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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS TURMA FORA DE SEDE/ UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

ESTUDO DO PROCESSO DE VASCULARIZAÇÃO DA

RETINA EM CAMUNDONGOS DEPLETADOS DA

PROTEÍNA PRION CELULAR

Mônica Moreau da Cunha Lima

Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro e à Universidade Federal da Bahia como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.

Salvador/BA Dezembro

2007

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ESTUDO DO PROCESSO DE VASCULARIZAÇÃO DA RETINA

EM CAMUNDONGOS DEPLETADOS DA PROTEÍNA PRION

CELULAR

Mônica Moreau da Cunha Lima

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro e à Universidade Federal da Bahia como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas.

Orientadora: Tatiana Coelho-Sampaio (UFRJ) Co-orientadora: Elisabete Freire (FTC)

Salvador/BA Dezembro

2007

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Título: Estudo do processo de vascularização da retina em

camundongos depletados da proteína prion celular

Autora: Monica Moreau da Cunha Lima

Dissertação de mestrado submetida à avaliação pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ (Turma Fora de Sede UFRJ/UFBA), como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências Morfológicas. Aprovada por: Prof. ________________________________________________________ Tatiana Coelho-Sampaio – ICB/UFRJ Orientadora Prof._________________________________________________________ Elisabete Freire – FTC/JA Co-orientadora Prof._________________________________________________________ Radovan Borojevic – ICB/UFRJ Presidente da Banca Prof._________________________________________________________ Maria de Fátima Dias Costa - ICS/UFBA Prof._________________________________________________________ Maria Isabel Dória Rossi – ICB/UFRJ Prof._________________________________________________________ Manoel Luis Costa – ICB/UFRJ Revisor Prof._________________________________________________________ Vitor Antonio Fortuna – ICS/UFBA Suplente

Salvador/BA

2007

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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de

Neuroquímica do Departamento de Biofunção do

Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal

da Bahia e no Laboratório de Biologia da Matriz

Extracelular do Departamento de Histologia do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da

professora Tatiana Coelho-Sampaio e Co-orientação da

professora Elisabete Freire, com auxílios concedidos

pela coordenação de aperfeiçoamento de pessoal e

ensino superior (CAPES), pelo Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pela

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa

do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

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FICHA CATALOGRÁFICA

LIMA, Monica Moreau da Cunha

ESTUDO DO PROCESSO DE VASCULARIZAÇÃO DA RETINA DE CAMUNDONGOS DEPLETADOS DA PROTEÍNA PRION CELULAR, RIO DE JANEIRO, UFRJ, 2007.

Dissertação de Mestrado xii, 92 pp. 1. Retina 2. Proteína Prion Celular 3. Vascularização 4. Laminina

5. Membrana basal I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Instituto de Ciências

Biomédicas - ICB II. Dissertação

vi

Aos meus pais, Joaquim e Aury, por terem me dado a energia da vida, o amor.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por me fazer paciente nas tribulações e pelo auxílio

para concluir este trabalho. Agradeço também por ter colocado tantas

pessoas maravilhosa em meu caminho.

À Elisabete Freire, minha amiga Bete, por tantas coisas que, por

mais que eu agradeça, ainda ficaria devendo. Por ter me resgatado para a

realização de um antigo sonho. Por me incentivar a acreditar neste sonho e

por fornecer meios para a realização deste sonho. Obrigada pelo apoio, não

somente no trabalho, mas em tudo.

À Tatiana Coelho-Sampaio, minha orientadora, pela oportunidade de

ter trabalhado sob sua proteção e inspiração, por ter me aceitado como

aluna e acreditado que mesmo longe o trabalho seria concluído. Por se

preocupar com meus problemas pessoais e me olhar não somente como

aluna, mas acima de tudo, como pessoa. Obrigada pelo grande

crescimento que você me proporcionou.

Ao professor Vivaldo, pela oportunidade de crescimento e por ter

acreditado e possibilitado meios para que eu pudesse desenvolver este

trabalho desde o início. Por se preocupar com o crescimento dos alunos

deste Mestrado.

Ao Professor Radovan Borojevic, por ter primeiro acreditado no

Mestrado aqui em Salvador e por tantos momentos de aprendizado.

viii

Ao meu querido irmão Vitor Hugo, por me apoiar em todos os

momentos, pela ajuda quando precisei de auxílio para estudar, pela

compreensão em vários momentos e pelas horas de descontração e risos.

Ao meu querido irmão Ramon, por também me apoiar em todos os

momentos, por demonstrar tanto carinho e compreensão nos momentos

em que precisei.

À querida Astria, pelo grande apoio desde o início, quando perdeu um

carnaval para estudar comigo para a prova do Mestrado. Obrigada pelo

carinho, amizade e conselhos.

Aos meus amores, meu marido Nando e minhas filhas Fernanda e

Luíza, pelo carinho e paciência.

Aos meus queridos pais, Joquim e Aury, pelo grande apoio e afeto.

À professora Sílvia Costa, por ter me recebido em seu laboratório

(LabNq/UFBA) durante a realização deste trabalho e pela amizade e

carinho que sempre demonstrou.

Ao professor Ramon El-Bachá, por ter me recebido em seu laboratório

(LabNq/UFBA) e por ter sido sempre muito cordial.

Aos colegas do laboratório (LabNq/UFBA), pela amizade, especialmente

Ana Rita, Alexandre, Sandra, Bruno, José Pinheiro e o Senhor Carlos.

À professora Vilma R. Martins pela excelente colaboração, cedendo os

animais para a realização deste trabalho.

Ao professor Rafael Linden pela colaboração cedendo os animais e pelas

frutíferas discussões.

ix

Ao Dr° Marcos Vanier, por ter permitido a utilização de seu laboratório

(Microscopia eletrônica/Fio Cruz-Ba) em vários momentos.

À Professora Graça da Escola de Veterinária da UFBA, por

disponibilizar o biotério para os camundongos.

x

RESUMO

A forma alterada da proteína prion celular, chamada de prion scrapie (PrPsc), tem sido identificada como a partícula infecciosa responsável pela transmissão de um conjunto de patologias denominadas encefalopatias espongiformes. No entanto, ainda não foi descrito um fenótipo evidente associado à proteína prion celular (PrPc). Como a proteina prion celular é um receptor para a proteína de matriz extracelular, laminina,neste trabalho investigamos se os animais nocaute para PrPc apresentariam alguma anomalidade relacionada à distribuição de laminina. Para tanto caracterizamos o padrão de deposição da proteína na membrana limitante interna da retina de camundongos neonatos selvagens e PrPc-. Observamos que os polímeros de laminina depositados na membrana limitante interna da retina dos animais selvagens apresentam um padrão de organização poligonal compatível com o previamente visualizado sobre camadas de astrócitos em cultura, obtidas de córtex de animais embrionários (Freire e cols., 2004). Esta organização não é vista em animais nocaute. Realizamos estudos comparativos da morfologia e integridade funcional dos vasos em camundongos selvagens e depletados do gene para PrPc em diferentes fases do desenvolvimento. Para esta análise fizemos imunomarcação de vasos em montagens planas de retina com anticorpos anti-laminina, anti-colágeno IV, anti-PECAM 1, além de marcação de núcleos de células da camada interna da retina com DAPI. Fizemos cortes histológicos de globo ocular de animais adultos para verificar a integridade das camadas da retina. Caracterizamos que ocorre um atraso no processo de vascularização da retina de animais depletados do gene prnp. Identificamos que os vasos da retina de animais nocaute, apresentam várias alterações como diminuição do calibre, menor ramificação e perda de pericitos. Acreditamos que estas alterações comprometam tanto o desenvolvimento quanto a maturação dos vasos, levando também a alterações nas camadas retinianas e conseqüentemente ao descolamento de retina descrito neste trabalho. Observamos ainda um comprometimento da função visual nos animais nocaute. O conjunto dos resultados obtidos neste trabalho sugere que exista uma correlação entre as alterações moleculares, celulares e histológicas no desenvolvimento vascular das retinas de animais nocaute para PrPc e alterações na função visual desses animais.

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ABSTRACT Prion scrapie (PrPsc), the altered form of cellular prion protein (PrPc),

has been identified as the infectious particle in a class of diseases named spongeform encephalopathies. Nevertheless, no phenotype has been associated to PrPc. In this work, we prepared flat retina samples from newborn PrPc knock-out and wild-type mice and labeled them with DAPI for nuclei labeling, anti-laminin, anti-type IV collagen and anti-PECAM antibodies in order to evaluate structural changes associated to PrPc in mice retina. Histological slices of adult mice retina were also analyzed. Laminin polymers present in wild-type mice retina displayed polygonal patterns, comparable to those previously described in embryonic mice asthrocyte in culture [Freire et al. (2004) J. Cell Sci. 117: 4067-4076]. This polygonal pattern was not observed in knock-out mice. Several structural changes, such as decrease of vessel diameter, low vessel ramification, loss of vessel pericytes and retinal detachment, were observed in knock-out mice. We believe that these process contribute to the delayed vascularization of knock-out mice retina compared to wild-type. In addition, visual loss was observed in knock-out mice but not in wild-type. These findings suggest that molecular, cellular, histological and functional particularities in mice retina may be correlated to PrPc function in vasculogenesis and vessel maturation in mammals

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ÍNDICE

RESUMO x ABSTRACT xi CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO 1 I.I PROTEÍNA PRION CELULAR 2

I.I.I DESCOBERTA DA PROTEÍNA PRION COMO AGENTE INFECCIOSO DAS ENCEFALITES ESPONGIFORMES 2 I.I.II DOENÇAS ASSOCIADAS A ALTERAÇÕES DA PROTEÍNA PRION 5 I.I.III ALTERAÇÕES CONFORMACIONAIS DA PROTEÍNA PRION CELULAR 7 I.I.IV CAMUNDONGOS DEFICIENTES DE prnp 12

I.I.V LIGANTES DE PrPc 13 I.II RETINA 15 I.II.I ASPECTOS MORFOLÓGICOS DA RETINA 15 I.II.II VASCULARIZAÇÃO DA RETINA 19 I.II.III DOENÇAS RELACIONADAS À VASCULARIZAÇÃO RETINIANA ANORMAL 24 I.II.IV ASPECTOS MOLECULARES E CELULARES ENVOLVIDOS NA MODULAÇÃO DA ANGIOGÊNESE POR BROTAMENTO 26

CAPÍTULO II: OBJETIVOS 31

CAPÍTULO III: MATERIAIS E MÉTODOS 34

III.I MATERIAIS 35 III.II MÉTODOS 36

III.II.I PREPARAÇÃO DE MONTAGENS PLANAS DA RETINA 36 III.II.II IMUNOFLUORESCÊNCIA 37 III.II.III ANÁLISE HISTOLÓGICA 38 III.II.IV AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO VISUAL 39 III.II.V ANÁLISE QUANTITATIVA E ESTATÍSTICA 40

CAPÍTULO IV: RESULTADOS 41 CAPÍTULO V: DISCUSSÃO 69 CAPÍTULO VI: CONCLUSÕES 78

CAPÍTULO VII: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80

1

I. INTRODUÇÃO

2

I. INTRODUÇÃO

I.I. PROTEÍNA PRION CELULAR

I.I.I. Descoberta da proteína Prion como o agente infeccioso das

encefalites espongiformes

Ao longo de vários anos, pesquisadores tentaram entender as causas

e as bases moleculares de um grupo de patologias denominadas

encefalopatias espongiformes (TSE), que se caracterizam pela deposição de

material de origem protéica, denominado fibrilas amilóides, e por uma

extensa degeneração do tecido cerebral. Essa patologia encontra-se

associada a altos graus de morbidade e mortalidade e inclui formas que

atacam tanto o homem (kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), doença

de Gerstmann-Sträussler-Scheinker e insônia familiar fatal) como animais

(scrapie, doença debilitante crônica e encefalopatia espongiforme bovina ou

BSE, popularmente conhecida como doença da vaca louca).

A transmissibilidade de encefalopatias espongiformes foi

demonstrada em várias ocasiões. Na década de 30, o scrapie foi

experimentalmente transmitido entre ovelhas e entre camundongos

através da inoculação de extratos de cérebro de animais afetados em

animais saldáveis (Cuille e cols., 1939; Chandler, 1961). A propagação do

kuru, doença que atingia nativos de algumas tribos da Papua Nova Guiné,

foi atribuída a atos de canibalismo em rituais fúnebres, quando se

ingeriam cérebros e vísceras de pessoas mortas. Essa hipótese foi

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confirmada com estudos que demonstraram a transmissão experimental

da doença para macacos, através da ingestão de vísceras contaminadas

(Gadjusek e cols., 1966). A redução do kuru só ocorreu quando o

canibalismo foi extinto nessas tribos. Desde então, foram feitas outras

demonstrações sobre a transmissibilidade das encefalopatias

espongiformes (Prusiner, 1993).

Durante anos, vários grupos de pesquisa se dedicaram a estudos

com o objetivo de caracterizar o agente causador das encefalopatias

espongiformes transmissíveis (TSE). Experimentos mostraram que o

agente responsável por essas patologias era extremamente resistente a

tratamentos que destroem ácidos nucléicos, como raios ultravioleta e

radiação ionizante. Assim, a participação de patógenos clássicos como

vírus ou bactérias atuando como agentes causadores das TSEs poderia ser

descartada (Alper e cols.,1967).

A partir de 1974, Stanley Prusiner e seu grupo, iniciaram um

trabalho com o objetivo de isolar e identificar esse novo agente infeccioso.

O grupo, usando cérebro de animais infectados por scrapie, confirmou os

resultados anteriores, ou seja, que o uso de agentes que provocam danos

ao material genético não reduziam a infectividade. Além disso, observaram

que ao testar agentes que desnaturam ou degradam proteínas, a

capacidade infecciosa era drasticamente reduzida. Acreditando que se

tratava de uma nova classe de agentes infecciosos, Prusiner nomeou-os de

“prions” (proteinaceous infectiuos particles) (Prusiner e cols., 1983).

4

A intensa investigação sobre a patogênese das doenças do prion

levou à formulação da hipótese de que estas fossem causadas pela

infecção com a proteína PrPsc (onde sc refere-se à variante scrapie). Esta

corresponderia a uma forma estruturalmente alterada de uma proteína

normal presente na membrana plasmática de diversos tipos celulares,

inclusive neurônios, denominada proteína prion celular (PrPc)( Prusiner,

1998). A proteína infecciosa, de conformação alterada, seria responsável

por desencadear a progressiva conversão conformacional das proteínas

celulares normais (PrPc) em proteínas na forma scrapie (PrPsc), sendo

estas últimas mais propensas a formar os agregados protéicos tidos como

responsáveis pela toxicidade neuronal. Em 1993, o grupo de Charles

Weissmann demonstrou inequivocamente a obrigatoriedade da

participação de PrPc na patogênese das TSE ao relatar que animais

depletados do gene para a proteína celular normal eram totalmente

incapazes de desenvolver a doença, e que a reintrodução do gene para PrPc

restaurava a suscetibilidade à infecção (Bueler e cols., 1993). A geração de

camundongos nocaute para PrPc levou, curiosamente, a uma constatação

adicional, a de que animais deficientes em PrPc não apresentavam

qualquer perturbação do desenvolvimento normal ou alteração morfológica

visível (Bueler e cols., 1992). Posteriormente foram relatadas algumas

flutuações sutis no comportamento dos animais, como por exemplo,

alterações no ritmo circadiano e perturbações no sono (Tobler e cols.,

1996). No entanto, a ausência de um fenótipo evidente associado à

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depleção do gene para PrPc tem dificultado o estabelecimento das funções

desta proteína em animais normais, o que, por sua vez, tem dificultado as

investigações na direção de uma possível perda de função associada à

patogênese (Martins e cols., 2002).

I.I.II. Doenças associadas a alterações da proteína prion

A primeira patologia associada à proteína prion já é conhecida desde

o inicio do século passado. Trata-se do scrapie, uma doença que acometia

cabras e ovelhas, causando-lhes uma perda de coordenação motora,

irritabilidade extrema e muita coceira, o que determinou o nome da

doença. O scrapie é incurável e após o aparecimento dos sintomas, o curso

da doença até a morte do animal é muito curto (Narang, 1996)

Na década de 1920, foram descritos os primeiros casos de TSE em

humanos. A patologia foi denominada doença de Creutzfeldt-Jakob

porque os primeiros casos foram identificados por Creutzfeldt em 1920 e

por Jacob em 1921. Os sintomas mais comuns são desordens visuais,

perda de memória e deficiência na coordenação motora. Esta doença pode

possuir aspecto esporádico, adquirido ou hereditário (Masters e cols.,

1981). A forma adquirida pode ocorrer através do transplante de córnea,

esterilização imprópria de material cirúrgico, transplante de dura-mater

dentre outras (Lang e cols., 1998). O padrão hereditário dessa doença é

encontrado em aproximadamente 15% dos casos, ocorrendo devido às

mutações no gene que codifica PrPc (Goldfarb e cols., 1994).

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Na encefalopatia chamada de kuru, como não foi identificada

nenhuma mutação relacionada a essa doença acredita-se que a origem da

epidemia possa estar relacionada com a ingestão de vísceras de algum

portador de CJD, durante a prática canibal (Gajdusek, 1977).

Na década de 80, surgiu uma epidemia que acometeu o gado bovino

na Grã-Bretanha, a encefalopatia espongiforme bovina ou “doença da vaca

louca”. Essa variedade de doença do prion, provavelmente foi originada

pela contaminação por scrapie da ração utilizada para alimentação do

gado, a qual era preparada a partir de vísceras de carneiros, bois, porcos e

galinhas. Dessa forma as partículas do prion eram ingeridas pelo gado

(Wilesmith e cols., 1991). Estudos confirmaram a transmissão da doença

por via oral quando demonstraram a infecção experimental de

camundongos e também do gado através da alimentação (Prusiner, 1991).

Existem ainda outras doenças ligadas à proteína Prion, que afetam

homens ou animais e com características bem semelhantes às já descritas.

As principais são: Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, Insônia

Familiar Fatal, Encefalopatia espongiforme felina, dentre outras.

Alguns estudos se dedicam à investigação de estratégias

terapêuticas para doenças relacionadas com alterações da proteína do

prion. Estudos in vitro mostram que diversas substâncias, possuem a

capacidade de inibir a deposição das fibrilas amilóides, incluindo Vermelho

Congo (Caughey e Race, 1992), anfoterecina B, antraciclinas (Tagliavini e

cols., 1997), poliaminas (Supattapone e cols., 2001), curcumina (Caughey

7

e cols., 2003) e RNA de interferência (Daude e cols., 2003). Nenhum destes

trabalhos efetivamente comprovou a eficácia de tais substâncias in vivo.

Mais recentemente, foram produzidos anticorpos contra a proteína scrapie

a partir da inoculação da proteína alterada em camundongos nocaute para

PrPc e camundongos controle, com o objetivo de criar meios de evitar a

associação entre as moléculas protéicas, impedindo a formação das fibrilas

amilóides. Até o momento, não se tem dados sobre a eficácia da utilização

desses anticorpos no tratamento das TSEs (Spinner e cols., 2007).

I.I.III. Alterações conformacionais da proteína prion celular

A proteína do prion celular (PrPc) é normalmente encontrada na

membrana de células de mamíferos e expressa em todos os tecidos, mas se

apresenta de forma abundante no sistema nervoso central (Oesch e cols.,

1985).

Essa proteína é codificada por um gene contido no cromossomo 20,

em humanos (Oesch e cols., 1985). Este gene, denominado prnp em

camundongos e ratos, possui três exons. Em humanos e hamsters existem

apenas dois exons. No entanto, o quadro aberto de leitura se encontra em

um único exon (Collins e cols., 2004). Uma vez codificada, a proteína

murina apresenta 254 aminoácidos com um peptídeo sinalizador na

extremidade amino terminal contendo 22 aminoácidos que é clivado no

retículo endoplasmático durante a sua biossíntese. Uma ancora de GPI

(glicosil-fosfatidil-inositol) é anexada à região C-terminal, que fixa a

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proteína à porção externa da membrana celular. Além disso, dois sítios de

N-glicosilação estão presentes nos resíduos de asparagina 181 e 197 (em

humanos) e há formação de uma ponte dissulfeto intermolecular entre os

resíduos de cisteína 179 e 214. Após o processamento das porções N- e C-

terminal, a PrPc é gerada na sua seqüência final apresentando 209

aminoácidos ( Prusiner, 1998) (Figura 1).

Figura 1: O diagrama de barras mostra a região da cadeia polipeptídica que se liga glicosil-fosfatidilinositol (GPI). Após o processamento dos grupamentos NH2 e COOH terminais, ambas PrPC e PrPSc passam a apresentar 209 resíduos de aminoácidos. Adaptado de Prusiner, 1998.

PrPc e PrPsc possuem a mesma seqüência de aminoácidos e diferem

apenas em suas propriedades físico-químicas (Turk e cols., 1988).

Enquanto PrPc é solúvel e susceptível à ação de proteases, sua forma

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anormal, PrPsc apresenta-se muito insolúvel e relativamente resistente à

proteólise (Meyer e cols., 1986). Estas propriedades da PrPsc favorecem a

formação de agregados insolúveis que se depositam lenta e

progressivamente em várias regiões do sistema nervoso, causando a morte

celular. Estudos de espectroscopia de dicroísmo circular revelaram as

estruturas secundárias dessas duas isoformas. Verificou-se que PrPc tem

um perfil característico de proteínas em α-hélice, contendo 40% de regiões

com estrutura do tipo α-hélice e cerca de 3% de regiões com estrutura do

tipo folha-β, ao passo que PrPsc possui muito mais regiões com estruturas

β- pregueadas (Pan e cols., 1993) (Figura 2).

O mecanismo de conversão de PrPc em PrPsc envolve mudanças

conformacionais na estrutura. A proteína PrPc que apresenta

predominantemente regiões com estrutura do tipo alfa-hélice, passa a

apresentar outra conformação com estrutura predominantemente do tipo

folhas beta (Prusiner, 1998). Atualmente existem duas hipóteses para

explicar o mecanismo envolvido na mudança conformacional, a hipótese

do modelo de molde assistido e a do modelo de polimerização por

nucleação.

10

Figura 2. Desenho esquemático mostrando as diferenças nas estruturas terciárias de PrPc e PrPsc. A, PrPc possui três regiões em α-hélices (verde) em sua estrutura: α-hélice A (resíduos 144-157), α-hélice B (resíduos 172-193) e α-hélice C (resíduos 200-227), e duas regiões em folha β-pregueada (azul) em sua estrutura nos resíduos 129-134 e 159-165. B, PrPsc mostra-se rica em folha β-pregueada (azul) e pobre em α-hélice (verde). Retirado de Pan e cols.,1993.

A hipótese de modificação através de molde assistido propõe que a

conversão de PrPc em PrPsc dependa da participação de uma outra

proteína, denominada de proteína X. Esta auxiliaria na formação de um

estado intermediário entre PrPc e PrPsc funcionando como um catalisador.

A conversão espontânea seria impedida por uma alta barreira energética

ocorrendo apenas em presença do catalisador (Aguzzi e Polymenidou,

2004).

A hipótese de polimerização por nucleação, postula que PrPc e

PrPsc possam existir em equilíbrio termodinâmico e que monômeros de

PrPsc por apresentarem a capacidade de polimerizar, formaria um

pequeno núcleo. Este núcleo inicial recrutaria outras moléculas de PrPc

11

que seriam convertidas na forma anormal (Come e cols., 1993). A formação

do núcleo inicial é um processo muito lento, o que explicaria o fato da

demora no aparecimento dos sintomas associados à patologia, mas após o

surgimento a progressão seria acelerada com o recrutamento de mais PrPc

para o agregado em um processo cooperativo (Jarrett e Lansbury, 1993). A

limitação dessa hipótese é que se é possível a existência do equilíbrio entre

as formas PrPc e PrPsc, então a transformação da forma scrapie em

normal deveria ser observado em alguma condição experimental. Além

disso, as duas hipóteses são compatíveis entre si.

Alguns estudos tentam propor a dependência do meio no processo

de conversão de formas estruturais. Diferentes compartimentos celulares

com propriedades físico-químicas distintas poderiam modular o processo

de alteração conformacional. Por exemplo, nos “rafts” da membrana

plasmática, regiões ricas em esfingolipídios e colesterol e onde

normalmente se encontram as moléculas de PrPc (Walmsley e cols., 2003),

talvez haja uma distribuição espacial de cargas e moléculas capazes de

evitar a alteração conformacional indutiva do processo de agregação. Por

outro lado, os lisossomos, organelas que apresentam pH acidificado em

relação ao citoplasma celular, poderiam induzir alterações

conformacionais que facilitariam a agregação protéica durante o processo

de reciclagem de PrPc (Prusiner, 1996).

12

I.I.IV. Camundongos deficientes de prnp

Na tentativa de gerar modelos para o estudo não só da patogênese e

transmissão das doenças priônicas, mas também para estabelecer a

importância biológica de PrPc, foram criados camundongos depletados do

gene prnp.

O grupo de Charles Weissmann, gerou a primeira linhagem de

camundongos nocaute para PrPc, uma vez que estes pesquisadores

conseguiram remover seletivamente o gene prnp que codifica essa proteína

(Büeler e cols., 1992). O grupo verificou que camundongos transgênicos,

(PrPc-), são resistentes à infecção por prions e não replicam o agente

infeccioso (Büeler e cols., 1993). Esses resultados levaram à conclusão de

que é necessário que o organismo expresse a proteína do prion nativa para

poder ser infectado e replicar esse agente infeccioso (Büeler e cols., 1993;

Sailer e cols., 1994). A reintrodução de genes de PrPc de diferentes

espécies nestes camundongos restaura sua susceptibilidade em uma

forma espécie específica (Weissmann e cols., 1996; Flechsig e cols., 2000).

Portanto, pode-se afirmar que é absolutamente necessária a expressão da

PrPc para a patogênese da doença (Brandner e cols., 1996a).

A maioria das linhagens nocaute para a proteína PrPc não

apresenta nenhuma anormalidade severa (Büeler e cols., 1992),

entretanto algumas apresentaram problemas como alterações no ritmo

circadiano, defeito na função hipocampal (Collinge e cols., 1994; Tobler e

cols., 1996), dificuldade de aprendizado espacial (Criado e cols., 2005),

13

diminuição dos níveis de cobre cerebral (Brown e cols., 1997), dano

oxidativo tecidual (Shyu e cols., 2005) alterações na resposta inflamatória

(de Almeida e cols., 2005), implicações na diferenciação de células tronco

hematopoiéticas e neurais (Zhang e cols., 2006) (revisado em Caughey e

Baron, 2006). Outros estudos demonstraram que esses animais são mais

sensíveis a drogas convulsivantes (Walz e cols., 2002) e possuem atividade

locomotora alterada (Roesler e cols., 1999). A consolidação das memórias

de curta e longa duração foi descrita nesses camundongos nocautes e

verificou-se que esse processo apresenta-se prejudicado em animais PrPc-

idosos, quando comparados com animais selvagens da mesma idade

(Coitinho e cols., 2003).

I.I.V. Ligantes de PrPc

Foram descritas inúmeras moléculas como sendo ligante ou

receptores de PrPc. Em 1997, Brown e cols., identificaram a capacidade de

ligação da PrPc ao íons Cu++. Mais recentemente foi mostrado que a

capacidade de ligação do cobre radioativamente marcado na membrana

celular era diretamente dependente da concentração de PrPc (Brown e

cols., 1997; Rachidi e cols., 2003). O cobre é um elemento importante para

várias enzimas envolvidas com a proteção contra estresse oxidativo e foi

demonstrado que PrPc possui uma atividade semelhante à da enzima

superóxido dismutase (Brown e Besinger, 1998). Além do cobre, outros

ligantes foram identificados para a PrPc, tais como Aplp1, Nrf2 (Yehiely e

14

cols., 1997), glicosaminoglicanas (Gonzales-Iglesias e cols., 2002; Warner e

cols., 2002), distroglicanas (Keshet e cols., 2000), entre outros.

Outro ligante de PrPc já bem caracterizado, é a laminina, que é o

principal componente não colagenoso da matriz extracelular (Graner e

cols., 2000a e b). A laminina participa do controle de várias funções

biológicas como embriogênese, formação de tecidos, fenômenos

imunológicos entre outros. A laminina também pode estimular a

neuritogênese através da ligação a PrPc (Graner e cols., 2000 a e b ). O

nosso grupo mostrou que astrócitos são capazes de secretar laminina e

que a presença de laminina sobre camadas astrocitárias, diferentemente

estruturadas poderia estimular o crescimento neurítico de forma

diferencial. Como alguns trabalhos mostram que a indução do crescimento

neurítico e a formação de vasos podem ser controlados pelos mesmos

fatores quimiotaticos atrativos e repelentes, sugerindo similaridade entre

os processos (Eichmann e cols., 2005), torna-se interessante avaliar se a

ausência da expressão da PrPc pode influir no processo de vascularização

retiniana.

15

I.II. Retina

I.II.I. Aspectos morfológicos da retina

O olho é um órgão complexo de recepção do sinal luminoso que

atingiu alto grau de especialização, permitindo uma análise minuciosa da

forma dos objetos, sua cor e intensidade de luz refletida. Esse órgão é

formado por várias estruturas adaptadas à função de captação e

interpretação do sinal luminoso. É constituído por três túnicas ou

camadas dispostas concentricamente: 1. A camada externa, formada pela

esclera e pela córnea; 2. A camada média ou túnica vascular, constituída

pela coróide, corpo ciliar e pela íris; e 3. A camada interna ou retina, que

se comunica com o cérebro através do nervo óptico. Além das túnicas

existem outras estruturas presentes no olho. O cristalino ou lente é uma

estrutura transparente, sem vasos e nervos e constituído por organizações

celulares que formam lamelas concêntricas. Situada à frente do cristalino

encontra-se uma expansão fortemente pigmentada denominada íris. Essa

estrutura separa dois compartimentos, a câmara anterior e a câmara

posterior. Atrás do cristalino e circundado pela retina encontra-se o espaço

vítreo, cheio de uma substância viscosa e gelatinosa, denominada corpo

vítreo (Figura 3) (Junqueira e Carneiro, 2004). A retina, constituída por

células neurais e gliais, é a estrutura envolvida na transformação do sinal

luminoso em sinal neural, muito embora todas as outras estruturas que

compõem o olho sejam necessárias para dar-lhe sustentação e forma,

permitindo o seu desempenho como sistema óptico (Heegand, 1997).

16

Figura 3. Estrutura interna do olho humano. Retirado de Junqueira e Carneiro, 2004.

Classicamente, sob a luz da microscopia óptica, a retina é

composta por várias camadas: 1) A membrana limitante interna,

essencialmente uma membrana basal; 2) A camada de células

17

ganglionares; 3) A camada plexiforme interna; 4) A camada nuclear

interna; 5) A camada plexiforme externa; 6) A camada dos fotorreceptores,

que compreende a região nuclear externa, o segmento interno e o

segmento externo; e 6) O epitélio pigmentado da retina (Heegand, 1997).

A camada dos fotorreceptores é composta de células chamadas

cones e bastonetes. Essas células estão próximas à superfície externa da

retina e para que a luz possa atingi-las, é necessário atravessar a cavidade

vítrea e a retina interna. Após a fotorrecepção, o sinal é conduzido para as

células bipolares, que compõem a camada nuclear interna. Essas células

transmitem os sinais luminosos para a camada de células ganglionares,

cujos axônios se agrupam na superfície interna da retina formando o nervo

óptico. A camada mais externa da retina compreende o epitélio

pigmentado, o qual está em íntimo contato com os segmentos externos dos

fotorreceptores (Figura 4). O suporte metabólico para o funcionamento da

retina interna vem da rede vascular, que repousa sobre a camada

ganglionar, penetra na retina e se estabelece novamente na altura da

camada plexiforme externa. Na realidade a retina pode ser considerada um

tecido relativamente pouco vascularização, dependente da vascularização

dos tecidos adjacentes. O suporte para a retina externa é dado por difusão

através dos vasos da coróide que estão adjacentes ao epitélio pigmentar da

retina. (Schroder e cols., 1990).

A retina também possui colunas de sustentação, compostas pelas

células gliais, ou fibras de Müller, que auxiliam o metabolismo dos

18

neurônios. Juntos, os vasos da retina e o epitélio pigmentar formam a

barreira hemato-retiniana (BHR), uma barreira, que limita o trânsito de

moléculas, propiciando mecanismo para um efetivo controle do fluxo de

fluidos e metabólitos e fazendo da retina neural um tecido

imunologicamente privilegiado (Heegand, 1997).

Figura 4. Desenho esquemático das camadas da retina. Retirado de Junqueira e Carneiro, 2004.

19

I.II.II. Vascularização da retina

Durante o desenvolvimento embrionário, o sistema circulatório

vascular é o primeiro a se formar, o que vai permitir o fornecimento de

suporte metabólico para a diferenciação celular e desenvolvimento dos

demais tecidos. Os vasos sangüíneos se organizam espacialmente por

todos os tecidos permitindo o fornecimento de nutrientes e as trocas

metabólicas (Risau, 1997).

A formação de vasos sangüíneos pode ocorrer por dois mecanismos

fundamentais: vasculogênese e angiogênese. A vasculogênese é um

processo de formação de vasos a partir de precursores de células

endoteliais, os angioblastos. Estes migram em direção ao local de formação

de novos vasos se diferenciando em células endoteliais. Os primeiros

vasos, como a aorta dorsal e veia cardinal, são formados por esse

mecanismo (Flamme, 1992). Fatores de indução mesodérmica, como os da

família de fatores de crescimento de fibroblastos, são importantes na

indução da diferenciação do mesoderma em hemangioblastos, precursores

não somente de angioblastos, como também de células hematopoiéticas

(Risau, 1995). A angiogênese é o desenvolvimento de novos vasos

sangüíneos a partir de vasos pré-existentes e que tem participação em

diversos processos fisiológicos, como a preparação do endométrio durante

o ciclo menstrual ou a cicatrização de feridas e processos patológicos,

incluindo o crescimento tumoral. Um sistema vascular se forma de

maneira adequada quando há um equilíbrio entre fatores que favorecem a

20

angiogênese e fatores que a inibem, resultando em estabilização vascular

(Bussolino e cols., 1997). A angiogênese excessiva pode causar patologias

como câncer, artrite e cegueira. Por outro lado, o crescimento vascular

insuficiente ou regressão vascular anormal, podem gerar isquemia

cardíaca e cerebral, neurodegenaração, osteoporose e outras doenças

(Carmeliet, 2003).

Durante o desenvolvimento fetal do olho, tanto em humanos

quanto em camundongos, foi observada uma intensa formação de vasos

sangüíneos que partem do pólo posterior para o pólo anterior do olho (Ash

e cols., 2005). A vascularização fetal consiste no processo de formação do

sistema hialóide, o qual atravessa o vítreo em direção à parte posterior do

cristalino. Posteriormente o sistema hialóide regride e é substituído por

vascularização própria da retina (Ash e cols., 2005). Em humanos a

regressão do sistema hialóide é concluída por volta do quarto mês de

gestação enquanto que em camundongos esse processo se completa na

época do nascimento. Com a regressão dos vasos do hialóide, um novo

plexo vascular surge a partir do nervo óptico, dando início à vascularização

da retina propriamente dita. Esta será composta por veias e artérias, que

em seguida se ramificam sobre a superfície interna formando uma espécie

de rede (Figura 5) (Fruttiger, 2007). Em camundongos, já no dia do

nascimento, observa-se o início da formação do plexo vascular primário no

centro da superfície interna da retina. Este cresce e se ramifica até a

periferia do tecido retiniano por volta do sétimo dia após o nascimento. A

21

partir desse momento, os vasos do plexo primário invadem a camada

interna da retina, se ramificando e formando um segundo plexo vascular

paralelo ao primeiro (Connolly e cols., 1988; Stone e cols., 1995).

Figura 5. Desenvolvimento do sistema vascular retiniano em camundongos. Em (A) a vasculatura hialóide (hv) é suprida pela artéria hialóide (ha) e drenada pela rede venosa coroidal (ch). A rede venosa coroidal não se encontra representada em (B) e (C). Em (B) a regressão da vasculatura hialóide concomitante ao desenvolvimento do plexo primário (pp) no interior da retina. Em (C) o plexo secundário (dp), mais profundo se forma a partir de vasos do plexo primário. Retirado de Fruttiger, 2007.

Estudos mostram que tanto a angiogênese quanto a vasculogênese

são processos importantes na vascularização da retina. Alguns trabalhos

sugerem que a formação do plexo vascular primário da retina ocorra pelo

processo de vasculogênese e que a formação do plexo secundário ocorra

por angiogênese (Ashton, 1970 e Hughes e cols., 2000). Essa teoria baseia-

22

se em dados que sugerem a presença de angioblastos, precursores de

células endoteliais, ocupando a superfície da retina durante a formação do

plexo vascular primário. Nesses trabalhos, entretanto, os métodos

utilizados para a marcação de angioblastos, não caracterizam

definitivamente essa população celular, uma vez que a coloração de Nissl,

isolectina de Grinfonia simplicifolia ou identificação de ATPases, não são

universalmente aceitos como marcadores específicos de angioblastos

(McLeod e cols., 1987 e Flower e cols., 1985). Posteriormente, considerou-

se a proteína receptora do tipo 2 para fator de crescimento de endotélio

vascular (VEGFR2) como marcador específico de precursores de células

endoteliais retinianas (Yamashita, 2000 e Yamaguchi, 1993). Entretanto,

em montagem plana de retina de camundongo, a marcação para VEGFR2

foi feita em combinação com colágeno IV, e foi observado que células

positivas para VEGFR2 encontravam-se circundadas pelo colágeno,

evidenciando a presença de células endoteliais maduras, capazes de

secretar a própria membrana basal. Desta forma, não foi possível a

confirmação da presença de angioblastos e a caracterização do processo de

vasculogênese na formação do plexo vascular primário (Fruttger, 2002).

Apesar de até o momento não terem sido encontrados precursores de

células endoteliais na retina de camundongos, alguns trabalhos

desenvolvidos com retinas de embriões humanos sugerem a presença de

angioblastos durante o desenvolvimento retiniano através de marcação

para ADPase/CD39 e CXCR4 (Chan-Ling, 2004 e McLeod, 2006). Contudo,

23

ainda não é possível afirmar que precursores de células endoteliais não

estejam efetivamente envolvidos na formação da vasculatura retiniana,

pois embora dados mostrem a ausência dos mesmos no tecido, é possível

que tais precursores endoteliais possam se agrupar dentro da crescente

rede de vasos sanguíneos propiciando o processo de vasculogênese

(Fruttiger, 2007).

A maior parte das evidências aponta para a hipótese de que o plexo

vascular primário seja formado a partir do processo de angiogênese por

brotamento. Nesse caso, os novos vasos seriam formados a partir de

células endoteliais de vasos já existentes (Risau, 1997). A primeira fase da

angiogênese por brotamento é caracterizada por uma vaso permeabilidade

aumentada decorrente da redução da adesão entre células; pelo início da

invasão, com produção de enzimas proteolíticas que degradam a matriz

extracelular e pela entrada de células no ciclo celular. Esta fase é seguida

pela etapa de diferenciação das células endoteliais em tubos contendo

lúmen. Finalmente chega-se à terceira fase quando ocorre estabilização e a

maturação dos vasos, promovidas por moléculas mediadoras que recrutam

células mesenquimais para as paredes dos capilares (Bussolino e cols.,

1997). O processo é dependente da matriz extracelular no ambiente das

células e a formação de tubos capilares é modulada por componentes da

membrana basal, que as próprias células endoteliais podem secretar

(Risau, 1997).

24

A hipótese de que o plexo primário da retina de camundongos se

forme por angiogênese por brotamento é alicerçada pelas seguintes

evidências. Primeiramente, pela identificação de subtipos de células

endoteliais presentes durante o processo de angiogênese por brotamento

(Gerhardt, 2003). Em segundo lugar, pela existência de perfis de expressão

gênica variados entre os diferentes tipos de células endoteliais ao longo

rede vascular durante o processo de brotamento (Claxton, 2004 e Saint-

Geniez, 2002). Em terceiro lugar, dados sugerem que a via de sinalização

Notch desempenhe um papel relevante na estabilização e manutenção do

fenótipo diferenciado das células endoteliais de regiões do broto. Essas

evidências indicam que as células endoteliais não formam uma população

uniforme e que existem diferenças entre os subtipos celulares dependendo

da sua posição e função na rede vascular (Lu e cols., 2004).

I.II.III. Doenças relacionadas à vascularização retiniana anormal

O crescimento de novos vasos sangüíneos, também chamado de

neovascularização, na retina de indivíduos adultos é uma grande

complicação em doenças como retinopatia diabética. Quase 100% dos

indivíduos com diabetes tipo1 desenvolvem alguma forma de retinopatia

após 15 anos de doença, sendo que, destes, aproximadamente 60% irá

desenvolver a forma mais grave que é a proliferativa. Este estado é

caracterizado pela formação de novos vasos na retina que crescem em

direção à interface vítrea, podendo evoluir para a perda irreversível da

25

acuidade visual, principalmente pelo descolamento tracional da retina

(Fong e cols., 2004). A não proliferativa é caracterizada por alterações

vasculares intra-retinianas associadas a anormalidades microvasculares

como a dissociação de células murais, ou pericitos, dos capilares

retinianos, levando a fragilidade desses vasos e consequentemente a

edemas e hemorragias (Frank, 2004).

A retinopatia da prematuridade também é uma doença

vasoproliferativa que acomete a retina de recém nascidos prematuros. Por

ocasião do nascimento, a vasculogênese da retina está incompleta

favorecendo a formação de tecido neovascular. Na grande maioria dos

casos, este tecido sofre involução espontânea, porém em alguns casos,

evolui para uma proliferação fibrovascular em direção ao vítreo, formando

membranas e trações retinianas. O descolamento da retina pode ser

decorrente dessas trações, acarretando nesses olhos um baixo poder de

resolução visual (Hughes e cols., 2000). Crianças prematuras, muitas

vezes, necessitam ser submetidas a terapias com altos níveis de oxigênio.

Esta terapia cria uma alta tensão de oxigênio na coróide, que se difunde

para a retina e suprime o desenvolvimento normal dos capilares (Penn e

cols., 1995). Em modelos de retinopatias da prematuridade em cobaias,

altos níveis de oxigênio causam regressão dos capilares da retina por

apoptose, a qual é precedida pela diminuição de VEGF. Uma vez o animal

retirado de um ambiente de hiperóxia para o ar atmosférico, a isquemia

subseqüente, promovida pelo fechamento dos capilares em hiperóxia,

26

induz a expressão exagerada VEGF, que induz a angiogênese anormal

(Alan e cols.,1995).

Tanto em humanos quanto em camundongos, a regressão do

sistema vascular hialóide, pode não ocorrer de forma completa.

Vasculatura fetal persistente é um termo utilizado para descrever a

situação onde um ou mais componentes da vasculatura intraocular fetal

não regride totalmente. Essa condição patológica pode causar

complicações incluindo deslocamento de retina, catarata e hemorragias

intra-oculares (Goldberg , 1997).

O entendimento dos princípios biológicos que governam o

crescimento dos vasos sangüíneos na retina poderá resultar em

importantes aplicações clínicas.

I.II.IV. Aspectos moleculares e celulares envolvidos na modulação da

angiogênese por brotamento

O fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF) é considerado

o mais importante fator proangiogênico, sendo capaz de regular

angiogênese fisiológica e patológica. O VEGF ou fator de permeabilidade

vascular é produzido em quatro principais isoformas de 121, 165, 189 e

206 aminoácidos (Ferrara e Davis-Smyth, 1997). Tanto VEGF 165 quanto

VEGF 189 e 206 são básicos, com uma alta afinidade por heparina, e

permanecem seqüestrados na matriz extracelular. VEGF 121 é ácido e não

se liga com heparina. As moléculas de VEGF que ficam ligadas com a

27

matriz extracelular podem ser liberados pela ação de proteinases que

desencadeiam a quebra da matriz (Carmeliet e cols., 1999). Existem dois

principais receptores para VEGF, em que se ligam com alta afinidade, que

são VEGFR1 e VEGFR2. Estas são encontrados predominantemente na

superfície de células endoteliais. A expressão de VEGF é sensível à tensão

de oxigênio e é rapidamente regulada por hipóxia, que por sua vez,

também leva à expressão dos genes para VEGFR1 e VEGFR2 nas células

endoteliais (Shweiki e cols., 1992).

Podemos destacar como principais funções de VEGF: potente

mitogênico principalmente para células endoteliais, mediador da secreção

e ativação de enzimas envolvidas na degradação da matriz extracelular

(Pepper e cols., 1991), modulador de sobrevivência para as células

endoteliais através da inibição de apoptose (Alan e cols., 1995) além de

apresentar um papel importante na modulação da migração das células

endoteliais nos sítios de angiogênese (Rousseau e cols., 2000).

O desenvolvimento vascular da retina é precedido pela migração de

astrócitos, formando uma rede que tem início a partir do nervo óptico e se

espalha, por meio da proliferação dessas células, através da superfície

interna retiniana. A rede de astrócitos fornece um molde para o

surgimento dos vasos sangüíneos (Fruttiger, 1996 e Ling, 1988) que vai

envolver a produção de VEGF (Stone e cols., 1995). Estudos sugerem que

exista uma relação estreita entre a rede de astrócitos e vasos da retina. Em

cavalos, os astrócitos estão presentes somente em uma pequena região em

28

volta do nervo óptico, exatamente na região que é vascularizada (Schnitzer,

1987). Na retina de coelhos, vasos e astrócitos estão também intimamente

associados na mesma região (Stone, 1987). Em primatas e camundongos,

astrócitos e vasos sangüíneos cobrem a superfície interna da retina, com

exceção da fóvea, onde nem astrócitos nem vasos sangüíneos são

observados (Schnitzer, 1987).

Durante a vascularização da retina, tipos celulares endoteliais formam

prolongamentos chamados filopódios direcionando o crescimento vascular.

A formação desses prolongamentos depende da sinalização via VEGFR2

estimulada pelo gradiente de concentração de VEGF que é regulada devido

a tensão de oxigênio (Gerhardt, 2005). Normalmente no centro da retina,

onde se observam os primeiros sinais de vascularização, os níveis de VEGF

são baixos devido ao bom suprimento de oxigênio. Por outro lado, observa-

se que na periferia da retina, onde ainda não existem vasos, os níveis de

VEGF são elevados já que ainda não existe um suprimento adequado de

oxigênio (Fruttiger, 2007). Apesar desse gradiente de concentração de

VEGF não ter sido ainda bem demonstrado, existem evidencias que

fortalecem essa hipótese. Por exemplo, distúrbios na distribuição de VEGF

afetam diretamente a velocidade da expansão do plexo vascular através da

retina (Gerhardt, 2003). Isso foi demonstrado com a utilização de

camundongos mutantes com alterações na afinidade a VEGF pela matriz

extracelular.

29

As células endoteliais secretam PDGF-B que possibilita o

recrutamento de células murais também chamadas de pericitos, que se

posicionam ao redor das células endoteliais (Fruttiger, 2002). Os pericitos

são células contrateis que regulam o calibre vascular e o fluxo da

microcirculação retiniana. Normalmente existe uma célula endotelial para

cada pericito no leito capilar da retina humana (Cogan, 1984). Os pericitos

são envoltos por uma lamina basal própria, a qual por sua vez pode

fundir-se com a membrana basal das células endoteliais (Clever e Melton,

2003). A membrana basal é composta por diversas moléculas, destacando-

se dentre elas o colágeno IV e a laminina. O colágeno IV é uma proteína de

alto peso molecular, formado por duas cadeias polipeptídicas, alfa 1 e alfa

2, unidas numa molécula tri-helicoidal que se dispõe em forma de rede. É

uma proteína fibrosa que forma a parte principal da membrana basal

sobre a qual os outros componentes são organizados (Timpl, 1989). A

laminina é uma glicoproteina, também de alto peso molecular, formada por

três cadeias longas de polipeptídeos organizadas em forma de cruz

assimétrica e mantidas unidas através de pontes dissulfeto. Ela atua como

mediador da adesão de grande número de diferentes células ao substrato,

liga-se ao colágeno IV, ao sulfato de heparan, à entactina e a outros

receptores protéicos localizados nas superfícies das células. A laminina

regula uma variedade de fenômenos incluindo adesão, crescimento e

migração celular (Miner e Yurchenco, 2004).

30

A proteína laminina, sabidamente um ligante de PrPc (Graner e cols.,

2000a), se auto-polimeriza de modos distintos na matriz extracelular,

podendo a exposição de domínios específicos da proteína em cada tipo de

polímero formado modular diferentemente a sinalização para o tecido

adjacente (Freire e Coelho-Sampaio, 2000; Freire e cols., 2002; Freire e

cols., 2004). Nesse trabalho investigamos se a ausência de um dos

receptores celulares para laminina nos camundongos nocaute para PrPc

altera o padrão da organização extracelular da proteína e se essa alteração

pode influenciar na vascularização da retina.

Tendo em vista o grande interesse científico e, eventualmente clínico,

em se estabelecer por completo quais seriam as funções normais da PrPc,

esse estudo é de fundamental importância, pois avalia possíveis alterações

morfológicas nos animais nocaute. É interessante chamar a atenção para o

fato de que tal observação poderá orientar a busca por deficiências da

função visual nos animais deficientes em PrPc, que poderiam mesmo

incluir a própria perda da visão. Existe hoje na literatura um caso

correlato observado em camundongos nocaute para colágeno XVIII (Fukai,

2002). Estes animais foram originalmente descritos como desprovidos de

qualquer fenótipo visível. No entanto, investigações mais criteriosas

levaram à descrição de que os camundongos depletados do gene para o

colágeno XVIII eram, na verdade, portadores de extensas deficiências

visuais, suficientes para comprometer totalmente a função visual (Fukai,

2002).

31

II. OBJETIVOS

32

II. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho é investigar um possível papel para a

proteína PrPc no desenvolvimento do processo de vascularização da retina.

Realizaremos estudos comparativos da morfologia e integridade funcional

dos vasos em camundongos selvagens e depletados do gene para PrPc em

diferentes fases do desenvolvimento e buscaremos avaliar a função visual

dos animais adultos. Mais especificamente, nossos objetivos serão:

OBJETIVO 1: Estudar o padrão de organização de laminina na membrana

limitante interna da retina de camundongos, para estabelecer se existe

diferença entre os camundongos controle e nocaute no padrão de

deposição da laminina na superfície interna da retina, local no qual a rede

vascular se forma. Para a realização desses ensaios serão utilizadas

preparações do tipo montagens planas, nas quais se tem acesso direto à

superfície da retina.

OBJETIVO 2: Estudar o padrão de organização de laminina nos plexos

vasculares da retina em diferentes etapas do desenvolvimento para

estabelecer se existem diferenças temporais e morfológicas na formação da

rede vascular. Para a realização desses ensaios serão utilizadas

preparações do tipo montagens planas, nas quais se tem acesso direto ao

local de crescimento e expansão da rede vascular ou, alternativamente, em

33

cortes do tecido para se ter acesso à distribuição interna dos capilares e

avaliar a integridade das camadas da retina.

OBJETIVO 3: Investigar a função visual através de avaliação da

capacidade de localização de queijo, ração e objeto inodoro (bola), em

caixas de Skinner. Para avaliar a capacidade de localização, investigamos o

tempo gasto para alcançar os diferentes objetos testados. Adicionalmente,

avaliamos a influência da iluminação ambiente no tempo gasto para a

localização.

34

III. MATERIAIS MÉTODOS

35

III. MATERIAIS E MÉTODOS III. I. MATERIAIS

Os camundongos utilizados neste estudo foram obtidos através do

cruzamento das linhagens Black C 57 e 129 SV selvagens e nocauteados

para o gene da proteína prion celular. Os camundongos nocaute foram

gentilmente cedidos pelo grupo da professora Vilma Martins do Instituto

Ludwig de Pesquisa contra o Câncer-SP, a partir de uma doação original

do grupo do professor Weissman (Department of Genetics and Howard

Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven)

responsável pelo desenvolvimento da linhagem de camundongos nocaute

PrPc-. Controle e nocaute de ambos os sexos foram usados nos

experimentos. Estes animais permaneceram no biotério da Escola de

Veterinária da Universidade Federal da Bahia (UFBA), em ambiente com

temperatura e umidade controladas e com livre acesso a água e comida.

Foram utilizados um total de 440 animais respeitando as normas e

recomendações nacionais e internacionais.

Os anticorpos primários utilizados foram: anti-laminina desenvolvida

em coelho e adquirida da Sigma Chemical Co. com diluição 1:100 em

salina tamponada por fosfato (PBS); anti-colágeno IV desenvolvido em

camundongo, adquirido da Sigma Chemical Co. com diluição 1:50 em

PBS; anti-PECAM1 (molécula de adesão plaquetária em célula endotelial)

desenvolvido em coelho, adquirido da Sigma Chemical Co. com diluição

36

1:100 em PBS; anti α-actina de músculo liso desenvolvida em

camundongo, adquirida da Sigma Chemical Co. diluído 1:100 em PBS. Os

anticorpos secundários Alexa anti-camundongo diluído 1:500 em PBS e

Cy3 anti coelho 1:100 diluído em PBS foram obtidos respectivamente da

Molecular Probes/Invitrogen e Sigma Chemical Co.

As caixa de Skinner utilizadas foram do modelo 2-EP 100 com luz

de 40W e capacidade de variação da intensidade luminosa.

III. II. MÉTODOS

III.II.I. Preparação de montagens planas da retina

Camundongos de diferentes idades: neonatos (P0), com 1 dia pós-

natal (P1), 2 dias (P2), 5 dias (P5), 10 dias (P10) ou 15 dias (P15), foram

sacrificados (por inalação de CO2) para remoção dos globos oculares. Após

a enucleação, os olhos foram imediatamente fixados em 4% de

paraformaldeído (Reagen – Quimibrás Indústrias Químicas S.A.) diluído

em PBS durante 1 hora e dissecados em lupa para retirada da esclera,

lentes e vítreo. As retinas foram então aplainadas realizando-se 4 cortes

radiais a partir das bordas, colocadas em lâminas gelatinizadas e cobertas

com uma lamínula de vidro. Em cima de cada lamínula foi colocado um

peso para facilitar a adesão da retina à lâmina. Este material permaneceu

embebido em paraformaldeído 4% por 24 horas e posteriormente as

lamínulas foram retiradas e as retinas ficaram aderidas às respectivas

37

lâminas. Estas lâminas foram utilizadas para imunohistoquímica,

conforme descrito na próxima seção.

III.II.II. Imunofluorescência

Nos ensaios onde a visualização foi feita por imunofluorescência, as

amostras foram processadas como descrito a seguir. Após aplainadas, as

montagens planas de retina foram submetidas a três lavagens de 5

minutos cada com tampão PBS (Nuclear – Casa da Química Ind. e com.

Ltda) e bloqueadas por 30 minutos com soro albumina bovina 5% (BSA)

(Nuclear – Casa da Química Ind. e com. Ltda) em PBS, em temperatura

ambiente. Em seguida o material foi incubado com os anticorpos primários

em teste por 12 horas a temperatura de 4ºC. Depois deste período mais

três lavagens de 5 minutos com tampão PBS foram feitas e em seguida

incubou-se com o anticorpo secundário por mais duas horas à

temperatura ambiente. As montagens planas de retina marcadas com anti

PECAM 1 e anti-α actina de músculo liso foram permeabilizadas por 10

minutos em tampão PBS/triton X-100 0,2% (Nuclear – Casa da Química

Ind. e com. Ltda) antes da realização do bloqueio com BSA. Algumas

montagens planas de retina foram tratadas com DAPI (4’,6-Diamidino-2-

phenylindole dihydrochloride) (Sigma Chemical Co) por 15 minutos para

visualização dos núcleos celulares. As lâminas foram montadas para

microscopia sobre n-propilgalato (Sigma Chemical Co) e examinadas em

microscópio de epifluorescência Nikon TE 300.

38

III.II.III. Análise Histológica

Para os cortes histológicos foram retirados os globos oculares após o

sacrifício (conforme descrito anteriormente) de camundongos adultos com

60 dias de nascidos. Os globos oculares íntegros após serem removidos,

foram colocados em paraformaldeido 4% por 24 horas. Em seguida o

material foi submetido a banhos em concentrações crescentes de álcool

etílico (70%, 80%, 90% e 100%), imerso em xilol e impregnado com

parafina fundida (Nuclear – Casa da Química Ind. e com. Ltda). Os blocos

foram colocados em temperatura ambiente para a solidificação da parafina

e posteriormente levados ao micrótomo (Hexasystens MRPO 3) e cortados

em cortes de 5 µm de espessura. Entre um corte e outro houve um espaço

de 300 µm. A parafina foi então removida com um banho de xilol e os

cortes de tecido foram imersos em banhos de proporção crescente de

água/álcool etílico para a re-hidratação. O tecido foi então corado com

hematoxilina e eosina (Nuclear – Casa da Química Ind. e com. Ltda), as

lâminas montadas e observadas em microscópio Nikon TE 300.

Foram processados 20 globos oculares de camundongos controle e

20 de animais PrPc-. De cada globo ocular foram analisadas cinco lâminas,

chegando a um total de 100 lâminas para controle e 100 para nocaute.

Foram analisados dois campos para cada uma dessas lâminas, 200

campos para PrPc- e 200 para controle. Foi considerado a medida de um

campo o diâmetro observado com a objetiva em aumento de 10 X.

39

III.II.IV. Avaliação da função visual

Para avaliar a função visual dos camundongos foi utilizado um

dispositivo conhecido como caixa de Skinner (Figura 6). Este dispositivo é

adequado para estudos de comportamento animal, pois podemos ter

controle de uma variedade de condições de estímulos. Utilizamos este

equipamento porque era necessário o controle da luminosidade do

ambiente em que estavam os camundongos nos testes desenvolvidos para

verificar a função visual. Com 100% de intensidade luminosa na caixa, foi

medido o tempo gasto para que um camundongo alcance determinado

alvo. Os animais foram colocados em uma das extremidades da caixa. Na

outra extremidade foi oferecido primeiro um cubo de queijo. Depois o

animal era trocado de caixa e o mesmo procedimento era feito trocando o

queijo por ração. Novamente mudava-se o animal de caixa e, ao invés de

queijo ou ração, era colocado um objeto (bola) do tamanho do pedaço de

queijo e ração. Em seguida foi medido o tempo gasto, em segundos, para

que cada animal chegasse ao alvo (queijo, ração ou objeto). Este

procedimento foi feito com 20 animais controles e 20 animais PrPc-. Cada

animal foi testado 10 vezes para cada alvo. A troca de caixa foi importante

para que o cheiro de um alimento não influenciasse o próximo passo do

experimento.

Foi avaliado também o efeito da intensidade luminosa na função

visual de camundongos controle. Um animal foi colocado na caixa e

mediu-se o tempo que ele levou para chegar ao objeto na outra

40

extremidade. Este tempo foi medido com a caixa contendo 100% de luz,

depois com 70% em seguida com 50% e finalmente com 25% de luz. O

procedimento foi feito com 20 animais controle e repetido 10 vezes para

cada animal.

Figura 6. Caixa de Skinner.

III.II.V Análise Quantitativa e Estatística

As lâminas foram observadas em microscópio de epifluorescência, as

imagens foram capturadas ou fotografadas. As imagens fotografadas foram

escaniadas para posterior montagem no programa Adobe Photoshop CS

versão 8.0.1. As análises estatísticas foram feitas no programa Excel.

Calculamos a média e o desvio padrão em cada caso. As diferenças entre

os grupos de resultados coletados foram analisadas pelo teste t - ANOVA e

considerado significante quando o valor de p foi menor que 0,05. Para

medir o calibre dos vasos foi utilizado o programa Image Pro Plus (Media

Cybernetics).

41

IV. RESULTADOS

42

IV. RESULTADOS

Inicialmente investigamos se em camundongos nocaute para PrPc a

ausência da expressão da proteína prion celular, sabidamente um ligante

para laminina (Graner e cols., 2000a e b), poderia promover alterações no

padrão de deposição da proteína laminina na camada limitante interna da

retina. Observamos, como descrito originalmente por Fruttiger (2002), a

formação das fileiras de células com núcleo fusiformes, marcadas com

DAPI no fronte de crescimento da rede vascular (Figura 7 A). Como a

morfologia nuclear acompanha a celular, essas células foram definidas

como células fusiformes. Análises subseqüentes revelaram que as células

fusiformes eram precursores astrocitários (Fruttiger, 2002). Em associação

às células organizadas em fileiras, a laminina se organiza em tramas

poligonais nas retinas de animais controle (Figura 7 C), mas não nas

retinas de animais nocaute (Figura 7 D). Nos animais nocaute as mesmas

células estão desagrupadas e soltas, sem um padrão definido de

organização, e não há detecção de laminina (Figura 7 B).

43

A

C D

B

Figura 7. Imunomarcação para laminina na membrana limitante interna da retina de camundongos neonatos (P0).Marcão para DAPI (A) (B).Formação das fileiras de células fusiformes (seta), no fronte de crescimento da rede vascular em animais controle (A) e células sem padrão de organização em retinas de camundongos PrPc- (B). Imunomarcação anti-laminina (C)(D).Organização em tramas poligonais da laminina em camundongos controle (C). Não observamos a organização em tramas poligonais em camundongos nocaute (D). A barra de calibração corresponde a 10 µm.

44

As redes poligonais de laminina foram observadas sobre os

astrócitos enfileirados encontrados no fronte de crescimento da rede

vascular dos animais controle. Estas redes poligonais de laminina são

semelhantes às que se formam sobre culturas de astrócitos obtidos a

partir do córtex cerebral de animais embrionários ou polimerizadas

artificialmente em pH ácido (Freire e cols. 2002 e 2004). As matrizes com

estruturas poligonais são formadas através da interação entre os braços

curtos da laminina (Barroso e cols., em preparação) e são extremamente

eficientes na promoção do crescimento neurítico.

Para avaliar se a ausência da expressão da proteína prion celular e a

conseqüente ausência da deposição de laminina na matriz da superfície

interna da retina afetariam o desenvolvimento da rede vascular retiniana,

foram dissecadas as retinas de animais nocaute e controle (P1, P2 e P5).

Após serem dissecadas as retinas foram preparadas em montagens planas

e submetidas a análise por imunomarcação da proteína laminina. A

proteína laminina é sabidamente um constituinte de membrana basal que

envolve as células endoteliais e, portanto, neste caso funciona como

marcador da rede vascular. Para acompanhar o crescimento do plexo

vascular primário fizemos marcação para laminina em animais controle

(Figura 8 A, C e E) e nocaute (Figura 8 B, D e F). O plexo vascular

primário, em animais controle, na idade P0 já é bem visível através da

marcação para laminina (Figura 8 A) enquanto que na mesma idade, em

camundongos PrPc-, a marcação para laminina se limita a inserção do

45

nervo óptico (Figura 8 B). O crescimento dos vasos em retinas de animais

nocaute com 2 dias (P2) e 5 dias (P5) continua mostrando um atraso em

relação ao observado nas retinas de camundongos controle. Nos controle

em P2 a vascularização da retina já alcança a metade da sua superfície e

nos nocaute este processo apenas se inicia (comparar Figura 8 C e D).

Em P5, os animais controle já apresentam o plexo primário alcançando a

extremidade da retina e nos nocaute o plexo ainda não passa da metade

da retina (Figura 8 E e F).

46

CT PrPc-

P0

P2 P2

P5 P5

P0

A B

C D

E F

Figura 8. Imunomarcação da membrana basal dos vasos, do plexo vascular primário da retina de camundongos, com anticorpo anti-laminina. Em camundongos controle (P0)(A), (P2)(C) e (P5)(E) e em camundongos PrPc-(P0)(B),(P2)(D) e (P5)(F).Observamos um atraso no processo de vascularização de animais nocaute. O círculo marca a inserção do nervo óptico. Barra de calibração corresponde a 100 µm.

47

A marcação para PECAM 1 da rede vascular das retinas de

camundongos no quinto dia de vida mostra um padrão de ramificação dos

vasos diferente entre retinas de animais controle e nocaute. Ao

observarmos os pontos de ramificação por campo analisado, verificamos

um número muito maior de ramificações nos vasos de animais controle do

que em vasos de animais nocaute. Estes pontos de ramificação dos vasos

chegam a 25 ramificações por campo analisado nos controle (Figura 9 A) e

somente cinco pontos em retinas de camundogos PrPc- (Figura 9 B).

Observamos um total de 40 campos para animais controle e 40 para

animais nocaute. O diâmetro dos vasos também foi avaliado através de

marcação para laminina. Quantificamos uma média de 17,5 ± 2,2 µm

para controle (Figura 10 A) e 8,9 ± 1,0 µm para nocaute (Figura 10 B).

48

0

5

10

15

20

25

30

PrPc- CT

Núm

ero

de r

amifi

caçõ

es

por

cam

po

A B

C

A B

Figura 9. Número de ramificações dos vasos do plexo vascular primário da retina por campo observado, em 30 campos para controle e 30 para PrPc-.Cada campo corresponde ao diâmetro observado com a objetiva de 10X. Imunomarcação para PECAM1 nos vasos da retina de camundongos PrPc- (B) e controle (A). A quantificação (C) mostra um padrão mais ramificado nos vasos de animais controle (24,6 ± 1,6 ramificações) em relação ao nocaute (3,8 ± 0,3 ramificações). Barras representam o erro padrão da medida. Barra de calibração corresponde a 50 µm.

49

0

5

10

15

20

25

Diâ

met

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édio

de

vaso

s (µ

m)

CT PrPc-

C

A

B

Figura 10. Imunomarcação dos vasos do plexo vascular primário com anticorpo anti-laminina em camundongos controle (A) e nocautes (B) para observação do calibre dos vasos. O calibre foi medido, quantificado e obtivemos uma média de 17,5 ± 2,2 µm para controle e 8,7 ± 1,0 µm para nocaute (C). Barras representam o erro padrão da medida. Barra de calibração corresponde a 50 µm.

50

Após caracterizarmos as diferenças no crescimento da rede vascular

e identificarmos diferenças no padrão de ramificação e no diâmetro dos

vasos, fomos verificar se haveria diferenças no grau de maturação desses

vasos. Para isso fizemos marcação para α-actina de músculo liso que,

neste caso, identifica pericitos, ou seja, aquelas células murais associadas

ao revestimento endotelial dos capilares. Observamos pericitos descolados

dos vasos em retinas de camundongos PrPc- (Figura 11 B). Em animais

controle, os pericitos aparecem bem aderidos aos vasos da retina (Figura

11 A). Quando comparamos com a marcação para laminina dos vasos

confirmamos que em camundongos controle os pericitos aparecem bem

aderidos aos capilares, o que não se observa nos nocaute (comparar

Figura 11 C e D).

51

PrPc - CT

A

C

B

D

Figura 11. Imunomarcação dos vasos do plexo vascular primário da retina com anti α actina de músculo liso (A) e (B) e anti- laminina (C) e (D).Notamos pericitos descolados dos vasos em retinas de camundongos PrPc- (B)(seta). Em animais controle, os pericitos aparecem bem aderidos aos vasos da retina (A). Quando comparamos os vasos marcados para laminina confirmamos que em camundongos controle os pericitos aparecem com a sua membrana basal aderida a membrana basal dos vasos (C) o que não se observa nos nocautes (D). Barra de calibração corresponde a 10 µm.

52

Para ter certeza de que os nossos resultados, obtidos através de

imunomarcação para laminina se reportam efetivamente à formação da

rede vascular, os vasos nas retinas foram também identificados através de

uma dupla imunomarcação para laminina e colágeno IV (Figura 12A e B).

O colágeno IV, assim como a laminina, identifica a membrana basal que

circunda os vasos sangüineos. Além disso observamos um padrão de

marcação bastante semelhante através da marcação para PECAM-1

(Figura 12 C), que é marcador específico para célula endotelial. Esses

resultados em conjunto demonstram que a marcação para laminina

identifica majoritariamente os vasos da retina.

Uma observação adicional foi a identificação de uma tendência

acentuada à perda de vasos nos nocaute durante o processamento para

imunohistoquímica e preparação das montagens planas. Das 280 retinas

que foram dissecadas durante o desenvolvimento desse trabalho, 140

foram de animais entre o dia do nascimento até o segundo dia de vida (P0-

P2), sendo 70 delas dissecadas de animais controle e 70 de animais

nocaute. Cerca de 100 retinas de animais entre o terceiro e o quinto dia de

vida foram dissecadas, sendo 50 de camundongos controle e 50 de

nocaute. Analisamos ainda 20 retinas de camundongos PrPc- e 20 de

controle acima do quinto dia após o nascimento (>P5) (Figura 13 A). Do

total de retinas observadas entre P0 e P2, os vasos foram mantidos em 60

retinas (86%) dissecadas de camundongos controle, enquanto que em

camundongos nocaute somente em 10 retinas (14%) foram observados

53

vasos após os procedimentos de dissecação e montagem plana. Entre as

idades P3 e P5, cerca de 80% das retinas dissecadas dos animais controle

apresentaram vasos, enquanto apenas 10% das retinas do nocaute

mantiveram a rede vascular. Nas retinas dissecadas de animais após o

quinto dia do nascimento foram observados vasos em apenas 25% das de

camundongos controle e nenhuma das retinas dissecada de animais

nocaute mantiveram a rede vascular. (Figura 13 B).

54

C

B A

Figura 12. Imunomarcação de vasos do plexo vascular primário da retina de camundongos controle. Anti-laminina (A), anti- colágeno IV (B) e anti- PECAM1 (C). Barra de calibração corresponde a 50 µm.

55

0

10

20

30

40

50

60

70

80

CT PrPc-

Núm

ero

tota

l de

retin

as d

isse

cada

s A

Figura 13. Quantificação do número total de retinas dissecadas de animais controle e PrPc- (A). Em B, a quantificação de retinas dissecadas que mantiveram os vasos preservados.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

CT PrPc-

P0 – P2 P3 – P5 > P5

B

Núm

ero

tota

l de

retin

as d

isse

cada

s co

m v

asos

P0 – P2 P3 – P5 > P5

56

Para observar a integridade das camadas da retina dos

camundongos fizemos cortes histológicos do globo ocular intacto e

realizamos o procedimento de coloração com hematoxilina e eosina. As

retinas de animais controle são mostradas na figura 14A e C com suas

camadas bem definidas e organizadas, e praticamente inexistem regiões de

descolamento da camada pigmentar da retina. Na figura 14B, D notamos

que nas retinas de camundongos PrPc- existem regiões de desorganização

além de regiões de descolamento da retina. As regiões de desorganização

observadas na camada superficial da retina foram quantificadas e

comparadas entre retinas de animais controle (Figura 15 A) e nocaute

(Figura 15 B e C). Observa-se nas retinas de animais nocaute regiões nas

quais as células da superfície retiniana encontram-se aderidas ao

cristalino (Figura 15 B), em outras regiões células da camada superficial

parecem se soltar da retina (Figura 15 C). Do total dos 200 campos

analisados para PrPc- e 200 para controle, 85% apresentaram áreas de

desorganização nas retinas dos animais nocaute enquanto apenas cerca de

30% apresentaram áreas de desorganização nas retinas de animais

controle (Figura 15 D).

57

A B

C

D C

Figura 14. Cortes histológicos do globo ocular, corados com hematoxilina e eosina, de animais controle (A) e (C) e de camundongos nocaute (B) e (D). Notamos que nas retinas de camundongos PrPc- existem regiões de desorganização das camadas da retina (ponta de seta) além de regiões de descolamento de retina (seta).

58

A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% d

e ca

mpo

s co

m

des

orga

niza

ção/

lâm

ina

CT PrPc-

C

B

D

Figura 15. Cortes histológicos de globo ocular. Em camundongos controle (A) mostra-se a integridade das camadas da retina. Em B e C observamos regiões de desorganização das camadas da retina de animais PrPc- (seta). Em D a quantificação mostra que foi encontrada uma porcentagem significantemente maior de campos de desorganização em retinas de camundongos PrPc-.

59

A analise da organização dos vasos evidencia uma maior

estruturação dos vasos nos animais controle, que apresentam paredes

endoteliais íntegras (Figura 16 A). Nos animais nocaute, alguns vasos da

camada superficial encontram-se dilatados, muitas vezes rompidos e não

circundados devidamente por células endoteliais (Figura 16 B). A

quantificação da integridade dos vasos mostra que em apenas cerca de

20% dos campos analisados, as retinas dos animais controle

apresentavam vasos com interrupções da camada endotelial, enquanto que

em 70% dos campos analisados, as retinas dos animais nocaute

apresentavam vasos não íntegros (Figura 16 C).

60

Figura 16. Corte histológico da retina mostrando a organização dos vasos (seta). Observamos uma maior integridade nas paredes dos vasos de retina de animais controle (A). Nos animais nocaute, vasos da camada superficial encontram-se rompidos (B). A quantificação mostra maior desestruturação nos vasos de retina de camundongos PrPc- (C).

A

C

B

C CC C C

C

CCCCCCC

C

0

10

20

30

40

5060

70

80

90

100

% d

e ca

mpo

s an

alis

ados

com

V

asos

des

estr

utur

ados

CT PrPc-

61

Em paralelo a observação da estruturação dos vasos, comparamos

as retinas dos animais controle (Figura 17 A) e nocaute (Figura 17 B) em

relação à existência de áreas de descolamento de retina. Verificamos que

80% dos campos analisados das retinas dos animais nocaute mostraram

áreas de descolamento enquanto nos animais controle apenas 5% dos

campos apresentaram descolamento (Figura 17 C). Dos 80% dos campos

que apresentaram áreas de descolamento, 45% mostraram apenas uma

região de descolamento no campo observado, cerca de 30% mostraram

duas regiões no campo observado e ainda cerca de 10% mostraram mais

que três regiões de por campo analisado (Figura 17 D).

62

A B

Regiões de descolamento de retina por campos analisados

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CT

PrPc-

1 região 2 regiões 3 ou + regiões

% d

e ca

mpo

s an

alis

ados

CT PrPc-

C D

CT

PrPc-

Figura 17. Corte histológico de retina mostrando integridade das camadas em camundongos controle (A) e regiões de descolamento de retina em camundongos PrPc- (B) (seta). Quantificação de áreas de descolamento de retina por campo analisado em camundongos controle e nocaute (C). Quantificação do número de regiões de descolamento de retina por campo analisado, em camundongos controle e nocaute (D).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

% d

e ca

mpo

s an

alis

ados

com

ár

eas

de d

esco

lam

ento

de

retin

a

D CTPrPc-CTPrPc-

63

Para verificar se as alterações observadas nos vasos da retina,

através das análises por imunohistoquímica e dos cortes histológicos,

poderiam levar a alterações na função visual, fizemos ensaios funcionais

utilizando caixas de Skinner. Com iluminação total os animais PrPc- e

controle foram colocados em uma das extremidades da caixa. Na outra

extremidade foram oferecidos diferentes alvos a serem alcançados.

Quantificamos quantas vezes por minuto os animais controle (Figura 18

A) e nocaute (Figura 18 B) chegaram até o alimento (ração ou queijo) e

objeto sem odor, mas como o mesmo tamanho que o pedaço de queijo e de

ração (bola). Tivemos o cuidado de realizar os experimentos trocando de

caixas entre cada teste para evitar que o odor desprendido dos alimentos

interferisse no ensaio seguinte. Observamos que os animais controle

alcançaram o queijo e a ração o mesmo número de vezes no período de um

minuto e poucos se dirigiram apenas uma única vez em direção ao objeto

(Figura 18 A). Os animais nocaute gastaram o período de um minuto

alcançando apenas uma única vez o queijo, alguns sequer alcançaram a

ração e nenhum dos animais testados localizou o objeto inodoro (Figura

18 B).

A’

64

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

ração objeto

Idas

até

o a

lvo

por

min

uto

*

CT

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

PrPc-

*

B

queijo objeto ração queijo

A

Figura 18. Quantificação do número de vezes por minuto que os animais controle (A) e nocaute (B) levam para chegar até o alimento (ração ou queijo) e objeto sem forte odor (bola). Barras representam o erro padrão da medida. De acordo com tratamento estatístico p< 0,05.

65

Adicionalmente analisamos o tempo que cada animal necessita para

encontrar cada alvo oferecido (queijo, ração e objeto). Notamos que não

houve diferença significativa no tempo gasto pelos animais controle para

chegar ao alvo, variando entre 5 segundos para o queijo e o objeto e 3

segundos para a ração (Figura 19 A). Os animais PrPc- necessitaram de

um período de tempo significativamente maior tanto para alcançar a ração

quanto para alcançar o queijo. Estes animais levaram em média 66

segundos para encontrar o queijo e 45 segundos a ração (Figura 19 B).

Quando comparamos, na mesma escala, o tempo gasto pelos animais

nocaute e controle notamos que os animais nocaute levam cerca 14 de

vezes mais tempo que os controle para alcançar o alvo (inset C). É

interessante observar que nenhum dos animais PrPc- submetidos ao teste

conseguiu chegar ao objeto em num período de 120 segundos (Figura 19

D). Esses resultados mostram claramente que os camundongos controle

tiveram mais facilidade, tanto para encontrar os alimentos quanto o objeto

quando comparados com os animais nocaute.

66

% d

e an

imai

s qu

e nã

o al

canç

aram

o

obje

to a

pós

(120

seg

)

objeto

D

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

D

* *

Figura 19. Análise do tempo que cada animal necessita para encontrar cada alvo oferecido (queijo, ração e objeto). Não houve diferença significativa no tempo gasto pelos animais controle para chegar ao alvo (A). Os animais PrPc- utilizaram um período de tempo significativamente maior tanto para alcançar a ração quanto para alcançar o queijo (B). Nenhum dos animais PrPc- submetidos ao teste conseguiu chegar ao objeto no período de 120 segundos (D). Barras representam o erro padrão da medida. De acordo com o tratamento estatístico p < 0,05.

Tem

po g

asto

par

a

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ntra

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alvo

(se

g)

0

1

2

3

4

5

6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

AB

0

10

20

30

40

50

60

70

80

C

queijo ração objeto queijo ração

* *

67

Para verificar se o ato de encontrar objetos, sob as condições

experimentais encontra-se associado à função visual dos animais, foi

avaliado o efeito da variação da luminosidade no interior das caixas de

Skinner sobre o tempo gasto pelos animais controle, para localizar o

objeto. Observamos que a diminuição da luminosidade no ambiente

diminuiu o tempo gasto pelos animais para alcançar o alvo, indicando que

a diminuição da luminosidade facilita a localização do objeto (Figura 20).

68

0

50

100

150

200

250

Tem

po g

asto

par

a

enco

ntra

r o

obje

to p

ela

segu

nda

vez

(seg

)

25 50 75 100

CT

% de luz

*

*

Figura 20. Quantificação dos testes feitos para verificar se o ato de encontrar objetos, sob as condições experimentais, encontra-se associado à função visual dos animais. Foi avaliado o efeito da variação da luminosidade sobre o tempo gasto pelos animais controles, para localizar o objeto. De acordo com tratamento estatístico p<0,05.

69

V. DISCUSSÃO

70

V. DISCUSSÃO

A laminina é uma glicoproteína de alto peso molecular,

primeiramente identificada e caracterizada como constituinte da

membrana basal (Timple, 1989), teve sua presença também demonstrada

na formação de tecidos como na matriz extracelular do cérebro

embrionário (Luckenbill-Edds, 1997). A Laminina é constituída de três

cadeias, α, β e γ, que se arranjam em forma de cruz, sendo o braço mais

longo formado pela associação entre as três cadeias (Miner e Yurcheco,

2002).

A proteína laminina se auto-polimeriza, dando origem a matrizes de

diferentes formas. A organização da laminina na matriz extracelular do

sistema nervoso central em desenvolvimento é bastante variada, podendo

ser observados agregados puntiformes dispersos de tamanhos variados,

agregados associados a membranas celulares ou ainda agregados em

forma de lâmina. O fato dos padrões de organização apresentarem uma

distribuição temporal sugere que possam ter diferentes funções no

desenvolvimento (Zhou, 1990). Esta hipótese é suportada por observações

feitas in vitro, comparando matrizes de laminina depositadas por diferentes

populações de astrócitos em cultura.

As propriedades do meio extracelular onde são formados os

depósitos de laminina pode modular o processo de organização dos

agregados formados por esta proteína e suas respectivas capacidades de

induzir respostas celulares (Freire e cols., 2002, 2004). Uma possibilidade

71

alternativa seria a de que a morfologia dos depósitos fosse determinada

pela interação com receptores celulares específicos (Tsiper e Yurchenco,

2002). Trabalhos mostram que PrPc se liga tanto a laminina (Graner e

cols., 2000a e b), quanto ao receptor de laminina 67 kDa (Gauczynski e

cols., 2001). Sabendo que durante o desenvolvimento da retina, em

camundongos, há normalmente síntese de laminina pelos astrócitos na

membrana limitante interna, neste trabalho nós inicialmente investigamos

o padrão de organização polimérica da laminina sintetizada pelas células

localizadas nesta região. Células de morfologia fusiformes foram

previamente identificadas na membrana limitante interna e classificadas

como sendo astrócitos por Fruttiger, 2002. Observamos que existe um

padrão de organização de laminina diferenciado na membrana limitante

interna da retina de animais controle quando comparados com os animais

nocaute. No desenvolvimento das retinas de animais controle notamos

deposição de laminina por toda a superfície interna da retina. Observamos

que os polímeros de laminina sintetizados pelos astrócitos retinianos dos

animais controle (Figura 7 C) apresentam um padrão de organização

poligonal compatível com o previamente visualizado sobre camadas de

astrócitos em cultura, obtidas de córtex de animais embrionários (Freire e

cols., 2004). O mesmo padrão poligonal é também observado em matrizes

artificiais sintetizadas por diluição da proteína em pH ácido (Freire e cols.,

2002). A organização poligonal tem sido atribuída às interações que

envolvem exclusivamente os domínios globulares dos braços curtos da

72

laminina (Barroso e cols., em preparação). Em camundongos PrPc-, apesar

de existir laminina na membrana basal dos vasos (Figura 8B, D e F), não

identificamos o padrão de organização polimérica de laminina na

membrana limitante interna da retina (Figura 7 D). Na verdade, nenhuma

marcação para laminina foi observada nos animais depletados da proteína

PrPc. Desta forma, acreditamos que a adesão da proteína laminina sobre a

camada limitante interna da retina possa ser prejudicada pela ausência

da proteína prion celular um dos seus ligantes.

Trabalhos anteriores mostraram que o padrão de polimerização de

laminina é importante para a diferenciação neuronal (Garcia-Abreu e cols.,

1995) e que o complexo PrPc-Ln modula a neuritogênese em células de

cultura primária de hipocampo de ratos e camundongos (Graner e cols.,

2000a e b). Quando neurônios são cultivados em co-cultura com astrócitos

de animais PrPc- observa-se crescimento neurítico menor se comparados

com neurônios em contato com astrócitos de animais controle (Lima e

cols., 2007). Neste mesmo trabalho, foi mostrado adicionalmente que a

laminina da matriz extracelular secretada por astrócitos de animais PrPc-,

apresenta um padrão de deposição interrompido, ou seja, que os

agregados de laminina não se estruturam em redes poligonais planas,

como as previamente descritas como indutoras de neuritogênese (Freire e

cols., 2002 e 2004). Nossos dados corroboram a hipótese de que PrPc

module a formação da rede poligonal de laminina indutora de

neuritogênese.

73

Além de alterações na organização de laminina na membrana

limitante interna da retina de camundongos nocaute, observamos também

diferenças no padrão de organização das células fusiformes. Foi mostrado

que uma das principais funções dos astrócitos da retina é induzir

crescimento dos vasos (Akiyoshi e cols. 2006). Além disso, segundo

Fruttiger (2002), para que ocorra a formação da rede vascular na

superfície da retina, vários processos celulares e moleculares devem seguir

uma ordem cronológica. Antes de se iniciar a vascularização da retina,

ocorre a formação de uma rede de astrócitos crescendo a partir do nervo

óptico em direção a periferia da retina. A rede de astrócitos forma um

molde para que ocorra efetivamente a formação dos vasos sanguíneos. No

nosso trabalho observamos que as células com núcleos fusiformes

encontradas, em animais controle neonatos (P0), se mostram organizadas

no fronte de crescimento da rede vascular. Estas células se organizam em

forma de fileiras com ramificações definindo a organização estrutural para

que a rede vascular possa ser formada. Quando comparamos com animais

nocaute de mesma idade, não observamos o padrão de organização

compatível com a rede de astrócitos observada nos controles (Figura 7A e

B).

Um dos principais resultados relatados nesta tese foi o atraso na

progressão da vascularização da retina de camundongos nocaute. Segundo

Gariano (2003), o plexo primário da retina de camundongos inicia a sua

formação no dia do nascimento a partir do nervo óptico e cresce em

74

direção às margens da retina. Esta rede vascular ultrapassa a metade da

superfície retiniana em aproximadamente 4 dias após o nascimento e por

volta de uma semana depois de nascidos alcança a periferia da retina. Em

nosso trabalho, ao acompanhar a formação da rede vascular dos

camundongos controle, notamos o início da vascularização em animais

neonatos P0. Aproximadamente no segundo dia de vida a rede vascular

quase alcança metade da superfície retiniana e já no quinto dia a rede

encontra-se próxima a periferia da retina. Observamos, no entanto (Figura

8), que em animais nocaute, este crescimento vascular é bem diferenciado.

Notamos que os vasos da retina destes animais, quando neonatos (P0) são

virtualmente ausentes na inserção do nervo óptico. Em animais nocaute

com idade de dois dias de nascidos (P2), o plexo vascular primário apenas

se inicia na inserção do nervo óptico, o que sugere um atraso no processo

de formação da rede vascular nos animais nocaute. A análise das retinas

dos animais com 5 dias após o nascimento confirma o atraso no processo

de desenvolvimento vascular da retina de camundongos nocaute, pois

nesta fase o plexo vascular primário ainda não alcança a metade da

superfície da retina quando já deveria se aproximar da periferia

Além do atraso no crescimento do plexo vascular primário de

retinas de camundongos nocaute, também observamos diferenças no

padrão de ramificação dos vasos, seu calibre e na sua maturação (Figura

11). Os vasos da retina de animais nocaute são muito menos ramificados e

possuem espessura menor que os de animais controle. Adicionalmente,

75

observamos um número significativo de pericitos descolados da membrana

basal dos vasos. Esses dados sugerem que existam deficiência tanto na

maturação quanto na estabilização dos vasos da retina de camundongos

nocaute. A presença de pericitos nos vasos demonstra a maturação e

integridade dos vasos (Akiyoshi e cols., 2006). O descolamento de pericitos

é um dos primeiros sintomas de comprometimento da integridade dos

vasos sangüíneos. Em doenças relacionadas com vascularização da retina,

como é o caso da retinopatia diabética, a dissociação dos pericitos dos

capilares da retina é o primeiro sintoma da doença e o início de várias

alterações nos vasos que incluem aumento da permeabilidade vascular e

hemorragia (Frank, 2004).

A avaliação histológica comparativa das retinas de animais PrPc- e

controle mostrou que as retinas de animais nocaute apresentam

alterações na organização de camadas celulares, assim como alterações na

estrutura vascular associadas a processos de descolamento de retina

(Figura 15). Já em 1997, Bursell e colaboradores mostraram que

processos de descolamento de retina podiam ser causados por patologias

ligadas às alterações microvasculares do tecido retiniano. Estas alterações

circulatórias como as que foram observadas por nós neste trabalho,

podem levar à perda do tônus vascular, alteração do fluxo sangüíneo,

aumento da permeabilidade vascular e conseqüentemente hemorragias e

edema culminando em descolamento de retina que, muitas vezes, pode

levar a diminuição da função visual e até mesmo a perda total da visão.

76

Os ensaios funcionais desenvolvidos nesse trabalho não

permitiram conclusões sobre a acuidade visual dos animais PrPc-, apesar

de nossas análises sobre o padrão de comportamento dos camundongos

nocaute sugerirem fortemente que estes animais apresentem alterações na

função visual. Os camundongos nocaute, durante os testes funcionais

realizados, necessitaram de um tempo consideravelmente maior que os

animais controle para alcançar os alimentos oferecidos. Além disso,

nenhum dos camundongos nocaute alcançou o objeto (bola) no tempo

estipulado para o ensaio.

A aquisição de alimentos por camundongos requer o uso de vários

sentidos, dentre eles o olfato e a visão. Para avaliar mais especificamente a

participação da visão nesta atividade, testamos a influência da

luminosidade sobre o tempo necessário para o alcance de objeto

desprovido de odor. O objeto, colocado no lugar do alimento, foi alcançado

pelos animais controle em um tempo similar ao tempo gasto para o

alcance dos alimentos. Os animais nocaute não alcançaram o mesmo

objeto durante o tempo do ensaio funcional. Poderíamos atribuir este fato

aos animais não se sentirem tão atraídos pelo objeto quanto pelo alimento.

Entretanto, percebemos claramente que a visão foi requisitada no ato, pois

quanto menor a intensidade luminosa, menor foi o tempo necessário para

os animais controle encontrarem o objeto. Esse comportamento, no

entanto, não foi verificado nos animais nocaute, ou seja, a diminuição da

intensidade luminosa não promoveu uma diminuição no tempo gasto para

77

o alcance do objeto. Vale ressaltar que era esperado que a diminuição da

intensidade luminosa favorecesse a visão, já que roedores apresentam

visão noturna (Mackintosh, 1974). Os dados obtidos demonstram que o

grande aumento no tempo gasto pelos animais nocaute para alcançarem o

objeto desprovidos de forte odor, não se encontra exclusivamente

associado à falta de interesse pelo objeto, mas principalmente ao

comprometimento visual nesses animais.

78

VI. CONCLUSÕES

79

VI. CONCLUSÕES

- Nossos resultados mostraram que, apesar de existir laminina expressa

na membrana basal dos vasos, não existe deposição de laminina na

membrana limitante interna da retina dos animais nocaute antes do

crescimento vascular. Acreditamos que a adesão da proteína laminina

sobre a camada limitante interna da retina possa ser prejudicada pela

ausência da expressão da proteína prion celular, um dos seus ligantes.

- Caracterizamos um atraso no processo de vascularização da retina de

animais depletados do gene prnp. Além disso, identificamos que os vasos

da retina de animais nocaute apresentaram várias alterações como

diminuição do calibre, menor ramificação e perda de pericitos.

Acreditamos que estas alterações comprometem tanto o desenvolvimento

quanto a maturação dos vasos levando também a alterações nas camadas

da retina e conseqüentemente ao descolamento de retina observado.

- Os resultados da avaliação funcional sugeriram haver alteração da

função visual nesses animais. Nossos resultados indicam a existência de

uma correlação entre as alterações moleculares, celulares e histológicas no

desenvolvimento vascular das retinas de animais nocaute para PrPc e

alterações na função visual desses animais.

80

VII. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS

81

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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