expressÃo de receptores de egf, inibidores e …

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE EGF, INIBIDORES E

REGULADORES DO CICLO CELULAR EM LESÕES

PROLIFERATIVAS DA PRÓSTATA CANINA

Mariana Batista Rodrigues Faleiro

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura

GOIÂNIA

2014

ii

MARIANA BATISTA RODRIGUES FALEIRO

EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE EGF, INIBIDORES E

REGULADORES DO CICLO CELULAR EM LESÕES

PROLIFERATIVAS DA PRÓSTATA CANINA

Tese apresentada junto ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência Animal da Escola de

Veterinária da Universidade Federal de Goiás

para obtenção do título de Doutorem Ciência

Animal.

Área de Concentração:

Patologia, Clínica e Cirurgia Animal

Linha de Pesquisa:

Patobiologia animal, experimental e comparada

Orientadora:

Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura-EVZ/UFG

Comitê de Orientação:

Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno (EVZ / UFG)

Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo (EVZ / UFG)

GOIÂNIA

2014

iii

MARIANA BATISTA RODRIGUES FALEIRO

Tese defendida e aprovada em 14/11/2014 pela banca examinadora constituída pelos

professores:

iv

Dedico este trabalho:

A vocês que abriram mão de momentos de convívio, que sofreram com a ausência quando o

dever do estudo chamava;

A vocês que muitas vezes receberam-me com silenciosa mágoa ou muda revolta quer pela

ausência, quer por saudade ou impaciência;

A vocês que agora vêem com alívio este fim de etapa e que, por mais que não queiram

demonstrar, estão mais felizes do que eu;

Pois amaram suficientemente para aplaudir, chorar, tolerar e encorajar.

Essa vitória é nossa.

Marido, Pai, Mãe, Irmão, Sogra, Sogro, Cunhada, Cunhado...

v

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter dado meu anjo da guarda e meu mentor, que me auxiliaram dando

força maior que me impulsiona e guia, fazendo chegar até aqui e ainda a seguir em frente por

qualquer que seja o caminho.

Ao meu companheiro, meu ídolo, meu modelo, Neylon Teixeira Faleiro, que vem

me acompanhando nos último quatorze anos, sendo fonte inesgotável e incessante de

compreensão, atenção, amor e carinho. Sempre presente, paciente e disposto a ensinar.

Em especial agradeço a minha mãe, Eunice Batista da Silva Rodrigues,por seu

exemplo de luta, vida e superação. E ao meu Pai, Rivalino Rodrigues, que mesmo longe se faz

presente em minhas orações.

Ao meu irmão, Bruno Batista Rodrigues, por ser amigo companheiro, braço

direito, mesmo sendo tão perfeccionista e certinho.

As minhas meninas Teka, Kika e Mila e o menino Tupi, por serem minha fonte

inspiradora e carregadores de energias. Companheiros fiéis e presentes nos bons e maus

momentos.

Agradeço a minha orientadora, amiga, mãe verdadeira, Veridiana Maria Brianezi

Dignani de Moura, por ter tido fé em mim, apoiado e confiado nas minhas loucuras pela

biologia molecular.

Ao Dr. Rafael Malagoli, Carlos Ferreira Nascimento, Suely Nonogaki e demais

funcionários do hospital do câncer A.C. Camargo, São Paulo, pela ajuda e acolhida.

Àprofessora Rosália Santos Amorim Jesuíno,por ter me acolhido não só no seu

laboratório, mas também em sua vida. Quando tudo parecia escuro, sem luz, eis que surge

com a lanterna ao fim do túnel e fez tangível grande parte deste projeto tornandosonho em

realidade.

Aos novos amigos,Lorena Cintra Cardoso, Saulo Siqueirae Marcelo Ramada, por

terem aberto as portas do conhecimento e passeado comigo pelo mundo da PCR e do gel de

agarose.

Aos professores, funcionários e alunos do laboratório de Biotecnologia de

Fungos,laboratório de Enzimologia e laboratório de Engenharia Genética doInstituto de

Ciências Biológicas II da Universidade Federal de Goiás, pelo carisma e excelente recepção a

mim conferidos.

vi

Ao comitê de orientação, composto pelos professores doutores Adilson Donizeti

Damasceno e Eugênio Gonçalves de Araújo, pela co-orientação e auxílio na formação

profissional.

Aos professores do Setor de Patologia Animal da EVZ/UFG, doutores Ana Paula

Iglesias Santin, Eugênio Gonçalves de Araújo, Luiz Augusto Batista Brito, Moema Pacheco

Chediak Matos e Regiani Nascimento Gagno Pôrto, que quando deveriam ser simplesmente

professores foram mestres, quando deveriam ser simplesmente mestres foram amigos e em

sua amizade me compreenderam e incentivaram a seguir o caminho. Meu maior

agradecimento e o meu profundo respeito que sempre serão poucos diante do muito que me

foi oferecido.

As amigas irmãs Caroline Rocha de Oliveira Lima, Léa Resende Moura e Denise

Caroline Toledo, pela amizade e auxílio durante o curso.

Aos alunos, amigos, irmãos companheiros de toda hora do Setor de Patologia

Animal da EVZ/UFG, Aline Maria Vasconcelos Lima, Danilo Rezende e Silva e Paula Lima

Magalhães, pela grande colaboração e amizade.

ÀEscola de Veterinária e Zootecnia da UFG, que se tornou minha segunda casa

nesses últimos anos e me preparou profissionalmente, conferindo-me conhecimentos

necessários a tão sonhada pós-graduação.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG e ao seu corpo

docente, que mais do que ensinar um ofício ensinou-me uma filosofia de vida.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) e à

Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES)pela bolsa cedida,

permitindo que me dedicasseexclusivamente ao desenvolvimento deste trabalho.

Aos demais professores, funcionários e alunos da EVZ/UFG.

Meu especial agradecimento àqueles que tornaram tudo isso possível,os animais.

A todos aqueles que em algum momento fizeram parte da minha vida.

MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS.

vii

“Lentamente, os cromossomas adquirem a sua apresentação peculiar, em forma de

pontoalçabastonetebengala, e a evolução que lhes diz respeito na cariocinese, desde a

prófase à telófase, merece a melhor atenção dos Construtores Divinos, que através do centro

celular mantêm a junção das forças físicas e espirituais, ponto esse em que se verifica o

impulso mental, de natureza eletromagnética, pelo qual se opera o movimento dos

cromossomas, na direção do equador para os pólos da célula, cunhando as leis da

hereditariedade e da afinidade que se vão exercer, dispondo nos cromatídeos, em forma de

granulações perfeitamente identificáveis entre o leptptênio e o paquitênio, os genes ou fatores

da hereditariedade, que, no transcurso dos séculos, são fixados em número e valores

diferentes para cada espécie.”

André Luiz

(Francisco Cândido Xavier e Waldo Vieira)

Evolução em dois mundos (1959)

viii

“A cada um é dadosegundo suas Obras!”

Mateus 16:27

ix

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xi

LISTA DE TABELAS.................................................................................................. xiv

LISTA DE QUADROS ................................................................................................. xv

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................... xvi

RESUMO ..................................................................................................................... xix

ABSTRACT .................................................................................................................. xx

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS ............................................................ 1

1.1. Morfofisiologia e enfermidades da próstata canina ................................................ 1

1.1.1. Hiperplasia prostática benigna (HPB) .................................................................. 2

1.1.2. Atrofia inflamatória proliferativa (PIA) .............................................................. 3

1.1.3. Neoplasia intraepitelial prostática (PIN) .............................................................. 7

1.1.4. Carcinoma prostático (PC) ................................................................................... 9

1.2. Carcinogênese ......................................................................................................... 12

1.3. Ciclo e crescimento celular .................................................................................... 13

1.4. Fatores de crescimento ........................................................................................... 16

1.5. Receptores de Fator de Crescimento Epidérmico - EGFR/Her1 e Her2/c-

erbB-2 ............................................................................................................................ 17

1.6. Inibidores de ciclina dependente de quinase - p21, p27 e p53 .............................. 22

1.7. Ciclina D1 (CD1) .................................................................................................... 27

1.8. Proteínas c-myc ...................................................................................................... 29

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 30

3. Referências ................................................................................................................ 31

CAPÍTULO 2 – EGF receptors expression in canine prostate with proliferative

inflammatory atrophy and carcinoma ......................................................................... 43

ABSTRACT .................................................................................................................. 43

RESUMO ...................................................................................................................... 44

INTRODUCTION......................................................................................................... 45

MATERIAL AND METHODS .................................................................................... 46

RESULTS ...................................................................................................................... 50

DISCUSSION ................................................................................................................ 54

CONCLUSIONS ........................................................................................................... 55

REFERENCES ............................................................................................................. 55

x

CAPÍTULO 3 - Cell cycle inhibitors expression in canine prostate with prostatic

inflammatory atrophy and carcinoma ......................................................................... 60

ABSTRACT .................................................................................................................. 60

RESUMO ...................................................................................................................... 61

INTRODUCTION......................................................................................................... 62


RESULTS ...................................................................................................................... 66

DISCUSSION ................................................................................................................ 71

CONCLUSIONS ........................................................................................................... 73

REFERENCES ............................................................................................................. 73

CAPÍTULO 4 – Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate

with proliferative lesions ............................................................................................... 79

ABSTRACT .................................................................................................................. 79

RESUMO ...................................................................................................................... 80

INTRODUCTION......................................................................................................... 81


RESULTS ...................................................................................................................... 83

DISCUSSION ................................................................................................................ 90

CONCLUSIONS ........................................................................................................... 92

REFERENCES ............................................................................................................. 92

CAPÍTULO 5 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................. 98

ANEXO A .....................................................................................................................100

APÊNDICE A................................................................................................................101

xi

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Figura 1

A) Vista ventral da cavidade pélvica canina. 1) Bexiga urinária; 2) próstata;

3) reto; 4) uretra. B) Fotomicrografia da histomorfologia normal da próstata

canina. Glândula túbulo-alveolar ramificada (ácinos), recobertas por epitélio

colunar simples (seta preta). Lúmen glandular (asterisco), estroma de

sustentação fibromuscular (seta amarela) e célula basal (seta verde). HE,

200x...................................................................................................................

01

Figura 2

Fotomicrografia da próstata canina com HPB cística. Evidenciação de ácinos

acentuadamente dilatados (asterisco vermelho), irregulares e proliferação

estromal adjacente (asterisco preto). HE, 200x.................................................

03

Figura 3

Fotomicrografia de próstata canina com foco de atrofia inflamatória

proliferativa (PIA). A) PIA com infiltrado inflamatório mononuclear

intersticial (asterisco) e atipias epiteliais com mais de uma camada de células

epiteliais (seta), citoplasma marcadamente reduzido, núcleos aumentados e

nucléolos evidentes (PIA-moderada), HE, 400x; B) Atrofia acinar, dupla

camada de células epiteliais (seta) e infiltrado inflamatório mononuclear

intersticial (asterisco) (PIA-acentuada), HE, 200x............................................

06

Figura 4

Fotomicrografia de próstata canina com foco de PIN. Epitélio acinar

estratificado e displásico, com variação do tamanho nuclear, nucléolo

evidente e perda de diferenciação citoplasmática (seta). HE, 400x...................

09

Figura 5 Fotomicrografia de carcinoma prostático canino. Áreas de proliferação celular

com atipias e perda da conformação acinar. HE, 400x.......................................

11

Figura 6 Representação esquemática das fases da carcinogênese. Iniciação, promoção,

progressão e manifestação...................................................................................

13

Figura 7

Ciclo celular. A) Representação gráfica esquemática do ciclo celular com as

fases G0, G1, S, G2 e M, e os pontos de checagem do ciclo (setas

vermelhas). B) As fases da mitose. Interfase, prófase, metáfase, anáfase e

telófase...............................................................................................................

14

Figura 8

O número de células de um tecido pode ser alterado pelo aumento ou

diminuição da taxa de recrutamento das células tronco, pela morte celular

por apoptose ou por alterações nas taxas de proliferação ou

diferenciação......................................................................................................

15

Figura 9

Receptores da família do EGF (EGFR, Her2, Her3, Her4) apresentando sítio

de ligação extracelular, porção transmembrana e domínio da tirosina quinase

intracelular...........................................................................................................

19

Figura 10

Representação esquemática do ciclo celular com as fases G0, G1, G2 e M, e

ação de proteínas estimuladoras (ciclinas e cdk’s), inibidoras (p21, p27, p57,

p16, p15, p18 e p19), e de controle do ciclo (c-myc). TGF-β induz a

produção dos inibidores.....................................................................................

23

Figura 11

Representação gráfica da atividade dos complexos Cdk/ciclina durante o

ciclo celular. A largura das faixas coloridas é aproximadamente proporcional

à atividade dos complexos indicados.................................................................

28

xii

CAPÍTULO 2 - EGF receptors expression in canine prostates with proliferative

inflammatory atrophy and carcinoma

Figura 1 Immunostaining intensity of EGFR and Her2 antibodies in canine prostatic

tissue………………………………………………………...……….…………

48

Figure 2

EGFR immunostaining membrane through cytoplasm (arrow). A) Human

placenta. Positive control with 3+ immunostaining score (200X); B) Canine

PC tissue with 1+score (400X); C) Normal canine prostatic tissue with 1+

score (400X); D) Canine prostatic tissue with PIA and 2+labeling score

(200X). IHC, DAB with H&E counterstain…….................................................

51

Figura 3

Her2 immunostaining membrane through cytoplasm (arrow). A) Human

mammary carcinoma. Positive control with 3+ immunostaining intensity

score (400X); B) Canine PC tissue with 3+score (400X); C) Normal canine

prostatic tissue with 0- score (200X); D) Canine prostatic tissue with PIA and

2+ labeling score (400X); IHC, DAB with H&E counterstain...…….…….…..

51

Figura 4

Agarose gel images showing amplification products of β-actin, ErbB1 and

ErbB2 genes from canine prostatic tissue. A) RT-PCR for β-actin expression

as samples positive control. All samples amplified. B) RT-PCR for

ErbB1.Prostatic samples N3, N4, PIA2, all PC, and MC amplified. C) RT-

PCR for ErbB2. Prostatic samples PIA2, PIA3, all PC and MC amplified.

MW = Molecular weight (GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder - Thermo

scientific, CA, USA, #SM1331); MC= canine mammary carcinoma (ErbB1

and ErbB2 positive control); N=Canine normal prostatic tissue; PIA=Canine

proliferative inflammatory atrophy; PC=Canine prostatic carcinoma…………

53



Figura 1

Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining

(arrow). A) Canine PC tissue with score three for labeling intensity and four

for number of labeled cells for p21. 400X. B) Human colon carcinoma; p21

positive control with score two for labeling intensity and four for number of

labeled cells. 400X. C) Canine PIA tissue with score three for labeling

intensity and four for number of labeled cells for p27. 200x. D) Human colon

carcinoma; p27 positive control with score three for labeling intensity and

four for number of labeled cells. 400X E) Canine PC tissue with score three

for labeling intensity and four for number of labeled cells for p53. 200X. F)

Human mammary carcinoma; p53 positive control with score three for

labeling intensity and three for number of labeled cells. 200X. IHC, DAB

with H&E counterstain.……………………….………...…...………………..

67

Figura 2

Images from agarose gels showing the amplification products of ACTG1 (β-

actin), CDKN1A, CDKN1B and TP53 genes from canine prostatic tissue.

(A) RT-PCR for β-actin expression (positive control). (B) RT-PCR for

CDKN1A. Prostatic samples PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. (C)

RT-PCR for CDKN1B. Prostatic samples PC7, PC8, PC9 and MC amplified.

(D) RT-PCR for TP53. Prostatic samples PIA1, PIA2, PIA3, PC1, PC2, PC3,

PC4, PC5, PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. MW = Molecular weight

(Gene Ruler 1Kb Plus DNA Ladder - Thermo scientific, CA, USA,

#SM1331); MC= canine mammary carcinoma (CDKN1A, CDKN1B and

xiii

TP53 positive control); N=Normal tissue; PIA= Canine proliferative

inflammatory atrophy; PC= Canine prostatic carcinoma……………………...

69

Figura 3

Fold expression levels of CDKN1A, CDKN1B and TP53 in canine normal,

PIA and PC normalized by β-actin. Values>1.6 were considered

overexpression and values<0.4 were considered decrease of gene

expression..………………………………………………..…………….…….

70

CAPÍTULO 4 - Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate with

proliferative lesions

Figura 1

Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining

(arrow). A) Canine PIN tissue with score three for labeling intensity and four

for number of labeled cells for p21. 200x. B) Human colon carcinoma.

Positive control for p21 with scores two for labeling intensity and four for

number of labeled cells. 400x. C) Normal canine prostatic tissue with one for

labeling intensity and one for number of labeled cells for p21 (400X) D)

Canine PIN with score two for labeling intensity and two for number of

labeled cells for p27. 200x. E) Human colon carcinoma. Positive control of

p27 with score three for labeling intensity and four for number of labeled

cells. 400X. F) Canine PIA with score three for labeling intensity and four

for number of labeled cells for p53. 400X. G) Mammary carcinoma. Positive

control of p53 with score three for labeling intensity and three for number of

labeled cells. 200X. H) Normal canine prostatic tissue with 0- score for p-53

(400X). IHC, DAB, counterstained with H&E………………………….……...

84

Figura 2

Immunohistochemistry photomicrography on nuclear through cytoplasmic

and membrane immunostaining.A) Canine PIN tissue with score one for

labeling intensity and three for number of labeled cells of cytoplasmic cyclin

D1 (arrow) (400X). B) Canine lymph node. Positive control of cytoplasmic

cyclin D1 (arrow) with score two for labeling intensity and two for number

of labeled cells. (400X) C) Normal canine prostatic tissue with 0- score for

cyclin D1 (200X) D) Canine PC tissue with score three for labeling intensity

and four for number of labeled cells for nuclear through cytoplasmic c-myc

(arrow). (400X) E) Canine lymph node. Positive control of nuclear through

cytoplasmic c-myc (arrow), with score two for labeling intensity and four for

number of labeled cells. (200X) F) Normal canine prostatic tissue with score

three for labeling intensity and four for number of labeled cells for c-myc

(arrow). (200X). IHC 400x. DAB with H&E counterstain. ………….…….…

85

xiv

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2 - EGF receptors expression in canine prostates with proliferative


Tabela 1 Labeling intensity scores of EGFR and Her2 antibodies in normal

prostate tissue and with PIA and PC ……………………………………..

50

Tabela 2 Means of comparison between EGFR and Her2 immunostaining

intensity in canine normal prostatic tissue and with PIA and PC…..….....

52

Tabela 3

Comparison results of EGFR and Her2 immunostaining scores by

immunohistochemistry (IHC) and ErbB1 and ErbB2 detection by RT-

PCR in normal canine prostatic tissue and with PIA and PC…………....

53



Tabela 1

Number of cases sorted by scores applied to variable number of labeled

cells and intensity of labeling to p21, p27, and p53 antibodies in canine normal prostatic tissue and with PIA and PC.……………………………

66

Tabela 2

Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding

number of stained cells and intensity of staining in canine normal

prostatic tissue, PIA and PC.………..……………………...….……...…..

69

Tabela 3

Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding


prostatic tissue, PIA and PC..…………..……………..……………….….

71

CAPÍTULO 4 - Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate with

proliferative lesions

Tabela 1

Distribution of cases according to the scores applied to variable number

of labeled cells and intensity of labeling to p21, p27, p53, ciclyn D1 and

c-myc antibodies in normal prostate tissues and with BPH, PIA, PIN and

PC.…………...……………………………………………………………

86

Tabela 2

Means of comparison between p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc

immunostaining regarding the number of stained cells and intensity of

staining cells in canine normal prostatic tissue and with BPH, PIA, PIN

and PC.……………...………………………...…………………………..

87

Tabela 3

Means of correlation between antibodies expression regarding the

number of stained cells and intensity of staining of the normal canine prostate and with BPH, PIA, PIN and PC………………………………..

89

xv

LISTA DE QUADROS


Quadro 1 Fatores de crescimento, células de origem, sítios alvo e suas funções no

tecido prostático normal e neoplásico.........................................................

17

Quadro 2 Fatores de crescimento que ativam (+) a família de receptores

EGFR..........................................................................................................

20

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS

ACTG1 - Gene que decodifica proteína da Beta actina

AKT - Quinase PI-3 dependente da serina tireonina quinase

AR - Receptor de andrógeno

ARF - Alternate reading frame

Bcl-2 - Proteína do Gene B-cell lymphoma/leukemia-2

bFGF- Fator de crescimento básico do fibroblasto

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

BPH - Benign Prostatic Hyperplasia

BSA - Bovine serum Albumin - Albumina serica bovina

BTC - Betacellulin

CCND1 - Gene que codifica protein ciclina D1

CD1 - Ciclina D1

Cdk - Ciclina dependente quinase

CdkI - Inibidor de Ciclina dependente quinase

CDKN1A - Inibidor de Ciclina dependente quinase 1A gene (gene do p21)

CDKN1B - Inibidor de Ciclina dependente quinase 1B gene (gene do p27)

cDNA - Fita Complementar do Àcido Desoxirribonucleico

c-erbB-2 - Mesmo que Her-2: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 2



Cip/Kip - Familia ciclina dependente quinase

CIP1 - Cdk-interacting protein 1

CLN - Gene neuronal ceroid lipofuscinosis que codifica proteínas semelhantes a ciclina

CMT-U229 - Linhagem de cultura de células de cancer de mama - Tumor misto benigno

c-MYC - Proto oncogene Myelocytomatosis

c-myc – Proteína produto do Proto oncogene Myelocytomatosis

COX-2 - Cicloxigenase-2

CP - Carcinoma prostático

CSC - Cancer stem cell like

DAB - Diaminobenzidine

dATP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Adenina

dCTP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Citosina

DEPC - Dietilpirocarbonate

dGTP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Guanina

DNA – Àcido Desoxirribonucleico

dNTP - 2´-deoxynucleoside 5`-triphosphate - Conjunto de Adenina, Citosina, Guanina e

Tiamina

dTTP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Tiamina

DU145 - linhagem de cultura de células de PChumano

DuPro - Linhagem de cultura de célula de PC andrógeno independentes

E2F - Proteína de regulação gênica - fator de transcrição

E-box - Enhancer Box

EGF - Fator de crescimento epidérmico

EGFR - Receptor do Fator de Crescimento Epidermico

ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EPR - Epiregulin

ErbB1-Gene do EGFR ou Her1: Erythroblasticleucemia viral oncogene homologo 1

ErbB2-Gene do Her2ou c-erbB-2: Erythroblastic leucemia viral oncogenes homologo 2

ErbB3-Gene do Her3 ouc-erbB-3: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 3

xvii

ErbB4-Gene do Her4 ou c-erbB-4: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 4

ERK - Proteína quinase regulada extracelularmente

FC - Fator de Crescimento

FC - Fold Change - Utilizado para identificar diferença significativa na expressão gênica

FFPE - formalin-fixed-paraffin-embedded

FGF - Fator de Crescimento Fibroblástico

FGFR - Receptor do Fator de Crescimento Fibroblástico

Fw - Forward

G0 - Fase de quiescência (Gap 0)

G1 - Fase de intérfase (Gap 1)

G2 - Fase de intérfase (Gap 2)

GA - Agarose gel electrophoresis – Gel de agarose

GSTP-1 - Glutathione S-transferase pi 1

HB-EFG - Heparina EGF

HB-EGFR - fator de crescimento epitelial ligador de heparina,

HE - Hematoxylina and Eosina

Her-1 - Proteína codificada pelo gene ErB1

Her-2 - Proteína codificada pelo gene ErbB2



HGPIN - Neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau

HPB - Hiperplasia prostática benigna

IGF1R - Receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 1

IGF2R - Receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 2

IGF-I - Fator de crescimento semelhante a insulina

IHQ - Imunohistoquímica

INCA - Instituto nacional de câncer

INK4 - Inibidor de CDK4

IRF1 - Interferon regulatory factor 1

KGF - fator de crescimento queratinócito

Ki-67 - Proteína nuclear responsável pela proliferação celular

KIP - Kinase inhibitor protein (inibidor de proteína quinase)

LGPIN - Neoplasia intra-epitelial prostática de baixo grau

LH-RH - Hormônio hipotalâmico

LNCaP - Linhagem de cultura de célula de PC andrógeno dependentes

M - Fase Mitótica

MAPK - Proteína quinase ativadora de mitose

MC - Mammary carcinoma

MCF-7 - Linhagem de cultura de célula de câncer de mama

Mdm - protein murine double minutes 2

MDM2 - Gene que codifica a proteína murine double minutes

MEC - Matriz extracelular

MEK - Mitogenactivated protein kinase

MgCl2 - Cloreto de Magnésio

mRNA - Mesmo que RNAm (Ácido ribonucléico mensageiro) na versão inglês

MSeA- Àcidocompostos de seléniode segunda geração do metil selénio, agente anti-câncer

N -Tecido normal

NaN3- sodium azide

NGR1 - Neuregulinas 1

NGR2 - Neuregulinas 2

xviii

NKX3.1 - NK3 homeobox 1 é: homeobox-containing transcription factor 1

NOS-2 - Óxido nítrico sintase 2

OSH - Ovariohisterectomia

P114 - Linhagem de cultura de célula de carcinoma mamário anaplásico primário

P15 - Proteina de 15 kDa, p15

P16 - Proteina de 16 kDa, p16

p21 - Proteina de 21 kDa, p21




pb - Pares de bases

PBS - Phosphatebuffered saline

PC - Prostate carcinoma-Carcinoma prostático

PCR - Polymerase chain reaction - Reação de cadeia de polimerase

PDGF - Fator de crescimento plaquetário

PDGFα - Receptor Fator de crescimento plaquetário alfa

PI3K- fosfatidil inositol 3,4,5 quinase

PIA - Atrofia inflamatória proliferativa

PIN - Neoplasia intra-epitelial prostática

Ponto R - Ponto de restrição

pRB - proteína do gene retinoblastoma

PSA - Antígeno prostático específico

PTEN - Phosphataseand tensin homolog deleted from chromosome 10

RAD51 - RecA recombinase

RAS - proteínas G monoméricas

Rev - reverse

RNA - Ácido ribonucléico

RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro

RNase - Enzima que cliva / hidrolisa RNA

RT - Reverse transcription - Transcriptase Reversa

RT-PCR - Reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa

RT-qPCR - Real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction

S - Fase de síntese do ciclo celular

T2–3 N1–3 M0 - Estadiamento tumoral: Tamanho, Localização próxima em linfonodos pélvico

mais não metástase a distância

Taq - Thermus aquaticus – DNA polimerase

TGF-α - Fator de crescimento transformador alfa

TGF-β - Fator de crescimento transformador beta

TIMP-1 - Inibidor tecidual de metaloproteinase -1

TIMP-2 - Inibidor tecidual de metaloproteinase 2

TMA - Tissue microarray - Micro arranjo Tecidual

TP53 - Gene que codifica Tumour Protein 53

TVT - Tumor Venéreo Transmissível

UFG - Universidade Federal de Goiás

uPAR - Receptor de ativador de plasminogênio tipo uroquinase

VEGF - fator de crescimento vascular endotelial

WAF1 - wild type p53 activated factor 1

WM - Weight Molecular - peso Molecular

ZO2 occludens - Membro da Membranaassociadaguanilato/quinaseproteína homóloga a

família -MAGUK (Membrane-associated guanylate kinases)

xix

RESUMO

Algumas lesões displásicas da próstata, como a atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e a

neoplasia intraepitelial prostática (PIN), são proliferativas, consideradas pré-malignas e

podem evoluir para carcinoma prostático (PC). Outras, como a hiperplasia prostática benigna

(HPB), apesar de proliferativas, não possuem relação com malignidade. Sendo o PC humano

uma das neoplasias que mais matam, e o cão aúnica espécie animal que apresenta a

enfermidade com características semelhantes, esta tem sido utilizada como modelo para o

estudo do câncer de próstata. Assim, com o intuito de melhor compreender os mecanismos

moleculares envolvidos na regulação do ciclo celular e evolução das lesões proliferativas na

próstata canina, este estudo teve por objetivo avaliar a expressão gênica de ErbB1, ErbB2,

CDKN1A, CDKN1B e TP53,e imunomarcação deEGFR (Her1), Her2 (c-erbB-2), p21, p27 e

p53 em próstatas com PIA e PC. Também foi avaliada a imunomarcação de p21, p27, p53, c-

myc e cyclin D1 em próstatas com HPB, PIA, PIN e PC. Para tal, foram obtidas de um bloco

de microarranjo tecidual (TMA) 106 amostras de tecido prostático canino, sendo 15 normais,

16com HBP, 30com PIA,20com PIN, e25com PC. As técnicas de RT-PCR e RT-qPCR foram

empregadas na avaliação da expressão gênica, assim como a técnica de imunoistoquímica foi

utilizada para verificar o imunofenótipo das lesões prostáticas. Quanto aos receptores

EGFReHer2 foi observado que esses atuam naslesões de PIAePCcanino, com ação importante

do receptor Her2, sugerindoqueessesestão envolvidosna carcinogênese e no

desenvolvimentotumoral da prostata canina.Em relação aos inibidores do ciclo celular

councluiu-se que quando superexpressos em próstatas com PIA e PC, p21 e p27 controlam a

proliferação celular, atuando comofator protetivo na evolução da PIA para PC, e no

desenvolviemento do PC, mesmo quando da alteração de p53. Na avaliação da

imunoexpressão dos reguladores do ciclo celular (p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc) em

próstatas caninas com lesões proliferativas foi constatado que os carcinomas possivelmente

apresentam baixo potencial de crescimento quando da superexpressãop21 ep27, menor

subexpressão de ciclina D1e expressão inalterada de c-myc, mesmo na presença de p53 tipo

mutante. Ainda, considerando o imunofenótipo semelhante nas glândulas com PIA, PIN e PC

no que se refere aos reguladores daprogressão do ciclo celular, reforça o potencial pré-

maligno da PIA e PIN na próstata canina.

Palavras-chave:carcinoma prostático, FFPE, PIA,PIN, imunoistoquímica, RT-PCR.

xx

ABSTRACT

Somedysplastic lesionsof prostate, such as proliferativeinflammatoryatrophy (PIA) and

prostatic intraepithelial neoplastic(PIN) are proliferative,consideredpremalignant andcan

progress toprostatic carcinoma (PC). Others, such asbenign prostatichyperplasia(BPH) are

proliferative, butare not related tomalignancy.The humanPC is the one ofcancers that more

kill,and dog`sthe onlyanimal species thatpresentsadiseasewith similarcharacteristics, thishas

been usedas a modelfor studyof prostatecancer. Thus, in order tobetter understandthe

molecular mechanisms involvedin repairand cell cycleevolution ofproliferative

lesionsincanine prostate, this study aimed to evaluatethe gene expression ofErbB1, ErbB2,

CDKN1A, CDKN1BandTP53andimmunostaining ofEGFR(Her1), Her2(c-erbB-2), p21,

p27and p53 inprostateswithPIAandPC. Also was evaluatedtheimmunostaining ofp21, p27,

p53, c-myc andcyclinD1inprostateswith BPH, PIA, PINandPC. For this purpose,wereobtained

from atissue microarray (TMA)block, 106samplesofcanineprostate tissue, which 15 normal,

16with BPH, 30 withPIA, 20 with PIN, and 25with CP. The RT-PCR andRT-qPCR

techniques wereused to evaluategene expression, as well as immunohistochemistrywas used

to determinetheimmunophenotypeofprostatic lesions.As forEGFRand Her2has beenobserved

that thesereceptorsactin canine lesions withPIA and with PCan importantaction ofHer2,

suggesting that theyare involvedin carcinogenesisandtumor development in canineprostate.

Regarding to cellcycleinhibitor concludethat whenoverexpressedin canine

prostateswithPIAandPC, p21andp27control cellproliferation, acting as a protective factorin

the evolution of PIA to PC, and in the PC development, even in the presence of altereted

p53.In assessing ofimmunostaining ofcell cycle regulators(p21, p27, p53, cyclinD1andc-myc)

in canineprostateswithproliferative lesionswas observedthatcarcinomas probably have

lowgrowth potentialwhenoverexpressed of p21andp27, reduced expression of cyclinD1and

unalteredexpression ofc-myc, even in the presence ofmutant p53type.Further,considering

thesimilarimmunophenotypein canine glands with PIA, PINandPC considered the

regulatorsofcell cycle progression, it is reinforce the pre-malignant potential of PIA andPINin

the canineprostate.

Keywords:FFPE, immunohistochemistry, PIA, PIN, prostatic carcinoma, RT-PCR.


1.1.Morfofisiologia e enfermidades da próstata canina

No cão, a próstata representa a única glândula sexual acessória, compondo-se por

órgão retroperitonial músculo-glandular, ovóide e bilobulado, que circunda a uretra

proximal1. Localiza-se caudal à bexiga, ventral ao reto e dorsal à sínfise púbica

1,2, podendo

variar de posição a depender da idade, distensão da bexiga e enfermidades envolvendo a

glândula3 (Figura 1A). Sua principal função é a produção do líquido prostático, que atua como

meio de transporte, proteção e nutrição para os espermatozóides durante a ejaculação5. Além

disso, auxilia no metabolismo da testosterona em diidrotestosterona3.

A próstata canina possui dois lobos, separados por um septo medial de tecido

fibroso1,2

. Esses lobos subdividem-se em lóbulos, contendo glândulas túbulo-alveolares

ramificadas (ácinos), recobertas por epitélio colunar simples5, sustentadas por delicado

estroma e que se estendem desde sua abertura no ducto uretral até a cápsula fibromuscular

prostática, a qual limita e protege o parênquima glandular1,6

. O epitélio glandular prostático é

composto por dois tipos celulares, as células epiteliais secretoras colunares altas e as células

epiteliaisda camada basal, estas localizadas ao longo da membrana basal. O estroma consiste

de fibroblastos e células musculares lisas, envoltos em colágeno, com vasos sanguíneos e

nervos3,6

(Figura 1B).

FIGURA 1 - A) Vista ventral da cavidade pélvica canina. 1) Bexiga urinária; 2) próstata; 3) reto; 4)

uretra. B) Fotomicrografia da histomorfologia normal da próstata canina. Glândula

túbulo-alveolar ramificada (ácinos), recobertas por epitélio colunar simples (seta preta). Lúmen glandular (asterisco), estroma de sustentação fibromuscular (seta amarela) e

célula basal (seta verde). HE, 200x.

Fonte: Faleiro7,8

1 2

3

4

A B

2

As doenças prostáticas representam um problema comum em cães adultos e

idosos, semelhante ao que ocorre na próstata do homem9-11

. Dentre as enfermidades que

acometem a prostáta dos cães, destacam-se a hiperplasia prostática benigna12

(HPB), as

prostatites3,4

, as lesões displásicas12

e o carcinoma prostático (PC)6,14-17

. Quanto às lesões

displásicas da próstata, consideradas pré-malignas, destacam-se a neoplasia intraepitelial

prostática (PIN)15,18

e a atrofia inflamatória proliferativa (PIA)13,16

.

A caracterização diagnóstica das prostatopatias caninas é um constante desafio,

uma vez que a similaridade dos sinais nas diferentes enfermidades e a substancial

possibilidade de ocorrência concomitante de duas ou mais alterações limitam diagnósticos

precisos, somado ao fato da inexistência de testes bioquímicos apropriados para a espécie,

como biomarcadores de detecção precoce de enfermidades como HPB e câncer. Ressalte-se

que à exceção da prostatite aguda, cães com doenças prostáticas são

comumenteassintomáticos3,5,19

.

Similaridades em relação à ocorrência natural e influência hormonal no

desenvolvimento das afecções prostáticas, principalmente HPB17

, PIN18

, PIA13

e PC6, têm

feito do cão modelo experimental para o estudo de algumas dessas prostatopatias na glândula

humana10,11,17,18

, contribuindo para o conhecimento médico e médico-veterinário acerca das

doenças prostáticas nessas espécies. Considerando essas similaridades e o contexto do estudo,

apresentam-se a seguir as enfermidades relacionadas aos objetivos desta pesquisa.

1.1.1. Hiperplasia prostática benigna (HPB)

A hiperplasia prostática benigna (HPB) é a prostatopatia mais comum no cão20

eestá associada ao envelhecimento e a desequilíbrios hormonais envolvendo a testosterona, a

diidrotestosterona (DHT) e o estrogênio3,12,17

. A HPB no cão envolve preferencialmente o

componente epitelial e ocorre de forma difusa19,21

, enquanto no homem costuma ser estromal

e nodular20

. Apesar disso, o cão é a única espécie não humana que desenvolve HPB

espontaneamente, o que reforça sua utilização como modelo experimental para essa doença

no homem20,22

.

Em decorrência do desequilíbrio entre andrógenos prostáticos, há alteração da

interação entre estroma e epitélio, havendo resposta das células epiteliais aos fatores de

crescimento produzidos pelas células estromais. Observa-se tanto aumento no número de

células (hiperplasia), quanto aumento no tamanho das mesmas (hipertrofia)19

. Essa alteração

resulta em descontrole na proliferação, migração e morte celular, sendo um dos fatores que

3

contribuem para o desenvolvimento da HPB20

. Quanto ao padrão histológico da HPB canina

há dois tipos bem caracterizados, a hiperplasia glandular, com proliferação das células

secretoras; e hiperplasia complexa, com hiperplasia glandular intercalada a focos de atrofia.

Neste último, há proliferação dos elementos estromais em associação a áreas atróficas ou de

ácinos dilatados, císticos e preenchidos por material eosinofílico12,20,21

(Figura 2).

FIGURA 2 - Fotomicrografia da próstata canina com

HPB cística. Evidenciação deácinos

acentuadamente dilatados (asterisco vermelho), irregulares e proliferação

estromal adjacente (asterisco preto).

HE, 200x.

Fonte: Faleiro8

Embora a HPB possa ocorrer concomitantemente a lesões potencialmente pré-

malignas, como a PIN e PIA, e malignas, como o PC22,23

, é improvável que a HPB represente

lesão pré-neoplásica24

.

1.1.2.Atrofia inflamatória proliferativa (PIA)

O termo atrofia inflamatória proliferativa, do inglês proliferative inflammatory

atrophy (PIA), foi proposto para designar focos de epitélio glandular proliferativo com o

aspecto morfológico de atrofia focal simples e inflamação concomitante24

. A atrofia da

próstata é identificada pela redução no volume glandular e estroma pré-existentes, sendo

caracterizada em dois padrões, difuso e focal. A forma difusa resulta da diminuição de

andrógenos circulantes e envolve a próstata como um todo, de maneira relativamente

uniforme. Ao contrário, a atrofia focal não se relaciona unicamente à diminuição de

andrógenos circulantes e ocorre como áreas de epitélio atrófico intercaladas com áreas de

epitélio de aspecto normal e são proliferativas, sendo que a ampla maioria associa-se à

4

inflamação, de maneira que essas lesões podem se originar em um cenário de estresse

oxidativo aumentado, possivelmente derivado das células inflamatórias próximas24-26

.

A inflamação é sugerida como fator etiológico capaz de incitar a carcinogênese

por causar dano celular e no genoma, promover a substituição celular e criar um

microambiente rico em radicais livres tóxicos, ácido aracdônico, proteases, citocinas e fatores

de crescimento que elevam a replicação celular, antiapoptóticos e a angiogênese27,28

. Portanto,

no que refere à carcinogênese, a inflamação pode atuar como agente iniciador, via efeitos

genotóxicos, ou como agente promotor, via efeitos citotóxicos29

. Ainda, segundo Nonomura

et al.30

e Sfanos e De Marzo26

, a inflamação crônica em tecidos benignos prediz o

desenvolvimento de câncer de alto grau (com escore de Gleason entre 7-10).

Sugar31

e Tomas et al.14

sugerem que na PIA ocorre equilíbrio entre proliferação e

perda celular por mecanismos que não os apoptóticos, uma vez que nessas lesões há

proliferação, mas não há perda celular por apoptose, e mesmo assim não há crescimento em

volume. Ainda, acreditam em injúria celular direta e que as células lesadas caem no lúmen

glandular e são eliminadas no ejaculado ou capturadas por macrófagos. Além disso, inferem

que o epitélio em regeneração suprima a morte celular programada, ao menos

temporariamente, para substituir as células perdidas, fato que poderia explicar a expressão

aumentada de B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) nas células secretoras da PIA, resultando

em níveis muito baixos de apoptose e embasando o conceito de que a PIA é uma lesão

regenerativa. Ainda, os fatores de crescimento poderiam estar sendo liberados tanto pelas

células epiteliais lesadas quanto pelas células inflamatórias presentes.

Há vários critérios para que se considere uma lesão pré-maligna, como a relação

epidemiológica, a presença anterior ao câncer, assemelhanças morfológicas e a proximidade

ou equivalência às suas características de malignidade32

. A PIN é considerada a lesão

precursora mais provável do carcinoma prostático invasivo por atender a tais critérios32

.

Apesar da PIA também ser apresentada como lesão prostática pré-maligna, destaca-se que

Anton et al.34

e Billis e Magna35

, não encontraram associações entre a atrofia prostática e

câncer. Já Wang et al.36

observaram que 70% das lesões de PIN e 28% das de PC eram

margeadas por PIA. Com isso, concluíram sobre a evidência direta entre as lesões e

mostraram transições morfológicas entre PIA e PIN, e PIA e PC na próstata humana. Além

disso, muitos focos de PIA compartilham alterações fenotípicas, genotípicas e moleculares

com PIN e PC, podendo esses focos compor o principal alvo de transformação neoplásica33-37

.

Putzi e De Marzo38

avaliaram a relação entre PIA, PIN e adenocarcinoma

prostático em humanos e observaram concomitância entre PIA e PIN, PIA e PC, e PIN e PC,

5

sendo as combinações de topografia variada, observando-se desde lesões adjacentes a

distantes. Dessa forma, os autores acreditam que embora não caracterize regra, a PIA pode

representar um precursor da PIN e/ou do PC, embora assumam que a relação topográfica não

seja prova definitiva dessa proposta. Enfatizam ainda que nem todas as lesões de PIN ou

pequenas lesões de PC estão associadas à atrofia, assim como nem todas as lesões atróficas

são precursoras de PIN ou PC.

Segundo Palapattu et al.27

, a PIA compreende resposta das células epiteliais

prostáticas normais a um microambiente de estresse, e regiões individuais de PIA que são

inábeis em debelar o dano oxidativo ao genoma podem progredir para PIN ou PC. Assim, as

células epiteliais da PIA são possíveis alvos de transformação neoplásica, passando ou não

por PIN, o que significa dizer que dão origem ao PC indireta ou diretamente. Contudo, alguns

tumores parecem se desenvolver diretamente da PIN enquanto outros ocorrem sem evidência

de lesões precursoras36,37

.

Em cães, alguns autores estudaram a relação da PIA com a evolução do

PC13,15,16,39,40

. Di Santis41

caracterizou morfologicamente e imunofenotipicamente a PIA e a

PIN, validando o potencial pré-maligno dessas lesões na próstata do cão. Rodrigues et

al.15

embora não tenham examinado o aspecto proliferativo da PIA, encontraram

imunomarcação para cicloxigenase-2 (COX-2) e fator de crescimento transformador beta

(TGF-β) em quantidade intermediária entre o tecido normal e o PC, concluindo tratar-se de

lesão pré-neopásica, já que o aumento na expressão desses reguladores de atividades celulares

é observado em processos neoplásicos.

Toledo et al.13

, com base nos critérios de De Marzo et al.25

e Di Santis41

,

propuseram a subdivisão da PIA canina de acordo com o grau de inflamação adjacente aos

focos atróficos, sendo discreta, quando há poucas células inflamatórias e estas são esparsas

em sua maioria; moderada, quando há agregados de células inflamatórias sem destruição

tecidual ou formação de folículos ou nódulos linfoides (Figura 3A); e acentuada, quando da

presença de agregados confluentes de células inflamatórias com destruição tecidual ou

formação de folículos ou nódulos linfoides (Figura 3B).

6

FIGURA 3 - Fotomicrografia de próstata canina com foco de atrofia inflamatória proliferativa

(PIA). A)PIA cominfiltrado inflamatório mononuclear intersticial (asterisco) e

atipias epiteliais com mais de uma camada de células epiteliais (seta), citoplasma marcadamente reduzido, núcleos aumentados e nucléolos evidentes (PIA-moderada),

HE, 400x; B) Atrofia acinar, dupla camada de células epiteliais (seta) e infiltrado

inflamatório mononuclear intersticial (asterisco) (PIA-acentuada), HE, 200x. Fonte: Toledo et al.

13

Croce et al.40

avaliaram a expressão imunoistoquímica de óxido nítrico sintase 2

(NOS-2), COX-2, p53 e Glutathione S-transferase pi 1 (GSTP-1) em focos de PIA e PC

canino e concluíram que o aumento na expressão de NOS-2, COX-2 relaciona-se ao estresse

oxidativo, muitas vezes gerado pelo infiltrado inflamatório, podendo o epitélio prostático ser

foco de alteração genética e transformação neoplásica. Ainda, a expressão aumentada do

GSTP-1 poderia conferir certa proteção ao dano oxidativo ao tecido prostático.

Faleiro et al.16

avaliaram a expressão imunoistoquímica das metaloproteinases de

matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e receptor de ativador de plasminogênio tipo uroquinase

(uPAR) na próstata canina com PIA e concluíram que a inflamação influencia positivamente a

atividade dessas enzimas. Com isso, ocorre maior atividade proteolítica na matriz extracelular

(MEC), possivelmente contribuindo para a remodelação e o processo de invasão tumoral e

metástase. Essa idéia é reforçada nos achados de Toledo42

, que observou maior expressão de

inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1) no tecido prostático com PIA, PIN e PC e

menor expressão de TIMP-2, demonstrando o desequilíbrio dessas proteínas nos focos de

PIA, o que contribui com a remodelação tecidual e possível grau de invasão tumoral e

metástase.

Rodrigues et al.15

ao analisar a expressão gênica de COX-2 e estudar ascélulas da

camada basal pela marcação imunoistoquímica de p63 na PIA e no PC canino,

observarammaior expressão gênica de COX-2 no estroma em relação às células epiteliais, e

A B

7

aumento da proliferação e redução daapoptose das células secretoras na PIA e no PC. O

mesmo ocorreu com as célulasbasais na PIA, que apresentaram maior índice proliferativo e

menor taxa de apoptose.Ainda, sendo a expressão de COX-2 na PIA maior no compartimento

estromal, revela o importante papel dessa enzima na carcinogênese prostática canina.

Fonseca-Alves et al.39

analisaram por imunoistoquímica a expressão de c-myc,

NKX3.1,E-caderina e p63no tecido prostático canino com HPB, PIA e PC, e observaram que

a expressão de c-myc eleva-se nos casos de PC e PIA em comparação ao tecido prostático

normal. A proteína NKX3.1 apresentou-se reduzida em 94,75% dos casos de PC e em 100%

dos de PIA em comparação ao tecido normal. Ainda, a expressão de E-caderina apresentou

menor expressão nos tecidos com PC em relação aos com PIA e normal, bem como a

expressão de p63 foi maior em PC e PIA do que no tecido normal. Dessa forma, demonstram

que a carcinogênese do tecido prostático canino pode estar relacionada com a proliferação de

células basais, ganho de função de c-MYC e perda da expressão da proteína NKX3.1 e E-

caderina, bem como potencial envolvimento das células basais no desenvolvimento da PIA

para PC.

1.1.3.Neoplasia intraepitelial prostática (PIN)

Inicialmente, o termo displasia foi utilizado para designar alterações não usuais no

epitélio glandular prostático e diferenciá-las de lesões inquestionavelmente benignas e de

proliferações verdadeiramente neoplásicas, e abrangia várias alterações, como as de natureza

atrófica, inflamatória e metaplásica, além de hiperplasias atípicas glandulares e intraductais43

.

Em 1986, Mcneal e Bostwick44

propuseram que a displasia intraductal na próstata humana

poderia representar uma lesão pré-maligna, constituindo-se no precursor biológico direto do

PC. O termo neoplasia intraepitelial prostática (PIN) foi proposto por Bostwick e Brawer43

e

endossado consensualmente por Drago et al.45

, com o intuito de substituir termos sinônimos

como displasia intraductal, hiperplasia atípica acinar, hiperplasia com alterações malignas,

marcada atipia e displasia ductoacinar, unificando a terminologia PIN para designar as

alterações displásicas intraepiteliais da próstata humana46

.

A PIN é observada em mais de 85% dos casos de PC e em 43% de forma contígua

às lesões prostáticas benignas da próstata humana44,46

, sendo que estudos acerca do

comportamento biológico dessa lesão comprovaram seu aspecto pré-maligno43-47

.

Os mecanismos de proliferação e diferenciação celular estão alterados na PIN,

pois são observadas células basais atípicas, com potencial proliferativo, migrando para o

compartimento secretor, enquanto no tecido normal ou hiperplásico a capacidade proliferativa

8

é restrita à camada basal15,41

. Com a indiferenciação celular, tende a ocorrer perda gradativa

das células basais, facilitando a extensão da lesão para o estroma e sua transformação em

carcinoma invasivo, com aumento da atividade proliferativa, neovascularização, instabilidade

genética e variação na quantidade de DNA44,46

.

Histologicamente, a PIN consiste de alterações nos ductos ou ácinos, geralmente

multifocais. A lesão pode ser de baixo grau (LGPIN) ou de alto grau (HGPIN). Focos de

LGPIN caracterizam-se por ductos ou ácinos com epitélio hipercelular, condensado e

irregular, com marcada variação do tamanho nuclear. Núcleos alongados, hipercromáticos e

pequenos nucléolos podem estar presentes. A HGPIN é semelhante à LGPIN, porém a alta

celularidade e a estratificação celular são mais evidentes e a variação do volume nuclear entre

as células é menor, pois a maioria possui núcleo aumentado. Nucléolo proeminente e

frequentemente múltiplo é uma característica da HGPIN. Além disso, a membrana basal do

epitélio da próstata humana apresenta-se íntegra e a lesão apresenta crescimento lento46

(Figura 4).

O primeiro relato mencionando PIN em cães descreve a presença da lesão em 19

(66%) de 29 glândulas com diagnóstico de adenocarcinoma18

. As características histológicas

da PIN na próstata canina são similares àquelas descritas na glândula humana48

, a exceção da

continuidade da camada de células basais, a qual no cão é naturalmente descontínua18

.

Assim como Waters e Bostwick48

, que observaram incidência de 55% de PIN em

cães idosos e não castrados sem que apresentassem evidências clínicas de câncer, Di Santis41

observou 12,5% de PIN canina nas mesmas condições. No entanto, Aquilina et al.49

observaram PIN em 72% dos animais com PC. Os autores consideraram a frequente

associação entre PIN e adenocarcinoma um forte indicativo de que a PIN compreenda lesão

pré-maligna. Apesar da incidência da lesão ter sido baixa nos animais sem câncer prostático,

os mesmos acreditam que a lesão possa ter sido subestimada pelo fato de se ter avaliado

apenas uma amostra do tecido prostáticodesses animais. Ainda segundo esses autores48,49

, a

prevalência da PIN em cães e humanos é influenciada pela idade e por andrógenos

testiculares, constituindo a única espécie não humana em que a PIN se desenvolve

espontaneamente.

9

FIGURA 4 - Fotomicrografia de próstata canina com foco de PIN.

Epitélio acinar estratificado e displásico, com variação do

tamanho nuclear, nucléolo evidente e perda de diferenciação citoplasmática (seta). HE, 400x.

Fonte: Faleiro 8

A PIN nas próstatas canina e humana apresenta-se de forma semelhante no que

diz respeito à morfologia e associação com o câncer46,48

. Assim, a próstata canina é apontada

como modelo para a determinação dos fatores que regulam a aparente progressão do epitélio

benigno para PIN, e deste para o carcinoma invasivo18,48

.

1.1.4. Carcinoma prostático(PC)

As neoplasias da próstata canina são comumente epiteliais malignas, de estrutura

glandular ou acinar50

, sendo o adenocarcinoma e o carcinoma indiferenciado os tipos

histológicos mais comuns50,51

. Nos cães, os PC são raros, de baixa prevalência e relatados

com maior frequência em animais adultos e idosos21,52

, oposto ao que ocorre no homem, para

o qual o PC é a forma mais comum de câncer e a segunda causa de óbito entre os homens10,11

.

Vale destacar que a lesão é extremamente rara em qualquer outra espécie animal52,53

.

A maioria dos PC no homem e no cão apresenta padrão intra-alveolar e

morfologia heterogênea, variando de pequenos focos de células relativamente bem

diferenciadas a camadas de células anaplásicas, lembrando carcinoma de células renais claras

ou carcinoma de células transicionais52,54

(Figura 5). Em associação aos focos de PC canino é

possível encontrar focos de HBP, dilatação glandular e inflamação supurativa ou

linfoplasmocitária significativa3. Os PC no homem são classificados de acordo com o sistema

10

de Gleason, em que escores são atribuídos aos tumores com base na diferenciação

arquitetônica, padrões de crescimento em relação ao estroma e atipias nucleares das células

em amostras coradas em HE, tornando o sistema um bom indicador da progressão e evolução

clínica da doença55

.Padrões semelhantes aos observados no sistema Gleason foram

encontrados nas neoplasias da glândula canina, mas sem significado prognóstico, restringindo

sua utilização na rotina diagnóstica6.

Acredita-se que o PC na espécie humana tem início em lesões pré-malignas, a

exemplo das displasias, em que as células sofrem alterações substanciais, diferem-se das

normais e adquirem características proliferativas e de dominância sobre as células

adjacentes56

. Nesse contexto, postula-se que a fase inicial do PC corresponda à PIN de alto

grau25,43,47

, encontrada em 82% dos PC invasivos e em 43% das glândulas de homens acima

de 50 anos sem sinais de câncer44

. No cão, a ocorrência da PIN de alto grau com PC

concomitante foi relatada entre 30-72% dos casos49,57

. Em contraste, na ausência de PC, a PIN

foi encontrada em 3% dos casos por Madewell et al.57

e não relatada por Aquilina et al.49

.

É sabido que o PC no homem está associado a mutações em genes prostáticos

susceptíveis, como TP53 e ErbB2, juntamente a defeitos somáticos em genes como NKX3.1,

C-MYC, ErbB1, PTEN, CCND1, CDKN1B, CDKN1A e o gene receptor de andrógeno58

(AR). Já em cães, pouco se conhece sobre a patogênese molecular e origem dos PC91

. De

acordo com Leroy e Northrup52

, não foram identificadas mutações somáticas predispondo os

cães ao maior risco para o desenvolvimento de PC, masWinkler et al.59

afirmam que há

anormalidades cromossômicas no PC canino. Entretanto, Ganem et al.60

destacam que não se

pode afirmar se essas anormalidades cromossômicas no PC humano ou canino são causa ou

consequência da transformação neoplásica.

Fatores endógenos e exógenos têm sido considerados predisponentes ao risco do

desenvolvimento do PC humano, incluindo histórico familiar, raça, idade e fatores

nutricionais8,52

, o que não se extrapola aos cães e dificulta a identificação das alterações

genéticas associadas ao processo52

. Devido à natureza agressiva da neoplasia e da falta de um

teste de identificação de cães com PC em estágio inicial, metástases são observadas em

aproximadamente 80% dos casos e localizadas preferencialmente nos linfonodos pélvicos,

ilíacos internos e externos, até corpos vertebrais, sistema esquelético e pulmões11,52,61

.

No cão considera-se espontânea a etiologia do PC, mas não há dúvidas quanto ao

envolvimento hormonal62

. Johnston et al.1 relataram que a depleção andrógena pós-

orquiectomia resulta em involução de lesões proliferativas prostáticas benignas, mas não de

PC. Nesse sentido, Bell et al.63

estudaram o comportamento biológico do PC em cães

11

castrados e não castrados. Observaram metástases em 89% dos animais e curiosamente as

lesões pulmonares prevaleceram nos cães orquiectomizados. Além disso, o tipo histológico

observado com maior frequência foi o adenocarcinoma pouco diferenciado. Por isso, sugere-

se que o PC seja mais agressivo nos cães castrados, mesmo considerando que os não castrados

são mais susceptíveis a doenças prostáticas63,64

.

Para Teske et al.61

, a castração favorece a progressão do processo neoplásico. Já

Mahapokai et al.65

descreveram que o aumento no número de células basais na próstata de

animais castrados sugere que os PC mais agressivos possam ter origem nessas células, visto

que as mesmas são andrógeno-independentes, sobrevivem e proliferam ativamente na

ausência desses hormônios. Interessante que Garnick66

também apresenta a possibilidade da

vasectomia aumentar o risco de PC na espécie humana. Já Swinney67

apresentou duas

hipóteses de etiologia para a PC em cães orquiectomizados: 1) as células envolvidas no tumor

são hormônio-independentes; 2) as neoplasias sofrem influências de hormônios

extratesticulares, como os produzidos na adrenal.

FIGURA 5 - Fotomicrografia de carcinoma prostático canino. Áreas de

proliferação celular com atipias e perda da conformação

acinar. HE, 400x.

Fonte: Faleiro8

Para Pylkkänen et al.68

, diferenças significativas entre o PC humano e canino,

como baixa incidência, longo período de latência e grau de resposta hormonal descartam o

12

cão como modelo prático para a carcinogênese prostática humana. Contudo, Waters e

Bostwick18

, Madewellet al.57

, Lai et al.6,Leroy e Northrup

52, Anidjar et al.

10 e Keller et al.

11

apontaram semelhanças relevantes entre as espécies, incluindo desenvolvimento embrionário,

anatomia macroscópica e microscópica, desenvolvimento em idade avançada, concomitância

com focos de PIN, localização anatômica e propensão para metástases ósseas que, segundo os

autores, fazem do cão modelo experimental adequado para o estudo do PC humano.

1.2.Carcinogênese

Os processos neoplásicos sejam benignos ou malignos ocorrem em decorrência de

alterações nos genes, cujas mutações podem ser de origem hereditária ou adquiridas pelas

células somáticas69,70

. Os eventos moleculares envolvidos na gênese neoplásica são os

mesmos entre as diferentes espécies animais, e geralmente resultam de mudança do estado

celular a partir do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas, que desorganizam os

eventos celulares normais68

.

De acordo com Clark71

, o processo neoplásico é considerado uma forma aberrante

de vida, de enorme complexidade pelo ponto de vista evolutivo, não sendo explicável única e

exclusivamente por suas modificações no material genético celular. Segundo Solomon et al.72

,

um neoplasma é decorrente de uma série progressiva de alterações gênicas irreversíveis que

ocorrem em um único clone celular, como resultado de uma série de fatores, incluindo

alterações nos oncogenes sob a ação de fatores de crescimento, assim como nos genes

supressores tumorais. É necessário ainda ocorrer fixação da lesão e conversão gênica após a

replicação do DNA e a divisão celular, o que compreende a primeira etapa (iniciação) de um

evento complexo,de quatro fases, conhecido como carcinogênese ou gênese neoplásica69,70

.

Na fase subsequente, a promoção, acontece diferenciação celular entre célula

normal e neoplásica pela capacidade de escape aos mecanismos homeostáticos do organismo,

favorecendo uma proliferação desorganizada e descontrolada, só cessada quando a neoplasia

já não consegue mais realizar o metabolismo apenas por difusão. Se continuar crescendo, as

células ao centro morrerão por necrose ou apoptose. Acredita-se que microtumores nesse

estágio possam sobreviver em estado dormente, em que o número de células que proliferam

se equivaleria ao das que morrem69,70

.

Para continuar a progredir e se manifestar, na terceira e quarta fases da gênese, a

célula neoplásica precisa induzir a produção de fatores pró-angiogênicos capazes de estimular

as células endoteliais dos vasos sanguíneos adjacentes a degradar sua lâmina basal e migrar

13

em sua direção. Isso confere ao tumor maior potencial invasivo e consequentemente maior

potencial metastático70,72

(Figura 6).

FIGURA 6 - Representação esquemática das fases da carcinogênese. Iniciação, promoção,

progressão e manifestação.

Fonte: Adaptado de INCA73.

Diante disso, alterações na expressão de proto-oncogenes e genes supressores

tumorais desempenham papel-chave na gênese neoplásica. A disfunção na produção de seus

produtos protéicos leva à regulação anormal das vias de sinalização que controlam o ciclo

celular, a apoptose, a estabilidade genética, a diferenciação celular e as reações de

morfogênese. Alterações nesses importantes processos fisiológicos são responsáveis tanto

pelas etapas iniciais de transformação das células neoplásicas, quanto pela determinação da

progressão do tumor, resultando no desenvolvimento de tumores malignos72

.

Uma das características mais importantes das células malignas é a capacidade de

proliferação, ou seja, a célula normal perde o controle da sua própria divisão, rompendo assim

uma série de barreiras fisiológicas, os pontos de controle ou checagem do ciclo celular, para

tornar-secancerosa71,72

.

1.3.Ciclo e crescimento celular

O ciclo celular é composto de uma sequência ordenada de fases, incluindo G0,

G1, S, G2 e M. Em G0, a célula atinge sua diferenciação terminal e está quiescente. Quando

estimulada a proliferar, esta entra em gap 1(G1 ou primeiro intervalo), período em que

aumenta de tamanho e prepara as proteínas de que necessita para a síntese de DNA. Em G1, a

célula é susceptível às condições do microambiente, que pode parar a divisão em condição

desfavorável. No entanto, se ultrapassar o ponto de restrição (ponto R), a divisão celular

ocorrerá independente dessas condições. Na fase subsequente, de síntese (fase S), ocorre a

síntese de DNA, que será replicado na fase gap 2 (G2 ou segundo intervalo). No início de G2

14

há outro ponto de controle importante, em que será verificada a qualidade do DNA replicado.

Na fase mitótica (M), os cromossomos se condensam na prófase, na metáfase se alinham ao

centro da célula pela ligação ao centrômero, na anáfase separam e migram para os pólos

opostos do fuso e, na telófase, as células se dividem e o DNA duplicado será dividido

igualmente dentre as duas células filhas. Em caso de anormalidades na divisão dos

cromossomos, a mitose é interrompida70,72,76-78

(Figura 7).

FIGURA 7 -Ciclo celular. A) Representação gráfica esquemática do ciclo celular

com as fases G0, G1, S, G2 e M, e os pontos de checagem do ciclo (setas vermelhas). B) As fases da mitose. Interfase, prófase,

metáfase, anáfase e telófase.

Fonte: http://homepage.mac.com/enognog/checkpoint.htm

Nessa sequência ordenada de fases há quatro pontos de verificação que garantem

que uma fase não se inicie antes do término da anterior, bem como confirmam o êxito dos

eventos moleculares de cada fase. Assim, o primeiro ponto de checagem ocorre ao final de

G1; o segundo na fase S, impedindo a célula de avançar no ciclo antes que o DNA complete

sua duplicação; o terceiro ocorre ao final de G2, com a principal função de conferência da

integridade do DNA; e o quarto ponto ocorre em M, mais precisamente na anáfase,

verificando o correto funcionamento do fuso mitótico e associação às fibras dos mesmos, para

que a divisão celular aconteça corretamente72,76,77

.

Esses eventos são controlados pela expressão coordenada do gene da

proteínaretinoblastoma (pRB), e pela interação entre as ciclinas e as quinases dependentes da

http://homepage.mac.com/enognog/checkpoint.htm

15

ciclina (CDK), e as proteínas inibidoras de CDK (CDKIs)70,75,77

. Essas são, portanto,

responsáveis por regular a atividade de um amplo número de proteínas que implicam na

duplicação do DNA e na mitose, com a fosforilação das mesmas em sítios reguladores

específicos, ativando algumas e inibindo outras, mas coordenando-lhes as atividades76,77

.

O crescimento e a diferenciação celular são processos essenciais para os seres

vivos, pois a proliferação das células é necessária para que ocorra a embriogênese, o

crescimento e o funcionamento adequado de diversos tecidos adultos75,76

. Dessa forma, a

população celular é controlada por sinais do microambiente, que podem estimular ou inibir a

sua proliferação. Um excesso de estimuladores ou a deficiência de inibidores levam a célula a

proliferar, entretanto, em casos neoplásicos essa proliferação se dá de forma descontrolada70

.

O principal foco da investigação sobre a proliferação celular tem sido o

entendimento dos mecanismos que regulam o estado proliferativo, trabalho que remete à

identificação dos fatores e dos respectivos receptores de crescimento, bem como das vias de

transdução de sinais e transcrição que permitem as células iniciar e manter o ciclo celular78

.

Em um tecido adulto, o tamanho da população celular é determinado pelo balanço

entre proliferação, diferenciação celular e morte por apoptose70,76

(Figura 8). Entre as

alterações promovidas pelas células neoplásicas, encontram-se as anormalidades na resposta

celular a fatores de crescimento e seus receptores que promovem a proliferação celular, que

inibem apoptose e habilitam células cancerosas a disseminar e a estimular a angiogênese70,75

.

FIGURA 8 - O número de células de um tecido pode ser alterado

pelo aumento ou diminuição da taxa de recrutamento

das células tronco, pela morte celular por apoptose

ou por alterações nas taxas de proliferação ou diferenciação.

Fonte: Adaptado de McGavineZachary70

.

16

A síntese de proteínas é a manifestação de um gene. Por isso, genes que codificam

proteínas que são sintetizadas em um evento de divisão celular normal são denominados

proto-oncogenes, e sua principal função é induzir ou estimular a progressão do ciclo. Quando

esses genes sofrem mutações são chamados oncogenes, cuja ação permitirá ganho de função à

célula mutante, conferindo a esta vantagens de crescimento e desenvolvimento sobre as

células normais. Há ainda genes conhecidos como supressores tumorais ou antioncogenes,

que possuem ação de proteção ou são bloqueadores do ciclo celular, que quando sofrem

mutações perdem a capacidade de realizar suas funções e acabam por permitir a proliferação

celular descontrolada75-78

. Esses genes codificam proteínas que estão envolvidas na inibição

da proliferação celular e que são cruciais para o desenvolvimento e diferenciação celulares79

.

1.4. Fatores de crescimento

Os fatores de crescimento são um conjunto de substâncias, a maioria de natureza

protéica, que juntamente com hormônios e neurotransmissores desempenham importante

função na comunicação intercelular70,78

. Em baixas concentrações, atuam em células alvo in

vivo ou in vitro como mitógenos, isolados ou sinergicamente a outros fatores, por meio da

interação primária com receptores específicos da superfície celular. Fosforilam e ativam uma

cascata de sinais que culmina em ativação de um ou vários genes (transdução de sinal). A

função dos fatores de crescimento é regulada por diferentes mecanismos que controlam a

ativação do gene do fator de crescimento por mecanismos regulatórios em nível transcricional

e da traducional e a modulação da emissão do sinal pelo receptor70,76,78

.

Os fatores de crescimento atuam por três mecanismos, autócrino, parácrino e

endócrino. No primeiro, uma mesma célula produz e responde ao fator de crescimento. No

segundo, uma célula recebe a ação do fator de crescimento produzido por uma célula

adjacente. No terceiro, o fator de crescimento é secretado por uma célula, transportado pela

circulação e age em células distantes76,78

.

Dentre os fatores de crescimento de interesse na gênese do PC destacam-se: fator

de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformador alfa e beta (TGF-α;

TGF-β), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento de

queratinócito (KGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento

plaquetário (PDGF) e fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)81

(Quadro 1).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Gene

http://pt.wikipedia.org/wiki/Transdu%C3%A7%C3%A3o_de_sinal

17

QUADRO 1 - Fatores de crescimento, células de origem, sítios alvo e suas funções no tecido

prostático normal e neoplásico

FC Célula origem Sítios alvo Papel napróstata

normal

Papel no PC

EGF Superfície

luminal do

tecido epitelial

EGFR na superfície do

tecido epitelial baso

lateral

Regula o

crescimento

Superexpressão em

metástase e invasão

tumoral

TGF-α Estroma EGFR na superfície de células epiteliais

basolaterais

Regulação do crescimento

Superexpressão nas células epiteliais

TGF- β Estroma e

músculo esquelético

TβRI e TβRII na

superfície das células epiteliais

Induz apoptose,

controla crescimento celular

via bFGF

Superexpressão no PC

IGF-I Estroma IGF1R na superfície da

célula epitelial, sequestrado e degradado

por IGF2R

Promove

crescimento e diferenciação

celular

Expressão epitelial e

níveis séricos aumentados

FGF Estroma bFGF receptor em

células estromais no tecido normal e presente

nas células epiteliais no

PC

Regulação do

crescimento

Superexpresso em

metástase e promove angiogênese

KGF Estroma e epitelial

FGFR2 receptorna célula epitelial

Mediador da ativação

androgênica

Produção epitelial com progressão

independente de

andrógenos

PDGF Estroma e epitelial no PC

PDGFα receptor em células epiteliais no PC

Baixa expressão Aumento da expressão dos receptores no PC

VEGF Epitelial Células endoteliais Não definido Expressão aumentada

no PC

PC - carcinoma prostático Fonte: Adaptado de Hellawell e Brewster

80.

1.5. Receptores de fator de crescimento epidérmico -EGFR/Her1 e Her2/c-erbB-2

O fator de crescimento epidérmico (EGF) é um membro da família dos fatores de

crescimento (FC) que compartilha o mesmo receptor, o receptor de fator de crescimento

epidérmico (EGFR), com o fator de crescimento transformador alfa (TGF- α). É detectado em

praticamente todo o organismo, principalmente saliva, secreções mamárias, prostáticas, da

vesícula seminal e na urina, na qual se encontra em alta concentração82-84

.

O eixo EGF, composto pelos fatores de crescimento EGF e TGF-α, seus

receptores (EGFR), receptores de andrógenos (AR), testosterona, hormônio hipotalâmico

(LH-RH) e antígeno prostático específico (PSA), é considerado uma das formas de ativação

não androgênica dos receptores androgênicos nas alterações prostáticas malignas, sendo esse

eixo relacionado à progressão do PC. Nesse âmbito, a mediação da atividade mitogênica dos

ligantes EGF e TGF-α, utilizando vias de ativação parácrina e autócrina, é feita pelos

18

receptores EGFR e AR, por modulação do LH-RH ou da testosterona e por ação direta do

EGF em ambos os receptores, mesmo em meio ausente de andrógenos, no qual o PSA

representa importante protease do EGFR84

.

Na próstata, o EGF é produzido no tecido normal, na HPB e no PC82,84,86

, sendo

que, para Pina et al.82

, não há relação entre níveis séricos de EGF e carga tumoral ou escala

de Gleason. Embora no PC o EGF circulante se manifeste com hiperprodução autóloga em

aproximadamente 50% dos casos, provavelmente o seu principal papel será o da atividade

autócrina, não só na diferenciação neuroendócrina, como também no estímulo migratório

celular do câncer em fase androgênica. Contudo, a baixa imunorreatividade de EGFR está

associada a prognóstico favorável em pacientes com câncer de próstata86

.

A família do EGFR, um receptor tirosina-quinase, desempenha papel importante

na determinação da linhagem celular, na morfogênese de vários órgãos e na sobrevivência das

células no adulto. A superexpressão contribui para a tumorigênese, induzindo as células a

proliferar e resistir a apoptose81-88

. A família compreende os receptores EGFR ou Her1, Her2

ou c-erbB-2, Her3 ou c-erbB-3 e Her4 ou c-erbB-4, codificados pelos genes ErbB

(erythroblastic leukemia viral oncogene homolog) 1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4,respectivamente.

As proteínas produzidas pelos membros dessa família possuem em comum estrutura

composta de domínio de ligação extracelular, este constituído por quatro subdomínios (L1,

CR1, L2 e CR2 - I, II, III, IV), dispostos em repetição de duas unidades e separados por

resíduos ricos em cisteína; um segmento lipofílico transmembrana; e área citoplasmática com

domínio de atividade tirosina-quinase, a qual possui locais de auto fosforilação para regulação

em cauda c-terminal85,87-89

(Figura 9).

O receptor EGFRpossuiestrutura que compreendedomíniode ligação extracelular,

domínio hidrofóbico transmembrânico edomínio intracelularcom domínio de tirosina-quinase

para a transdução desinal. Ao ser ativado pela ligação com o EGF ou TGF-α, promove sua

dimerização ou a heterodimerização comoutro membrodafamíliaerbB. Issoleva àativaçãoda

tirosina-quinase associadaao receptoreresulta em uma cascata de sinalização de efeitos

diversos, incluindo migração de células, maturação, diferenciação, metástase,

angiogêneseeinibição daapoptose85,89,90-93

. O receptor EGFR pode estar superexpresso em

uma variedade detumores sólidos,incluindo cancer de mama, cabeçaepescoço, pulmão e

próstata90

, sendo, nesse caso, associado à estadio avançado, prognóstico ruim e resistência à

quimioterapia, hormonioterapia e radioterapia92-94

.

19

FIGURA 9 - Receptores da família do EGF (EGFR, Her2, Her3,

Her4) apresentando sítio de ligação extracelular,

porção transmembrana e domínio da tirosina quinase intracelular.

Fonte: Adaptado de Ciardello e Tortora144

.

Segundo Nicholson et al.54

e CiardielloeTortora90

, o EGFRpodeseravaliadode

várias formas, sendo a imunoistoquímica (IHQ) a melhor e mais comum técnica utilizada para

essa avaliação. O método da PCR para detectar DNA proporciona informações sobrea

amplificação, deleçãooumutaçãodo gene. No entanto, nãoreflete a quantidade deproteína

produzida. Ainda, a técnica de PCR utilizada para avaliaros níveis de mRNA pode resultar em

problemasde degradação econtaminação do RNA.

Os receptores Her2e Her3funcionam como co-receptores, pois Her3 possui

domínio quinase inativo, que se ativa ao ligar com Her2, o qual não possui ligante específico

para ser ativado e, para isso, utiliza outros membros da família (EGFR, Her3 ou Her4)95

.

Yarden e Sliwkowski96

ressaltaram que homodímerossão menosmitogênicos em

comparação aos heterodímeros, e assim possuem baixa atividade detransformação. Dessa

forma, o Her2 por ser preferencialmente heterodímero e possuir maior atividade de tirosina-

quinase tende a ser mais potente e gerar sinais intracelulares intensos, o que confere maior

potencial mitogênico. Portanto, níveis deoutrosreceptores da famíliaErbB, em particular Her2,

pode afetar significativamente asinalizaçãodo EGFRno câncer em humanos. Ainda, para Daly

et al.97

e Pal e Pegram 98

, o Her2é o par de eleição aos demais membros da família no

processo de heterodimerização. Isso ocorre devido à sua conformação estrutural, que promove

a exposição permanente dos domínios de dimerização99

.

Os ligantes para a família EGFR incluem EGF, amphiregulin e TGF-α, os quais

se ligam preferencialmente ao EGFR, enquanto betacellulin (BTC), heparina EGF (HB-EFG)

20

e epiregulin (EPR) ligam-se ao EGFR e Her4. Neuregulinas 1 (NGR1) e 2 (NGR2) ligam-se

preferencialmente a Her3 e Her4, e NGR3 e NGR4 somente a Her489,100

(Quadro 2). Assim, a

formação do complexo para a ativação do Her2 ocorre pela sua união com um fator de

crescimento, por meio de um ligante, quando é desencadeada sua função tirosina-quinase e

autofosforilação da tirosina. Isso desencadeia uma série de eventos em cascata, resultado da

transmissão de sinais através da membrana celular e do citoplasma até o núcleo, onde ocorre

ativação gênica, estimulação da mitose, bloqueio da apoptose e estimulação da

neoangiogênese tumoral100

.

QUADRO 2 - Fatores de crescimento que ativam (+) a família de

receptores EGFR.

Fonte: Adaptado de Linggi e Carpenter

100.

Embora a IHQ constitua a técnica comumente utilizada para avaliaros níveis

protéicos de EGFR no tecido, compreende método estritamentequalitativo, sem sistemade

pontuação validado, de interpretação subjetiva e que avalia apenas a presença e não a

atividade da proteína. Além disso,mostrauma imagemestática, não funcionaldoestadocelular,

quando écada vez maisevidenteque o EGFR épartedeumsistemaaltamentedinâmico,

ondealteraçõessignificativas podem ocorreremcurtos períodos detempo. Assim, para uma

abordagem dinâmica da funcionalidade deEGFRse faz necessária a avaliação conjunta dos

níveis da proteína pela expressão de seu RNAm utilizando a técnica de PCR.No entanto, pode

ser simplistaconsiderar a IHQcomo o único fator ao fracasso da correlação entre EGFR e

prognósticoou eficácia de tratamento,deve-se considerar auniãocom aexpressão de Her289

.

O receptor Her2pode ter sua expressão aumentada no processo de transformação e

progressão tumoral, sendo que a redução de p27, um inibidor de ciclinas, pode induzir

superexpressão desse receptor100

. Ainda, o aumento de Her2e a redução de EGFR estão

21

relacionados à carcinogênese prostática101

. A expressão de Her2é regulada por fatores de

crescimento e sua transformação a oncogene ocorre geralmente por amplificação gênica,

originando síntese protéica elevada. Quando o gene HER-2 é superexpresso, a concentração

protéicaéde dez a 100 vezes maior do que no epitélio normal, porém sem que ocorra alteração

estrutural da proteína100

, ou seja, o gene está superexpresso na ausência de mutação gênica.

Geralmente, os carcinomas com expressão positiva para Her2 apresentam alto

grau de indiferenciação histológica, alta taxa de proliferação, baixa expressão de bcl-2 e dos

receptores de estrógeno e progesterona103

. O aumento na expressão de Her2 relaciona-se à

maior agressividade dos carcinomas em estágio inicial ou avançado, podendo ser indicador de

prognóstico de recidivas e de estimativa da sobrevida103

. Ainda, segundo Gutierrez e

Schiff104

, tumores que expressam Her2 possuem maior percentagem de aneuploidia, maior

propensão de metástase e resistência à terapia endócrina.

Em veterinária, a expressão deEGFRjá foidetectada nos tumoresmamários105,106

,

cerebrais primários107

, carcinomas nasais108

, carcinomas de pulmão109

, e gástricos110

. A

superexpressão de Her2 foi relatada entre8,3%168

e 40%173

das neoplasias mamárias

caninas105,106

, e em 61% dos tumores gástricos em cães110

. Entretanto, não há relatos acerca da

expressão desses receptores na próstata canina. Ressalte-se que EGFR e Her2 são

biologicamente semelhantes nas espécies canina e humana, com 80% de homologia quanto

aos genes que codificam as proteínas111

.

Beselga112

em um estudo com tumores mamários de cadela comparou a

imunoexpressão de Her2 utilizando anticorpos de diferentes clones (CB11, 4B5, TAB250 e

SP3) e observou que apenas aqueles que reconhecem o domínio intracelular (CB11 e 4B5)

detectam o receptor Her2nos tecidos neoplásicos de mama canina. Ainda, o autor não

observou correlação positiva entre a superexpressão de Her2 e o grau de malignidade ou o

tipo histológico. Já Hus et al.175

observaram que cadelas com tumor de mama Her2 negativo

apresentaram menor taxa de sobrevivência em um período de dois anos. Segundo os autores,

não se conhece a razão da diferença observada entre as espécies canina e humana no que diz

respeito a superexpressão de Her2 e sua relação com agressividade tumoral a sobrevida. Os

autores complementam que os resultados sugerem queHer2desempenha papel naformação de

tumormamáriocanino,mas a agressividade tumoral pode não estar diretamenteassociada a

superexpressão de Her2.

Hsu et al.113

também observaram associação significativa entre superexpressão de

Her2 eovariosalpingohisterectomia (OSH). Os tumores de cadelassubmetidas aOHSantes ou

nomomento da retirada dotumor apresentaram maior propensão à superexpressão de Her2 em

22

comparação àqueles tumores provenientes de cadelas não submetidas a OSH. Também não

observaram correlação entre expressão tumoral de Her2 e peso corporal, estágio e tamanho do

tumor, glândula afetada, número de tumores, classificação histológica, infiltração linfática,

metástases à distância e morte. Já Dutraetal.114

, utilizando 48 amostras de tumor de mama

canino maligno e 22de tumorbenigno observaram superexpressão de Her2em35,4% das

amostras malignas, sendo as amostras benignas negativas para Her2. Os autores também

encontraramcorrelação positiva entreHer2epleomorfismonuclear, contagem de mitosee

diferenciação histológica, oposto relatado por Hsuetal.113

eBeselga112

, sugerindo que a

expressão de Her2está associada a crescimento e divisão celular nos tumores mamários

caninos. Ao final, os autores concluiram quanto a estreita relação entre morfologia e

imunofenótipo nos tumores mamários das cadelas, a exemplo do que ocorre nos tumores

mamários da mulher.

1.6. Inibidores de ciclina dependente de quinase - p21, p27 e p53

O ciclo celular é regulado por um grupo de inibidores de ciclina dependentes de

quinase (CdkI) que inibem a produção de Cdk. Duas famílias de CdkI são descritas de acordo

com seu mecanismo de ação, a família dos inibidores de Cdk4 (INK4), que compreende as

proteínas p16INK4A

, p15INK4B

, p18INK4C

e p19INK4D

(ou p14ARF

), responsáveis por inibir os

complexos Cdk4/ciclina D1 e Cdk6/ciclina D1 na transição G1-S; e a família dos Cdk-

interacting protein 1/inibidor de proteína quinase (CIP/KIP), que compreende as proteínas

p21WAF1/CIP1

, p27KIP1

e p57KIP2

, que atuam inibindo a atividade de múltiplos complexos Cdk1-

Cdk2-Cdk4-Cdk6/ciclina D176,115

(Figura 10).

23

FIGURA 10 - Representação esquemática do ciclo celular com as fases G0,

G1, G2 e M,e ação de proteínas estimuladoras (ciclinas e cdk’s),inibidoras(p21, p27,p57, p16, p15,p18 e p19), e de

controle do ciclo (c-myc).TGF-β induz a produção dos

inibidores. Fonte: adaptado de Ward

74.

O inibidor de ciclina dependente de quinase1A(CDKN1A) é o genequecodifica a

proteína p21, a qual se associa a mecanismosde parada do ciclo celular entre as fases G1-S, a

reparo do DNA, a mecanismos antiapoptóticos116

, a proliferação e diferenciação celular com

indução à senescência e mecanismo de proteção contra transformações malignas115-118

. A

função da p21, mediada pela proteína p53, relaciona-se a sua concentração, já que em baixos

níveis de p21 ocorre efeito estimulante aos complexos Cdk4/ciclina D1115-120

. A ausência de

p21 leva a um déficit na capacidade de parada do ciclo celular em G1, em resposta aos danos

no DNA. No entanto, o aumento da expressãodep21nãoestá necessariamente ligado àparada

do crescimento, tendo em vista que esta desempenha papelduplo, atuando como inibidor e

estimulador da atividadede ciclina/Cdk117

. Aredução ouausênciadep21temsidomostradaem

culturas celulares detumoressemp53,ouque contenham uma forma mutanteafuncionaldo

geneTP53119

e do gene que codifica aproteína fosfatase tensina homologa (PTEN)121

, uma vez

que a expressão da proteína p21 reflete o estado funcional da proteína p53119-122

.

Mutações somáticas no gene CDKN1A foram descritas em PC123

, mas não

correlacionada sua expressão ao grau histológico, estágio clínico ou prognóstico do câncer,

seja de forma isolada ou combinada a p53124

. Além disso, estudostêm revelado que

adiminuição da expressãoda proteínap21é frequente no cãncergástrico, da vesícula biliar, do

colorretal, e carcinomasdo endométrio em humanos124,125

. Já nos cães a redução de expressão

24

da p21 foi observada em melanomas125

, tumores de mama205

, de terceira pálpebra127

e

renais128

, mas ainda não se conhece quanto à expressão de p21 na próstata desses animais.

De acordo com Li et al.124

, ap21quando fosforilada por AKT tende a ser estável,

sendo observada comumente no núcleo celular117

. No entanto, há relatos de

localizaçãocitoplasmáticade p21 resultante da ativaçãodeAKTcomHer2

esubsequentefosforilaçãode p21118

. A p21 quando acumulada no citoplasma contribui para o

crescimento ativo egera resistência da célula a apoptose118,125

. Ainda, Lin et al.124

ao avaliar

p21 ePTEN por meio da imunoistoquímicamostraramrelação inversamente proporcionalentre

a expressãodePTENelocalização citoplasmáticade p21, reiterando sua ação antiapoptose124

e

implicando em comportamento mais agressivo do tumor e pior prognóstico118,124,130

. No

entanto, temsidodescritoque a proteína PTEN inibe a degradaçãode p53 mediada por Mdm-

2133

, por isso épossívelqueoaumento observadonos níveis dep21 seja mediado pela proteína

p53 ouMdm-2, oupor mecanismo independente dep53134

.

Segundo Majid et al.134

, a expressão aumentada de p21 pode significar bom

prognóstico, uma vez que em testes utilizando modelos animais e o potente agente terapêutico

anticâncer inibidor de tirosina quinase, genisteína, foi observado aumento da expressão do

gene CDKN1A, codificador de p21, com concomitante declínio de ciclinas em cultura de

células prostáticas andrógeno dependentes (LNCaP) e independentes (DuPro).

TambémWangetal.74

, emestudocom o agente anticâncer ácido metilselénico (MSeA) sobre

cultura de células de PChumano (DU145),relataramaumento significativodonívelde RNAm

parap21 ep27, e redução de RNAm para ciclina D1(CD1)apóstratamento com MSeAdurante

24horas. Ainda, esse aumento foi maioremais rápidopara o RNAm de p21 (3horas) em

comparação ao RNAm dep27 (12horas). Segundo os autores, essesdados

sustentamqueoaumentodep21 ep27remetema bomprognóstico, easdiferenças noespaço de

tempodep21 ep27sugeremque a indução dep21seria maisimportante do que a de

p27paraaparada do ciclo celular em G1124,125

.

Aaltomaaetal.135

relataram o oposto, quep21está significativamente relacionado

aprognóstico desfavorável. Concluíram quea expressão da proteínap21associa-se à

proliferação celulare à sobrevida do paciente com PC. Ainda, segundo Huang et al.123

, a p21

pode ter participação na patogênese da HPB, pois uma alteração no gene CDKN1A pode

causar desequilíbrio entre a proliferação de células epiteliais e do estroma da próstata e falha

da apoptose, contribuindo para o acúmulo de células característico da HPB. No entanto, vale

ressaltar que as alterações relacionadas à expressão p21 nem sempre têm origem em mutação

do CDKN1A, podendo também ocorrer alterações epigenéticas, ou seja, aquelas que

25

envolvem metilação, acetilação e aumento ou modificação de histonas, já que CDKN1A é

frequentemente silenciado por metilação no PC humano, reduzindo a síntese de p21. Da

mesma forma, é possível que ocorra aumento na síntese de p21 quando da ativação do

mecanismo de modificação de histonas136

.

O inibidor de ciclina dependentede quinase1B(CDKN1B) é o genequecodifica a

proteína p27, membro dafamíliaCIP/KIP, que atua de forma a inibir a proliferação celularea

carcinogênese136,137

. Contrariamente à p21, que parece ser uma CdkI universal, já que atua

sobre diferentes complexos Cdk/ciclina, a p27 exerce função de modulação inibitória apenas

sobre o complexo Cdk2/ciclina E, o que resulta em bloqueio da entrada da célula na fase S.

Ressalte-se que essa função inibitória do p27 só é possível a partir de sua ligação aos

receptores de TGF-β113,115

. Portanto, a ausência de sinalização de TGF-β contribui para a

proliferação celular anormal e para a malignidade117

Segundo Coqueret138

, aredução da expressão dep27 sugere prognóstico

desfavorável, tendo em vista que em sua ausência ocorre manutenção da célula no ciclo

celular. Essa redução de expressão de p27 tem sido observada em várias neoplasias, incluindo

as da próstata. Yang et al.135

e De Marzo et al.26

observaram menor expressão de p27 em

lesões como HPB, PIN e PC, concluindo que isso contribui para a alta taxa de mitose nessas

lesões proliferativas. Também Wangetal.139

observaram expressãoelevada dep27 em células

normais, comlesões hiperplásicasmuito precoceseem células com PIN e concluíram que o

aumento da expressãodep27 contribui para a prevençãoe inibe aprogressão das lesõesde

PINparaPCinvasivo. Da mesma forma, Majumderetal.140

e DiCristofanoet al.141

observaram

elevada expressão dep27emlesões de PIN experimentalmente induzidas em camundongos.

Tayloretal.142

completaram que na redução ou ausência de expressão de p27 a PIN possui

maior potencial de progressão edesenvolvimento de um fenótipo mais agressivo.

Wang et al.139

demonstraram que o epitélio nas lesões de PIA possui suas próprias

características moleculares, com fenótipo intermediário entre o das células basais e luminais,

isto é, expressa fatores de crescimento que podem aumentar a atividade de proliferação e

regular a expressão de p27, podendo, dessa forma, servir como marcador de evolução tumoral

e prognóstica75,26

.

Em tumores mamários de cadelas, Klopfleisch et al.143

observaram redução da

imunoexpressão de p27, já que as amostras de epitélio mamário normal apresentaram maior

expressão dessa proteína em comparação às amostras de tecido mamário com adenomas e

carcinomas. Em outro estudo de neoplasias mamárias em cadelas, Klopfleische

Gruber126

tambémrelataramredução significativadonível deexpressão de RNAm dep27em40%

26

dos adenomas, 90% de adenocarcinomase80% dasmetástases nos nódulos linfáticos

regionais,quandocomparado àglândulamamárianão neoplásica. Os autores concluíram que o

controle do ciclocelular via p27 é falho na maioria dos tumores mamários caninos e ainda que

essa redução representa papel importante na evolução do processo tumoral, apesar de não

terem observado diferençasignificativa na expressão de p27 entretumoresmamários

benignosemalignos. Isso limita a utilização dessa proteína como marcador de malignidade

para os tumores mamários caninos, mas não descarta o envolvimento da mesma na regulação

do crescimento tumoral79

.

O produto do gene TP53, a proteína p53, é considerada a guardiã do genoma, a

chave reguladora, pois é responsável por regular grande parte dos processos celulares,

incluindo o ciclo celular, reparo do DNA, estabilização do genoma, morte celular

programada, diferenciação, senescência e angiogênese144

. Em condições normais a proteína

p53, conhecida como p53 tipo selvagem, possui meia-vida curta, sendo degradada

imediatamente após o término de sua função. Assim, é sabido que mutações no gene TP53

resultam em falha da proteção celular, desestabilização do genoma e permite a produção de

proteína p53 afuncional, que se acumula na célula e é eliminada lentamente, o que permite

sua detecção nuclear pela técnica da IHQ76

.

O ciclo celular prossegue normalmente sob a vigilância passiva de p53 em níveis

baixos. Quando um erro ocorre na transcrição do DNA, esta interrompe o ciclo na fase S para

a atuação dos mecanismos de reparação, ou seja, os níveis de p53 se elevam e há indução da

expressão de p21, que impedirá a ligação Cdk-ciclina. Consequentemente, pRB não será

fosforilada, impedindo assim a liberação do fator de transcrição (E2F), com parada do ciclo

na fase S. Nesse momento, a célula pode promover reparo do DNA e seguir no ciclo ou

acionar eventos apoptóticos para que ocorra a destruição da célula danificada70,115,122

.

A ação da p53 é inibida quando da ligação à proteína murine double minutes

(Mdm2), impedindo-a de reativar a transcrição da proteína p21. No entanto, o gene que

codifica a proteína Mdm2, gene MDM2, é ativado por transcrição pela p53, evitando o

excesso funcional da mesma. Em células tumorais, os níveis de Mdm2 estão aumentados e há

o decréscimo na concentração de p53117

, mas também pode haver mutação do gene TP53,

seguida de ausência de expressão da proteína p53. Nesses casos, as células com danos no

DNA escapam do reparo ou do processo de apoptose, dando início a um clone

maligno115,122,145,146

.

Entre as neoplasias humanas, o TP53 é considerado o gene mais comumente

alterado146

. Nos animais, alterações nogene TP53foram identificados em vários tipos de

27

tumor, como de tiroide147

, papilomaoral148

, mamário149-150

, osteossarcoma151

, adenomada

glândula hepatoide152

, linfoma153

e próstata55,154

.

Segundo Stricker et al.155

, Cheng et al.156

, Leite et al. 157

e Tsujimoto et al.158

, em

humanos com PIN e PC quanto maior a expressão da p53 maior a probabilidade de

progressão da doença devido a índices proliferativos mais elevados e a um fenótipo mais

agressivo. Ainda, de acordo com Stricker et al.155

, nos casos de carcinoma prostático humano

em que a expressão da p53 foi pouco expressiva o câncer não progredia. Ressalte-se que a

avaliação imunoistoquímica da proteína p53 não deve ser considerada isoladamente na

determinação do prognóstico das alterações prostáticas de caráter maligno, considerando que

devido a meia-vida curta da proteína, é possível reação cruzada entre as formas selvagem e

mutante, como demonstrado por Wang et al.47

.

Na próstata canina, a expressão de p53 foi relatada em alguns trabalhos, mas com

resultados antagônicos. Di Santis58

não detectou a expressão de p53 nas afecções da próstata

canina. De outra parte, Croce et al.55

verificaram sua expressão tanto no tecido prostático

normal quanto com PC, e ainda nas lesões proliferativas e atípicas da próstata canina, sendo

que 95% das amostras de PIA e PC apresentavam-se intensamente marcadas quando

comparadas às amostras de tecido normal. Embora não tenham observado imunomarcação de

p53 no tecido prostático normal, Faleiro e De Moura 154

obtiveram resultados semelhantes aos

de Croce et al.55

, já que observaram imunomarcação de p53 em amostras de próstata canina

com PIA, PIN e PC. Nesse estudo, os autores argumentaram que a elevada expressão de p53

constatada nos casos de PIA se justifica em decorrência do microambiente inflamatório, fator

importante na promoção da alteração da p53. Ainda, segundo Wang et al.47

, a p53 mutante é

frequentemente detectada em tecidos com inflamação crônica, incluindo colangioepatites,

gastrites e colites, assim como Tsujimoto et al.158

também referiram a expressão de p53 na

atrofia inflamatória pós-atrófica da próstata humana.

1.7. Ciclina D1 (CD1)

As ciclinas, produtos do gene CLN (neuronal ceroid lipofuscinosis), são enzimas

reguladoras das subunidades das ciclinas dependentes de quinase (Cdk). Diferentes ciclinas se

associam a diferentes Cdk, podendo associar-se a mais de uma Cdk nas diferentes fases do

ciclo celular. Esse grupo de enzimas, por sua vez, fosforila uma série de substratos-chave que

permitirão a progressão de uma fase à outra do ciclo75-77,159

. Em G0 não há expressão de

ciclinas nem de Cdk. Em G1 há expressão dos complexos Cdk4/ciclina D1 e Cdk6/ciclina D1

e, ao passo que se aproxima o ponto de restrição, ocorre aumento do complexo Cdk2/ciclina

28

E. Já em S há expressão de Cdk2/ciclina A e, em G2, de Cdk1/ciclina B e Cdk1/ciclina A, que

se intensifica em M75-77,161

(Figura 11).

FIGURA 11 - Representação gráfica da atividade dos

complexos Cdk/ciclina durante o ciclo

celular. A largura das faixas coloridas é

aproximadamente proporcional à atividade dos complexos indicados.

Fonte: Lodish et al.76

.

Na fase G1, a CD1 representa um ponto crítico de regulação e, por isso, alterações

na sua expressão estão relacionadas à tumorigênese e à progressão tumoral de diferentes tipos

neoplásicos, incluindo os prostáticos. Ainda, em muitos casos há correlação entre essa

alteração e a expressão e regulação esteróide, com aumento de receptores de andrógenos77,162

.

Dessa forma, a avaliação da expressão da CD1 pode fornecer informações de prognóstico,

tendo em vista que maior expressão foi observada em lesões indiferenciadas e avançadas135

.

Quanto às outras ciclinas, pouco se conhece acerca do seu papel na carcinogênese

prostática77

.

O geneda CD1, CCND1, é reguladoem nívelde transcriçãopela interação entre a

proteínas guanilato quinase (ZO-2), E-box, e c-myc, e recrutamento de histonas

desacetiladas159,160

, sendo essa transcrição reprimida pelas proteínas fosfatase tensina

homologa (PTEN)162

e p53163

. Segundo Tapia et al.159

, a expressão aumentada de ZO-2 é

capaz de induzir a redução da expressão de CD1 em células epiteliais e, dessa forma, há

redução na proliferação celular, com bloqueio na fase G0/G1 do ciclo celular e manutenção

da taxa de apoptose.

A CD1éimportante na regulaçãodociclo celular e estudos em modelos animais

sugerem que essa enzima pode atuar como oncogene de predileção, pois a superexpressão de

CD1 nas células mamárias de camundongos transgênicos levou ao desenvolvimento de

29

hiperplasia e neoplasia164

. Oncogene de predileção é um termo utilizado para descrever o

fenômeno em que a superatividade de determinado oncogene é requisito para que as células

neoplásicas sobrevivam e proliferem. Assim, oncogenes de predileção são alvos para o

desenvolvimento de drogas que possam bloquear seus efeitos sobre as células neoplásicas,

mas sem afetar a viabilidade de células normais163

.

ACD1é uma proteínainstável e de meia-vida curta, sendo que seu acúmulo induz

arápida progressãodociclo celular da fase G1 paraS. A CD1 também atua em conjunto com a

proteína RecA recombinase (RAD51), ativando vias de reparo de DNA, com redução de sua

expressão nessas situações, embora isso não necessariamente implique em redução da

proliferação de células prostáticas neoplásicas161

, o que sugere que a CD1 não é a única

envolvida no processo de proliferação neoplásica. Entretanto, muitos autores relataram a

relação entre superexpressão de CD1 e proliferação de vários tipos de câncer em

humanos164,165

.

1.8. Proteínas c-myc

Outro importante elemento relacionado à regulação do ciclo celular é o oncogene

C-MYC, que codifica as proteínas myc1 ou p67 e myc2 ou p64, ou simplesmente proteínas c-

myc165,166

. Essas proteínas suprimem a transcrição de genes como o CDKN1A (transcritor da

proteína p21) e CDKN1B (transcritor da proteína p27) e ativam a transcrição das proteínas

Cdk2, Cdk4 e pRB, com consequente liberação de E2F e superação do efeito inibitório do

TGF-β sobre o ciclo celular, culminando com a passagem da fase G1 para S75,115,167

. Assim,

participa de forma direta e indireta nos processos associados à transformação e metabolismo

celulares, apoptose e instabilidade genômica52,75,165,167-169

.

A ativação inapropriada do C-MYC pode contribuir para o desenvolvimento

neoplásico por diferentes mecanismos, incluindo translocaçãocromossômica, amplificação

gênica einserção do generetroviral165,166

.Outrosestudossugeriramque as proteínas c-myc

estimulamaproduçãomitocondrialderadicais livres, o que comprometeo DNA, causando

instabilidade genômica. No entanto, não são consideradasessenciaispara mecanismos que

envolvem metástase165,168,169

.

Sendo ogene C-MYC um elemento-chave no processo de tumorigênese, já foi

observado em váriostipos de câncer, incluindo osmamários165,169-174

e prostáticos em

humanos175,176

e cães39

, bem como palpebrais em cães127

, osteossarcomas caninos 265

, tumor

venéreo transmissível canino177

, mamários em ratas170

e prostáticos em camundongos179

.

30

De acordo comSong etal.180

, Iwataetal.181

e Kohetal.175

, a proteína c-myc está

elevadaem87% dos casosPC humano esignificativamente aumentada em relação ao tecido

prostático normal e não neoplásico. Ainda, segundo Qianetal.168

e Kohetal.175

, a c-myc está

associada ao grau de diferenciação e estágio avançado do tumor, sendo observada nos casos

de PC com escore de Gleason maior que cinco e naqueles com metástases, caracterizando pior

prognóstico115,184

.

Fonseca-Alves etal.39

relataram maior positividade de c-myc na prostáta canina

com PIA e PCem comparaçãoàquelas normais, sendo observada imunoexpressão aumentada

nas amostras de PIA. Os autores completaram que a proteína c-myc é normalmente

expressanocitoplasmadas célulasepiteliais da próstata com PC equeestá associada à perdado

gene NKX3.1, um gene supressor detumor, e da proteína de junção E-caderina. Entretanto,

também descrevem imunomarcação nuclear de c-myc em algunscasosde PC concomitante a

focos dePIN, o que já havia sido relatado por Gureletal.182

eProwatkeetal.183

.

Ellwood-Yen etal.184

, Iwataetal.181

, Kohet

al.175

eNakagawaeYamanaka185

hipotetizaram que oaumento daexpressão de c-myc no

PChumanopromovea proliferação e diferenciaçãode células tumorais,emespecial das

célulasbasais, bem como alterações na viaapoptótica, uma vez que a superexpressãonuclearde

c-myc correlaciona-se a PINe sua transiçãopara PC.Civennietal.176

estudaram a expressão do

gene C-MYC em uma subpopulação de células neoplásicas semelhantes a células tronco (CSC

- cancer stem cell like) e observaram redução das CSCem resposta ao silenciamento desse

gene, concluindo que na ausência de ação do C-MYC ocorre ativaçãodos mecanismos

desenescência e redução do potencial tumorigênico e metastático. Os autores estudaram ainda

a expressão de C-MYC em diferentes tipos tumorais e obtiveram o mesmo silenciamento

gênico nos casos de PC. Entretanto, concluíram que a relação entre redução de proliferação

celular e silenciamento do C-MYC não compreende mecanismo único envolvido no

crescimento tumoral, tendo em vista que também foi observada proliferação de células

quando do C-MYC silenciado.

2. Objetivos

Com o intuito de melhor compreender os mecanismos celulares envolvidos em

lesões proliferativas da próstata canina, este trabalho teve por objetivo avaliar a expressão

gênica de ErbB1, ErbB2, CDKN1A, CDKN1B e TP53, e a imunomarcação de EGFR, Her2,

p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc no tecido prostático canino normal e com HPB, PIA, PIN e

PC.Para a avaliação da expressão gênica foram utilizadas as técnicasRT-PCR e RT-

31

qPCRcomRNAm de amostras próstata canina parafinizada e para a imunomarcação a técnica

de imunoistoquímica em lâminas demicroarranjo tecidual.

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“O corpo herda naturalmente do corpo, segundo as disposições da mente que se ajusta a

outras mentes, nos circuitos da afinidade, cabendo, pois, ao homem responsável

reconhecer que a hereditariedade relativa, mas compulsória lhe talhará o corpo físico de

que necessita (...) unidades de força psicossomática que atuam no citoplasma,

projetando sobre as células e, consequentemente, sobre o corpo os estados da mente...”

André Luiz (Francisco Cândido Xavier e Waldo Vieira)


43

CAPÍTULO 2 - EGF receptors expression in canine prostate with

proliferative inflammatory atrophy and carcinoma

ABSTRACT

In this study, gene expression of ErbB1 and ErbB2 and immunostaining of EGFR (Her1) and

Her2 (c-erbB-2) were evaluated to verify if those receptors are involved in canine

premalignant and malignant prostatic lesions, proliferative inflammatory atrophy (PIA) and

carcinoma (PC). From 70 prostatic samples obtained, 15 were considered normal, 30 had PIA

and 25 PC. Regarding EGFR immunostaining intensity there was no difference between

normal prostatic tissue and PIA or PC. In contrast, in relation to immunostainig intensity for

Her2, differences between normal prostatic tissue and with PIA and PC, and also between

PIA and PC, were recorded. There was no correlation between EGFR and Her2

immunostaining. RT-PCR was performed in sixteen samples of canine prostatic formalin-

fixed paraffin embedded tissue (FFPE), four of which were considered normal, three had PIA

and nine PC. ErbB1 gene product was detected in two normal samples, in one with PIA, and

in all samples with PC. ErbB2 mRNA was recorded in two canine samples with PIA, in all

with PC, but not detected in normal prostatic tissue. It was concluded that EGFR and Her2

play an important role in canine PIA and early lesions of canine PC, particularly Her2,

suggesting that those receptors may be involved in canine prostatic carcinogenesis and

tumoral development.

Key words: c-erbB-2, growth factor receptor, Her1, PIA, RT-PCR.

44

Expressão de receptores EGF na próstata canina com atrofia inflamatória

proliferativa e carcinoma

RESUMO

Neste estudo a expressão gênica de ErbB1 e ErbB2 e a imunomarcação de EGFR (Her1) e

Her2 (c-erbB-2) foram avaliadas com o objetivo de verificar quanto ao envolvimento desses

receptores nas lesões pré malignas e malignas da próstata canina,como a atrofia proliferativa

inflamatória (PIA) e o carcinoma prostático (PC). Foram obtidas 70 amostras de próstata

canina, sendo 15 normais, 30 com PIA e 25 com PC. Em relação àintensidade de

imunomarcação de membrana para EGFR, não houve diferença estatística entre os tecidos

prostáticos normais e com PIA e PC. Em relação a Her2, observou-se diferença estatística de

imunomarcação entre o tecido prostático normal e aqueles com PIA e PC e entre os com PIA

e PC. Não houve correlação de imunoexpressão de EGFR e Her2. Foram utilizadas dezesseis

amostras de cDNA de próstata canina FFPE para a realização da RT-PCR, sendo quatro

normais, três com PIA e nove com PC. O gene ErbB1 foi detectado em duas amostras

normais, uma de PIA e em todas as amostras de PC. O gene ErbB2 foi detectado em duas

amostras de PIA e em todas as amostras de PC, não sendo detectado no tecido prostático

normal. Concluiu-se que o EGFRe Her2atuam nas lesões de PIA e PC, com ação importante

do receptor Her2, sugerindo que esses receptores estão envolvidos na carcinogênese e no

desenvolvimento tumoral da próstata canina.

Palavra chave: c-erbB2, Her1, PIA, receptor de fator de crescimento,RT-PCR.

45

INTRODUCTION

The canine prostate has been extensively studied due to similarities to human

gland regarding natural occurrence of diseases and hormonal influence in their development,

as in prostatic carcinoma1-3

(PC). Dysplastic lesions of the human prostate, such as prostatic

intraepithelial neoplasia (PIN), may be considered premalignant due to morphological

similarities to cancer or potentially carcinogenicfactorsinvolvement4. Proliferative

inflammatory atrophy (PIA) is another lesion that has been investigated to determine its

premalignant potential5.In dogs, Rodrigues et al.

6 reported PIA in canine prostate and Toledo

et al.7 described its histological aspects.

Dogs are the only animals besides humans that develop spontaneous PC with high

frequency1. The canine PC model is used to study molecular mechanisms of carcinogenesis

and potential therapies, pathogenesis, development, angiogenesis, and tumoral

progression2,3

.Amongmanychanges introduced by neoplastic cells, abnormalities in cellular

response to the growth factors and their receptors promote cell proliferation, apoptosis

inhibition and ability of cancer cells to spread and angiogenesis stimulation8.

Growth factor activity is regulated by different mechanisms that control growth

factor gene activation and signal output modulation by receptors9.In this context, ErbB

receptors, particularly EGFR (Her1) and Her2 (c-ErbB-2), have been implicated in the

development and progression of PC10

. The ErbB family is a group of tyrosine kinase

receptors, comprised by EGFR or Her1, Her2 or c-erbB-2, Her3 or c-erbB-3, and Her4 or c-

erbB-4. They are coded by ErbB (erythroblastic leukemia viral oncogene homolog) 1, ErbB2,

ErbB3 and ErbB4, respectively, and also are widely expressed in epithelial tissues where they

play crucial roles in regulation of cell differentiation, proliferation and survival11,12

.

EGFR has an extracellular ligand-binding domain, a transmembrane domain and

an intracellular domain with tyrosine kinase activity for signal transduction. The domains are

activated by binding with epidermal growth factor (EGF) or transforming growth factor alfa

(TGF-α), resulting in dimerization with Her1 or heterodimerization with other ErbB member.

This leads to receptor-linked tyrosine kinase activation and results in a signaling cascade that

produces effects including cell migration, maturation, differentiation, metastasis, angiogenesis

and inhibition of apoptosis11,13-15

. EGFR is expressed or overexpressed in solid tumors

including breast, head and neck, non-small cell lung and PC. Also, it has been associated with

advanced tumor stage, poor prognosis, and resistance to chemotherapy, hormone therapy and

radiation11,16

.

46

Furthermore Yarden and Sliwkowski17

enhance that homodimers are less

mitogenic than heterodimers, and have low transformation activity. Thus, Her2 are

heterodimer preferably, have more tyrosine kinase activity tends to be more potent

andgenerate intracellular signals more intense, which gives increased mitogenic potential.

Therefore, levels of the other ErbB family receptors, especially HER2, can significantly affect

the EGFR signaling in human`s cancer. For Daly et al.18

and Pal and Pegram19

, Her2 is the

election pair to the other members of the family in heterodimerization process. This is due to

its structural form, which promotes permanent exhibition of domain dimerização20

.

Her2 and Her3 receptors work as co-receptors, since Her2 has a kinase domain

that is activated when bound to Her3. Also, Her2 does not require a specific binder to be

activated; therefore, it may bind to another ErbB family member21

. Her2 overexpression has

been reported in a range of 20-70% in human PC14,22,23

.In contrast, other studies also report

almost no Her2 expression24

, and even expression in 90% of samples of human PC25

.

In domestic animals, EGFR immunostaininghas been reported in canine breast

tumors26,27

, primary brain tumors24

, nasal carcinomas29

, lung carcinomas30

, and gastric

tumors31

. Likewise, Her2 cases overexpression was reported in 19-35% of canine mammary

tumors32,33

, and in 57.9% of canine gastric neoplasms31

. However, there are no reports

regarding both EGFR and Her2 receptors expression in canine prostate. Therefore, in order to

clarify molecular mechanisms involving those receptors in canine premalignant and malignant

prostatic tissue, RNA detection of ErbB1 and ErbB2, and immunostaining of EGFR and Her2

were evaluated in the prostate of dogs with PIA and PC.

MATERIAL AND METHODS

The samples were derived from the necropsied animal´s on pathology service of

the School of Veterinary Medicine and Animal Science of the Federal University of Goiás

(UFG), Goiânia, Goiás, Brazil, registered from 2008 to 2012. The research was approved by

committee on publication ethics COPE/UFG number 353/2010.Three-µm-sections were

obtained from formalin-fixed-paraffin-embedded (FFPE) tissue blocks and stained with

hematoxylin and eosin (HE) for microscopic examination. Histomorphological evaluation was

used to identify normal, PIA7 and PC

34prostates. All prostatic samples were obtained from

with pure or mixed-breed adult dogs and normal prostatic tissues were harvested from dogs

with no lesions in the gland.

Prostate tissue microarray (TMA) was carried out according to criteria described

by Rubin et al.35

. From the previous defined areas in histomorphological evaluation, tissue

47

cores with a dimension of 1.0 mm were taken from FFPE tissue samples and arrayed on a

recipient paraffin block, in duplicate, using the tissue microarray (Beencher Instruments®

,

Silver Spring, USA). Three-µm-sections were obtained from recipient block and distended on

charged slides (Starfrost White, Sakura Adhesion microscope slide with Cut Edges, ready to

use, Germany - Dako 9545-1) for HE staining and immunohistochemistry.

Immunohistochemistry was performed in TMA slides, in duplicate, which were

deparaffinized, rehydratated and washed in distilled water. Endogenous peroxidase and non-

specific protein were blocked with 3% hydrogen peroxide incubation for 20min (for EGFR

and c-erbB-2), protein block (Leica, Newcastle, UK, #RE7102) incubation for 5min at 37°C

(EGFR), and milk powder 10% (Molico®, Brazil - 10g/100 mL distilled in water) incubation

for 1h at 37ºC (c-erbB-2). EGFR antigen retrieval was performed with 10mM pre-heated

citrate buffer, pH 6.0, for 3min, in a pressure cooker (Solar, Rapid Express, Tramontina,

Brazil). Novocastratm

mouse monoclonal antibody anti-human EGFR (Leica, Newcastle, UK,

#NCL-L-EGFR-384), clone EGFR-25 was diluted at 1:50 and incubated overnight at 4°C in a

wet chamber. C-erbB-2 antigen retrieval was carried out in a water bath at 96ºC for 40min,

with 10 mM of pre-heated citrate buffer, pH 6.0. Polyclonal rabbit anti-human c-erbB-2

oncoprotein (Dako, Carpinteria, CA, USA, #A0485) was diluted at 1:200 and applied

overnight at 4°C in a wet chamber. A polymer kit (New Link Max Polymer, UK, #RE7260-K)

was used to incubate sections with polymer enzyme, chromogen and HRP substrate for signal

detection. Sections were counterstained with Mayer's hematoxylin, washed, dehydrated,

cleared, cover slipped, and examined by light microscopy.

Samples from human placenta for EGFR and human mammary carcinoma for c-

erbB-2 were used as positive control. For negative control, primary antibody was replaced by

pH 7.4 PBS buffer. The intensity of EGFR and c-erbB-2 reactivity was scored following

adapted criteria from Bilous et al.36

, including 0- (negative, no staining), 1+ (mild, weak

membrane staining in <10% of cells), 2+ (moderate, weak to moderate incomplete membrane

staining in >10% of cells), and 3+ (intense, strongly positive with strong complete membrane

staining in >10% of cells) (Figure 1). Samples scored as 0 and 1+ were assigned as normal

expression (or negative), and those scored as 2+ and 3+ were considered overexpressed for

EGFR and Her2.

48

Intensity Score

Negative (0-) Mild (1+) Moderate (2+) Intense (3+)

FIGURE 1 - Immunostaining intensity of EGFR and Her2 antibodies in canine

prostatic tissue

Before working with RNA, the microtome, the entire lab bench, pipettors, and

sectioning equipment were cleaned with an RNase decontamination solution (Ambion®

RNaseZap®

Solution, Life Technologies, CA, USA, #AM9780). Also, RNase-free pipette tips

were used. The analysis were performed in duplicate using 20 sections with 12 μm from each

paraffin block, which were placed into 1.5 mL sterilized polypropylene micro tubes. The

tubes were kept at -20°C until deparaffinization, digestion and RNA extraction.

The RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit (Life technologies, CA, USA,

#AM1975) was used to extract total nucleic acids (RNA and DNA) from all FFPE tissues

sample that were used in the TMA. Twelve-μm-sections were deparaffinized using xylene

and ethanol washes followed by protein digestion with protease K, incubation in water bath

for 16h at 50°C, and 15min at 80°C. Sequentially, RNA isolation and purification samples

were treated with DNase mix for 30min followed by washing and finishing with the elution.

The solution containing the nucleic acid (RNA) was stored at -20°C until proceeding the

cDNA synthesis using High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®

: CA, USA,

#4387406).

After purification of RNA, the yield and quality was measured by NanoVue™

Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, UK - 28-9301-69 AC). The yield was estimated by

UV absorbance at 260 nm and quality for rate between A260/A280, using samples higher

than 1.70. Likewise, presence of RNA was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis on

PowerPacTM

Basic Power Supply (Bio-Rad, CA, USA, #164-5050) and the images of gels

were obtained by Gel DocTM

EZ System (Bio-Rad, CA, USA, #170-8270).

The High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®: CA, USA,

#4387406) was used for reverse transcription (RT) of total RNA to single-stranded cDNA

using a reaction size of 20 µL. All the RT reaction was prepared on ice and in duplicate. In a

0.6 mL micro centrifuge tube was added 10 µL of 2✕ RT buffer, 1.0 µL of 20✕ RT enzyme

100µm 100µm 50µm 50µm

49

mix, 2µg of each sample, and nuclease-free water until complete 20 µL. This solution was

incubated at Thermal Cycler T100TM

(Bio Rad, CA, USA, #186-1096) at 37°C for 60min,

followed by 95°C for 5min, and storage at -20°C until proceeding the RT-PCR reaction.

The polymerase chain reaction (PCR) was performed in duplicate for cDNA

amplification of ErbB1 - (GenBank: AY527212.1) - Canis lupus familiaris epidermal growth

factor receptor (EGFR), locus chromosome 18; ErbB2 (GenBank: AB008451.1) – C. l.

familiaris ErbB2 - erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, locus chromosome 9;

and beta-actin, (canine housekeeping gene - GenBank: AF021873.2) - C. l. familiaris actin,

gamma 1 (ACTG1) locus chromosome 9. PCR amplified gene fragments with 149pb, 157pb,

and 151pb respectively.

In each PCR micro tube, we inserted 100 ng of DNA; 1x of 10X PCR buffer (200

mM Tris-HCl pH 8.4, 500 Mm KCl); 2.5 mM of Magnesium Chloride (MgCl2 - 50 mM); 0.2

mM of 2´-deoxynucleoside 5`-triphosphate (100 mM dNTP set, PCR grade - dATP, dCTP,

dGTP, dTTP- Invitrogen by life TechnologiesTM

CA, USA, #10297-018); 0.4 mM of each

oligonucleotide primer [EGFR Forward (Fw): CCAAGATCCCATCCATT - reverse (Rev):

CTCGACAAGCTCTCTTT; Her2 Fw: AGTGCTGGATGATAGAC, Rev:

AGTAGTGAACGGTAGAAG; β-actin, Fw: TGGAATCATGCGGTATC, Rev:

GGCTGTGATTTCCTTCT]; 1U of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase recombinant

(Invitrogen CA, USA, #11615-010); and Diethylpyrocarbonate (DEPC) treated until complete

25 µL of solution. Followed conditions at Thermal Cycler T100TM

(Bio Rad, CA, USA, #186-

1096): 95ºC for 5min; 95ºC for 1min; 58ºC for 30s; 72ºC for 1min and 72ºC for 5min;

repeated 50 times. Electrophoresis in 1% Ultra PureTM

agarose gel (Invitrogen, CA, USA,

#16500-100) with 0.5 µg/mL of Ultra PureTM

10mg/ml ethidium bromide (EtBr, Invitrogen,

CA, USA, #15585011) was performed in duplicate by 1h of running in 80 V on PowerPacTM

Basic Power Supply (Bio Rad, CA, USA, #164-5050) with GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder

(Thermo scientific, CA, USA, #SM1331). The RT-PCR amplified products were visualized

on Gel DocTM

EZ System (Bio Rad, CA, USA, #170-8270). The ErbB1, ErbB2 and β-actin

primers were obtained from Primer Quest Advanced tool (www.idtdna.com). The

oligonucleotides were synthesized by Eurofins MWG Operon, and diluted with nuclease free

water at concentration according to manufacturer’s directions.

Chi-square, Kruskal-Wallis and descriptive data were used to compare the scores

of intensity positive cells. Association between EGFR and Her2 expression in normal

prostatic tissue with PIA and PC was achieved by Spearman test. It was used SPSS (IBM

Corp. Released 2010. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM

http://www.idtdna.com/

50

Corp.) and R (R Development Core Team (2008) R Foundation for Statistical Computing,

Vienna, Austria). All values were in rank and were considered with 5% of significance level.

RESULTS

From the TMA slide, 15 (21.43%) samples of normal tissue, 30 (42.86%) of PIA,

and 25 (35.71%) of PC were obtained and scored according intensity of immunostaining to

EGFR and Her2 (Table 1).

The immunostaining was present in the membrane going through cytoplasm, is

shown in Figures 2 and Figure 3. Even using human antibodies, the results from this study are

reliable since Singer et al.37

demonstrated by BLAST alignments that canine ErbB1 and

ErbB2 are homologues in 91% and 92%, respectively, with the equivalent human

homologues, and identities of 95% for both molecules with the human counterparts. They

conclude that both targets indicated almost perfect evolutionary conservation which makes

canine cancer an excellent method suited for proof-of-concept studies in clinical comparative

oncology settings, especially for research working on the ErbB-family37

.

TABLE 1- Labeling intensity scores of EGFR and Her2 antibodies in

normal prostate tissue and with PIA and PC.

EGFR

Normal

(n=15)

PIA

(n=30)

PC

(n=25)

Labeling Intensity

0- Negative 20% (3) 6.67% (2) 24% (6)

1+ (Mild) 53.33% (8) 56.67% (17) 44% (11)

2+(Moderate) 26.67% (4) 33.33% (10) 28% (7)

3+(Intense) 0% (0) 3.33% (1) 4% (1)

Her2

Labeling Intensity

0- Negative 87.7% (13) 13.33% (4) 0% (0)

1+(Mild) 13.3% (2) 26.67% (8) 16% (4)

2+(Moderate) 0% (0) 23.33% (7) 12% (3)

3+(Intense) 0% (0) 36.67% (11) 72% (18)

51

FIGURE 2 - EGFR immunostainingmembrane through cytoplasm (arrow). A) Human

placenta. Positive control with 3+ immunostainingscore(200X); B) Canine

PC tissue with 1+score(400X); C) Normal canine prostatic tissue with 1+ score (400X); D) Canine prostatic tissue with PIA and 2+labeling score

(200X). IHC, DAB with H&E counterstain.

FIGURE 3 - Her2 immunostainingmembrane through cytoplasm (arrow). A) Human

mammary carcinoma. Positive control with 3+ immunostaining intensity score (400X); B) Canine PC tissue with 3+score(400X); C) Normal canine

prostatic tissue with 0- score (200X); D) Canine prostatic tissue with PIA

and 2+ labeling score (400X); IHC, DAB with H&E counterstain.

A B

C D

A B

D C

52

Regarding EGFR immunostaining intensity, there was no difference between

normal prostate and PIA and PC (p<0.05). In contrast, difference was noticed in Her2

immunostaining intensity between normal prostatic tissue and with PIA and PC, and between

PIA and PC (p<0.05) (Table 2). When comparing immunostaining intensity of EGFR and

Her2, there was no difference between normal prostatic tissue and with PIA and PC (p<0.05).

TABLE 2 - Means of comparison between EGFR and Her2 immunostaining intensity in canine normal

prostatic tissue and with PIA and PC.

Diagnoses Rank of Staining Intensity

EGFR Her2

Normal (n=15) 45.20a

17.33a

PIA (n=30) 55.86a

56.66b

PC (n=25) 47.12a

74.18c

Similar letters in the same column are not different by Kruskal-Wallis test (p>0.05).

From 70 samples, sixteen cDNA samples of canine prostatic tissue with rate

between A260/A280 higher than 1.70, were obtained to perform RT-PCR, being four (25%)

normal tissue, three (18.75%) with PIA, and nine (56.25%) with PC.

A commercial kit for extraction enabled us to obtain DNA and RNA from FFPE

canine prostate tissue with good enough quality and quantity to perform the RT-PCR test

successfully. Isolating nucleic acids from tissues in sufficient amount, purity and integrity is

an essential step in the practice of molecular biology. The quantity, purity and integrity of

nucleic acid extracted depend on time of pre-fixation, and time and temperature used in FFPE

process38,39

. Thus, extracting RNA with good quality and quantity is a feasible and valuable

tool in diagnostic routine and retrospective studies40,41

.

The ErbB1 gene mRNA was detected in two normal, one PIA and in all PC

samples. ErbB2 mRNA was detected in PIA2, PIA3, and all PC, but no in normal prostatic

tissue samples (Figure 4). A parallel of EGFR and Her2 immunostaining by IHC and ErbB1

and ErbB2 detection by RT-PCR is shown in Table 3.

53

FIGURE 4 - Agarose gel images showing amplification products of β-actin, ErbB1 and ErbB2

genes from canine prostatic tissue. A) RT-PCR for β-actin expression as samples

positive control. All samples amplified. B) RT-PCR for ErbB1.Prostatic samples

N3, N4, PIA2, all PC, and MC amplified. C) RT-PCR for ErbB2. Prostatic samples PIA2, PIA3, all PC and MC amplified. MW = Molecular weight (GeneRuler 1Kb

Plus DNA Ladder - Thermo scientific, CA, USA, #SM1331); MC= canine

mammary carcinoma (ErbB1 and ErbB2 positive control); N=Canine normal

prostatic tissue; PIA=Canine proliferative inflammatory atrophy; PC=Canine prostatic carcinoma.

TABLE 3- Comparison results of EGFR and Her2 immunostaining scores by immunohistochemistry (IHC) and ErbB1 and ErbB2

detection by RT-PCR in normal canine prostatic tissue and with

PIA and PC.

Samples IHC RT-PCR

EGFR Her2 ErbB1 ErbB2

N1 0 (-) 0 (-) - -

N2 1 (-) 0 (-) - -

N3 2 (+) 1 (-) + -

N4 1 (-) 0 (-) + -

PIA1 1 (-) 1 (-) - -

PIA2 2 (+) 2 (+) + +

PIA3 1 (-) 2 (+) - +

PC1 1 (-) 2 (+) + +

PC2 2 (+) 2 (+) + +

PC3 1 (-) 3 (+) + +

PC4 2 (+) 3 (+) + +

PC5 1 (-) 2 (+) + +

PC6 0 (-) 3 (+) + +

PC7 1 (0) 2 (+) + +

PC8 2 (+) 3 (+) + +

PC9 2 (+) 2 (+) + +

MC 3 (+) 3 (+) + +

MC=canine mammary carcinoma; N=canine normal prostatic tissue;

PIA=canine proliferative inflammatory atrophy; PC=canine prostatic

carcinoma; 0,1,2,3 IHC scores; + positive; - negative.

54

DISCUSSION

It was observed immunostaining of EGFR in 80% of canine normal prostatic

tissue, and also detected ErbB1 mRNA in 50% of canine normal prostatic tissue by RT-PCR.

It is according to Carlsson et al.15

, Peraldo-Neia et al.42

and Gama et al.43

that reported EGFR

expression in normal tissues such as liver, digestive tract, human prostate and canine

mammary tissue. However, Terragni et al.31

have reported no expression of EGFR in canine

normal gastric epithelium, similar to observed here in 20% of canine normal prostatic tissue.

In this study, 36.6% of prostates with PIA and 32% with canine PC presented

EGFR immunostaining. Similar results were reported by Carlsson et al.15

in a study with

human PC and lymph node metastasis, observing EGFR immunostaining in roughly41% of

primary tumors and in one case of metastasis. In contrast, Schlomm et al.44

observed EGFR

immunostaining in 17.5% of human prostates with PC. In this context, Carlsson et al.15

suggest that EGFR could have an important role in initial lesions of PC and it would be

negligible in tumors of stage advanced.

Thus, since in this study there was no difference of EGFR immunostaining

between prostate with PIA and PC, it is possible that EGFR play a role in pre-malignant and

early lesions of canine prostate. Corroborating that idea, Di Palma et al.45

and Matsubayashi

and Yoshihara46

reported ErbB1 amplification and EGFR overexpression in early events of

carcinogenesis in tumors of human salivary glands. Also, Bertagnolli et al.47

have studied

EGFR in canine mammary tumors and concluded that EGFR expression may contribute to

malignant epithelial transformation. Those authors also has been referring that EGFR is

associated with increased tumor proliferative activity, angiogenesis and metastatic potential,

working as a predictive factor in these neoplasms.

Her2immunostaining was observed in two samples of canine normal prostatic

tissues, also it was scored as 1+, considered here as negative. These results are accordingly to

Terragni et al.31

that have not observed Her2 expression in non-neoplastic canine gastric

mucosa. However, Carlsson et al.15

reported that Her2immunostaining may occur in normal

tissues. Also, the IHC results concerning Her2were coherent with those obtained in RT-PCR

technique, since there was expression of ErbB2 in normal prostatic tissue.

Canine prostates with PC presented 84% of Her2 overlabeling and 100% ErbB2

expression. In human PC Her2overexpression is reported in 20-70% of PC samples14,22,23

and

was associated to high Gleason score44,48

, tumor recurrence and cancer advanced stage44

.

However, Liu et al.24

reported no expression of Her2in primary human PC. On the other hand,

Carles et al.25

reported Her2 expression in up to 90% of PC cases, and Carlsson et al.15

, when

55

studying human PC and lymph node metastases, observed nearly 33% Her2 immunostaining

in primary tumors and 66.6% in metastases. Those authors reported higher frequency of

Her2overexpression in human PC cases with metastases when compared to cases where PC

was confined to the prostate, and have suggested up regulation of Her2in metastases. Based

on this, our results would indicate the canine PC as having great potential of aggressively as

mentioned by Leroy & Northrup2. However, even without evaluation for canine PC

metastasis, it is likely that Her2 may have a single role in canine prostate tissue regarding PC

evolution and metastasis, since canine PC is less frequent and with later onset if compared

with PC in humans. Perchance, mechanisms of Her2 interaction with inhibitors proteins

involved in cell cycle, such as p21 and p27, are more efficient in canine prostatic tissue than

in human gland.

In this study, Her2 overlabeling and ErbB2 expression were found in 60% and

66% of canine prostates with PIA, respectively, confirming the proliferative pattern of this

prostatic disease and supporting its pre-malignant potential2,4

. Terragni et al.31

observed that

Her2 was more expressed in dysplastic areas of canine benign gastric tumors, suggesting its

potential relevance in pre-malignant lesions. It is a relevant remark that Her2 immunostaining

was significantly weaker in canine prostates with PIA than those with PC. Also, ErbB2

mRNA was less detected in prostates with PIA than PC. Taken together, the results are

suggestive that Her2 growth factor receptor plays an important role in canine prostatic

carcinogenesis and tumoral development.

CONCLUSIONS

EGFR and Her2 are expressed in canine PIA and early lesions of canine PC,

particularly Her2, which was overexpressed, pointing to the involvement of these receptors in

canine prostatic carcinogenesis and tumoral development. Considering these findings, the

next step would be exploring the association of EGFR and Her2 action and tumoral disease

evolution, metastasis, and prognosis.

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“Eis porque, interpretando os cromossomas à guisa de caracteres em que a mente inscreve,

nos corpúsculos celulares que a servem, as disposições e os significados dos seus

próprios destinos, caracteres que sãoconstituídos pelos genes, como as linhas são

formadas de pontos.”



60

CAPÍTULO 3 - Cell cycle inhibitors expression in canine prostate with

prostatic inflammatory atrophy and carcinoma

ABSTRACT

Gene expression of CDKN1A, CDKN1B, and TP53, and immunostaining of p21, p27 and

p53 were evaluated to verify the role of these cell cycle inhibitors in canine prostates with

proliferative inflammatory atrophy (PIA) and prostatic carcinoma (PC). From 70 prostatic

samples obtained, 15 were considered normal, 30 had PIA and 25 PC. Regarding the number

of p27 and p53 labeled cells, difference between normal and PIA and PC was observed, as

well as between PIA and PC for p53. Immunostaining intensities of p21, p27 and p53 were

different when comparing normal tissues to PIA and PC. Sixteen cDNA samples of canine

prostatic FFPE tissue were subjected to RT-PCR and RT-qPCR, four considered normal

tissue, three diagnosed as PIA, and nine as PC. CDKN1A mRNA was detected in four PC

cases by RT-PCR, and it was overexpressed when compared to normal by RT-qPCR, in one

PIA and six PC samples. CDKN1B mRNA was detected in three PC cases by RT-PCR and it

was overexpressed in three PC and decreased in one PC case. TP53 mRNA, detected in all

canine prostates with PIA and PC, was also overexpressed in one gland with PIA and three

with PC. It was conclude that when overexpressed in canine prostate with premalignant and

malignant lesions, p21 and p27 play role controlling cell proliferation, most likely working as

a protective factor in the evolution of PIA to PC, and in the PC development, even in the

presence of altered p53. Thus, the next step would be verifying these cell cycle proteins in

canine PC with metastasis.

Key words: p21, p27, p53, PIA, RT-qPCR.

61

Expressão de inibidores do ciclo celular na próstata canina com atrofia

inflamatória proliferativa e carcinoma

RESUMO

A expressão gênica de CDKN1A, CDKN1B e TP53, e imunoexpressão de p21, p27 e p53

foram avaliados, a fim de verificar o papel desses inibidores do ciclo celular na próstata

canina com atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e carcinoma prostático (PC).Foram obtidos

um total de 70 amostras de próstata canina, sendo 15 de tecido normal, 30 de PIA e 25 de PC.

Quanto ao número de células imunomarcadas foi observado diferença entre normal, PIA e PC

para p27 e p53, também para p53 houve diferença entre PIA e PC. Para a intensidade de

imunomarcação houve diferença entre os tecidos normais e com PIA e PC para p21, p27 e

p53. Foram obtidas dezesseis amostras de cDNA a partir de tecido FFPE de próstata canina

para realização da RT-PCR e RT-qPCR, sendo quatro tecidos normais, três com PIA, e nove

com o PC. O gene CDKN1A foi detectado em quatro das PC por RT-PCR, e pela RT-qPCR

este estava super expresso em uma PIA e em seis PC quando comparado com o tecido

prostático normal. O CDKN1B foi detectado em três PC por RT-PCR e pela RT-qPCR estava

super expresso em três PC e reduzido em um PC. O TP53 foi detectado em todas as próstatas

caninas com PIA e PC por RT-PCR, sendo também superexpresso em uma glândula com PIA

e em três com PC. Concluiu-se que p21 e p27 quando superexpressas na próstata canina com

lesões pré-malignas e malignasdesmpenham ação no controle da

proliferaçãocelular,possivelmenteatuando como fator de proteção na evolução da PIA para

PC, e no desenvolvimento do PC, mesmo na presença de p53 alterada. Assim, o próximo

passo seria avaliar essas proteínas do ciclo celular em casos de PC canino com metástase.

Palavra chave: p21, p27, p53, PIA, RT-qPCR.

62

INTRODUCTION

The canine prostate has similarities with the human gland regarding occurrence of

benign and malignant diseases as benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostatic carcinoma

(PC)1,2

. Proliferative inflammatory atrophy (PIA) is also a human prostate lesion with

premalignant potential and involvement in carcinogenesis of PC3,4

. In dogs, Rodrigues et

al.5have mentioned PIA in canine prostate and Toledo et al.

6 described its histological aspects.

The proliferation of eukaryotic cells is controlled at specific points in the cell

cycle, particularly at G1-S and G2-M transitions, and regulated by interaction of cyclins and

cyclin-dependent kinases (Cdk) and their inhibitors (CdkI`s). The major step in malignant

transformation in tumors is the loss of cell cycle control. Knowing how regulators work is a

key step to understand malignant transformations that occur in tumor types7-10

.

Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) gene encodes the p21 protein,

which has been implicated in mechanisms of cell-cycle arrest from G1-S phase through

different steps that allow cell DNA repair or apoptosis11-12

. Those tasks are performed by

cyclin A/cyclin dependent kinase 2 (Cdk2) and cyclin D/Cdk4 complexes13

. Increased

expression of CDKN1A is not necessarily linked to cell growth blocking, since p21 protein

may have dual a function, inhibiting cyclin/Cdk activity and also acting as positive modulator

of cyclin/CDK complex formation12

. Furthermore, studies have revealed decreased expression

of p21 associated with poor prognostic in human tumors, including gastric, colorectal,

prostatic, and endometrial carcinomas14-16

.

The p27 protein is encoded by cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (CDKN1B)

gene. This protein has been implicated in cell-cycle blocking mechanisms in S phase. It is

regulated by extracellular stimuli, like transforming growth factor beta (TGF-β)17-19

. Yang et

al.20

and De Marzo et al.21

observed decreased expression of p27 in lesions such as BPH, PIN

and PC, contributing to the high rate of mitosis in these proliferative lesions. Also,

Fredersdorf et al.22

and Tan et al.23

refer that the loss of p27 protein is a negative prognostic

factor for human breast cancer.

An important protein controlling the cell cycle is p53, well known as the

"guardian" of the genome. If an error in DNA transcription occurs, p53 stops cell cycle and

promote repair mechanisms or triggers apoptotic events leading to cell death. The p53 protein

stimulates p21, which has regulatory functions and blocks the cell cycle progression24,25

. In

normal cells, wild-type p53 has a short half-life and does not accumulate in the tissue at

detectable levels. Mutations or deletions of TP53 gene may lead to altered production of p53

protein, which fails to perform its function and accumulates in the nucleus, when is possible

63

to be detected it by immunohistochemistry19,24

. The p53 immunostaining in canine prostate

has been reported as increased in PIA and PC26

, but its role in canine prostatic tissue with

proliferative lesions is not yet clear. Thus, in order to further understand the molecular

mechanisms of cell cycle blocking in canine premalignant and malignant prostatic tissue,

CDKN1A, CDKN1B, and TP53 mRNA expression and immunostaining of p21, p27 and p53

were evaluated in canine prostate with PIA and PC.




(UFG), Goiânia, Goiás, Brazil, registered from 2008 to 2012. The research was approved by

committee on publication ethics COPE/UFG number 353/2010.Three-µm-sections were


hematoxylin and eosin (HE) for microscopic examination. Histomorphological evaluation was

used to identify normal, PIA6 and PC

27prostates. All prostatic samples were obtained from

with pure or mixed-breed adult dogs and normal prostatic tissues were harvested from dogs

with no lesions in the gland.

Prostate tissue microarray (TMA) was carried out according to criteria described

by Rubinet al.28

. From the previous defined areas in histomorphological evaluation, tissue

cores with a dimension of 1.0 mm were taken from FFPE tissue samples and arrayed on a

recipient paraffin block, in duplicate, using the tissue microarray (Beencher Instruments®,

Silver Spring, USA). Three-µm-sections were obtained from recipient block and distended on

charged slides (Starfrost White, Sakura Adhesion microscope slide with Cut Edges, ready to

use, Germany, Dako #9545-1) for HE staining and immunohistochemistry.

Immunohistochemistry was performed in TMA slides, in duplicate, which were


specific protein were blocked with 3% hydrogen peroxide incubation for 20min, protein block

(Leica, Newcastle, UK, #RE7102) incubation for 5min at 37°C. Antigen retrieval for p21, p27

and p53 was performed with 10 mM pre-heated citrate buffer, pH 6.0, for 3min, in a pressure

cooker (Solar, Rapid Express, Tramontina, Brazil). Mouse monoclonal anti-human

p21WAF1/Cip1

clone SX118 (Dako, Carpinteria, CA, USA, #M7202), monoclonal mouse anti-

Human p27Kip1

clone SX53G8 (Dako Carpinteria, CA, USA, #M7203), and monoclonal

mouse p53 clone 5G176 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, #sc-71785) were diluted at

1:50, 1:200, and 1:500 respectively and incubated overnight, at 4°C in wet chamber. A

64

polymer kit (NovoLink Max Polymer, UK, #RE7260-K) was used to incubate sections with

polymer enzyme, chromogen and HRP substrate for signal detection. Sections were

counterstained with Mayer's hematoxylin, washed, dehydrated, cleared, cover slipped, and

examined by light microscopy.

Sample from human colon carcinoma were used as positive control for p21 and

p27, and human mammary carcinoma for p53. For negative control, primary antibody was

replaced by pH 7.4 PBS buffer. The intensity of p21, p27, and p53 reactivity was scored as:

0=negative, 1=mild, 2=moderate, and 3=intense. The number of stained cells to p21, p27, and

p53 was scored as: 0=negative, 1=1-25%, 2=26-50%, 3=51-75% and 4=76-100%.

Before working with RNA, the microtome, the entire lab bench, pipettors, and

sectioning equipment were cleaned with an RNase decontamination solution (Ambion®

RNaseZap®

Solution, Life Technologies, CA, USA, #AM9780). Also, RNase-free pipette tips

were used. The analysis were performed in duplicate using 20 sections with 12 μm from each

paraffin block, which were placed into 1.5 mL sterilized polypropylene microtubes. The tubes

were kept at -20°C until deparaffinization, digestion and RNA extraction.

The RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit (Life technologies, CA, USA,

#AM1975) was used to extract total nucleic acids (RNA and DNA) from all FFPE tissues

sample that were used in the TMA. Twelve-μm-sections were deparaffinized using xylene and

ethanol washes followed by protein digestion with protease K, incubation in water bath for

16h at 50°C, and 15min at 80°C. Next, RNA isolation and purification samples were treated

with DNase mix for 30min followed by washing and finishing with the elution. The solution

containing the nucleic acid (RNA) was stored at -20°C until proceeding the cDNA synthesis

using High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®

: CA, USA, #4387406).

After purification of RNA, the yield and quality was measure by NanoVue™ Plus

Spectrophotometer (GE Healthcare, UK - 28-9301-69 AC). The yield was estimated by UV

absorbance at 260 nm and quality for rate between A260/A280, using samples higher than

1.70. Likewise, confirmed by 1% agarose gel electrophoresis on PowerPacTM

Basic Power

Supply (Bio-Rad, CA, USA, #164-5050) and the images of gels were obtained by Gel DocTM

EZ System (Bio-Rad, CA, USA, #170-8270).

The High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®: CA, USA,

#4387406) was used for reverse transcription (RT) of total RNA to single-stranded cDNA

using a reaction size of 20 µL. All the RT reaction was prepared on ice and in duplicate. In a

0.6 mL micro centrifuge tube was added 10 µL of 2✕ RT buffer, 1.0 µL of 20✕ RT enzyme

mix, 2 µg of each sample, and nuclease-free water until complete 20 µL. This solution was

65

incubated at Thermal Cycler T100TM

(Bio Rad, CA, USA, #186-1096) at 37°C for 60min,

followed by 95°C for 5min, and storage at -20°C until proceeding the RT-PCR reaction.

The polymerase chain reaction (PCR) was performed in duplicate for cDNA

amplification of p21 (GenBank: AJ830019.1) - Canis l. familiaris cyclin-dependent kinase

inhibitor 1A (CDKN1A) locus chromosome 12; p27(GenBank: NM001002957.1) - C. l.

familiaris cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (CDKN1B) locus chromosome 27; p53

(GenBank: NM_001003210.1) - C. l. familiaris tumor protein p53 (TP53) locus chromosome

5; and β-actin, (canine housekeeping gene - GenBank: AF021873.2) - C. l. familiaris actin,

gamma 1 (ACTG1) locus chromosome 9. These genes amplify fragments with 88 pb, 124 pb,

118 pb, 151 pb, respectively.

In each PCR microtube, we inserted 100 ng of DNA; 1x of 10X PCR buffer (200

mM Tris-HCl pH 8.4, 500 Mm KCl); 2.5 mM of Magnesium Chloride (MgCl2 -50 mM); 0.2

mM of 2´- deoxynucleoside 5`- triphosphate (100 mM dNTP set, PCR grade - dATP, dCTP,

dGTP, dTTP - Invitrogen by life TechnologiesTM

CA, USA, #10297-018); 0.4 mM of each

oligonucleotides primer [p21 Forward (Fw): ACCTCTCAGGGCCGAAAAC, reverse (Rev):

TAGGGCTTCCTCTTGGAGAA; p27 Fw: CAGAGGACACACACTTGGTAGA Rev:

TCTTTTGTTTTGAGGAGAGGAA; p53, Fw: CGCAAAAGAAGAAGCCACTA, Rev:

TCCACTCTGGGCATCCTT; β-actin, Fw: TGGAATCATGCGGTATC Rev:

GGCTGTGATTTCCTTCT] 1U of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase recombinant

(Invitrogen CA, USA, #11615-010) and Diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water until

complete 25 µL of solution. Followed conditions at Thermal Cycler T100TM

(Bio Rad CA,

USA, #186-1096): 95ºC for 5min; 95ºC for 1min; 58ºC for 30s; 72ºC for 1min and 72ºC for

5min; repeated 50 times. Electrophoresis in 1% Ultra PureTM

agarose gel (Invitrogen CA,

USA,#16500-100) with 0.5 µg/mL of Ultra PureTM

10mg/ml ethidium bromide (EtBr,

Invitrogen CA, USA, #15585011) was performed in duplicate by 1h of running in 80 V on

PowerPacTM

Basic Power Supply (Bio-Rad, CA, USA, #164-5050) with Gene Ruler 1Kb Plus

DNA Ladder (Thermo scientific, CA, USA, #SM1331). The RT-PCR-amplified products

were visualized in a Gel DocTM

EZ System (Bio-Rad, CA, USA, #170-8270). The CDKN1A,

CDKN1B and TP53 primers were obtained from Klopfleisch and Gruber29

, and β-actin

primers were obtained from Primer Quest Advanced tool (www.idtdna.com). The

oligonucleotides were synthesized by Eurofins MWG Operon, and diluted with nuclease free

water at concentration according to manufacturer’s directions.

The cDNA samples underwent real-time quantitative reverse-transcription

polymerase chain reaction (RT-qPCR) to evaluate CDKN1A, CDKN1B and TP53 gene

http://www.idtdna.com/

66

expression. β-actin reference canine gene was used as positive control. The reactions and data

analyses were performed in iQ5 real-time PCR system (Bio-Rad, CA, USA, #170-9780). The

20 µl total reactions were carried out in a 96-well polypropylene plates (iQTM

- 96 well PCR

plates, Bio-Rad, CA, USA, #223-9441) containing 10 µl of MAXIMA®

SYBR-green

Fluorescein qPCR Master mix 2x (Thermo Scientific, Fermentas, CA, USA, #K0241), 500

nM of each primer (forward and reverse are the same used at RT-PCR), 100 ng of synthesized

cDNA template, and nuclease free water. All plates were covered with optical sealing tape

(Microseal® Adhesive seals Bio-Rad, CA, USA, #MSB-1001).

RT-qPCR cycling conditions were 10min at 95ºC, followed by 40 cycles of 30s at

95ºC, 1min at 58ºC, and 30s at 72ºC. The plates contained triplicates of each cDNA sample

and β-actin gene as internal reference to normalize the amount of total cDNA. Specificity of

amplified products was confirmed by melting curve analyses. The expression level of the

genes was calculated from the threshold cycle according to the 2-ΔΔCT

method by Livak and

Schmittgen30

in iQ5 real-time PCR software (Bio-Rad, CA, USA, #170-9780).

The Chi-square, Kruskal-Wallis, and descriptive data were used to compare the

scores of percentage of positive cells and their intensity. For all data we used SPSS (IBM

Corp. Released 2010. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM

Corp.) and R (R Development Core Team (2008) R Foundation for Statistical Computing,

Vienna, Austria). All values were considered with 5% of significance level.

RESULTS

From the TMA slide, 15 (21.43%) samples of normal tissue, 30 (42.86%) with

PIA and 25 (35.71%) with PC were obtained and scored according to the number of stained

cells and immunostaining intensity of p21, p27 and p53 (Table 1). The nuclear

immunostainingfor p21, p27, and p53 is shown in Figure 1.

The number of p21 stained cells in normal prostatic tissue was neither different

from those with PIA and PC, nor between PIA and PC. Immunostaining intensity was

different between normal prostatic tissue and PIA and normal compared to PC, but not

between PIA and PC. The number of p27 stained cells and immunostaining intensity was

different between normal prostatic tissue and PIA and between normal and PC, but not

between PIA and PC. The number of p53 stained cells was different between normal prostatic

tissue and PIA and PC, as well as between prostates with PIA and PC. According to

Immunostaining intensity of p53 was difference between normal prostatic tissue and PIA and

PC, but not between PIA and PC (p< 0.05) (Table 2).

TABLE 1 –Number of cases sorted by scores applied to variable number of labeled cells and intensity of labeling to p21, p27, and p53 antibodies

in canine normal prostatic tissue and with PIA and PC.

Number of Labeled Cells Scores (%) Intensity of Labeling Cells (%)

Diagnoses Antibodies 0 (0%) 1 (1-25%) 2 (26-50%) 3 (51-75%) 4 (76-100%) 0 Negative 1 (mild) 2 (moderate) 3 (intense)

Normal

N=15

p21 46.6% (7) 0% 26.67% (4) 20% (3) 6.67% (1) 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0%

p27 46.67% (7) 6.67% (1) 33.33% (5) 13.33% (2) 0% 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0%

p53 73.33% (11) 20% (3) 6.67% (1) 0% 0% 73.33% (11) 26.67% (4) 0% 0%

PIA

N=30

p21 13.33% (4) 6.67% (2) 13.33% (4) 40% (12) 26.67% (8) 13.33% (4) 56.67% (17) 23.33% (7) 6.67% (2)

p27 13.33% (4) 6.67% (2) 23.33% (7) 43.33% (13) 13.33% (4) 13.33% (4) 36.67% (11) 40% (12) 6.67% (2)

p53 6.67% (2) 0% 70% (21) 10% (3) 13.33% (4) 6.67% (2) 83.33% (25) 10% (3) 0%

Carcinoma

N=25

p21 24% (6) 8% (2) 8% (2) 12% (3) 48% (12) 24% (6) 24% (6) 12% (3) 40% (10)

p27 16% (4) 0% 24% (6) 20% (5) 40% (10) 16% (4) 24% (6) 20% (5) 40% (10)

p53 4% (1) 4% (1) 24% (6) 8% (2) 60% (15) 4% (1) 60% (15) 28% (7) 8% (2)

68

FIGURE 1 - Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining(arrow). A) Canine PC tissue with score three for labeling intensity and four for number of labeled

cells for p21. 400X. B) Human colon carcinoma; p21 positive control with score two for

labeling intensity and four for number of labeled cells.400X. C) Canine PIA tissue with

score three for labeling intensity and four for number of labeled cells for p27. 200x. D) Human colon carcinoma; p27 positive control with score three for labeling intensity and

four for number of labeled cells. 400X E) Canine PC tissue with score three for labeling

intensity and four for number of labeled cells for p53. 200X. F) Human mammary carcinoma; p53 positive control with score three for labeling intensity and three for

number of labeled cells. 200X. IHC, DAB with H&E counterstain.

69

TABLE2 -Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding


prostatic tissue, PIA and PC.

Diagnoses N Rank of Number of Stained Cells Rank of Staining Intensity

p21 p27 p53 p21 p27 p53

Normal 15 46.3a 34.4

a 16.9

a 33.9

a 31.6

a 23.0

a

PIA 30 57.8a 60.1

b 54.6

b 55.8

b 60.4

b 55.7

b

Carcinoma 25 59.8a 67.4

b 75.2

c 64.3

b 68.6

b 68.2

b

Similar letters in the same column are not different by non parametric multiple

comparison test for paired contrasts the relative effects with Tukey correction.

(p value =<0.05).

Sixteen cDNA samples of canine prostatic tissue were obtained to perform RT-

PCR, being 4 (25%) normal tissue, 3 (18.75%) with PIA, and 9 (56.25%) with PC. CDKN1A

mRNA was detected in four of nine PC (4/9 - PC6, PC7, PC8, PC9) and CDKN1B mRNA in

three of nine PC (3/9 – PC7, PC8, PC9). TP53 gene expression was detected in all PIA and

PC samples, but not in normal prostatic tissue (Figure 2).

FIGURE 2 –Images from agarose gels showing the amplification products of ACTG1 (β-actin),

CDKN1A, CDKN1B and TP53 genes from canine prostatic tissue. (A) RT-PCR for β-

actin expression (positive control). (B) RT-PCR for CDKN1A. Prostatic samples PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. (C) RT-PCR for CDKN1B. Prostatic samples PC7,

PC8, PC9 and MC amplified. (D) RT-PCR for TP53. Prostatic samples PIA1, PIA2,

PIA3, PC1, PC2, PC3, PC4, PC5, PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. MW = Molecular weight (Gene Ruler 1Kb Plus DNA Ladder - Thermo scientific, CA, USA,

#SM1331); MC= canine mammary carcinoma (CDKN1A, CDKN1B and TP53 positive

control); N=Normal tissue; PIA= Canine proliferative inflammatory atrophy; PC=

Canine prostatic carcinoma.

70

The expression of CDKN1A, CDKN1B and TP53 in canine normal prostate, with

PIA and PC was determined by RT-qPCR and fold change (FC) normalized with β-actin

expression from the same dog and with normal gland with T melt 84.8ºC. The CDKN1A was

overexpressed in seven of sixteen tissues investigated (PIA1, PC1, PC3, PC4, PC7, PC8 and

PC9) with FC>1.6 when compared to normal gland N1 to N4 and T melt 76.9ºC. The

CDKN1B was overexpressed in three of nine PC tumors (PC7, PC8, PC9) with FC>1.6, and it

was under expressed in one of nine PC (PC2) based on FC<0.4 and T melt 80.5ºC. Regarding

TP53, overexpression was present in five of sixteen prostatic samples (PIA1, PC4, PC6, PC8,

PC9) with FC>1.6, and decreased expression was observed in two of sixteen prostatic tissues

(PIA2, PC2) based on FC<0.4 and T melt 78.8ºC (Figure 3).

FIGURE 3 – Fold expression levels of CDKN1A, CDKN1B and TP53 in canine normal, PIA and PC

normalized by β-actin. Values>1.6 were considered overexpression and values<0.4

were considered decrease of gene expression.

A commercial kit for extraction enabled us to obtain DNA and RNA from FFPE

canine prostate tissue with good enough quality and quantity to perform the RT-PCR test

successfully. Isolating nucleic acids from tissues in sufficient amount, purity and integrity is

an essential step in the practice of molecular biology. The quantity, purity and integrity of

nucleic acid extracted depend on time of pre-fixation, and time and temperature used in FFPE

process31,32

. Thus, extracting RNA with good quality and quantity is a feasible and valuable

tool in diagnostic routine and retrospective studies33,34

.

71

Comparison of results referring to p21, p27 and p53 immunostaining by IHC and

CDKN1A, CDKN1B and TP53 detection by RT-PCR and expression by RT-qPCR are

described in Table 3.

TABLE 3 – Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding number of stained

cells and intensity of staining in canine normal prostatic tissue, PIA and PC

Samples IHC RT-PCR RT-qPCR

p21 p27 p53 CDKN1A CDKN1B TP53 CDKN1A CDKN1B TP53

N1 0 0 0 - - - R R R

N2 0 0 0 - - - R R R

N3 2/1 2/1 0 - - - R R R

N4 0 0 1/1 - - - R R R

PIA1 4/3 2/1 4/3 - - + O R O

PIA2 2/2 2/1 1/1 - - + R R D

PIA3 0 2/1 2/2 - - + R R R

PC1 4/3 4/3 2/2 - - + O R R

PC2 0 0 0 - - + R D D

PC3 4/3 4/3 2/2 - - + O R R

PC4 4/3 4/3 4/3 - - + O R O

PC5 2/1 3/2 2/3 - - + R R R

PC6 3/2 3/2 4/3 + - + R R O

PC7 4/3 4/3 3/2 + + + O O R

PC8 4/3 4/3 3/2 + + + O O O

PC9 4/3 4/3 4/3 + + + O O O

MC 4/3 4/3 4/2 + + + R R R

MC=canine mammary carcinoma; N=canine normal prostatic tissue; PIA=canine proliferative

inflammatory atrophy; PC=canine prostatic carcinoma; N/N= score of number of stained cells/

score of intensity of staining; R=regular expression; D=decreased expression; and O=overexpression

DISCUSSION

It was observed in this study that p21 immunostaining protein was overexpressed

in 40% of PC and 6.7% of PIA, and in normal tissue the expression was weak in 53.3% and

absent in 46.7%. Protein p21 play an important function in the cell cycle and its increased

expression may mean a crucial step in the cell growth blocking, inducing senescence or

apoptosis, a mechanism which seems to protect against malignant transformation35-38

. Thus,

loss of p21 expression has been associated with shorter survival in human with PC16

. Also,

according to Matsushima et al.39

, immunostaining of p21 was more likely to be expressed in

well-differentiated areas.

Also, there was difference between normal prostatic tissue with PIA and PC

regarding intensity of immunostaining, and there was no difference between groups

72

considering the number of stained cells. In this context, our results suggest that p21 could

work as a protective factor in canine PC progression, since in human PC p21 overexpression

is associated with good prognosis16

. Furthermore, even considering the possibility that canine

PC shows high aggressively when present2,40

, this tumor is not as common in canine prostate

as compared to the human prostate. It seems that canine PC has longer time development,

which could be linked to action of inhibitors as p21 and p27 during canine PC progression.

This hypothesis was mentioned before in canine prostate, but referring proteins from other

regulatory pathways as GSTP126

. Also, it seems that immunostaining intensity of p21 in

canine prostate tumors should be considered.

Klopfleisch and Gruber29

reported p21 overexpression in canine malignant

mammary tumors, but concluded that its increase alone did not avoid metastasis and an

explanation for that would be a loss of p21 function by missense mutations. On the other

hand, Wang et al.16

add that overexpression of p21 in human prostate may be associated with

poor prognostic due to CDKN1A instability, or its function may be altered indirectly by TGF-

β41

, PTEN deficiency36

, and TP53 mutated42-44

. Since p21 may play a double function, acting

as tumoral suppressor or oncogene12

depending on tumor type, and considering our results, it

seems that p21 could be involved in controlling cell proliferation in canine prostate with

proliferative lesions as observed in human breast cancer45

.

Taken together, the results from this research concerning p21 and p27 inhibitors

indicate that positive relation for their overexpression in canine proliferative prostatic tissue

could work by controlling cell proliferation. Similar to p21, p27 protein is an important cell

proliferation inhibitor46,47

, once increased levels of p27 result in cell cycle blocking in the S

phase19,48-51

. The p27 expression may be lost or decreased in human PC20,52-55

, a feature

associated with tumor cell undifferentiation, proliferation and poor prognostic 48,51,56,57

. In

contrast to p21, p27overexpression is mostly related to better prognosis, acting as a tumoral

suppressor58

. However, it seems important to evaluate these cell cycle inhibitors together,

since there are studies showing association of malignant progression and the presence of

negative relation between p21 (overexpressed) and p27 (underexpressed) expression in canine

mammary tumor29

, as well as malignant progression and positive relation between p21

(underexpressed) and p27 (underexpressed) expression in human tumors59

. In contrast, in

canine prostate with premalignant and malignant lesions the positive relation for p21 and p27

overexpression would be related to a good prognosis.

Another important protein in cell cycle control is the product of TP53 gene, the

p53 protein24,25

. In this study, the number of stained cells for p53 was significantly higher in

73

canine prostates with PC than with PIA. TP53 mRNA was detected by RT-PCR in all

prostates with PIA and PC, but TP53 overexpression by RT-qPCR was present in a higher

number of prostates with PC than with PIA. According to Quian et al.60

, Tsujimoto et al.61

,

and Stangelberger et al.44

, in human prostates with PIN and PC, the increased expression of

p53 has been associated ith high proliferative index and more aggressive phenotype. Since

accumulations of p53 in the presence of TP53 gene mutation are usual, our results indicate

that alterations related to p53 protein may start in canine prostates with PIA and later

accentuates in canine glands with PC, emphasizing its malignant potential as described before

in dogs26

and humans60,61

. This hypothesis is also supported by the fact that inflammatory

microenvironment in PIA promotes changes in TP53 gene, as mentioned by Wang et al.4 and

Tsujimoto et al.61

. Furthermore, according to Wang et al.4,p53 accumulations occur in the

presence of a TP53 gene mutation, especially in tissues with chronic inflammation, such as

cholangiohepatitis, gastritis and colitis. Tsujimoto et al.61

also detected TP53 overexpression

in human post-atrophic hyperplasia.

Taken together, our results have showed that is important evaluate different cell

pathways in order to better understand the carcinogenis and tumoral development steps in

different types of tissue and species, since one lesion in the organism may evolute by different

mechanisms with similar biological results26

. Based on that, it seems that in canine

premalignant and malignant prostate the overexpression of p21 and p27 plays controlling cell

proliferation and lesion progression even with the evidence of alterations involving p53.

CONCLUSIONS

It was concluded that when overexpressed in canine premalignant and malignant

prostate, p21 and p27 possible play role controlling cell proliferation, most likely working as

a protective factor in the evolution of PIA to PC, and in the PC development, even in the

presence of altered p53.Thus, the next step would be verifying these cell cycle proteins in

canine prostate with PC and metastasis.

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“Lembremo-nos de que o homem interior se renova sempre. A luta enriquece-o de

experiência, a dor aprimora-lhe as emoções e o sacrifício tempera-lhe o caráter. O

espírito encarnado sofre constantes transformações por fora, a fim de acrisolar-se e

engrandecer-se por dentro.”



79

CAPÍTULO 4 - Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate

with proliferative lesions

ABSTRACT

In this study immunostaining of p21, p27, p53, cyclin D1, c-myc was evaluated in normal

canine prostate and with proliferative disorders to verify the interaction between these

regulators of cell cycle progression. From 106 samples of canine prostate obtained from a

TMA block, 15 were considered normal, 16 diagnosed as benign prostatic hyperplasia (BPH),

30 as proliferative inflammatory atrophy (PIA), 20 as prostatic intraepithelial neoplasia (PIN),

and 25 as prostatic carcinoma (PC). Difference in immunostaining of p21, p27, cyclin D1 and

p53 in acinar epithelium in relation to the prostate condition was observed. There was positive

correlation between p21 and p27 for number of stained cells and staining intensity in all

conditions and between c-myc and p53 in prostates with PIN. Considering the number of

labeled cells, there was positive correlation between p21 and p53 in the normal prostate. Also,

regarding the intensity of staining, there was positive correlation between p21 and p53 in

prostate tissue with PIN and between p27 and c-myc in prostates with PIA. Negative

correlation between c-myc and cyclin D1 was also found in the glands with PIN, considering

the number of labeled cells, and between p27 and c-myc in the prostates with PC for staining

intensity. In conclusion, the expression of p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc varies

according to type of proliferative lesion in canine prostate. Together, the results of this study

suggest low growth potential for canine PC in the presence of p21 and p27 overexpression,

cyclin D1seeming underexpression and regular expression of c-myc, also with the p53 mutant

type presence. Further, considering the similar immunophenotype presented by glands with

PIA, PIN and PC regarding these regulators of cell cycle progression, it is possible reaffirm

the premalignant potential of PIA and PIN in canine prostate.

Key words: c-myc, cyclin D1,benign prostatic hyperplasia, proliferative inflammatory

atrophy, prostatic intraepithelial neoplasia, prostatic carcinoma.

80

Imunoexpressão de reguladores do ciclo celular em próstatas caninas com

alterações proliferativas

RESUMO

Neste estudo a imunomarcação de p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc foi avaliada na próstata

canina normal e com desordens proliferativas para verificar quanto a interação desses

reguladores na progressão do ciclo celular. Um total de 106 amostras de próstata canina foi

obtido a partir de um bloco de TMA, sendo 15 normais, 16 hiperplasia prostática benigna

(HPB), 30 atrofia inflamatória proliferativa (PIA), 20 neoplasia intra-epitelial prostática

(PIN), e 25 carcinoma prostático (PC). Foi encontrada diferença na imunomarcação de p21,

p27, ciclina D1 e p53 no epitélio acinar em relação aos diagnósticos. Houve correlação

positiva entre p21 e p27 para as variáveis número de células marcadas e intensidade de

imunomarcação em todos os diagnósticos (normal, HPB, PIA, PIN e PC), e entre c-myc e p53

nas próstatas com PIN. De acordo com o número de células marcadas, houve correlação

positiva entre p21 e p53 na próstata normal. De acordo com a intensidade de imunomarcação

houve correlação positiva entre p21 e p53 no tecido prostático com PIN e entre p27 e c-myc

em próstatas com PIA. Foi observado também correlação negativa entre c-myc e ciclina D1

nas glândulas com PIN, considerando o número de células marcadas, e entre p27 e c-myc na

próstata com PC, para a variável intensidade de imunomarcação. Conclui-se quea expressão

de p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc variam na próstata canina de acordo com o tipo de lesão

proliferativa. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem baixo potencial de crescimento

dos carcinomas da próstata canina quando há superexpressão de p21 e de p27, aparente

subexpressão ciclina D1 e expressão normal de c-myc, mesmo na presença de p53 tipo

mutante. Ainda, considerando o imunofenótipo semelhante nas glândulas com PIA, PIN e PC

no que se refere aos reguladores da progressão do ciclo celular, reitera-se o potencial pré-

maligno da PIA e PIN na próstata canina.

Palavra chave:c-myc, ciclina D, hiperplasia prostática benigna, atrofia inflamatória

proliferativa, neoplasia intraepitelial prostática, carcinoma prostático.

81

INTRODUCTION

According to Brazilian National Institute of cancer (INCA)1, prostate cancer (PC)

is one of the largest cancer incidents among men in Brazil. There are estimated 68.800new

cases of PC in Brazil in 2014 year, these means 70.42 new cases per 100.000 human. Due to

similarities in natural occurrence and hormonal influence in development of benign prostatic

hyperplasia (BPH) and prostatic carcinoma (PC) between canine and human, canine prostate

have been studied as prostate carcinogenesis model2-4

. Furthermore, dysplastic lesions of

human prostate, such as prostatic intraepithelial neoplastic (PIN) and proliferative

inflammatory atrophy (PIA), are considered premalignant, because they show morphological

similarities to cancer and PIA commonly contain somatic mutations that are present in PIN

and PC3,5

.

The proliferation of cells is controlled at specific points in the cell cycle,

particularly at the G1-S and the G2-M transitions, with the evolvement of cyclins and cyclin-

dependent kinases (Cdk) and their inhibitors (CdkI`s). The major step in malignant

transformation in tumors is the uncontrolled cell cycle. Knowing the regulators is important to

understanding malignant transformations that occurred in tumor types6-9

.

One of the important proteins that control the cell cycle is the p53 protein, known

as guardianof genome, because if an error occurs in DNA transcription, it will stop the cell

cycle and action repair mechanisms or trigger apoptotic events, to death the cell. It occur by

stimulating p21 that has regulatory functions and blocks the cell cycle progression from G1-S

phase through different steps10,11

. Those protein p21 allow cell DNA repair, differentiation

and apoptosis12,13

. These tasks are performed by the interaction with cyclin A-cyclin

dependent kinase 2 (Cdk2), and cyclin D1-Cdk4 complexes14

. A reduction or a total absence

of p21 has been shown in tumors cell lines lacking p53 or containing a non-functional mutant

form of TP5315

.

Cyclin D1 (CD1) is positive regulator of G1 phase progression in the cell cycle,

binds to and activates the cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk6, regulate phosphorylation

of the retinoblastoma gene (Rb) product, thereby activating E2F transcription factors16,17

. Also

the CD1 protein is down-regulated by c-myc factor18,19

. In dogs, CD1 protein is also

overexpressed in mammary carcinoma, squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma20-

22, but not in cutaneous mast cell tumors

23.

Another important cell cycle inhibitor it is p27 protein, that increasing levels

result in blocking cell cycle in S phase12,24,25

. Yang et al.26

and De Marzo et al.27

observed

lower expression of p27 in lesions such as BPH, PIN and PC, concluding that this contributes

82

to the high rate of mitosis in these proliferative lesions. Also, Fredersdorf et al.28

and Tan et

al.29

infer that loss of p27 protein is a negative prognostic factor for human breast cancer.

The c-myc has been suggested as a key element of carcinogenesis in different

tumor type, with direct and indirect participation in a regulation of cell cycle and apoptosis30-

32. Expression of c-myc has been found in many types of canine neoplasm, as transmissible

venereal tumors (TVT)33

, eyelid tumors32

, osteosarcomas34

, mammary tumors35

and canine

prostate36

. In canine prostate the expression of c-myc protein is elevated in tissues with PIA

and PC and has been associated with loss of the tumor suppressor proteins NKX3.1 and E-

cadherin36

. In order to verify the interaction between the regulators of cell cycle progression

in canine prostate with proliferative lesions, p21, p27, p53, ciclina D1 and c-

mycimmunostaining was evaluated in normal glands and with BPH, PIA, PIN and PC.




(UFG), Goiania, Brazil recorded from 2008 to 2012. The research was approved by

committee on publication ethics COPE/UFG number 353/2010. Three-µm-sections were


hematoxylin and eosin (HE) for microscopic examination. Histomorphological evaluation

included normal prostates and with BPH37

, PIA38

, PIN39

, and PC40

. All prostatic samples were

from adult dogs with pure or mixed breeds and normal prostatic tissues were from dogs with

no lesions in the gland.

The prostate tissue microarray (TMA) was carried out according to criteria

described by Rubin et al.41

. From the previous defined areas in histomorphological evaluation,

tissue cores with a dimension of 1.0 mm were taken from FFPE tissue samples and arrayed on

a recipient paraffin block using the tissue microarray (Beencher Instruments®, Silver Spring,

USA). Three-µm-sections were obtained from recipient block and distended on charged slides

(Starfrost White, Sakura Adhesion microscope slide with Cut Edges, ready to use, Germany -

Dako 9545-1) for HE staining and immunohistochemistry.

Immunohistochemistry was performed in duplicate, in TMA slides, which were


specific protein were blocked with 3% hydrogen peroxide incubation for 20min, protein block

(Leica, Newcastle, UK, #RE7102) incubation for 5min at 37°C. For mouse monoclonal anti-

human p21WAF1/Cip1

clone SX118 (Dako, Carpinteria, CA, USA, #M7202), monoclonal mouse

83

anti-Human p27Kip1

clone SX53G8 (Dako Carpinteria, CA, USA, #M7203), monoclonal

mouse p53 clone 5G176 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, #sc-71785), monoclonal

mouse cyclin D1 clone A12 (Santa Cruz Biotechnology, Ca, USA, #sc-8396) and anti-Human

C-MYC Ab-2 clone 9E10.3 (Thermo Fisher Scientific, Neomarkes, #MS-139-P0).Antigen

retrieval was performed with 10 mM pre-heated citrate buffer, pH 6.0, for 3min, in pressure

cooker (Solar, Rapid Express, Tramontina, Brazil). The antibory was diluted at 1:50, 1:200,

1:500, 1:50, 1:50 respectively and incubated overnight, at 4°C, in wet chamber. Incubation

with polymer enzyme, chromogen and HRP substrate for signal detection were done using

reagents from polymer kit (New Link Max Polymer, United Kingdom, #RE7260-K) and

following manufacturer’s directions. Sections were counterstained with Mayer's hematoxylin,

washed, dehydrated, cleared, covers lipped, and examined by light microscopy.

Sample from human colon carcinoma for p21 and p27, human mammary

carcinoma for p53, and canine lymph node to cyclin D1 and c-myc were used as positive

control. For negative control the primary antibody was replaced by PBS buffer, pH 7.4. The

intensity of p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc reactivity was scored as: 0=negative, 1=mild,

2=moderate and 3=intense. Regarding the number of stained cells, the scores were:

0=negative, 1=1-25%, 2=26-50%, 3=51-75% and 4=76-100%.

The Chi-square, Kruskal-Wallis, nonparametric multiple comparison test for

paired contrasts the relative effects with Tukey correction, as well as descriptive data were

used to compare the scores of percentage of positive cells and their intensity. Association

between p21, p27, p53, cyclin D1and c-myc expression in normal prostatic tissue and with the

different lesions studied was achieved by Spearman test. For all it was used SPSS (IBM Corp.

Released 2010. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM Corp.)

and R (R Development Core Team (2008) R Foundation for Statistical Computing, Vienna,

Austria). All values were considered with 5% of significance level.

RESULTS

From TMA slide were obtained 15 (14.15%) were normal tissues, 16 (15.09%)

BPH, 30 (28.3%) PIA, 20 (18.87%) PIN, and 25 (23.58%) PC (Table 1).The immunostaining

was nuclear for p21, p27 and p53is shown in Figure 1, cytoplasmic for cyclin D1and nuclear

through cytoplasmic and membrane for c-mycis shown in Figure 2.

84

FIGURE 1 - Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining(arrow). A)

Canine PIN tissue with score three for labeling intensity and four for number of

labeled cells for p21. 200x. B) Human colon carcinoma. Positive control for p21 with scores two for labeling intensity and four for number of labeled cells. 400x. C)

Normal canine prostatic tissue with one for labeling intensity and one for number

of labeled cells for p21 (400X) D) Canine PIN with score two for labeling intensity

and two for number of labeled cells for p27. 200x. E) Human colon carcinoma. Positive control of p27 with score three for labeling intensity and four for number

of labeled cells. 400X. F) Canine PIA with score three for labeling intensity and

A B

E F

G H

C D

85

four for number of labeled cells for p53. 400X. G) Mammary carcinoma. Positive

control of p53 with score three for labeling intensity and three for number of

labeled cells. 200X. H)Normal canine prostatic tissue with 0- score for p-53 (400X). IHC, DAB, counterstained with H&E.

FIGURE 2.Immunohistochemistry photomicrography on nuclearthrough cytoplasmic and membrane

immunostaining.A) Canine PIN tissue with score one for labeling intensity and three for number of labeled cells of cytoplasmic cyclin D1 (arrow)(400X). B) Canine lymph

node. Positive control of cytoplasmic cyclin D1 (arrow) with score two for labeling

intensity and two for number of labeled cells.(400X) C) Normal canine prostatic tissue with 0- score for cyclin D1 (200X) D) Canine PC tissue with score three for labeling

intensity and four for number of labeled cells for nuclear through cytoplasmic c-myc

(arrow).(400X) E) Canine lymph node. Positive control of nuclear through cytoplasmic

c-myc (arrow), with score two for labeling intensity and four for number of labeled cells.(200X) F) Normal canine prostatic tissue with scorethree for labeling intensity and

four for number of labeled cells for c-myc(arrow). (200X). IHC 400x. DAB with H&E

counterstain.

A B

C D

E F

TABLE 1 - Distribution of cases according to the scores applied to variable number of labeled cells and intensity of labeling to p21, p27, p53, ciclyn D1 and c-

myc antibodies in normal prostate tissues and with BPH, PIA, PIN and PC.

Number of Labeled Cells (%) Intensity of Labeling Cells (%)

Diagnoses Antibodies 0 (0%) 1 (1-25%) 2 (26-50%) 3 (51-75%) 4 (76-100%) 0 Negative 1 (mild) 2 (moderate) 3 (intense)

Normal N=15

p21 46.67% (7) 0% 26.67% (4) 20% (3) 6.67% (1) 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0% p27 46.67% (7) 6.67% (1) 33.33% (5) 13.33% (2) 0% 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0%

c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (15) 0% 33.33% (5) 66.67% (10) 0%

cyclin D1 100% (15) 0% 0% 0% 0% 100% (15) 0% 0% 0% p53 73.33% (11) 20% (3) 6.67% (1) 0% 0% 73.33% (11) 26.67% (4) 0% 0%

BPH

N=16

p21 62.5% (10) 6.25% (1) 12.5% (2) 18.75% (3) 0% 62.5% (10) 37.5% (6) 0% 0%

p27 62.5% (10) 12.5% (2) 18.75% (3) 6.25% (1) 0% 62.5% (10) 37.5% (6) 0% 0% c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (16) 0% 18.75% (3) 81.25% (13) 0%

cyclin D1 62.5% (10) 0% 6.25% (1) 6.25% (1) 25% (4) 62.5% (10) 37.5% (6) 0% 0%

p53 37.5% (6) 18.75% (3) 43.75% (7) 0% 0% 37.5% (6) 62.5% (10) 0% 0%

PIA N=30

p21 13.33% (4) 6.67% (2) 13.33% (4) 40% (12) 26.67% (8) 13.33% (4) 56.67% (17) 23.33% (7) 6.67% (2) p27 13.33% (4) 6.67% (2) 23.33% (7) 43.33% (13) 13.33% (4) 13.33% (4) 36.67% (11) 40% (12) 6.67% (2)

c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (30) 0% 6.67% (2) 73.33% (22) 20% (6)

cyclin D1 30% (9) 13.33% (4) 33.33% (10) 0% 23.33% (7) 30% (9) 60% (18) 6.67% (2) 3.33% (1) p53 6.67% (2) 0% 70% (21) 10% (3) 13.33% (4) 6.67% (2) 83.33% (25) 10% (3) 0%

PIN

N=20

p21 10% (2) 5% (1) 5% (1) 15% (3) 65% (13) 10% (2) 25% (5) 35% (7) 30% (6)

p27 15% (3) 5% (1) 20% (4) 40% (8) 20% (4) 15% (3) 35% (7) 35% (7) 15% (3) c-myc 0% 0% 0% 5% (1) 95% (19) 0% 20% (4) 75% (15) 5% (1)

cyclin D1 20% (4) 10% (2) 65% (13) 5% (1) 0% 20% (4) 80% (16) 0% 0%

p53 10% (2) 0% 15% (3) 40% (8) 35% (7) 10% (2) 50% (10) 35% (7) 5% (1)

Carcinoma N=25

p21 24% (6) 8% (2) 8% (2) 12% (3) 48% (12) 24% (6) 24% (6) 12% (3) 40% (10) p27 16% (4) 0% 24% (6) 20% (5) 40% (10) 16% (4) 24% (6) 20% (5) 40% (10)

c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (25) 0% 32% (8) 44% (11) 24% (6)

cyclin D1 28% (7) 40% (10) 8% (2) 0% 24% (6) 28% (7) 60% (15) 12% (3) 0% p53 4% (1) 4% (1) 24% (6) 8% (2) 60% (15) 4% (1) 60% (15) 28% (7) 8% (2)

87

The number of stained cells to p21 in normal prostatic tissue was different

from those with PIN, as well as it was different in prostatic tissues with BPH from those

with PIA, PIN and PC. According to intensity of expression, there were differences in

normal prostatic tissue from those with PIA, PIN and PC, as well as it was different in

prostatic tissues with BPH from those with PIA, PIN and PC (p<0.05 - Table 2).


from those with PIA, PIN and PC, as well as it was different in prostatic tissues with

BPH from those with PIA, PIN and PC. According to intensity of expression, there were

differences in normal prostatic tissue from those with PIA, PIN and PC, as well as it

was different in prostatic tissues with BPH from those with PIA, PIN and PC (p<0.05 -

Table 2).


from those with PIA, PIN and PC as well as it was different in prostatic tissues with

BPH from those with PIA, PIN and PC, and in prostatic tissues with PIA from those

with PC. According to intensity of expression, there were differences in normal

prostatic tissue from those with PIA, PIN and PC, as well as it was different in prostatic

tissues with BPH from those with PIA, PIN and PC (p<0.05 - Table 2).

The number of stained cells to cyclin D1 in normal prostatic tissue was

different from those with BPH, PIA, PIN and PC. According to intensity of expression,

there were differences in normal prostatic tissue from those with BPH, PIA, PIN and PC

(p<0.05 - Table 2).The number and the intensity of stained cells to c-myc antibody there

were no difference according to diagnoses (p<0.05 - Table 2).

TABLE 2 -Means of comparison between p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc immunostaining regarding the number of stained cells and intensity of staining cells in canine normal

prostatic tissue and with BPH, PIA, PIN and PC.

Diagnoses N

Rank of Number of Stained Cells Rank of Staining Intensity

p21 p27 c-

myc

cyclin

D1 p53 p21 p27

c-

myc

cyclin

D1 p53

Normal 15 36.3a

34.4a

54.0a

23.0a

16.9a

33.9a

31.6a

42.5a

21.5a

23.0a

BPH 16 28.0ab

26.4a

54.0a

49.1b

30.4a

28.3a

28.4a

49.3a

46.5b

38.4a

PIA 30 57.8ac

60.1b

54.5a

61.7b

54.6b

55.8b

60.4b

63.3a

61.4b

55.7b

PIN 20 72.5c

62.3b

55.4a

62.8b

70.8bc

71.4b

60.8b

50.8a

61.5b

66.9b

Carcinoma 25 59.8ac

67.4b

56.0a

57.3b

75.2c

64.3b

68.6b

53.2a

61.6b

68.2b

Similar letters in the same column are not different by nonparametric multiple comparison test

for paired contrasts the relative effects with Tukey correction. (p value - p<0.05).

88

There was strong positive correlation between p21 and p27 for both number

of stained cells and staining intensity for normal tissue and with BPH, PIA, PIN and PC.

There was positive correlation between p21 and p53 regarding to number of stained

cells in normal prostate tissue, and also the intensity of staining to PIN tissue. There

were positive correlation of staining intensity between p27 and c-myc in prostates with

PIA. Also, in prostates with PIN there is correlation between p53 and c-myc regarding

to intensity of staining cell (Table 3).

Furthermore, there was negative correlation between c-myc and cyclin D1

for prostate tissue with PIN regarding the number of stained cells. Considering staining

intensity, there was negative correlation between p27 and c-myc and between p21 and

c-myc for prostate with carcinoma. That means that high values of one variable are

associated the low values of the other variable (Table 3).

89

TABLE 3 - Means of correlation between antibodies expression regarding the number of stained cells and intensity of staining

of the normal canine prostate and with BPH, PIA, PIN and PC.

CORRELATION

between antibodies

Diagnoses

Normal BPH PIA PIN PC

R P R P R P R P R P N

um

ber

of

Sta

ined

Cel

ls

p21/p27 0.841 <0.001cr 0.992 <0.001

cr 0.527 0.043

cr 0.528 0.017

cr 0.587 0.002

cr

p21/cyclin D1 - - 0.173 0.681 -0.30 0.272 -0.329 0.157 0.273 0.187

p21/p53 0.518 0.048cr 0.378 0.356 -0.073 0.797 0.223 0.345 0.088 0.676

p27/cyclin D1 - - 0.201 0.634 0.170 0.545 -0.123 0.606 0.201 0.334

p27/p53 0.325 0.237 0.375 0.360 -0.019 0.947 0.090 0.705 0.265 0.200

c-Myc/cyclin D1 - - - - - - -0.446 0.049cr - -

c-Myc/p53 - - - - - - 0.379 0.009cr - -

cyclin D1/ p53 - - 0.344 0.404 0.022 0.938 -0.307 0.187 0.161 0.442

Sta

inin

g I

nte

nsi

ty

p21/p27 0.732 0.002cr 1.000 <0.001

cr 0.522 0.046

cr 0.429 0.050

cr 0.573 0.003

cr

p21/c-Myc -0.378 0.165 0.293 0.482 0.121 0.667 0.324 0.164 -0.404 0.045cr

p21/cyclin D1 - - 0.467 0.244 0.295 0.286 -0.057 0.813 0.061 0.772

p21/p53 0.262 0.346 0.447 0.267 0.250 0.369 0.445 0.050cr -0.056 0.789

p27/c-Myc -0.378 0.165 0.293 0.482 0.592 0.020cr -0.058 0.807 -0.586 0.002

cr

p27/cyclin D1 - - 0.467 0.244 0.407 0.132 -0.114 0.633 -0.039 0.852

p27/p53 0.262 0.346 0.447 0.267 0.150 0.594 0.200 0.397 0.090 0.669

c-Myc/cyclin D1 - - 0.293 0.482 0.058 0.837 0.100 0.674 0.064 0.762

c-Myc/p53 -0.213 0.446 -0.218 0.604 -0.069 0.806 0.593 0.006cr 0.145 0.488

cyclin D1/ p53 - - 0.447 0.267 0.282 0.309 0.083 0.728 0.124 0.554

R = Spearman´s correlation between the antibodies; P values followed by the letters cr represents the correlation between the

antibodies (p<0.05).

90

DISCUSSION

In this study p21 was overexpressed in 40% of PC, 30% in PIN and 6.7% of PIA.

Furthermore, Xiong et al.42

reported p21 overexpression in 100% of malignant mammary

tumors when compared to normal mammary gland in women. Thus, it seems that malignant

tissue shows high expression of p21, which would work as a pathway to control cell

proliferation in those tissues. Increased expression of p21 may lead a crucial part in growth

arrest, inducing senescence or apoptosis, a mechanism which seems to protect against

malignant transformation43-45

. According to Majid et al.44

, increased levels of p21 indicate

good prognosis. So, the p21 overexpression observed in canine PC could mean tumors more

controlled in terms of proliferation and growing.

Almost prostates with BHP were p21 negative and those ones positives to p21

showed mild immunostaining, which could contribute to the typical cell proliferation

associated with this condition in the canine prostate. According to Huang et al.45

, prostatic

tissue with BPH may express p21 due to an alteration in CDKN1A (p21 gene). It could cause

an imbalance between cell proliferation and apoptosis in the prostatic tissue,resulting in a

continuous cell cycle,which influences the cell proliferation andinvolves the pathogenesis of

BPH45

.

It was observed p53 expression in normal canine prostate, in proliferative lesions

and a higher expression in PC, as reported by Fernandez e Thomson25

and by Croce et al.46

.

There were differences between PIA and PC, but not between PC and PIN regarding the

number of stained cells. These results suggest that alterations related with p53 protein start in

canine prostate with PIA and become accentuated in canine glands with PIN and PC,

reinforcing malignant potential of PIN as described before in dogs46

, and humans47-49

.

According to Quian et al.47

, Tsujimoto et al.48

and Stangelberger et al.49

, the high expression

of p53 in human PC and PIN has been associated with progression of disease due to higher

proliferative indices and more aggressive phenotype.

Prostate with PIA, PIN and PC showed higher immunostaining of p27 when

compared to BPH and normal tissue. The opposite was reported by Yang et al.26

and De

Marzo et al.27

in human prostate with PIN and PC, whichshowed lower expression of p27.

Once loss or decrease of p27 protein has been associated with cancer cell undifferentiation,

proliferation and poor prognostic50-53

, it is prompt to think that p27 would be working as a

product of one suppressor gene (CDKN1B) in canine prostate tissues with premalignant and

malignant lesions. Reinforcing this hypothesis, Trotman et al.54

have observed 100% of

prostate tumors in p27-deficient mices. Wang et al.53

reported thatoverexpression of p27 in

91

prostate with PIN may contribute to preventing and inhibitingthe progression of PIN to

invasive PC. Either, Wang et al.53

affirm that both p27 and p53 function should be checkedin

the progression of PIN to invasive cancer in order to prognosis establishment.

In canine prostate we observed cyclin D1 (CD1) immunostaining only in tissues

with lesions (BPH, PIA, PIN, PC). Moreover, the CD1 expression though almost mild it was

more frequent in prostates with PIA, PIN and PC if compared to BPH. CD1 protein is a

positive regulator of G1-S phase progression in the cell cycle. It binds to and activates the

cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk616,17,20,55

, and the low expression of CD1 is

significantly associated with high expression of p21 protein13,43,56,57

. Also according to

Jirawatnotai et al.58

, CD1 may play a positive role in DNA damage repair. Thus, the

seeminglower expression of CD1 in association with high p21 expression could mean the

slowing of cell cycle and it mild expression could represent the repairing of DNA damagedin

the prostatic tissue with proliferative lesion.

Interestingly, even with no differences regarding c-myc immunostainingaccording

to diagnosis, c-myc immunostaining was found in all normal prostates and with PIA, PIN, and

PC, PIA and PIN. However, it was cytoplasmic or nuclear depending on diagnosis, being

cytoplasmic in normal and with BPH prostates, and cytoplasmic and/or nuclear in glands with

PIA, PIN and PC. It was also observed that even in low frequence, the immunostaining

became stronger from PIA to PIN and from this to PC and also if compared to normal prostate

and with BPH. It was similar to Fonseca-Alves et al.36

that have reported c-myc

immunostaining in canine normal prostate and with PIA and PC having concomitant PIN foci.

They also observed cytoplasmic and nuclear immunostaining,but with nuclear staining only

few prostates with PC. Although the cytoplasmic immunostaining of c-myc is reported36,59

, its

importance at this location is controversial, since Koh et al.60

affirm that almost c-myc

functions are besed on its known nuclear action. So, considering our results for nuclear

immunostaining of c-myc it seems that lesions of PIA and PIN really have any malignant

potencial and the canine PC could be less aggressive, since the increased c-myc expression in

the human PC is related totumor cell proliferation, indifferentiation of basal cells and changes

in the apoptotic pathway60,61

. To Koh et al.60

, Gurel et al.61

and Dang62

c-myc is

overexpressed at early and late stages of development of PC and many others human cancers.

It was observed correlation between p21 and p27 in all tissues (normal, BPH,

PIA, PIN and PC) regarding the number and intensity of immunostaining in canine prostates,

but not between p21, p27 and cyclin D1 and c-myc. In this context, Wang et al.57

reported that

when p21 and p27 levels are increased and cyclin D1 decreased, good prognosis is indicated.

92

Likewise, Majid et al.44

reported increase of p21 and p27 protein with decrease of several

types of cyclin (A2, B2, E1 and E2), but not with cyclin D1. Thus, herein our results suggests

that even with no correlation between all those proteins, the positive relation between p21 and

p27 overexpression and decreasing of CD1 seems to be controlling the cell proliferation in

canine prostates with proliferative disorders, mainly in PC, which could explain the low

incidence of canine PC in comparison with this tumor in human glands.

There was positive correlation between immunostaining of p21 and p53 in canine

prostatic normal tissues, but no in prostates with proliferative lesions, except in glands with

PIN regarding intensity of staining. It confirms that the expressions of p21and p53 are

associated, with both playing role together in the cell pathway where p53 induces p21in

normal tissues10-15

. Thus, this known cellular mechanism of control and repair would be

absent in those canine prostates with PIA and PC, enabling the cell growing, since areduction

or absence of p21 has been shown in cell lines of tumors with lacking of p53 or containing a

non-functional mutant form of TP5315,49

. However, it seems that even in the presence of p53

mutant, p21 is induced and keeps its action controlling cell growing, which could justify the

low development of PC in canine prostate. In prostates with PIA the inflammatory

environment could be changing those proteins expression and other p21 pathways would be

arresting the cell proliferation. In this context, Yan et al.63

indentified p21 induction

independent of p53 expression in several cell types of tumors, including human breast cancer

cells and the canine kidney cell line. Also, in human PC,Matsushima et al.64

reported that PC

with p53+/p21

- phenotype showed poorer prognosis compared with those p53

+/p21

+,and that

combination could predict the patient survival more accurately than p53 immunostaining

alone, turning p21 a useful tool for interpretation of p53 IHC results.

CONCLUSIONS

The results suggest low growth potential for canine PC in the presence of p21 and

p27 overexpression, cyclin D1 seeming low expression and regular expression of c-myc, also

with the p53 mutant type presence. The similar cell cycle progression regulators

immunostaining profile presented by glands with PIA, PIN and PC, corroborate the pre-

malignant potential of PIA and PIN in canine prostate.

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“As leis da genética encontram-se presididas por numerosos agentes psíquicos que a ciência

da Terra está longe de formular...”

Emmanuel (Francisco Cândido Xavier)

O consolador (pergunta nº 35) ano 1940

CAPÍTULO 5 - CONSIDERAÇÕES FINAIS

Na realização desta tese foi possível observar que há controvérsia acerca do

potencial de malignidade da PIA na próstata canina, sendo que este quadro vem se

modificando. Os relatos em periódicos que descrevem a PIA no cão, bem como sua relação

com tecidos adjacentes e concomitância com outras lesões proliferativas como HPB, PIN e

PC, apesar de escassos, vem aumentando. No entanto, essas lesões ainda constituem

grande desafio à pesquisa do câncer ao entendimento das alterações genéticas e

epigenéticas associadas à oncogênese, que contribuem para as alterações celulares e

biológicas que podem ser reconhecidas como malignas. Genes intimamente envolvidos na

regulação da proliferação celular são conhecidos por alterarem-se em todos os casos.

Frente a esse desafio, o objetivo principal deste trabalho foi estudar proteínas

envolvidas no ciclo celular, com o intuito de melhor entender os possíveis mecanismos de

escape do controle do ciclo e assim verificar o potencial pré-maligno da PIA e maligno do

PC na espécie canina.

Nesse sentido, foi possível observar a expressão de p21, p27, p53, ciclina D1,

c-myc, EGFR e Her2 na próstata canina e inferir que essas proteínas participam de forma

direta ou indireta no processo de desenvolvimento do carcinoma na próstata dos cães, bem

como da PIA. Ainda, analisados em conjunto, os resultados direcionam à conclusão de que

o carcinoma da próstata canina apresenta baixo potencial de progressão, o que justifica a

baixa frequência de casos observada na clínica veterinária, somado ao fato de que, mesmo

quando presente, as metástases não se desenvolvem de forma imediata. Esse perfil

imunofenotípico voltado a um baixo potencial de progressão também justificaria o

interessante fato de se ter encontrado inúmeros focos de PIN e PC na próstata de cães que

não apresentavam sinais macroscópicos de tumor. Isto faz questionar quanto ao que se diz

raro na literatura. O que é raro, o desenvolvimento ou o diagnóstico dessas lesões na

próstata canina? Ainda, porque tantos focos de PC constatados na próstata dos cães de

Goiânia? Qual o fator predisponente nessa região do país que contribui para a presença

expressiva do carcinoma na próstata do cão?

Na espécie humana, o emprego dessas proteínas como marcadores tumorais

vem sendo amplamente estudado e muitos já são utilizados na rotina diagnóstica e

prognóstica do câncer humano, como é o caso do Her2 para neoplasias mamárias. No cão

não foi possível correlacionar a expressão dessas proteínas com a evolução da doença,

evidência clínica do tumor e prognóstico.

99

Diante do elevado número de amostras obtidas foi possível otimizar o estudo

com o uso do bloco de TMA, conferindo grande economia de reagentes e tempo, além de

proporcionar a uniformização na realização das reações. Somado a isso, a compilação das

amostras em uma única lâmina facilita a interpretação comparativa dos casos, com

possibilidade de repetição das reações em múltiplos níveis do bloco, o que confere melhor

representação das lesões em comparação ao corte original. Ainda, seu uso simplifica o

trabalho das linhas de pesquisa, já que as amostras podem ser utilizadas em mais de um

projeto.

O avanço das pesquisas, com o advento de novas técnicas e a disponibilidade

de reagentes comerciais tornou possível a extração de material biológico proveniente de

material parafinizado, a exemplo de RNA e DNA em quantidade e qualidade, viabilizando

a realização das técnicas de RT-PCR e RT-qPCR neste estudo. Isso também possibilita a

realização de estudos retrospectivos envolvendo material de arquivo, aumentando a

quantidade de material a ser estudado.

Identificando bons marcadores de diagnóstico, prognóstico e tratamento será

possível estabelecer terapias precoces e efetivas para o tratamento do câncer prostático.

Nesse sentido, o estudo da expressão de p21, p27, p53, ciclina D1, c-myc, EGFR e Her2

em próstatas caninas com PIN, PIA e PC permitiram-nos adicionar novos dados ao

conhecimento dos eventos biológicos que desencadeiam o câncer prostático no cão e

reforçou o conceito de que o cão é o melhor modelo experimental para a verificação desses

eventos na próstata humana.

100

ANEXO A

Tabela contendo a quantidade e pureza do DNA e RNA (razão

A260/280)extraído das 16 amostras de próstata parafina.

Sample Diagnoses DNA RNA

A260/A280 ng/ul A260/A280 ng/ul

1 – N1

Normal

1.893 106.0 1.758 182.4

2 - N2 1.988 313.0 1.798 78.4

3 - N3 1.806 149.0 1.837 76.4

4 - N4 1.985 260.0 1.960 58.8

5- PIA 1

PIA

1.985 260.0 1.971 67.8

6 – PIA 2 2.007 697.5 1.953 82.8

7 - PIA 3 1.847 318.0 1.973 60.3

8 – PC 1

PC

1.944 190.5 2.057 57.6

9 - PC 2 1.983 229.0 1.858 84.0

10 – PC3 1.888 497.5 2.130 59.7

11 – PC 4 1.942 506.0 1.976 76.8

12 - PC 5 1.977 207.5 1.851 124.4

13 – PC 6 1.904 227.5 1.923 70.0

14 – PC 7 1.931 309.0 1.851 672.0

15 – PC 8 1.925 412.0 1.753 127.6

16 - PC 9 1.884 574.5 1.781 74.8

17 – MC 1 MC 1.926 586.5 1.888 377.6

MC: Mammary carcinoma.

101

APÊNDICE A

Relatório do comitê de ética: protocolo 353/10

expressÃo de receptores de egf, inibidores e …

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