Inibidores de Proteases Vegetais

Lhaís Leal Márcia Vieira

Inibidores de proteases (PIs)

• Inibidores de protease são proteínas ou peptídeos capazes de inibir a atividade catalítica de enzimas proteolíticas.

• Encontrados em todas as formas de vida.

Qual a sua importância para as plantas?

• São proteínas relacionadas a patogênese (PR-proteins) de classe VI.

• Podem estar envolvidos em processos de degradadação endógena de proteínas, na maturação de proteínas de reserva, morte celular programada.

4 Classes

-metaloproteinases(Zn2+ e/ou Mg2+)

Hys

-proteinases aspárticasAsp (ácido aspártico)

-serinoproteinasesHis, Asp e Ser (C-terminal)Tripsina e quimiotripsina

-proteinases cisteínicasGln – Cys – His - Asn

Clivam ligações peptídicasComposição do domínio

catalítico: podem exo e/ou endo proteases.

FAMÍLIAS CaracterísticasInibidor do tipo Kunitz Proteínas com massa de aprox. 20 kDa, possuem 4

resíduos de cisteína. Foram duas pontes dissulfeto. Presente em sementes de leguminosas.

Bowman-Birk Possuem dois sítios reativos, massa entre 8-10kDa.SerpinsInibidores de cisteínoproteases

Amplamente distribuídos em plantas e animais.

Potato type I protease inhibitors

Ausência de pontes dissulfeto para alguns inibidores. Podem ser encontrados em animais e protozoparios.

Potato type II protease inhibitors

Foi isolado inicialmente da batata. Dois dominios, com 2 sítios reativos. Massa de 21 kDa.

Metallocarboxypeptidase inhibitors

Formam complexos com a carboxipetidases de mamíferos.

Mustard Trypsin Inhibitors Isolados de sementes de mostarda, massa molecular de aprox. 7 kDa, contem 4 pontes dissulfeto.

Squash protease inhibitors Cereal trypsin/alpha-amylase inhibitors

Também inibem as α-amilases, massa aprox. de 13 kDa

Estrutura terciária dos inibidores de proteases

Sítio reativo

Figura 1 - Representação da estrutura tridimensional do inibidor de tripsina de Inga laurina. (A) Visão geralda formação do complexo entre o inibidor e a enzima tripsina e (B) detalhe da interação entre o resíduo deLisina 64 e os resíduos da tríade catalítica (Ser195, His57 e Asp102) presentes no sítio catalítico durante aformação do complexo (adaptado de MACEDO et al., 2011).

Fonte:http://www.seer.perspectivasonline.com.br/index.php/CBS/article/viewFile/14/3

Coevolução?

Adaptação?

São comumente mais expressos em folhas e sementes

Atividade inseticida

Introdução

Importantes na inativação de proteases-alvo:• Relacionadas a processos patogênicos em doenças humanas.• Fatores antinutricionais em insetos.• Podem atuar no retardo de processos de deterioração de alimentos relacionados a ação de proteases endógenas e exógenas

Quimiotripsina

P. monodon

Moringa oleifera

Planta de distribuição pantropical:• Muito utilizada no tratamento de doenças• Folhas – raízes – sementes – caule• Ausência de relatos sobre a presença de inibidores de proteases.

OBJETIVO:• Detectar atividade inibitória do inibidor extraído de M. oleifera contra proteases terapeuticamente importantes e comercialmente disponíveis.• Efeito preservativo no camarão Penaeus monodon

Metodologia

TRIAGEM INICIAL-15 espécies de

diferentes famílias

EXTRAÇÃO-nas diferentes espécies;

-diferentes partes da planta

-diferentes soluções

ENSAIO DE ATIVIDADE INIBITÓRIA

-Tripsina-Caseína

-TCA-UV-Spectrofotômetro

QUANTIFICAÇÃO PROTÉICA

Lowry, 1951(BSA)

Kunitz, 1947

PURIFICAÇÃO- Precipitação com (NH4)2SO4

-Cromatografia de troca iônica+Gel filtração

-Eletroforese

EFEITO DO PI de M. oleífera em proteases de

importância terapêutica(0,27 mg/mL)

EFEITO DO PI de M. oleífera na proteólise de P. monodon durante seu armazenamento

(3 doses testadas)

Triagem inicial

Tabela 1: Triagem de plantas para inibidor de proteases.

77%63%

Purificação

Bijina et al., 2011

Ensaios de inibição

Proteases de importância terapêutica

• Os inibidores de proteases modulam a atividade de proteases e controlam diversos processos como a coagulação, fibrinólise e remodelamento tecidual (Laskowski and Kato, 1980)

• Catepsina B, atua em muitos processos patológicos, como o câncer e a invasão de protozoários.

• As serinoproteases constituem o intestino de muitos insetos.

• Método de Kunitz (1947)

Inibição da proteólise de P. monodon

•Amostras tratados com 10mL de PI purificado;•Amostras incubadas a T.A por 8h; 4ºC por 24 hrs e -20ºC por 168hr.• Amostras não tratadas foram incubadas nas mesmas condições.

Dosagem de 0,2 mg

Proteases de micro-organismos podem causar a degradação do

tecido, havendo perdas significativas de conteúdo protéico na carne desses

camarões

Conclusões

• O PI isolado de M. oleifera tem potencial uso contra algumas proteases de importancia farmacêutica. Ex.: Catepsina B.

• É um candidato ao uso como preservativo de frutos do mar.

• Estudos posteriores sobre a dose ideal ainda são necessários.

Aplicabilidade de proteínas inibidoras de proteases

Proteínas de defesa vegetal

INTRODUÇÃO• Lectinas;• Proteínas inativadoras de

proteases;• Inibidoras de enzimas

proteolíticas e glicohidrolases.

O uso de inibidores de proteases no controle de insetos depende da inibição de proteases digestivas do intestino;

A maioria dos lepdópteros tem fluido intestinal alcalino com ph variando entre 9 e 11;

Serinas – proteinases e quimiotripsinas são as principais enzimas proteolícas em seus fluidos intestinais.

• Prasad, E.R. et al (2010) sugere a presença de Bowman–Birk inhibitor (BBI) em sementes de grama vermelha e grama preta;

• Prasad, E.R. et al (2010) sugere que inibidores de proteases de grama vermelha teve forte atividade inibitória contra Achaea janata e Manduca sexta;

• JONGSMA, M.A. sugere que pragas de insetos sejam capazes de se adaptarem contra inibidores de proteinases de plantas.

• Necessário o rastreio de potentes inibidores de proteases com ação inseticida.

• O trabalho tem como objetivo explorar a atividade de inibidores de proteases de sementes de grama vermelha e grama preta.

• Efeito in vitro: A. janata, H. armigera, Spodoptera,litura, Amsacta albistriga, Daphnis nerii, Papilio demoleus, Corcyra cephalonica e Bombyx mori;

• Cajanus cajan H. armigera e A. albistriga;

• Vigna mungo H. armigera e S. litura;

• A estabilidade das isoformas de inibidores de Red gram e Black gram foram comparadas na presença de proteinases intestinais de A. janata, H. armigera e S. litura;

• O efeito in vivo de RGPI e BGPI foram investigados avaliando o crescimento e desenvolvimento larval A. janata e S. litura.

Materiais e métodoSeleção dos materiais

Purificação de RGPI e BRPI: cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade por Sefarose, cromatografia por exclusão molecular (Sephadex).

Estimativa do teor de proteínas do extrato bruto, bem como extrato do intestino de insetos foi determinada por Folin – Ciocalteu usando BSA como padrão.

Criação de insetos As larvas foram alimentadas com folhas frescas de mamonas ;

As pupas foram alimentadas com 20% de mel contendo 200 g de vitamina E;

Os ovos dos insetos foram colocados para eclodir em um papel filtro úmido.

Extração de proteases intestinais As proteinases foram extraídas do conteúdo alimentar das larvas seguindo

a metodologia de Girard et al .

Atividade da protease e inibidor de protease

A atividade da protease foi medida usando o substrato sintético BAPNA ( benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida);

O potencial inibitório de RgPI e BgPI ou BBI de soja foram determinados incubando PIs e extratos de intestino em tampão de ensaio à 37c° por 15 min.

• Visualização dos perfis inibitórios contra tripsina, quimiotripsina e proteases intestinais

Gel de eletroforese de poliacrilamida com gelatina a 1%;

Em seguida o gel foi incubado com TRIS – HCL ( Ph 8.2) contendo tripsina (0.1 mg/ ml) ou 0.1 M Tris – HCL ( ph 7.8) contendo quimiotripsina ( 0.2 mg/ ml;

Os géis foram incubados em 0,1 M Tris-HCl (pH 8,2) contendo extrato A. Janata midgut ou em 0,1 M de glicina-NaOH (pH 10,5) contendo extrato intestino de H. armigera ou S. litura durante 30 min a 4 º C seguido por 2 h à37° C.

Após a hidrólise da gelatina o gel foi corado com Comassie blue.

Zimograma de extratos do intestino de insetos foi realizado de acordo com o método de Garcia-Carreno et al ;

Efeito de RGPI e BGPI sobre o crescimento e desenvolvimento larval

Para examinar os efeitos dos PIs sobre o crescimento e desenvolvimento Larval de S. litura ,uma dieta artificial foi suplementada com diferentes concentrações (0.025 % e 0.050%) de RgPI ou BgPI;

Para testar o efeito dos PIs sobre o crescimento e desenvolvimento larval de A. janata , revestiu- se folhas de mamona com concentrações diferentes de PIs (2,4,8 ug / cm2 da área foliar).

Análise estatística realizada por SigmaStat 3.1.

Resultados

Efeito in vitro do RPI e BPI sobre as proteases tipo – tripsina do intestino .

Fig. 2. Effect of chemical modification of lysine residues on the inhibitory activity of RgPI and BgPI towards trypsin-like proteinases from larval midgut of A. janata and H. armigera. The lysine residues were modified according to the method of Hayne et al. [38] using TNBS. The midgut proteinases were incubated with modified and unmodified inhibitors for 15 min and residual trypsin-like proteinase activity was measured as described above. Bars with different letters are significantly different(P < 0.05). Values are the mean ± S.E.

Estabilidade de isoinibidores na presença de proteases

intestinais.

Efeitos de RgPI e BgPI sobre o crescimento e desenvolvimento de A. janata .

Efeitos de RgPI e BgPI sobre o crescimento e desenvolvimento de S. litura.

Fig. 5. Development of A. janata larvae reared on castor leaf coated with either RgPI or BgPI in different concentrations as indicated above. The photographs of the larvae after6 days of feeding on castor leaves coated with RgPI/BgPI at a concentration of 2 lg/cm2, 4 lg/cm2 and 8 lg/cm2 leaf area.

Discussão e conclusão Inibidores de proteases de plantas agem como substratos

específicos para proteases digestivas;

PIs são importantes na defesa da planta;

RGIP e RBIP apresentaram atividade inibitória sobre os lepidópteros;

RGIP e RBIP apresentaram atividade inibitória de tripsina bovina bem como quimiotripsina. Contudo a inibição foi maior sobre a tripsina quando comparado com a quimiotripsina.

ProteasesInibidor

• Sivakumar, S. et al (2005), inibidor da tripsina isolado a partir Prosophis juliflora demonstrou apenas 45% de inibição sobre as enzimas do intestino de A. Janata, enquanto o inibidor da mesma, apresentou 83% de inibição sobre a tripsina digestiva de H. armigera;

• Em geral, os IPs de planta hospedeira são ineficazes ou respondem moderadamente a infestação de pragas, como foi observado com RgPI e BgPI contra H. armigera e

S. litura.

• Qi et al. sugeriu que a presença de lisina ou arginina no sítio reativo do PIs tipo BBI é responsável pela ligação à tripsina , inibindo a sua atividade;

• o presente estudo indicou que o resíduo de lisina (s) dos IPs desempenham um papel importante na inibição de tripsina- tipo protease no intestino de A. Janata e H. armigera;

• RGPI e RBPI revelaram a presença de isoinibidores;

• O estudo sugeriu que os inibidores RGPI e BGPI inibem a ação das proteases formando complexos estáveis;

• RGPI e BGPI foram eficiente na inibição do crescimento e desenvolvimento larval A. Janata e S. litura.

• A redução do peso e da taxa de sobrevivência das larvas sugerem que os genes para RGPI e BGPI podem ser alvos potenciais para estudos de desenvolvimento de insetos em plantas transgênicas contra A. janata;

• Além disso, o gene que codifica para BgPI que tem efeito moderado sobre o crescimento e desenvolvimento das larvas de S. litura, também poderia ser alvo potencial nadesenvolvimento de plantas transgênicas a este inseto.

Referências

• JONGSMA, M.A.; BAKKER, P.L.; PETERS, J. ; BOSCH, D. ; STIEKEMA, W.J. Adaptation of Spodoptera exigua larvae to plant proteinase inhibitors by induction of gut proteinase activity insensitive to inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9, 8041–8045, 1995.

• PRASAD, E.R. ; DUTTA-GUPTA, A. ; PADMASREE, K. Purification and characterization of a Bowman–Birk proteinase inhibitor from the seeds of black gram (Vigna mungo). Phytochemistry . 71 ,363–372,2010.

• PRASAD, E.R. ; MERZENDORFER, H.; MADHURAREKHA, C.; DUTTA-GUPTA, A. ; PADMASREE, K. ; Bowman–birk proteinase inhibitor from Cajanus cajan seeds: purification, characterization, and insecticidal properties, J. Agric. Food Chem. 58, 2838–2847, 2010 .

• SIVAKUMAR, S. ; FRANCO, O.L.; TAGLIARI, P.D.; BLOCH ,J.R; MOHAN, M.; THAYUMANAVAN, B. Screening and purification of a novel trypsin inhibitor from Prosopis juliflora seeds with activity toward pest digestive enzymes, ProteinPept. Lett. 12, 561–565, 2005.