exto completo

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE M ESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARM ACÊUTICAS

CAM PUS DE ARARAQUARA

LATENCIAÇÃO DE CLOREXIDINA PARA USO POTENCIAL EM

PERIODONTITES

RENATO FARINA M ENEGON

ORIENTADORA: Profa. Dra. Chung M an Chin

ARARAQUARA – SP

2005

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE M ESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARM ACÊUTICAS

CAM PUS DE ARARAQUARA

LATENCIAÇÃO DE CLOREXIDINA PARA USO POTENCIAL EM

PERIODONTITES

RENATO FARINA M ENEGON

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área dePesquisa e Desenvolvimento de Fármacos eM edicamentos, da Faculdade de CiênciasFarmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de M estre em Ciências Farmacêuticas.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Chung M an Chin

ARARAQUARA – SP

2005

Ficha CatalográficaElaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação

Faculdade de Ciências FarmacêuticasUNESP – Campus de Araraquara

M enegon, Renato Farina

M 541L Latenciação de clorexidina para uso potencial em periodontites. / Renato Farina M enegon .– Araraquara, 2005.

140 f.

Dissertação (M estrado) –Universidade Estadual Paulista. “Júlio deM esquita Filho”. Faculdade de CiênciasFarmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Chung M an Chin

. 1.Clorexidina. 2. Periodontite. I.Chung M an Chin, orient.II. Título.

CDD: 615.4

CAPES:40300005

DEDICATÓRIA

À memória de meu irmão Ricardo Farina M enegon

À minha namorada Lorena, pela compreensão, amor e paciência demonstrado

em todos os momentos

Aos meus pais, à minha avó e à minha irmã, por terem sempre confiado e

acreditado em mim e nas minhas escolhas

AGRADECIM ENTOS

À Profa. Dra. Chung Man Chin, pela confiança depositada em mim e no meu

trabalho, e por ter tantas vezes extrapolado os limites da simples orientação,

demonstrando profunda amizade e companheirismo, contribuindo para o meu

crescimento profissional e pessoal. A todos estes anos de convivência, meu muito

obrigado.

Aos Professores Doutores Horácio Faig Leite, Leoberto Costa Tavares e Ivone de

Carvalho, pelas inestimáveis contribuições dadas a este trabalho.

Ao Prof. Dr. Antonio Gilberto Ferreira e às pós-graduandas Elisangela Fabiana

Boffo e Leila Aley Tavares, pela realização das análises de RMN e interpretação dos

espectros obtidos.

Ao Prof. Dr. José Carlos Nassute e às Professoras Doutoras Márcia da Silva e

Adélia Emília de Almeida, pela amizade e incentivo à realização deste trabalho.

Aos funcionários Luiz Eduardo dos Santos (Dudu) e Osmar Redondo, que além de

muito facilitarem a realização do meu trabalho, sempre demonstraram amizade e

bom humor nos momentos mais difíceis.

Aos amigos de pós-graduação Antonio, Lúcia, Eduardo, Eliana, Jean, Thaís, Ednir,

Vanessa e Mara, e aos estagiários Rodolfo, Ricardo e Paulo pelo companheirismo

e pelos bons momentos vivenciados.

Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pelo suporte financeiro para a execução deste trabalho.

À Galena Química e Farmacêutica Ltda, pelo apoio e fornecimento de matéria-prima a este trabalho.

E a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

Sumário e Índices

iR.F.Menegon

SUM ÁRIO

1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO ................................................................pg. 03

1.1. INTRODUÇÃO...........................................................................pg. 03

1.2. OBJETIVO................................................................................pg. 10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................pg. 11

2.1. PERIODONTITE........................................................................pg. 11

2.2. TRATAMENTO...........................................................................pg. 17

2.2.1. Enzimas.......................................................................pg. 18

2.2.2. Antibióticos..................................................................pg. 18

2.2.3. Antissépticos................................................................pg. 20

2.2.4. Antiinflamatórios Não Esteroidais (AINEs) ......................pg. 27

2.2.5. Doses sub-antimicrobianas de doxiciclina.......................pg. 28

2.2.6. Bifosfonatos e Tetraciclinas Quimicamente Modificadas...pg. 29

2.3. PLANEJAMENTO DE PRÓ-FÁRMACOS..........................................pg. 40

2.3.1. Definição.....................................................................pg. 40

2.3.2. Solução de Problemas...................................................pg. 43

2.3.2.1. Correção de sabor............................................pg. 44

2.3.2.2. Correção de solubilidade...................................pg. 52

3. M ATERIAL E M ÉTODOS......................................................................pg. 56

3.1. MATERIAL................................................................................pg. 56

3.2. MÉTODOS DE SÍNTESE.............................................................pg. 56

3.3. MÉTODOS DE ANÁLISE.............................................................pg. 59

Sumário e Índices

iiR.F.Menegon

3.3.1. Cromatografia em Camada Delgada (CCD).....................pg. 59

3.3.2. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear..........pg. 59

3.3.3. Espectrometria no Infravermelho (IV)............................pg. 60

3.3.4. Faixa de Fusão.............................................................pg. 60

3.4. MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICO E FARMACOCINÉTICO.....................pg. 60

3.4.1. Coeficiente de partição (Log P)......................................pg. 60

3.4.2. Determinação do tempo de retenção do pró-fármaco na

cavidade bucal.......................................................................pg. 61

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................pg. 62

5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS......................................................pg. 108

5.1. Conclusões ............................................................................pg. 108

5.2. Perspectivas............................................................................pg. 109

6. PROCEDIM ENTO EXPERIM ENTAL...................................................pg. 110

6.1. SÍNTESE DO PRÓ-FÁRMACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DA ROTA A..

....................................................................................................pg. 110

6.1.1. Rota A1..................................................................... pg. 111

6.1.2. Rota A2.1.................................................................. pg. 111

6.1.3. Rota A2.2.................................................................. pg. 112

6.1.4. Rota A3..................................................................... pg. 112

6.1.5. Rota A4.1.................................................................. pg. 113

6.1.6. Rota A4.2.................................................................. pg. 113

6.1.7. Rota A4.3.................................................................. pg. 114

Sumário e Índices

iiiR.F.Menegon

6.1.8. Rota A4.4.................................................................. pg. 114

6.1.9. Rota A4.5.................................................................. pg. 115

6.2. SÍNTESE DO PRÓFÁRMACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DA ROTA

B................................................................................................. pg. 116

6.2.1. Rota B1..................................................................... pg. 117

6.2.2. Rota B2..................................................................... pg. 118

6.3. ENSAIOS FÍSICO-QUÍMICO E FARMACOCINÉTICO.....................pg. 119

6.3.1. Coeficiente de partição (Log P).....................................pg.119

6.3.1.1. Curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina

(TPCHD)....................................................................pg. 119

6.3.1.2. Estimativa preliminar do coeficiente de partição.pg.120

6.3.1.3. Determinação do Coeficiente de Partição.........pg. 121

6.3.2. Determinação do tempo de retenção do pró-fármaco na

cavidade bucal.....................................................................pg. 123

6.3.2.1. Cromatografia................................................pg. 123

6.3.2.2. Procedimento de extração...............................pg. 124

6.3.2.3. Curva de calibração........................................pg. 124

6.3.2.4. Taxa de recuperação......................................pg. 125

6.3.2.5. Estudo farmacocinético...................................pg. 127

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................pg. 128

Sumário e Índices

ivR.F.Menegon

ÍN DICE DE ESPECTROS

1: Espectro de infravermelho da clorexidina base........................................pg. 64

2: Espectro de infravermelho do diacetato de clorexidina............................ pg. 65

3: Espectro de infravermelho do produto obtido a partir da rota A1............. pg. 71

4: Espectro de infravermelho do precipitado obtido durante a reação da rota

A2........................................................................................................... pg. 74

5: Espectro de infravermelho do precipitado obtido pela neutralização do filtrado

da reação da rota A2................................................................................ pg. 75

6: Espectro de infravermelho do precipitado obtido na rota A3.................... pg. 77

7: Espectro de infravermelho do produto obtido através da rota A4.1.......... pg. 79

8: Espectro de infravermelho do precipitado da reação da rota A4.2............ pg. 81

9: Espectro de RMN 1H do precipitado da reação pela rota A4.2.................. pg. 82

10: Espectro de infravermelho do produto amarelado da rota A4.2.............. pg. 84

11: Espectro de infravermelho do precipitado da rota A4.2, após lavagem com

ácido acético a quente.............................................................................. pg. 86

12: Espectro de RMN 1H do precipitado da rota A4.2, após lavagem com ácido

acético a quente....................................................................................... pg. 87

13: RMN 1H do produto purificado por CCD na rota A4.3............................. pg. 89

14: Espectro de infravermelho do produto obtido ao final da purificação da rota

A4.5........................................................................................................ pg. 91

15: Espectro de infravermelho do produto precipitado em isopropanol da rota B1...

................................................................................................................pg. 93

Sumário e Índices

vR.F.Menegon

16: Espectro de RMN 1H do produto oleoso amarelo obtido na rota B1........ pg. 96

17: Espectro de infravermelho do sal tetrapalmitato de clorexidina.............. pg. 97

18: Espectro de RMN 1H do sal tetrapalmitado de clorexidina...................... pg. 99

ÍNDICE DE FIGURAS

1.1: Mapa das Américas Central e do sul indicando a prevalência de periodontites

severas entre indivíduos jovens por país..................................................... pg. 04


severas entre indivíduos adultos por país................................................... pg. 05


severas entre indivíduos idosos por país..................................................... pg. 05

1.4: Inflamação do tecido gengival (gengivite)........................................... pg. 06

1.5: Perda severa de dentes..................................................................... pg. 07

1.6: Reabsorção óssea............................................................................. pg. 07

1.7: Manchas nos dentes provocadas pelo uso de clorexidina...................... pg. 08

2.1: Representação esquemática do conceito de pró-fármacos.................... pg. 41

2.2: Exemplos de pró-fármacos no mercado.............................................. pg. 42

2.3: Pró-fármacos de opióides ................................................................. pg. 48

2.4: Estrutura química do paracetamol e seu profármaco N-[(acetiloxi)-

fenil]acetamida........................................................................................ pg. 49

2.5: Estrutura química da norfloxacina e seus pró-fármacos........................ pg. 50

Sumário e Índices

viR.F.Menegon

2.6: Estrutura química do cloranfenicol e do palmitato de cloranfenicol........ pg. 51

2.7: Exemplos de formação de sais para correção de sabor......................... pg. 52

2.8: Estrutura química do paclitaxel e seu pró-fármaco solúvel protaxel....... pg. 53

2.9: Estrutura da buparvaquona e seu pró-fármaco fosfonoximetil-buparvaquona-

oxima...................................................................................................... pg. 54

2.10: Estrutura química da fenitoína e da fosfenitoína................................ pg. 55

4.1: Fórmula estrutural da clorexidina base................................................ pg. 62

4.2: Mecanismo de reação para a obtenção do pró-fármaco........................ pg. 66

4.3: Mecanismo da ação catalítica da piridina e da 4-DMAP......................... pg. 67

4.4: Possíveis produtos formados na reação............................................... pg. 68

4.5: Formação de sal com o ácido palmítico (palmitato de clorexidina)..........pg. 69

4.6: Metanólise do cloreto de palmitoíla, com liberação de ácido clorídrico... pg. 72

ÍNDICE DE QUADROS

2.1: Estruturas química dos compostos pesquisados para o tratamento da

periodontite............................................................................................. pg. 33

2.2: Relações empíricas e qualitativas de estrutura-sabor........................... pg. 46

ÍN DICE DE TABELAS

4.1: Condições reacionais e produtos obtidos............................................ pg. 96

4.2: Concentração das soluções saturadas de TPCHD em água e em n-

octanol.................................................................................................. pg. 101

Sumário e Índices

viiR.F.Menegon

4.3: Concentração de TPCHD nas fases n-octanol e aquosa, e valor do coeficiente

de partição P e log P.............................................................................. pg. 102

4.4: Taxa de recuperação da extração..................................................... pg. 104

ÍNDICE DE GRÁFICOS

4.1: Curva de calibração UV (258nm) do tetrapalmitato de clorexidina....... pg. 100

4.2: Curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina.......................... pg. 104

4.3: Concentração de TPCHD em função do tempo transcorrido ao enxágüe bucal

com suspensão 0,35%........................................................................... pg. 106

ÍNDICE DE ESQUEM AS

3.1: Obtenção do pró-fármaco a partir do cloreto de palmitoíla....................pg. 57

3.2: Obtenção do pró-fármaco a partir do ácido palmítico............................pg. 58

6.1: Síntese do pró-fármaco(3) a partir do cloreto de palmitoíla(2) e clorexidina

base(1)...................................................................................................pg. 110

6.2: Síntese do pró-fármaco(3) a partir do ácido palmítico(4) e clorexidina

base(1)...................................................................................................pg. 116

Resumo

1_____________________________________________________________________________________________________

R.F.Menegon

RESUM O

A Saúde bucal da população mundial apresentou grandes melhoras nos

últimos anos, mas certas doenças como as cáries e as periodontopatias ainda

consistem em sérios problemas, apresentando altas incidências em muitos países,

levando à perda prematura de dentes.

A Organização Mundial de Saúde considera a Saúde bucal como parte

integrante da Saúde geral, apresentando um forte impacto psicossocial, afetando a

qualidade de vida dos pacientes.

O controle da placa bacteriana é o ponto principal da prevenção das

doenças periodontais, no entanto, uma eficaz remoção mecânica da placa exige

certa habilidade, e nem sempre é feita corretamente. Daí a importância do

desenvolvimento de agentes químicos para o tratamento e a profilaxia destas

doenças.

O digluconato de clorexidina é o agente mais amplamente utilizado e de boa

eficácia, mas que apresenta dificuldades na aceitação pelos pacientes dado seu

sabor desagradável de difícil mascaramento farmacotécnico.

Quando esta tentativa não é eficiente, a modificação química, através de

técnicas de latenciação, pode suprimir esta propriedade organoléptica indesejável,

aumentando a adesão dos pacientes ao tratamento.

O presente trabalho propõe a diminuição do sabor amargo da clorexidina

através da síntese de pró-fármaco, obtendo um derivado palmítico.

Abstract

2R.F.Menegon

ABSTRACT

Despite great improvements in the oral health of populations across the

world, problems still persist. Some diseases like caries and periodontitis have high

incidence in most countries, causing premature lost of teeth.

The World Health Organization (WHO) consider the oral health integral to

general health and essential to well-being, moreover, the psychosocial impact of

these diseases often significantly diminishes quality of life.

The control of bacterial plaque is the key of periodontal diseases prevention,

but the degree of motivation and skill required for an effective mechanical remove

of the plaque may be beyond the ability of the majority of patients. By this way,

the development of chemical agents for the treatment and prophylaxis of these

diseases makes important.

The most widely used chemical agent to control of plaque is chlorhexidine

digluconate, but the patients compliance is very hard because of its bitter taste

that is not easily to be masked by the use of flavours and flavour modifiers.

When this approach is ineffective, chemical modifications, like latentiation

process, have to be consider to suppress this undesirable organoleptic property,

increasing the patients’ compliance.

With this aim, the purpose of this work was to suppress the bitter taste of

the chlorhexidine by the means of prodrug synthesis, to give a palmitic derivative.

1– Introdução e Objetivo

Introdução e Objetivo

3R.F.Menegon

1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO

1.1. INTRODUÇÃO

Apesar das grandes melhorias na Saúde bucal das diversas comunidades ao

redor do mundo, alguns problemas ainda persistem, principalmente entre grupos

desfavorecidos em ambos países desenvolvidos e em desenvolvimento. A

Organização Mundial de Saúde (OMS) considera a Saúde bucal como parte integral

da Saúde geral, apresentando grande impacto sobre o bem–estar (PETERSEN;

LENNON, 2004), visto as doenças orais restringirem atividades na escola, no

trabalho e em casa. O impacto psicossocial destas doenças freqüentemente

diminui a qualidade de vida dos pacientes.

A cárie dental é ainda o principal problema de Saúde bucal em muitos

países industrializados, afetando entre 60 e 90% das crianças em idade escolar e a

grande maioria dos adultos. É também a doença bucal de maior prevalência em

muitos países asiáticos e latino americanos (WHO, 2002).

Em todo o mundo, muitas crianças apresentam sinais de gengivite e, entre

os adultos, os estágios iniciais de doenças periodontais são ainda mais comuns. 5

a 15% da população de muitas comunidades apresentam periodontite severa e

cerca de 2% dos jovens estão acometidos por periodontite juvenil agressiva, uma


4R.F.Menegon

condição grave que afeta indivíduos durante a puberdade levando a perda

prematura de dentes (ALBANDER; BROWN; LÖE, 1997; WHO, 2004). As figuras de

1.1 a 1.3 demonstram a prevalência das formas mais severas de periodontite nas

Américas Central e do Sul, de acordo com a faixa etária. O tabagismo é

considerado o principal fator de risco para doença periodontal em adultos,

responsável por mais que a metade dos casos de periodontite nesta faixa etária

em países industrializados (TOMAR; ASMA, 2000).

Figura 1.1: Mapa das Américas Central e do Sul indicando a prevalência de periodontites severas

entre indivíduos jovens por país (GJERMO; RÖSING; SUSIN, et al, 2002)


5R.F.Menegon


entre indivíduos adultos por país (GJERMO; RÖSING; SUSIN, et al, 2002)


entre indivíduos idosos por país (GJERMO; RÖSING; SUSIN, et al, 2002).


6R.F.Menegon

As doenças periodontais são caracterizadas por uma reação inflamatória do

tecido gengival, em resposta a biofilmes bacterianos que se acumulam na

superfície da raiz dos dentes, resultando na perda de osso alveolar e do ligamento

periodontal (JIN; ANUSAKSATHIEN; WEBB; et al, 2003). A periodontite crônica é a

principal causa de perda de dentes na população adulta em todo o mundo

(PAPAPANOU, 1996).

Figura 1.4: Inflamação do tecido gengival (gengivite): <http://WWW.eduardorubio.odo.br>


7R.F.Menegon

Figura 1.5: Perda severa de dentes. Extraído da internet em: <http://WWW.eduardorubio.odo.br>

Figura 1.6: Reabsorção óssea. Extraído da internet em: <http://WWW.eduardorubio.odo.br>

A placa bacteriana é sabidamente o fator iniciante do desenvolvimento de

gengivites, sendo o seu controle, portanto, o ponto principal de uma boa prática

de higiene bucal (LÖE; THEILADE; JENSEN, 1965). No entanto, para muitos

pacientes, a habilidade necessária e a motivação pessoal para uma eficaz remoção


8R.F.Menegon

mecânica da placa, estão além de suas capacidades, sobretudo para aqueles que

estão impossibilitados de movimentar seus membros superiores, ou apresentam

movimento limitado (HULL, 1980).

Neste sentido, dá-se a importância do desenvolvimento de fármacos

eficazes na profilaxia e tratamento destas doenças. Entre os agentes mais

amplamente utilizados no controle da gengivite e periodontite está o digluconato

de clorexidina, um antisséptico de amplo espectro e de eficácia comprovada (LÖE;

SCHIOTT, 1970). No entanto, tem sido demonstrado alguns efeitos adversos

devido ao seu uso por períodos prolongados, os quais limitam sua aceitação

pública, como amarelamento dos dentes e de restaurações dentárias (figura 1.7),

aumento na deposição de cálculo salivar, sabor desagradável de difícil

mascaramento farmacotécnico e lesão descamativa superficial (LÖE; SCHIOTT;

KARRING, 1976; ZANINI; BASILE; FOLLADOR; et al, 1997; TILLIS, 1999).

Figura 1.7: Manchas nos dentes provocadas pelo uso de clorexidina (TILLIS, 1999)


9R.F.Menegon

Nestas situações, onde o desenvolvimento farmacotécnico é insuficiente

para corrigir ou mascarar problemas organolépticos relacionados ao fármaco,

modificações químicas podem ser consideradas. Através de técnicas de obtenção

de pro-fármacos, termo primeiramente utilizado por Albert, em 1958, para

descrever compostos que necessitavam de biotransformação prévia para promover

efeito farmacológico (BUNDGAARD, 1991), é possível a supressão de propriedades

indesejáveis como sabor ou odor desagradável, estabilidade insuficiente, estado de

agregação inapropriado e outros problemas de natureza físico-química

(WERMUTH, 1996).


10R.F.Menegon

1.2. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho consiste no estudo da obtenção de pró-fármaco

derivado de clorexidina utilizando o ácido palmítico como transportador, o qual

apresente uma remoção mais lenta nas cavidades orais e maior penetração nos

tecidos subgengivais, aumentando desta forma sua atividade nas doenças bucais,

além de minimizar a percepção de seu sabor desagradável, melhorando sua

aceitação pelos pacientes.

Objetivos específicos:

1. Síntese e caracterização do pró-fármaco derivado de clorexidina;

2. Determinação do coeficiente de partição (P) e Log P do pró-fármaco;

3. Determinação do tempo de retenção do pró-fármaco na cavidade bucal,

através de estudo cinético em saliva.

2– Revisão Bibliográfica

Revisão Bibliográfica

11R.F.Menegon

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. PERIODONTITE

As doenças periodontais são caracterizadas por uma reação inflamatória do

tecido gengival, em resposta a biofilmes bacterianos que se acumulam na

superfície da raiz dos dentes, resultando na perda de osso alveolar e do ligamento

periodontal. Periodontite crônica é a principal causa de perda de dentes na

população adulta em todo o mundo (PAPAPANOU, 1996). Essas doenças são

infecciosas, crônicas e freqüentemente assintomáticas, ocorrendo como resultado

da exposição do periodonto à ação das bactérias aderidas à superfície dentária, de

natureza não descamativa (AXELSSON; LINDHE, 1981).

A placa bacteriana é sabidamente o fator iniciante do desenvolvimento de

gengivites, sendo o seu controle, portanto, o ponto principal de uma boa prática

de higiene bucal (MOORE; HOLDEMAN; SMIBERT, 1984). A formação da placa dá-

se inicialmente com a adesão de uma película de constituintes salivares à

superfície dental, a qual é composta por material acelular derivado de

componentes salivares específicos, que compreendem proteínas altamente

carregadas e glicoproteínas. Acredita-se que esta película salivar seja a

responsável direta pela subseqüente aderência das bactérias orais. Esta aderência

ocorre provavelmente devido à interações entre receptores específicos na


12R.F.Menegon

superfície bacteriana com glicoproteínas da película. Uma vez ocorrida a adesão e

a colonização, dá-se início aos processos de aderência secundários. Nesta etapa, a

formação de produtos bacterianos extracelulares (levanos e glucanos) podem agir

aumentando a adesão entre as células e as protegendo. Se não houver nenhum

distúrbio dentro de 2 a 3 dias, a placa começa a mudar. O ambiente mais interno

da placa torna-se anaeróbio e outras formas de bactérias aparecem. A massa da

placa cresce até 200% de seu tamanho inicial, tornando-se uma grossa massa

gelatinosa sobre a superfície do esmalte. Se deixada permanecer na superfície do

dente, pode ocorrer deposição de fosfato de cálcio, levando à transformação da

placa em cálculo (NISENGARD; NEWMAN, 1997).

Apesar da impossibilidade da ausência total de placa bacteriana, a gengiva e

demais estruturas periodontais podem ser mantidas sadias se a quantidade da

placa for pequena, se a microbiota for pouco virulenta e ainda se os mecanismos

de defesa orgânica forem eficazes (PAGE; KORNMAM, 1997).

As bactérias formadoras do biofilme são habitantes normais da cavidade

bucal que recobre a superfície dos dentes. A colonização bacteriana se dá

normalmente e em poucas horas. Não havendo interferência no processo, o

biofilme dental se modificará quantitativa e qualitativamente, tornando-se mais

propício ao aparecimento da doença periodontal inflamatória (LISTGARTEN, 1987;

CHRISTERSSON; ZAMBON; DUNFORD; et al, 1989).

A doença periodontal é uma mistura específica de bactérias que causam

destruição periodontal nos indivíduos susceptíveis (OFFENBACHER, 1996).


13R.F.Menegon

Bactérias periodontopáticas específicas, com seus fatores peculiares de virulência

provocarão aumento da agressão que dificulta o processo de defesa do

hospedeiro. Quando o organismo não consegue suplantar a agressão, ocorre

migração apical do epitélio juncional e perda de inserção conjuntiva. O padrão de

progressão está diretamente relacionado ao binômio agressão e defesa (MOORE;

MOORE, 1994).

A microbiota na placa dental humana é diversa e muito complexa,

consistindo em mais de 300 tipos de bactérias diferentes (MOORE, 1987), mas

somente um pequeno grupo delas, denominadas microrganismos

periodontopáticos, são considerados agentes etiológicos primários na doença

periodontal humana (VAN WINKELHOFF, 1991).

Os principais microrganismos associados à doença periodontal são

Porphyrom onas gingivalis, Bacterioides forsythus, Prevotella interm edia,

Cam pylobacter rectus, Eikenella corrodens,Actinobacillus actinom ycetem com itans,

Capnocytophaga sp, Treponem a denticola, Eubacterium nodatum , Streptococcus

interm edia, Prevotella nigrescens, Peptostreptococcus m icros e Fusobacterium

nucleatum (HAFFAJEE; SOCRANSKY; DZINK; et al, 1988; TANNER; BOUDIN,

1989). Embora não seja certo quais microrganismos, ou combinação deles,

estejam envolvidos na indução da doença periodontal, estudos clínicos sugerem

que Porphyrom onas gingivalis, Bacterioides forsythus, Actinobacillus

actinom ycetem com itans,e Treponem a denticola estejam presentes na maioria dos


14R.F.Menegon

casos nos sítios de progressão da doença (SLOTS; LISTGARTEN, 1988;

SIMONSON; ROBINSON; PRANGER; et al, 1992).

As doenças periodontais são o resultado da destruição dos tecidos

periodontais pela ação dos produtos tóxicos liberados na área subgengival pelos

periodontopatógenos específicos, como também pela resposta inflamatória

desencadeada pela presença de microrganismos e seus sub-produtos tóxicos. A

inflamação leva à produção local de citocinas e mediadores biológicos

(interleucinas e prostaglandinas). Estão, portanto, associadas com a colonização

da área subgengival por bactérias patogênicas específicas, algumas destas com

capacidade de invadir os tecidos periodontais provocando danos. As bolsas

profundas, observadas nas formas graves de doença periodontal, oferecerão um

microambiente mais propício ao crescimento microbiano anaeróbio (BARILI, 2003).

Tüter e colaboradores (2001) mostraram que o estado clínico da

periodontite está intimamente relacionado com os níveis de interleucina -1? (IL-

1? ) no fluido crevicular gengival. A IL-1? é uma citocina inflamatória produzida

predominantemente por macrófagos em resposta a produtos bacterianos

(MASADA; PERSSON; KENNEY; et al, 1990; KJELDSEN; HOLMSTRUP; BENDTZEN,

1993; GORE; SANDERS; PANDEY; et al, 1998), sendo estes produtos, ou

endotoxinas, constituídos principalmente por lipopolissacarídeos (LPS), que são

componentes estruturais da parede celular de bactérias gram-negativas

(RAMAMURTHY; RIFKIN; et al, 2002).


15R.F.Menegon

Os LPS podem ativar as células hospedeiras no periodonto, incluindo

leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos e o epitélio sulcular,

mediante sua ligação aos receptores de superfície celular, neste caso, o receptor

CD14 de LPS (DING; UITTO; HAAPASALO; et al, 1996; MALHOTRA; BIRD, 1997).

Esta ativação celular pode induzir macrófagos da medula óssea a expressarem um

produto proto-oncogene, um provável marcador específico do fenotipo de

osteoclasto (ABU-AMER; ROSS; EDWARDS; et al, 1997), e vários tipos celulares,

como fibroblastos e macrófagos, a secretarem citocinas pró-inflamatórias e

metaloproteinases (WILSON, 1995).

A atividade da colagenase, uma dentre uma série de proteinases

degradantes da matriz óssea, chamadas de metaloproteinases, é um passo

limitante da colagenólise patológica na periodontite (HARRIS; WELGUS; KRANE,

1984).

A liberação dos fragmentos de degradação do colágeno, assim como a

exposição e/ou liberação de mediadores biológicos (ex. osteocalcinas e citocinas),

atrai osteoclastos para os ossos mineralizados, e assim iniciam o processo de

reabsorção óssea (HOLLIDAY; WELGUS; FLISZAR; et al, 1997). Os osteoblastos,

células cuja principal função é a síntese de nova matriz óssea (a qual é composta

por 90% de colágeno tipo I) (PLOSKER; GOA, 1994), também é capaz de iniciar a

reabsorção óssea através da síntese de proteinases neutras, incluindo

metaloproteinases (ex. colagenase) a qual podem degradar o tecido osteóide

(HOLLIDAY; WELGUS; FLISZAR; et al, 1997).


16R.F.Menegon

Tai e colaboradores, em 1997, demonstraram que a adição de IL-1? , IL-6, e

receptor solúvel de IL-6, sobre cultura de osteoblastos induziram

cooperativamente a estimulação de cox-2, aumentando a produção de

prostaglandina E2 (PGE2), que é um potente estimulador da reabsorção óssea. Este

aumento de PGE2 parece ser o responsável pela osteoclastogênese a partir dos

osteoblastos (RAMAMURTHY; RIFKIN; et al, 2002).

PGE2 é o principal metabólito do ácido araquidônico, o qual pode ser

produzido por muitas células. Macrófagos estimulados por LPS podem ser um

importante produtor desta prostaglandina na doença periodontal (ALEXANDER;

EVANS, 1971; LINDEMANN; ECONOMOU; ROTHERMEL, 1988). Além disso, esses

macrófagos estimulados secretam IL-1 e TNF? (fator de necrose tumoral) que

estimulam fibroblastos a secretarem PGE2 (NEWTON; COVINGTON, 1987;

MOLVIG; BAEK; CHRISTENSEN; et al, 1988; RICHARDS; RUTHERFORD, 1988). As

prostaglandinas têm sido relacionadas por diversos autores com a perda óssea

(OFFENBACHER; ODLE; van DYKE 1986, OFFENBACHER; ODLE; BRASWELL; et al

1989; SALVI; SPETS-HAPPONEN; SINGER; et al, 2005).

A evolução da doença, assim como seu início, é modificada por condições

locais e sistêmicas, denominados fatores de risco. Desta forma, as doenças

periodontais são associadas aos microrganismos periodontopatógenos do biofilme

dental, e aos fatores de riscos, que incluem o tabagismo, o estresse emocional, o

diabetes, HIV entre outros, capazes de alterar a resposta à ação dos

microrganismos. Medidas preventivas e terapêuticas devem reconhecer, identificar


17R.F.Menegon

e eliminar ou controlar o fator etiológico primário (biofilme dental) como também

os fatores de risco associados ao processo da doença (VAN DIKE, 1993; GENCO,

1996; SAKKI; KNUUTTILA; ANTTILA, 1998).

2.2. TRATAM EN TO

O controle da formação da placa bacteriana é o ponto principal para a

prevenção de gengivites e de outras doenças periodontais. Uma boa prática de

higiene bucal consiste em sua remoção mecânica, através da escovação dental

(LÖE; THEILADE; JENSEN, 1965; MOORE; HOLDEMAN; SMIBERT; et al, 1982,

1984).

No entanto, tendo em vista a necessidade de motivação pessoal e uma

habilidade manual para uma correta escovação dental, muitos pesquisadores vêm

estudando a etiologia e o desenvolvimento dessa patologia, de maneira a

encontrar alternativas terapêuticas cada vez mais eficazes (HULL, 1980).

Até a década de 1980, os principais grupos de substâncias utilizadas para o

controle da placa bacteriana e da cárie eram: 1) enzimas; 2) antibióticos, e 3) anti-

sépticos. Mais recentemente, têm se estudado agentes inibidores da colagenase,

antiinflamatórios não esteroidais e inibidores na reabsorção óssea, como forma de

modular a resposta do hospedeiro aos patógenos quando a doença já está

instalada.


18R.F.Menegon

2.2.1.Enzim as

Preparações com enzimas foram estudadas numa tentativa de romper a

matriz da placa bacteriana, causando uma dispersão desta (HULL, 1980).

Deste modo, muitas enzimas foram testadas, dentre elas destacam-se a

mucinase, enzimas do pâncreas desidratado (tripsina, quimotripsina,

carboxipeptidase, amilase, lipase e nucleases), enzimas originárias de fungos,

dextranase e mutanase (HULL, 1980).

Apesar de algumas delas terem apresentado uma significativa redução na

formação dos cálculos salivares, alguns efeitos indesejáveis, como feridas na

língua, ulcerações localizadas e perturbações no paladar foram observados, o que

levou ao quase abandono desta terapia (HULL, 1980).

2.2.2. Antibióticos

Dado o fato de a placa ser constituída por microrganismos, a terapia

antibiótica visa à prevenção e ao controle da formação delas.

A introdução da antibioticoterapia no controle da placa se deu com a

observação de que pacientes que faziam uso de penicilinas por longos períodos

como profilaxia da febre reumática apresentavam uma significante redução nas

cáries dentárias e na inflamação da gengiva (ZANDER, 1950).


19R.F.Menegon

Os efeitos da eritromicina (estrutura 1, quadro 2.1, página 33) foram

reportados por Lobene e colaboradores, em 1969, quando se observou redução de

35% na formação das placas (LOBENE; BRIAN; SOCRANSKY, 1969).

Enxaguatórios bucais contendo 0,01% de nidamicina (estrutura 2, quadro

2.1, página 33) produziram redução substancial na placa, cálculo e gengivite,

quando usada duas vezes ao dia (VOLPE; KULPLZAK; BRANT; et al, 1969).

Aplicações tópicas de sulfato de canamicina (estrutura 3, quadro 2.1, página

33) a 5% em Orabase foram estudadas por Loesche e colaboradores em 1977,

produzindo redução na gengivite, a qual foi atribuída ao decréscimo da população

de streptococci na placa (LOESCHE; HOCKETT; SYED, 1977).

Löe e colaboradores, em 1967, compararam os efeitos de 3 enxaguatórios

bucais contendo tetraciclina, vancomicina e polimixina B (estruturas 4, 5 e 6

quadro 2.1, página 33). Destas, a tetraciclina foi a mais efetiva dos três

antibióticos investigados, sendo que somente no grupo das tetraciclinas houve

redução na inflamação da gengiva. Listgarten e colaboradores, em 1978,

observaram marcante melhora nas condições gengivais de pacientes tratados

sistemicamente com tetraciclina. Houve também diminuição na microbiota

subgengival dos pacientes estudados.

Uma importante observação foi feita por Williams e colaboradores, em 1979,

ao notificar diminuição na perda de osso alveolar em cães da raça beagle tratados

com tetraciclina.


20R.F.Menegon

A espiramicina (estrutura 7, quadro 2.1, página 33) é efetiva principalmente

contra organismos Gram-positivos, sendo interessante o fato dela ser mantida em

seu estado ativo por prolongados períodos nas glândulas salivares, saliva e ossos.

Winer e colaboradores (1966) mostraram ser a espiramicina a mais efetiva dentre

nove agentes antimicrobianos testados em hamisters para o controle de placa,

caries e lesões periodontais.

De maneira geral, antibióticos, particularmente os de amplo espectro,

demonstraram-se capazes de prevenir a colonização bacteriana reduzindo, desta

forma, a severidade da gengivite. No entanto, existem muitos problemas

associados a antibioticoterapia prolongada, os quais usualmente limitam sua

aplicabilidade no controle da doença periodontal. Estes problemas incluem: 1) o

desenvolvimento de cepas resistentes de microrganismos, tornando o antibiótico

ineficiente tanto para a prevenção do acúmulo da placa quanto no controle de

infecções sistêmicas; 2) o aumento de outros microrganismos da microbiota bucal,

ex., Candida albicans, contra os quais, o antibiótico é ineficiente, e 3) ocorrência

de reações de hipersensibilidade ao medicamento.

2.2.3. Anti-sépticos

Muitos agentes anti-sépticos foram investigados na tentativa de suprimir a

microbiota bucal e inibir a formação de cáries. O principal grupo anti-séptico é o

das biguanidas, na qual se inclui o mais bem sucedido agente antiplaca, a


21R.F.Menegon

clorexidina (estrutura 8, quadro 2.1, página 33). Outras biguanidas, como a

hexetidina e alexidina, também são eficazes, sem que tenham qualquer vantagem

sobre a clorexidina, a qual já foi extensivamente estudada (HULL, 1980).

Um importante experimento foi realizado por Löe e Schiott (1970). Estes

pesquisadores demonstraram que, na ausência de limpeza mecânica dos dentes, a

formação de placa e o desenvolvimento de gengivites foram prevenidas pelo

enxágüe com solução de gluconato de clorexidina a 0,2% duas vezes ao dia

durante de 21 dias. A única desvantagem notificada foi o aparecimento de

manchas nos dentes e na língua, além do sabor desagradável da clorexidina.

O aparecimento destas manchas se devem, aparentemente, a reações de

precipitação entre os cromóforos encontrados nos alimentos e à clorexidina

aderida aos dentes (TILLIS, 1999).

Foi demonstrado também, que a clorexidina apresenta afinidade por regiões

da superfície bucal, sendo gradualmente liberada exercendo sua ação anti-séptica

(RÖLLA; LÖE; SCHIOTT, 1976). Esta ligação reversível exerce importante papel no

mecanismo de ação da clorexidina.

A ação da clorexidina depende da adsorsão do composto na parede celular

das bactérias. Os grupos lipofílicos da molécula causam desorientação das

lipoproteínas da membrana celular, alterando sua permeabilidade,

consequentemente o equilíbrio osmótico. (HUGO; LONGWORTH, 1964, 1965). Em

baixas concentrações, a clorexidina causa lise em microrganismos osmoticamente


22R.F.Menegon

sensíveis e em altas concentrações leva a um violento choque osmótico (HUGO;

LONGWORTH, 1964).

Davies e colaboradores (1954) demonstraram que na concentração de

1:2.000.000 a clorexidina previne o crescimento de Estafilococcus aureous e

Estreptococcus lactis (entre outros), e que diluições de 1:50.000 impedem o

crescimento de Pseudom onas aeruginosa. Resultados semelhantes foram

encontrados por Lawrence (1960), que demonstrou também ser necessária apenas

uma pequena diferença nas concentrações para produzir efeitos bacteriostático ou

bactericida.

Outro importante grupo de anti-sépticos é o dos compostos de amônio

quaternário, no qual estão incluídos o cloreto de benzetônio e cloreto de

cetilpiridínio (estruturas 9 e 10, quadro 2.1, página 33). Apesar destas substâncias

apresentarem certa similaridade com as propriedades químicas e antibacterianas

da clorexidina (VOLPE; KULPLZAK; BRANT; et al, 1969), esta última apresenta

maior efetividade no controle da placa in vivo do que os compostos quaternários

investigados por Gjermo (1970).

As diferenças clínicas entre estes dois grupos de anti-sépticos podem ser

explicadas pelas taxas de remoção destas substâncias pela saliva. Os compostos

quaternários são claramente mais rapidamente removidos da boca que a

clorexidina. Isto explica a observação de que quando se enxágua a boca com

amônio quaternário 4 vezes ao dia, ao invés de 2 vezes, o efeito inibitório sobre as

placas também aumenta (BONESVOLL; GJERMO, 1978). Os efeitos colaterais


23R.F.Menegon

destas substâncias são similares aos encontrados com as biguanidas, ou seja,

sabor desagradável e aparecimento de manchas nos dentes (CIANCIO; MATHER;

BUNNEL, 1975).

Até o presente, o enxágüe bucal com clorexidina é o método mais utilizado

e investigado para o controle químico da placa, demonstrando alta efici ência na

inibição quase completa da formação da placa. A clorexidina tem se mostrado

muito segura e com poucos efeitos adversos registrados. Flötra e colaboradores

(1972), demonstraram que, embora a clorexidina seja muito eficiente no controle

da placa supragengival, ela não é efetiva contra a placa subgengival. O controle da

placa supragengival não necessariamente produz mudanças na microbiota

subgengival, a qual está mais relacionada às características destrutivas da

periodontite crônica. Sugere-se que a melhor utilização da clorexidina seja como

auxiliar no tratamento da periodontite ou profilática na prevenção da formação da

placa supragengival (FLÖTRA; GJERMO; RÖLLA; et al, 1972).

As mesmas observações podem ser válidas para os compostos de amônio

quaternário, os quais, a despeito de necessitarem de mais enxágües diários,

possivelmente apresentam mais efeitos adversos com seu uso prolongado, sem

que apresente, no entanto, qualquer vantagem sobre as biguanidas (FLÖTRA;

GJERMO; RÖLLA; et al, 1972).

Mais recentemente, tem sido pesquisada a atividade de agentes inibidores

da colagenase, tanto às de origem mamífera quanto às provindas de

microrganismos periodontopáticos, como as Porphyrom onas gingivales,


24R.F.Menegon

Actinobacillus actinom ycetem com itans, espécies de Espiroquetas e de Bacilos

(MOOKHTIAR; MARLOWE; BARLETT; et al, 1987; MAKINEN; SYED; LOESCH; et al,

1988). Nesse sentido, foram estudados alguns inibidores da colagenase mamífera,

como o ácido retinóico (BRINKERHOFF; MCMILLAN; DAYER; et al, 1980), fenitoína

(MAKINEN; SYED; LOESCH; et al, 1988), negro de eriocromo T (MAKINEN; SYED;

LOESCH; et al, 1988) e fosfonamidas (MOOKHTIAR; MARLOWE; BARLETT; et al,

1987) (estruturas 11 a 14 respectivamente, quadro 2.1, página 33).

O cloranil (estrutura 15, quadro 2.1, página 33) e a fosfonamida têm sido

investigados como inibidores da colagenase bacteriana também (GREENWALD;

GOLUB; LAVIETES; et al, 1987; GREENWALD; SIMONSON; MOAK; et al, 1988).

Diversos estudos têm notificado que os antibióticos da classe das

tetraciclinas podem inibir colagenases mamíferas por mecanismo independente de

sua atividade antibacteriana (LEE; GOLUB; GWINNETT; et al, 1985; GOLUB;

McNAMARRA; D’ANGELO; et al, 1987; GREENWALD; GOLUB; LAVIETES; et al,

1987 ; GREENWALD; SIMONSON; MOAK; et al, 1988). Elas podem, também, inibir

outras metaloproteinases (gelatinases, colagenases tipo IV/V e elastases)

envolvidas no tecido conectivo (LEE; GOLUB; GWINNETT; et al, 1985; CHANG;

RAMAMURTHY; GOLUB, 1989). Desde a descoberta da ação anticolagenase deste

grupo de fármacos, o potencial terapêutico de suas propriedades não

antimicrobianas vem sendo considerado (GOLUB; RAMAMURTH; McNAMARA; et al,

1991; GOLUB; SUOMALAINEN; SORSA, 1992).


25R.F.Menegon

Posteriormente, 10 tetraciclinas quimicamente modificadas (CMTs)

(estrutura 16 – CMT-8, quadro 2.1, página 33), desprovidas de ação

antimicrobianas, foram sintetizadas, dentre as quais 9 mostram propriedades

anticolagenase (GOLUB; RAMAMURTH; McNAMARA; et al, 1991; GOLUB;

SUOMALAINEN; SORSA, 1992; SORSA; RAMAMURTHY; VERNILLO; et al, 1998).

Ramamurthy e colaboradores (2002), compararam a doxiciclina (estrutura 17,

quadro 2.1, página 33) com as CMTs, quanto à ação inibitória das

metaloproteinases, em modelo animal (usando ratos) de inflamação periodontal

com perda óssea induzida por endotoxinas. Neste trabalho, foi demonstrado que

estas CMTs podem ser capazes de inibir a reabsorção óssea através de ação sobre

a ativação oxidativa de metaloproteinases latentes, cuja síntese é regulada através

da ação de citocinas pró inflamatórias, as quais as CMTs também são capazes de

reduzir seus níveis no tecido periodontal; a doxiciclina, por outro lado, não é capaz

de inibir a atividade das metaloproteinases latentes (LEE; GOLUB; GWINNETT; et

al, 1985; SOBRIN; LIU; MONROY; et al, 2000).

Um estimulador da síntese de muitas citocinas pró-inflamatórias é o óxido

nítrico (NO), o qual aumenta a quantidade destas citocinas através do aumento da

expressão das isoformas da ciclooxigenase (cox-1 e cox-2) (SALVEMINI, 1997). A

produção de NO é aumentada na presença de LPS, estando, portanto, envolvida

no processo patológico da periodontite crônica. No entanto, um inibidor da óxido

nítrico sintase (iNOS), a aminoguanidina (estrutura 18, quadro 2.1, página 33),

aumenta notavelmente a reabsorção óssea in vitro (KASTEN; COLLIN-OSDOBY;


26R.F.Menegon

PATEL; et al, 1994), não apresentando, até o momento, utilidade terapêutica na

periodontite. Este fato aparentemente ambíguo se deve não à ação regulatória

sobre a expressão de isoformas da ciclooxigenase, mas sim à uma regulação

bidirecional da função osteoclástica pelo óxido nítrico. Por um lado, o NO

produzido por osteoblastos inibe a função de osteoclastos maduros, diminuindo a

reabsorção óssea, por outro lado, os próprios osteoclastos, assim como seus

precursores, também são capazes de produzir NO, e que mínimas quantidades do

radical livre são necessárias para o funcionamento normal destas células. A

inibição da síntese de NO leva notoriamente ao aumento da atividade

osteoclástica sobre a reabsorção óssea (BRANDI; HUKKANEN; UMEDA; et al,

1995).

Atualmente, para a modulação da resposta do hospedeiro, estudos

apontam: 1) o uso de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) para reduzir os

metabólitos do ácido araquidônico, como a PGE2, reduzindo, então, a cascata

inflamatória, e também a osteoclastogênese a partir dos osteoblastos (JEFFCOAT;

REDDY; HAIGH; et al, 1995; WILLIAMS; JEFFCOAT; HOWELL; et al, 1989); 2) O

uso de doses sub-antimicrobianas de doxiciclina ou CMTs para reduzir a

quantidade de derivados metaloproteinase (como a colagenase), e 3) O uso de

substâncias capazes de reduzirem o recrutamento, a fixação e a atividade dos

osteoclastos (inibindo também as metaloproteinases), reduzindo então a

reabsorção óssea, como os bifosfonatos (BFs) por exemplo (PLOSKER; GOA, 1994;


27R.F.Menegon

TAI; MIYAURA; PULBEAM; et al, 1997; TERONEN; KONTTINEN; LINDQVIST; et al,

1997).

2.2.4. Antiinflam atórios Não Esteroidais (AINEs)

PGE2 é o principal metabólito do ácido araquidônico, o qual pode ser

produzido por muitas células. Macrófagos estimulados por LPS podem ser

importantes produtores desta prostaglandina na doença periodontal (ALEXANDER;

EVANS, 1971; LINDEMANN; ECONOMOU; ROTHERMEL, 1988). Além disso, esses

macrófagos estimulados secretam IL-1 e TNF? (fator de necrose tumoral) que

estimulam fibroblastos a também secretarem PGE2 (NEWTON; COVINGTON, 1987;

MOLVIG; BAEK; CHRISTENSEN; et al, 1988; RICHARDS; RUTHERFORD, 1988).

As prostaglandinas têm sido relacionadas com a perda óssea por diversos

pesquisadores (OFFENBACHER; ODLE; BRASWELL; et al, 1989; JOHNSON; WOOD;

SERIO, 2004; SALVI; SPETS-HAPPONEN; SINGER; et al, 2005). Neste sentido, os

antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), que inibem a produção de

prostaglandinas, tem reduzido significativamente a taxa de perda óssea

(WILLIAMS; JEFFCOAT; KAPLAN; et al, 1985; WILLIAMS; JEFFCOAT; HOWELL; et

al, 1987, 1989; TIPTON; FLYNN; STEIN; et al, 2003).

Williams e colaboradores (1989) foram capazes de demonstrar a diminuição

na perda óssea, através de método radiográfico, em pacientes tratados com

flurbiprofeno (estrutura 19, quadro 2.1, página 33). Outros AINEs, como


28R.F.Menegon

naproxeno (estrutura 20, quadro 2.1, página 33), têm reduzido a perda óssea

alveolar em periodontite crônica e em pacientes com forma mais agressiva da

doença através de sua ação inibitória na formação de prostaglandinas

(OFFENBACHER, 1996), e mais recentemente inibidores específicos da

ciclooxigenase-2 têm se mostrado eficazes também no controle da produção de

interleucinas por fibroblastos (TIPTON; FLYNN; STEIN; et al, 2003).

2.2.5. Doses sub-antim icrobianas de doxiciclina

Um estudo pioneiro realizado por Golub e colaboradores demonstrou o

efeito anti-proteinase de tetraciclina no tecido gengival humano e a redução da

atividade colagenolítica de uma metaloproteinase específica degradante da matriz,

derivada do hospedeiro (colagenase mamífera) (GOLUB; CIANCIO; RAMAMURTHY;

et al, 1990). Neste estudo, um regime de baixa dosagem de doxiciclina reduziu

substancialmente a atividade colagenolítica no fluido da bolsa periodontal e

também na gengiva de humanos com periodontite.

O benefício potencial do emprego de dose sub-antimicrobiana de doxiciclina

como auxiliar na remoção mecânica da placa e na higiene bucal para prevenção do

rápido progresso da periodontite crônica foi testada pela primeira vez por Novak e

colaboradores, em 2002. Uma vez que a rápida destruição do tecido periodontal

envolve a destruição da matriz colagenase, incluindo o tecido conectivo gengival,

ligamento periodontal, e osso alveolar, é possível pressupor que inibidores de


29R.F.Menegon

colagenase, como doses sub-antimicrobianas de doxiciclina, deve ter efeito

benéfico como auxiliar na terapia tradicional. De fato, os resultados encontrados

permitem especular que a combinação de baixas doses de doxiciclina com um

agente suplementar antimicrobiano, como a clorexidina ou um antibiótico tópico ou

sistêmico, pode agir sinergicamente produzindo uma melhora clínica não alcançada

pelo uso individual dessas substâncias.

2.2.6. Bifosfonatos e Tetraciclinas Quim icam ente M odificadas

Tetraciclinas quimicamente modificadas (CMTs), desprovidas de ação

antimicrobiana, podem apresentar ação similar aos bifosfonatos como inibidores da

reabsorção óssea, perturbando a função osteoclástica. Assim, como os

osteoclastos degradam os ossos, doses de CMTs ou de bifosfonatos, que são

direcionados aos ossos, serão absorvidas pelos osteoclastos, cuja função será

subseqüentemente inibida (HUGHES; WRIGHT; UY; et al, 1995).

A manutenção da massa normal e saudável dos ossos depende da interação

entre osteoblastos, osteoclastos e constituintes da matriz óssea para balancear a

reabsorção óssea e a sua formação. O desbalanceamento desse equilíbrio acarreta

em perda patológica de massa óssea, como é observado em periodontites,

osteoporose e tumores osteolíticos (FLEISCH, 1997).

O osteoclasto apresenta um sensor de cálcio sobre sua membrana em

contato com o plasma (ZAIDI; SHANKER; TUNWELL; et al, 1995). Uma mudança


30R.F.Menegon

na concentração extracelular de cálcio é monitorada por essas células e

internalizada em um sinal citosólico de cálcio, resultando em marcada inibição da

função osteoclástica. Então, quando CMTs ligam-se ao sensor do osteoclasto,

muitas funções celulares correlacionadas são reduzidas. Isto inclui a adesão à

matriz, secreção enzimática e reabsorção óssea (ZAIDI; MOONGA; HUANG; et al,

1993; ZAIDI; SHANKER; TUNWELL; et al, 1995).

Receptores de cálcio são expressos também na membrana nuclear dessas

células (ZAIDI; MOONGA; ADEBANJO, 1999), onde tais receptores provavelmente

controlam o influxo de cálcio para o nucleoplasma. Então, o cálcio

nucleoplasmático regula os processos críticos nucleares, incluindo a expressão de

genes e a apoptose. É sabido que CMTs podem também se ligar aos receptores de

cálcio na membrana nuclear, alterar o influxo nucleoplasmático de cálcio e,

conseqüentemente, afetar a expressão de genes osteoclásticos e a apoptose.

Um estudo realizado por Ramamurthy e Rifkin (2002) sugeriram que

mecanismos moleculares, múltiplos, adicionais, podem ser regulados com estas

substâncias. Tais mecanismos incluem, mas não se limitam necessariamente, 1) a

redução nos níveis de citocinas pró-inflamatórias, após injeções de endotoxinas

bacterianas; 2) a redução na atividade de metaloproteinases degradantes da

matriz, e 3) o aumento dos níveis de IL-10, uma citocina (interleucina)

antiinflamatória, resultando na redução da osteoclastogênese e reabsorção óssea.

O efeito da associação de um bifosfonato, o clodronato (estrutura 21,

quadro 2.1, página 33), um potente inibidor da reabsorção óssea, com um análogo


31R.F.Menegon

não antimicrobiano quimicamente modificado da doxiciclina (CMT-8),

administrados em ratos com periodontite induzida por LPS, foi estudado por

Llavaneras (2001). Cada substância foi administrada em doses tais que, baseado

em experimentos de dose-resposta preliminares, são consideradas muito baixas

para produzirem efeitos terapêuticos ótimos em regime de monoterapia, uma

estratégia desenvolvida para definir a eficácia do tratamento combinado.

A combinação de CMT-8 e clodronato em doses sub-terapêuticas reduziu

significativamente a reabsorção óssea alveolar e os níveis de metaloproteinases

degradantes do tecido, em extratos de gengiva obtidos de ratos tratados com LPS,

enquanto cada um dos medicamentos, por si só, nas mesmas dosagens,

apresentaram apenas pequeno e estatisticamente insignificante efeito. Estes

resultados sugerem que estas substâncias atuam sinergicamente na redução dos

níveis de metaloproteinases gengivais e na reabsorção óssea.

Como pode ser observado, as estratégias para o tratamento das

periodontites crônicas com perda óssea evoluíram de tal forma, que o controle da

microbiota bucal aparentemente deixou de apresentar um papel principal no

tratamento para ocupar, de certa forma, um lugar secundário, onde se prestigia o

controle da perda óssea através da inibição da atividade dos mediadores químicos

responsáveis pela patologia. É claro que um controle sobre os principais

microrganismos envolvidos com a indução da resposta inflamatória, sobretudo de

bactérias gram-negativas como as Porphyrom onas gingivales e Actinobacillus

actinom ycetem com itans, é sempre desejável; assim, com a diminuição do


32R.F.Menegon

emprego de antibióticos, principalmente os de amplo espectro, contribui-se para o

uso racional destes medicamentos, evitando seu abuso e , consequentemente, o

aparecimento de resistência por parte dos microrganismos.

Modernas abordagens terapêuticas têm sido estudadas empregando-se

proteínas morfogenéticas ósseas para a remodelagem do tecido periodontal. No

entanto, apesar do sucesso de ensaios in vitro, parece que certas dificuldades,

como a atividade biológica excessivamente curta destas proteínas, vêm

comprometendo os resultados in vivo. Jin e colaboradores, em 2003, parecem ter

conseguido resultados animadores utilizando modernas técnicas de transferência

de genes.

A seguir está apresentado o quadro 2.1 das estruturas dos compostos

mencionados, utilizados e/ou estudados para o tratamento da periodontite.


33R.F.Menegon

Quadro 2.1: Estruturas química dos compostos pesquisados para o tratamento da periodontite .

AN TIBIÓTICOS REFERÊN CIAS ESTRUTURA

01 eritromicina

LOBENE; BRIAN;

SOCRANSKY, 1969

02 nidamicina

VOLPE; KULPLZAK;

BRANT; et al, 1969

03 canamicina

LOESCHE;

HOCKETT; SYED,

1977

O

O

O

O

NH2

O H

OH

OHOH

NH2

NH2

OH

OHNH2

O H

CH 3 O

O

CH3

O

O H

O

CH3

O

O

O

CH3

O

N C H3

CH3OH

O

O H

CH3

O

CH 3

O

CH3

CH3

O O O

O

O

N

O

O

O H

OH

O H

OH

O

O H

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

C H3

CH 3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3


34R.F.Menegon

04 tetraciclina

LÖE; THEILADE;

JENSEN; et al, 1967

05 vancomicina

LÖE; THEILADE;

JENSEN; et al, 1967

06

polimixina B

(mistura das polimixinas B1

e B2)

LÖE; THEILADE;

JENSEN; et al, 1967

OO

N

OHOO H

O H

OH

NH2

CH3

O H

CH3 CH3

H

NH

NH

NH

NH

NH

N H

O

O

OO

O O

O

OO

O

O O

O

O

NH2

OH

OH

OH

NH

NH 2

OH

Cl

OHCl

O H

OH

O HOH

CH 3

O H

CH 3

CH3

CH3

CH 3

H

H

H

H H

HH

H

R-L-DAB-

L-Thr

L-DAB-

L-DAB

L-DAB-

D-Phe-

L-Leu

L-Thr-

L-DAB-

L-DAB

Polimixina B 1: R= (+)-6-metioctanoil

Polimixina B 2: R= 6-metilheptanoil

DAB= ácido ??? -diaminobutírico


35R.F.Menegon

07espiramicina

WINER; COHEN;

CHAUNCEY, 1966

AN TISSÉPTICO S REFERÊN CIAS ESTRUTURAS

08clorexidina

DAVIES; FRANCIS;

MARTIN; et al, 1954

09

cloreto de

benzetônio

VOLPE; KULPLZAK;

BRANT; et al, 1969

OO

O

O

O

O

O

N

O

O

O

OH

O

O H

O

CH 3

OH

CH 3

CH 3

CH3 CH3

CH3

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

N HNHNH

N H

N H

NH

NH

NH

N HNH

C l

Cl

N+

O

CH 3

CH3

CH 3

CH 3

O

CH 3 CH 3

CH 3

Cl-


36R.F.Menegon

10

cloreto de

cetilpiridínio

VOLPE; KULPLZAK;

BRANT; et al, 1969

DIVERSO S REFERÊN CIAS ESTRUTURAS

11ácido

retinóico

BRINKERHOFF;

MCMILLAN; DAYER;

et al, 1980

12 fenitoína

MAKINEN; SYED;

LOESCH; et al, 1988

N+

CH3

Cl-

O

O H

CH3

CH3CH3

CH3C H3

NHNH

O

O


37R.F.Menegon

13negro de

eriocromo T

MAKINEN;

MAKINEN, 1988

14 fosfonamida

MOOKHTIAR;

MARLOWE;

BARLETT; et al,

1987

15 cloranil

GREENWALD;

SIMONSON; MOAK;

et al, 1988

O

O

Cl

Cl

Cl

Cl

S

O

O

O-

N

N

OH

N+

O-

O

Na+

N

O

O

CH 3

P

O

O-

O

NH

CH 3CH3

O

NH

CH 3

O

NH 2


38R.F.Menegon

16 CMT-8

PATEL; ATTUR;

DAVE; et al, 1999

17 doxiciclina

GOLUB; CIANCIO;

RAMAMURTHY; et

al, 1990

INIBIDORES DA N O SIN TASE

REFERÊN CIAS ESTRUTURAS

18 aminoguanidina

BRANDI;

HUKKANEN;

UMEDA; et al, 1995

OO OH

OH

OH

NH2

O H

O H

N

OOO H

OO H

O H

O H

NH2

CH3

OH

CH3CH3

H H

O

H

H

NH

NHNH2

NH2


39R.F.Menegon

AINEs REFERÊN CIAS ESTRUTURAS

19 flurbiprofeno

WILLIAMS;

JEFFCOAT; KAPLAN;

et al, 1985

20 naproxeno

OFFENBACHER,

1996

BIFOSFONATOS REFERÊN CIAS ESTRUTURAS

21ácido

clodrônico

LLAVANERAS;

RAMAMURTHY;

HEIKKILÄ; et al,

2001

O

F

O H

CH3

O O H

O

CH3

CH3

P P

O

O

Cl

ClO H

O H

O H

OH


40R.F.Menegon

2.3. PLANEJAM ENTO DE PRÓ-FÁRM ACOS

2.3.1. Definição

Pró-fármaco (ou pró-agente) é um termo utilizado para descrever

compostos que necessitam de biotransformação prévia para promover efeito

farmacológico (BUNDGAARD, 1991), sendo primeiramente introduzido em 1958,

por Adrien Albert, que o definiu como “agentes terapêuticos que são inativos per

se mas são transformados em um ou mais metabólitos ativos”. O termo

latenciação foi proposto por Harper, em 1988, para designar o processo de

obtenção de pró-fármacos.

A latenciação, transformação do fármaco em forma de transporte inativo

que, in vivo, mediante reação química ou enzimática, libera a porção ativa no local

de ação ou próximo dele (figura 2.1), destaca-se entre os processos de

modificação molecular quanto à introdução de novos fármacos no mercado

(BUNDGAARD, 1991; CHUNG; FERREIRA, 1999).


41R.F.Menegon

Figura 2.1: Representação esquemática do conceito de pró-fármacos (BUNDGAARD, 1991).

Sinvastatina, omeprazol, aciclovir, lovastatina e enalapril são alguns

exemplos bem conhecidos de pró-fármacos (figura 2.2) (ETTMAYER; AMIDON;

CLEMENT; et al, 2004).

FÁRM ACO

PRÓ -FÁRM ACO

FÁRM ACO + TRANSPORTADOR

Biotransform açãoenzim ática ou quím ica

Barreira


42R.F.Menegon

Figura 2.2: Exemplos de pró-fármacos no mercado (ETTMAYER; AMIDON; CLEMENT; et al, 2004).

Entre os diversos métodos de preparação de pró-fármacos, a esterificação é

o mais empregado, seguido da formação de amidas, imidas e carbamatos

(KOROLKOVAS, 1988; BUNDGAARD, 1991). Outras ligações vêm merecendo

atenção na obtenção de pró-fármacos nos quais a biotransformação não seja

enzimática, como as iminas, bases de Mannich e enaminas. A formação de sais,

complexos e acetais também são possíveis (CRUZ, 1995).

O

O

O

O

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

HH

H

N

NH

S

N

O

O

CH3O

CH3 CH3

CH3

NNH

NH2

O

N

N

OOH

O

OO

OOH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

H H

N

NH

O

O

O

OH

OCH3

CH3

H H

sinvastatina omeprazol

aciclovir lovastatina

enalapril


43R.F.Menegon

Os pró-fármacos podem ser classificados de acordo com dois critérios

principais (ETTMAYER; AMIDON; CLEMENT; et al, 2004).

1º) Pela classe química:

- pró-fármacos ligados a um transportador;

- bioprecursores;

- sistemas de liberação química em local específico (pró-

fármacos dirigidos);

- pró-fármacos macromoleculares;

- conjugados fármaco-anticorpo.

2º) Pelo mecanismo de ativação:

- por meio enzimático versus não enzimático;

- por reações catabólicas versus anabólicas;

- por oxidação, redução ou hidrólise.

2.3.2. Solução de Problem as

Os pró-fármacos podem ser planejados para superar barreiras

farmacocinéticas, farmacodinâmicas ou farmacotécnicas, como estabilidade

química insuficiente, baixa solubilidade, sabor ou odor indesejável, dor ou irritação,

absorção bucal insuficiente, permeabilidade inadequada à barreira hemato-

encefálica e acentuada toxicidade e metabolismo pré-sistêmico (STELLA;

CHARMAN; NARINGREKAR, 1985). Nesta revisão será dado maior enfoque aos


44R.F.Menegon

problemas farmacotécnicos, sobretudo os relacionados à solubilidade e às

características organolépticas.

2.3.2.1. Correção de sabor

Sabor é uma complexa combinação de sensações incluindo gustação,

olfação, textura e resposta ao calor e ao frio. A sensação de sabor nos seres

humanos é confinada primariamente à face dorsal da língua, ao palato mole, à

epiglote e partes do esôfago. Em crianças, no entanto, os receptores do sabor são

distribuídos sobre amplas áreas da boca (SINKULA; YALKOWSKY, 1975).

A olfação exerce um papel fundamental na percepção do sabor, assim ao se

impedir o acesso ao epitélio olfatório de uma substância aromática colocada na

boca pelo fechamento do nariz, o sabor desaparece completamente, retornando

quando o nariz é aberto novamente. O mesmo ocorre num resfriado comum,

quando o aumento da secreção mucosa impede que o ar inspirado leve o material

volátil ao epitélio olfatório pelas cóanas, resultando em grande diminuição da

apreciação e detecção do sabor (DE SÁ FILHO, 2004).

Basicamente, existem 4 sabores primários: azedo, salgado, doce e amargo.

O principal problema farmacotécnico consiste em mascarar o sabor amargo.

Gowthamarajan e colaboradores (2004) relacionaram algumas características

químicas dos compostos com a percepção de seus sabores primários:


45R.F.Menegon

Azedo. O sabor azedo é geralmente atribuído a substâncias que contém

grupos ácidos ionizáveis em soluções aquosas. E ainda, quanto maior a

concentração de íons hidrogênios, maior é a sensação do azedo.

Salgado. Espécies catiônicas são parcialmente responsáveis por soluções

salgadas. O cloreto de sódio apresenta um típico sabor salgado. Cloretos de

potássio, amônio e cálcio apresentam sabor salgado similar, mas ligeiramente

diferente. Muitos sais de haletos apresentam predominância no sabor salgado, mas

com o aumento em seu peso molecular, como nos sais brometo de potássio e

iodeto de amônio, o sabor torna-se amargo além de salgado, ficando

completamente amargo no caso do iodeto de potássio, indicando a influência do

peso molecular do sal na sensação do sabor.

Doce.Este sabor é produzido por uma grande variedade de substâncias,

muitas das quais não apresentam similaridades estruturais. As duas substâncias

doces mais comuns, açúcar e glicerina, são álcoois polihidroxilados. No entanto, a

sacarina, que não apresenta grupos hidroxilas, é intensamente doce, mas

apresenta um sabor residual amargo.

Am argo. Assim como no caso do sabor doce, a sensação de amargura é

encontrada em muitas substâncias, muitas das quais são sais de compostos

orgânicos e inorgânicos. A amargura é freqüentemente associada com grupos

nitros, e a presença de dois ou mais destes grupos resultam em forte sabor

amargo.

O quadro 2.2 fornece relações empíricas e qualitativas de estrutura química-sabor.


46R.F.Menegon

Quadro 2.2: Relações empíricas e qualitativas de estrutura-sabor (McEVOY, 1974)

?? Compostos contendo muitos grupos hidroxilas são usualmente doces (glicois, açúcares e outros

carboidratos);

?? Um aumento no peso molecular, i.e. estendendo-se uma série homóloga, freqüentemente

muda de doce para amargo. Continuando-se este aumento, reduz-se a solubilidade da

substância para valores abaixo do limiar de percepção dos receptores de sabor;

?? Grupos nitros presentes em uma molécula são freqüentemente indicativos de sabor amargo

(cloranfenicol e ácido pícrico);

?? A alquilação de uma amina ou amida usualmente produz uma substância de sabor doce;

?? A alquilação de um grupo hidroxila (eterificação) diminui o sabor doce;

?? A alquilação de uma imida diminui o sabor doce, N-alquil sacarinas são sem sabor;

?? A adição de um grupo fenila em um composto causa ou aumenta o sabor amargo, e pode ser

devido ao aumento da lipofilicidade e/ou ligação preferencial com receptores de sabor amargo;

?? Um aumento em uma cadeia lateral diminui o sabor doce e aumenta o sabor amargo;

?? Esterificação aumenta o sabor doce ex.: etilbutirato;

?? Introdução de insaturação em uma molécula aumenta o sabor amargo e pungência;

?? Aminas primárias aumentam o sabor doce, especialmente se na proximidade houver um grupo

eletronegativo (-COOH), ex.: em certos D e L aminoácidos;

?? Aminas secundárias e terciárias e sais de amônio quaternários são amargos, especialmente

alcalóides, antibióticos e fármacos de amônio quaternário;

?? Uréias monossubstituídas são usualmente doces, embora algumas são sem sabor, a própria

uréia é amarga. Moléculas simétricas são freqüentemente amargas;

?? Compostos polihalogenados alifáticos são doces (clorofórmio, 1,2-dicloroetano e

diclorometano);

?? Substituição de halogênios aromáticos aumenta o sabor amargo e é uma função do peso

atômico do halogênio (ex.: sacarinas halogenadas);

?? A presença de enxofre em uma molécula alifática é usualmente associada com sabor amargo

(-SH, -S-, -S-S-, C=S );

?? Ácidos sulfônicos são usualmente amargos;

?? Aldeídos são doces. Aldeído semicarbazonas não são tão doces quanto aldeídos. Aldeído

fenilhidrazonas não são doces;

?? Oximas são usualmente doces ou sem sabores.


47R.F.Menegon

Duas estratégias são possíveis para a correção do sabor: a modificação da

forma e do potencial eletrônico da molécula, e a diminuição da solubilidade para

abaixo do valor limite de ativação dos receptores de sabor.

A)M odificação da Form a e do Potencial Eletrônico da M olécula

A liberação local de opióides analgésicos e de antagonista na boca é uma

maneira útil de melhorar sua biodisponibilidade relativa pela via oral. No entanto,

estes compostos são amargos. Hussain e colaboradores (1988) desenvolveram

vários pró-fármacos de nalbufina, naloxona, naltrexona, oximorfona, butorfanol e

levalorfano através da esterificação de suas hidroxilas fenólicas, gerando

compostos não mais amargos e preservando a hidrossolubilidade dos compostos

matrizes, sugerindo uma importante interação entre o grupamento fenólico e os

receptores de sabor na boca (figura 2.3).


48R.F.Menegon

Figura 2.3: Pró-fármacos de opióides (HUSSAIN; AUNGST; KOVAL; et al, 1988).

O

N

O H

OOH R

nalbufina

O

N

O H

O

CH2

O R

naloxone

O

N

O H

O O

H

R

naltrexona

O

N

OH

O O

CH3

R

oxim orfona

N

O H

O R

butorfanol

N

CH2

O R

levalorfano

R= (CH3)3CCO-

(CH3CH 2)3CCO-

CH 3(CH 2)10CO -

C 6H 5CO -

2-CH3C 6H 4CO -

2-NH3C 6H 4CO -

2-O HC6H4CO-

2-CH3CO O C6H 4CO -

CH 3SO 2-

CH 3O CO-

4-CH3O CO C6H 4NHCO -


49R.F.Menegon

Outro exemplo de esterificação da hidroxila fenólica é a formação de um

pró-fármaco do paracetamol. Caira e colaboradores (1999) sintetizaram o

composto N-[4-(acetiloxi)-fenil]acetamida (figura 2.4), que apresentou melhora no

sabor, mantendo biodisponibilidade similar à do paracetamol, apesar da diminuição

em sua solubilidade.

FIGURA 2.4: Estrutura química do paracetamol e seu pró-fármaco N-[(acetiloxi)-fenil]acetamida

(CAIRA; WET; GERBER, 1999).

Algumas modificações, porém, podem levar à diminuição da solubilidade e

também da biodisponibilidade do fármaco matriz. Pró-fármacos da norfloxacina,

antibiótico quinolônico de segunda geração, foram sintetizados para mascarar seu

sabor desagradável (ALEXANDER; FROMTLING; BLAND; et al, 1991), realizando

para isto uma acilação no nitrogênio secundário piperazínico, o que eliminou seu

sabor amargo, porém reduziu sua solubilidade e biodisponibilidade (figura 2.5).

NH

OOH

CH3NH

OO

CH3

CH3

O

paracetamol N-[4-(acetiloxi)-fenil]acetamida


50R.F.Menegon

Figura 2.5: Estrutura química da norfloxacina e seus pró-fármacos (ALEXANDER; FROMTLING;

BLAND; et al, 1991).

B) Dim inuição da Solubilidade em Água

Como exemplo da diminuição da hidrossolubilidade para a melhora do sabor

temos o palmitato de cloranfenicol. Pesquisadores da Parke-Davis (PARKE, DAVIS

& COMPANY, 1953), descobriram que este éster tornava o fármaco matriz insípido,

e ainda que esterases intestinais eram responsáveis pela liberação da porção ativa

no organismo, permitindo sua absorção (figura 2.6). De maneira semelhante, foi

sintetizado o éster palmitato de clindamicina (KOROLKOVAS, 1988).

NN

O

NH

OF

O H

CH3

NN

O

N

OF

O H

CH3

O

O

RCl

NN

O

N

OF

O H

CH3

O

O

RO

OCH3

R= H ou M e


51R.F.Menegon

Figura 2.6: Estrutura química do cloranfenicol e do palmitato de cloranfenicol (PARKE, DAVIS &

COMPANY, 1953).

Outros exemplos são citados por Gowthamarajan e colaboradores (2004),

que incluem o maleato de D-clorfeniramina, um sal insípido da clorfeniramina e o

sal magnésico do ácido acetilsalicílico (figura 2.7). A formação de sal também foi

utilizada para o mascaramento do sabor do dextropropoxifeno, através de seu sal

napsilato (GRUBER; STEPHENS; TERRILL, 1971).

N+

NH

O-

O

O Cl

Cl

OH

O H

N+

NH

O-

O

O

O

O

Cl

Cl

OH

CH3

cloranfenicol palmitato de cloranfenicol


52R.F.Menegon

Figura 2.7: Exemplos de formação de sais para correção de sabor (GRUBER; STEPHENS; TERRILL,

1971; GOWTHAMARAJAN; KULKARNI; KUMAR, 2004).

2.3.2.2. Correção de solubilidade

Uma inadequada solubilidade em água de alguns fármacos é um importante

fator limitante ao uso das vias parenteral, percutânia e oral por exemplo. Em

alguns casos, a estratégia de pró-fármaco pode trazer grandes benefícios

farmacotécnicos e farmacocinéticos.

Paclitaxel é um quimioterápico muito utilizado para vários tipos de tumores

assim como para malária e esclerose múltipla. No entanto, apresenta baixa

margem de segurança, que possivelmente é reflexo tanto da sua alta

O

O

N

CH3

CH 3 CH3

CH3

S

O

OO

OH

OH 2. .

napsilato de dextropropoxifeno

Cl

N

N+

CH 3

CH 3 H

O

O O-

O-

HH

O

O

O

O-

CH3

2

Mg2+

sal magnésico do ácido acetil salicílico

maleato de D-clorfeniramina

2


53R.F.Menegon

hidrofobicidade e toxicidade quanto do uso de Cremophor EL ®, um óleo de

considerável toxicidade, necessário para a solubilização desta substância. Seligson

e colaboradores (2001), sintetizaram o protaxel, um carbonato derivado do

paclitaxel passível de ser formulado em meio aquoso, diminuindo

consideravelmente sua toxicidade (figura 2.8).

FIGURA 2.8: Estrutura química do paclitaxel e seu pró-fármaco solúvel protaxel (SELIGSON;

TERRY; BRESSI; et al, 2001).

Buparvaquona, assim como outras hidroxinaftoquinonas, apresenta alta

atividade in vitro contra leishmaniose (MÄNTYLÄ; RUTIO; NEVALAINEN; et al,

2004). A baixa atividade in vivo destes compostos é conseqüência de sua baixa

hidrossolubilidade, o que compromete a biodisponibilidade pelas vias oral,

subcutânea e tópica. A síntese do derivado fosfonooximetil-buparvaquona-oxima

levou a um composto com alta solubilidade em água e boa estabilidade química


54R.F.Menegon

para formulação, sendo rapidamente hidrolisado enzimaticamente in vivo,

tornando este pró-fármaco promissor para uso oral (figura 2.9).

Figura 2.9: Estrutura da buparvaquona e seu pró-fármaco fosfonoximetil-buparvaquona-oxima

(MÄNTYLÄ; RUTIO; NEVALAINEN; et al, 2004).

O grupamento fosfato é muito utilizado para a melhoria da

hidrossolubilidade de muitos compostos, tendo sido utilizado também para

melhorar a solubilidade da fenitoína, através da formação da fosfenitoína (figura

2.10), a qual melhorou consideravelmente problemas com a utilização da via

parenteral (GERBER; MAYS; DONN; et al, 1988).

O

O

OH

CH3

CH3CH3

O

N

O H

CH3

CH3CH3

O

O

P

O

OHOH

buparvaquonafosfonooximetil-buparvaquona-oxima


55R.F.Menegon

Figura 2.10: Estrutura química da fenitoína e da fosfenitoína (GERBER; MAYS; DONN; et al,

1988).

NHNH

O

O

NNH

O

O

P

O

O

O-

O-

fenitoína fosfenitoína

3– M aterial e M étodos

Material e Métodos

56R.F.Menegon

3. M ATERIAL E M ÉTODOS

3.1. M ATERIAL

Clorexidina base (Aldrich), cloreto de palmitoíla (Aldrich), ácido palmítico

(Sigma), piridina (Merck), 4-dimetilaminopiridina (Fluka), trietilamina (Merck),

metanol (Synth), etanol absoluto (Merck), clorofórmio (Synth), éter etílico (Synth),

dimetilformamida (Mallinckodt), tetrahidrofurano (Synth), n-octanol (Merck),

metanol grau HPLC (J. T. Baker) e ácido p-tolueno sulfônico (Merck)

3.2. M ÉTODOS DE SÍNTESE

Os métodos gerais para a obtenção do pró-fármaco proposto dividem-se em

duas preparações principais: Preparação A, reagindo-se a clorexidina com o cloreto

de palmitoíla (esquema 3.1), e Preparação B, reagindo-se a clorexidina com o

ácido palmítico (esquema 3.2).

Material e Métodos

57R.F.Menegon

Esquema 3.1: Obtenção do pró-fárm aco a partir do cloreto de palm itoíla.

NH

NHNHN H

NH

N H

NH

N H

NHN H

Cl

Cl

O

Cl

CH 3

Procedim entoA1

Procedim entoA2

Procedim entoA3

Procedim entoA4

Solvente

Prótico

Solvente

Éter/Metanol

(2/1)

Solvente

Aprótico Polar

Solvente

Aprótico Apolar

Com

Piridina

CHCl3

Piridina

THF

Refluxo

DMAP

THF

Refluxo

DMAP

pH=10

THF

Refluxo

THF

Refluxo

pH=10

Sem

Piridina

A2.1 A2.2 A4.1 A4.2 A4.3 A4.4 A4.5

clorexidina base

cloreto de palmitoíla

Material e Métodos

58R.F.Menegon

Esquem a 3.2: Obtenção do pró-fármaco a partir do ácido palmítico.

Estas preparações foram realizadas sob refluxo e sem a utilização de

catalisadores.

O

OH

CH3

NH

NHN H

N H

NH

NH

NH

NH

NH

NH

Cl

Cl

Procedim ento B1 Procedim ento B2

Meio THF Meiotrietilamina

clorexidina base

ácido palmítico

Material e Métodos

59R.F.Menegon

3.3. M ÉTODOS DE ANÁLISE

3.3.1. Crom atografia em Cam ada Delgada (CCD)

Foram utilizadas placas de sílica gel G-60, com 0,25 mm de espessura (para

cromatografia preparativa), e placas Alugram Nano-Sil G/UV 254 (Merck) para o

acompanhamento das reações. Os sistemas eluentes empregados foram

butanol/ácido acético/água (4:1:5); diclorometano/acetato de etila (8:2), e

metanol/ácido acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81).

3.3.2. Espectrom etria de Ressonância M agnética Nuclear

(RM N)

Os espectros de RMN 1H foram realizados no Departamento de Química,

Laboratório de RMN da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), utilizando

espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Brucker 9.4 T, modelo DRX-400

a 400 MHz. Os solventes utilizados foram clorofórmio (CDCl3) e DMSO-d6.

Material e Métodos

60R.F.Menegon

3.3.3. Espectrom etria no Infraverm elho (IV)

Os espectros de infravermelho foram realizados em Espectrofotômetro de

Infravermelho Schimadzu, modelo FTIR-8300.

3.3.4. Faixa de Fusão

As faixas de fusão aparente foram obtidas em aparelhos para determinação

de ponto de fusão Electrothermal 9200.

3.4. M ÉTODOS FÍSICO-QUÍM ICO E FARM ACOCINÉTICO

3.4.1. Coeficiente de partição (P) e Log P

Para a determinação do coeficiente de partição e do Log P, foi utilizado o

método shake-flask, o qual baseia-se na partição da substância analisada entre

duas fases imiscíveis, n-octanol e água (OJEC, 1992).

Volumes diferentes de uma solução estoque da amostra em n-octanol foram

misturados em volumes pré determinados de água, e então agitados. As

concentrações da amostra nas duas fases foram quantificadas por método

espectrofotométrico no ultravioleta.

Material e Métodos

61R.F.Menegon

3.4.2. Determ inação do tem po de retenção do pró-fárm aco

na cavidade bucal

O estudo farmacocinético preliminar foi realizado em um voluntário do sexo

masculino.

Amostras de salivas (200 ?L) foram coletadas e extraídas em acetonitrila em

meio básico. A quantidade do pró-fármaco recuperado foi medida por CLAE

(cromatografia líquida de alta eficiência) após 1, 15, 60, 120, 240, 480, 720 e 1440

minutos ao enxágüe bucal com 30 mL de suspensão aquosa a 0,35% do pró-

fármaco de clorexidina.

Método analítico adaptado do desenvolvido por Pesonen, Holmalahti e

Pohjola (1995).

4– Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

62R.F.Menegon

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A clorexidina é o mais eficaz agente anti-placa usado em odontologia, e sua

eficácia está baseada em seus potentes efeitos bactericida e também

bacteriostático, quando lentamente liberada na cavidade bucal.

Com o emprego da modificação molecular, a obtenção de formas latentes

ou de sais pode possibilitar aumento no tempo de permanência da clorexidina nas

cavidades bucais e ainda minimizar a percepção de sabor desagradável.

A molécula da clorexidina é simétrica, com uma porção hexametilênica

unindo dois grupos biguanidas, nos quais está ligado um radical p-clorofenil (figura

4.1).

Figura 4.1: Fórmula estrutural da clorexidina base. Desenho mostrando a densidade eletrônica da

molécula (regiões em vermelho = alta densidade, regiões em azul = baixa densidade; cálculo da

geometria no equilíbrio com método semi-empírico AM-1, utilizando software PC Spartan Pro 1,0,5).

NHNH NH

NH

NH

NH

NH

NH

NHNH

Cl

Cl


63R.F.Menegon

Esta molécula contém quatro grupos iminos (=NH), que apresentam

propriedades fortemente básicas, estando carregada com 4 cargas positivas

deslocalisadas sobre seus 10 átomos de nitrogênio, em presença de ácidos fortes

(CHRISTENSEN; JENSEN, 1982). No entanto, apenas dois valores de pKa tem sido

relatados em 2,2 e 10,3 (HUGO; LONGWORTH, 1964). A figura 4.2 apresenta o

espectro de infravermelho da clorexidina base; o espectro de um de seus sais, o

diacetato, é demonstrado na figura 4.3.

A clorexidina e seus sais apresentam grandes diferenças em seus pontos de

fusão e solubilidade; a clorexidina base apresenta faixa de fusão entre 134 e 136

ºC e solubilidade em água a 20 ºC de 0,08%, seu sal diacetato apresenta faixa de

fusão entre 154 e 155 ºC e solubilidade em água de 1,9% e o sal dicloridrato

apresenta faixa de fusão entre 260 e 262 ºC e solubilidade em água de 0,06%, por

fim o digluconato de clorexidina, disponível comercialmente, apresenta solubilidade

em água maior que 50% (THE MERCK INDEX, 1996).


64R.F.Menegon

Grupo de átomos ? (cm-1)

A N-H 3475,5 – 3382,9

B C-H alifático 2933,5 – 2860,2

C C=N imina 1662,5

D =N-H 1606,6

E -N-H 1544,9

F C-N 1373,2 – 1406,0

Figura 4.2: Espectro de infravermelho da clorexidina base. Realizado em pastilha de KBr.

NH

NHNHNH

NH

NH

NH

NH

NHNH

Cl

Cl

clorexidina base


65R.F.Menegon

Grupo de átom os ?? (cm -1)

A N-H 3390,6 – 3178,5

B C-H alifático 2933,5 – 2862,2

C C=N imina 1645,2

D N-H (sal) 1554,1

E C=C aromático 1487,0

F C-N 1415,7

Figura 4.3: Espectro de infravermelho do diacetato de clorexidina. Realizado em pastilha de KBr.

NH

N HNH

N H

NH

NH

N+

N+

N H

NH

C l

Cl

H H

H H

O

O-

C H3

O

O-

CH3

diacetato de clorexidina


66R.F.Menegon

Dada a basicidade destes grupamentos guanidinas, o mecanismo pelo qual

espera-se obter o pró-fármaco envolve um ataque nucleofílico sobre a carbonila do

ácido palmítico, ou de seu cloreto ácido derivado (figura 4.4).

Figura 4.4: Mecanismo de reação para a obtenção do pró-fármaco palmitoil clorexidina.

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

Cl

O

R CH3..

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N+

NH

Cl

H

O-

R

CH3

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N

NH

Cl

O

CH 3

pró-fárm aco m onossubistituído

clorexidina

R = -OH ácido palmítico

R = -Cl cloreto de palmitoíla


67R.F.Menegon

A velocidade desta reação pode ser aumentada com a adição de

catalisadores, como a piridina e seu derivado 4-dimetilaminopiridina, os quais são

capazes de reagirem com ácidos e cloretos ácidos gerando um forte agente

acilante, e ainda neutralizando o ácido clorídrico liberado durante a reação com

cloretos de acila. Seu mecanismo está demonstrado na figura 4.5.

Figura 4.5: Mecanismo da ação catalítica da piridina e da 4-DMAP.

Dada a presença de quatro grupos guanidinas em sua molécula, é possível

prever a formação de isômeros estruturais entre os possíveis produtos desta

reação, em sua totalidade, são 9 as possibilidades de produtos esperados nesta

reação (figura 4.6), sendo dois isômeros monossubstituídos, quatro formas

dissubstituídas, duas trissubstituídas, e mais uma forma tetrassubstituída.

O

RCH3

N

R'

R = -OH ácido palmítico

R = -Cl cloreto de palmitoíla

..

R' = -H piridina

R' = -N(CH3)2 4-DMAP

N+

R'

CH3

O -

RN+

R'

CH3

O

R-

agente acilante


68R.F.Menegon

Figura 4.6: Possíveis produtos formados na reação.

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N

Cl

R

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N

NH

Cl

R

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N

N

Cl

R

R

C l NH

NH

NH

N

N H

NH

NH

NH

NH

N

Cl

R

R

Cl NH

NH

N

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N

Cl

R

R

Cl NH

NH

NH

N

NH

NH

NH

NH

N

NH

Cl

R

R

Cl NH

NH

N

NH

NH

NH

NH

NH

N

N

Cl

R

R

R

Cl NH

NH

NH

N

NH

NH

NH

NH

N

N

Cl

R

R

R

Cl NH

NH

N

N

NH

NH

N H

NH

N

N

Cl

R

R

R

R

Produtos monossubstituídos

Produtos dissubstituídos

Produtos trissubstituídos

Produto tetrassubstituído

R =

O

CH3


69R.F.Menegon

No entanto, dependendo das condições reacionais, é possível ocorrer a

formação de sais, como a do sal palmítico da clorexidina, representado na figura

4.7.

Figura 4.7: Formação de sal com o ácido palmítico (palmitato de clorexidina).

Assim como nos derivados amídicos, estes sais também podem existir em

várias formas, podendo ser mono, di, tri ou tetravalente.

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

Cl

O

O CH3H

clorexidina

..

Cl NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

N+

NH

Cl

H

H

O

O

CH3-

sal palmítico de clorexidina


70R.F.Menegon

Desta forma, visando a solubilização da clorexidina no meio reacional,

evitando o emprego de calor, para minimizar a degradação da clorexidina, que

pode ser favorecida pelo aumento da temperatura (HOANG; MOELLMER; KHAN,

1990), a primeira reação realizada foi em meio alcoólico (metanol), como descrito

no Procedim ento A1. A adição do ácido nítrico tem como objetivo promover a

total solubilização dos materiais de partida e ainda servir como catalisador. Com o

pH da solução em torno de 4,0, a molécula de clorexidina está preferencialmente

em sua forma dicátion, restando, portanto mais dois grupamentos guanidínicos

não protonados e nucleófilos, capazes de atacar nucleofilicamente a carbonila do

cloreto de palmitoíla, a qual está ainda mais ativada dada a protonação de seu

átomo de oxigênio. Ao se adicionar água no final da reação, ocorre a separação de

uma fase não miscível com água, de coloração amarela, a qual é constituída em

parte por produtos de degradação da clorexidina e também por alguma matéria

graxa, como será comprovado mais adiante (procedimento B1). Apesar de não se

ter utilizado aquecimento, o meio ácido e altamente polar pode também promover

sua degradação (GOODALL; GOLDMAN; WOODS, 1968). Ao neutralizar a solução,

promoveu a precipitação de um pó branco, identificado como uma mistura

contendo principalmente cloridrato de clorexidina, apresentando faixa de fusão em

212 ºC, e absorção no infravermelho em 3452,3 a 3222,8 cm-1 (relativo aos

grupamentos guanidínidos protonados) e pequena absorção entre 2927,7 e

2856,4cm-1, sugerindo a ausência da longa cadeia alifática do ácido palmítico

(figura4.8).


71R.F.Menegon


A N-H 3452,3 – 3222,8

B C-H alifático 2927,7 – 2856,4

C C=N imina 1635,5

D N-H (sal) 1531,4

E C-N 1413,7 – 1340,4

Figura 4.8: Espectro de infravermelho do produto obtido a partir do procedimento A1, realizado

em pastilha de KBr.

NHNHNH

NH

NH

NH

N+

N+

NHNH

Cl

Cl

H H

H H

Cl-

Cl-

dicloridrato de clorexidina


72R.F.Menegon

A formação deste sal é resultado da liberação de HCl como resultado da

metanólise do cloreto de palmitoíla (figura 4.9) ou após sua hidrólise pela presença

de água no solvente ou da umidade do ar.

Figura 4.9: Metanólise do cloreto de palmitoíla, com liberação de ácido clorídrico.

O

Cl CH3CH3 O

H

CH3O+

H

O-

Cl CH3

CH3 O+

H

O

CH3

Cl-

O

CH3OCH3

+ ClH


73R.F.Menegon

Com base nestas informações, tentou-se realizar a reação em meio

totalmente aprótico, no entanto, dada a total insolubilidade da clorexidina, foi

necessário adicionar um pouco de metanol ao éter para melhorar sua solubilidade,

como descrito no Procedim ento A2. Nestas reações, pelas mesmas razões

explicadas no procedimento A1, não se observou a formação do produto proposto,

apenas a formação majoritária de cloridrato de clorexidina.

Os resultados mostrados a seguir são relativos ao Procedim ento A2.1,

pois os obtidos através do Procedim ento A2.2, utilizando piridina como

catalisador, foram essencialmente os mesmos. A faixa de fusão encontrado para o

precipitado branco obtido durante a reação foi de 268 a 270 ºC, e o espectro de

infravermelho (figura 4.10) confirma a formação cloridrato, dada a presença de

intensa absorção entre 3390,6 e 3122,5 cm–1, indicando a protonação de grupos

guanidínicos. O produto branco obtido após neutralização do líquido filtrado foi

identificado como clorexidina base, apresentando faixa de fusão em 132 ºC e

espectro de infravermelho característico da clorexidina base (figura 4.11).


74R.F.Menegon


A N-H 3390,6 – 3122,5

B C-H alifático 2937,4 – 2856,4

C C=N imina 1635,5

D N-H (sal) 1533,3

E C-N 1413,7 – 1353,9

Figura 4.10: Espectro de infravermelho do precipitado obtido durante a reação do procedimento

A2, realizado em pastilha de KBr.

NHNHNH

NH

NH

NH

N+

N+

NHNH

Cl

Cl

H H

H H

Cl-

Cl-



75R.F.Menegon


A N-H 3475,5 e 3408,0

B C-H alifático 2933,5 e 2860,2

C C=N imina 1670,2

D N-H imina 1606,6

E N-H amina 1544,9

F C-N 1406,0 e 1377,1

Figura 4.11: Espectro de infravermelho do precipitado obtido pela neutralização do filtrado da

reação do procedimento A2. Realizado em pastilha de KBr.

NHNHNH

NH

NH

NH

NH

NH

NHNH

Cl

C l

clorexidina base


76R.F.Menegon

O próximo passo foi realizar a reação em meio polar e aprótico, utilizando

dimetilformamida como solvente e piridina como catalisador, o procedimento está

descrito no Procedim ento A3. Nesta reação ocorre rapidamente a formação de

um precipitado, com faixa de fusão ampla, cerca de 40 a 60 ºC. O espectro de

infravermelho ( figura 4.12) revela a presença do reagente cloreto de palmitoíla no

precipitado formado através da absorção em 1803,3 cm-1, relativo à carbonila de

um cloreto de acila e da intensa absorção em 2918,1 e 2850,6 cm–1, relativo a

uma longa cadeia alifática; é possível perceber absorções características da

formação de sais de clorexidina em 1539,1 cm–1, absorções muito próximas às

encontradas no cloridrato de clorexidina (1531,4 cm–1) o que pode indicar a

formação de um sal de palmitato, dada a baixa faixa de fusão da mistura. A

análise por cromatografia em camada delgada da DMF restante não indica a

presença de nenhuma outra substancia a não ser clorexidina, desta forma, não se

tentou realizar uma extração deste solvente. Esta reação foi repetida várias vezes

obtendo-se sempre aos mesmos resultados negativos. Este fato deveu-se,

provavelmente, à formação de subprodutos de clorexidina, indisponibilizando-a

para a reação propriamente dita.


77R.F.Menegon


A N-H 3438,8

B C-H alifático 2918,1 – 2850,6

C C=O cloreto de acila 1803,3

D C=N imina 1645,2

E N-H (sal) 1539,1

Figura 4.12: Espectro de infravermelho do precipitado obtido no procedimento A3, realizado em

pastilha de KBr.

NH

NHNHNH

NH

NH

N+

N+

NHNH

Cl

Cl

H H

H H

Cl-

Cl-


O

Cl CH3

cloreto de palm itoíla


78R.F.Menegon

As próximas tentativas formam realizadas em meios totalmente apróticos e

de baixa polaridade, a primeira tentativa, Procedim ento A4.1, foi utilizando

clorofórmio como solvente. Mesmo sem a solubilização da clorexidina foi

adicionado o catalisador e o cloreto de palmitoíla, no entanto, neste momento

forma-se um gel espesso, que impede a agitação da reação. Ao se lavar este gel

com água, rapidamente se converte em um pó branco, que após secagem

apresentou faixa de fusão em 260 ºC e espectro de infravermelho com absorção

entre 3390,6 e 3122,5 cm-1 (relativo aos grupamentos guanidínidos protonados) e

pequena absorção entre 2925,8 – 2854,4 cm-1 , sugerindo a ausência de longa

cadeia alifática proveniente do ácido palmítico (figura 4.13), sugerindo a formação

de cloridrato de clorexidina.


79R.F.Menegon


A N-H 3390,6 – 3122,5

B C-H alifático 2925,8 – 2854,4

C C=N imina 1635,5

D N-H (sal) 1533,3

E C-N 1411,8 – 1348,2

Figura 4.13: Espectro de infravermelho do produto obtido através do procedimento A4.1,

realizado em KBr.

NHNHNH

NH

NH

NH

N+

N+

NHNH

Cl

Cl

H H

H H

Cl-

Cl-



80R.F.Menegon

Assim sendo, foram realizadas novas reações, agora com o emprego de

temperatura para promover uma solubilização dos reagentes, mesmo correndo-se

o risco de degradar a clorexidina. No Procedim ento A4.2, foi utilizado o

tetrahidrofurano como solvente e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalisador.

Mais uma vez, o precipitado branco formado durante a reação foi identificado

como sendo cloridrato de clorexidina, porém misturado a um derivado do ácido

palmítico, possivelmente o pró fármaco desejado, visto o espectro de

infravermelho não acusar a presença de ácido palmítico livre ou na forma de

carboxilato formando um sal com a clorexidina (figura 4.14).

É possível observar, ainda, absorção entre 1693,4 e 16981,8 cm–1, que pode

ser atribuído à carbonila relativa a uma amida, intensa absorção em 2931,6 cm–1,

própria de cadeia alifática e outras absorções relativas à clorexidina.

A análise de RMN 1H (figura 4.15) realizada neste composto, contudo, não é

conclusiva com relação à obtenção do produto desejado, no entanto, comprova a

presença da molécula de clorexidina e a presença de uma longa cadeia alifática.

A proporção molecular destas substâncias é de 6 moléculas de clorexidina

para uma de palmitato, esta proporção pode ser calculada com base nos valores

das integrais destes dois grupos, a porção relativa aos hidrogênios metílicos da

cadeia palmítica (? 0,84 ppm) apresenta valor igual a 3,00 enquanto que para

quatro dos hidrogênios aromáticos da molécula da clorexidina (? 7,40 ppm) o valor

de integral é igual a 23,91, ao invés de 4,00, como seria o esperado para uma

proporção molecular de 1:1 (palmitato/clorexidina). Esta observação está em


81R.F.Menegon

acordo com a medida da faixa de fusão, que variou de 180 a 250 ºC

aproximadamente, evidenciando uma mistura de produtos.


A N-H 3234,4

B C-H alifático 2931,6

C C=O amida 1693,4 – 1681,8

D N-H imina 1614,3

Figura 4.14: Espectro de infravermelho do precipitado da reação do procedimento A4.2. Realizado

em pastilha de KBr.

NHNHNH

NH

NH

NH

N

NH

NHNH

Cl

Cl

O

CH3 NHNHNH

N H

NH

NH

NH

NH

NHNH

Cl

Cl

pró-fárm aco de clorexidna clorexidina


82R.F.Menegon

Próton Deslocam entoquím ico (ppm )

Integral

A CH3 0,84 3,00

B (CH ar)4 7,40 23,91

Figura 4.15: Espectro de RMN 1H do precipitado da reação pelo procedimento A4.2.

DMSO-d6, 400 MHz.

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

DMSO-d6

7.40

7.31

3.56

3.33

3.08

2.49

2.26

2.07

1.45 1.27

1.22

0.84

7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7

23.91

7.40

7.31

1.5 1.0

3.00

1.45 1.27

1.22

0.84

NH

NHNHNH

NH

NH

N

NH

NHNH

Cl

Cl

OCH3NH

NHNHNH

NH

NH

NH

N H

NHNH

Cl

Cl

H

H

H

H

pró-fárm aco de clorexidnaclorexidina

A

B

B

B

B


83R.F.Menegon

Ainda na reação do procedimento A4.2, a evaporação do solvente levou à

obtenção de um produto amarelado, de aparência pastosa. O espectro de

infravermelho (figura 4.16), realizado em clorofórmio, demonstra a presença de

ácido palmítico, com absorção em 1706,9 cm-1, relativo à carbonila, além de outras

absorções em 1647,1 e 1620,1 cm-1, sugerindo a presença de clorexidina ou de

seus produtos de degradação. A análise por CCD, utilizando como fase móvel

metanol/ácido acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81) revelou a presença de

cerca de 10 substâncias, no entanto, dada a quantidade muito reduzida de cada

uma delas isoladamente, e o fato de se utilizar uma fase móvel quaternária e com

grande diferença de polaridade entre seus constituintes, uma separação por coluna

de sílica gel seria muito difícil.


84R.F.Menegon


A C-H alifático 2927,7 – 2860,2

B C=O ácido 1706,9

C C=N imina 1647,1 - 1620,1

D N-H 1550,3

Figura 4.16: Espectro de infravermelho do produto amarelado do procedimento A4.2. Realizado

em clorofórmio.

NH NH

NH

R R

O

OHCH3

ácido palm ítico derivados de clorexidina


85R.F.Menegon

Como uma tentativa de purificação do precipitado branco anterior, tentou-se

remover a clorexidina através de sua conversão em um sal mais hidrossolúvel,

como o diacetato de clorexidina, cuja solubilidade em água é de 1,9%, contra

0,06% do dicloridrato e 0,08% da clorexidina base. Para isto, misturou-se o

produto com grande volume de ácido acético diluído em pH 4,0, com aquecimento

durante uma hora, o produto insolúvel foi novamente analisado por infravermelho

(figura 4.17) e RMN 1H (figura 4.18).


86R.F.Menegon


A N-H 3390,6 – 3120,6

B C-H alifático 2939,3 – 2854,4

C C=N imina 1635,5

D N-H (sal) 1533,3

E C-N 1415,7

Figura 4.17: Espectro de infravermelho do precipitado do procedimento A4.2, após lavagem com

ácido acético a quente. Realizado em pastilha de KBr.

NH

NHNH

NH

NH

NH

N+

N+

NH

NH

Cl

Cl

H H

H H

Cl-

Cl-



87R.F.Menegon


A CH2 1,26

B (CH ar)4 7,32

C (CH ar)4 7,38

Figura 4.18: Espectro de RMN 1H do precipitado do procedimento A4.2, após lavagem com ácido

acético a quente. DMSO-d6, 400 MHz.

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

DMSO-d6

8.04

7.70

7.38

7.32

7.10

6.77

3.42

3.06

2.53

2.49

2.07

1.44 1.26

NHNHNH

NH

N H

N H

NH

N H

N HNH

Cl

C l

H

H

H

H

H

H

H

Hclorexidina base

AC

C

C

C

B

B

B

B


88R.F.Menegon

Com base neste espectro de RMN, é possível perceber o desaparecimento

da metila em 0,84 ppm, o que indica uma possível hidrólise do pró fármaco devido

ao meio ácido. O espectro refere-se ao cloridrato de clorexidina, que se manteve

insolúvel durante a lavagem.

Tentou-se então, a realização de uma nova reação, Procedim ento A4.3,

agora com o pH ajustado em torno de 10 com trietilamina. Esta reação levou à

formação de resultados semelhantes à anterior, no entanto, decidiu-se prosseguir

com uma purificação por cromatografia em camada delgada preparativa do

produto amarelado, utilizando como fase móvel metanol/ácido

acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81). Ao final desta separação, somente a

fração superior pode ser isolada e então analisada por RMN 1H (figura 4.19),

revelando ser, ainda, uma mistura de substâncias, porém com aparente presença

de um material graxo e com fracos sinais relativos à clorexidina.


89R.F.Menegon


A CH3 0,87

B CH2 1,25

Figura 4.19: RMN 1H do produto purificado por CCD no procedimento A4.3. CDCl3, 400 MHz.

Como não foi possível a identificação das últimas dez substâncias, realizou-

se duas novas reações, sem a utilização de DMAP, visto a possibilidade destas

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

Chloroform-d

0.87

1.25

7.25

C H 3

H HA

B


90R.F.Menegon

substâncias serem resultado, pelo menos em parte, de múltiplas acilações na

molécula de clorexidina. Desta forma, a remoção do catalisador poderia diminuir o

número de subprodutos, aumentando a concentração relativa dos produtos

formados possibilitando um isolamento dessas substâncias.

Na primeira delas, de acordo com o Procedim ento A4.4, os resultados

foram semelhantes aos anteriores, a análise por CCD revela ainda a presença de

inúmeros subprodutos; já na segunda, de acordo com o Procedim ento A4.5,

houve o desenvolvimento de uma coloração amarela mais intensa durante a

reação, e uma maior quantidade do produto amarelado.

Decidiu-se, então, prosseguir com uma purificação por filtração em gel,

utilizando coluna de 40cm de comprimento empacotada com Sephadex LH-20®,

no entanto, não houve separação das substâncias, indicando uma semelhança nos

pesos moleculares delas, o que pode ser indicativo da existência de isômeros

estruturais entre os derivados acilados da clorexidina, visto sua molécula

apresentar quatro grupos passíveis de sofrerem substituições.

Desta forma, as frações foram reagrupadas e eluídas coluna de sílica gel,

usando como fase móvel apenas o diclorometano. Nesta condição, somente uma

mancha é observada ao eluir da coluna, porém, é importante salientar que o ácido

palmítico não é visualizado pela luz u.v e muito fracamente revelado com iodo

ressublimado. Mas, através do espectro de infravermelho, sua presença é

facilmente constatada na amostra através da absorção em 1701,1 cm-1, relativo à

carbonila de ácido carboxílico (figura 4.20). A faixa de fusão observado foi de 53 a


91R.F.Menegon

55 ºC próximo ao do ácido palmítico (63 a 64 ºC), que certamente está em

excesso.


A N-H 3477,4 – 3406,1

B C-H alifático 2918,1 – 2848,7

C C=O ácido 1701,1

D C=O amida 1685,7

Figura 4.20: Espectro de infravermelho do produto obtido ao final da purificação do procedimento

A4.5. Realizado em pastilha de KBr.

N H

N HNH

NH

N H

N H

N

NH

NH

NH

Cl

Cl

O

C H3

pró-fárm aco de clorexidna ácido palm ítico

O

O H CH 3


92R.F.Menegon

Como tentativa de se reduzir a formação de inúmeros produtos, realizou-se

a reação a partir do ácido palmítico, e ainda sem a utilização de catalisadores.

Através do Procedim ento B1, a precipitação proporcionada pela adição de

isopropanol levou à formação de um sal com o ácido palmítico, o qual é

evidenciado pelo espectro de infravermelho (figura 4.21), onde pode ser

visualizado forte absorção entre 3398,8 a 3193,9 cm–1, relativos à protonação dos

grupos guanidina, e em 2916,2 e 2848,7 cm–1, relativos à cadeia palmítica alifática,

a qual não se deve à presença de ácido livre, pois não há absorção na região de

1700 cm–1, relativa à carbonila de ácido carboxílico, e sim em 1577,7 cm–1,

proveniente da formação do ânion carboxilato. A análise por CCD, utilizando como

fase móvel butanol/água/ácido acético (5:4:1) revela a presença de uma única

mancha, de Rf=0,44, enquanto que o Rf do padrão clorexidina é de 0,53. O

rendimento deste produto foi de 63%.

O produto oleoso, de coloração amarela foi analisado por RMN 1H, porém

trata-se de mistura com grande quantidade de grupos metilas e metilenos,

evidenciado pelas absorções em 0,81 e 1,18 ppm (figura 4.22).


93R.F.Menegon


A N-H 3398,8 – 3193,9

B C-H alifático 2918,2 – 2848,7

C C=N imina 1629,7

D C=O carboxilato 1577,7

E N-H (sal) 1541,0

F C-N 1419,5

Figura 4.21: Espectro de infravermelho do produto precipitado em isopropanol do procedimento

B1. Realizado em pastilha de KBr.

HH

NH

NHNH

NH

N+

N+

N+

N+

NH

NH

Cl

Cl

H H H H

H H

O

O-

CH3

4salpalm itato de clorexidina


94R.F.Menegon


CH3 0,81

CH2 1,18

Figura 4.22: Espectro de RMN 1H do produto oleoso amarelo obtido no procedimento B1. CDCl3,

400MHz.

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Chloroform-d

TM S

2.10

1.36

1.18

0.81

0.78

0.00


95R.F.Menegon

A última tentativa de obtenção do produto foi a realização da reação em

meio trietilamina. Nesta condição, o ácido está totalmente ionizado e um ataque

nucleófilo em sua carbonila é muito dificultado. Assim a reação deverá ocorrer

muito mais lentamente e resultando na formação de um número menor de

produtos. No entanto, após 7 dias de reação, somente uma coloração amarelada

pode ser observada na reação, e o óleo obtido revelou conter uma mistura com

muitos produtos, possivelmente provindos da degradação da clorexidina.

Como pode ser observado, a obtenção do pró-fármaco é possível, porém

com rendimentos muito insatisfatórios, por outro lado, temos que o sal do ácido

palmítico é facilmente formado e com bom rendimento. A tabela 4.1 faz um

resumo das condições reacionais e os principais produtos obtidos.


96R.F.Menegon

Tabela 4.1: Condições reacionais e produtos obtidos

Proced. Condições Reacionais Resultados

A1 Metanol, temperatura ambiente,

catálise ácida, pH = 4

Cloridrato de Clorexidina

A2.1 Éter etílico/metanol (2:1), temperatura

ambiente, sem catalise


A2.2 Éter etílico/metanol (2:1), temperatura

ambiente, com piridina


A3 DMF, temperatura ambiente, com

piridina

Sais da clorexidina

(cloridrato e palmitato)

A4.1 Clorofórmio, temperatura ambiente,

com piridina

Cloridrato de clorexidina

A4.2 THF, refluxo (65 ºC), com DMAP Possível derivado amídico

A4.3 THF, refluxo (65 ºC), com DMAP e

pH=10

Possível derivado amídico

A4.4 THF, refluxo (65 ºC), sem catálise Possível derivado amídico

A4.5 THF, refluxo (65 ºC), com DMAP Possível derivado amídico

B1 THF, refluxo (65 ºC), sem catálise Sal tetrapalmitato de

clorexidina

B2 Trietilamina, 65 ºC, sem catálise Não há reação


97R.F.Menegon

Desta forma, o sal palmitato de clorexidina foi eleito para a continuidade do

estudo. O sal foi ressintetizado e identificado por infravermelho e 1H RMN.

O espectro no infravermelho demonstra mais uma vez a obtenção de um sal

(figura 4.23).


A N-H 3340,5 – 3192,0

B C-H alifático 2918,1 – 2848,7

C C=N imina 1623,9

D C=O carboxilato 1577,7

E N-H (sal) 1533,3

F C-N 1419,5

Figura 4.23: Espectro de infravermelho do sal tetrapalmitato de clorexidina. Realizado em pastilha

de KBr.


98R.F.Menegon

A análise de RMN sugere a formação do tetrapalmitato de clorexidina

(TPCHD) (figura 4.24). Neste espectro os valores das integrais calculados para o

grupo metila da cadeia palmítica e de quatro dos oitos hidrogênios aromáticos da

molécula da clorexidina são respectivamente 3,00 e 0,91, ou seja, existem 3

prótons metílicos para cada próton aromático, logo quatro vezes mais ácido

palmítico que clorexidina. É importante notar que existe duas absorções atribuídas

para este grupo metila (0,78 e 0,85 ppm), o que sugere que estas 4 cadeias não

estão no mesmo ambiente eletrônico, apresentando duas absorções diferenciadas.

Para assegurar a reprodutibilidade da reação, sobretudo com relação ao

número ânions carboxilatos, obteve-se soluções a 0,030 mg/mL (1,96 x 10-5 M) e a

0,004 mg/mL (2,6 x 10-6 M) em etanol, sendo a absorbância foi medida em 258

nm. A absortividade molar calculada foi de 46000, a comparação destes resultados

com os obtidos de reações subseqüentes garante a formação do mesmo sal.


99R.F.Menegon


Integral

A CH3 0,85 3,00

B (CH ar)4 7,28 0,91

Figura 4.24: Espectro de RMN 1H do sal tetrapalmitado de clorexidina. DMSO-d6, 400MHz.

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

3.000.91

TM S

7.43

7.41

7.28

7.26 2.05

1.45

1.23

1.17

0.85

0.78

0.00

HH

NH

NHNHNH

N+

N+

N+

N+

NHNH

Cl

Cl

H H H H

H H

H

H

H

H

O

O-

CH3

4salpalm itato de clorexidina

A

B

B

B

B


100R.F.Menegon

Para analisar sua solubilidade, realizou-se um estudo do coeficiente de

partição n-octanol/água. As medidas foram realizadas com auxílio de

espectrofotômetro no ultravioleta a 258 nm. A curva de calibração e a tabela das

absorções dos padrões são mostradas a seguir (gráfico 4.1).

Gráfico 4.1: Curva de calibração UV (258nm) do tetrapalmitato de clorexidina

y = 30,281x - 0,0035

R2 = 1,0000

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0,000 0,010 0,020 0,030 0,040

m g/m L

Abs 258 nm

m g/m L Abs 2580,030 0,9040,020 0,6050,010 0,2960,004 0,1190,002 0,0570,001 0,027


101R.F.Menegon

O coeficiente de partição estimado encontrado foi de 8500, visto a

solubilidade máxima do TPCHD em n-octanol ser de 85 mg/mL e em água ser de

0,010 mg/mL (Log P estimado = 3,9) (tabela 4.2).

Tabela 4.2: Concentração das soluções saturadas de TPCHD em água e em n-octanol.

Am ostra Abs Diluída (m g/m L) Concent. (m g/m L)

Água 0,017 0,001 0,010

n-octanol 0,503 0,017 85,000

Diluída = concentração na amostra analisada, e Concent. = concentração na solução do ensaio.

Esta estimativa preliminar faz-se necessária para prevermos a partição real

e assim evitar que se obtenha uma solução muito concentrada em algumas das

duas fases (C>0,01M), onde não mais se aplicaria a lei de partição de Nernst,

tornando o ensaio não confiável (OJEC, 1992).

Com base neste resultado, foi obtido solução estoque na concentração de

11mg/mL (0,007M) em n-octanol e calculou-se as proporções entre as duas fases

de maneira a se possibilitar detectar a substância na fase mais diluída, a aquosa.

Os resultados das determinações estão listados na tabela 4.3.


102R.F.Menegon

Tabela 4.3: Concentração de TPCHD nas fases n-octanol e aquosa, e valor do coeficiente de

partição P e Log P.

Concentração (m g/m L)Am ostra Réplica Abs

Diluída concentradaP Log P

Estoque octanol --- 0,335 0,011 11 --- ---

10:05 (O /A)- octanol 0,331 0,011 11

10:05 (O /A) – água1

0,014 0,001 0,00111000 4,0

10:05 (O /A)- octanol 0,326 0,011 11

10:05 (O /A) – água2

0,017 0,001 0,00111000 4,0

05:05 (O /A)- octanol 0,323 0,011 11

05:05 (O /A) – água1

0,017 0,001 0,00111000 4,0

05:05 (O /A)- octanol 0,323 0,011 11

05:05 (O /A) – água2

0,015 0,001 0,00111000 4,0

05:10 (O /A)- octanol 0,328 0,011 11

05:10 (O /A) – água1

0,015 0,001 0,00111000 4,0

05:10 (O /A)- octanol 0,333 0,011 11

05:10 (O /A) – água2

0,015 0,001 0,00111000 4,0

O valor de Log P encontrado (4,0) indica um grande aumento na

lipofilicidade do sal tetrapalmitato da clorexidina com relação aos seus outros sais

(clorexidina base = -0,1, diacetato = -1,3, e digluconato = -1,4) (Farkas, Zelkó,

Török, et al, 2001). Este valor de Log P mais elevado pode resultar em melhora na

atividade biológica deste agente antimicrobiano visto que, segundo Warner e


103R.F.Menegon

Lynch (1979), o caráter hidrofóbico dos compostos guanidínicos parece ser o

parâmetro físico-químico mais intimamente associado à ação antimicrobiana,

sendo que os valores ótimos para Log P estão dentro do limite de 5,6 a 6,6.

De maneira a verificar a velocidade de remoção deste sal da cavidade bucal

pela ação da saliva, realizou-se estudo farmacocinético baseado no trabalho

realizado por Pesonen e colaboradores (1995).

Primeiramente, foi testada a eficiência da extração pela comparação da área

do pico da injeção direta de um padrão com a área da injeção a partir do

procedimento de extração. Neste ensaio duas observações fazem-se necessárias:

1) A acetonitrila, solvente de escolha utilizado no referido trabalho, não se separa

completamente da fase aquosa, ou seja, após a adição de 400?L de acetonitrila

somente 375?L são separados, e 2) Na etapa final do procedimento de extração,

verificou-se que a solubilização do resíduo da evaporação da acetonitrila com um

volume muito reduzido de fase móvel (117?L) era insuficiente, resultando em

baixas e irregulares taxas de recuperação, assim sendo, resolveu-se utilizar o

dobro do volume de fase móvel (234?L), ficando por esta razão com a

concentração igual à metade da concentração do padrão de injeção direta. A

tabela 4.4 mostra as áreas dos picos de cada padrão e a taxa de recuperação já

com as concentrações corrigidas.


104R.F.Menegon

Tabela 4.4: Taxa de recuperação da extração.

Padrões Área do pico Recuperação

PE 7??g/m L 139266

PID 14??g/m L 360944,377,17%

PE 3,5 ??g/m L 62952,7

PID 7??g/m L 169361,374,34%

PE = padrão de extração; PID = padrão para injeção direta; recuperação = [ (área do pico do

PE)x2/área do pico do PID]x100.

A curva de calibração foi linear dentro do limite 6,75 a 135?g/mL

apresentando bom coeficiente de correlação (R2=0,9999), como mostrado na

gráfico 4.2.

Gráfico 4.2: Curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina

y = 6878,5x + 3376,3

R2 = 0,9999

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 50 100 150

?g/m L

área

?g/m l área135 931713,327 192285,713,5 91529,36,75 51577,7


105R.F.Menegon

A concentração do sal na suspensão aquosa usada para o enxágüe bucal foi

calculada mantendo-se a mesma concentração molar, em termos de clorexidina

base, que os enxaguatórios disponíveis no mercado; a suspensão a 0,35% contém

2,28mM de tetrapalmitato de clorexidina, o qual corresponde a 0,75mM de

clorexidina base, já os enxaguatórios comerciais contém 0,12% de digluconato de

clorexidina, o que eqüivale a 1,34mM do sal ou 0,75mM de clorexidina base.

Schiött e Löe (1972) determinaram em 4?g/mL a concentração mínima de

digluconato de clorexidina na cavidade bucal capaz de inibir cepas de

Streptococos, o que equivale a cerca de 11?g/mL de tetrapalmitato de clorexidina.

Com base nesta informação, podemos observar através do gráfico 4.3, que mesmo

após 12 horas à administração da suspensão a concentração do sal está bem

acima deste valor (28?g/mL), mesmo após a realização de uma refeição e da

escovação dental.


106R.F.Menegon

Gráfico 4.3: Concentração de TPCHD em função do tempo transcorrido ao enxágüe bucal com

suspensão 0,35%

Pesonem e colaboradores (1985) verificaram que em cerca de 10 horas

após a administração de diacetato de clorexidina (cerca 0,75mM de clorexidina

base), a concentração desta estava no limite mínimo para se ter uma atividade

inibitória, e após 12 horas estava abaixo de 50% deste limite.

Assim sendo, é possível observar aumento na retenção do sal tetrapalmitato

na cavidade bucal, o que pode permitir que a dosagem de clorexidina empregada

no enxágüe bucal seja diminuída sem haver prejuízo de sua atividade

antimicrobiana, resultando na minimização de seus efeitos indesejáveis (manchas

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 250 500 750 1000 1250 1500tem po (m inutos)

ug/mL

tem po área ?g/m l1 3037248 44115 770014,7 11160 469107,3 68120 450565,7 65240 366787,3 53480 327998 47720 195606,7 281440 32152,7 4


107R.F.Menegon

nos dentes e sabor desagradável), o que pode resultar em maior adesão dos

pacientes ao tratamento.

Estes resultados sugerem o tetrapalmitato de clorexidina como potencial

antimicrobiano para uso em odontologia com eficácia superior ao utilizado

comercialmente. Neste sentido, é possível a continuação do trabalho, envolvendo

ensaios clínicos de análise sensorial, para a observação do sabor e amarelamento

dos dentes.

5- Conclusões e Perspectivas

Conclusão e perspectivas

108 R.F.Menegon

5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

5.1. CONCLUSÕES

?? O pró-fármaco amídico derivado da clorexidina foi obtido com rendimentos

muitos baixos, devido à possibilidade de formação de muitos produtos, além da

própria degradação da molécula de clorexidina.

?? O sal tetrapalmitato de clorexidina é obtido facilmente, com 63% de

rendimento.

?? O coeficiente de partição n-octanol/água do sal tetrapalmitato de clorexidina

é 11.000 (Log P = 4,0), demonstrando alta lipossolubilidade e baixa

hidrossolubilidade.

?? O estudo farmacocinético realizado na saliva demonstrou menor remoção do

sal tetrapalmitato de clorexidina pela saliva e elevada concentração do mesmo nas

primeiras 12 horas após enxágüe bucal mantida a concentração usual dos

enxagüatórios disponíveis no mercado.

Conclusão e perspectivas

109 R.F.Menegon

5.2. PERSPECTIVAS

?? Realizar estudo sobre a permeação do sal obtido nos tecidos subgengivais.

?? Realizar ensaio clínico para a observação de alteração de sabor e

amarelamento dos dentes.

6– Procedimento Experimental

Procedimentos Experimentais

110R.F.Menegon

6. PROCEDIM ENTO EXPERIM ENTAL

6.1. OBTENÇÃO DO PRÓ-FÁRM ACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DO PROCEDIM ENTO A

Esquem a 6.1: Obtenção do pró-fármaco(3) a partir do cloreto de palmitoíla(2) e clorexidina

base(1).


111R.F.Menegon

6.1.1. Procedim ento A1

Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de metanol e

algumas gotas de ácido nítrico até total solubilização, com pH da solução em torno

de 4,0. Sobre esta solução, adicionou-se 0,6 ml (2 mmol) de cloreto de palmitoíla.

A reação foi mantida em agitação à temperatura ambiente por 24 horas. Após este

período, adicionou-se 10 ml de água, formando duas fases, uma superior amarela

e uma inferior incolor. Sobre a fase incolor adicionou-se hidróxido de sódio a 1 M

até precipitação de um pó branco. A reação foi acompanhada por CCD e o produto

final analisado por ponto de fusão e infravermelho.

6.1.2. Procedim ento A2.1

Sobre 50 ml de uma mistura 2:1 de éter etílico/metanol adicionou-se 0,505

g (1mmol) de clorexidina. Ocorre uma leve solubilização. Adicionou-se 0,6 ml (2

mmol) de cloreto de palmitoíla, favorecendo a solubilização de toda a reação. A

reação foi mantida sob agitação a temperatura ambiente por 24 horas, formando

uma grande massa de precipitado branco. Filtrou-se a solução e lavou-se o

precipitado com água gelada. Parte do solvente do líquido filtrado foi extraído com

rota-vapor e neutralizado com hidróxido de sódio 0,2N, obtendo-se um produto

também branco. A reação foi acompanhada por CCD, o precipitado e o produto

brancos foram analisados por infravermelho e ponto de fusão.


112R.F.Menegon


Sobre 50 ml de uma mistura 2:1 de éter etílico/metanol adicionou-se 0,505

g (1mmol) de clorexidina, 0,6 ml (2 mmol) de cloreto de palmitoíla, e 0,16 ml (2

mmol) de piridina. A solução foi mantida sob agitação, a temperatura ambiente por

24 horas, formando uma grande massa de precipitado branco. Filtrou-se a solução

e lavou-se o precipitado com água gelada. Parte do solvente do líquido filtrado foi

extraído com rota-vapor e neutralizado com hidróxido de sódio 0,2N, obtendo-se

um produto também branco. A reação foi acompanhada por CCD e os produtos

analisados por ponto de fusão e infravermelho.

6.1.4. Procedim ento A3

Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 10 ml de DMF. Sobre a

suspensão formada adicionou-se 0,16 ml (2 mmol) de piridina e então 0,6 ml (2

mmol) de cloreto de palmitoíla, com subseqüente solubilização da reação. Após 1

hora a temperatura ambiente, o precipitado branco formado foi filtrado da reação

e lavado com água gelada. A reação foi acompanhada por CCD e o produto obtido

analisado por infravermelho e ponto de fusão.


113R.F.Menegon


Em 50 ml de clorofórmio, adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina

formando uma suspensão. Adicionou-se 0,16 ml (2 mmol) de piridina e 0,6 ml (2

mmol) de cloreto de palmitoíla. Instantaneamente formou-se um gel, o qual foi

colocado em um funil revestido com papel de filtro e lavado com metanol e água

gelada, formando um pó branco. O produto obtido foi analisado por ponto de

fusão e infravermelho.


Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de THF. Aqueceu-se

a mistura até temperatura de refluxo (aproximadamente 65 ºC) ocorrendo

solubilização. Sob esta solução, adicionou-se 20 mg (0,16 mmol) de DMAP e 0,32

ml (4 mmol) de cloreto de palmitoíla. A reação foi mantida sob refluxo durante

uma noite, e então removeu-se o precipitado branco formado por filtração e

extraiu-se o solvente do líquido filtrado em rota-vapor, obtendo-se uma pasta de

coloração levemente amarelada. O produto branco precipitado foi analisado por

ponto de fusão, infravermelho e RMN 1H, e a pasta amarelada analisada por CCD e

infravermelho.


114R.F.Menegon


Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de THF e aqueceu-

se até refluxo com subseqüente solubilização. Adicionou-se 20 mg (0,16 mmol) de

DMAP e 0,32 ml (4 mmol) de cloreto de palmitoíla. O pH foi ajustado para 10 com

Et3N. Após 24 horas de reação removeu-se o precipitado da reação e extraiu-se o

solvente do líquido filtrado com rota-evaporador. O resíduo foi solubilizado em

clorofórmio e lavado com 2 frações de 20 ml de HCl 0,2 N. A fração orgânica foi

concentrada pela evaporação do solvente e o resíduo amarelo purificado por

cromatografia em camada delgada preparativa usando como fase móvel

metanol/ácido acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81). A fração superior foi

analisada por RMN 1H.




solubilização. Sob esta solução, adicionou-se 0,32 ml (4 mmol) de cloreto de

palmitoíla e manteve-se a reação sob refluxo por 24 horas. Após este período,

filtrou-se o precipitado da reação e extraiu-se o solvente do líquido filtrado com

rota-vapor obtendo-se um produto levemente amarelado. A reação foi

acompanhada por CCD e os produtos analisados por infravermelho.


115R.F.Menegon




solubilização. Sob esta solução, adicionou-se 0,32 ml (4 mmol) de cloreto de

palmitoíla e ajustou-se o pH as reação para cerca de 10 com Et3N. A reação foi

mantida sob refluxo por 24 horas. Após este período, filtrou-se o precipitado da

reação e extraiu-se o solvente do líquido filtrado com rota-vapor obtendo-se um

produto levemente amarelado. Este produto foi solubilizado em diclorometano e

aplicado em uma coluna de 40 cm x 2,6 cm de filtração em gel (Sephadex LH-20

®), utilizando diclorometano como fase móvel, e depois purificado novamente em

coluna de sílica gel de 10 cm x 2,5 cm usando como fase móvel 100 % de

diclorometano. Obteu-se um produto branco, o qual foi analisado por ponto de

fusão, infravermelho e RMN 1H


116R.F.Menegon

6.2. OBTENÇÃO DO PRÓ-FÁRM ACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DO PROCEDIM ENTO B

Esquem a 6.2: Obtenção do pró-fármaco (3) a partir do ácido palmítico (4) e clorexidina base (1).


117R.F.Menegon

6.2.1. Procedim ento B1

1,024 g (4 mmol) de ácido palmítico foi solubilizado em 30 ml de THF. A

dicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina e aqueceu-se a reação até refluxo do

solvente (aproximadamente 65 ºC). Após 24 horas de reação, extraiu-se parte do

solvente da reação com auxílio do rota-vapor e adicionou-se cerca de 20 ml de

isopropanol e guardou-se a solução na geladeira (a aproximadamente 4 ºC). Após

24 horas, removeu-se o precipitado formado, e o produto foi analisado por ponto

de fusão, infravermelho e análise elementar. O solvente restante foi rota-

evaporado fornecendo um produto amarelado, o qual foi dissolvido em

clorofórmio, removido algum produto insolúvel branco, e aplicado em coluna de

sílica gel de 5 cm x 2,5 cm , utilizando mistura 2:8 de acetato de etila/clorofórmio

como fase móvel. O óleo amarelo obtido foi analisado por RMN 1H.


118R.F.Menegon

6.2.2. Procedim ento B2

Em 30 ml de Et3N adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina e aqueceu-

se a reação para 65ºC, a solubilização só ocorreu após a adição de 1,024 g (4

mmol) de ácido palmítico. O sistema foi mantido a 65 ºC por 7 dias, sendo

acompanhado por CCD. Após este período, a reação foi vertida para um funil de

separação e então adicionou-se 30 ml de água gelada formando duas fases, a fase

inferior (incolor) foi descartada e à superior (amarela) foi adicionado 30 ml de

diclorometano. A fase orgânica foi separada, seca com sulfato de sódio anidro e

rotaevaporada, produzindo uma pasta amarelada que foi analisada por CCD.


119R.F.Menegon

6.3. ENSAIOS FÍSICO-QUÍM ICO E FARM ACOCINÉTICO

6.3.1. Coeficiente de partição (Log P)

6.3.1.1. Curva de calibração do tetrapalm itato declorexidina (TPCHD)

Para a medida das absorbâncias das soluções foi utilizado espectrofotômetro

UV-VIS da marca Hitachi, modelo U-2001, e cubeta de quartzo de 1cm.

Solução estoque (10 m g/m L): Pesou-se exatamente 0,0100g de TPCHD

em um balão volumétrico de 100 mL e dissolveu-se em cerca de 80 mL de etanol

absoluto, agitou-se por 20 minutos a 250 rpm e manteve-se por mais 10 minutos

em banho ultrassônico e então completou-se o volume com etanol absoluto.

Diluições:

D1 (0,030 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 3 mL da solução

estoque para um balão volumétrico de 10 ml, completou-se o volume com etanol

absoluto.



absoluto.


120R.F.Menegon



absoluto.



absoluto.



absoluto.



absoluto.

As soluções foram medidas em espectrofotômetro a 258 nm, e suas

absorbâncias plotadas em gráfico versus a concentração. A reta final foi obtida

pela regressão linear dos pontos obtidos.

6.3.1.2. Estim ativa prelim inar do coeficiente de

partição

Misturou-se um excesso da amostra com 5 mL de água e manteve-se sob

agitação a 250 rpm por 24 horas. Ao final deste período, filtrou-se a mistura e

transferiu-se volumetricamente 1 mL da água saturada em balão volumétrico de


121R.F.Menegon

10 mL, completou-se o volume com etanol absoluto. A concentração desta solução

foi medida no espectrofotômetro a 258nm, usando como branco solução de 1 mL

de água em 10 mL de etanol.

De maneira similar, misturou-se um excesso da amostra com 5 mL de n-

octanol e manteve-se sob agitação a 250 rpm por 24 horas. Ao final deste período,

filtrou-se a mistura e transferiu-se exatamente 20 ?L de n-octanol para um balão

volumétrico de 100 mL e completou-se o volume com etanol absoluto. A

concentração desta solução foi medida no espectrofotômetro a 258nm, usando

como branco solução de 20 ?L de n-octanol em 100 mL de etanol.

6.3.1.3. Determ inação do Coeficiente de Partição

Para a determinação do coeficiente de partição é necessário que se faça

uma pré saturação das fases, para isto, agitou-se durante 24 horas n-octanol com

um pouco de água e água com um pouco de n-octanol, após este período, as

misturas foram mantidas em repouso por mais 24 horas e então separou-se os

solventes saturados.

Solução estoque de TPCHD (11 m g/m L): Pesou-se exatamente

0,5500g de TPCHD em balão volumétrico de 50 mL e completou-se o volume com

n-octanol.

Uma alíquota de 10?L da solução estoque foi transferida para um balão

volumétrico de 10 mL e completou-se o volume com etanol absoluto, esta diluição


122R.F.Menegon

foi analisada no espectrofotômetro a 258 nm de maneira a confirmar a

concentração da solução.

Condições do ensaio: De maneira a garantir a reprodutibilidade do

ensaio, este deve ser feito em duplicata e em três condições diferentes, variando-

se a massa da amostra e as proporções dos solventes.

Condição 1 – Transferiu-se volumetricamente 10 mL da solução estoque de

TCPHD para um tubo de ensaio de 20 mL e adicionou-se exatamente 5 mL de

água. Massa de TPCHD empregada = 110 mg.


TPCHD para um tubo de ensaio de 20 mL e adicionou-se exatamente 5 mL de



TPCHD para um tubo de ensaio de 20 mL e adicionou-se exatamente 10 mL de


Os seis tubos de ensaio foram submetidos a agitação manual, realizando-se

em 5 minutos 100 rotações de 180 º no seu eixo transversal. Os tubos

permaneceram então descansando por 1 hora na temperatura do ensaio (20 ºC) e

então mediu-se a concentração em cada uma das fases no espectrofotômetro a

258 nm. Para a fase n-octanol foi necessário diluir 10?L da solução para 10mL com

etanol absoluto de maneira à absorção se enquadrar dentro da curva de

calibração, já a fase aquosa foi medida diretamente sem diluição, dada à sua baixa

concentração, utilizando água saturada com n-octanol como branco.


123R.F.Menegon

O coeficiente de partição “P” foi calculado dividindo-se a concentração na

fase oleosa pela concentração na fase aquosa. O valor do Log P é obtido

calculando-se o logaritmo na base 10 do valor de “P”.

6.3.2. Determ inação do tem po de retenção do pró-fárm aco

na cavidade bucal

6.3.2.1. Crom atografia

Para a análise por CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) foi

utilizado um sistema cromatográfico da Shimadzu SCL-10A, detector UV-VIS SPD-

10A, sistema de bombeamento de fase móvel quaternário LC-10AD, degaseificador

DGU-14A (à vácuo), e loop do injetor de 20?L.

A CLAE em fase reversa foi realizada a temperatura ambiente, a coluna

utilizada foi a shim-pack CLC-ODS (M), de 25 cm de comprimento, 4,6 mm de

diâmetro interno 5?m de diâmetro de partícula. A fase móvel empregada foi 1000

?g/mL de ácido p-tolueno sulfônico em metanol-água (65:35, v/v)


124R.F.Menegon

6.3.2.2. Procedim ento de extração

200 ?L de saliva foram introduzidos em um tubo de ensaio e adicionou-se

400 ?L de NaOH 4,5 N e 400 ?L de acetonitrila. O tubo foi agitado em vórtex por

um minuto e centrifugado a 1610 g por 15 minutos, após a separação das fases,

175 ?L da fase orgânica foi coletada em outro tubo de ensaio e o solvente

evaporado. O resíduo foi ressolubilizado em 250 ?L de fase móvel, e injetado no

sistema de CLAE.

6.3.2.3. Curva de calibração

A curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina (TPCHD) foi feita

utilizando quatro concentrações (6,75, 13,5, 27 e 135 ?g/mL) e em triplicata. A

curva de calibração foi gerada pela regressão linear da área do pico do TPCHD

versus a concentração.

Preparação dos padrões:

Preparou-se uma solução padrão de trabalho de concentração 10 ?g/mL,

para isto, pesou-se exatamente 0,0100 g de TPCHD em um balão volumétrico de

100 ml e adicionou-se cerca de 80 mL de metanol, agitou-se por 20 minutos a 250

rpm e manteve-se por 10 minutos em banho ultrassônico, e então completou-se o

volume com metanol. Transferiu-se volumetricamente 10 mL desta solução para


125R.F.Menegon

um novo balão volumétrico de 100 mL e completou-se o volume com metanol

obtendo a solução padrão de trabalho (SPT).

Padrão 6,75 ?g/mL – Transferiu-se 135 ?L da SPT para um tubo de ensaio e

evaporou-se o metanol.

Padrão 13,5 ?g/mL – Transferiu-se 270 ?L da SPT para um tubo de ensaio e


Padrão 27 ?g/mL – Transferiu-se 540 ?L da SPT para um tubo de ensaio e


Padrão 135 ?g/mL – Transferiu-se 2700 ?L da SPT para um tubo de ensaio

e evaporou-se o metanol.

A cada um dos tubos, foi adicionado 200 ?L de saliva e prosseguiu-se com a

extração como descrita anteriormente.

6.3.2.4. Taxa de recuperação

A taxa de recuperação do TPCHD a partir da saliva foi determinada em

triplicata em duas concentrações diferentes dentro dos limites da curva de

calibração.

Padrões para Injeção Direta (PID):

PID 14 ?g/mL: Transferiu-se 350 ?L da SPT para um tubo de ensaio

e evaporou-se o metanol, o resíduo foi misturado com 250 ?L de fase móvel,

agitado em vórtex por um minuto e injetado no sistema cromatográfico.


126R.F.Menegon

PID 7 ?g/mL: Transferiu-se 175 ?L da SPT para um tubo de ensaio e

evaporou-se o metanol, o resíduo foi misturado com 250 ?L de fase móvel, agitado

em vórtex por um minuto e injetado no sistema cromatográfico.

Padrões de Extração (PE):

PE 7 ?g/mL: Transferiu-se 370 ?L da SPT para um tubo de ensaio e

evaporou-se o metanol, ao resíduo foi adicionado 200?L de saliva, 400?L de NaOH

4,5 N e 400?L de acetonitrila. A mistura foi agitada por um minuto em vórtex e

então centrifugada a 1610g por 15 minutos. 175 ?L da fase orgânica foi separada

e evaporada para ser posteriormente solubilizada em 234 ?L de fase móvel,

agitada em vórtex por um minuto aplicada no sistema cromatográfico.

PE 3,5 ?g/mL: Transferiu-se 175 ?L da SPT para um tubo de ensaio e

evaporou-se o metanol, ao resíduo foi adicionado 200?L de saliva, 400?L de NaOH

4,5 N e 400 ?L de acetonitrila. A mistura foi agitada por um minuto em vórtex e

então centrifugada a 1610g por 15 minutos. 175 ?L da fase orgânica foi separada

e evaporada para ser posteriormente solubilizada em 234 ?L de fase móvel,

agitada em vórtex por um minuto aplicada no sistema cromatográfico.


127R.F.Menegon

6.3.2.5. Estudo farm acocinético

Realizou-se um enxágüe bucal com 30 mL de uma suspensão aquosa a

0,35% de TPCHD durante um minuto. Alíquotas de saliva foram coletadas nos

tempos 1, 15, 60, 120, 240, 480, 720 e 1440 minutos após o enxágüe. Uma

amostra branco da saliva foi coletada antes da administração da suspensão.

Durante as oito primeiras horas não foi permitido nenhuma bebida (exceto água),

comida ou fumo.

7– Referências Bibliográficas

Referências Bibliográficas

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R.F.Menegon

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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