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Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas
Curso de Doutorado em Ciências Biológicas
ESTUDOS CLÍNICO-MOLECULARES DE TRÊS
FAMÍLIAS PERNAMBUCANAS COM MICROCEFALIA PRIMÁRIA
Recife Outubro 2003
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Centro de Ciências Biológicas Curso de Doutorado em Ciências Biológicas
Universidade Federal de Pernambuco
ESTUDOS CLÍNICO-MOLECULARES DE TRÊS FAMÍLIAS PERNAMBUCANAS COM
MICROCEFALIA PRIMÁRIA
Tese apresentada por Gabriela Ferraz Leal ao Curso de Doutorado em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (área de concentração: Genética).
Orientador: Prof. Elias Oliveira da Silva (Depto. Genética, UFPE)
Recife Outubro 2003
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas
Curso de Doutorado em Ciências Biológicas
ESTUDOS CLÍNICO-MOLECULARES DE TRÊS FAMÍLIAS
PERNAMBUCANAS COM MICROCEFALIA PRIMÁRIA
Comissão Examinadora
Membros titulares:
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Elias Oliveira da Silva, Depto. de Genética, CCB, UFPE ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Gisélia Alves Pontes da Silva, Depto. Materno-Infantil, CCS, UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. João Guilherme Bezerra Alves, Instituto Materno-Infantil de Pernambuco ___________________________________________________________________ Prof. Dr. José Ferreira dos Santos, Depto. de Genética, CCB, UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo Moraes Valença, Depto. de Neuropsiquiatria, CCS, UFPE
Membros suplentes:
___________________________________________________________________ Profa. Dra. Rosilda dos Santos Silva, Dpto. de Genética, CCB, UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Antônio de Moraes Júnior, Dpto. de Genética, CCB, UFPE
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Aos pacientes e suas famílias, que têm
me ensinado genética clínica e, muitas vezes,
muito mais do que isso.
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AGRADECIMENTOS
Às famílias estudadas neste trabalho, pela confiança e colaboração de tão boa vontade; Ao Prof. Elias Oliveira da Silva, por mais esta orientação, prolongamento de uma relação orientador/orientanda iniciada desde a época da minha graduação, quando uma de suas aulas me emocionou profundamente e me despertou para a genética médica; Aos Drs. Christopher Geoffrey Woods e Emma Roberts, da Unidade de Medicina Molecular do Hospital St James (Universidade de Leeds - Inglaterra), por disponibilizar o seu laboratório para o nosso trabalho e pela orientação nos estudos moleculares; Às Dras. Emma Roberts e Jacquelyn Bond, e a Daniel Hampshire, pela ajuda na iniciação com as técnicas de biologia molecular e os programas de bioinformática; A Dra. Andréa de Rezende Duarte, colega do Serviço de Genética Médica do Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), pela convivência agradável e troca de experiências; A Ana Emília Barros e Silva, pela ajuda na extração de DNA; À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos para realização dos trabalhos laboratoriais na Universidade de Leeds (Inglaterra); À Fundação de Saúde Amaury de Medeiros (FUSAM), ao Hospital de Pediatria Helena Moura e ao Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), pela licença de trabalho concedida; A Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida e Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto, do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, pela concessão do laboratório de Microbiologia para realização das extrações de DNA; A Marcelo, pela companhia em viagens para obtenção de dados, mas, sobretudo, pela companhia na vida de todos os dias, tornando-a mais colorida e feliz.
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SUMÁRIO
Pág.
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
I. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 13
II. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 16
II.1. Microcefalia ............................................................................................... 17
II.2. Etiologia da microcefalia ........................................................................ 19
II.2.1. Microcefalia de etiologia ambiental ............................................................ 19
II.2.2. Microcefalia de etiologia genética ............................................................ 21
II.3. Microcefalia primária autossômica recessiva ................................................. 22
II.4. Mapeamento por homozigose/autozigose ............................................... .. 24
II.5. Aspectos moleculares da microcefalia primária autossômica recessiva 25
III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................. 29
IV. ARTIGO 1 − Primary Microcephaly: a Clinical Perspective .............. 36
Abstract ............................................................................................................. 38
Introduction ............................................................................................................. 39
Head circumference measurement .......................................................................... 40
The diagnosis of primary microcephaly .............................................................. 42
Differential diagnosis of primary microcephaly .................................................. 43
Autosomal dominant microcephaly .............................................................. 44
Chromosome anomalies .......................................................................... 45
Microcephaly with normal intelligence ................................................... 45
Post-nataly developing microcephaly ................................................... 46
Classification of microcephaly ........................................................................... 47
Clinical findings in primary microcephaly ............................................................... 48
Genetics of primary microcephaly ........................................................................... 51
Primate evolution and primary microcephaly ................................................... 53
Conclusions .............................................................................................................. 54
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7
References .............................................................................................................. 55
Table 1 .......................................................................................................... .... 62
V. ARTIGO 2 − A Novel Locus for Autosomal Recessive Primary
Microcephaly Maps to 13q12.2. .......................................................................... 63
Abstract (key points) ................................................................................................. 65
Introduction ............................................................................................................. 65
Materials and methods ..................................................................................... 66
Subjects ................................................................................................. 66
Molecular genetics ..................................................................................... 66
Results ............................................................................................................ 67
Discussion ............................................................................................................. 68
Acknowledgements ................................................................................................. 69
Electronic-Database Information ......................................................................... 69
References ............................................................................................................. 70
Table 1 ............................................................................................................. 73
Figure 1 ............................................................................................................. 74
Figure 2 ............................................................................................................. 75
Legends of figures ................................................................................................. 76
VI. ARTIGO 3 − Microcefalia Primária em Três Famílias Consangüíneas:
Estudos Clínicos e Moleculares .......................................................................... 77
Resumo ............................................................................................................. 80
Abstract ............................................................................................................. 81
Introdução ............................................................................................................. 82
Pacientes e métodos ................................................................................................. 83
Resultados ............................................................................................................. 83
Estudos clínicos ..................................................................................... 83
Estudos moleculares ..................................................................................... 85
Discussão ............................................................................................................. 85
Agradecimentos ................................................................................................. 88
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8
Referências bibliográficas ..................................................................................... 88
Figura 1 ............................................................................................................. 91
Figura 2 ............................................................................................................. 92
Figura 3 ............................................................................................................. 93
Figura 4 ............................................................................................................. 94
Legendas das figuras ................................................................................................. 95
VII. CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................... 96
VIII. AS PERSPECTIVAS ..................................................................................... 99
VIII. ANEXOS .........................................................................................................102
Normas das revistas
1. Journal of Medical Genetics ..................................................................................103
2. Jornal de Pediatria .........................................................................................................109
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RESUMO
Três famílias consangüíneas pernambucanas (famílias 1, 2 e 3) com microcefalia
primária autossômica recessiva foram analisadas nos seus aspectos clínicos e, duas delas,
submetidas a estudos de ligação. A família 1, a mais extensa delas, continha oito afetados
(cinco homens e três mulheres, com idades variando entre 4 e 27 anos) com medidas de
perímetro cefálico entre 7 e 10 desvios-padrões abaixo da média populacional para idade e
sexo. Na família 2 havia cinco afetados (dois homens e três mulheres, com idades variando
de 14 a 25 anos) com medidas de circunferência craniana 4 desvios-padrões abaixo da
média. Todos os pacientes dessas duas famílias tinham saúde geral boa e parâmetros do
crescimento dentro dos limites da normalidade. A microcefalia acompanhava-se de retardo
mental moderado em todos eles, mas nenhuma outra alteração neurológica, dismorfia ou
malformação foi observada. Os pais tinham perímetro cefálico e inteligência normais.
Exame oftalmológico, estudo cromossômico (400 bandas) e eletroencefalograma realizados
em alguns pacientes foram normais e tomografia computadorizada de crânio-encéfalo não
evidenciou malformações cerebrais nem distúrbios de migração neuronal. Após excluir-se
ligação aos cinco locos já sabidamente associados à microcefalia primária autossômica
recessiva, foi realizada, em ambas as famílias, pesquisa genômica ampla com um painel de
365 marcadores microssatélites autossômicos espaçados a intervalos de 10 cM em média.
Na família 1 identificou-se, por meio do método de mapeamento por autozigose, um novo
loco (o sexto, denominado MCPH6 − microcephaly6) associado à microcefalia primária
autossômica recessiva. Na família 2, a análise dos 365 marcadores não revelou nenhuma
região de autozigose. Uma terceira família (a família 3), estudada do ponto de vista
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clínico mas não analisada molecularmente, tinha dois afetados (um do sexo feminino e
outro do sexo masculino), com medidas de perímetro cefálico 6 e 8 desvios-padrões abaixo
da média, respectivamente. O rapaz tinha retardo mental moderado e a moça, atraso
profundo do desenvolvimento neuropsicomotor, o que sugeria que outra patologia pudesse
estar associada à microcefalia primária. Os três irmãos desses dois afetados tinham medida
de perímetro cefálico 2-3 desvios-padrões abaixo da média (limítrofe para microcefalia) e
nível intelectual variável: um deles apresentava inteligência normal e os outros dois, retardo
leve a moderado. O estudo dessas três famílias pernambucanas levou ao mapeamento de
um novo loco (o sexto) associado à microcefalia primária autossômica recessiva e revelou
que pelo menos mais um outro existe e aguarda identificação.
Palavras-chave: microcefalia, MCPH6, mapeamento por autozigose.
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ABSTRACT
Three consanguineous families from Pernambuco (families 1, 2 and 3) with primary
autossomal recessive microcephaly were studied clinically, and two of them submitted to
linkage analysis. Family 1, the largest one, had eight affected individuals (five males and
three females, with ages varying between four and 27 years) with head circumference
measurements 7-10 SD below the expected mean for age and sex. Family 2 had five
microcephalic individuals (two males and three females with ages ranging from 14 to 25
years) with head circumference measurements 4 SD below the mean. In both families,
microcephaly was accompanied by mental retardation of moderate severity and no other
neurologic problem, dysmorphic feature or malformation. All the affected individuals were
in good he alth and had growth parameters within normal limits. The parents had normal
head circumference and intelligence. Ophthalmologic examination, standard lymphocyte
karyotype (400 bands) and electroencephalogram performed in patients from both families
were normal, and brain computed-tomography scan showed no cerebral malformations or
neuronal ectopia. After exclusion of linkage to the five known loci related to autosomal
recessive primary microcephaly, a genome trawl with 365 autosomal microssatelite
markers spaced at approximately 10 cM intervals was performed in both kindreds. By
autozygosity mapping a new locus (the sixth one, MCPH6 − microcephaly6) associated to
autosomal recessive primary microcephaly was identified in family 1, but in family 2 no
region of homozygosity was found. The third family (family 3), studied clinically but not
submitted to linkage analysis, had a boy and a girl affected with head circumference
measurements six and eight SD below the mean respectively. The boy presented mental
retardation of moderate severity while the girl had severe neuropsychomotor delay,
suggesting another disorder could be associated to primary microcephaly in this subject.
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Their three siblings had head circumference measurements 2-3 SD below the expected
mean (boderline for microcephaly), but only one of them had normal intelligence whislt the
two others presented mental retardation of mild to moderate severity. The study of these
three families resulted in the mapping of a novel locus (the sixth one) for autosomal
recessive primary microcephaly and revealed that at least one more locus exist and awaits
identification.
Key words: microcephaly, MCPH6, autozygosity mapping.
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I. INTRODUÇÃO _________________________________________________________________________
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I. INTRODUÇÃO
A microcefalia é um sinal clínico que consiste de um perímetro cefálico com
medida com mais de três desvios-padrões abaixo da média populacional para idade e sexo 1
e pode ser encontrado em várias condições, de etiologia tanto ambiental quanto genética.2
Independentemente da sua causa, a microcefalia resulta sempre de um defeito no
desenvolvimento cerebral e acompanha-se, na grande maioria dos casos, de retardo mental.3
A microcefalia pode ocorrer como manifestação clínica isolada (microcefalia não-
sindrômica) ou vir acompanhada de outros defeitos morfológicos (microcefalia
sindrômica).
Na microcefalia primária, um dos subtipos de microcefalia de causa genética, a
redução do perímetro cefálico não está associada a outras malformações e o exame
neurológico não revela outras anormalidades além de retardo mental.4 5 Nessa condição, o
cérebro é simetricamente pequeno e não apresenta alterações estruturais.6 Seu padrão de
herança é, geralmente, o autossômico recessivo.
Cinco genes associados à microcefalia primária autossômica recessiva já foram
mapeados, confirmando-se, assim, as suspeitas prévias de que esta entidade apresentasse
importante heterogeneidade genética, e apenas famílias de origem paquistanesa,
marroquina e turca foram analisadas molecularmente até o momento.7 12 Recentemente,
dois dos cinco genes mapeados foram clonados.13 14
Três famílias consangüíneas pernambucanas com microcefalia primária foram
estudadas nos seus aspectos clínicos e duas delas submetidas a estudos de ligação a fim de
se verificar se apresentavam ligação a um dos cinco locos associados a esta condição já
conhecidos.
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O mapeamento e a caracterização molecular dos genes causadores de microcefalia
primária, e a identificação de seus produtos e funções correspondentes, significarão uma
contribuição enorme à compreensão da evolução do cérebro humano e à compreensão da
patogênese da microcefalia, com implicações importantes para o aconselhamento genético.
Assim, esses conhecimentos poderão ser utilizados no diagnóstico pré-natal, na detecção de
heterozigotos, no estabelecimento de riscos genéticos, e no diagnóstico dos afetados.
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II. REVISÃO DA LITERATURA _________________________________________________
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II. REVISÃO DA LITERATURA
II. 1. Microcefalia
O termo microcefalia significa, a rigor, cérebro pequeno e microcrania, crânio
pequeno, entretanto considerando-se que o fator determinante do crescimento da caixa
óssea craniana é o aumento de volume do cérebro, os dois termos podem, muitas vezes, ser
considerados sinônimos. A microcefalia pode ocorrer em três diferentes situações: 1) a
capacidade de crescimento do cérebro está normal, mas as suturas cranianas fundem-se
precocemente e impedem o seu aumento de volume; 2) a capacidade de crescimento do
cérebro está diminuída e o crânio mantém-se pequeno e desproporcional à estatura, 3) a
capacidade de crescimento do cérebro está diminuída e o crânio mantém-se pequeno mas
proporcional à estatura (microcefalia relativa).15
As medidas de circunferência craniana consideradas normais, de acordo com a idade
e sexo do indivíduo, estão hoje representadas em gráficos, e considera-se que o perímetro
cefálico não aumenta após os 18 anos de idade. O gráfico construído por Nellhaus (1968)16
para ambos os sexos, do nascimento aos 18 anos de idade e com base em dados obtidos de
indivíduos caucasóides, negros americanos, japoneses, esquimós do Alasca e eslavos é um
dos mais usados. Este autor não encontrou diferenças inter-raciais significativas nas
medidas de perímetro cefálico, ao contrário de Palti e cols. (1983) 17 que observaram
diferenças entre raças e entre nacionalidades. Outro gráfico usado com freqüência é o de
Roche (1987),18 também construído para indivíduos do nascimento aos 18 anos, com base
em dados seriados obtidos de uma amostra de 888 crianças brancas americanas
pertencentes a diferentes classes sócio-econômicas. Os valores referentes ao primeiro ano
de idade são equivalentes àqueles obtidos por Nellhaus, contudo em idades mais avançadas,
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os valores do gráfico de Roche, para o sexo masculino, são cerca de 0,5 a 1,5 vezes maiores
que aqueles do gráfico de Nellhaus. Quanto ao sexo feminino, os valores de Roche tendem
a ser discretamente mais elevados que os de Nellhaus. Tais diferenças poderiam ter
resultado da baixa condição sócio-econômica de vários indivíduos da amostra de Nellhaus,
ou poderiam ser conseqüência de mudanças seculares ou do uso de métodos diferentes,
pelos dois autores, para a aferição da circumferência craniana. Dados obtidos sobre o
crescimento do perímetro cefálico nos primeiros dois anos de vida, em uma amostra de
crianças brancas e negras americanas, 19 sugerem que os gráficos de Roche, embora
construídos apenas com dados sobre crianças brancas, poderiam ser também aplicáveis a
indivíduos negros americanos. Estudos sobre o crescimento da criança brasileira foram
realizados no município de Santo André (área metropolitana da Grande São Paulo). Os
dados de altura e peso foram obtidos para ambos os sexos, analisando-se uma amostra de
indivíduos de 3 a 239 meses de idade, entretanto os dados de perímetro cefálico foram
obtidos apenas para a faixa etária de 0 a 36 meses.20
O valor de perímetro cefálico representativo de microcefalia não é unânime entre os
autores: enquanto alguns consideram microcefalia uma medida de circunferência craniana
com pelo menos 2 desvios-padrões abaixo da média para idade e sexo, 5 21 outros
consideram-na uma medida de perímetro cefálico com mais de três desvios-padrões abaixo
do esperado.1 22 Esta última condição geralmente vem acompanhada de retardo mental,3
enquanto indivíduos com perímetro cefálico com 2-3 desvios-padrões abaixo do esperado
geralmente têm inteligência normal. Sells (1977), 23 analisando uma amostra de 1.006
estudantes com idades entre 5 e 18 anos e freqüentando escola normal, encontrou que
dezenove (1,9%) deles apresentavam perímetro cefálico com 2-3 desvios-padrões abaixo da
média, o que significa que tais medidas não necessariamente levam a deficiência
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19
intelectual, considerando-se que apenas um dos 19 estudantes apresentava quociente
intelectual abaixo de 80 e nenhum necessitava de cuidados educacionais especiais. Quando
o cérebro é pequeno mas proporcional à estatura (microcefalia relativa), o desenvolvimento
mental também tende a ser normal.2
II. 2. Etiologia da Microcefalia
A microcefalia é um sinal clínico encontrado em inúmeras condições de origem
tanto ambiental quanto genética, podendo vir acompanhada de outros defeitos morfológicos
(microcefalia sindrômica ou complexa) ou não (microcefalia pura, não sindrômica). A
microcefalia de etiologia genética é também chamada microcefalia primária e a
microcefalia de causa ambiental, microcefalia secundária.6 Os termos microcefalia
primária e microcefalia secundária também têm sido usados para designar, respectivamente,
uma cabeça desproporcionalmente pequena desde o nascimento e uma cabeça de tamanho
normal ao nascimento e que se torna desproporcionalmente pequena posteriormente.15
II. 2. 1. Microcefalia de etiologia ambiental
A microcefalia de causa ambiental resulta de injúrias ao cérebro em
desenvolvimento no período fetal ou pós-natal precoce.6 Na Tabela 1 estão listadas
algumas causas ambientais de microcefalia com os correspondentes quadros clínicos.
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Tabela 1. Alguns exemplos de microcefalia secundária, com os respectivos agentes
etiológicos e anomalias associadas.
_________________________________________________________________________ Agente etiológico Quadro clínico
Citomegalovírus (congênita) Microcefalia, retardo mental, espasticidade,
crise convulsiva, hepatoesplenomegalia, icterícia, anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica, coriorretinite, calcificações intracranianas.24 25
Toxoplasma gondii (congênita) Microcefalia, retardo mental, deficiência de
crescimento pré e pós-natal, crise convulsiva, hepatoesplenomegalia, anemia, microftalmia, coriorretinite, calcificações intracranianas.26
Vírus da rubéola (congênita) Microcefalia, deficiência de crescimento pré e
pós-natal, surdez, catarata, glaucoma, retinopatia, anomalia cardíaca.27
Hipóxia perinatal Microcefalia, atraso do desenvolvimento
neuropsicomotor, crise convulsiva, paralisia cerebral.28
Exposição intra-uterina ao etanol Microcefalia, deficiência de crescimento pré e
pós-natal, atraso do desenvolvimento, fissuras palpebrais pequenas, epicanto, hipoplasia maxilar, mobilidade articular diminuída, anomalia cardíaca.29
Exposição intra-uterina à carbamazepina Microcefalia, deficiência de crescimento pré e
pós-natal, atraso do desenvolvimento, fissuras palpebrais oblíquas para cima, nariz pequeno, filtro naso-labial longo, unhas hipoplásicas.30
Exposição intra-uterina à hidantoína Microcefalia, retardo de crescimento pré e pós-
natal, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, hipertelorismo, epicanto, nariz curto e com raiz baixa, orelhas com implantação baixa e/ou malformadas, hipoplasia de unhas e falanges distais, macrostomia.31
Exposição intra-uterina à radiação Microcefalia, retardo mental.32
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II. 2. 2. Microcefalia de etiologia genética
A microcefalia genética pode resultar de anomalias cromossômicas, alterações
monogênicas ou fazer parte de síndromes de etiologia ainda não esclarecida.4 Na tabela 2
são apresentados exemplos de formas sindrômicas de microcefalia, resultantes de
anomalias cromossômicas e mutações gênicas.
Tabela 2. Alguns exemplos de síndromes genéticas com microcefalia.
Síndrome
Fenótipo
Trissomia do cromossomo 18
Microcefalia, deficiência de crescimento, atraso neuropsicomotor, sobreposição do 2° sobre o 3° quirodáctilo e do 5° sobre o 4°, hipoplasia de unhas, esterno curto, anomalia cardíaca.33 34
Trissomia do cromossomo 13 Microcefalia, deficiência de crescimento, atraso neuropsicomotor, microftalmia, fissura labial e/ou palatal, polidactilia, unhas estreitas e hiperconvexas, calcanhares proeminentes, defeito de couro cabeludo em região parieto-occipital.35 36
Síndrome do “miado” ou cri-du-chat (deleção parcial do braço curto do cromossomo 5)
Microcefalia, deficiência de crescimento, atraso neuropsicomotor, choro semelhante a miado de gato, fissuras palpebrais oblíquas para baixo, hipertelorismo, epicanto.37 38
Síndrome de Seckel (herança autossômica recessiva)
Microcefalia, baixa estatura, nariz proeminente, orelhas malformadas e com implantação baixa, ausência de um par de costelas.39
Síndrome de Cockayne (herança autossômica recessiva)
Microcefalia, deficiência de crescimento pós-natal, escassez de panículo adiposo, aparência senil, retardo mental, ataxia, disartria, degeneração retiniana, surdez, fotossensibilidade.40
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Síndrome de Dubowitz (herança autossômica recessiva)
Microcefalia, deficiência de crescimento pré e pós-natal, retardo mental, fissuras palpebrais pequenas e com telecanto lateral, ptose palpebral, blefarofimose, epicanto, micrognatia, eczema de face e áreas de flexão.41
Síndrome de Feingold (herança autossômica dominante)
Microcefalia, alterações de mãos e pés, fissuras palpebrais pequenas, narinas antevertidas, micrognatia, anomalias auriculares, atraso do desenvolvimento, atresia de esôfago/duodeno.42
Síndrome de Sutherland-Haan (herança ligada ao X)
Microcefalia, braquicefalia, baixa estatura, diplegia espástica, retardo mental, testículos pequenos.43
II. 3. Microcefalia Primária Autossômica Recessiva
A microcefalia primária autossômica recessiva é uma entidade nosológica com
quadro clínico composto de microcefalia e retardo mental leve a moderado, não associados
a outros sinais/sintomas neurológicos, dismorfias ou malformações.5 Os termos
microcefalia verdadeira e microcefalia pura têm sido usados como sinônimos de
microcefalia primária autossômica recessiva, contudo não tem havido concordância na
literatura quanto à definição do quadro clínico associado a estas expressões.45 Baraitser
(1997) 4 considera que indivíduos com microcefalia verdadeira ou pura apresentam cabeça
pequena não associada a outras malformações e não exibem problemas neurológicos com
exceção de retardo mental, contudo outros estudiosos, como por exemplo Accardo e
Whitman (1988),46 afirmam que indivíduos com microcefalia verdadeira não exibem
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problemas neurológicos grosseiros, mas freqüentemente apresentam comportamento
hipercinético e distúrbio da coordenação motora fina. Roberts e cols.47 analisaram 56
famílias consangüíneas com microcefalia nas quais a redução de perímetro cefálico
acompanhava-se apenas de deficiência mental, não se observando outras alterações
neurológicas, distúrbios de crescimento nem dismorfias. O fato de este quadro clínico ter
sido encontrado em grande número de famílias e estar associado a mutações em locos
específicos levou Roberts e cols. a sugerirem que este fenótipo constitui um distúrbio
específico do neurodesenvolvimento e que o termo mais exato para defini-lo seria
microcefalia primária autossômica recessiva. Exames de ressonância nuclear magnética de
crânio-encéfalo têm demonstrado que, nesta condição, a redução da circunferência craniana
é conseqüência de uma diminuição simétrica de espessura do córtex cerebral, não se
observando alterações significativas do padrão dos giros cerebrais, alterações estruturais em
outras áreas do cérebro nem distúrbios de migração neuronal.48 Os afetados têm
desenvolvimento motor normal e condições de saúde geral boas, não apresentam crises
convulsivas e seu retardo mental varia de leve a moderado, permitindo a realização de
tarefas simples do dia-a-dia (como comer, vestir, tomar banho) e uma comunicação verbal
simplificada.4 A microcefalia primária autossômica recessiva é um diagnóstico de exclusão
e, para firmá-lo, é necessário que causas ambientais, cromossômicas e metabólicas de
microcefalia tenham sido investigadas e eliminadas. Na amostra estudada por Roberts e
cols.,47 as medidas de perímetro cefálico situavam-se entre 4 e 14 DP abaixo da média para
idade e sexo, assim esses autores consideram que na microcefalia primária autossômica
recessiva a medida do perímetro cefálico está pelo menos 4 DP abaixo do esperado. Esta
redução do perímetro cefálico é congênita e não progressiva: medidas de circunferência
craniana ao nascimento e aos 5-10 anos de idade, em 15 indivíduos da amostra de Roberts
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et al., demonstraram que não houve variação no grau de microcefalia. Também não se
observou variação significativa no grau da microcefalia entre afetados de uma mesma
família. Estudando 13 famílias com microcefalia genética, Qazi e Reed 49 observaram que
11 dos 24 genitores e 11 dos 33 irmãos normais de afetados apresentavam retardo mental
sem microcefalia, e atribuíram esta alteração a um efeito do gene de microcefalia em
heterozigose, contudo nas famílias analisadas por Roberts e cols.47 nenhum dos genitores
ou irmãos de afetados tinham deficiência intelectual
Não há estudos relatando a incidência da microcefalia primária autossômica
recessiva conforme aqui definida. Komai, estudando microcefalia genética no Japão,
encontrou freqüência de 1/30.000, no entanto seus pacientes apresentavam retardo mental
grave, peso e estatura abaixo da média, crises convulsivas e alteração do sistema
piramidal.50
II. 4. Mapeamento por homozigose/autozigose
Em 1987, Eric S. Lander e David Botstein 51 propuseram uma estratégia para o
mapeamento de genes relacionados a traços autossômicos recessivos em famílias
consangüíneas. Tal estratégia − denominada mapeamento por homozigose − baseia-se na
hipótese de que regiões adjacentes ao loco a ser mapeado devem ser homozigotas por
descendência nos indivíduos que apresentam a característica autossômica recessiva em
análise. Uma região cromossômica é homozigota por descendência quando ambos os seus
alelos são herdados de um ancestral comum.
O termo autozigose significa homozigose de marcadores idênticos por descendência
e herdados de um ancestral comum recente, assim as expressões mapeamento por
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
25
homozigose e mapeamento por autozigose são sinônimas. Indivíduos afetados por doenças
autossômicas recessivas raras, em famílias consangüíneas, muito provavelmente
apresentam autozigose dos marcadores ligados ao loco da doença. Na época em que Lander
e Botstein propuseram esta técnica, os marcadores genéticos conhecidos eram muito pouco
informativos, contudo a identificação, na década de 90, de marcadores altamente
polimórficos, como por exemplo os polimorfismos de tamanho de cadeia simples, deu uma
nova dimensão à estratégia proposta por estes autores.
II. 5. Aspectos Moleculares da Microcefalia Primária Autossômica Recessiva
Em 1998, usando o princípio de mapeamento por homozigose e analisando uma
família consangüínea de origem paquistanesa, Jackson e cols.7 identificaram, em 8p22-pter,
o primeiro loco associado a microcefalia primária autossômica recessiva e denominaram-no
MCPH1 (microcephaly 1). Os afetados tinham perímetro cefálico medindo 5-9 DP abaixo
da média e apresentavam retardo mental leve a moderado. Estes autores também
demonstraram que a microcefalia primária autossômica recessiva apresentava
heterogeneidade de loco, uma vez que a análise de outras oito famílias, também
consangüíneas e de origem paquistanesa, revelou que apenas uma delas (com dois afetados)
apresentava ligação ao loco MCPH1. A região de homozigose comum a todos os afetados
das duas famílias compreendia uma região de 13 cM. Posteriormente, a genotipagem desses
afetados com um grande número de marcadores localizados em 8p23 permitiu que se
refinasse a região crítica até 2,1 Mb, intervalo onde se encontravam dois genes, o gene da
angiopoietina-2 e AX087870, gene ainda não caracterizado. Nenhuma mutação foi
detectada no primeiro, entretanto identificou-se, em todos os pacientes de ambas as
famílias, a troca de uma citosina por uma gruanina (C→G) no éxon 2 de AX087870, o que
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
26
cria um códon de parada prematuro e trunca a proteína codificada por este gene. Os
afetados eram homozigotos para tal mutação e os seus pais, heterozigotos, enquanto em
nenhum dos 202 alelos controle de origem paquistanesa encontrou-se a referida mutação.
Tanto o gene AX087870 quanto a proteína por ele codificada foram denominados
“microcefalina”. Experimentos de hibridização in situ com tecidos fetais de camundongo
confirmaram que a microcefalina expressa-se durante a neurogênese: no cérebro de feto de
camundongo, a microcefalina apresentou altos níveis de expressão no telencéfalo e, em
particular, nas paredes dos ventrículos laterais, região onde células progenitoras dividem-se
produzindo os neurônios que vão formar o córtex cerebral.13
O segundo loco associado à microcefalia primária autossômica recessiva foi
identificado em 19q13.1-13.2, também por meio do mapeamento por homozigose, em duas
famílias consangüíneas originárias do norte do Paquistão. Seus afetados tinham medidas de
perímetro cefálico com 4-7 DP abaixo da média e retardo mental leve a moderado. O gene
de MCPH2 ainda não foi clonado e o intervalo crítico mínimo, nessas duas famílias, é de
7,6 cM.8
O terceiro e quarto locos foram mapeados, respectivamente, em 9q34 e 15q15-q21,
usando-se a técnica de mapeamento por homozigose. O terceiro loco foi identificado em
uma família de origem paquistanesa e o quarto, em uma família marroquina. Em ambas as
famílias, os afetados tinham medidas de perímetro cefálico com cerca de 6 DP abaixo do
esperado e retardo mental leve a moderado. Na família paquistanesa, a região de
homozigose tem cerca de 12 cM e na marroquina, 5,3 cM. Os genes de MCPH3 e MCPH4
ainda não foram clonados.9 10
Usando-se também o princípio de autozigose, o quinto loco foi mapeado,
simultaneamente em uma família de origem turca e uma família do Paquistão, em 1q25-
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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q32. Na família originária da Turquia, os afetados tinham retardo mental moderado a grave
e suas medidas de perímetro cefálico situavam-se entre 6 e 8 DP abaixo da média. Na
família paquistanesa, a deficiência intelectual era moderada e os três indivíduos
microcefálicos apresentavam circunferência craniana medindo 5-7 DP abaixo da média.11
Cinqüenta e seis famílias com microcefalia primária autossômica recessiva (com um
total de 131 afetados, sendo 70 do sexo masculino e 61 do sexo feminino), todas originárias
do norte do Paquistão, foram genotipadas com marcadores microssatélites localizados nos
cinco locos associados a esta condição (MCPH1-MCPH5): duas famílias apresentaram
ligação com MCPH1; 10, com MCPH2; duas, com MCPH3; 24, com MCPH5; nenhuma
família segregou com MCPH4 e 18 famílias não apresentaram ligação com nenhum dos
cinco locos analisados. MCPH5 é, assim, o loco mais prevalente na população
paquistanesa. As medidas de perímetro cefálico dos afetados destas 56 famílias situavam-se
entre 4 e 14 DP abaixo da média e apresentavam pouca variabilidade intrafamiliar (em
torno de 1 DP). Não foi possível distinguir o fenótipo associado a cada um dos locos com
base apenas nos aspectos clínicos.47
A genotipagem das 24 famílias (com um total de 61 afetados) ligadas a MCPH5
com novos marcadores microssatélites permitiu que este loco fosse reduzido até 600 Kb.
Neste intervalo, encontravam-se quatro genes, três dos quais − um homólogo de
KIAA1089, um gene do tipo zinc-finger e o gene ASPM − poderiam estar envolvidos com
microcefalia. O quarto gene já se sabia estar associado à amaurose congênita de Leber. As
seqüências completas dos três genes candidatos foram determinadas e, nas quatro famílias
mais extensas ligadas a MCPH5, eles foram seqüenciados. Em todos os afetados,
identificaram-se, em ASPM, mutações em homozigose produzindo um códon de parada
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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prematura que truncava a proteína por ele codificada. ASPM é um ortólogo do gene asp de
Drosophila melanogaster, envolvido na formação e funcionamento do fuso mitótico de
neuroblastos embrionários. Alterações da sua proteína impedem que neuroblastos em
divisão celular progridam além da metáfase, prejudicando, assim, o desenvolvimento do
sistema nervoso central.14
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
_________________________________________________
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
36
IV. ARTIGO 1
Primary Microcephaly: a Clinical Perspective
Artigo a ser submetido ao Journal of Medical Genetics ________________________________________________________________________
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
37
Primary Microcephaly: a Clinical Perspective
Gabriela F Leal*, Emma Roberts#, C Geoffrey Woods#‡
*Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), Recife-PE, Brazil
#Molecular Medicine Unit, University of Leeds, St James's University Hospital, Leeds, UK
‡Department of Clinical Genetics, St James's University Hospital, Leeds, UK
Corresponding Author
C Geoffrey Woods
Molecular Medicine Unit
Clinical Sciences Building
St James's University Hospital
Beckett Street
Leeds LS9 7TF
England-UK
Tel: 0044 113 2065252
Fax: 0044 113 2444475
Email: [email protected]
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
38
Abstract
This clinical review of Primary Microcephaly draws on our experience of this condition in
the Northern Pakistani population in Yorkshire and the North-eastern Brazilian population,
and summarises the relevant literature. Primary Microcephaly is a clinical “diagnosis of
exclusion” that should be considered in any individual with the finding of congenital
microcephaly. The additional clinical findings are of mild to moderate mental retardation
and an easy-going, biddable manner which allows such individuals to be trained and
function at a higher level than may have been expected. The differential diagnoses to be
considered and need for observation until at least the age of 2 year before making the
diagnosis are discussed. The prevalence of Primary Microcephaly is not known. It seems to
be rare in Caucasians (less than 1 per 100,000) but higher in Asian and Arab populations.
Primary Microcephaly is usually considered to be an autosomal recessive disorder and had
been assumed to present genetic heterogeneity. This has now been established with the
identification of six autosomal loci: MCPH1 on 8p23, MCPH2 on 19q13, MCPH3 on 9q23,
MCPH4 on 15q, MCPH5 on 1q21, and MCPH6 on 13q12, with further loci known to await
detection. In the British Pakistani population, the MCPH5 locus is the most prevalent, and
in a Brazilian family the MCPH6 locus was mapped. The genes mutated in MCPH1 and
MCPH5 are microcephalin and ASPM respectively. The discovery of these genes and the
others implicated in Primary Microcephaly should allow prenatal and early post-natal
diagnosis, and, in consanguineous families, carrier identification. However, it may also give
us valuable insights into normal cerebral cortex growth (which is taken to an extreme in
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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primates, especially man) and the evolutionary cerebral changes that have distinguished us
from our nearest relatives, the higher primates.
Key words: primary microcephaly, mental retardation, heterogeneity, cerebral cortex
Introduction
The term “microcephaly” has become awkward as it is in use both to describe a
clinical finding and a diagnosis.1 2 “Microcephaly” should be reserved for use as a clinical
finding, that is a head circumference significantly less than expected for an individual’s age
and sex. There is a myriad of causes − both genetic and environmental − for an individual
to have “microcephaly”, but this article seeks to focus on the group of individuals with the
autosomal recessive disorder “Primary Microcephaly” (MCPH). This condition seems to be
rare in Caucasians (less than 1 per 100,000) 3 but its incidence is probably more elevated in
populations with a higher rate of consaguineous marriages.
The microcephaly in MCPH seems to be caused by a reduction in size in the
cerebral cortex, and is accompanied by mental retardation and no other neurological
problems, malformations or dysmorphic features. After the clinical features in Primary
Microcephaly are discussed here, an approach to eliminating potential differential
diagnoses is suggested.
To date six autosomal loci have been identified associated to Primary Microcephaly,
confirming the previous suspect of genetic heterogeneity of this condition. MCPH1, 2 and 3
were mapped in Northern Pakistani families; 4−6 MCPH4 in a Moroccan family; 7 MCPH5
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
40
in Northern Pakistani and Turkish families, 8 9 and MCPH6 in a Brazilian family.10 MCPH1
and MCPH5 genes have been cloned. 11 12 This clinical review is based on our experience
of this condition in the Northern Pakistani population of Yorkshire and the North-eastern
Brazilian population.
The neuro-developmental aetiology of Primary Microcephaly and the brain
evolution from the great apes to Homo sapiens sapiens are also discussed here as it could
be speculated that the genes involved with Primary Microcephaly could also have taken
part in the primates cerebral cortex evolution processes.
Head circumference measurement
Micrencephaly , theoretically, refers to a small brain, and microcephaly refers to a
small cranio, but, as Aicardi states, “in practice the two definitions, microcephaly and
micrencephaly, are equivalent”.2 We will use the term microcephaly throught this article to
mean a head circumference of at least –4 SD to the population mean for age and sex. 2 To
detect the clinical finding of microcephaly, a head circumference needs to be accurately
obtained and charted. Serial measurements and their analysis as standard deviations will tell
if microcephaly is congenital or post-nataly developed; and static, progressive or reducing.
Occipitofrontal head circumference is only imperfectly correlated with brain volume, but
whilst other methods have been used, it remains the common simple method for evaluating
brain size.2 The head size increases rapidly in the first few years of life driven by the
growth of the brain (the brain triples in weight from birth to 1 year of age), therefore the
need to chart measurements by age particularly carefully in the first few years of life.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
41
A correct head circumference measurement is necessary for head size to be
assessed, particularly if this is being performed longitudinally. Head circumference is
measured around the head from encompassing the occipital bump, above ears and across
the brow- in the same plane as if the person was staring straight ahead. The largest
measurement should be taken by trying to slide the tape measure slightly up and down. A
cloth tape should be used, to reduce the possibility of tape stretching. It can be almost
impossible to get an accurate measurement in a child with significant microcephaly due to
the slope of the forehead with the apparent greatest head circumference being in the plane
of the orbits. Exuberant or platted hair can lead to an overestimate of the head
circumference. Scalp tumours, similarly, will lead to erroneous measurements, e.g.
cephaloheamatoma in the newborn.
The head circumference can then be recorded on a head circumference chart for the
appropriate sex (males head circumference is approximately 1cm greater than that of
females throughout life). Due to the rapid growth of the brain in pregnancy and early
childhood, the measurement is charted against age. This is particularly important in the
premature newborn: in a 36 week premature newborn, a head circumference of 32cm is
normal, but this head circumference size would be 3SD below the mean in an infant born at
term. Practically, it is not always possible to assess gestational age. Many charts are
available and all differ, although these differences are usually minor and only really of
importance in the first year of life. Charts are available for healthy and sick preterm infants.
13 14 We have generated a second pair of charts giving the number of standard deviations a
head circumference is below the expected mean for age and sex (these were calculated
using the data of Roche et al 15 and Nellhaus. 16
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
42
Head shape obviously affects head circumference and there are no specific charts
for children with the various types of craniosynostosis. Excepting turricepahly, the more
extreme the shape of the head the less intra-cerebral volume there will be for a given head
circumference. It is unclear whether there are racial differences in normal and below
normal head circumference. Such differences that have been recorded may all be explained
by differences in nutrition. Head circumference is said to vary independently of height and
weight (with the exception of severe intra-uterine growth retardation, in which weight, then
length, then head circumference reduce), so microcephaly should be readily clinically
apparent when growth parameters are within +3 to –3.
The diagnosis of Primary Microcephaly
Primary Microcephaly may be defined as an autosomal recessive disorder causing a
cerebral cortex of reduced size but of normal appearance on MRI and CAT scans. The
cerebral cortex reduction is congenital and the head circumference size ranges between –4
and –11 SD from the mean with no variation of the degree of microcephaly throughout life.
Affected individuals have normal build and stature and present no dysmorphic features. All
of them have static mental retardation of mild to moderate severity with no associated
motor retardation or other neurological abnormalities. The incidence of fits is not increased.
As standard medical enquiry and laboratory investigations reveal no cause for the
microcephaly, the diagnosis of Primary Microcephaly is therefore a “diagnosis of
exclusion”. This definition is arbitrary but there is some justification for its use in that it has
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
43
allowed us to ascertain and study 59 families (often with multiple affected individuals) and
map a number of gene loci for Primary Microcephaly.
To date there are no investigations that can confirm all the cases of Primary
Microcephaly, considering that only MCPH1 and MCPH5 genes have already been
identified, but those that can eliminate some of the differential diagnoses. Given the
number of differential diagnoses and the time needed for phenotypes to become apparent,
we would only provisionally diagnosis Primary Microcephaly before the age of two years.
A minimum set of investigation would include MRI brain scan (CAT as well if intra-cranial
calcification is sought), full metabolic screening including maternal phenylketonuria,
clinical genetics opinion if referred by a Paediatric Neurologist and vice versa, and detailed
cytogenetic analysis.
Differential diagnosis of primary microcephaly
Using the definition of Primary Microcephaly stated above should lead to the
elimination of many causes of microcephaly. We would not regard anyone with a head
circumference of –1 to –3 SD as having Primary Microcephaly, considering that
individuals of normal intelligence and a head circumference of –3 SD have been reported.1 2
17-19 Therefore we would be guarded about diagnosing Primary Microcephaly in an
individual with a head circumference of –3 to –4SD. Discussion of syndromal disorders
involving microcephaly are not within the scope of this article but see LNDB, 20 Friede 21
and Bundey. 22 There are many non-genetic causes of microcephaly which need to, if
possible, be eliminated before considering the diagnosis of Primary Microcephaly. These
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include prenatal exposure to ionising irradiation, drugs and chemical; materno-fetal
circulatory problems; and hypoxic-ischeamic insult. 23-27 Parental head circumference
should always be measured to detect autosomal dominant microcephaly or possible
dominantly inherited chromosome anomalies.
Autosomal dominant microcephaly
A number of families with apparent autosomal dominant microcephaly have been
described and it seems to be a heterogenous entity. The microcephaly appears to be
congenital and its severity as well as the mental retardation are usually of a lesser degree
than that observed in the autosomal recessive cases. Most affected individuals are reported
to have normal or borderline normal intelligence, or mild mental retardation. The families
described by Rossi and Battilana, 28 Rossi et al, 29 Ramirez et al, 30 and Merlob et al 31
presented microcephaly of −2.2 SD to −4.7 SD degree accompanied by normal intellectual
function and no physical anomalies. Haslam and Smith 32 reported four families with
microcephaly ranging from −2 SD to −4.2 SD and mild mental retardation. Autosomal
dominant microcephaly associated to moderate mental retardation seems to be rare, but it
has been reported. 33 During the evaluation of a child with microcephaly, parental head
circumference measurement and charting is essential, and it is usually assumed that head
circumference changes little after 18 years of age.
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45
Chromosome anomalies
Chromosome anomalies can cause microcephaly, diminished intelligence and little
in the way of dysmorphic findings or congenital anomalies. In particular the terminal
deletions of the short arm of chromosome 8 − which are more frequent than previously
thought − must be actively sought. The phenotype associated with these deletions includes
microcephaly, mental retardation, behavioural problems, minor or absent facial anomalies,
and heart defects (characteristically endocardial cushion defects). The occurrence of
microcephaly and cardiac anomalies, and the severity of the mental retardation appear to be
directly related to the extent of the deletion. In patients with microscopically visible
del(8)(p23.1→pter), microcephaly (ranging between −2 SD and −4 SD) and/or cardiac
anomalies have been found, and the intellectual impairment is usually mild. 34 35 This small
del(8)(p23.1→pter) can easily be missed on standard chromosome analysis. 36 Doubtless
other subtle chromosome anomaly syndromes await description. The finding of subtle
dysmorphic features or congenital anomalies and a family history suggestive of a
translocation are of help in urging the physician not to overlook the chromosome anomalies
as the cause of microcephaly.
Microcephaly with normal intelligence
As stated previously, autosomal dominant microcephaly is usually accompanied by
normal intelligence or mild mental retardation but autosomal recessive microcephaly with
no mental impairment seems to be rare. Teebi 37 reported a large consanguineous Arab
kindred with nonsyndromal microcephaly and normal intelligence. The head circumference
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46
measurement was between −6 and −8 SD from the mean. Two sibs described by Rizzo and
Pavone 38 − a girl and a boy born to normal nonconsanguineous parents − had severe
microcephaly and normal, borderline/normal intelligence respectively. Both had small ears,
markedly protruding midface, curved nose and severe retrognathia. A few other cases of
autosomal recessive microcephaly with normal intelligence have been reported. 39 We have
not seen any families in the Northern Pakistani or North-eastern Brazilian populations with
“Primary Microcephaly with normal intelligence”. The autosomal recessive Nijmegen
breakage syndrome should not cause diagnostic confusion. In this condition the head
circumference is 2 to 3 SD below the mean and the affected individuals have symptomatic
immune deficiency. Cytogenetic studies show a chromosome breakage pattern
indistinguishable from the one found in Fanconi anemia, ataxia telangiectasia and Bloom
syndrome, and immunological studies reveals humoral and cellular immune defects. 40
Post-nataly developing microcephaly
This is a difficult diagnostic grouping and clearly heterogeneous. It needs to be
considered when early head circumference measurements are not available. Affected
individuals have a normal head circumference at birth which falls through the centiles to –4
to –5 SD’s by 4 years of age and is associated with moderate to severe mental retardation.
Whilst an extensive differential diagnosis of metabolic and storage diseases, chromosome
anomalies and birth asphyxia needs to be eliminated, we have seen families with this
phenotype, non-progressive mental retardation and a probable autosomal recessive
inheritance pattern. Furthermore some families have the additional finding of spasticity and
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47
others early onset tonic/clonic fits. Whilst this group needs further characterisation one
could also speculate that the aetiology is likely to be abnormalities in dendritic arborisation
and post-natal synapse formation.
Classification of microcephaly
A number of different methods exist for classifying microcephaly: by clinical
features, which include time of onset of the microcephaly and the presence or absence of
additional malformations or dysmorphic features; by CT/MRI scan appearance; by neuro-
pathology studies. Pure, non-syndromal or uncomplicated microcephaly is microcephaly
without associated anomalies whilst syndromal microcephaly implies development
disturbances elsewhere in the body besides the brain. In primary microcephaly the head is
disproportionately small at birth while in secondary microcephaly the head circumference
starts to fall below normal channels after birth. 41 Other authors, however, consider primary
microcephaly as genetic microcephaly, and secondary microcephaly as non-genetic
microcephaly. 42 Sometimes these two classification do not agree, for example in the case
of the families we have seen with a post-nataly developing microcephaly and an autosomal
recessive pattern of inheritance. Barkovich et al 43 44 have produced and revised a useful
classification of brain scan anomalies. Within this classification, children with Primary
Microcephaly would be regarded as having microcephaly vera, that is, small symmetrical
cerebral cortices with no structural anomalies (radial microbrain is the term used for a brain
in which all parts are symmetrically reduced in size, with a total weight of <500 g).
Existing clinical classifications include the terms microcephaly vera and true microcephaly.
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48
True microcephaly refers to a genetic type of microcephaly (usually with an autosomal
recessive mode of inheritance) in which the head circumference is well below (at least 5-6
SD) the mean and a narrow, receding forehead is seen. The microcephaly is evident since
birth and there are no associated malformations. Early development is relatively normal and
individuals with this type of microcephaly do not exhibit gross neurological signs, but
seizures may occur in 1/3 of them. Most of the affected subjects are trainable and can
acquire at least a simplified language.45 Microcephaly vera incorporates children with
significant microcephaly which is thought to be genetic in aetiology, but the head
circumference need not have been abnormal at birth. The child can be significantly
retarded, and fits and other neurological problems such as spastic cerebral palsy may be
present.41 Primary Microcephaly fits only in part to the categories of true microcephaly or
microcephaly vera. In true microcephaly, an obligatory feature is the sloping forehead
which is absent in many of the families we have studied and, besides, this is also variable
within affected members of the same family. Sloping forehead is as well frequently seen in
individuals with extreme microcephaly (head circumference > −10SD) who are likely to
have brain scan anomalies. In microcephaly vera, the head circumference can be normal at
birth and the affected individual can present associated neurological problems, such as
cerebral palsy. In none of the families we have studied cerebral palsy was observed.
Clinical findings in Primary Microcephaly
Apart from those features listed in the definition there is little to tell. Appearance is
normal, except for the small head size. The forehead may be sloping, giving the appearance
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of “true microcephaly”, however this is not specific to Primary Microcephaly as it is
certainly seen in other disorders with microcephaly of > −5 SD. Furthermore, our
experience is that within affected families some show this appearance while others with a
similar degree of microcephaly do not. There appears to be a tendency for the sloping
forehead appearance to lessen with age, possibly as brain growth slows and face continues
to grow, resulting that affected individuals often have a round shape head. The affected
children tend to be well behaved and are “biddable”, that is, compliant with instruction and
able to be taught skills of daily living, common sense safety and writing and reading. There
is no evidence that the degree of microcephaly − as judged by SD’s from the mean −
changes with age. Nor is there a sex difference. When comparing sucessive head
circumference measurements there is usually only a variation in the degree of microcephaly
of 1 SD.
Mothers do not report any difference between their pregnancies of affected and
unaffected children. We have been able to review or prospectively follow the ultrasound
scans of 3 affected pregnancies. In each one, brain appearance was normal throughtout the
pregnancy (as would be expected as post-natal brain scans are normal), however head
growth assessed by bi-parietal diameter and head circumference was normal until 28 weeks
and reduced by 36 weeks. Therefore in these cases there was a lack of continuing cerebral
cortex growth in the third trimester (see section Neuro-developmental Aetiology of Primary
Microcephaly). The corollary of this is that microcephaly evident by fetal ultrasound
scanning at 22 weeks is unlikely to be caused by Primary Microcephaly and poses a worse
prognosis.
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50
Early milestones of alertness, smiling to parents and head control are often normal.
Later motor and social milestones are mildly delayed. Speech development is delayed as
may be expected for a child with mild to moderate mental retardation. No specific learning
or speech problems have been identified, however no detailed learning/psychological
profile has been performed, and this probably best awaits specific gene testing so that each
form of Primary Microcephaly can be analysed separately. The affected children have good
fine motor control, balance and grace in movements. They achieve well in sports compared
to other mental retarded children and do seem to have the “happy affect” talked of in the
literature.
In our study population we cannot comment on the incidence of epilepsy, as this
would be an exclusion criteria for our studies. However, it is our impression that whilst a
few children had febrile convulsions, epilepsy was uncommon both in the early years and
in adulthood. We have seen multiple affected families who had: 1) post-natally developing
microcephaly and early onset fits, or 2) congenital microcephaly with spasticity and fits,
but these are clearly distinguishable from Primary Microcephaly. Affected individuals
enjoy good health and do not seem prone to develop any specific medical conditions. Of the
older affected individuals − 40 years and over − 4/12 have become withdrawn, less
communicative and less mobile (but not spastic). Whether this is due to the underlying
condition or their lifestyle is unclear.
Within our study population we have encountered two families with findings similar
to Primary Microcephaly, but with the distinguishing features of 1) the degree of
microcephaly is more severe (-10 to –12 SD’s), 2) all have severe mental retardation and 3)
two of the four affected individuals have minor spasticity, and three of the four have
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51
infrequent tonic/clonic fits. MRI brain scans on two of the four have been performed and
are normal (personal communication D Pfiltz). The families are linked to the 5 cM region
spanning the MCPH5 gene locus. For the time being we have designated these families as
having Extreme Primary Microcephaly. It is unclear whether this condition is allelic to
MCPH5 or a different disorder.
It has been stated that there may be a heterozygote effect of carrying a microcephaly
gene which consists of mild mental retardation and possibly a small head size. 46 We have
found no evidence for such a heterozygote effect in our 59 study families.
Genetics of Primary Microcephaly
The literature on this topic is difficult to interpret because of the heterogeneity of
“microcephaly vera” and the problems with microcephaly nomenclature, as detailed
previously. However, the inheritance of “microcephaly vera” is usually considered to be
autosomal recessive. 47 Primary Microcephaly is also usually autosomal recessive, and to
date no autosomal dominant families fulfilling the diagnostic criteria have been reported. A
family with an X-linked recessive disorder with the clinical features of microcephaly and
mental retardation but variable spastic diplegia has been documented, in which some
affected individuals are only microcephalic. 48
Microcephaly vera is rare, with Tolmie describing only one case in a Scottish
population of 2 million in a study of recurrence risk and prenatal diagnosis of
microcephaly. 51 The incidence of Primary Microcephaly is not known with certainty
considering that only two studies have been done to date. These studies suggest an
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52
incidence of 1/30 000 to 1/250 000.3 50 In the Bradford area we know of 131 affected
individuals in a population of 486.400, giving a minimum incidence of 27/100.000.
Primary Microcephaly has been reported in many races, and seems more frequently in
consanguineous populations. Whether all genotypes of Primary Microcephaly are equally
represented in different ethnic groups awaits clarification.
The recurrence risks given to a couple who have had one child with a probable
diagnosis of primary microcephaly are empiric. The first figures used were those of Carter
and were one in eight to one in four. 51 Bundey 22 suggests that an autosomal recessive
recurrence risk is used if neuroradiological examination confirms symmetrical
microcephaly. We would also consider a risk of one in four correct if the family is
consanguineous and of Arab or Brazilian origin. Several research teams have sought and
found loci for Primary Microcephaly. That is in different families with apparently similar
children with a diagnosis of Primary Microcephaly genetic heterogeneity has been shown.
4-10 The research teams have used the principle of autozygosity mapping and multi-affected
consanguineous pedigrees to unambiguously define Primary Microcephaly loci. Six loci
have been described, designated MCPH1–6. At least one further locus awaits discovery, as
we ourselves have multi-affected consanguineous pedigrees not linked to any of the
described loci. The six loci are documented in Table 1. To date only MCPH1 and MCPH5
genes − microcephalin and ASPM respectively − have been identified.11 12 Prenatal
diagnosis and carrier testing could be offered using linkage analysis but the heterogeneity
of the disorder currently precludes this in all but exceptional families.
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53
Primate Evolution and Primary Microcephaly
It is generally accepted that hominids (including man, Homo sapiens sapiens) and
the greater apes (gibbon, orang-outan, chimpanzee and gorilla) had a common ancestry.
The divergence of the species has occurred over the last 10 million years. The intervening
species between the gorilla/chimpanzee/hominid emergence 4 million years ago and
modern man have all become extinct. So the exact number of species and their evolutionary
relationship is unknown. However paleantological studies of fossil records suggest that
there have been at least 6 hominids, and that there has been a step-wise increase in brain
volume as the hominid species have diverged from a common ape/hominid ancestor.
Australopithecus, the most ancient hominid fossil found in the southern tip of Africa, is
believed to have lived about 3.8-3.6 million years ago and had a brain volume of 600cm3.
Homo erectus lived between 1.5 and 0.2 million years ago, and his brain volume increased
from 850 to 1200cm3. The most recent Homo erectus − the ones who lived between 0.4 and
0.2 million of years ago − had such a modern appearance that they can be considered Homo
sapiens. After 0.2 million of years ago the hominids brain volume reached 1400cm3, the
same size seen in men today. It is thought, nevertheless, to exist differences in the relative
size of parts of the cerebral cortex, with Neanderthals having a larger motor strip – because
of their greater muscle bulk − and humans a larger frontal cortex. It has been assumed that
the increase in brain size of the hominid species has lead to our increased intelligence
(which may be broadly defined as “adaptability to environment”) and our unprecedented
spread to inhabit all parts of the earth (something not achieved by any other creature). This
increase in brain size has occurred over a relatively short period of time.52
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54
The major differences between higher primates and other primates is larger relative
brain size and shoulder anatomy allowing under branch travel and greater general arm
manouverability and use. Homo sapiens and higher primates seem to differ in 1) the ability
to speak with changes both in the larynx and in the parts of the brain needed to exert
exquisite breath control, 2) the loss of a tail and 3) the size of our cerebral cortex. Most
changes of a size or specialisation of a part of an organism occur because of dominant
mutations in a number of genes that become fixed in the population. It may then be
hypothesised that the genes causing the autosomal recessive disorder of Primary
Microcephaly may be the same genes that have lead to the increase in human cerebral
cortex size. If so Primary Microcephaly may be viewed as an evolutionary disease – one in
which a key step in the differential development of a human from an ancestral species
cannot occur because of a gene mutation.
Conclusions
The diagnosis of Primary Microcephaly should only be made if diagnostic criteria
are met and known differential diagnosis are sought and eliminated. The majority of the
cases will have an autosomal recessive inheritance, with the resultant one in four risk of a
further affected child. Prenatal diagnosis is not available and fetal ultrasound scanning only
detects a reduction in expected head circumference after 28 weeks. The condition is rarely
reported in Caucasians, but seems more common in those of Asian and possibly Arab
origin. The condition exhibits genetic heterogeneity with six loci identified to date. Prenatal
diagnosis (to detect a recurrence of the disorder), post-natal diagnosis (to identify the
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55
disorder from the many differential diagnoses) and carrier testing (in consaguineous
families in which the disease is known to occur) may all become possibilities once the
MCPH genes are identified (to date only MCPH1 and MCPH5 genes have been identified).
It has been speculated, without any evidence, that the genes that cause Primary
Microcephaly wouls be involved in the “encephalisation” of the recently evolved hominid
species, culminating in the human cerebral cortex, three times that of our closest relatives
the chimpanzee and gorilla.
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antenatal diagnosis after the birth of an affected child. Am J Med Genet 1987;27:583-
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50 Komai T, Kishimoto K, Ozaki Y. Genetic study of microcephaly based on Japanese
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51 Blyth H, Carter CO. A guide to genetic prognosis in paediatrics. Dev Med Child
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52 Futuyma DJ. Evolutionay biology. 3rd edition. Sinauer Associates, Inc., 1998.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
62
Table 1
The six known loci for autosomal recessive primary microcephaly
Primary microcephaly locus
Chromosomal location Ethnicity of family Reference
MCPH1 8p23.1 Northern Pakistani Jackson et al., 1998
MCPH2 19q13 Northern Pakistani Roberts et al., 1999
MCPH3 9q34 Northern Pakistani Moynihan et al., 2000
MCPH4 15q14 Moroccan Jamieson et al., 1999
MCPH5 1q31.3 Northern Pakistani
Turkish
Pattison et al., 2000
Jamieson et al., 2000
MCPH6 13q12.2 Brazilian Leal et al., 2003
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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V. ARTIGO 2
A Novel Locus for Autosomal Recessive Primary Microcephaly
(MCPH6) Maps to 13q12.2
Artigo publicado no Journal of Medical Genetics 2003;40:540-542. ________________________________________________________________________________________
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A Novel Locus for Autosomal Recessive Primary Microcephaly (MCPH6)
Maps to 13q12.2
Gabriela F Leal, MD*, Emma Roberts, PhD‡, Elias O Silva, PhD*#, Suzana M R Costa,
MD*, Daniel J Hampshire, BSc‡, C Geoffrey Woods, FRCP‡
*Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), Recife-PE, Brazil
‡Molecular Medicine Unit, University of Leeds, St James’s University Hospital, Leeds,
LS9 7TF, UK
#Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brazil
Corresponding Author
C Geoffrey Woods
Molecular Medicine Unit
Clinical Sciences Building
St James's University Hospital
Beckett Street
Leeds LS9 7TF
England-UK
Tel: 0044 113 2065252
Fax: 0044 113 2444475
Email: [email protected]
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Key points
• Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a genetic disorder in which an
affected subject is born with a head circumference >3 SD below the expected mean and is
mentally retarded.
• We report a novel locus (MCPH6) mapped to chromosome 13q12.2 in a Brazilian family.
• The minimal critical region spans 6 Mb between markers AL139378GT17 and D13S1244
with a maximum two point lod score of 6.25.
Microcephaly is the clinical finding of a head circumference measurement greater than
three standard deviations (SD) below the population mean for age and sex. It is usually
accompanied by mental retardation and there are many diagnoses with both environmental
and genetic aetiologies.1 Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) (MIM
251200) is a disorder in which affected subjects are born with a small head circumference,
explained by a cerebral cortex of reduced size, and are mentally retarded. The brain is
structurally normal and, apart from the intellectual impairment, there are no other
significant neurological problems, dysmorphic features, or malformations.2,3 In a study
carried out in the Netherlands,4 the incidence of MCPH was approximately 1/250 000 but it
is probably greater in populations with a high rate of consanguineous marriages. MCPH has
been shown to be genetically heterogeneous with the identification of five loci: MCPH1 on
8p23,5 MCPH2 on 19q13,6 MCPH3 on 9q34,7 MCPH4 on 15q15-q21,8 and MCPH5 on
1q31.9 10 MCPH1, 2 and 3 were mapped in Northern Pakistani families, MCPH4 in a
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Moroccan family, and MCPH5 in Northern Pakistani and Turkish families. Here we report
the identification by autozygosity mapping11 of a novel locus for primary microcephaly,
MCPH6, in a North-Eastern Brazilian family.
MATERIALS AND METHODS
Subjects
The consanguineous family had eight affected subjects (five males and three females, DNA
available from seven subjects), with ages varying between four and 27 years (fig 1), in four
sibships (fig 2). The head circumference of all affected subjects was noted to be small at
birth and between 7-10 SD below the expected mean when examined by us. All had mental
retardation of moderate severity: the three adults and the adolescent affected were unable to
read or write but could speak simple phrases and had basic self-care skills. With the
exception of intellectual impairment, there were no other neurological problems (including
fits) and motor development had been normal. All eight were in good health and had
growth parameters within normal limits. They were not dysmorphic and no syndrome
diagnosis could be made. No past medical history or environmental causes could be found
to explain the finding of microcephaly. The parents had normal head circumference and
intelligence. Ophthalmologic examination, standard lymphocyte karyotype (400 bands),
and electroencephalogram performed in four affected subjects were normal, and brain scans
in two showed no cerebral malformations or neuronal ectopia.
Molecular genetics
Linkage to the five known MCPH loci was ruled out (data not shown). An autosomal
chromosome screen for regions of shared homozygosity was performed on seven of the
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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eight affected subjects and their parents with the CHLC/Weber Human Screening Set
version 8 (Research Genetics), which contains 365 autosomal microsatellite repeat markers
spaced at approximately 10 cM intervals. PCR amplification of all markers was performed
according to the manufacturer’s specifications using a Roboseq 4200 (MWG BioTech Ltd).
Amplified markers were pooled and electrophoresed on an ABI Prism 377 gene sequencer
(Applied Biosystems) on 4.2% polyacrylamide gels, at 3000 V and 52°C, for 2.5 hours.
Fragment length analysis was undertaken using the ABI Prism Genescan and Genotyper
1.1.1 analysis packages.
RESULTS
A single region of homozygosity common to all seven microcephalic subjects was
identified on chromosome 13q defined by markers D13S787 and D13S1304. Further
refinement of the region was conducted using the following markers selected from the ABI
Linkage Mapping Panel Version I (Applied Biosystems), the Todd Panel,12 and the
Marshfield Linkage Maps: cen – D13S175 – D13S1275 – D13S787 – D13S221 –
D13S1304 – D13S1254 – D13S1244 – D13S217 – D13S120 – D13S171 – D13S1493 – tel.
This defined a shared homozygous region on chromosome 13 at band q12.2 with meiotic
crossovers between markers D13S175-D13S1275 and D13S1254-D13S1244, with the
centromeric and telomeric boundaries of a 9cM region being defined by D13S175 and
D13S1244. Information regarding marker order and relative distances was obtained from
the Marshfield Linkage Maps. The marker order obtained from the Marshfield Linkage
Maps was in agreement with that derived from analysis of the current draft human genome
data.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
68
A fully penetrant autosomal recessive mode of inheritance and a disease gene
frequency of 0.003 were assumed. Owing to the complexity of the family structure, equal
allele frequencies were assumed for each marker when calculating the LOD scores and the
maximum number of alleles was set at 4. Pedigree allele inconsistencies were identified
using PedCheck.13 Two point analysis was performed using the LINKAGE analysis
programs14 at θ=0 for markers in the critical region and results are shown in table 1 with the
highest lod score at 6.25 for marker D13S1275.
Novel microsatellite markers to refine the region further were designed using the
Human Genome Browser and the Primer3 program, and designated [human BAC accession
number] [microsatellite repeat unit] [number of unit repeats in the reference BAC], for
example, AL356285TG25 (fig 2). These allowed us to redefine the centromeric boundary
marker as AL139378GT17.
DISCUSSION
Haplotype and LOD score analysis both suggest that the chromosome region 13q12.2,
designated the MCPH6 locus, contains a gene which when mutated causes autosomal
recessive primary microcephaly. Within the larger MCPH6 region of 9 cM there is the
potential candidate gene, fibroblast growth factor 9 (FGF9). In the nervous system of mice,
FGF9 is produced mainly by neurones and may have a role in glial cell growth and
differentiation during development.15 16 The redefinition of the region to 6 cM using novel
microsatellite markers flanking FGF9 resulted in the exclusion of this gene (fig 2). We now
therefore consider that the gene causing this form of autosomal recessive primary
microcephaly must lie within this smaller region of approximately 6 Mb. To date, only the
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
69
MCPH1 gene, microcephalin, and the MCPH5 gene, ASPM, have been identified.17 18
Future identification of the MCPH6 gene may be aided by an insight into how these
proteins function and interact within the human brain, such as mitotic spindle activity in the
case of ASPM. The discovery of MCPH genes will lead to a greater understanding of
normal and abnormal human fetal cerebral cortex growth, giving potential insights into the
question of how the mammalian cerebral cortex evolved and has become so predominant in
humans, and the wherewithal to offer diagnostic, prenatal, and carrier testing for affected
families.
Acknowledgements
We express our gratitude to the members of the family studied. This work has been funded
by CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), FACEPE
(Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco), the Wellcome
Trust, and the West Riding Medical Research Trust. We thank the Research Center Aggeu
Magalhães (CPqAM) for permitting us to use their equipment for DNA extraction and the
staff of HGMP for computational assistance.
Electronic-Database Information
URLs for data in this article are as follows:
Center for Medical Genetics, Marshfield Medical Research Foundation available at
http://research.marshfieldclinic.org/genetics/ (for genetic linkage maps).
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
70
Human Gene Nomenclature Database, HUGO Gene Nomenclature Committee:
http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/
The draft human genome browser: http://genome.cse.ucsc.edu/
For primer creation (for novel microsatellite markers): http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer/primer3_www.cgi.
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Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
73
Table 1
Two point lod scores at θ = 0 for each marker defining the MCPH6 region at 13q12.2
Marker LOD score at θ = 0
D13S175 - ∞
D13S1275 6.25
D13S787 5.9
D13S221 3.87
D13S1304 2.75
D13S1254 4.29
D13S1244 2.31
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Figure 1
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
75
Figure 2
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
76
LEGENDS OF FIGURES
Figure 1
Six of the eight affected subjects with ages between 4 and 27 years with a diagnosis of
autosomal recessive primary microcephaly.
Figure 2
Genotypes for eight markers used in the study at 13q12.2 arranged centrosome to qter.
Unaffected sibs have been omitted for clarity. Marker order was taken from the Marshfield
linkage map. The boxed region shows the shared region of homozygosity in affected
individuals. The FGF9 gene, indicated by an arrow, is flanked by markers AL139378GT21
and AL139378GT17 and hence is excluded as a candidate gene from the commom
homozygous region in affected subject
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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VI. ARTIGO 3
Microcefalia Primária em Três Famílias Consangüíneas:
Estudos Clínicos e Moleculares
Artigo submetido ao Jornal de Pediatria ________________________________________________________________________
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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Microcefalia Primária em Três Famílias Consangüíneas: Estudos Clínicos
e Moleculares
Primary Microcephaly in Three Consanguineous Families: Clinical and Genetic Studies
Título abreviado: Microcefalia genética em três famílias consangüíneas.
Gabriela F. Leal 1, Elias O. Silva 2
1Mestre em Genética. Médica do Serviço de Genética Médica do Instituto Materno-Infantil
de Pernambuco (IMIP), Recife-PE. Email: [email protected]
2Doutor em Genética. Médico-fundador do Serviço de Genética Médica do Instituto
Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), Professor Adjunto do Departamento de Genética
da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE.Email: [email protected]
Ambos os autores possuem currículo cadastrado na plataforma Lattes do CNPq e
contribuíram igualmente na realização deste trabalho.
Endereço para correspondência e para contatos pré-publicação:
Dra. Gabriela F. Leal
Serviço de Genética Médica
Instituto Materno-Infantil de Pernambuco
Rua dos Coelhos, 300 - Boa Vista
50070-550 Recife-PE Brasil
Tel: (81) 34132100 Fax: (81) 34237772 Email: [email protected]
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
79
Fonte financiadora: FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de
Pernambuco) e CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)
Número de palavras do texto, excluindo-se referências bibliográficas e legendas de figuras: 2.062.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
80
Resumo
Objetivo: descrever os aspectos clínicos de três famílias consangüíneas pernambucanas
com microcefalia primária e os aspectos moleculares de uma delas (família 2).
Pacientes e métodos: três famílias consangüíneas pernambucanas, não relacionadas
biologicamente, com microcefalia primária foram estudadas. Os heredogramas e a história
clínica dos afetados foram construídos com base em informações obtidas de seus pais e
outros parentes. Exame físico foi realizado em todos os afetados, seus genitores e na quase
totalidade dos irmãos normais dos afetados. DNA genômico dos afetados da família 2 e de
seus pais foi usado em reações de PCR (polimerase chain reaction) com primers
elaborados para amplificar marcadores microssatélites ligados aos locos já conhecidos de
microcefalia primária. Os marcadores amplificados foram submetidos a eletroforese e seus
alelos analisados.
Resultados e conclusões: nas três famílias, os afetados apresentavam perímetro cefálico
muito reduzido acompanhado de retardo mental e apenas uma paciente (da família 3)
manifestava outras alterações neurológicas, mas sem dismorfias associadas. Estudos
moleculares demonstraram que a microcefalia primária, na família 2, não apresentava
ligação com nenhum dos locos associados a esta condição já mapeados, sugerindo a
existência de pelo menos mais um gene determinante de microcefalia primária.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
81
Abstract
Objective: describe the clinical findings in three consanguineous families from Pernambuco
with primary microcephaly, and the molecular studies in one of them (family 2).
Patients and methods: three consanguineous families from Pernambuco, not related one to
another and with primary microcephaly, were studied. The genealogical data and the
clinical history of the affected individuals were obtained from their parents and other
family members. All the affected subjects, almost all their normal siblings, and their parents
were clinically examined. Genomic DNA from the microcephalic persons of family 2 and
from their parents was used in PCR (polimerase chain reaction) reactions with primers
designed to amplify microsatellite markers linked to the known primary microcephaly loci.
Amplified markers were electrophoresed and analysed.
Results and conclusions: in the three families, all the affected subjects presented a small
head circumference with accompaning mental retardation, and only one patient (of family
3) showed other neurological problems. None of the microcephalic individuals had
dysmorphic features. Molecular studies on family 2 revealed that the microcephaly in this
family was not linked to any of the already known primary microcephaly loci, what
suggests that at least one more locus exist associated to this condition.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
82
Introdução
Considera-se que um indivíduo apresenta microcefalia quando a medida de seu perímetro
cefálico situa-se mais de três desvios-padrões (DP) abaixo da média populacional para
idade e sexo1. A microcefalia é um sinal clínico encontrado em vários distúrbios com
etiologia ambiental e/ou genética, podendo estar acompanhado de outros defeitos
morfológicos (forma sindrômica) ou não (microcefalia não-sindrômica). Hipóxia perinatal,
infecções congênitas (tais como rubéola, citomegalovirose, toxoplasmose e herpes-virose
tipo 2), exposição intra-uterina a radiação ionizante e a drogas (como álcool e hidantoína), e
fenilcetonúria materna são algumas das causas ambientais de microcefalia 2, 3. A
microcefalia geneticamente determinada pode resultar de alterações monogênicas,
anomalias cromossômicas ou distúrbios multifatoriais 4.
A microcefalia primária (MP) (microcefalia pura, isolada) é uma forma de
microcefalia genética com padrão autossômico recessivo de herança. Os indivíduos
afetados apresentam redução do perímetro cefálico − como conseqüência de uma
diminuição na espessura do córtex cerebral − associado a retardo mental, não se observando
dismorfias, malformações ou outras alterações neurológicas significativas4. A microcefalia
primária é geneticamente heterogênea, com seis locos mapeados previamente em regiões
cromossômicas específicas: MP1 em 8p23 5, MP2 em 19q13 6, MP3 em 9q34 7, MP4 em
15q15-q21 8, MP5 em 1q31 9,10 e MP6 em 13q12.2 11.
Neste trabalho, relatamos os resultados de um estudo clínico-molecular envolvendo
três famílias pernambucanas consangüíneas com microcefalia primária.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
83
Pacientes e métodos
As três famílias estudadas não são biologicamente relacionadas. A família 1 é originária do
sertão pernambucano; a 2, do agreste e a família 3 é proveniente da região metropolitana do
Recife. As figuras 1, 2 e 3 representam os heredogramas dessas famílias. As informações
genealógicas foram obtidas com a colaboração de vários membros das famílias, e exame
físico foi realizado em todos os afetados, seus genitores e na quase totalidade dos irmãos
dos afetados. Análise cromossômica com bandeamento G (400 bandas), exame
oftalmológico, tomografia computadorizada crânio-encefálica, eletroencefalograma e testes
para infecções congênitas foram realizados em diversos pacientes das três famílias.
Os estudos moleculares foram realizados com DNA genômico dos afetados da
família 2 e de seus pais. O DNA, obtido a partir de leucócitos do sangue periférico, foi
usado em reações de PCR (polimerase chain reaction) com primers marcados com
fluorescência e elaborados para amplificar marcadores microssatélites ligados aos locos
MP1-MP6. Os marcadores amplificados foram submetidos a eletroforese em seqüenciador
ABI Prism 377 (Applied Biosystems) e análise de tamanho dos seus alelos foi realizada
com os programas de computador ABI Prism Genescan e Genotyper (versão 1.1.1)
(Applied Biosystems).
Resultados
Estudos clínicos
A família 1 continha oito afetados vivos (cinco do sexo masculino e três do feminino), com
idades entre quatro e 27 anos, distribuídos em quatro irmandades (Fig. 1). Na família 2
havia cinco indivíduos microcefálicos vivos (dois masculinos e três femininos), com idades
variando de 15 a 25 anos e distribuídos em duas irmandades (Fig. 2). Na família 3, eram
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
84
afetados um rapaz e uma moça com 16 e 15 anos de idade respectivamente (Fig. 3). A Fig.
4 mostra fotografia de um paciente de cada família. Todos os afetados das três famílias
nasceram a termo, não havendo intercorrências dignas de nota durante as gestações.
Quando examinados, os pacientes das famílias 1 e 2 apresentavam medidas de perímetro
cefálico com 7-10 e 4-6 DP abaixo da média respectivamente, e, em ambas as famílias, o
retardo mental era moderado. Os adultos e adolescentes afetados não sabiam ler nem
escrever, mas falavam frases simples e tomavam banho, vestiam-se e alimentavam-se
sozinhos. Na família 3, o indivíduo III-4 tinha medida de perímetro cefálico com 6 DP
abaixo da média e retardo mental moderado: conhecia o alfabeto mas não aprendeu a
ler/escrever, apesar de freqüentar escola desde os seis anos de idade. Sua irmã afetada (III-
5) apresentava perímetro cefálico com 8 DP abaixo da média e deficiência mental grave:
não falava palavras inteligíveis, nem tinha controle esfincteriano. Os irmãos III-1, III-2 e
III-3 apresentavam perímetro cefálico com 2-3 DP abaixo da média e nível intelectual
variável − III-1 era intelectualmente normal, enquanto III-2 e III-3 manifestavam retardo
leve (ambos freqüentaram escola desde os seis anos de idade, mas liam precariamente e
foram reprovados várias vezes). Todos os afetados das famílias 1 e 2, assim como o afetado
III-4 da família 3, eram eumórficos, com estatura normal e sem outros problemas
neurológicos além do déficit intelectual. A adolescente afetada III-5 da família 3 também
era eumórfica, mas apresentava espasticidade generalizada. Os genitores de todos os
afetados eram normocéfalos e intelectualmente normais. Análise cromossômica, exame
oftalmológico, eletroencefalograma e testes para infecções congênitas não revelaram
alterações. A tomografia computadorizada crânio-encefálica apenas confirmou a presença
de microcefalia, não tendo sido observadas outras anormalidades.
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
85
Estudos moleculares
A análise de tamanho dos alelos dos marcadores microssatélites ligados aos locos MP1-
MP6 mostrou que nenhum desses seis locos representavam regiões de homozigose na
família 2, excluindo-se assim a possibilidade de que a microcefalia, nesta família, fosse
causada por mutações em homozigose em gene localizado em um desses seis locos.
Discussão
Descrevemos aqui três famílias consangüíneas com microcefalia genética, com padrão de
herança autossômico recessivo. Todos os afetados apresentavam redução importante do
perímetro cefálico acompanhada de retardo mental, na ausência de
dismorfias/malformações e apenas uma paciente (III-5/família 3) manifestava outros
problemas neurológicos. Além disso, apresentavam desenvolvimento motor normal (com a
exceção de III-5/família 3), eram bem-humorados e tinham convívio social fácil, o que está
de acordo com a observação de que, na microcefalia primária autossômica recessiva, as
habilidades sociais parecem bem menos comprometidas do que as cognitivas. Outras
características encontradas que ajudam a firmar o diagnóstico dessa anomalia são a
presença de consangüinidade, a ausência de um fator ambiental causador de microcefalia, a
história de gestação e parto sem intercorrências, e o achado, na tomografia crânio-
encefálica, de um cérebro simetricamente pequeno mas sem alterações estruturais 4,12.
Os estudos moleculares que realizamos com a família 1 (Leal et al.11) − a primeira
família brasileira com microcefalia primária analisada molecularmente − resultaram no
mapeamento do sexto loco gênico determinante desta condição na região cromossômica
13q12.2. O primeiro gene foi mapeado em 1998 em uma família paquistanesa5 e,
posteriormente, outros quatro foram identificados em outras famílias 6-10. Os genes de MP1
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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e MP5 já foram clonados. A MP1 é causada por mutações em homozigose no gene
microcefalina, que apresenta altos níveis de expressão nas paredes dos ventrículos laterais,
onde células progenitoras dividem-se e originam neurônios que migram para formar o
córtex cerebral 13. Em MP5, mutações em homozigose ocorrem no gene ASPM (abnormal
spindle-like microcephaly associated), envolvido na formação e no funcionamento do fuso
mitótico nos neuroblastos da fase embrionária. Alterações da proteína codificada por esse
gene impedem que neuroblastos em divisão celular progridam além da metáfase,
prejudicando, assim, o desenvolvimento do sistema nervoso central 14.
A análise molecular dafamília 2, ao revelar que a microcefalia, nesta família, não
estava ligada a nenhum dos seis locos mapeados previamente, sugere a existência de um
novo gene associado à microcefalia primária autossômica recessiva aguardando
identificação. Considerando-se a complexidade do desenvolvimento do cérebro, um
processo que envolve um balanço da proliferação, migração e apoptose neuronais 15, já era
esperado que a microcefalia primária apresentasse importante heterogeneidade genética,
entretanto esta heterogeneidade de locos não é acompanhada de uma heterogeneidade
fenotípica correspondente, porquanto todas as famílias em que se mapearam os diferentes
locos apresentavam quadros clínicos bastante semelhantes, não sendo possível, com base
apenas em dados clínicos, diferenciar-se as seis formas entre si 16.
Na família 3, o paciente III-4 apresentava quadro típico de microcefalia primária,
mas sua irmã afetada manifestava retardo neuropsicomotor grave com espasticidade
generalizada, o que viabiliza a hipótese de patologia associada, ainda que não identificada.
Analisando 48 casos (19 familiais, distribuídos em nove famílias, e 29 casos isolados) de
microcefalia não-sindrômica com provável modo de herança autossômico recessivo,
Tolmie et al.17 observaram que sete dos casos isolados e cinco das nove famílias com mais
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de um afetado apresentavam microcefalia acompanhada de espasticidade e/ou crises
convulsivas, e que a severidade da microcefalia e da espasticidade variava entre as famílias
e também entre irmãos afetados. Contudo, essas famílias, assim como a família 3 aqui
descrita, não foram estudadas com técnicas de DNA. A análise molecular dessas famílias
poderia esclarecer se, eventualmente, genes determinantes de microcefalia estariam
etiologicamente implicados na ocorrência de manifestações neurológicas adicionais. Outro
aspecto relevante relativo à família 3 é o fato de que os irmãos III-1, III-2 e III-3
apresentavam medidas de perímetro cefálico nos limites inferiores de normalidade e dois
deles (III-2 e III-3) exibiam deficiência mental leve, enquanto os perímetros cefálicos de
seus genitores situavam-se em torno da média populacional. Assim, julgamos pertinente
questionar se os fenótipos desses três indivíduos representam manifestações suaves de
mutação em homozigose em um dos genes determinantes de microcefalia primária, ou
manifestações do gene mutante em heterozigose. Esta questão poderia ser elucidada com a
análise molecular desta família, que ainda não foi realizada.
Casais com crianças portadoras de microcefalia são freqüentemente encaminhados
aos serviços de genética médica para avaliação diagnóstica e aconselhamento e uma parcela
substancial dessas crianças consiste de casos esporádicos de microcefalia isolada. Não é
surpreendente que esses casos representem problemas especiais para o aconselhamento
genético. Havendo apenas uma criança afetada na família, sem anomalias associadas que
permitam o diagnóstico de síndrome específica e sem consangüinidade parental, torna-se
difícil discernir se a causa da microcefalia é genética ou ambiental. O mapeamento e a
caracterização molecular dos genes causadores de microcefalia, e a identificação de seus
produtos e funções correspondentes, constituem uma contribuição extraordinária à
compreensão da patogênese da microcefalia. E esses conhecimentos poderão ser utilizados
Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________
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no diagnóstico pré-natal, na detecção de heterozigotos, e no diagnóstico e − possivelmente
no futuro − tratamento dos afetados.
Agradecimentos
Agradecemos às famílias estudadas pela confiança e colaboração, e à CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e à FACEPE (Fundação
de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco) pelo suporte financeiro. As análises
moleculares foram realizadas na Unidade de Medicina Molecular do Hospital St James’s
(Universidade de Leeds - Inglaterra) sob a supervisão dos Drs. Christopher G. Woods e
Emma Roberts, a quem dispensamos agradecimentos especiais.
Referências bibliográficas
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microcephalin, a protein implicated in determining the size of the human brain. Am J
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91
2 2
1 2 3
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
21 5 6 7 8 109 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24
1 2 3 4 5
3,4 22,23
= Homem normal; = Mulher normal; = Afetados; = Propósito; = Aborto espontâneo;
= Casamento consangüíneo.
Fig. 1
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1
1
32 4 6 9 128 117 10
3 421
21 3 4
1 2
Fig. 2
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LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1
Heredograma da família 1.
Figura 2
Heredograma da família 2.
Figura 3
Heredograma da família 3.
Figura 4
Fotografias da região crâniofacial de três pacientes: IV-12 (família 2), III-5 (família 3) e
VI-5 (família 1).
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VII. CONCLUSÕES GERAIS _________________________________________________________________________
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CONCLUSÕES GERAIS
Os estudos clínicos de três famílias consangüíneas pernambucanas com microcefalia
primária e a análise molecular de duas delas permitiram as seguintes conclusões:
a) A microcefalia primária é uma entidade nosológica geneticamente heterogênea.
b) Um novo gene associado à microcefalia primária autossômica recessiva (o sexto loco)
foi mapeado em 13q12.2 na família 1 estudada neste trabalho.
c) Os estudos moleculares com a família 2 indicam a existência de pelo menos mais um
gene autossômico recessivo relacionado com microcefalia primária aguardando
identificação.
d) A microcefalia primária é uma entidade nosológica bem definida em que os afetados
apresentam medida de perímetro cefálico com pelo menos 4 desvios-padrões abaixo da
média para idade e sexo e retardo mental associado, na ausência de dismorfias,
malformações ou outros problemas neurológicos além da deficiência intelectual. Contudo,
não se pode excluir de todo a possibilidade de que, eventualmente, genes determinantes de
microcefalia primária estejam etiologicamente implicados na ocorrência de manifestações
neurológicas adicionais.
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e) Mutações em homozigose em genes para microcefalia primária resultam, comumente,
em microcefalia associada a retardo mental. Entretanto, pode-se questionar se retardo
mental leve associado a um perímetro cefálico no limite inferior de normalidade não seria,
em alguns casos, uma manifestação suave de mutação em homozigose em um desses genes,
ou, alternativamente, uma manifestação do gene mutante em heterozigose.
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VIII. AS PERSPECTIVAS _________________________________________________________________________
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100
AS PERSPECTIVAS
Com os estudos que realizamos neste projeto, surge a perspectiva de darmos
continuidade a esta linha de pesquisa envolvendo as seguintes questões:
a) Por meio da análise dos genes candidatos existentes na região de 6 cM onde se encontra
mapeado o sexto loco de microcefalia primária autossômica recessiva chegar-se-á à
identificação (clonagem) de mais um gene relacionado a esta condição. A eventual
identificação de outras famílias ligadas a este sexto loco poderá permitir o refinamento do
intervalo de 6 cM e, assim, facilitar a identificação/clonagem de mais um gene de
microcefalia primária.
b) Análises de ligação com membros da família 2 empregando-se outros marcadores
autossômicos microssatélites além dos 365 já utilizados na triagem genômica inicial,
provavelmente revelará mais um loco relacionado à microcefalia primária autossômica
recessiva.
c) A análise molecular da família 3 estudada neste trabalho poderá definir se
genes determinantes de microcefalia primária podem estar etiologicamente implicados na
ocorrência de manifestações neurológicas outras além de microcefalia com retardo mental.
Além disso, a análise desta família poderá esclarecer se retardo mental leve associado a um
perímetro cefálico no limite inferior de normalidade não seria, em alguns casos, uma
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manifestação suave de mutação em homozigose em um desses genes, ou, alternativamente,
uma manifestação do gene mutante em heterozigose.
d) Além das três famílias estudadas neste trabalho há, no Serviço de Genética Médica do
Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), outras famílias matriculadas com quadro
clínico de microcefalia primária. Estudos de ligação com estas famílias poderão revelar
outros locos associados a esta condição.
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IX. ANEXOS
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and the principal conclusions of the study. Structured abstracts (in the format used by e.g. the British Medical Journal and the Journal of the American Medical Association) have been shown to be more useful to readers, and their use is encouraged when possible.
2. Key words (maximum of five) These should be given beneath the abstract.
3. Introduction: Description of the background that led to the study.
4. Methods: Details relevant to the conduct of the study. Statistical methods should be clearly explained at the end of this section.
5. Results: Work should be reported in SI units. Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on validity and significance of results is appropriate but broader discussion of their implications should be placed in the next section.
6. Discussion: The nature and findings of the study are placed in context of other relevant, published data. Subheadings that aid clarity of presentation are encouraged.
7. Data access: Reference should be made to availability of detailed data, either through public databases or otherwise, and to availability of materials used for reported investigations. It is generally expected that genomic and similar data should be lodged in appropriate public databases at or before the time of publication. Authors are encouraged to make DNA or cell lines available to other workers. Mutation information: it is recommended that all mutations in any gene be deposited in existing public databases
8. Acknowledgments and affiliations: People with direct involvement in the study but not included in authorship may be acknowledged. The source of financial support and industry affiliations of all those involved should be stated.
9. References: In accordance with the Vancouver agreement these are cited by the numerical system and listed in the order cited in the text, not in alphabetical order by authors' names (In the text, the reference number should be given between square brackets on the line, not superscript.) All authors should be listed. Journal titles are abbreviated in accordance with the style of Index Medicus e.g Tomlinson IP, Beck NE, Homfray T, Harocopos CJ, Bodmer WF. Germline HNPCC gene variants have little influence on the risk for sporadic colorectal cancer. J Med Genet 1997;34:39-42
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10. Figures should be be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a separate sheet.
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13. Nomenclature: Current standard international nomenclature should be adhered to: Chromosomes: ISCN 1995. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Mitelman F (ed); S Karger, Basel, 1995 Genes: For human genes, use genetic notation and symbols approved by the HUGO Nomenclature Committee. Approved gene symbols may be obtained prior to submission from: Dr Sue Povey, HUGO Nomenclature Committee, The Galton Laboratory University College, London, UK. E-mail :[email protected], Fax: +44 171-387-3496. For nomenclature guidelines, see White et al., 'Guidelines for Human Gene Nomenclature' (Genomics 1997;45:468-471). The Gene Name Proposal form may be completed on the Nomenclature Web page:
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http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/. Human gene names and loci should be written in italicised capital letters and Arabic numerals. Protein products are not italicised. For mouse nomenclature, refer to the International Committee on Standardised Genetics Nomenclature for Mice: http://www.informatics.jax.org/support/nomen/. Enzymes: Enzyme nomenclature: recommendations of the nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. New York: Academic Press, 1992. Information also available on URL http://expasy.hcuge.ch/sprot/enzyme.html
2. Short reports
A brief communication presenting laboratory or clinical work, collected case reports, or single case reports of clinical or scientific significance. Reports of single mutations at loci which have already been documented will be published only if they are of unusual clinical or biological interest. The format can be identical to Original papers (see above) but in some circumstances the main body of the text may be better presented without division into sections. Brevity and clarity are always likely to enhance the chance of a manuscript being accepted for publication.
3. Review articles
Authors are welcome to discuss possible topics for review directly with the Editor. Submissions of review articles of the type that were published previously in the "Syndrome of the month" format are welcome.
4. Hypothesis articles
Contributions which present an interesting theory, discussed in relation to published data, are welcome.
5. Letters to the Editor
This section includes brief descriptions of significant clinical or laboratory findings. There is no formal word limit on Letters to the Editor and abstracts are not required. However, authors are encouraged to divide the letter into subheadings (e.g. methods, results etc.) as appropriate. In addition, authors may wish to add a textbox summarising their findings. Letters relating to or responding to previously published items in the journal will be shown to those authors, where appropriate.
6. Online mutation reports
OMRs provide an opportunity to publish interesting human gene mutations in a concise format. Human gene mutations may be interesting because of their nature, their epidemiology, the associated phenotype etc. On line publishing provides easy access and expedites publication. On-line mutation reports are intended to publish disease-causing mutations in known genes. In principle these should be significant new mutations (e.g. missense mutations that might provide insights into critical
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protein domains, founder mutations, mutations associated with an unusual phenotype etc). Known mutations can only be included if important additional information is given (e.g. functional analysis of the mutant protein). The number of mutations reported will depend on the significance of the mutations described and the number of mutations reported previously. However if >20 mutations are known it is expected that OMRs will contain at least 5 new mutations. Avoid figures that do not contribute to the understanding of the mutation, such as sequence electropherograms or SSCP gels. More complex and informative figures such as Southern or northern blots are encouraged. Tables summarizing previously reported mutations are encouraged. Include Genbank numbers for reference sequences. Mutation information: it is recommended that all mutations in any gene be deposited in existing public databases
For more information please request the OMR guidelines from the JMG Editorial Office
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A complimentary copy of the journal will be sent to the corresponding author on publication. Where the contribution is electronic-only, the author will receive a toll-free link to their article online
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JORNAL DE PEDIATRIA
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Relatos de casos tratam de pacientes ou situações singulares, doenças raras ou nunca descritas, assim como formas inovadoras de diagnóstico ou tratamento. O texto é composto por uma introdução breve que situa o leitor quanto à importância do assunto e apresenta os objetivos da apresentação do(s) caso(s); por um relato resumido do caso; e por comentários que discutem aspectos relevantes e comparam o relato com a literatura. O número de palavras deve ser inferior a 2.000, excluindo referências e tabelas. O número máximo de referências é 15. Recomenda-se não incluir mais de duas figuras. Artigos especiais são textos não classificáveis nas categorias acima, que o Conselho Editorial julgue de especial relevância para a saúde da criança. Sua revisão admite critérios próprios, não havendo limite de tamanho ou exigências prévias quanto à bibliografia. Cartas ao editor são altamente estimuladas. Em princípio, devem comentar, discutir ou criticar artigos publicados no Jornal de Pediatria, mas também podem versar sobre outros temas
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médicos de interesse geral. Também são bem-vindos comunicados de investigação de assuntos relevantes, cujo conteúdo não seja suficientemente desenvolvido para ter sua publicação como artigo original. Recomenda-se tamanho máximo de 1.000 palavras, incluindo referências bibliográficas, que não devem exceder a seis. Sempre que possível, uma resposta dos autores será publicada junto com a carta.
Instruções para envio de material para publicação
O Jornal de Pediatria dá preferência ao envio de material submetido à publicação por correio eletrônico (e-mail), desde que não contenha desenhos ou fotografias digitalizados. Caso o artigo inclua figuras que necessitem ser digitalizadas, o material pode ser enviado por correio comum.
Instruções para envio de material por e-mail:
1. Enviar para: [email protected]
2. Assunto: Escrever o título abreviado do artigo
3. Corpo da mensagem: Deve conter o título do artigo e o nome do autor responsável pelos contatos pré-publicação, seguidos de uma declaração em que os autores asseguram que: a) o artigo é original; b) nunca foi publicado e, caso venha a ser aceito pelo Jornal de Pediatria, não será publicado em outra revista; c) não foi enviado a outra revista e não o será enquanto sua publicação estiver sendo considerada pelo Jornal de Pediatria; d) todos os autores participaram da concepção do trabalho, da análise e interpretação dos dados, de sua redação ou revisão crítica e que leram e aprovaram a versão final; e) não foram omitidas informações sobre quaisquer ligações ou acordos de financiamento entre os autores e companhias ou pessoas que possam ter interesse no material abordado no artigo; f) todas as pessoas que fizeram contribuições substanciais para o artigo, mas não preencheram os critérios de autoria, são citados nos agradecimentos, para o que forneceram autorização por escrito; e reconhecem que a Sociedade Brasileira de Pediatria passa a ter os direitos autorais, caso o artigo venha a ser publicado. (Obs.: Caso o artigo seja aceito para publicação, será solicitado o envio desta declaração com a assinatura de todos os autores.)
4. Arquivos anexados: Anexar dois arquivos separados, contendo respectivamente: (a) resumo, palavras-chave, abstract, keywords, texto e referências bibliográficas, (b) tabelas e gráficos. Esses arquivos devem permitir a leitura pelos programas do Microsoft Office® (Word, Excel e Access).
Instruções para envio de material por correio comum:
1. Enviar para: Jornal de Pediatria Av. Carlos Gomes, 328 - conj. 304 Porto Alegre, RS CEP 90480-000
2. 2. Incluir uma carta de submissão, assinada por todos os autores, assegurando que: a) o artigo é original; b) o artigo nunca foi publicado e, caso venha a ser aceito pelo Jornal de Pediatria, não será publicado em outra revista; c) não foi enviado a outra revista e não o será enquanto sua publicação estiver sendo considerada pelo Jornal de Pediatria; d) todos os autores participaram da concepção do trabalho, da análise e interpretação dos dados, de sua redação ou revisão crítica e que leram e aprovaram a versão final; e) não foram omitidas informações sobre quaisquer ligações ou acordos de financiamento entre os autores e companhias ou pessoas que possam ter interesse no material abordado no artigo; f) todas as pessoas que fizeram contribuições substanciais para o artigo, mas não preencheram
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os critérios de autoria, são citados nos agradecimentos, para o que forneceram autorização por escrito; e reconhecem que a Sociedade Brasileira de Pediatria passa a ter os direitos autorais, caso o artigo venha a ser publicado.
3. O Jornal de Pediatria não se responsabiliza pelo eventual extravio de originais; os autores devem guardar cópia de seus trabalhos enquanto sua publicação estiver sendo considerada pelo Jornal de Pediatria.
4. O original deve ser enviado em três cópias impressas em folha de papel branco, tamanho A4 (210x297mm), com margens de 25mm em ambos os lados, espaço duplo em todas as seções; fonte Times New Roman, tamanho 11; páginas numeradas no canto superior direito, a começar pela página de rosto. Não usar recursos de formatação, tais como cabeçalhos e rodapés. Utilizar preferencialmente Microsoft Word®; caso seja usado um programa diferente, empregar o formato ASCII.
5. Enviar uma cópia do original em disquete ou CD (não usar discos "zip"), que contenha apenas arquivos relacionados ao artigo.
Diretrizes para a Preparação do Original
Orientações gerais: O original - incluindo tabelas, ilustrações e referências bibliográficas - deve estar em conformidade com os "Requisitos Uniformes para Originais Submetidos a Revistas Biomédicas", publicado pelo Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas1-4 (ver a última atualização, de outubro de 2001, disponível em http://www.jped.com.br/port/normas/normas_07.asp). Cada seção deve ser iniciada em nova página, na seguinte ordem: página de rosto, resumo em português, resumo em inglês, texto, agradecimentos, referências bibliográficas, tabelas (cada tabela completa, com título e notas de rodapé, em página separada), gráficos (cada gráfico completo, com título e notas de rodapé em página separada) e legendas das figuras.
A seguir, as principais orientações sobre cada seção:
Página de rosto: (a) título do artigo, conciso e informativo, evitando termos supérfluos e abreviaturas; evitar também a indicação do local e da cidade onde o estudo foi realizado, exceto quando isso for essencial para a compreensão das conclusões; (b) versão exata do título para o idioma inglês; (c) título abreviado (para constar na capa e topo das páginas), com máximo de 50 caracteres, contando os espaços; (d) primeiro e último nome de cada um dos autores e iniciais dos nomes intermediários; (e) titulação mais importante de cada autor; (f) endereço eletrônico de cada autor; (g) informar se cada um dos autores possui currículo cadastrado na plataforma Lattes do CNPq; (h) a contribuição específica de cada autor para o estudo; (i) instituição ou serviço ao qual o trabalho está vinculado; (j) nome, endereço, telefone, fax e endereço eletrônico do autor responsável pela correspondência; (k) nome, endereço, telefone, fax e endereço eletrônico do autor responsável pelos contatos pré-publicação; (l) fonte financiadora ou fornecedora de equipamento e materiais, quando for o caso; (m) contagem total das palavras do texto, excluindo referências bibliográficas, tabelas e legendas das figuras.
Resumo em português: O resumo deve ter no máximo 250 palavras ou 1.400 caracteres, evitando o uso de abreviaturas. O resumo deve ser apresentado também em inglês. Todas as informações que
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aparecem no resumo devem aparecer também no artigo. O resumo deve estruturado5, conforme descrito a seguir:
Artigo original: Objetivo: Informar por que o estudo foi iniciado e quais foram as hipóteses iniciais, se houve alguma. Definir precisamente qual foi o objetivo principal e informar somente os objetivos secundários mais relevantes. Métodos: Informar sobre o delineamento do estudo (definir, se pertinente, se o estudo é randomizado, cego, prospectivo, etc.), o contexto ou local (definir, se pertinente, o nível de atendimento, se primário, secundário ou terciário, clínica privada, institucional, etc.), os pacientes ou participantes (definir critérios de seleção, número de casos no início e fim do estudo, etc.), as intervenções (descrever as características essenciais, incluindo métodos e duração) e os critérios de mensuração do desfecho. Resultados: Informar os principais dados, intervalos de confiança e significância estatística. Conclusões: Apresentar apenas aquelas apoiadas pelos dados do estudo e que contemplem os objetivos, bem como sua aplicação prática, dando ênfase igual a achados positivos e negativos que tenham méritos científicos similares.
Artigo de revisão: Objetivo: Informar por que a revisão da literatura foi feita, indicando se ela enfatiza algum fator em especial, como causa, prevenção, diagnóstico, tratamento ou prognóstico. Fontes dos dados: Descrever as fontes da pesquisa, definindo as bases de dados e os anos pesquisados. Informar sucintamente os critérios de seleção de artigos e os métodos de extração e avaliação da qualidade das informações. Síntese dos dados: Informar os principais resultados da pesquisa, sejam quantitativos ou qualitativos. Conclusões: Apresentar as conclusões e suas aplicações clínicas, limitando generalizações aos domínios da revisão.
Relato de caso: Objetivo: Informar por que o caso merece ser publicado, com ênfase nas questões de raridade, ineditismo ou novas formas de diagnóstico e tratamento. Descrição: Apresentar sinteticamente as informações básicas do caso, com ênfase nas mesmas questões de ineditismo e inovação. Comentários: Conclusões sobre a importância do relato para a comunidade pediátrica e as perspectivas de aplicação prática das abordagens inovadoras.
Abaixo do resumo, fornecer de três a seis descritores, que são palavras-chave ou expressões-chave que auxiliarão a inclusão adequada do resumo nos bancos de dados bibliográficos. Empregar descritores integrantes da lista de "Descritores em Ciências da Saúde" 6,7, elaborada pela BIREME e disponível nas bibliotecas médicas ou na Internet (http://decs.bvs.br/). Se não houver descritores adequados na referida lista, usar termos novos. Para traduzir os descritores, utilizar a lista de "Medical Subject Headings", publicada pela U.S. National Library of Medicine, do National Institute of Health, e disponível em http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html. Abreviaturas Devem ser evitadas, pois prejudicam a leitura confortável do texto. Quando usadas, devem ser definidas ao serem mencionadas pela primeira vez. Jamais devem aparecer no título e nos
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resumos.
Texto O texto dos artigos originais deve conter as seguintes seções, cada uma com seu respectivo subtítulo: (a) Introdução: deverá ser curta, citando apenas referências estritamente pertinentes para mostrar a importância do tema e justificar o trabalho. Ao final da introdução, os objetivos do estudo devem ser claramente descritos. (b) Métodos: deve descrever a população estudada, a amostra, critérios de seleção, com definição clara das variáveis e análise estatística detalhada, incluindo referências padronizadas sobre os métodos estatísticos e informação de eventuais programas de computação. Procedimentos, produtos e equipamentos utilizados devem ser descritos com detalhes suficientes que permitam a reprodução do estudo. É obrigatória a inclusão de declaração de que todos os procedimentos tenham sido aprovados pelo comitê de ética em pesquisa da instituição a que se vinculam os autores ou, na falta deste, por um outro comitê de ética em pesquisa indicado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa do Ministério da Saúde8. (c) Resultados: devem ser apresentados de maneira clara, objetiva e em seqüência lógica. As informações contidas em tabelas ou figuras não devem ser repetidas no texto. Usar gráficos em vez de tabelas com um número muito grande de dados. (d) Discussão: deve interpretar os resultados e compará-los com os dados já existentes na literatura, enfatizando os aspectos novos e importantes do estudo. Discutir as implicações dos achados e suas limitações, bem como a necessidade de pesquisas adicionais. As conclusões devem ser apresentadas no final da discussão, levando em consideração os objetivos do trabalho. Relacionar as conclusões aos objetivos iniciais do estudo, evitando assertivas não apoiadas pelos achados e dando ênfase igual a achados positivos e negativos que tenham méritos científicos similares. Incluir recomendações, quando pertinentes. O texto de artigos de revisão não obedece a um esquema rígido de seções. Sugere-se uma introdução breve, em que os autores explicam qual a importância da revisão para a prática pediátrica, à luz da literatura médica. Não é necessário descrever os métodos de seleção e extração dos dados, passando logo para a sua síntese, que, entretanto, deve apresentar todas as informações pertinentes em detalhe. A seção de conclusões deve correlacionar as idéias principais da revisão com as possíveis aplicações clínicas, limitando generalizações aos domínios da revisão. O texto de relatos de caso deve conter as seguintes seções, cada uma com seu respectivo subtítulo: (a) Introdução: apresenta de modo sucinto o que se sabe a respeito da doença em questão e quais são as práticas de abordagem diagnóstica e terapêutica, por meio de uma breve, porém atual, revisão da literatura. (b) Descrição do(s) caso(s): o caso é apresentado com detalhes suficientes para o leitor compreender toda a evolução e seus fatores condicionantes. Quando o artigo tratar do relato de mais de um caso, sugere-se agrupar as informações em uma tabela, por uma questão de clareza e aproveitamento do espaço. Evitar incluir mais de duas figuras. (c) Discussão: apresenta correlações do(s) caso(s) com outros descritos e a importância do relato para a comunidade pediátrica, bem como as perspectivas de aplicação prática das abordagens inovadoras. Agradecimentos Devem ser breves e objetivos, somente a pessoas ou instituições que contribuíram significativamente para o estudo, mas que não tenham preenchido os critérios de autoria. Integrantes da lista de agradecimento devem dar sua autorização por escrito para a divulgação de seus nomes, uma vez que os leitores podem supor seu endosso às conclusões do estudo. Referências bibliográficas
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As referências bibliográficas devem ser numeradas e ordenadas segundo a ordem de aparecimento no texto, no qual devem ser identificadas pelos algarismos arábicos respectivos entre parênteses. Devem ser formatadas no estilo Vancouver, de acordo com os exemplos listados a seguir: 1. Artigo padrão Morris SS, Grantham-McGregor SM, Lira PI, Assuncao AM, Ashworth A. Effect of breastfeeding and morbidity on the development of low birthweight term babies in Brazil. Acta Paediatr 1999;88: 1101-6. Se houver mais de 6 autores, cite os seis primeiros nomes seguidos de "et al".
2. Livro Lawrence RA. Breastfeeding. 5th ed. St. Louis (MO): CV Mosby; 1999.
3. Capítulo de livro Howard CR. Breastfeeding. In: Green M, Haggerty RJ, Weitzman M, editors. Ambulatory pediatrics. 5th ed. Philadelphia: WB Saunders; 1999. p.109-16.
4. Teses e dissertações Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly's access and utilization [tese de doutorado]. St. Louis (MO): Washington Univ.; 1995.
5. Trabalho apresentado em congresso ou similar (publicado) Blank D, Grassi PR, Schlindwein RS, Mello JL, Eckert GE. The growing threat of injury and violence against youths in southern Brazil: A ten year analysis. Abstracts of the Second World Conference on Injury Control; 1993 May 20-23; Atlanta, USA. Atlanta: CDC,1993:137-38.
6. Artigo de revista eletrônica Morse SS. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg Infect Dis [periódico eletrônico] 1995 Jan-Mar [citado1996 Jun 5];1(1). Disponível: www.cdc.gov/ncidod/EID/eid.htm. Acessado: 14 de dezembro de 2001. 7. Materiais da Internet Food and Agriculture Organization of the United Nations. Preparation and use of food based dietary guidelines [site na Internet]. Disponível: www.fao.org/docrep/x0243e/x0243e09.htm#P1489_136013. Acessado: 14 de dezembro de 2001. Obs.: uma lista completa de exemplos de citações bibliográficas pode ser encontrada na Internet, em http://www.icmje.org/ ou http://www.jped.com.br/port/normas/normas_07.asp. Artigos aceitos para publicação, mas ainda não publicados, podem ser citados desde que indicando a revista e que estão "no prelo".
Observações não publicadas e comunicações pessoais não podem ser citadas como referências; se for imprescindível a inclusão de informações dessa natureza no artigo, elas devem ser seguidas pela observação "observação não publicada" ou "comunicação pessoal" entre parênteses no corpo do artigo.
Os títulos dos periódicos devem ser abreviados conforme as abreviaturas do Index Medicus; uma lista extensa de periódicos, com suas respectivas abreviaturas, pode ser obtida através da publicação da NLM "List of Serials Indexed for Online Users", disponível no endereço http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lsiou.html
Para informações mais detalhadas, consulte os "Requisitos Uniformes para Originais Submetidos a Revistas Biomédicas". Este documento está disponível em http://www.icmje.org/ ou http://www.jped.com.br/port/normas/normas_07.asp Tabelas
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Cada tabela deve ser apresentada em folha separada, numerada na ordem de aparecimento no texto, e com um título sucinto, porém explicativo. Todas as explicações devem ser apresentadas em notas de rodapé e não no título, identificadas pelos seguintes símbolos, nesta seqüência: *, †, ‡, §, ||, . A formatação das tabelas deve utilizar apenas comandos de tabulação ("tab") e nova linha ("enter"). Não usar funções de criação de tabelas, não sublinhar ou desenhar linhas dentro das tabelas, não usar espaços para separar colunas (usar comando de tabulação/"tab"), não usar comandos de justificação, não usar tabulações decimais ou centralizadas. Não usar espaço em qualquer lado do símbolo±.
Figuras (fotografias, desenhos, gráficos) Todas as figuras devem ser numeradas na ordem de aparecimento no texto. Todas as explicações devem ser apresentadas nas legendas. Figuras reproduzidas de outras fontes já publicadas devem indicar esta condição na legenda, assim como devem ser acompanhadas por uma carta de permissão do detentor dos direitos. Fotos não devem permitir a identificação do paciente; tarjas cobrindo os olhos podem não constituir proteção adequada. Caso exista a possibilidade de identificação, é obrigatória a inclusão de documento escrito fornecendo consentimento livre e esclarecido para a publicação. Microfotografias devem apresentar escalas internas e setas que contrastem com o fundo.
As ilustrações são aceitas pelo Jornal de Pediatria em cores para publicação no site. Contudo, todas as figuras serão vertidas para o preto-e-branco na versão impressa. Caso os autores julguem essencial que uma determinada imagem seja colorida mesmo na versão impressa, solicita-se um contato especial com os editores. Imagens geradas em computador, como gráficos, devem ser anexadas sob a forma de arquivos nos formatos .jpg, .gif ou .tif, com resolução mínima de 300 dpi, para possibilitar uma impressão nítida; na versão eletrônica, a resolução será ajustada para 72 dpi. Gráficos devem ser apresentados somente em duas dimensões, em qualquer circunstância. Desenhos, fotografias ou quaisquer ilustrações que tenham sido digitalizadas por escaneamento não costumam apresentar grau de resolução adequado para a versão impressa da revista; assim, devem ser enviadas em versão impressa original (qualidade profissional, a nanquim ou impressora com resolução gráfica superior a 300 dpi), com duas cópias. Nesses casos, no verso de cada figura deve ser colada uma etiqueta com o seu número, o nome do primeiro autor e uma seta indicando o lado para cima.
Legendas das figuras Devem ser apresentadas em página própria, devidamente identificadas com os respectivos números (nas versões impressas, em espaço duplo).
Referências:
1. International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. JAMA 1997;277:927-34. 2. International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. Updated October 2001. Available from: http://www.icmje.org. Acessado 28 de janeiro de 2003. 3. Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas. Requisitos uniformes para originais submetidos a revistas biomédicas. J Pediatr (Rio J) 1997;73:213-24. 4. Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas. Requisitos uniformes para originais submetidos a revistas biomédicas. Atualização de outubro de 2001. Disponível em: http://www.jped.com.br. Acessado 28 de janeiro de 2003. 5. Haynes RB, Mulrow CD, Huth EJ, Altman DJ, Gardner MJ. More informative abstracts revisited. Ann Intern Med 1990;113:69-76. 6. BIREME - Centro Latino-Americano e do Caribe de Informação em Ciências da Saúde. DeCS - Descritores em ciências da saúde: lista alfabética 2ª ed. rev. amp. São Paulo: BIREME, 1992.
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111p. 7. BIREME - Centro Latino-Americano e do Caribe de Informação em Ciências da Saúde. DeCS - Descritores em ciências da saúde. Disponível em: http://decs.bvs.br 8. Ministério da Saúde. Conselho Nacional de Saúde. Resolução no. 196 de 10/10/96 sobre pesquisa envolvendo seres humanos. DOU 1996 Out 16; no. 201, seção 1:21082-21085.
Lista de Checagem
Recomenda-se que os autores utilizem a lista de checagem abaixo para certificarem-se de que todo o material requerido está sendo enviado. Não é necessário anexar a lista.
- Carta de submissão assinada por todos os autores (ou declaração no corpo da mensagem do e-mail) - Original em 3 cópias impressas (dispensado, em caso de envio por e-mail) - Cópia do original em disquete (dispensada, em caso de envio por e-mail) - Página de rosto com todas as informações solicitadas (no corpo da mensagem, em caso de e-mail) - Resumo em português e inglês, com descritores (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Texto contendo introdução, métodos, resultados e discussão (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Referências bibliográficas no estilo Vancouver, numeradas por ordem de aparecimento (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Tabelas numeradas por ordem de aparecimento (integrante do segundo arquivo anexado, em caso de e-mail) - Gráficos numerados por ordem de aparecimento (integrante do segundo arquivo anexado, em caso de e-mail) - Figuras (original e 2 cópias) identificadas (no caso de envio por correio) - Legendas das figuras (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Inclusão da informação sobre aprovação do trabalho por comitê de ética (no corpo do texto, na seção de Métodos)
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