de CO2 (7,13 x 10-4 g de leo por g CO2). Em relao ao teor de diterpenos, a temperatura de 70 C e densidade do CO2 de 0,74 g/mL, foram as que proporcionaram a maior concentrao. Os teores de cafestol e de caveol no leo foram de 201,7 mg/ 100 g e 251,6 mg/100 g, respectivamente. Estes dados so, respectivamente, 52,5 % e 52,8 %, menores que os teores de cafestol e de caveol no leo extrado com hexano. Para o leo de caf torrado, o processo extrativo 70 C e densidade do CO2 de 0,84 g/mL, por 20 min, foi suficiente para promover a sua completa extrao. Esta condio foi tambm a mais eficiente na reduo do teor de diterpenos presentes no leo. Os teores de cafestol e de caveol foram, respectivamente, de 94,4 mg/ 100 g e 114,7 mg/ 100g, representando uma reduo de 71,3 % e 71,2 %, em relao aos teores destes componentes determinados no leo extrado com solvente. De uma forma geral, foi observada uma relao inversa entre a quantidade de leo obtida e o teor de diterpenos. Por isso, diferentes teores de leo, com diferentes teores de diterpenos podem ser obtidos por esta tcnica, tornando-a potencialmente interessante para a obteno deste produto. Para o leo de caf torrado, por exemplo, a reduo do seu teor de diterpenos em at 71 %, aumenta significativamente a sua estabilidade, a sua qualidade sensorial e reduz o seu potencial hipercolesterolmico. ix 10. ABSTRACTSANDI, DELCIO. D.S. Universidade Federal de Viosa, January, 2003. Supercritical fluid extraction of coffee diterpenes and coffee oil. Adviser: Jlio Maria de Andrade Arajo. Committee members: Marco Tlio Coelho da Silva, Jane Slia dos Reis Coimbra. This study was carried out to test the feasibility of supercritical carbon extraction of oil from both green and roasted coffee beans. The oil composition regarding to fatty acid profile (FA) and levels of the diterpenes cafestol and khaweol (both found exclusively in coffee beans) was evaluated. Operational conditions were initially determined to maximize oil extraction from both green and roasted coffee beans. Also, conditions were study to obtain the highest and the lowest diterpene levels on green and roasted coffee oil, respectively. To accomplish this, operational temperature (60, 70, 80 and 90 C) and CO2 density (0.68, 0.71, 0.77, 0.81, 0.84 and 0,88 g mL-1) were optimized for coffee oil extraction. Time static extraction (5 min), granulometry (0.297 to 0.35 mm), extraction sample weight (200 mg), CO2 flow (1.5 mL min-1), and time of dynamic extraction (20 min) were kept constant. For each temperature and density combination, three extraction conditions were selected to obtain the pre- determined objectives. Therefore, static extraction time (0, 2 and 5 min), granulometry (0.297 to 0.35 mm; 0.35 to 0.42 mm; 0.42 to 0.50 mm), extraction sample weight (100, 150 and 200 mg), CO2 flow (1.5, 2.0 and 2.5 mL min-1) and dynamic extraction time (5 min until the maximum oil extraction) were optimized. Oil content levels, FA and diterpene concentration of the oil were compared to the results obtained with the extraction with Soxhlet apparatus, in which hexane was utilized as solvent. FA profile was similar in both oil extraction methods. In addition, FA composition was not modified by the different density and temperature combinations used in the SC-CO2. However, SC-CO2 was able to completely extract the coffee oil (determined with hexane extraction). Best results were obtained with the following raw material characteristics and extraction conditions for green and roasted coffee beans, respectively: moisture content (9.98 and 2.40 %), granulometry (200 mg for both beans), CO2 flow (1.5 and 2.0 mL min-1), non-static extraction and 5 min static extraction utilization. For green coffee oil, the most efficient extraction x 11. (mass of oil per unit of CO2 consumption) was obtained with temperature of 90 C and CO2 density of 0.77 g mL-1. These conditions promoted completely oil extraction within 20 min, using 28.6 g of CO2 (7.13 x 10-4 g oil/g CO2). The highest concentration of diterpenes was obtained with 70 C and 0.74 g mL-1 of CO2. The extracted oil contained cafestol at 201.7 mg 100 g-1 and kahweol at 251.6 mg 100 g-1. These diterpenes values were 52.5 % and 52.8 % lower when compared to oil obtained with the hexane extraction. Roasted coffee oil was completely extracted in 20 min at 70 C and CO2 density of 0.84 g mL-1. This condition was also the most efficient to significantly reduce the oil diterpene concentrations. Cafestol and kahweol levels were 94.4 and 114.7 g 100 g-1, respectively. These values represented a reduction of 71.3 and 71.2 %, compared to levels obtained in oil extraction using hexane. In general, an inverse correlation was observed between the amount of extracted oil and diterpene concentration levels. As a result, different oil contents with different diterpene concentrations could be successfully obtained using this technique. For example, a reduction of 71 % on diterpene levels of roast coffee oil significantly increases its stability and sensorial profile, and decreases hypercholesterolemic effect. xi 12. INTRODUO O gro de caf verde possui em torno de 10 % a 15 % de leo com elevado teor de compostos insaponificveis, dos quais fazem parte principalmente os diterpenos cafestol e caveol, presentes exclusivamente no caf. Esta composio peculiar do leo de caf verde torna-o valioso para a indstria de cosmticos dadas as suas propriedades amaciantes, emolientes e hidratantes, alm da capacidade de bloquear a radiao solar. Outras propriedades, como antinflamatrias e anticarcinognicas so tambm citadas na literatura.J o caf torrado contm alta quantidade de compostos volteis que proporcionam o seu sabor e aroma caractersticos, os quais so encontrados principalmente no seu leo. Por isso, o leo de caf torrado utilizado na indstria de alimentos como fonte de aroma, em produtos de confeitaria, balas e chocolates, na produo de caf instantneo, onde pode ou no ser adicionado no final do processo.A presena do cafestol e do caveol no leo afeta a sua estabilidade e diminui a sua qualidade sensorial (HAMELL et al., 1979). Adicionalmente, a presena dos diterpenos cafestol e caveol no leo de caf torrado ( 1 %), tem sido considerada responsvel pela elevao do colesterol em consumidores de caf que no utilizam filtro de papel na sua obteno, como o caf expresso, turco e grego, os quais apresentam altas quantidades de leo. Desta forma, este tipo de bebida possui elevada quantidade de diterpenos, podendo aumentar os nveis de colesterol de quem os consome.Devido a estas questes, os diterpenos como qualquer outra substncia, no podem ser classificados unicamente como benficos ou malficos. De acordo com CAVIN et al. (1998), a exposio a doses aceitveis em relao a atividade hipercolesterolmica pode ser benfica em relao as propriedades nutracuticas dadas, principalmente, pelo potencial anticarcinognico destas substncias. Esta observao, coloca os diterpenos em uma classe de compostos a qual pode ser considerada futuramente para a incluso em alimentos como aditivo (HUBER et al., 2002), alm de poderem ser utilizados na industria farmacutica e de cosmticos.1 13. Outro fator importante a ser ressaltado que existe certa especificidade destas duas substncias em relao atividade hipercolesterolmica ou anticarcinognica. Se por um lado o cafestol tem demonstrado ser o composto chave no aumento dos nveis de colesterol (POST et al., 1997), o caveol parece desempenhar a funo anticarcinognica em maior grau (LAM et al., 1982), o que amplia o seu leque de aplicaes potenciais. Tradicionalmente, os leos vegetais so obtidos por prensagem, cujo rendimento geralmente baixo, ou por meio de solventes orgnicos, como o hexano, que extraem completamente o leo, mas que podem deixar resduos de solvente no leo, diminuindo a sua qualidade e tambm causar srios problemas ambientais com o descarte do solvente. O rendimento mdio em leo de caf verde, na extrao por prensagem a frio, no ultrapassa 3,5 % (Zanze Cosmticos, Esprito Santo do Pinhal, So Paulo, informao pessoal). Em relao produo do leo de caf torrado, no Brasil, algumas poucas empresas o processam para a indstria de alimentos. Nestas, a extrao se d exclusivamente por prensagem, obtendo-se um rendimento que raramente ultrapassa 5 % (Cia Cacique de Caf Solvel, Londrina, Paran, informao pessoal). Como alternativa aos processos tradicionais, a tecnologia de extrao com fluidos supercrticos tem sido utilizada h algum tempo. Avanos na aplicao de CO2 supercrtico tem tornado esta tcnica atrativa para a extrao de biomaterias sem as desvantagens dos mtodos clssicos de extrao. Alm de no poluir o ambiente, e resultar em produtos de alta qualidade sem resduos de solventes, este processo pode ser empregado para o seu fracionamento, facilitando a separao de compostos desejveis e/ou indesejveis. O potencial do uso desta tecnologia deve-se a sua habilidade em extrair componentes de matrizes complexas, consubstanciado por leis ambientais cada vez mais severas aos processos industriais, e a demanda pelos consumidores por produtos naturais (TEJA e ECKERT, 2000; PERRUT, 2000). Em caf, a tecnologia de extrao supercrtica tem sido quase que exclusivamente empregada para a sua descafeinizao, sendo que inmeros trabalhos e patentes tem sido publicados a esse respeito. Na literatura foram 2 14. encontradas duas patentes visando a extrao do leo de caf torrado como fonte de aroma, uma nos EUA e outra na Alemanha. Entretanto, nenhum destes trabalhos avaliou o comportamento dos diterpenos presentes no leo e to pouco a extrao do leo de caf verde. Portanto, o desenvolvimento de uma metodologia para a obteno destes produtos trar avanos para a indstria nacional de alimentos, de cosmticos, e farmacutica, diminuindo a dependncia em tecnologia externa para a sua produo, alm de agregar valor ao produto, e aumentar a competitividade do leo de caf brasileiro nos pases consumidores.3 15. REVISO BIBLIOGRFICA 16. 1. Teoria dos fluidos supercrticosA obteno de produtos de ocorrncia natural faz parte do nosso cotidiano e diversas etapas podem estar envolvidas nos processos empregados na sua obteno. Segundo MOHAMED (1997), estas etapas podem ser simplesmente mecnicas ou envolver operaes de transferncia de massa, como extrao, destilao, absoro, adsoro, entre outras. Neste sentido, os fluidos supercrticos apresentam-se como meios bastante atrativos no processamento de produtos de ocorrncia natural devido a certas caractersticas inerentes, como a facilidade de recuperao do soluto, reciclagem do solvente e a possibilidade de direcionar a separao pela escolha das condies termodinmicas de temperatura e/ou presso.De acordo com SIHVONEN et al. (1999), o estado supercrtico foi registrado pela primeira vez em 1822 pelo Baro Gagniard de la Tour. Mais de meio sculo depois, em 1879, Hannay e Hogarth demonstraram o poder solvente dos fluidos supercrticos. Mas somente 100 anos depois, esta tecnologia passou a ser utilizada em laboratrios e posteriormente em escala industrial.O estado supercrtico atingido quando a temperatura e a presso a que uma substncia submetida so elevadas ao seu ponto crtico (Figura 1). A partir deste ponto no existe mais distino entre a fase gasosa e a lquida, e o fluido no liquefeito com o aumento da presso, nem tampouco transformado em gs pelo aumento da temperatura (SHIVONEN et al., 1999).A presso crtica definida como a presso mxima na qual um lquido pode ser convertido a um gs pelo aumento da temperatura. Analogamente, a temperatura crtica considerada a temperatura mxima na qual um gs pode ser convertido a um lquido pelo aumento de presso. Desta forma, acima do ponto crtico, variaes de presso e de temperatura no modificam a fase do fluido (RIZVI et al., 1986), e ele adquire propriedades intermedirias quelas apresentadas na forma de gs e de lquido, como pode ser observado na Tabela 1.Dado a estas caractersticas, propriedades fsico-qumicas dos fludos supercrticos como densidade, difusividade, constante dieltrica e viscosidade5 17. podem ser facilmente controladas por variaes de presso e temperatura sem que ocorra mudana de fases (SIHVONEN et al., 1999). Figura 1 Diagrama de fases de uma substncia pura (Pc = presso crtica;Tc = temperatura crtica). Fonte: McHUGH e KRUKONIS (1994).Tabela 1 Propriedades fsicas tpicas dos fluidos supercrticos em diferentesestados. GsFluido supercrtico Lquido PropriedadeP = 0,1 mPaPc 4PcP = 0,1 mPa T = 15 a 30 CTcTc T = 15 a 30 C Densidade (g/cm3)0,0006 a 0,0020,2 a 0,50,4 a 0,9 0,6 a 1,6 Viscosidade (Pa.s)10 a 3010 a 3030 a 90 200 a 3000 20,7 x 10-3 0,2 x 10-3 (0,2 a 2) x 10-5 Difusividade (cm /s)0,1 a 0,4 Fonte: modificado de RIZVI et al. (1986a).Como pode ser observado, a densidade de um fluido supercrtico prxima quela apresentada pelos lquidos, mas a difusividade e a viscosidade so semelhantes quelas dos gases. Estas propriedades tornam os fluidos 6 18. supercrticos interessantes j que a alta densidade proporciona a eles um poder solvente semelhante ao apresentado pelos lquidos, enquanto a alta difusividade e a baixa viscosidade permitem alto poder de penetrao em diferentes matrizes, propriedade esta apresentada pelos gases (RIZVI et al., 1986a), o que favorece a transferncia de massa no processo de extrao.Diferentemente dos lquidos, entretanto, onde a densidade difcil de ser modificada, nos fludos supercrticos ela pode ser facilmente alterada pela variao da temperatura e presso, notadamente a ltima. Pequenas variaes de presso prximas ao ponto crtico provocam grandes mudanas na densidade do solvente, o que conseqentemente modifica a sua capacidade de solvatao (SIHVONEN et al., 1999). Isto acontece porque medida que as condies de temperatura e de presso de uma substncia aproximam-se de seu ponto crtico, sua compressibilidade isotrmica tende ao infinito, e o seu volume molar ou a sua densidade modificam-se drasticamente (McHUGH e KRUKONIS, 1994).A observao de um grfico de presso reduzida (PR = P/Pc) versus temperatura reduzida (TR = T/Tc) ilustra melhor este comportamento (Figura 2). Para uma temperatura reduzida entre 0,9 a 1,2 a densidade reduzida (R = /c) pode aumentar de 0,1 (densidade comum para os gases) a 2,5 (densidade comum para os lquidos), a medida em que a presso reduzida aumentada para valores prximos de 1,0. Entretanto, a medida em que a temperatura reduzida (TR) aumentada para 1,55 o fluido supercrtico expande, e presses reduzidas maiores que 10,0 so necessrias para obter densidades semelhantes s de um lquido. Deste modo, as variaes de presso e temperatura nesta regio so utilizadas para regular a densidade e o poder de solvatao de um fluido.McHUGH e KRUKONIS (1994), descreveram o comportamento da solubilidade do naftaleno slido em etileno supercrtico (Tc = 9,3 C, Pc = 50,5 bar) (Figura 3).7 19. Figura 2 Variao da densidade reduzida de um composto puro, em condies prximas ao ponto crtico (McHUHG e KRUKONIS, 1994).Na isoterma de 12 C (TR = 1,01) a solubilidade do naftaleno aumenta abruptamente at a presso de 50 bar, o que corresponde presso crtica do etileno. A presses abaixo de 50 bar a sua solubilidade muito baixa, uma vez que a presso crtica no atingida. interessante notar que o comportamento desta isoterma parecido com a isoterma reduzida igual a 1,0 (TR = 1,0) da Figura 1. A Figura 4 apresenta a regio supercrtica, bem como a subcrtica (nearcritical-liquid) para o dixido de carbono. Obviamente, o estado supercrtico est situado acima de PR = 1 e de TR = 1, e a regio subcrtica definida por FILLIPI (1982) como estando entre TR = 0,95 e TR = 1. 8 20. Figura 3 Solubilidade do naftaleno slido no etileno supercrtico (PC = pontocrtico) (McHUHG e KRUKONIS, 1994). Figura 4 Densidade reduzida versus presso reduzida para o dixido decarbono puro. (RSC = regio supercrtica; RSB = regio subcrtica)(FILIPPI, 1982). 9 21. Observa-se que em valores prximos ao ponto crtico, a medida em que a temperatura aumenta ocorre uma diminuio relativa da densidade, o que se por um lado aumenta a difusividade do solvente e a presso de vapor do soluto, diminui o seu poder de solvatao. Assim, a concentrao do soluto no solvente ser funo destas duas variveis. Observa-se tambm pela extrapolao das isotermas do grfico, que em presses muito elevadas a maior influncia na solubilidade dada pela alterao da temperatura, e no mais pela variao de densidade. Contudo, para condies de presso usuais de extrao, a modificao da densidade, traduzida na capacidade de solvatao do solvente, a base para todo o processo de extrao com fluidos supercrticos. Quanto maior a densidade, maior ser o poder de extrao de um fluido, entretanto, menor a sua seletividade (REVERCHON et al., 1995). Desta forma, o aumento da densidade aumenta o poder de solvatao do fludo supercrtico, assim como o aumento da temperatura melhora a sua difusividade, e conseqentemente a capacidade de extrao. Entretanto, altas temperaturas nem sempre so vantajosas, j que elas resultam na reduo da densidade do fluido, diminuindo o seu poder solvente (FATTORI et al., 1988). Por esta razo, a definio do binmio presso/temperatura adequado, determina o sucesso ou no do processo extrativo. Como demonstra a Tabela 2, o ponto crtico de uma substncia para outra varia consideravelmente, o que aumenta a possibilidade do emprego de diferentes fluidos em diferentes aplicaes. Fluidos com temperatura crtica prxima ambiente, como o dixido de carbono, etano e etileno so interessantes para a extrao de aromas, e lipdios termolbeis. Por outro lado, hidrocarbonetos de alta massa molar podem ser empregados na extrao de fraes de petrleo que apresentam alta massa molar (McHUGH e KRUKONIS, 1994).10 22. Tabela 2 Condies de temperatura e presso crticas para diferentessolventesSolvente Temperatura crticaPresso crtica (C)(bar) Dixido de carbono31,1 73,8 Etano32,248,8 Etileno9,3 50,4 Propano96,742,5 Propileno 91,9 46,2 Cicloexano280,340,7 Isopropanol 235,247,6 Benzeno 289,048,9 Tolueno 318,641,1 p-xileno343,135,2 Clorotrifluorometano 28,939,2 Triclorofluorometano198,144,1 Amnia132,5 112,8 gua374,2 220,5 Fonte: McHUGH e KRUKONIS (1994) 1.1. Dixido de carbono como fluido supercrtico (CO2-SC) Mesmo com a disponibilidade de fluidos com diferentes poder solvente, extremamente dispendioso atingir o ponto crtico de determinadas substncias, como a gua, por exemplo, que apesar de ser um solvente extremamente polar, ao contrrio do CO2, apresenta temperatura e presso crticas bastante elevadas (Tabela 2). Alm disso, alguns fluidos so txicos e outros apresentam alta inflamabilidade, tornando a utilizao do CO2, puro ou em misturas com modificadores, como o mais atrativo. Fluidos inertes, no-txicos, no-inflamveis, no-agressivos ao meio ambiente e com temperaturas crticas baixas, como o dixido de carbono, apresentam a possibilidade de realizao da extrao e do fracionamento sem os riscos de deixar resduos indesejveis e/ou provocar a degradao trmica dos produtos obtidos (MOHAMED, 1997). De acordo com RAMSAY (1991), o uso do CO2 como fluido supercrtico apresenta vantagens como a baixa presso crtica (73 bar) e a temperatura11 23. crtica (31 C) prxima a ambiente, o que facilita a sua utilizao. Possui baixa toxidez, no explosivo, no poluente, e disponvel em grandes quantidades, sendo facilmente removido do produto extrado, podendo ento ser reciclado. Alm de ser ambientalmente incuo, o CO2 considerado seguro exposio humana em nveis aceitveis, podendo ser liberado no ambiente. Apesar de apresentar inmeras vantagens, a utilizao do CO2-SC limitada por ser um solvente essencialmente apolar, dificultando assim a extrao de muitos compostos polares e inicos. O baixo poder solvente do CO2 se deve a baixa constante dieltrica, situada entre 1,4 e 1,5 enquanto a grande maioria dos solventes orgnicos possui constante dieltrica variando de 2,5 a 4,0.Para comparao, a constante dieltrica da gua aproximadamente 78. Para diminuir esta limitao, a capacidade solvente essencialmente apolar do CO2-SC pode ser alterada com a adio de modificadores, surfactantes e quelantes (BRENNECKE, 1997), com os quais forma misturas facilmente, e aumenta a sua fora solvente. A adio de co-solventes ou modificadores aumenta a solubilidade do soluto. O efeito co-solvente definido como a razo entre a solubilidade obtida com a utilizao do co-solvente e quela obtida sem a sua utilizao (WANG et al., 2001). Normalmente, modificadores como o etanol, so utilizados na extrao de leos vegetais quando se deseja melhorar a extrao de compostos polares lipossolveis, como fosfolipdios, pigmentos e cidos graxos livres (MISHRA et al. 1994; STHAL et al., 1980). 2. Aplicaes dos fluidos supercrticos A primeira aplicao em escala industrial dos fluidos supercrticos foi realizadanadcadade 70 paraa descafeinizao do caf (GOPALAKRISHNAN, 1990). De l para c, vrios trabalhos tem aumentado o leque de aplicao, como pode ser observado nas Tabela 3 e 4. 12 24. Tabela 3 Possveis aplicaes do CO2-SC IndstriaFinalidade Indstria deObteno de aromas e essncias; pigmentos naturais; alimentos e bebidas gorduras animais, fosfatdios (p. e., lecitina); condimentos (p. e., baunilha, pimenta, cravo, noz moscada); gorduras e leos vegetais a baixas temperaturas; aromas de frutas; lpulo; caf e ch sem cafena.Indstia Obteno de extratos de plantas (p.e., valeriana, farmacutica camomila, pimenta); e princpios ativos para drogas (p.e., penicilinas, esterides).Indstria deObteno de leos essenciais; substncias ativas de cosmticosorigem vegetal; leos e gorduras de alto valor agregado (p. e., cidos graxos e substncias presentes em leos). Fonte: modificado de UHDE (n.d.). Alm da sua utilizao como solvente de extrao, os fluidos supercrticos, especialmente o CO2-SC, tm sido empregados como meio para reaes enzimticas e qumicas (McHUGH e KRUKONIS, 1994), e como tcnica cromatogrfica alternativa cromatografia de fase lquida e gasosa (FLAMENT et al., 1994). Atualmente, uma das aplicaes mais promissoras est relacionada a extrao de ingredientes para alimentos, compostos nutracuticos e frmacos (PERRUT, 2000). De acordo com TEJA e ECKERT (2000), unidades de extrao de compostos nutracuticos e fitoqumicos obtidos de produtos naturais tem sido construdas no extremo oriente, objetivando, por exemplo, a extrao de ginseng. 13 25. Tabela 4 Plantas industriais EmpresaAtividade Capacidade General Foods (Houston, EUA) Decafeinizao de 50.000 ton/ano Kaffee HAG AG (Bremen, Alemanha) caf22.000 ton/ano Hermsen (Bremen, Alemanha) 22.000 ton/ano SKW Trostberg (Pozzilo, Itlia)DesconhecidaSKW Trostberg AG (Alemanha)Decafeinizao de 6.000 ton/anochPfizer Hops Extraction (Sidney, Austrlia) Extrao de lpuloDesconhecida Hopfenextraktion HVG, Barth, Raiser &22.000 ton/ano Co. (Wolznach, Alemanha) Hops extraction Corp. of America 1.000 a 2.000 (Yakima, EUA)ton/ano J. I. Haas, Inc. (Yakima, EUA) Desconhecida Carlton & United Breweries Ltd.Desconhecida (Melbourne, Austrlia)SKW Trostberg AG/HEG Extrao de lpulo e10.000 ton/ano (Munchmuenster, Alemanha)especiarias Pauls & White, InglaterraDesconhecidaPhilip Morris (Hopewell, EUA)Extrao de nicotinaDesconhecidaKerr (McGee, EUA)Rose (leos residuais) VarivelCammilli Albert & Louie (Grasse, Frana) Extrao de 4 ext. de 100LfragrnciasFlavex GmbH (Rehlingen, Alemanha)Extrao de 1 ton/diafragrncias e aromas)Mori Oil Mills (Ise, Japo)Extrao de leo de Desconhecidamilho Mori Oil (Masuzaka, Japo) Extrao de corantesExtr. de 500L Fuji Flavor (Japo)de pimentaDesconhecida Sumitomo Seiko (Japo) Desconhecida Yasuma (Japo) Desconhecida Hasegawa Koryo (Japo) Desconhecida Takasago Foods (Japo) Desconhecida Takada Pharmaceuticals (Japo) Purificao deExtr. de 1200 Lresduosfarmacuticos Marbet GmbH (Dusseldorf, Alemanha) cidos graxos deDesconhecidacevada Agrofarm (Inglaterra)Refino de leo de Desconhecidapiretro com CO2 Fonte: SUTTER et al. (1994). 14 26. 2.1. Extrao de leos vegetais com fluidos supercrticos A aplicao comercial mais importante da tecnologia dos fluidos supercrticos na indstria alimentcia a extrao da cafena do caf, com unidades de extrao na Alemanha, Japo, EUA e ustria (SALDAA et al., 1997; GOPALAKRISHNAN, 1990; TEMELLI et al., 1988).Contudo, com a expanso da aplicao desta tecnologia, passou-se a ser utilizada tambm para a extrao e fracionamento de leos e gorduras de diferentes fontes (MODEY et al., 1996). Alguns exemplos podem ser citados, como leo de milho (UHDE, n. d.), leo de soja (FRIEDRICH et al., 1982), canola (FATTORI et al., 1988), leo de manteiga (CHEN et al., 1992), de sementes de uva, (GMEZ et al., 1996), de buriti (FRANA et al., 1999), de palma (MARKOM et al., 2001), de girassol (BRAVI et al., 2002) bem como para a purificao de leo de frituras (YOON et al., 2000) e o refino de azeite de oliva lampante (BONDIOLI et al., 1992).Para a extrao de leos vegetais utilizam-se normalmente presses e temperaturas relativamente baixas, variando de 200 bar a 300 bar, e de 40 C a 60 C, respectivamente (MAHESHWARI et al., 1992; FRANA e MEIRELLES, 1997), embora presses de at 700 bar tenham sido utilizadas por FRIEDRICH et al. (1982) para a extrao de leo de soja.A manipulao das variveis presso e temperatura permite a otimizao do rendimento em leo bem como a seletividade dos diferentes componentes presentes. GMEZ et al. (1996), extraindo leo de sementes de uva por CO2-SC, obtiveram rendimento similar extrao com hexano por 20 horas em aparelho de Soxhlet. Este resultado foi obtido com a extrao a 40 C por 3 horas e presso de 350 bar, e a qualidade do leo foi considerada superior a do leo extrado com solvente, o que tambm foi observado por STAHL et al. (1980) com a qualidade dos leos de soja, algodo e colza.STAHL et al. (1982), observaram em leo de mamona, que a solubilidade dos lipdios no dixido de carbono supercrtico aumenta, com o aumento da presso. Entretanto, este aumento alm de proporcionar maior rendimento em leo, altera o teor dos diferentes constituintes presentes, j que a seletividade diminui com o aumento da densidade. 15 27. Alm da presso e temperatura de extrao, outras variveis como o tamanho das partculas e umidade dos gros devem tambm ser considerados na otimizao do rendimento em leo, e foram estudados por GMEZ et al. (1996), na extrao de leo de semente de uva. Os resultados obtidos demonstraram que teores de umidade da matria-prima entre 0,35 % e 6,3 % proporcionaram rendimentos semelhantes, diferentemente do tamanho das partculas, que apresentou diferenas significativas de rendimento, na faixa entre 0,35 mm a 2,83 mm. FOLSTAR (1989), tambm demonstrou que o dimetro das partculas do caf influencia no rendimento em leo, sendo que quanto maior o dimetro, menor o rendimento. A extrao de leo de caf torrado com CO2 supercrtico foi conduzida por duas empresas alems e patenteada nos EUA e na Alemanha (ROSELIUS et al., 1982; BRIMMER, 1996). ROSELIUS et al. (1982), demonstraram que a temperatura de extrao do leo influencia na sua cor bem como no aroma. Neste trabalho so dados exemplos de rendimento, com temperaturas de extrao variando de 50 C a 150 C e presses de aproximadamente 294 bar a 1763 bar. Os rendimentos variaram de 8,7 % (80 C e 294 bar) a 13 % (150 C e 304 bar). Neste ltimo, o leo apresentou uma cor bastante escura e um aroma forte de queimado, provavelmente devido alta temperatura, necessria para aumentar o rendimento. J BRIMMER (1996), concluiu que as variveis temperatura e presso ideais para garantir o maior rendimento em leo de caf e a maior quantidade de compostos volteis extrada, so de 75 C e 280 bar, respectivamente. O autor trabalhou com presses variando de 74 bar a 350 bar, e temperaturas entre 31 C e 90 C.3. O cafApesar de ser originrio da Etipia, o caf passou a ser cultivado para a obteno de bebida na Arbia, para onde foi levado no sculo XV. Mais tarde, por volta de 1600, os turcos levaram o caf para a Europa, de onde foi disseminado rapidamente para o resto do mundo. Em 1650 foi aberta a primeira casa de caf em Oxford, na Inglaterra, e 25 anos depois elas j eram 16 28. quase 300. O Rei da Frana Luiz XIV foi presenteado com esta planta em 1714, e a disseminou na Amrica Central e do Sul, por meio de suas colnias (SMITH, 1989). No Brasil, o caf foi introduzido no sculo XVIII pela Guiana Francesa e foi disseminado em toda a costa, chegando ao Rio de Janeiro, So Paulo e ao Paran, tornando o Brasil o maior produtor e exportador mundial de caf (AGRIANUAL, 2002). Duas espcies so comercialmente cultivadas, a Coffea arabica e a Coffea canephora, respectivamente conhecidas como caf arbica e caf robusta, e apresentam diferenas em relao a sua composio qumica, incluindo os teores de leo e a sua composio em diterpenos. 4. O leo de caf 4.1. Teor de leo Em relao ao teor de leo, fatores como espcie, condies de cultivo, alm do mtodo de extrao e determinao utilizados so importantes. Segundo FOLSTAR (1989), o caf arbica contm maiores quantidades de leo que o caf robusta. Os resultados encontrados por vrios autores apresentaram teores variando de 10,5 % a 17,7 % e 8 % a 10 %, respectivamente (PINTO e CARVALHO, 1961; TANGO, 1963; LERCKER et al., 1996a; MAZZAFERA et al., 1998). De acordo com FOLSTAR (1989), a torrao praticamente no afeta a quantidade absoluta de leo, entretanto, a perda de umidade aumenta o seu teor relativo. A quantidade de leo de caf extrada industrialmente sempre menor que aquela determinada analiticamente. Segundo CALLE VELEZ (1960), a extrao do leo de caf por solvente, quando utilizada nas indstrias, raramente ultrapassa 10 %. Este comportamento tambm observado na extrao por prensagem. LPEZ-FONTALe CASTAO-CASTRILLN (1999),determinarama quantidade de leo em uma variedade colombiana de caf arbica, e obtiveram valores em torno de 17 %. Entretanto, o rendimento em leo quando obtido por prensagem foi de 6,8 % a 8,7 %. 17 29. 4.2. Composio do leo O leo de caf distuinge-se da maioria dos leos vegetais dada a maior quantidade de compostos insaponificveis. Enquanto os leos vegetais possuem em torno de 95 % de triglicerdios, o leo de caf apresenta em torno de 80 % (AL KANHAL, 1997). So compostos principalmente pelos cidos palmtico e linolico, com teores de aproximadamente 35 % e 42 %, respectivamente (MURATORE et al., 1998).Os lipdios do gro de caf verde esto presentes principalmente no endosperma, e contm uma frao considervel de compostos insaponificveis (LPEZ-FONTAL e CASTAO-CASTRILLN, 1999) (Tabela 5), os quais conferem caractersticas importantes, sendo os lcoois diterpnicos cafestol e caveol e seus steres, os mais importantes (FOLSTAR, 1989; AL KANHAL, 1997).18 30. Tabela 5 Composio lipdica de gros de caf verde (porcentagem mdia dototal de lipdios)Componente % cido graxos:C14:00,09C15:00,04C16:034,77C16:10,03C18:07,68C18:198,33C18:111 0,49C19:00,02C18:242,30C20:02,75C20:190,27C18:31,34C21:00,07C22:00,75C23:00,08C24:00,23 75,2 Triglicerdios118,5 steres de lcoois diterpnicos e cidos graxos 0,4 lcoois diterpnicos 3,2 steres de esteris e cidos graxos 2,2 Esteris 0,04 - 0,06 Tocoferis0,1 0,5 Fosfatdios0,6 1,0 Derivados de triptamina FONTE: Maier (1981) citado por FOLSTAR (1989); 1MURATORE et al. (1998). Os diterpenos (Figura 5) e seus steres foram isolados da frao insaponificvel do caf verde em 1932 e 1938, respectivamente (LAM et al., 1982). Figura 5 Estruturas qumicas do cafestol e do caveol. 19 31. O caf arbica possui maiores quantidades de diterpenos que o caf robusta. As quantidades no gro de caf verde, variam de 1,3 % a 1,9 % (m/m) e 0,2 % a 1,5 %, respectivamente (VIANI, 1989; RATNAYAKE et al., 1993). Em relao ao leo, LERCKER et al. (1996b) quantificaram os diterpenos em caf verde e torrado obtido de vrias regies produtoras. Para o caf arbica verde obtido do Brasil, a quantidade de cafestol e de caveol foi de 533,7 mg/100g de leo, e 619,2 mg/100g de leo; enquanto o caf torrado, apresentou valores de 432,1 mg/100g e 572,3 mg/100g, respectivamente. Os diterpenos cafestol e caveol existem no leo na forma livre em menor quantidade, e esterificados aos cidos palmtico, linolico e esterico (VAN ROOIJ et al., 1995). Segundo os autores, o leo de caf arbica contm maiores quantidades de cidos graxos esterificados ao cafestol e caveol, que o leo de caf robusta. O ltimo, alm de possuir menores quantidades de steres de cafestol, apresenta somente traos de steres de caveol (Tabela 6). Tabela 6 Diterpenos livres e esterificados em leo de caf verdeComposto C. arabica C. canephora(g/kg) (g/kg) Caveol esterificado cidos graxos851 Cafestol esterificado cidos 68 29 graxos Caveol livre 2 nd Cafestol livre 2 1 16-O-metilcafestol nd9 FONTE: VAN ROOIJ et al. (1995).5. Aplicaes do leo de caf verde na indstria de alimentos efarmacuticaEvidencias tm sugerido a presena de compostos no caf que estimulam a formao de agentes desintoxicantes in vivo. O consumo de caf reduz, por exemplo, os nveis sricos de -glutamiltransferase, considerada um marcador de doenas relacionadas ao fgado (NILSSEN e FORDE, 1994; TANAKA et al., 1998), o que de acordo com URGERT et al. (1995) e URGERT e KATAN (1997), deve-se presena dos diterpenos cafestol e caveol. Adicionalmente, estudos comprovaram cientificamente que o caf no possui 20 32. potencial carcinognico (HASEGAWA et al., 1995). De acordo com PEZZUTO et al. (1986), os diterpenos presentes no caf no apresentam atividade mutagnica em Salmonella typhimurium, ao contrrio do steviosdio, um glicosdio diterpnico presente no adoante obtido da stvia.Vrios trabalhos tm demonstrado que os diterpenos do caf apresentam propriedades anticancergenas, pela induo da atividade de glutationa-S-transferases GST (CAVIN et al., 1998; SCHILTER et al., 1996; LAM et al., 1982). Este sistema de enzimas (GST) catalisa a ligao de compostos eletroflicos carcinognicos como a aflatoxina B1 (AFB1) (CAVIN et al., 1998), o DMBA (7,12-dimetilbenz[]antraceno) (WATTENBERG, 1983) e o 2-amino-1-metil-6-fenilimidazol [4,5-b] piridina (PhIP) (HUBER et al., 1997), glutationa (GSH), reduzindo o seu efeito deletrio.Metablitos secundrios como a aflatoxina B1 (AFB1), por exemplo, produzida por algumas espcies de fungos do gnero Aspergillus, so potentes indutores da formao de cncer do fgado em diversas espcies de mamferos (homem, ratos, entre outros), em contraste com os camundongos, os quais so pouco sensveis (CAVIN et al., 1998). Na verdade, os compostos derivados da AFB1, aps ser metabolizada pelo citocromo P450, que apresentam atividade cancergena, particularmente a aflatoxina B1-8,9-epxido (AFBO) (NIGAM e GHOSH, 1997), um metablito instvel que prontamente forma ligaes com stios nucleoflicos do DNA, causando mutaes em clulas sadias (GALLAGHER et al., 1994). Felizmente, este epxido pode ser inativado antes da sua reao com o DNA, pela conjugao com a glutationa, mediada pela glutationa-S-transferase (DEGEN e NEWMAN, 1978).Vrias substncias possuem o poder de aumentar a atividade da GSH, e uma das mais potentes o 3-tert-butil-4-hidroxianisole (BHA). Para comparao, LAM et al. (1982), testaram sob as mesmas condies experimentais a induo da atividade de GSH pelo BHA e pelo palmitato de caveol, no intestino delgado de camundongos, e concluram que o ltimo foi trs vezes mais potente.WATTENBERG (1983), observou a inibio de neoplasia em ratos, um tumor mamrio especfico, induzida antes e aps a administrao de DMBA, utilizando uma dieta contendo caf verde. Aps a alimentao com 10 % e 20 21 33. % de caf verde, e administrao posterior de DMBA, 75 % e 44 % dos ratos apresentaram tumores, respectivamente. No grupo controle, a incidncia foi de 91 %. Quando os ratos foram alimentados com 10 % de caf verde aps a administrao de DMBA, 50 % deles apresentaram tumores enquanto 94 % foram afetados no grupo controle. Resultados no mesmo sentido foram obtidos por WATTENBERG e LAM (1983) aps a intubao oral com palmitato de cafestol ou palmitato de caveol.Em trabalho semelhante, MILLER et al. (1988) observaram somente o aparecimento de tumores ocasionais na cavidade bucal de hamsters, tratada 3 vezes por semana com uma soluo 0,5 % de DMBA em leo mineral, e alimentados com uma dieta contendo 20 % de caf verde. Todos os animais que no receberam a dieta contendo o caf verde apresentaram tumores mltiplos.Em outro trabalho com hamsters, MILLER et al. (1991) alimentaram os animais com uma dieta contendo 0,2 g/kg e 2,0 g/kg de uma mistura equivalente de cafestol e caveol, obtendo 30 % e 40 % de reduo da incidncia de tumores, respectivamente. CAVIN et al. (1998), observaram uma reduo de 50% na formao de compostos de ligao com o DNA, aps a administrao de 6200 ppm de uma mistura de cafestol e caveol (52,5 % : 47,5 %) em ratos.Contudo, o primeiro estudo com clulas humanas foi publicado por CAVIN et al. (2001) utilizando clulas epiteliais do fgado. Neste trabalho foi demonstrado que o mecanismo envolvido na diminuio da atividade cancergena em humanos pelos diterpenos, semelhante aquele observado em ratos, sugerindo que os resultados obtidos com esses animais podem ser extrapolados para os humanos. Foi observado um aumento da atividade de GST concomitante reduo de at 45 % na expresso de subunidades de citocromo P450, e por conseqncia, dos nveis de compostos de ligao.De acordo com LAM et al. (1982), os diterpenos cafestol e caveol so dois potentes agentes anticancergenos, j que promovem um aumento da atividade da GSH, o que tambm sugerido por SCHARF et al. (2001). O Dr. Lam e seus colaboradores (LAM et al., 1982) constataram que esta atividade dose dependente, e atriburam o maior efeito ao palmitato de caveol22 34. enquanto o cafestol apresentou menor atividade (5,6 e 3,9 vezes maior que o controle, respectivamente). Emtrabalho subseqentecomcafestol e caveol modificados quimicamente, os mesmos pesquisadores concluram que a atividade anticancergena induzida pelo anel furnico dos diterpenos e no pela funo glicol (LAM et al., 1987). MILLER et al. (1994) especularam sobre a maior atividade do caveol, tambm comprovada no trabalho anterior, ser devido presena da ligao dupla entre os carbonos 1 e 2 no caveol. Segundo CAVIN et al. (2001), existem dois mecanismos pelos quais acredita-se ocorrer esta atividade em ratos e humanos. O primeiro se d devido reduo da expresso de subunidades do citocromo P450, associado a bioativao da AFB1 AFBO; o segundo, ocorre devido a induo da atividade da GSH, pela qual ocorre a desintoxicao provocada pela AFBO. Por meio dos trabalhos de HUBER et al. (1997) e HUBER et al. (2002), possvel avaliar estes mecanismos de forma mais aprofundada, embora de acordo com CAVIN et al. (2002), eles ainda no estejam totalmente elucidados. No primeiro, os autores verificaram a reduo da formao de cncer de clon em ratos, provocada por uma amina heterocclica aromtica, a 2-amino-1-metil- 6-fenilimidazol [4,5-b] piridina (PhIP), com a administrao dos diterpenos. A PhIP uma amina formada por pirlise durante a coco de alimentos, freqentemente encontrada na urina de humanos aps a ingesto de carne cozida (LYNCH et al., 1992), e responsvel pelo aparecimento de cncer de mama, da prstata, do sistema linftico e do clon (CAVIN et al., 2002), sendo o ltimo, uma das mais freqentes formas de cncer do mundo ocidental (ADAMSON et al., 1996). Junto a uma mistura de palmitato de cafestol e palmitato de caveol (1:1) foram testadas outras 16 substncias com possvel atividade anticancergena, dentre elas o ch preto e o benzilisotiocianato. A atividade anticancergena foi medida pela reduo dos nveis de compostos de ligao formados por ligaes covalentes entre o DNA e derivados do PhIP. Esta reduo foi de 67 %, 66 % e 54 %, para o ch preto, o benzilisotiocianato e a mistura de diterpenos. Entretanto, somente a mistura de diterpenos esteve associada a induo de GST. 23 35. Para que ocorra a ligao covalente entre o PhIP e o DNA necessrio que a amina seja primeiramente oxidada a N-hidroxi-PhIP, reao catalisada pelo citocromo P450. Em seguida, este intermedirio transformado em diferentes steres eletroflicos reativos, na presena de acetiltransferases, sulfotransferases e quinases, que prontamente reagem covalentemente com molculas de DNA, formando os compostos de ligao (HUBER et al., 1997). Desta forma, a reduo dos nveis de citocromo pelos diterpenos reduz o potencial cancergeno de certas substancias, incluindo a PhIP e a prpria AFB1 (HUBER et al., 2002).Adicionalmente, a reao de reduo das formas oxidadas de PhIP outromecanismoimportante para a diminuio de sua capacidade cancergena, envolvendo a GSH, a qual catalisada pela GST (HUBER et al., 1997).Os estudos de HUBER et al. (2002), verificaram a ativao da GSH em diferentes rgos de ratos utilizando uma mistura de cafestol e caveol (1:1) e cafestol puro, mostrando com maior clareza a induo da atividade desta enzima. De acordo com estes autores, alm de induzir a atividade da GST, ocorre uma induo da atividade da glutamilcistena sintetase (GCS), uma enzima limitante na sntese de GSH, pelo aumento dos nveis de mRNAs da GCS, o que consequentemente eleva a atividade da GSH. O aumento da atividade foi dose dependente, e mais pronunciada em clulas do fgado, que do pncreas, clon e rins.Resumidamente, os complexos mecanismos pelos quais os diterpenos atuam podem ser explicados pela induo da atividade da enzima glutaiona-S- transferase (GST), pelo aumento da expresso da glutamilcistena (GCS), e conseqente aumento da atividade da glutationa (GSH), e pela inibio da expresso e/ou atividade do citocromo P450. Isto significa que os diterpenos podem ser considerados agentes bloqueadores de metablitos com potencial para se ligar ao DNA, modificando-os permanentemente, o que diminui a formao de tumores (CAVIN et al., 2002).24 36. 6. Aplicaes do leo de caf torrado na indstria de alimentosO leo de caf torrado um produto que possui valor elevado como aromatizante, para as indstrias de doces, biscoitos, caf instantneo, caf gelado, sorvetes, sobremesas, caf capuccino, pudins, e produtos a base de leite (CIA IGUA DE CAF SOLVEL, 2000), dado ao seu aroma pronunciado.Uma das utilizaes do leo de caf torrado na indstria pode se dar na sua adio aos gros de caf antes da sua moagem. Estes leo so previamente aromatizados com diversos aromas como os de chocolates, rum, baunilha, entre outros (NATURES FLAVORS, 2002) conferindo ao caf aromas diferenciados.Na indstria de caf solvel, uma das formas de melhorar o seu sabor reincorporar o leo de caf torrado, durante a sua obteno (VARGAS- VARGAS-ZAPATA et al., 1996). Por isso, vrias tcnicas para reincorporao do leo no caf solvel tm sido patenteadas (KOCH et al., 1994; STOECKLI e BERRY, 1989; JASOVSKY et al., 1985; KATZ et al., 1985).Contudo, como j comentado, a elevada frao insaponificvel presente no leo, e conseqente concentrao dos diterpenos no desejvel dada a sua capacidade hipercolesterolmica. Alm disso, de acordo com HAMELL et al. (1979), o leo livre de diterpenos considerado de melhor qualidade sensorial que o leo bruto.A considervel frao insaponificvel apresentada pelo leo levou pesquisadores a desenvolver tcnicas para a sua remoo. Neste sentido foram realizados alguns trabalhos com o intuito de diminuir a concentrao de diterpenos no leo ou no prprio caf torrado, quer seja por saponificao (HISBRUNNER et al., 1981), por aquecimento e extrao com soluo aquosa de isopropanol (ROYCHOUDHURY e RATHINDRA, 1985), ou por tratamento com cidos, separao cromatogrfica e destilao (HAMELL et al., 1979). BAECHLER e HISBRUNNER (1999) utilizaram cido fosfrico para a remoo dos compostos diterpnicos de caf para a utilizao em alimentao animal.A prpria possibilidade da reutilizao do caf verde aps a extrao do seu leo, para o processamento como caf torrado, abre perspectivas no que25 37. diz respeito produo de um caf com baixos ndices de diterpenos, e que poderia ser utilizado sem restries, em relao a sua propriedade hipercolesterolmica, alm de apresentar melhor estabilidade oxidao. 7. Aplicaes na indstria de cosmticos leos vegetais, inclusive o de caf, tm sido utilizados h anos na indstria de cosmticos (ALVAREZ e RODRIGUEZ, 2000). ANDERSEN (2000), compilou no International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook as informaes acerca do uso do caf arbica na indstria de cosmticos. Segundo ele, alm do leo de caf, os extratos de sementes e folhas tambm so utilizados como fonte de aroma e como agente condicionador para a pele. O leo de caf torrado tem sido empregado na indstria de cosmticos, para a formulao de batons e produtos onde se deseja proporcionar o seu aroma(CAMPO RESEARCH,2000; BRANNA, 2000). Entretanto,a caracterstica mais interessante conferida pelo leo de caf verde, a capacidade de bloquear a radiao solar UVB (280 a 320 nm), a qual mesmo possuindo capacidade bronzeadora, causa eritrema na pele humana, sem contudo impedir a passagem de raios UVA (320 a 400 nm), responsveis pelo bronzeamento saudvel (CONNOCK, 1999; GROLLIER e PLESSIS, 1988). Esta funo, acredita-se ser causada pelos diterpenos cafestol e caveol e seus steres (BERTHOLET, 1987; BERTHOLET, 1988; PELLE, 1999; SNOI INTERNATIONAL, 2000). Outra frao importante do leo de caf para a indstria de cosmticos so os cidos graxos presentes. O produto final das glndulas sebceas da pele humana, chamado de sebo cutneo, constitudo por compostos lipdicos como cidos graxos, triglicerdios, colesterol, esqualeno, ceras, etc. Assim, o sebo cutneo importante por formar uma capa protetora na pele, e funcionar como um agente hidratante natural (TISNES, 1992). Entretanto, dadas s sucessivas agresses sofridas pela pele, esta capa protetora freqentemente removida (CONNOCK, 1999). O leo de caf por sua vez, restaura a capa protetora da pele, melhorando a aparncia e a sua textura (CONNOCK, 1999, MONTCILLIAC, 2002).26 38. De acordo com CONNOCK (1999), o cido linolico, presente em altas concentraes no leo de caf, faz parte dos cidos graxos essenciais, juntamente com o cido linolnico e araquidnico. Estes cidos so muito interessantes quando utilizados em cosmticos, e estudos tm demonstrado que a sua carncia leva a diferentes tipos de distrbios na pele, inclusive a deficincia no processo de queratinizao, levando a sua descamao.O leo de caf alm de possuir a habilidade de absorver a radiao solar indesejvel em testes in vivo (GROLLIER e PLESSIS, 1988), promove a lubrificao da pele e regenerao da barreira hidrolipdica (CONNOCK, 1999).Os estudos de GROLLIER e PLESSIS (1988) foram patenteados pela empresa LOreal (Paris), no Departamento de Patentes Americano. O leo extrado da borra de caf por solventes orgnicos, bem como fraes ricas em diterpenos obtidas por destilao molecular, foram testadas em humanos como componentes de uma srie de produtos para a pele, dentre eles, diferentes emulses, gis e em misturas com outros leos vegetais. Os resultados demonstraram que o leo, alm de possuir caractersticas desejveis como facilidade para aplicao e distribuio uniforme nos veculos disponveis para utilizao em cosmticos, possui a propriedade de permitir a passagem dos raios UV benficos pele e de bloquear aqueles causadores de eritrema. Esta caracterstica importante no observada em outros leos vegetais utilizados em cosmticos, os quais absorvem em outros comprimentos de onda que no na faixa nociva pele.Os estudos concluram tambm que a maior proteo radiao foi apresentada pelas fraes ricas em diterpenos, demonstrando a sua importncia na proteo aos raios UV. Os autores apresentam tambm alguns exemplos de formulados para utilizao como filtro solar.PELLE (1999), registrou uma patente na qual outra propriedade dos diterpenos, mais especificamente do cafestol e de seus steres foi comprovada. Neste trabalho, estes compostos demonstraram a capacidade de aumentar a barreira lipdica do stratus corneun, a camada mais externa da pele. Esta camada constituda por clulas queratinizadas e por espaos intercelulares preenchidos por diferentes lipdios, e funciona como uma barreira natural, impedindo a entrada de substncias indesejveis nas camadas 27 39. internas, alm de evitar a perda de gua. Os testes demonstraram que o cafestol promove um aumento da camada de stratus corneun pelo aumento da diferenciao celular, alm de aumentar a sntese de lipdios.O autor enfatizou tambm que a utilizao de outros leos vegetais, ceras e manteigas como recuperadores da barreira lipdica natural, proporciona um aspecto gorduroso pele, o que indesejado. Alm disso, estes produtos somente promovem o aumento da barreira lipdica enquanto esto em contato com a pele, desaparecendo to logo sejam removidos, quer seja naturalmente ou pela ao de detergentes, sabes e da prpria gua. Isto diferencia o cafestol e seus steres, j que estes induzem a formao da barreira lipdica natural, permanecendo assim o efeito aps a sua remoo.No Brasil, a Zanze Cosmticos, sediada em Esprito Santo do Pinhal, So Paulo, desenvolveu uma linha de cosmticos totalmente baseada na utilizao do leo de caf verde. Esta empresa possui convnios com fornecedores, que aps a extrao do leo, retornam o caf indstria que processam normalmente para a produo do caf torrado (FOLHA DE SO PAULO, 1998). Recentemente, a Davene lanou um protetor solar para peles negras o qual contm leo de caf na sua composio (DAVENE, 2002).8. Propriedade hipercolesterolmica e hiperlipidmica do leo de caf Como citado, os diterpenos cafestol e caveol esto associados a algumas atividades fisiolgicas em seres vivos (BAECHLER e HISBRUNNER, 1999), principalmente ao aumento da atividade de enzimas no fgado (URGERT et al., 1995; URGERT & KATAN, 1997). Algumas destas atividades so consideradas benficas, como a propriedade anticancergena. No se sabe ao certo quais so exatamente as atividades indesejveis associadas a estes compostos, entretanto, uma delas refere-se ao aumento do risco de doenas cardiovasculares pelo aumento da concentrao de homocistena (GRUBBEN et al., 2001), e principalmente pelo incremento nos nveis de LDL no sangue (VAN DE WOUW et al., 1994; HECKERS et al., 1994 e VAN ROIJ et al., 1995).O aumento dos nveis de homocistena plasmtica considerado um indcio do risco de aparecimento de doenas cardiovasculares, e tem sido correlacionado a ingesto de caf no filtrado, o qual contm altas28 40. concentraes de diterpenos (GRUBBEN et al., 2001). Entretanto, URGERT et al. (2000) observaram rpido aumento na concentrao deste marcador aps a ingesto de caf filtrado, o qual contm quantidades bem menores de diterpenos. Em artigo de reviso, THELLE et al. (1987) observaram que dois teros dos estudos conduzidos at ento com o intuito de verificar a relao entre o consumo de caf e o aumento dos nveis de colesterol no sangue, obtiveram resultados positivos.Outra observao foi a de que esta relao era mais evidente nos estudos conduzidos em pases escandinavos (FORDE et al., 1985; ARO et al., 1985; ARO et al., 1987; BAK e GROBEE, 1989) que naqueles desenvolvidos na Europa e nos Estados Unidos (ROSEMARIN et al., 1990; VAN DUSSELDORP et al., 1990; SUPERKO et al., 1991; SEDOR et al., 1991). Isto levou os pesquisadores a abandonar a prtica de atribuir cafena qualquer distrbio fisiolgico que o consumo de caf pudesse provocar, j que tanto na Escandinvia quanto na Europa e nos Estados Unidos, o caf continha cafena, naturalmente. A no associao da cafena com os nveis de colesterol foi demonstrada em alguns trabalhos, como os desenvolvidos por ZOCK et al. (1990), VAN DUSSELDORP et al. (1990) e WEI et al. (1995).Nos pases escandinavos, a populao ainda possui o antigo hbito de obter a bebida adicionando o p de caf a gua fervida, ingerindo-a aps a decantao da borra (caf fervido). Todavia, a reduo dos nveis de colesterol na populao escandinava foi registrada a partir de 1985 (STENSVOLD et al., 1996). De acordo com STAVRIC (1992) a partir de 1960, boa parte da populao passou a utilizar filtros de papel no preparo da bebida, e em 1987, somente um quarto da populao finlandesa ainda consumia o caf fervido.BAK e GROBEE (1989), especularam sobre o possvel mecanismo pelo qual o caf fervido aumenta a concentrao de colesterol plasmtico. Duas hipteses surgiram, a primeira postulava que a elevada temperatura de preparo da gua do caf fervido, a qual ficava em contato direto com o p de caf por um tempo relativamente longo, poderia extrair uma maior quantidade dos compostos responsveis pela atividade hipercolesterolmica. A segunda, que veio a ser confirmada posteriormente, acreditava que estes compostos eram retidos pelo filtro de papel, e, portanto, estariam presentes no caf fervido. 29 41. De fato, os estudos conduzidos por ARO et al. (1987) e ZOCK et al. (1990) esclareceram estadvida,concluindo que o efeito hipercolesterolmico do caf causado pelos lipdios, presentes em quantidades elevadas nas bebidas de caf que no utilizam filtros de papel para o seu preparo, e concluram ainda, que a frao insaponificvel do leo que era responsvel por esta atividade fisiolgica.Estes estudos foram corroborados posteriormente pelos trabalhos de VAN DE WOUW et al. (1994), HECKERS et al. (1994) e VAN ROIJ et al. (1995), os quais elucidaram a questo, concluindo que os compostos responsveis pelo aumento do colesterol so os diterpenos cafestol e caveol, presentes em grande quantidade na frao insaponificvel do leo.RATNAYAKE et al. (1993), observaram que o contedo de lipdios encontrado em caf expresso obtido do caf arbica, foi de 2260 mg/L (12,5 % de lcoois diterpnicos), enquanto que a bebida de caf, obtida em cafeteiras que utilizam filtros de papel, apresentou valores mdios de 23,4 mg/L (10,4 % de diterpenos). Considerando-se a porcentagem de diterpenos encontrada no leo, tem-se que o caf expresso continha 282,5 mg/L de diterpenos, enquanto a bebida obtida em cafeteiras utilizando filtros de papel, 2,43 mg/L.Existem controvrsias em relao ao efeito do caf instantneo na elevao dos nveis de colesterol. Isto porque, teoricamente, este produto apresenta teores muito baixos de leo, devido sua forma de obteno. Entretanto, algumas indstrias adicionam o leo nas etapas finais de produo, como fonte de aroma, enquanto outras no o fazem. Neste sentido, a variao na quantidade de leo no caf instantneo pode ser bastante grande (URGERT et al., 1995) e o seu efeito hipercolesterolmico pode variar proporcionalmente. Bak (1990) citado por MIYAKE et al. (1999) observou que a ingesto de uma xcara de caf instantneo por dia estava associada ao aumento de 0,85 mg/dL nos nveis de colesterol total no sangue de mulheres. Enquanto o trabalho de BURR et al. (1995) demonstrou que a quantidade de colesterol total aumentou em 0,45 mg/dL (0,12 mmol/L) com a ingesto de 5 xcaras de caf instantneo por dia. De acordo com os autores, a ingesto desta quantidade de caf por seis semanas tem um efeito marginal no aumento do colesterol, e, em pessoas normais, no necessrio restringir o seu consumo. 30 42. MIYAKE et al. (1999), trabalhando com 4587 homens entre 48 e 56 anos, observou que a ingesto de uma xcara de caf instantneo diariamente, aumentou o nvel de LDL colesterol sangneo em 0,82 mg/dL, concluindo que a ingesto desta bebida est associada ao seu aumento. O mecanismo associado atividade hipercolesterolmica ainda no est bem definido, mas envolve o aumento dos nveis de LDL e a diminuio dos nveis de HDL (ESPARZA, 1998).Segundo POST et al. (1997), o cafestol que confere a maior elevao da concentrao de colesterol no sangue de mamferos, sendo o caveol menos importante, concluso tambm obtida por URGERT et al. (1997). De acordo com o primeiro trabalho, a converso do colesterol em cidos biliares no fgado, a rota mais importante para a sua eliminao, e o aumento dos nveis de LDL est associado diminuio da sntese de cidos biliares.A reao da biossntese dos cidos biliares a partir do colesterol, envolve a hidroxilao do colesterol pela enzima 7-hidroxilase, no retculo endoplasmtico, ou alternativamente pela ao da enzima esterol 27- hidroxilase. Como os diterpenos cafestol e caveol so estruturalmente semelhantes aos esteris, e estes, como os oxiesteris, podem inibir a ao da 7-hidroxilase e a formao dos cidos biliares, a partir do colesterol, pode ser inibida por estes compostos. Desta forma, o cafestol inibiria a sntese dos cidos biliares pela diminuio da atividade de 7-hidroxilase e esterol 27- hidroxilase, e tambm pela diminuio da transcrio dos genes que codificam essas duas enzimas (POST et al., 1987).Trabalhos de reviso efetuados por ROOS e KATAN (1999), indicaram que o cafestol a substncia conhecida que apresenta o maior poder hipercolesterolmico, e que o caveol responsvel por somente 20 % do efeito provocado pela ingesto de leo.Os autores descrevem trs mecanismos que podem estar envolvidos na elevao dos nveis de colesterol pelo cafestol, sendo que um deles o mais plausvel. Este mecanismo envolve o efeito do cafestol na supresso da transcrio de genes ligados a formao de importantes reguladores do metabolismo de lipdios em humanos, como a lpase lipoprotica, os receptores 31 43. de LDL e a 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA), levando a sua diminuio, e conseqente aumento dos nveis de colesterol. Alm da atividade hipercolesterolmica, vrios estudos tm demonstrado a capacidade dos diterpenos de elevar os nveis de triglicerdios em indivduos normais. De acordo com ROOS et al. (2001), o aumento nos nveis de triglicerdios plasmticos e do colesterol parece ser regulado independentemente no fgado. Enquanto o aumento dos nveis de colesterol pode ser explicado, por exemplo, pela supresso da sntese de cidos biliares, o mecanismo pelo qual ocorre atividade hiperlipidmica, se d pelo aumento da quantidade de VLDL1 apo B no plasma sanguneo, induzida pelos diterpenos, no fgado.32 44. CAPTULO 1 CARACTERIZAO DA MATRIA-PRIMA E DO LEOEXTRADO COM SOLVENTE 45. 1.1. INTRODUO Originrio da Etipia, o caf passou a ser cultivado para a obteno de bebida na Arbia, para onde foi levado no sculo XV. Mais tarde, por volta de 1600, os turcos levaram o caf para a Europa, de onde foi disseminado rapidamente para o resto do mundo. Em 1650 foi aberta a primeira casa de caf em Oxford, na Inglaterra e 25 anos depois, j eram quase 300. O Rei da Frana Luiz XIV foi presenteado com esta planta em 1714, e a disseminou na Amrica Central e do Sul, por meio de suas colnias (SMITH, 1989). No Brasil, o caf foi introduzido no sculo XVIII vindo da Guiana Francesa e foi disseminado em toda a costa, chegando a So Paulo e o Paran, tornando o Brasil o maior produtor e exportador mundial de caf. Duas espcies so comercialmente cultivadas, a Coffea arabica e a Coffea canephora, respectivamente conhecidas como caf arbica e caf robusta. Estas duas espcies apresentam diferenas em relao a sua composio qumica, tambm observadas entre o caf verde e o torrado. Em relao ao teor de leo, fatores como espcie, condies de cultivo, alm do mtodo de extrao e determinao utilizado so importantes. Segundo FOLSTAR (1989), o caf arbica contm maiores quantidades de leo que o robusta. Os resultados encontrados por vrios autores apresentaram teores variando de 10,5 % a 17,7 % e 8 % a 10 %, respectivamente (PINTO e CARVALHO, 1961; TANGO e CARVALHO, 1963; LERCKER et al., 1996a; MAZZAFERA et al., 1998). De acordo com FOLSTAR (1989), a torrao praticamente no afeta a quantidade absoluta de leo, entretanto, a perda de umidade aumenta o seu teor relativo. Em relao composio, o leo de caf possui menor quantidade de compostos saponificveis que os leos comestveis, e geralmente no ultrapassa 80% de triglicerdios, os quais so compostos principalmente pelos cidos palmtico e linolico, com teores de aproximadamente 35 % e 42 %, respectivamente (MURATORE et al., 1998). Em contrapartida, a quantidade de compostos insaponificveis bastante elevada, podendo chegar a 12 % ou mais (AL KANHAL, 1997).34 46. Por sua vez, a frao insaponificvel do leo de caf rica nos diterpenos caveol e cafestol, e seus steres (VIANI, 1988; URGERT et al., 1995), os quais foram isolados da frao insaponificvel do caf verde em 1932 e 1938, respectivamente (LAM et al., 1982).O caf arbica possui maiores quantidades de diterpenos que o caf robusta. As quantidades no gro de caf verde, variam de 1,3 % a 1,9 % (m/m) a 0,2 % a 1,5 %, respectivamente (VIANI, 1988; RATNAYAKE et al., 1993). Em relao ao leo, LERCKER et al. (1996b) quantificaram os diterpenos em caf verde e torrado obtido de vrias regies produtoras. Para o caf arbica verde obtido do Brasil, a quantidade de cafestol e de caveol foi de 533,7 mg/100g de leo, e 619,2 mg/100g de leo; enquanto o caf torrado, apresentou valores de 432,1 mg/100g e 572,3 mg/100g, respectivamente.Os compostos diterpnicos cafestol e caveol existem no leo na forma livre, e principalmente esterificados com cidos graxos, principalmente palmtico, linolico e esterico (VAN ROOIJ et al., 1995).O objetivo desta etapa do trabalho foi caracterizar a matria-prima e o leo obtido convencionalmente com hexano, em relao a umidade, teor de leo, perfil de cidos graxos e teor de diterpenos, sendo importante para o desenvolvimento das etapas seguintes, servindo de base para a comparao e o entendimento dos resultados obtidos na extrao com CO2 supercrtico. 1.2. MATERIAL E MTODOSEsta etapa foi conduzida no Laboratrio de Anlise de Alimentos do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UFV.Amostras de caf arbica verde e torrado (Coffea arabica) foram gentilmente fornecidas pela Companhia de Caf 3 Coraes S.A. (Santa Luzia, MG). O caf verde foi torrado temperatura de 237 C por 13,17 min em torrefador de cilindro rotativo Lilla Oppus 40.Para evitar a oxidao do leo e de seus componentes, as amostras foram acondicionadas em sacos plsticos de polietilenotereftalato laminado, sob vcuo, e armazenadas em congelador temperatura de 15 C.35 47. 1.2.1. Preparo da matria-primaTanto o caf verde quanto o caf torrado, foram triturados para reduo do seu tamanho, utilizando um moedor de caf de bancada (Arbel, Brasil), visando aumentar a rea interfacial para transferncia de massa e conseqentemente aumentar a extrao do leo. Os gros triturados foram classificados em peneiras de forma a obter 3 fraes de diferentes dimetros (0,297 mm a 0,35 mm; 0,35 mm a 0,42 mm e 0,42 mm a 0,50 mm).As fraes obtidas foram acondicionadas sob atmosfera de nitrognio em frascos de vidro de 250 mL com tampas de metal temperatura de 15 C. 1.2.2. Teor de umidade da matria-primaO teor de umidade foi determinado por gravimetria pelo mtodo de secagem em estufa, a temperatura de 105 C durante 24 horas (SALDAA et al., 1997). 1.2.3. Determinao do extrato etreoA determinao do extrato etreo nos gros de caf verde e torrado foi realizada em aparelho Soxhlet, segundo o mtodo oficial da AOAC ref. 8 n 15.033 (AOAC, 1997). Para tal, as amostras de caf verde e de caf torrado foram extradas em aparelho de Soxhlet, utilizando hexano p.a. como solvente, por um perodo de 16 horas. O solvente foi removido com o auxlio de um evaporador rotativo (Fisatom, modelo 802, Brasil), fazendo-se em seguida o resfriamento e a pesagem do balo de extrao, com o que foi obtido o teor de leo, sendo acondicionado em frascos de 5 mL sob atmosfera de nitrognio a 15 C para posterior anlise.36 48. 1.2.4. Perfil de cidos graxos e teor de diterpenos do leo 1.2.4.1. Preparo das amostras Para a determinao do perfil de cidos graxos e do teor de diterpenos, o leo armazenado foi descongelado, e 50 mg de leo foram saponificadas com 3 mL de uma soluo de KOH 0,5 mol/L em metanol (HARTMAN & LAGO, 1973). A frao insaponificvel foi extrada da frao saponificada com 3 x 2 mL de hexano. A fase metanlica foi utilizada para a determinao da composio em cidos graxos. O extrato em hexano foi usado para a determinao do teor de diterpenos. 1.2.4.2. Determinao do perfil dos cidos graxos Os cidos graxos da frao metanlica foram esterificados de acordo com HARTMAN & LAGO (1973). Ao extrato metanlico contendo os cidos graxos foram adicionados 3 mL do reagente de esterificao. No seu preparo, 10 g de NH4Cl foram adicionados a 300 mL de MeOH, seguido por 15 mL de NH2SO4, utilizando-se um balo de fundo chato. A mistura foi aquecida sob refluxo em um condensador at a dissoluo total do NH4Cl (em torno de 20 min). Os steres metlicos foram extrados adicionando-se 5 mL de hexano aps a adio de 10 mL de soluo saturada de NaCl. O perfil dos cidos graxos foi determinado por cromatografia de fase gasosa, usando cromatgrafo Hewlett Packard 5890 Series II, equipado com detector de ionizao de chama a 260 C e coluna capilar J & W Scientific, CP- Wax (25 m x 0,32 mm x 0,20 m) mantida a 215 C. O gs de arraste utilizado foi o hidrognio presso de 15 psi e velocidade de 95,6 cm/s. A temperatura do injetor foi mantida em 230 C. 1.2.4.3. Determinao do teor de diterpenos Os diterpenos cafestol e caveol foram determinados por cromatografia lquida de alto desempenho (CLAD), em cromatgrafo HP 1050A equipado com 37 49. duas colunas HP-C18 (200 mm x 4,6 mm x 5 m) conectadas em srie e detector de UV-VIS a 220 nm, utilizando-se como fase mvel metanol/gua (85:15 %, v/v) e fluxo de 0,7 mL/min. O extrato em hexano foi lavado com 1 mL de gua (3 vezes) para a remoo de resduos de sabo. A frao orgnica contendo os diterpenos foi ento transferida para frascos mbar de 5 mL, evaporada sob fluxo de nitrognio com aquecimento a aproximadamente 45 C, e ressuspensa em 1 mL de fase mvel. As amostras foram filtradas em filtros de celulose regenerada RC 55 de 0,45 m (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) e analisadas (CLAD). As amostras foram injetadas com seringa de 100 L em um loop de 50 L e os diterpenos quantificados utilizando-se curvas de calibrao construdas com padres de cafestol (LKT Labs, Inc. Saint Paul, Minessota) e caveol (Sigma, Saint Louis, Missouri). Para a construo das curvas de calibrao, foi preparada uma soluo estoque de cada padro na concentrao de 1 mg/mL, diludos na fase mvel. As solues estoques foram diludas de forma a se obter as seguintes concentraes para cada padro: cafestol: 0,019 mg/mL, 0,038 mg/mL, 0,076 mg/mL, 0,114 mg/mL e 0,152 mg/mL; e caveol: 0,016 mg/mL, 0,032 mg/mL, 0,064 mg/mL, 0,096 mg/mL e 0,128 mg/mL. O ndice de recuperao do mtodo foi realizado adicionando-se quantidades crescentes de uma mistura de cafestol e caveol (1 mg/mL) a amostras de leos de caf verde e torrado. 1.3. RESULTADOS E DISCUSSO 1.3.1. Obteno do caf triturado Os processos de extrao de componentes de interesse requerem a reduo do tamanho das partculas da matria-prima visando aumentar a superfcie de contato entre o solvente e a matria-prima. Dependendo do material, existe um dimetro de partcula timo para o processo extrativo. No 38 50. caso do caf, valores entre 0,15 mm e 0,85 mm so utilizados para a extrao de leo por solvente (FOLSTAR, 1989). A triturao forneceu diferentes quantidades de caf verde e torrado, em cada peneira (Tabela 1). Tabela 1 - Porcentagem relativa de cada frao obtida aps o peneiramento. Frao Abertura daCaf verde (%)Caf torrado (%)peneira (mm) 1 0,297 a 0,3527,533,9 20,35 a 0,4239,145,8 30,42 a 0,5033,420,3 Observa-se que a maior quantidade foi obtida na frao 2 para ambas as amostras, ou seja, entre 0,35 mm e 0,42 mm. Entretanto, o caf torrado foi triturado mais facilmente, devido provavelmente baixa umidade e por isso, comparativamente, apresentou maior quantidade na frao 1 (com menor dimetro de partcula) que o caf verde na mesma frao. 1.3.2. Teores de umidade e de leo Os teores de umidade e de leo determinados para o caf verde e o torrado, encontram-se na Tabela 2. Tabela 2 - Teores de umidade e de leo do caf verde e torrado.leo (g/100g)Umidade (%)Base mida (%) Base seca (%) Caf verde9,9810,23 11,37 Caf torrado2,4015,42 15,49 Os teores de umidade encontrados por MURATORE et al. (1998) em variedades de caf procedentes de trs diferentes locais, variaram de 9,68 % a 10,48 % para o caf verde e de 1,81 % a 1,85 % para o caf torrado. Isto demonstra que as amostras de caf verde esto dentro da faixa comum para o caf comercializado mundialmente, entretanto os resultados obtidos para o39 51. caf torrado situam-se um pouco acima da faixa relatada, o que aceitvel, j que o teor de umidade depende do tipo de torrao a que o gro submetido. LERCKER et al. (1996a), por exemplo, obtiveram para o caf arbica torrado valores de umidade de 0,6 %. Os teores de leo encontrados esto dentro da faixa de valores observados por outros autores, os quais variaram em base seca, de 10,5 % a 17,7 % para o caf arbica (PINTO e CARVALHO, 1961; TANGO e CARVALHO, 1963; LERCKER et al., 1996a; MAZZAFERA et al., 1998), e so iguais aos obtidos por LERCKER et al. (1996a), que foram de 11,4 % e 15,4 %, para o caf arbica verde e torrado, respectivamente. Como verificado por FOLSTAR (1989), a torrao no afeta significativamente a quantidade absoluta de leo, entretanto, a perda de umidade e de matria seca aumentam seu teor relativo. A perda de umidade no justificaria por si s o aumento no teor de leo, j que a diferena mesmo em base mida considervel, o que demonstra que a perda de matria seca causada principalmente pela pirlise de carboidratos contribui significativamente para este aumento. 1.3.3. Perfil de cidos graxos do leo do caf A Tabela 3 apresenta o perfil de cidos graxos nos leos de caf verde e torrado por cromatografia de fase gasosa em comparao quele obtido por LERCKER et al. (1996a). Observa-se a predominncia dos cidos palmtico (C16:0) e linolico (C18:2), seguidos pelo cido olico (C18:1) em menor concentrao, os quais somam aproximadamente 88 %. Ocorreu uma pequena variao na composio dos cidos graxos, com a torrao. Entretanto, esta variao no segue nenhuma tendncia em relao massa molar dos cidos graxos, a qual poderia supostamente ocorrer em maior amplitude naqueles de cadeia curta, dado a temperatura de torrao e a existncia de cidos graxos livres no leo (NIKOLOVA-DAMYANOVA, 1998). 40 52. Tabela 3 - Perfil dos cidos graxos no caf arbica verde e torrado obtidosneste estudo, comparados com outros trabalhos.cido graxoLERCKER et al. (1996a) Caf verde Caf torrado Caf verde*Caf torrado*0,12 0,010,10 0,01C14:0 0,1 0,1 32,44 0,30 33,04 0,50C16:030,933,9C16:1 traostraos < 0,1< 0,19,06 0,077,14 0,50C18:0 9,5 9,09,18 0,058,78 0,219,4 9,1C18:190,37 0,030,41 0,01 --C18:111 43,50 0,31 45,98 0,96C18:243,442,51,40 0,151,76 0,30C18:3 3,3 2,72,65 0,052,00 0,05C20:0 1,2 1,20,33 0,030,21 0,03C20:1 0,3 0,3C22:0 0,9 0,6 0,82 0,020,43 0,08C24:00,20 0,3 0,13 0,010,15 0,02 * Porcentagem de rea relativa. 1.3.4. Determinao do teor de diterpenos do leo No Brasil, nenhum estudo foi encontrado em relao a composio em diterpenos de leo de caf, devido possivelmente dificuldade na obteno de padres para identificao e quantificao de diterpenos, os quais somente agora esto disponveis no mercado. 1.3.4.1. Determinao do ndice de recuperao do mtodo O ndice de recuperao do mtodo foi testado adicionando-se 20 L, 40 L e 60 L de uma mistura de caveol e cafestol (1 mg/mL) a amostras de leo de caf verde e de caf torrado, com teor de diterpenos conhecido, como demonstrado na Tabela 4. Como observado, o ndice de recuperao do mtodo utilizado variou de 89,8 % a 109,1 % para o cafestol e de 88,2 % a 106,4 % para o caveol, sendo os menores ndices determinados nas amostras com as maiores concentraes. Resultados prvios indicaram baixo ndice de recuperao (dados no apresentados) o que foi atribudo alta temperatura (em torno de 70 C)41 53. utilizada para auxiliar a remoo do hexano, com nitrognio, tanto na etapa de secagem da amostra para a determinao do teor de leo, quanto na sua remoo para a ressuspeno da fase mvel. Por esta razo, a temperatura da amostra nestas etapas foi mantida em aproximadamente 45 C.Tabela 4 ndice de recuperao do mtodo para determinao dosditerpenos. ValorQuantidadeValor ndice de originaladicionada encontrado*recuperao(mg/100g)(mg/100g) (mg/100g)(%) Caf verdeCafestolAmostra 1383,9 2,3100 495,4 8,6102,4 1,8Amostra 2383,9 2,3200 546,1 4,7 90,1 3,9Amostra 3383,9 2,3300 614,1 5,8 89,8 7,2 CaveolAmostra 1476,2 6,4100 599,5 5,1104,0 10,2Amostra 2476,2 6,4200 632,9 9,6 93,5 7,2Amostra 3476,2 6,4300 621,5 4,0 91,9 5,7 Caf torradoValorQuantidadeValor ndice de originaladicionada encontrado*recuperao(mg/100g)(mg/100g) (mg/100g)(%)CafestolAmostra 1328,5 3,9100 467,4 3,6109,1 2,9Amostra 2328,5 3,9200 546,1 8,0103,3 6,0Amostra 3328,5 3,9300 604,1 5,9 96,1 1,9 CaveolAmostra 1397,8 6,6100 529,5 5,8106,4 5,2Amostra 2397,8 6,6200 552,9 7,7 92,5 9,3Amostra 3397,8 6,6300 615,5 10,188,2 8,4 *Valores mdios de triplicatas.42 54. 1.3.4.2. Teor de diterpenosObserva-se na Figura 1 que os teores de cafestol e de caveol nos leos de caf esto abaixo daqueles encontrados por LERCKER et al. (1996b) tanto para o caf verde (533,7 mg de cafestol e 619,2 mg de caveol por 100 g de leo) quanto para o torrado (432,1 mg de cafestol e 572,3 mg de caveol por 100 g de leo), mas como naquele trabalho, o caveol apresentou a maior concentrao, e com a torrao, ocorreu uma diminuio no teor dos dois diterpenos, que neste trabalho foi de 14,4 % e 16,5 % para o cafestol e caveol, respectivamente. Esta reduo da concentrao foi tambm reportada por NACKUNSTZ e MAIER (1987) e dependente do grau de torrao a que o gro submetido.De forma contrria, quando os teores de diterpenos so considerados em relao massa de caf, ocorre um pequeno aumento com a torrao, reflexo direto da perda de matria seca (Figura 2). Figura 1 Teores cafestol e de caveol nos leos de caf verde e torrado. 43 55. Figura 2 Teores de cafestol e de caveol no caf verde e no torrado. 44 56. 1.4. CONCLUSESOs teores de umidade, leo e o perfil de cidos graxos apresentados pelo caf verde e torrado esto dentro da faixa descrita na literatura.Em relao aos diterpenos foram observados menores teores de cafestol e de caveol que aqueles determinados por outros autores, provavelmente originrios de caractersticas intrnsecas da variedade utilizada. Para o leo de caf verde, teores de cafestol e de caveol de 533,7 mg/100g de leo e 619,2 mg/100g de leo foram observados por LERCKER et al. (1996b), enquanto os valores determinados neste trabalho foram de 383,9 mg/100g de leo e 476,2 mg/100g de leo, respectivamente.Os teores de caveol foram maiores que os de cafestol tanto no caf verde quanto no caf torrado e a torrao promoveu a reduo dos dois diterpenos, comportamento tambm esperado. O teor de cafestol neste trabalho foi reduzido para 328,5 mg/100g de leo, enquanto o de caveol para 397,8 mg/100g de leo.45 57. CAPTULO 2 EXTRAO DO LEO E DE DITERPENOS DO CAFVERDE COM CO2 SUPERCRTICO 58. 1.1. INTRODUO Processos de extrao com fludos supercrticos tm sido desenvolvidos para a obteno de produtos com alto valor agregado, como suplementos alimentcios e nutracuticos, para os quais a caracterstica natural do processo apresenta alto poder de marketing (SIHVONEN et al., 1999; PERRUT, 2000).A tecnologia dos fludos supercrticos comeou a ser desenvolvida na Alemanha, e propiciou a instalao da primeira unidade comercial, dedicada a descafeinizao do caf, na cidade de Bremen. A partir desta unidade, outras surgiram para o mesmo fim, e, posteriormente, para a extrao de lpulo. Com o surgimento de concorrentes como os EUA a partir da dcada de 1980, os alemes investiram em novas reas, incluindo a descafeinizao de ch, e a extrao de aromas e aditivos para alimentos, compostos nutracuticos e princpio ativos para a indstria farmacutica e de cosmticos (PERRUT, 2000).Esta tecnologia, aplicada extrao de produtos de alto valor agregado, foi tambm levada para a Frana e Inglaterra, estendeu-se depois para o Canad e mais recentemente atingiu pases da sia, como a China, Coria do Sul e ndia (SIHVONEN et al., 1999; PERRUT, 2000).Embora uma enorme quantidade de patentes que utilizam a tecnologia dos fludos supercrticos tenha sido requerida no mundo todo, poucas delas realmente foram aplicadas industrialmente. Como exemplo, tem-se a descafeinizao do caf e do ch e a extrao de lpulo, onde esta tecnologia substituiu a extrao por solventes tradicional. Contudo, de acordo com SIHVONEN et al. (1999), a extrao de nicotina, extratos de especiarias, e de leos e gorduras, so aplicaes industriais que tem ganhado bastante espao.De acordo com MERMELSTEIN (1999) e TEJA e ECKERT (2000), a extrao e purificao de compostos com propriedades nutracuticas, bem como a extrao de princpios ativos para produtos farmacuticos continuaro sendo reas de importncia na pesquisa e aplicao de fludos supercrticos. Como resultado, o conhecimento da solubilidade, capacidade de extrao, pureza, e qualidade dos materiais obtidos, continuar a ser expandido, a47 59. medida em que mais produtos forem comercializados. A obteno de cidos graxos polinsaturados apartir deleo depeixes, um exemplo (NILSSON, 1996; ESQUVEL et al., 1997).No caf, vrios trabalhos tm demonstrado que os diterpenos cafestol e caveol presentes na frao insaponificvel do leo, apresentam atividades nutracuticas, dentre elas a propriedade anticarcinognica (WILDMAN, 2001). Isto se deve principalmente, induo da atividade de glutationa-S- transferases GST (SCHARF, 2001; CAVIN et al., 1998; SCHILTER et al., 1996; MILLER et al., 1991; MILLER et al., 1988; LAM et al., 1982). Este sistema de enzimascatalisaaligaodecompostos eletroflicos carcinognicos como a aflatoxina B1 (AFB1) (CAVIN et al., 1998), o DMBA (7,12-dimetilbenz[]antraceno) (WATTENBERG, 1983) e o 2-amino-1-metil-6- fenilimidazol [4,5-b] piridina (PhIP) (HUBER et al., 1997), a glutationa (GSH), reduzindo o seu efeito deletrio.Outro mecanismo ligado atividade anticarcinognica se deve reduo da expresso de subunidades do citocromo P450, associado a bioativao aos compostos eletroflicos (CAVIN et al., 2001).Alm disto, de acordo com BERTHOLET (1987, 1988), o cafestol possui propriedades antiinflamatrias, o que torna a sua aplicao potencial na indstria farmacutica.Entretanto, uma das caractersticas mais interessante do leo de caf verde, a capacidade de bloquear a radiao solar UVB (280 a 320 nm), indesejvel pele humana (CONNOCK, 1999), sem contudo impedir a passagem de raios UVA (320 a 400 nm), responsveis pelo bronzeamento saudvel (GROLLIER e PLESSIS, 1988). Esta caracterstica tambm proporcionada pelos diterpenos e seus steres, naturalmente presentes na fraoinsaponificvel doleode caf(BERTHOLET, 1987; SNOI INTERNATIONAL, 2000; PELLE, 1999).Contudo, a ingesto de bebidas de caf preparadas sem o uso de filtros de papel, tem sido altamente correlacionada com a elevao dos nveis de colesterol sangneo em animais e humanos. Esta atividade fisiolgica tambm conferida pelos diterpenos, os quais so quase que totalmente removidos da bebida quando filtros de papel so utilizados para a sua obteno48 60. (ZOCK et al., 1990; VAN DE WOUW et al., 1994; HECKERS et al., 1994; VAN ROIJ et al., 1995).Entretanto, de acordo com CAVIN et al. (1998), a exposio a doses seguras em relao atividade hipercolesterolmica pode ser benfica em relao s propriedades nutracuticas dadas pelo potencial anticarcinognico destas substncias.Esta caracterstica coloca os diterpenos em uma classe de compostos a qual pode ser considerada futuramente para a incluso em alimentos como um aditivo (HUBER et al., 2002), alm de poder ser utilizada na indstria farmacutica e de cosmticos.Segundo PALMER e TING (1995), os processos que obtiveram sucesso comercial utilizando fludos supercrticos, como a extrao da cafena, apresentam algumas caractersticas em comum. Dentre elas esto a obteno de produtos de alto valor agregado os quais podem ser empregados no somente em alimentos, mas tambm em cosmticos. Na descafeinizao do caf por exemplo, so obtidos dois produtos com alto valor agregado, o caf descafeinado, e a prpria cafena, a qual encontra uma srie de aplicaes industriais.Neste sentido, a extrao do leo de caf verde por CO2-SC alm de fornecer o leo para ser empregado tanto na indstria de cosmticos quanto de alimentos e farmacutica, forneceria um caf verde livre de leo e de diterpenos. Este caf poderia futuramente vir a ser processado por meio de tcnicas modernas de torrao, fornecendo um produto de alto valor a