ESTUDO DO PAPEL DE GRÂNULOS DE RNA E DE EXOSSOMOS NA

INTERAÇÃO PATÓGENO-HOSPEDEIRO

PROJETO APRESENTADO À FUNDAÇÃO ARAUCÁRIA – EDITAL PRONEX

ROTEIRO DESCRITIVO

1 – Sobre o Núcleo de Excelência

a- Descrição do Núcleo e sua origem:

O Núcleo é formado por pesquisadores do Instituto Carlos Chagas (Fiocruz-

Paraná), pesquisadores da Universidade Estadual de Londrina (UEL) e

pesquisadores da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR). Na

verdade parte deste Núcleo já esteve organizado em outro projeto do Pronex

promovido pela Fundação Araucária e parte do Núcleo colabora intensamente

desde 2005 e integra o Núcleo de Células Tronco e Terapia Celular sediado no

Paraná. Participam ainda do Núcleo, na qualidade de colaboradores, um

pesquisador da Embrapa e dois pesquisadores do Uruguai (vinculados ao

Instituto Pasteur de Montevidéu e ao Instituto Clemente Estabile), todos

vinculados a atividades de análise bioinformática. É importante mencionar que

os projetos acima referenciados propiciaram um forte vínculo entre alguns dos

pesquisadores do ICC e os pesquisadores da UEL e da PUCPR, que perduram

desde então que podem, através deste projeto, aumentar de intensidade. O

foco do Núcleo proposto ao PRONEX é o estudo da interação patógeno-

hospedeiro usando modelos experimentais bem estabelecidos em nossas

instituições, os patógenos Trypanosoma cruzi e vírus da dengue e os modelos

biológicos de células tronco e células dendriticas. O estudo da interação

patógeno-hospedeiro será feito através da análise de exossomos e de grânulos

de RNA, seu papel na imuno-modulação e seu papel na regulação da

expressão gênica tanto dos patógenos como das células hospedeiras. Esta é

uma abordagem original e moderna , e conhecimentos fundamentais serão

adquiridos através deste projeto, propiciando uma excelente oportunidade e

ambiência para a formação de recursos humanos qualificados.

a- Adequação da equipe:

A equipe é adequada pela qualidade de sua formação profissional (como

facilmente comprovado pelos curricula em anexo) e a multi-disciplinaridade

requerida dentro da área de Ciências Biológicas. Tanto é assim que a equipe

domina a grande plêiade de técnicas que serão utilizadas, como comprovado

pela própria produtividade científica dos diferentes componentes do Núcleo. Os

membros do Núcleo são pesquisadores ativos e produtivos e todos com

bastante experiência no desenvolvimento de projetos de pesquisa (como

constatado abaixo pela descrição dos projetos da equipe nos últimos três

anos). A equipe é formada por:

Nome Função Instituição http://lattes.cnpq.br/

Samuel Goldenberg Coordenador ICC e IBMP 6917479410354653

Alejandro Correa Pesquisador ICC 0502314179930901

Alexandra Senegaglia Pesquisador PUC-PR 5130849139417489

Bruno Dallagiovanna Pesquisador ICC 5038843270685960

Carmen Rebelatto Pesquisador PUC-PR 9258812501826236

Claudia N. Duarte dos Santos Pesquisador ICC 4598537010242642

Fabiola Barbieri Holetz Pesquisador ICC 6996846049865794

Juliano Bordignon Pesquisador ICC 4831386727923397

Lysangela Ronalte Alves Pesquisador ICC 2213128430343323

Marco Augusto Stimamiglio Pesquisador ICC 2641327012811390

Maurilio José Soares Pesquisador ICC 1880268584104636

Nilson Zanchin Pesquisador ICC 4325584779249968

Phileno Pinge Filho Pesquisador UEL 1339724757657824

Sueli F. Yamada-Ogatta Pesquisador UEL 1783272660304122

Francisco Pereira Lobo Colaborador Embrapa 9614758933055047

Hugo Naya Colaborador Inst. Pasteur Montevideu

Estrangeiro

José Sotelo-Silveira Colaborador Inst. Clemente Estable, Uruguai

Estrangeiro

Alessandra Melo de Aguiar Tecnologista ICC 8168088417330193

Guilherme Silveira Doutorando ICC 0631237520300349

Pryscilla Fanini Wowk Pós-Doutoranda ICC 3170471417515903

Sharon de Toledo Martins Doutoranda ICC 4000443506010803

Cryscielli Kuligoski Técnica ICC/IBMP 4570976955280649

Giovanny A.C. A. Mazzarotto

Tecnologista ICC 4491426793431771

b- Descrição da infra-estrutura disponível

A maior parte das atividades experimentais serão realizadas no Instituto Carlos

Chagas. O ICC ocupa uma área de 2500 m2 no campus do Tecpar da Cidade

Industrial de Curitiba com perspectiva de expansão da área para quase 4 mil

metros quadrados até o final de 2012 com a reforma de áreas internas e a

construção de um grande laboratório de experimentação animal (500m2), um

almoxarifado central e reforma de áreas internas de expansão. O ICC é dotado

de moderna e excelente infra-estrutura envolvendo cinco laboratórios para

cultivo de bactérias, fungos e leveduras, parasitas, vírus e células tronco

(incluindo um área para transformação com lentivírus), um laboratório de nível

de segurança biológica 3 (NB3), duas salas de equipamentos comuns (com

centrífugas refrigeradas, ultra-centrífugas, ultra-freezers, máquinas de PCR

convencional e em tempo real), equipamentos de fotodocumentação,

cromatógrafos, microscópios de fluorescência e invertidos com câmeras de alta

resolução, micromanipulador de células e um microscópio confocal.

Recentemente foi aprovado pelo programa CT-Infra apresentado pela Fiocruz a

aquisição de um microscópio eletrônico. O ICC possui ainda três plataformas

tecnológicas, uma para citometria de fluxo (consistindo de um citômetro FACS

Aria II e um citômetro FACS Canto II), uma para seqüenciamento de ácidos

nucléicos (consistindo de um seqüenciador SoLID IV) e uma plataforma de

espectrometria de massas (Orbitrap LQ). O ICC conta ainda com excelente

infra-estrutura para processamento e armazenamento de dados e

investimentos deverão ser feitos pela Fiocruz ao longo de 2012 para

aperfeiçoamento de tecnologias da informação em geral. Somando-se à infra-

estrutura em equipamentos, o ICC conta com infra-estrutura em termos de

técnicos e tecnologistas para dar o importante suporte para as atividades de

pesquisa (preparo de materiais, confecção de meios, operação de

equipamentos das plataformas, preparação de células e de antisoros

policlonais e monoclonais).

O Laboratório de Biologia Molecular de Microrganismos, lotado no

Departamento de Microbiologia do Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Estadual de Londrina, possui 45m2 e conta com os seguintes

equipamentos: Microscópio de luz, Fluxo laminar, Incubadora com agitação,

Microcentrífuga, Centrifuga refrigerada, Estufa bacteriológica, Balança

analítica, Termociclador, Fontes de eletroforese, Sistema de fotodocumentação

de géis de agarose e poliacrilamida, Sistema de transferência de géis de

poliacrilamida, Máquina de gelo, pH metro, Autoclave, Universal Microplate

Reader ELx 800, Estufa incubadora de CO2, Computadores, Geladeiras e

Freezers (-20 e -80 oC). Ainda estão disponíveis no CCB, Ultracentrífuga,

Sistema de água ultrapura, Sistema de eletroforese em campo de pulsos

alternados, Microscópio eletrônico de transmissão e Biotério de criação e

manipulação que serão úteis no desenvolvimento do projeto.

O Laboratório de Imunopatologia Experimental do CCB da UEL (LIE-CCB-UEL)

é coordenado pelo Dr. Phileno Pinge Filho. O LIE-CCB-UEL possui 45 m2 de

área construída disponibilizará os seguintes equipamentos: Estufa de cultivo

celular,cabine de Fluxo laminar, Microscópio invertido, 2 refrigeradores, 2

congeladores, Balança analítica, estufa de secagem de material, forno para

esterilização de vidraria, 2 computadores de mesa, 2 Microscópios binoculares,

Luminômetro para placas, Centrífuga de tubos com capacidade para 1,5 e 15

ml, não refrigerada, centrífuga para capilares indicadores de hematócrito e

destilador de água de bancada.

O Núcleo de Cardiomioplastia Celular é formado pelo Laboratório Experimental

de Cultivo Celular, onde são desenvolvidos os projetos de pesquisa básica e

pré-clínica, pelo Laboratório de Cirurgia Experimental e pelo Laboratório do

Núcleo de Cardiomioplastia Celular, onde estão sendo desenvolvidos os

projetos clínicos. O Laboratório do Núcleo de Cardiomioplastia Celular está

localizado no segundo andar do Laboratório de Engenharia e Transplante

Celular no Parque Tecnológico do campus da Pontifícia Universidade Católica

do Paraná. Este espaço conta com um sistema de ar condicionado filtrado,

câmara-fria e núcleo de limpeza e esterilização, obedecendo a todas as

normas preconizadas na RDC 210 de Boas Práticas para a Fabricação de

Produtos Biológicos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e as normas

internacionais para o cultivo e expansão de células destinadas ao transplante

em seres humanos. O laboratório possui uma área de 67,61m² que está

dividida da seguinte maneira: 01 sala de recepção do material; 01 sala de

preparo de materiais (classe 100.000); 02 salas de cultivo celular (classe

10.000); 01 almoxarifado e 01 sala administrativa. O laboratório conta com os

seguintes equipamentos: 02 fluxos laminares, 02 incubadoras de CO2, 03

microscópios, 02 centrífugas refrigeradas, 02 refrigeradores, 02 freezeres, rede

de CO2, 01 container para armazenamento de amostras congeladas, 02

balanças, 01 banho-maria, 01 estufa bacteriológica, 01 pHmetro, 01 citômetro

de fluxo e 01 microscópio de imunofluorescência. O Centro de Tecnologia

Celular tem uma área de 148,22m² com uma estrutura de 04 salas de cultivo

celular (classe 10.000), sendo que cada sala contem 02 estufas de CO2, 01

fluxo laminar e 01 microscópio; 02 salas de preparo de materiais (classe

100.000), 01 sala de congelamento de amostras, 01 entrada para

paramentação, 01 saída para desparamentação, 01 almoxarifado, 01 sala

administrativa e 01 sala de apoio e 01 central de esterilização.

A Unidade de Bioinformática do Instituto Pasteur de Montevideo (IPM)

administra conjuntamente com o Grupo de Simulações Biomoleculares do IPM

um cluster BULL de 80 nodos para cálculo. Conta com 15 computadores de

escritório, espaço físico adequado, acesso à rede CLARA, capacidade de

armazenamento e suporte de informação centralizado. O software utilizado é

de acesso livre, contando com licenças de suítes de edição gráfica. Para o

presente projeto se disponibilizarão 15.000 horas nodo/mês em média.

O Laboratório de Neurobiologia Celular y Molecular do Instituto de

Investigaciones Biológicas Clemente Estable possui uma área de 30 m².

Sistema de hibridação para Microarranjos Agilent. Equipamentos de PCR em

Tempo Real. Facilidades para microscopia e análises de estrutura celular

como: Microscópio Confocal FV300 Olympus, Microscópio Eletrônico Jeol e

Fuji Bas-FLA5000 High Resolution Imager. Para a análise do transcriptoma e

resultados de seqüenciamento em larga escala se dispõe de processadores

Tetra Quad com 32 GB de memória e 10 TB de Hard Drive.

c- Listagem dos projetos de pesquisa desenvolvidos pela equipe nos

últimos 3 anos (agência, vigência, recursos e resultados obtidos)

- Vírus da dengue: caracterização genética, identificação de assinaturas moleculares de virulência e resposta do hospedeiro humano à infecção, CNPq, Proc. 558369/2008-1, Edital PNPD, R$36.000,00, resp. Samuel Goldenberg. Esse projeto teve como objetivo buscar uma maior compreensão da patogênese da dengue através do estudo da interação entre o vírus e seu hospedeiro mamífero. Para tanto foram utilizadas diferentes abordagens como a caracterização genética de diferentes isolados virais através de sequenciamento nucleotídico, estudo da resposta do hospedeiro à infecção em modelos in vivo (modelos murinos) e ex vivo (culturas primárias de células humanas) e desenvolvimento de ferramentas de genética reversa (clones infeccioso e replicons) para avaliar o papel de mutações pontuais ou em conjunto na virulência de determinadas cepas virais. Essa abordagem permitiu que identificássemos a circulação de diferentes genótipos de DENV-3 no Brasil, com importantes diferenças em termos de patogênese, que podem estar relacionadas a uma inibição da via de sinalização do IFN-tipo I pelo genótipo III, que se mostrou mais virulento. - Análise epigenética de células tronco mesenquimais da medula óssea na indução adipogênica, CNPq, Proc. 573520/2008-9, Edital Terapia Celular, R$174.000,00, resp. Samuel Goldenberg. Investigamos o perfil epigenético que caracteriza a diferenciação adipogênica de células-tronco adultas. Investigamos o efeito da acetilação de histonas no processo de diferenciação adipogênica de CTMs utilizando o inibidor de histona desacetilases tricostatina A (TSA). As análises mostraram que o tratamento com TSA interfere na expressão gênica, na diferenciação adipogênica e no crescimento celular. O tratamento parece ter efeito intrínseco à amostra biológica (doador), mas de modo geral levou à diminuição da diferenciação adipogênica. A análise da arquitetura nuclear pela presença de determinadas modificações em histonas através de imunomarcações em CTMs-MO induzidas à adipogênese mostrou que há diminuição de H3K4 metilada em células diferenciadas em comparação às células que estão iniciando o processo de diferenciação

- INCT para Diagnóstico em Saúde Pública, CNPq, Proc. 573791/2008-2, Edital INCT, R$ 4.792.361,91, Resp. Samuel Goldenberg. O projeto está em andamento e busca desenvolver novos reagentes e novas plataformas para o diagnóstico das doenças de diagnóstico compulsório nas transfusões. As instituições envolvidas são, FIOCRUZ, IBMP, UFPR, UTFPR, UFSC, UFRGS, Tecpar.

- Análise ribonômica e caracterização de complexos mRNP em Trypanosoma cruzi, CNPq, Proc. 403484/2008-1, Edital Encomendas Papes/FIOCRUZ - Papes V, R$ 60.000,00, Resp. Samuel Goldenberg. Os resultados obtidos levaram ao isolamento dos complexos mRNA-proteínas (mRNPs) associados aos P-bodies bem como complexos mRNPs não associados a estas estruturas. Caracterizamos proteínas de mRNPs e mRNAs associados aos P-bodies a o outros complexos mRNP utilizando micro-arranjo de DNA e sequenciamento de última geração. Entre as proteínas de mRNP evidenciadas, caracterizamos uma proteína de ligação a RNA com motivo de dedo de zinco CCCH e os resultados indicam que dependendo do estado fisiológico da célula diferentes mRNAs encontram-se associados a esta proteína. O conjunto dos resultados mostra que a mobilização de mRNAs para os grânulos de RNA na forma de mRNPs é extremamente dinâmico, respondendo rapidamente às alterações de meio a que o parasita é submetido, portanto indicando que mRNPs não são partículas estáticas para mera estocagem e degradação de mRNAs mas que devem participar do fluxo e funcionalidade dos mRNAs na célula.

- Caracterização funcional de complexos mRNP em Trypanosoma cruzi e seu papel na modulação da expressão gênica do parasita, Proc. 478516/2010-0, Edital MCT/CNPq 14/2010 - Universal - Faixa C, R$140.000,00, Resp. Samuel Goldenberg. Projeto em andamento e visa caracterizar, utilizando análise proteômica e sequenciamento de

ácidos nucleicos em larga escala, proteínas e RNAs associados em complexos mRNP. - Caracterização funcional de complexos mRNP em Trypanosoma cruzi e seu papel na modulação da expressão gênica, Proc. 301730/2011-3, Edital Produtividade em Pesquisa - PQ – 2011, Nível 1A R$ 168.000,00, Resp. Samuel Goldenberg. Solicitação de bolsa de produtividade récem aprovada e com inicio em março de 2012. Visa

estudar os componentes proteico e de ácidos nucleicos de mRNPs de T.cruzi. - Estabelecimento de uma metodologia de indução da diferenciação de células tronco adultas à cardiomiócitos através do método de cultivo com meio condicionado por explantes cardíacos humanos para utilização em terapia celular cardíaca, CNPq, EDITAL - MCT/CNPq 14/2009 - Universal / Edital MCT/CNPq 14/2009 – Universal, R$ 27.000,00, Resp. Alejandro Correa Resultados: Foram identificados vários componentes solúveis presentes no meio condicionado de explantes cardíacos de coração humano, utilizando arranjos de anticorpos e 2D-Gel/espectrometria de massas. As células tronco adultas quando colocadas a crescer na presença do meio condicionado aumentaram a taxa de proliferação e expressaram marcadores típicos de cardiomiócitos.

- Isolamento, caracterização, ativação e diferenciação em linhagens mesenquimais de pericitos cardíacos humanos, CNPq, Edital Encomendas Papes/FIOCRUZ - Papes V, R$ 40.000,00, Resp. Alejandro Correa Resultados: Foi isolada uma população de células do músculo cardíaco humano positivas para Fosfatase Alcalina, possivelmente pericitos. Estas células mostraram características imunofenotípicas de células tronco mesenquimais e foram capazes de diferenciar nas três linhagens mesodérmicas (adipócitos, osteoblastos e condrócitos). A diferenciação desta população positiva para a Fosfatase Alcalina é mais eficiente que das células-tronco mesenquimais da medula ou tecido adiposo, pelo menos do ponto de vista molecular.

- Estabelecimento de uma metodologia de indução da diferenciação de células tronco adultas à cardiomiócitos através do método de cultivo com meio condicionado e com matriz tecidual para utilização em terapia celular cardíaca, Fundação Araucária, Projeto de Pesquisa para o SUS: Gestão Compartilhada em Saúde PPSUS – 2008/2009. Chamada de Projetos 08/2009, R$ 49.786,54, Resp. Alejandro Correa. Resultados: Foi padronizado um protocolo para isolamento de matriz extracelular de coração humano. Neste projeto estão sendo cultivadas células tronco adultas em meio condicionado de explantes cardíacos de coração humano em combinação com a matriz extracelular. Os resultados estão sendo analisados.

- Efeito das proteínas 1 e 2 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGFBP-1 e 2) sobre a atividade de células-tronco mesenquimais, CNPq, EDITAL MCT/CNPq N º 14/2010 – Universal, R$ 15.000,00, Resp. Marco A. Stimamiglio. Trata-se de projeto em desenvolvimento que tem como objetivos analisar funcionalmente o papel das proteínas IGFBP-1 e 2 nos processos de proliferação, citoproteção e diferenciação de células-tronco mesenquimais. Resultados preliminares indicam a possível modulação da proliferação das células-tronco através da adição de concentrações crescentes das proteínas IGFBP avaliadas. Por outro lado, não foram observadas até o momento diferenças na indução da morte celular nos cultivos de células-tronco sob o estímulo destas proteínas.

- Efeito das proteínas IGFBP-1 e 2 sobre a atividade de células-tronco mesenquimais, Fundação Araucária, Chamada de Projetos n º 14/2009 – Programa de Apoio à Pesquisa Básica e Aplicada, R$ 20.000,00, Resp. Marco A. Stimamiglio. Trata-se de projeto em desenvolvimento, iniciado em julho de 2010, que tem como objetivos analisar funcionalmente o papel do microambiente tecidual cardíaco e das proteínas IGFBP-1 e 2, presentes neste microambiente, na indução da diferenciação cardiomiogênica de células-tronco mesenquimais humanas. Resultados preliminares indicam a necessidade da associação de outras proteínas encontradas no meio condicionado pelo cultivo de explantes cardíacos para a indução da pré-diferenciação destas células-tronco - Imunobiologia farmacêutica na fase aguda da doença de chagas experimental: papel dos eicosanóides, Fundação Araucária (Vigência 2007-2009, R$ R$ 27.561,00), Resp. Phileno Pinge Filho. Neste projeto demonstramos que a ciclooxigenase e a 5-lipoxigenase estão envolvidas no controle da carga parasitária e contribuem para o desenvolvimento do estresse oxidativo de eritrócitos que ocorre na fase aguda da infecção por Trypanosoma cruzi.

- Impacto da biodisponibilidade de óxido nítrico por AINES-NO sobre os níveis

de citocinas pró-inflamatórias na cardiopatia chagásica experimental. CNPq

(2009-2010, R$ 20.000,00). Resp. Phileno Pinge Filho. Neste projeto demonstramos que a 5-lipoxigenase participa da produção de citocinas, óxido

nítico e expressão da óxido nítrico sintase (iNOS) no tecido cardíaco na fase aguda da infecção

por T. cruzi.

- Mecanismos de infecção por formas tripomastigotas metacíclicas do

Trypanosoma cruzi: participação da enzima óxido nítrico sintase constitutiva

(cNOS) e dos eicosanóides, Auxílio Financeiro da Fundação Araucária (2009,

R$ 37.775,00) Resp. Dr. Phileno Pinge Filho.

- Mecanismos de ativação e invasão de fagócitos mononucleares pelo

protozoário Trypanosoma cruzi: relações entre eicosanóides, óxido nítrico e c-

AMP, Auxílio Financeiro do CNPq, Edital Universal (2012, R$ 17.800,00),

Resp. Phileno Pinge Filho.

- Interação de células dendríticas humanas e vírus da dengue: papel do interferon tipo I e da maturação celular. Edital MCT/CNPq 14/2009 - Universal / Edital MCT/CNPq 14/2009 - Universal - Faixa A – R$ 14.000,00, Resp. Juliano Bordignon. Neste projeto foi demonstrado que cepas de DENV3 genótipo III são capazes de inibir a ativação da via de IFN tipo I o que possibilita sua maior replicação em células dendríticas (mdDCs), bem como, maior produção de citocinas inflamatórias. Adicionalmente, demonstrou-se que a ativação de mdDCs após a infecção protege as células da apoptose.

- Produção, caracterização e aplicabilidade de anticorpos monoclonais contra cepas de vírus dengue-1, -2 e -3 circulantes no Brasil. Chamada de Projetos 08/2010 Programa de Pesquisa para o SUS: Gestão Compartilhada em Saúde PPSUS – 2008/2009 – R$ 49.500,00, Reps. Juliano Bordignon. Foram desenvolvidos hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra cepas de DENV-1, -2 e -3 circulantes no Brasil. No momento estes anticorpos estão sendo caracterizados e avaliados quanto sua utilidade para o desenvolvimento de testes

imunoenzimático para diagnósitco da dengue. - Identificação da atividade anti-dengue e anti-inflamatória de oleos essências. Chamada de Projetos 14/2009 Programa de Apoio a Pesquisa Básica e Aplicada. RS 15.900,00, Resp. Juliano Bordignon. Neste projeto foi desenvolvido um teste ELISA in situ para triagem da atividade

anti-dengue de substâncias isoladas de óleos essencias. A concentração segura dos

compostos citral e timol foram determinadas por ensaios de MTT/vermelho neutro,

e no momento, esta sendo avaliada a atividade anti-dengue dos mesmos pelo teste

de ELISA in situ.

- Identificação e Produção de Marcadores Celulares de Endocitose e Exocitose em Trypanosoma cruzi (Euglenozoa: Kinetoplastea). CNPq, Edital Universal CNPq MCT / CNPq 14/2010 (Processo 471928/2010-0 ), Recursos: R$25.000,00 (Edital Universal, faixa B), Vigência: 01/10/2010 a 01/10/2012 Resp.: Maurilio José Soares Resultados obtidos, Artigo publicado no tema: Barboza NR, Cardoso J, Lima CVP, Soares MJ, Gradia DF, Hangai NS, Bahia MT, Lana M, Krieger MA, Sá RG. Expression profile and subcellular localization of HslV, the proteasome

related protease from Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology, 130: 171-177, 2012.

- Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC), Fundação Araucária

Convênio Protocolo 18602 Vigência: 01/09/2011 , Valor: R$ 36.000 Resp.

Bruno Dallagiovanna

Resultados: Dez bolsas de iniciação científica, em andamento.

- Caracterização de redes pós-transcricionais de regulação gênica em

Trypanosoma cruzi, CNPq Edital Universal 473828/2009-0, R$ 20.000 ,

03/08/2009- 2011, Resp. Bruno Dallagiovanna Resultados: Foram identificados os membros da família de proteínas RRM em T. cruzi.

Caracterizamos funcionalmente a proteína TcRBP40 específica de T. cruzi identificando a rede

gênica regulada por ela.

- Mecanismos da regulação pós-transcricionais da auto-renovação em células-

tronco mesenquimais humanas. Análise funcional das proteínas Pumilio2 e

DZIP1, Edital MCT/CNPq/CT-Saúde/MS/SCTIE/DECIT nº 17/2008 - Terapia

Celular, Valor: R$ 100.000, 09/2008 – 2010, Resp. Bruno Dallagiovanna Resultados: Foram identificadas as redes gênicas reguladas por Pumilio2 e DZIP1 e seu papel

no controle da proliferação celular e da diferenciação de MSCs.

- Identificação e caracterização funcional de RNAs associados aos homólogos de PABP (PABP1-3) em Leishmania, Edital Universal CNPq 14/2009 – Faixa A Processo número 474052/2009-5, Valor aprovado: R$ 20.000,00, Resp. Fabíola Barbieri Holetz Foi possível identificar grupos distintos de mRNAs que se associam às diferentes PABPs. Verificamos diferenças significativas nos mRNAs que se associam a proteína PABP1 daqueles que estão associados as proteínas PABP2 e 3 e não observamos diferenças entre os mRNAs associados as proteínas PABP2 e 3. A proteína PABP1 está associada aos RNAs que codificam, em sua maioria, proteínas ribossomais, enquanto as proteínas PABP2 e 3 associam-se preferencialmente a RNAs que codificam proteínas ligadoras de DNA, entre elas as histonas e proteína de ligação a minicírculos, além das proteínas enolase, RBP 5 e Hsp70 Estes dados corroboram a participação da proteína PABP1 no processo de tradução, e a participação das proteínas PABP2 e 3 no transporte de mRNAs do núcleo ao citoplasma.

- Identificação e caracterização funcional de mRNAs associados aos fatores eIF4E1-6 de iniciação da traduação em Trypanosoma brucei, FACEPE - Processo APQ-0090-2.13/09, R$ 33.000,00, 2009-2011, Resp. Fabíola Barbieri Holetz. Identificamos diferenças significativas nos RNAs que se associam aos fatores de início de tradução em T. brucei, corroborando resultados prévios do grupo, onde se sugere a existência de dois complexos de iniciação da tradução em tripanosomatídeos: um deles formado pelos fatores eIF4E3 e eIF4G4, e o outro formado pelos fatores eIF4E4 e eIF4G3, além das demais proteínas envolvidas no início deste processo.

- Expressão e Análise Molecular e Funcional de Proteínas Relacionadas a

Doenças Genéticas – Agência financiadora: CNPq (479779/2010-4), vigência

12/2010-11/2012. Valor R$ 35.000,00. Responsável: Nilson Zanchin

Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas humanas NIP7 e FTSJ3.

- Investigação dos Mecanismos de Síntese e Regulação da Função de

Ribossomos Associados a Doenças Genéticas e Proliferação Celular - Agência

financiadora: CNPq (473551/2008-0), vigência 01/2009-12/2010. Valor R$

30.160,00. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas SBDS, Septinas e ISG95 humanas

e do exossomo de RNA de Archaea.

- Análise Funcional de Proteínas Envolvidas em Síntese de Ribossomos e

Associadas a Doenças Genéticas - Agência financiadora: CNPq, 309215/2011-

0, edital produtividade em pesquisa nível 1C, vigência Março 2012-Fevereiro

2016, valor R$ 105.600,00. Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas SBDS e SPP1 humanas e do

exossomo de RNA de Archaea.

- Estudo da Estrutura de Proteínas Componentes e Reguladoras do Exossomo

de Archaea e de Levedura. Modalidade “Projeto Temático”. Agência

financiadora FAPESP 2010/51842-3 – FAPESP valor R$, 480.000,00, vigência

01/01/2011 a 31/12/2014. Responsável, Carla Columbano de Oliveira,

pesquisador participante: Nilson I. T. Zanchin.

Resultados obtidos: Caracterização funcional do exossomo de RNA de Archaea e de levedura.

- The NIP7 protein is required for accurate pre-rRNA processing in human cells.

Agencia FAPESP - 2011/00309-6 - Vigência, 01/03/11 a 31/08/11. Valor

R$ 5. 259,29. Responsável: Nilson Zanchin

Resultados obtidos: publicação de artigo na revista Nucleic Acids Research.

- Investigação dos Mecanismos de Síntese e Regulação da Função de

Ribossomos Associados a Doenças Genéticas e Proliferação Celular. Agência

financiadora: CNPq 304578/2008-8, edital produtividade em pesquisa nível 1D.

vigência Março 2008-Fevereiro 2011, valor R$ 79.200,00. Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas SBDS, Septinas e ISG95 humanas

e do exossomo de RNA de Archaea.

- Caracterização funcional de proteínas envolvidas no controle da expressão

gênica. Auxílio individual regular (FAPESP 06/02083-7), coordenador, vigência:

01/08/2006 – 29/02/2009. Valor R$ R$ 222.471,25 e US$ 57.160,00.

Responsável: Nilson Zanchin Resultados obtidos: Caracterização funcional das proteínas humanas NIP7, FTSJ3, SBDS,

Septinas e ISG95 humanas e do exossomo de RNA de Archaea. - Vigilância e caracterização molecular e sorológica de arbovirus circulantes na Argentina, Brasil, Paraguai, Uruguai e Venezuela, CAPES, R$150.000,00 (bolsas de longa duração, cooperação internacional), Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. - Desenvolvimento de testes imunoenzimáticos utilizando antígenos recombinantes para detecção de patógenos virais visando certificação sanitária de camundongos SPF. CNPq Edital Universal 2011, R$85.500,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Desenvolvimento de uma série de imunobiológicos para rápido diagnóstico de patógenos virais comuns em camundongos de biotério, visando certificação sanitária dos mesmos.

- Caracterização molecular de hantavírus e seus potenciais reservatórios:

Desenvolvimento de insumos e contribuições para programas de vigilância

epidemiológica no Estado do Paraná. PPSUS-Fundação Araucária, R$

99.945,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: identificação precisa de áreas de risco para os seres humanos, e na implementação de estratégias de controle desta zoonose no estado. Ademais, aumentará a nossa compreensão sobre os aspectos básicos da biologia desses agentes, contribuindo para a melhoria das técnicas de diagnóstico, e proporcionarão informações úteis para a concepção de vacinas e antivirais.

- Desenvolvimento e validação de insumos para diagnóstico e monitoramento

de arboviroses no Brasil, Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da

Saúde, R$ 158.000,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Desenvolvimento de insumos para o diagnóstico sorológico de febre amarela, Chikungunya e Encefalite de Saint Louis em amostras humanas.

- Produção de reagentes para kits de diagnóstico sorológico humano de IgM e IgG para hantavirose, CGLAB/ Ministério da Saúde, R$ 134.000,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Produção e distribuição de kits HANTEC EIA para o diagnóstico de infecções agudas e convalescentes por hantavírus em humanos.

- Manutenção dos Laboratórios de Referência da Fiocruz integrantes da Rede Nacional de Laboratórios de Vigilância Ambiental em Saúde, CGLAB – Ministério da Saúde, R$ 107.619,66, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Prestar serviço de referência no diagnóstico de infecções por hantavirus em amostras humanas e de roedores reservatórios

- Vigilância e caracterização molecular e sorológica de arbovirus circulantes na Argentina, Brasil, Paraguai, Uruguai e Venezuela, CAPES, R$150.000,00 (bolsas de longa duração, cooperação internacional), Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. - Hantaviroses e Arenaviroses no Brasil: Desenvolvimento de insumos para o diagnóstico rápido em roedores silvestres através da plataforma de cromatografia de fluxo lateral, PROBIO II – Banco Mundial, R$355.400,00, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Desenvolvimento de insumos para o diagnóstico sorológico rápido de hanta e arenavirus em roedores silvestres através da tecnologia de cromatografia de fluxo lateral.

- Interação vírus dengue e hospedeiro: busca por marcadores moleculares de virulência e análise da resposta imune antiviral nos hospedeiros vertebrados e invertebrados, PROCAD-CNPq, R$333.513,21, Resp. Claudia Nunes Duarte dos Santos. Resultados: Estudo da interação entre os vírus da dengue e o hospedeiro vertebrado e invertebrado, o papel dos componentes salivares do mosquito nessa interação, bem como mapear mutações no genoma viral envolvidas nas diferenças de estimulação da resposta

imune.

- Candida spp. isoladas de mucosa bucal de pacientes portadores de HIV:

determinação dos fatores de virulência, formação de biofilme e sensibilidade

aos antifúngicos, PPSUS – 2008/2009 Fundação Araucária, R$ 81.291,85,

Resp. Sueli Fumie Yamada Ogatta. Resultados:Neste projeto foram isoladas 123 leveduras do gênero Candida que foram caracterizadas quanto à sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e nistatina, e à expressão de fatores de virulência. Esses isolados foram utilizados para seleção de substâncias de origem natural quanto a atividade antifúngica, principalmente antibiofilme. Os resultados geraram uma dissertação de mestrado e dois trabalhos que serão submetidos para publicação.

- Phytomonas serpens: caracterização do gene que codifica proteina P

ribossomal e sua participação na reatividade antigênica com Trypanosoma

cruzi. Programa de Apoio à Pesquisa Básica e Aplicada, Fundação Araucária,

R$ 24.896,00, Resp. Sueli Fumie Yamada Ogatta. Resultados: Os resultados parciais deste projeto permitiram a caracterização do gene que codifica a proteína P ribossomal de Phytomonas serpens.

- O uso de células-tronco mesenquimais autólogas da medula óssea no tratamento de lesões da cartilagem articular. Nº 461/2010/14939 financiado pela Fundação Araucária. Resp. Alexandra Cristina Senegaglia. Valor: R$ 17.567,86. Resultados: O projeto encontra-se na sua fase inicial, até o momento foram validadas as técnicas e selecionados os candidatos em potencial para participar do ensaio clínico. Ainda este ano pretendemos realizar os isolamento/expansão das células mesenquimais da medula óssea dos pacientes e proceder com as infusões.

- Avaliação da interface osso/implante em mandíbula de miniporcos irradiados

e o uso de células tronco na osseointegração. Nº 461/2010/15658 financiado

pela Fundação Araucária. Resp.: Carmen Lúcia Kuniyoshi Rebelatto Valor: R$

19.861,00. Resultados: Neste estudo foi realizada a padronização do isolamento e cultivo das células-

tronco mesenquimais de miniporcos BR-1. Esta primeira parte do estudo “Characterization and

in vitro differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of Brazilian

minipig. A protocol for basic research and tissue engineering” foi submetida para publicação no

periódico International Journal of oral Science. Serão realizadas as análises histológicas dos

implantes dentários dos animais que receberam transplante de células-tronco e será avaliado a

influência destas células na osteointegração.

2 – Sobre o Coordenador e Pesquisadores Principais

a- Experiência e competência comprovada e compatíveis com o Projeto;

O coordenador da proposta é pesquisador 1A do CNPq desde 1988 e tem

ampla experiência na coordenação de projetos tendo coordenado projetos

individuais nas diferentes agências de fomento do país (CNPq , PADCT e

FINEP), agências de fomento regionais (FAPERJ e Fundação Araucária), foi

“Pesquisador do nosso Estado” (FAPERJ), coordenou projetos individuais

Internacionais (Organização Mundial da Saúde, três projetos incluindo um

Research Strengthening Grant), coordenou projetos de cooperação

internacional (CAPES-COFECUB, CABIO-CBAB, DAAD, Amsud, Pasteur-

Fiocruz, Fiocruz-CNRS, Fiocruz-Inserm), coordenou projetos em rede nacionais

em rede destacando-se dois projetos do Pronex (um nacional no primeiro edital

do CNPq e outro pela Fundação Araucária), um projeto da rede Genoma

Nacional do CNPq e atualmente coordena o INCT Para Diagóstico em Saúde

Pública, um dos dois INCTs instalados no Estado do Paraná. Os

pesquisadores principais também têm experiência comprovada como pode ser

observado pelo grande número de publicações, orientações e captação de

recursos, sendo alguns bolsistas de produtividade do CNPq (Claudia Nunes

Duarte dos Santos, Bruno Dallagiovanna, Maurilio José Soares, Nilson

Zanchin).

b- Vínculo dos pesquisadores:

Os pesquisadores são tanto vinculados à Fiocruz, seja como servidores do

Sistema Jurídico Único (Samuel Goldenberg, Claudia Nunes Duarte dos

Santos, Bruno Dallagiovanna, Alejandro Correa, Juliano Bordignon, Maurilio

José Soares), servidores terceirizados da Fiocruz (Fabiola Barbieri Holetz) ou

servidores récem concursados aguardando posse (Nilson Zanchin, Lysangela

Ronalte Alves e Marco Augusto Stimamiglio). Dois pesquisadores principais

são professores da Universidade Estadual de Londrina (Sueli Fumie Yamada-

Ogatta e Phileno Pinge Filho), dois pesquisadores são professores da PUCPR

(Carmem Rebelatto, Alexandra Senegaglia) e os pesquisadores colaboradores

são servidores da Embrapa (Francisco Lobo), Instituto Pasteur de Montevideu

(Hugo Naya) e Instituto Clemente Estable do Uruguai (Jose Sotello-Silveira).

c- Qualidade e regularidade da produção científica

Os pesquisadores principais apresentam em seus curricula publicações

regulares em periódicos de impacto reconhecido. Várias destas publicações

envolvem as principais técnicas que serão utilizadas para o desenvolvimento

do presente projeto e os modelos experimentais aqui utilizados (Trypanosoma

cruzi, vírus dengue, células dendriticas, células tronco)

d- Experiência prévia na formação de pesquisadores:

A capacidade dos pesquisadores participantes desta proposta em formar

recursos humanos é inconteste haja vista o grande número de dissertações e

teses orientadas, além de orientações de iniciação científica e pós-doutorado.

É importante mencionar que o projeto descrito nesta proposta tem um grande

potencial para a formação de recursos humanos, dando continuidade a este

importante processo.

e- Experiência de intercâmbio com instituições e pesquisadores do Brasil e

de outros países

Vários dos pesquisadores participantes desta proposta participaram de projetos

e redes de cooperação internacional e algumas destas cooperações ainda

estão em vigência, notadamente com pesquisadores do Instituto Pasteur de

Montevidéu. É nosso objetivo buscarmos fonte de financiamento com a

Universidade de Lund na Suécia em vista de estreitarmos colaboração para o

estudo de microRNAs e seqüenciamento envolvendo a plataforma Ilumina. O

coordenador da presente proposta coordenou vários projetos de cooperação

internacional, organizou cursos internacionais e congressos e workshops

envolvendo a participação de pesquisadores de outros países.

3 – Sobre a Equipe Técnica e de apoio:

a- Qualificação dos técnicos de apoio

Os técnicos são bem treinados e conhecem bem a rotina do trabalho. Grande

parte dos técnicos tem curso superior e três tecnologistas (todos com pós-

graduação) ocupam-se da operação e manutenção dos equipamentos mais

sofisticados (os citômetros Facs Aria e Canto, o seqüenciador SoLID IV e o

espectrômetro de massas Orbitrap funcionam como plataformas tecnológicas e

têm técnicos que auxiliam na sua operação) . É importante ressaltar que como

a maior parte das técnicas estão bem estabelecidas, as mesmas são de

domínio do pessoal técnico.

b- Nível e fonte de financiamento dos estudantes e estagiários

Os estudantes e estagiários são financiados com bolsas do CNPq, CAPES,

Fundação Araucária e Fundação Oswaldo Cruz. Tanto o ICC como a UEL e a

PUCPR têm cursos de pós-graduação e atividades de PIBIC em suas

respectivas sedes e por consequência disponibilidade de bolsas.

c- Perfil de pessoal a ser eventualmente recrutado para o Núcleo

O pessoal a ser recrutado são estudantes nos diferentes níveis (iniciação

científica, pós-graduação e pós-doutorado) e o recrutamento será feito de

acordo com a dinâmica do projeto. Vale ressaltar que já existe o envolvimento

de estudantes e estagiários no projeto, mas em vista da riqueza e da

potencialidade desta proposta outros ingressos realizar-se-ão ao longo dos 36

meses de execução.

4- Sobre o conteúdo do projeto:

PROJETO: ESTUDO DO PAPEL DE GRÂNULOS DE RNA E DE

EXOSSOMOS NA INTERAÇÃO PATÓGENO-HOSPEDEIRO

a- Coerência temática, foco e articulação das atividades propostas

As atividades de pesquisa propostas serão centradas nos modelos biológicos

já utilizados pela equipe nos seus estudos mas novas perguntas serão

abordadas neste projeto. O Trypanosoma cruzi tem sido estudado pela equipe

há quase 30 anos (mais de 85 publicações), havendo o interesse no estudo

dos mecanismos de diferenciação deste parasita e nos mecanismos de

regulação da expressão gênica. Mais recentemente foram realizados estudos

relativos à caracterização de grânulos de RNA e proteínas associadas na

modulação da expressão gênica em T. cruzi. Os conhecimentos adquiridos

com os estudos de grânulos de RNA e a percepção da ubiquidade desses

grânulos na regulação da expressão gênica em eucariotos leva-nos ao estudo

dos mesmos em células tronco, outro importante modelo de estudo por

membros da equipe. A proposta aqui apresentada é bastante original pois

embora existam vários relatos na literatura sobre grânulos de RNA, nada existe

sobre os mesmos nas células tronco e de que maneira regulam o programa de

diferenciação destas células. De maneira análoga, estudos com vírus dengue

(mais de 15 publicações) demonstram a proficiência da equipe com este

modelo biológico e um dos aspectos originais desta proposta é a realização de

estudos referentes à presença e papel de grânulos de RNA utilizando este

modelo biológico.

Atividades de pesquisa envolvendo exossomos são um componente novo nas

atividades da equipe, mas resultados preliminares já levaram ao

estabelecimento da metodologia para isolamento e análise dos exossomos (o

projeto de tese da doutoranda Sharon Martins Toledo trata do estudo de

exossomos em células dendriticas infectadas e não infectadas com vírus

dengue). O conjunto de atividades, estudos de caracterização biológica e

funcional de grânulos de RNA e de exossomos em células tronco e células

dendriticas, infectadas ou não com os patógenos T.cruzi e vírus dengue,

permitirá a geração de novos conhecimentos para a melhor compreensão dos

mecanismos de patogênese e de regulação da expressão gênica nos modelos

estudados.

b- Estado atual de conhecimentos no domínio da pesquisa

1 - Grânulos de RNA

Nas células eucarióticas, a regulação da expressão gênica ocorre em

diferentes níveis e os mecanismos pós-transcricionais têm um papel crucial no

desenvolvimento, diferenciação e sinalização celular. A biogênese e a

funcionalidade de uma determinada molécula de RNA mensageiro (mRNA)

depende da ação de um conjunto de proteínas ligadoras de RNA (RNA binding

proteins) que participam de todas as etapas de processamento do transcrito

desde o capeamento, passando pelo splicing, a poliadenilação, a exportação

nuclear, a associação com ribossomos e em última etapa a degradação.

Proteínas específicas ligam-se às moléculas de mRNA e a dinâmica da

interação está diretamente associada à funcionalidade dos mRNAs na célula. A

combinação única de fatores que acompanham um mRNA específico, bem

como suas posições relativas neste transcrito, determinam o destino deste

mRNA no citoplasma, ou seja, tradução, estocagem para posterior tradução ou

degradação (Moore, 2005). Em células de mamíferos, os RNAs que não estão

sendo traduzidos, ou aqueles que estão destinados para a degradação, são

compartimentalizados em estruturas citoplasmáticas distintas denominadas

genericamente de “Grânulos de RNA” que podem ser classificados em

Processing bodies (P-bodies) e grânulos de estresse (GS), em função da

presença de proteínas específicas, e têm papel fundamental na regulação pós-

transcricional da expressão gênica. Os grânulos de estresse e P-bodies são

estruturas citoplasmáticas dinâmicas que participam ativamente no

metabolismo de RNA determinando o destino de mRNAs não envolvidos na

maquinaria de tradução, seja mantendo-os estabilizados, seja levando-os às

vias de degradação. Estas partículas por serem espacialmente e

funcionalmente ligadas, apresentam semelhanças, por exemplo, ambas são

induzidas por estresse e contém mRNAs não traduzidos provenientes da

dissociação dos polissomos (Kedersha & Anderson, 2002; Sheth & Parker,

2003; Teixeira et al., 2005; Holetz et al., 2007). Entretanto, estes grânulos

também diferem em vários aspectos, entre eles podemos ressaltar que

somente os P-bodies são observados em células em fase exponencial de

crescimento e em células não submetidas a estresse. Além disso, o estresse

induzido pela fosforilação do fator de tradução eIF2α afeta somente a formação

dos grânulos de estresse e não tem efeito sobre os P-bodies . De forma geral,

os grânulos de estresse são definidos pela presença de fatores de iniciação da

tradução enquanto os P-bodies são definidos pela presença de componentes

da maquinaria de degradação. Vários estudos, utilizando diferentes modelos,

como por exemplo, células de mamíferos, leveduras e protozoários, têm

revelado que muitas proteínas e RNAs com funções celulares distintas estão

integrados com os grânulos de RNA, indicando que as funções destas

estruturas vão além da triagem de mRNAs entre a tradução e a degradação

(Anderson & Kedersha, 2006; Anderson & Kedersha, 2007; Holetz et al., 2010).

Resultados recentes e ainda não publicados por membros de nosso núcleo

demonstraram que em células tronco adultas ocorre um aumento significativo

de grânulos que contém a proteína TIA-1 (marcadora de grânulos de estresse),

quando comparadas com as células diferenciadas, mesmo na ausência de

estresse. Este dado é mais um indicativo da diversidade de atuação e da

importância destas estruturas na modulação da expressão gênica, ressaltando

a necessidade de se ampliar os estudos acerca da dinâmica de formação e da

composição destes grânulos em diferentes tipos celulares, como também frente

a diferentes situações biológicas enfrentadas pelas células.

Adicionalmente, alguns estudos indicam que proteínas de grânulos RNA

podem favorecer ou limitar uma infecção viral e que determinados vírus

interagem com estas proteínas utilizando diferentes mecanismos para

manipular a montagem destas estruturas na célula hospedeira (Li et al., 2002).

Por exemplo, o vírus West Nile (WNV) codifica um RNA contendo uma

estrutura em forma de stem-loop que interage com a proteína TIAR, uma

proteína presente nos grânulos de estresse (Anderson & Kedersha, 2007; Li et

al., 2002). Durante a infecção, TIAR é seqüestrada em grânulos de replicação

viral e a montagem dos grânulos de RNA é inibida na célula hospedeira (Emara

& Brinton, 2007). Neste mesmo estudo, foi demonstrada uma redução do

número de P-bodies nas células infectadas com WNV e com o vírus da

Dengue, sendo postulado que a interferência dos flavivírus na montagem dos

grânulos de RNA beneficia a replicação viral por impedir a repressão

traducional das proteínas da célula hospedeira, através da inibição da

formação dos grânulos de estresse, e por proteger o RNA viral da degradação,

através da redução do número de P-bodies . Em contraste com os flavivirus, o

poliovirus e o SFV (Semliki Forest Virus) interagem com proteínas dos grânulos

de estresse utilizando estas estruturas para favorecer a repressão traducional

das proteínas celulares e a replicação viral (McInerney et al., 2005). Estes

estudos demonstraram que além das proteínas e RNAs virais, proteínas de

defesa antiviral da célula hospedeira também se acumulam nestes grânulos.

Mediante o exposto, fica evidente que os grânulos de RNA presentes nas

células hospedeiras, não atuam somente no controle da degradação,

estocagem ou tradução de seus próprios mRNAs, mas participam ativamente e

seletivamente no mecanismo de defesa da célula frente a uma situação

patológica.

Com base nos dados publicados na literatura, pode-se especular que

grânulos de RNA estejam envolvidos na modulação da resposta imunológica

em virtude de uma infecção viral. Neste caso, não é novidade que existe uma

extensa modulação de genes da célula hospedeira. Resultados recentes do

nosso grupo demonstraram que a infecção do sistema nervoso central (SNC)

de camundongos por cepas neuroadaptadas de DENV-1 induz a modulação de

genes da imunidade inata com atividade antiviral estimuladas por IFN-I (ISGs).

No entanto, esta resposta antiviral não é suficiente para conter a infecção, e os

animais desenvolvem encefalite e morrem dentro de duas semanas. Os

principais genes modulados são: genes da família OAS (Oligoadenilato

sintetase, que funciona como uma RNAseL degradando RNA no citoplasma);

família de genes de resistência a Mixovírus (Mx1 e 2), IFIT, Usp18, MHC-I e II

(apresentação de antígenos), entre outros. Além dos genes com atividade

antiviral observam-se também genes inflamatórios, como as quimiocinas

quimioatrativas, Ccl4, Ccl5, Cxcl10, Ccl9, entre outros (Bordignon et. al., 2008).

Da mesma forma, os experimentos realizados ex vivo utilizando células

dendríticas derivadas de monócitos humanos (mdDCs), confirmaram a extensa

modulação de genes da resposta antiviral estimulada por IFN-I, receptores de

imunidade inata (toll like), e apresentação de antígenos. Alguns genes super-

expressos na infecção por DENV-3 são: APOBEC, IFIT, OAS, MX, STAT1 e 2,

CCL8, CXCL10, ISG15 e 20, HERC, e os suprimidos são: CD177, CCL3,

CD180, CLEC6A (receptor envolvido na patogênese da dengue), entre outros

(Silveira et al., 2011). Neste caso novamente foi observado que a super-

expressão de genes com atividade antiviral não foi capaz de conter a infecção

e o mecanismo de evasão viral por DENV-3 em mdDCs permanece

desconhecido. Sabe-se que alguns flavivirus bloqueiam a sinalização por

receptor de reconhecimento de padrão (PRRs), e desta forma, escapam do

sistema imune.

Recentemente, foram isoladas por um dos laboratórios do núcleo, duas

cepas de DENV-3, uma do genótipo III e outra do V, apresentando

comportamentos bastante distintos nestas células, o do genótipo III (mais

patogênico) inibe a via de sinalização de IFN-I por impedir a fosforilação da

STAT1, ao contrário do genótipo V, menos patogênico, que ativa a via, e

modula a expressão de muitos genes, não se replicando de forma eficiente.

Este exemplo corrobora os dados obtidos recentemente pelo grupo em

camundongos nocaute para IFN-I, que mostram que a resposta de IFN-I é vital

para o controle da infecção por dengue. No entanto, o que faz com que

algumas cepas bloqueiem esta via ou ainda, ativem esta via, mas escapem da

resposta por ela induzida, permanece obscuro, o que estimula a investigação

do envolvimento de grânulos de RNA durante a resposta do hospedeiro.

Embora existam estudos demonstrando a interação de proteínas e RNAs

virais com proteínas de P-bodies e grânulos de estresse, nada se conhece

acerca da dinâmica de formação e a composição destes grânulos em células

de mamíferos infectadas com outros organismos patogênicos.

Esta proposta científica é inédita e propomos investigar como os grânulos de

RNA presentes nas células humanas poderiam modular a expressão gênica e

interagir com moléculas virais, e proteínas celulares da resposta imune inata,

influenciando o mecanismo de defesa das células frente a uma situação

patológica. Neste estudo serão utilizadas como modelo células apresentadoras

de antígenos (células dendríticas) e células tronco humanas infectadas com

diferentes patógenos. A inclusão de células tronco deve-se ao fato de que a

geração de conhecimento para a caracterização funcional de células tronco é

primordial no avanço das pesquisas visando à aplicação terapêutica destas

células. Os patógenos utilizados para a infecção das células serão o

protozoário T. cruzi e o vírus da Dengue, como explicitado anteriormente.

2 – Exossomos

Exossomos são pequenas vesículas contidas por membrana (30 a

100nm) e de origem endocítica que as células eucarióticas secretam no meio

extracelular. Foram inicialmente descritas como vesículas para a eliminação de

receptor de ferritina em reticulócitos (Harding et al., 1983) e só depois foram

descritas de maneira mais ubiquitária. O exossomos são formados através de

brotamento de endossomos tardios formando corpos multivesiculares

(multivesicular bodies, MVB) e são liberados no meio após a fusão destes MVB

com a membrana plasmática. Embora descritos inicialmente em reticulócitos,

exossomos foram posteriormente descritos em linfócitos B (Raposo et. al.,

1996), tendo um papel na apresentação de antígenos e consequentemente na

indução de resposta de linfócitos T. Desde então, exossomos foram descritos

em vários tipos celulares incluindo células tumorais (Taylor & Gercel-Taylor,

2011), células tronco mesenquimais (Lai et al., 2011, Huang et al., 2012),

células endoteliais (Dignat-George & Boulanger, 2011) e também em diferentes

fluidos biológicos como plasma, urina, saliva, líquido amniótico, etc (Simpson

et. al., 2009). Além de mediarem a comunicação intercelular, os exossomos

também estão envolvidos em enfermidades como câncer e doenças

degenerativas (Ludwig & Giebel B, 2012).

A composição protéica dos exossomos é variável de acordo com o tipo

celular do qual se originam (Simpson et. al., 2009). No entanto, existe um

núcleo de proteínas que são comuns a diferentes exossomos derivados de

células dendríticas, linfócitos B e células epiteliais intestinais. Dentre essas

proteínas comuns, estão aquelas associadas com a biogênese do exossomo,

adesão celular e fusão de membranas (como anexinas e proteínas Rab),

transdução de sinal, proteínas do citoesqueleto (como actina e tubulina). Os

exossomos apresentam também um conteúdo enriquecido em colesterol,

esfingomielina e GM3, que estão envolvidos na manutenção dos

microdomínios lipídicos que são essenciais na interação entre as células

(Février e Raposo, 2004; Li et al., 2006). As proteínas associadas à transdução

de sinal mais comumente encontradas são as proteínas-quinase, proteínas G

heterotriméricas, HSP70 e HSP90. Exossomos possuem ainda moléculas MHC

classe I e tetraspaninas, sendo que os membros CD3, CD63, CD9, CD81 e

CD82 são os mais encontradas nos exossomos. Acredita-se que essas

tetraspaninas interajam com integrinas e MHC classe II, e ainda participem na

ativação celular dos exossomos (Février e Raposo, 2004; Li et al., 2006). As

proteínas que compõem os exossomos são selecionadas por uma série de

proteínas que se ligam à ubiquitina, chamadas Vps (vacuolar protein sorting),

que constituem o complexo proteíco ESCRT 0, I, II e III (Complexo endossomal

de escolha protéica para o transporte) (Bishop, 2003; Vella et al., 2008).

Uma característica dos exossomos é que eles podem ser transferidos

entre diferentes tipos de células dendríticas e linfócitos B (Février e Raposo,

2004). Podem também estar associados à indução de respostas anti-tumorais.

Exossomos derivados de células dendríticas sensibilizadas com peptídeos

tumorais foram capazes de ativar respostas anti-tumorais mediadas por células

T citotóxicas, levando à regressão de tumores em modelos animais. Essas

observações levaram a estudos que tentam utilizar os exossomos como

imunoterapia para tratamento do câncer (Azevedo, 2007; Mignot et al., 2006).

Foi ainda demonstrado que os exossomos podem induzir tolerância

imunológica. Células epiteliais intestinais secretam exossomos em condições

inflamatórias, carregando MHC II na circulação. Esses exossomos, juntamente

com as células T CD4+ regulatórias, essenciais para a indução e manutenção

de tolerância periférica a antígenos do conteúdo intestinal (Li et al., 2006). As

plaquetas também secretam exossomos ricos em CD63, e são provavelmente

liberados no local da injúria vascular, podendo funcionar no ambiente direto de

adesão plaquetária (Denzer et al., 2000).

Recentemente foi descrito que os exossomos podem transferir proteínas

entre células sem a necessidade de contato direto entre as mesmas, e gerar

diferentes estímulos biológicos. Exossomos derivados de células dendríticas

podem modular a imunidade de células T (Li et al., 2006), além de produzirem

respostas anti-inflamatórias, resultando na diminuição de doenças auto-imunes

em modelos animais (Bianco et al., 2007; Kim et al., 2007). Estudos

demonstraram o papel dos exossomos no tráfego do vírus HIV (Loomis et al.,

2006), bem como no tráfego de proteínas neurodegenerativas, como príon

(Vella et al., 2007) e precursores mielóides (Rajendran et al., 2006). Esses

dados recentes da literatura indicam que as células utilizam os exossomos para

comunicação entre si em situações patológicas, fornecendo uma nova rota de

comunicação celular e possivelmente de disseminação de um patógeno (Cho

et al., 2005).

3- Células dendriticas

As células dendríticas (DCs) foram isoladas na década de 1970 do baço

de camundongos, apresentando uma morfologia semelhante a dêndritos

neuronais e aderência ao vidro, assim como os macrófagos (Steinman e Cohn,

1973). Atualmente, estas células são conhecidas como as principais células

apresentadoras de antígenos (APCs), realizando o mapeamento do ambiente

em busca de antígenos estranhos, os quais quando encontrados são

capturados, processados e apresentandos aos linfócitos. Desta forma, as DCs

são fundamentais na ativação da resposta imune adaptativa (Banchereau et al.,

2000). Além da ativação da resposta imune adaptativa, recentemente, outras

funções têm sido atribuídas às DCs, como o controle da migração de linfócitos

aos linfonodos (Moussin e Girard, 2011). As células dendríticas (DCs) formam

uma população heterogênea de células que apresentam subtipos com

diferenças no fenótipo de superfície, função e localização (Shortman e Naik,

2007). As células dendríticas respondem com plasticidade a diversos estímulos

endógenos, como citocinas, mediadores inflamatórios, neuropeptídeos e

hormônios. As modificações decorrentes de tais estímulos e a ampla

distribuição pelos tecidos têm levado a uma classificação ainda mais complexa

das DCs, que podem ser subdivididas com base em características fenotípicas,

de migração, presença na inflamação, estágios de desenvolvimento, entre

outros. Os estágios de desenvolvimento, por exemplo, fazem a distinção entre

células denominadas pré-DCs, DCs imaturas e DCs ativadas (Steinman, 1991;

Naik, 2008). As células plasmacitóides são exemplos de pré-DCs, pois

precisam de estímulo (vírus, bactérias) para apresentar a forma e a função

típicas de células dendríticas. Estas células têm como característica peculiar a

capacidade de produzir grandes quantidades de interferons do tipo I (O’Keefe

et al., 2002).

Baseando-se nestes aspectos as DCs representam atualmente as

células de escolha para estudos de patogênese de agentes infecciosos,

resposta a vacinas, câncer e outras doenças imuno-mediadas (Kooten et al.,

2011; Silveira et al., 2011; Hayden et al., 2009; Palucka et al., 2011).

Adicionalmente, a imunoterapia baseada em células dendríticas vem ganhando

importância, especialmente no desenvovlimento de vacinas anti-tumorais,

aumentando a importância dessas células para a imunologia e a medicina

(Hayden et al., 2009).

3.1 - Células dendriticas e dengue

Na infecção pelo vírus da dengue, as células dendríticas (DC), mais

especificamente as células de Langerhans da pele, representam o alvo

primário da infecção pelo vírus (Wu et al., 2000). Foi demonstrado que DCs

ativadas após a infecção pelo vírus dengue secretam fator de necrose tumoral

alfa (TNF-α), interferon (IFN) tipo I (alfa/beta) e IFN-γ, além de expressarem

marcadores de maturação como o HLA-DR, CD11b e CD83 (Libraty et al.,

2001). Enquanto o IFN tipo I pode conter diretamente a disseminação viral

(Umareddy et al., 2008), a produção de citocinas e a maturação das DCs são

fundamentais para a estimulação de linfócitos T DENV-específicos. Deste

modo, pode-se dizer que as DCs são responsáveis por iniciarem a resposta

imune adaptativa contra o DENV, bem como, constituem a primeira linha de

defesa contra a infecção (Wu et al., 2000; Navarro-Sánchez et al., 2005).

Finalmente, diferenças na capacidade das DCs em controlar a infecção podem

estar relacionadas com a variabilidade na patogenia da dengue (Navarro-

Sanchez et al., 2005; Silveira et al., 2011).

É importante mencionar que a resposta de DCs na infecção pelo DENV

também podem contribuir para a febre hemorrágica. Foi demonstrado por

Luplertlop e colaboradores (2006) que as DCs produzem metaloproteinases -9

e -2 (MMP-9 e MMP-2) após a infecção pelo DENV de forma dose-dependente.

MMP-9 e MMP-2 aumentam a permeabilidade endotelial através da redução na

expressão de PECAM-1 e VE-caderina, além da redistribuição das fibras de

actina F (Luplertlop et al., 2006).

Ainda mais, o número absoluto de células dendríticas plasmocitóides e

mielóides mostrou-se reduzido no sangue periférico de indivíduos infectados

com DENV em comparação aos controles saudáveis. Apesar disso, não foi

observado diferenças significativas no número de DCs em pacientes com febre

da dengue e febre hemorrágica da dengue. Além disso, a viremia não foi

correlacionada com a severidade da doença, apesar de mostrar relação com a

redução de DCs plasmocitóides e mielóides no sangue, isto é, quanto maior a

viremia menor o numero de DCs, sugerindo um importante papel das DCs no

controle inicial da viremia pelo DENV (De Carvalho et al., 2011).

Finalmente, as DCs contribuem para a eliminação direta do vírus, ou

ainda para a estimulação de linfócitos T e B DENV-específicos. Por outro lado,

sabe-se que sub-produtos da infecção das DCs pelo DENV podem contribuir

para a hemorragia observada na dengue hemorrágica. Desta modo, em virtude

deste duplo papel na infecção pelo DENV, bem como, no seu importante papel

na resposta imune inata e adaptativa, as DCs constituem em um importante

modelo para estudo da patogenia da dengue.

3.2 – Células dendríticas e doença de Chagas

A doença de Chagas, descoberta e descrita por Carlos Chagas há mais

de 100 anos ainda é um grave problema de saúde pública afetando uma

população superior a 10 milhões de indivíduos na America Latina. O primeiro

mecanismo de resistência à infecção por T. cruzi é a fagocitose. As formas

tripomastigotas metacíclicas replicam-se dentro dos macrófagos, e embora

muitos parasitas acabem destruídos dentro dos vacúolos fagocíticos, as formas

que evadem conseguem se multiplicar no citoplasma como amastigotas. Os

macrófagos não ativados controlam a infecção se a razão parasitas/célula

infectada for 5:1, no entanto os macrófagos são destruídos se forem infectados

na razão 10:1 (Kress et al., 1975).

Fatores associados à imunidade inata como citocinas, proteínas

catiônicas, transferrinas e proteínas do sistema complemento são responsáveis

pela lise do protozoário, resistência à infecção e redução da carga parasitária.

Semelhante a resposta às infecções virais e de outros protozoários, a infecção

por T. cruzi induz a expressão de interferons (IFN) e outras citocinas

produzidas por fagócitos mononucleares e células natural killer (NK) (Hatcher &

Kuhn, 1982).

Os níveis de interferons sérico estão correlacionados com a atividade de

células NK do baço durante a infecção por T. cruzi em modelo murino (James

et al., 1982). Inoculação diária de interferons aumenta a resistência de

camundongos infectados com T cruzi quando comparados aos animais

inoculados com placebo. Estes achados sugerem que a atividade das células

NK induzidas por IFN- é responsável pela resistência e sobrevivência dos

animais infectados (Hatcher & Kuhn, 1981; Hatcher et al., 1981; Sanderson et

al., 1977). No entanto, citocinas não afetam diretamente a viabilidade,

motilidade, infectividade e virulência dos parasitas (James et al., 1982;

Kierszenbaum & Sonnenfeld, 1982).

A imunidade protetora à infecção por T cruzi parece ser dependente de

linfócitos T CD4 e CD8 secretores de IFN- (de Alencar et al., 2009; Rodrigues

et al., 2009). No entanto, a geração de células T CD8 parasita-específicas não

é afetada na ausência de sinalização via IFN do tipo I (Bixby & Tarleton,, 2008;

Martin et al., 2010). Por sua vez, o papel das células T reguladoras parece ser

limitado na infecção por T cruzi (Sales et al., 2008). Vale ressaltar que os

diferentes estágios de infecção, aguda e crônica, parecem estar sob diferente

regulação de interações complexas entre o patógeno e as células hospedeiras,

consequentemente, vários padrões de ativação de células do sistema imune

influenciam a produção de citocinas e o equilíbrio parasita-hospedeiro (Goronzy

& Weyand, 2009).

A participação de células T CD4 (Th1) é essencial na resposta imune ao

T. cruzi, uma vez que recrutam e ativam outras células da resposta imune,

como macrófagos, células B, mastócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos e os

próprios linfócitos T CD8 (Sanderson & de Souza, 2009). Porém, a

sobreposição de células produtoras de citocinas tanto do padrão Th1 quanto do

padrão Th2 em ambos os estágios da progressão da infecção por T.cruzi

demonstram não haver um padrão dominante de produção das mesmas

(Zhang & Tarleton, 1996).

Células dendríticas são reconhecidas como células apresentadoras de

antígeno profissionais responsáveis pelo início da resposta imune devido à

capacidade de reconhecer PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns)

(Manickasingham et al., 2003). Porém, diferentes estudos demonstraram que a

infecção por T. cruzi desencadeia mecanismos reguladores capazes de reduzir

a resposta imune (Abrahamsohn & Coffman, 1995; Kierszenbaum et al., 1999;

Tarleton, 1991). Em modelos murinos foi demonstrado que a infecção com T.

cruzi regula negativamente a expressão de moléculas MHC de classe II e de

moléculas coestimuladoras assim como prejudicam a capacidade de células T

estimularem células dendríticas do baço (Alba Soto et al., 2003). Experimentos

in vitro com tripomastigotas (forma infectiva do T.cruzi), vivos ou mortos por

aquecimento, adicionados de LPS (lipopolissacarídeo) induzem propriedades

tolerogênicas com produção de altos níveis de IL-10 e inibição da capacidade

das células apresentadoras de antígenos em induzir linfoproliferação (Poncini

et al., 2008; Poncini et al., 2010). Além disso, foi demonstrado que o aumento

na produção de IL-10 pelas DCs é independente de TLR2 e envolve interações

parasita-DC via TLR4 ainda não caracterizadas (Poncini et al., 2010).

A produção de IL-10 na infecção com T. cruzi parece modular a função

das DCs através de mecanismos que resultam em estimulação da resposta

imune insuficiente para a erradicação do parasita. Desta forma, estratégias que

reduzam esta modulação podem ser essenciais no desenvolvimento da

imunidade protetora contra T. cruzi (Alba Soto et al., 2010).

4 - Células-Tronco Mesenquimais

As células tronco mesenquimais (CTMs) são células indiferenciadas,

auto-renováveis, com alta capacidade proliferativa e que podem diferenciar-se

em linhagens celulares maduras como osteócitos, adipócitos e condrócitos

(Dominici et. al., 2006). Estas células podem ser isoladas de diversos tecidos

adultos, dentre eles a medula óssea e o tecido adiposo (Rebelatto et. al.,

2008). Acredita-se que as CTMs presentes nos tecidos adultos sejam capazes

de se diferenciar nas linhagens celulares de seu tecido de origem como forma

de manutenção da integridade destes tecidos e órgãos (Verfaillie, 2002). Por

outro lado, além de seu potencial de diferenciação celular, as CTMs atuam na

homeostase tecidual através da secreção de fatores solúveis e da ação

parácrina destes fatores sobre os constituintes teciduais (Singer & Caplan,

2011). Neste sentido, já foi demonstrado que as CTMs são capazes de

efetivamente suprimir a proliferação clonal e a expansão de células T primadas

(Di Nicola et. al., 2002), migrando para os sítios de inflamação e induzindo a

regeneração tecidual (Singer & Caplan, 2011).

Neste contexto, os efeitos parácrinos induzidos pelas CTMs podem ser

divididos em: efeitos tróficos; imunomodulatórios; anti-cicatriciais; e

quimioatraentes. Tais efeitos tróficos podem regular ações celulares anti-

apoptóticas (VEGF, HGF, IGF-1, TGFb, GM-CSF), proliferativas (SCF, LIF,IL-

6, M-CSF, SDF-1), de diferenciação (GM-CSF, SCF, HGF) e angiogênicas

(bFGF, VEGF, PIGF, MCP-1, ECM) (Meirtelles et. al., 2009). A produção e

secreção desta gama de moléculas bioativas fazem das CTMs ferramentas

promissoras para o tratamento de diferentes enfermidades. Entretanto, os

mecanismos utilizados pelas CTMs que promovem tais ações e, desta forma,

mantém a homeostase tecidual ainda não são conhecidos (Di Nicola et. al.,

2002). Neste sentido, tem sido descrito como um novo mecanismo de

comunicação célula-célula a transferência de moléculas bioativas através de

microvesículas, sendo este mecanismo um potencial efetor das ações

biológicas características das CTMs (Morel et. al., 2004).

O mecanismo de sinalização celular através da secreção de

exossomos/microvesículas no microambiente extracelular, descrito em células-

tronco, foi inicialmente relacionado às células-tronco embrionárias. Neste

trabalho, Ratajczak e colaboradores demonstram o papel deste tipo de

sinalização como indutor da reprogramação de progenitores hematopoiéticos

através da transferência de mRNAs (Ratajczak et. al., 2006). Trabalhos mais

recentes sugerem que alguns dos efeitos regenerativos induzidos pelas CTMs

seriam mediados através da secreção de exossomos (Bruno et. al., 2009; Lai

et. al., 2010). Neste contexto, foi demonstrado que microvesículas derivadas

de CTMs humanas são capazes de estimular in vitro proliferação e maior

resistência contra apoptose em células tubulares epiteliais. Quando

administradas in vivo em camundongos SCID com lesão renal aguda, as

microvesículas aceleram a recuperação funcional e morfológica do órgão

afetado (Bruno et. al., 2009). Por outro lado, a análise proteômica do meio

condicionado derivado do cultivo com CTMs revelou que os efeitos

terapêuticos deste meio condicionado são, ao menos em parte, relacionados a

ação de proteínas de membrana e intracelulares, possivelmente presentes nos

exossomos derivados destas células (Sze et. al., 2007).

Acredita-se que os exossomos derivados das CTMs poderiam

redirecionar funções alteradas de células alvo durante processos de lesão

tecidual, sugerindo que estas microvesículas bioativas poderiam servir como

terapia alternativa não baseada em células e, assim, serem exploradas na

medicina regenerativa para reparar tecidos lesionados (Camussi et. al., 2010).

De qualquer forma, os mecanismos envolvidos na regeneração tecidual

induzida pela administração de CTMs ou de seus exossomos permanecem

obscuros.

5 – Panorama das questões propostas no projeto

O projeto que propomos desenvolver visa estudar o papel de exossomos

e de grânulos de RNA durante o processo de infecção de duas células alvo

com patógenos diferentes, um vírus e um protozoário. Trata-se de um projeto

original pois não há qualquer descrição na literatura do papel de exossomos

secretados por células infectadas com o vírus dengue ou com T.cruzi no

processo de infecção de outras células. Adicionalmente, não encontramos na

literatura qualquer descrição do papel da infecção por estes patógenos na

diferenciação de células tronco mesenquimais. Finalmente, é desconhecido se

os exossomos normalmente secretados por células dendriticas têm sua

composição alterada quando da infecção pelos patógenos estudados e como

os exossomos de células infectadas se comparam aos exossomos normais de

células tronco e células dendriticas. Na outra vertente, resta a ser determinado

de que maneira são alterados e o papel de grânulos de RNA (sejam P-bodies

ou grânulos de estresse) no processo de patogênese. Estes estudos serão

realizados utilizando sequenciamento em massa de RNAs (RNAseq) e análise

proteômica das proteínas constituintes dos exossomos e dos grânulos de

RNA, permitindo a visão holística dos genes e vias metabólicas e de regulação

envolvidas no processo de patogênese.

6 – Modelo experimentais de patógenos.

Neste projeto propomos estudos com dois modelos experimentais de

patógenos bem estabelecidos nas atividades de grande parte dos

pesquisadores do Núcleo. As doenças causadas por estes patógenos são de

alta relevância para a saúde pública (dengue e doença de Chagas) e os

modelos são descritos abaixo.

6.1 – Modelo experimental com vírus dengue.

Duas cepas do vírus da dengue (DENV) sorotipo 3 foram isoladas por

pesquisadores do Núcleo e serão utilizadas neste projeto. Uma foi denominada

BR DENV/3/290-02 (GeneBank EF629369), proveniente de um paciente

residente na cidade de Curitiba, que viajou para a cidade do Rio de Janeiro

onde se infectou. O diagnóstico clínico desse paciente foi o de dengue clássica

não fatal, durante uma epidemia em 2002 (LACEN, Curitiba-PR). A outra cepa

foi isolada de um caso visceral ocorrido no Paraguai em 2007 (PAR

DENV/3/5532-07). Essa cepa foi isolada de um caso fatal de febre da dengue

aguda primária com complicações hepáticas e cardíacas na cidade de

Lambaré, região metropolitana de Assunção, Paraguai, durante uma epidemia

em 2007.

Análises moleculares revelaram que ambas as cepas pertencem ao genótipo III

do sorotipo 3, o que possibilita o uso dessas cepas em estudos de interação

células dendriticas humanas – DENV, permitindo mimetizar a resposta do

paciente frente a infecção por dengue 3 com diferentes casos clínicos. A

comparação da sequência de aminoácidos na região codificadora do genoma

das cepas DENV/3/290 e DENV/3/5532, revelou 12 substituições localizadas

nas regiões estruturais e não estruturais e não foram observadas alterações na

estrutura secundária da região 3' não traduzida do RNA das cepas em estudo.

O primeiro alvo celular para a infecção pelo DENV são as DCs residentes da

pele, células de Langherans (LC) e as células dendriticas dermais (DDC)

(Navarro-Sánchez er al., 2005). Os resultados obtidos por Silveira e

colaboradores (2011), demonstraram que a cepa DENV/3/5532 associada a um

caso fatal de dengue, é capaz de infectar de maneira mais eficiente mdDCs

(células dendriticas derivadas de monócitos), modula mais intensamente genes

envolvidos na resposta imune inata, induz a uma maior apoptose e uma maior

secreção de citocinas pró-inflamatórias. Esse conjunto de fatores pode ter

contribuído para a miocardite, hepatite e morte por choque do paciente. Já foi

demonstrado que a patogenia da dengue está associada com a carga viral

(Libraty et al., 2002), onde foram detectados picos de viremia 100 a 1000

vezes maiores em paciente que desenvolveram febre hemorrágica da dengue

em comparação aos pacientes que apresentaram febre da dengue (Vaughn et

al., 2000). Corroborando os dados da literatura, a cepa DENV/3/5532 infectou

mais eficientemente as mdDCs do que a cepa DENV/3/290, produzindo altos

títulos de vírus no sobrenadante de cultura (Silveira et al., 2011). A infecção

das mdDCs com a cepa DENV/3/5532 induziu uma maior produção de

citocinas TNF- e IL-6 em comparação à infecção com a cepa DENV/3/290 em

72h pós-infecção; também foram observados elevados níveis de apoptose nas

mdDCs infectadas com DENV/3/5532.

A comparação entre cepas de DENV que apresentem diferentes casos clínicos

podem ajudar a elucidar mecanismos implicados numa maior virulência de uma

cepa em relação a outra e contribuir para o prognóstico de casos graves de

dengue.

6.2 – Modelo experimental com Trypanosoma cruzi.

Será utilizado o T.cruzi Dm28c. Trata-se de um clone bem caracterizado e

isolado por pesquisadores do Núcleo (Contreras et. al., 1988), sendo hoje uma

cepa de referência para trabalhos com o T.cruzi. As diferentes formas

(epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas) serão obtidas por cultivo

axênico (Contreras et al., 1985, Bonaldo et. al., 1988) ou então a partir de

células Vero infectadas com tripomastigotas metacíclicos provenientes de meio

axênico ou tripomastigotas isolados do sangue de animais infectados.

c- Plano geral de trabalho: atividades a serem desenvolvidas, descrição dos experimentos e da metodologia, parâmetros de avaliação do desempenho

Isolamento e cultura de células dendriticas derivadas de monócitos:

Células dendriticas derivadas de monócitos (mdDCs) serão obtidas utilizando-

se sangue periférico (120 mL) de voluntários saudáveis, após consentimento

informado, com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FIOCRUZ

(número 514/09). Para tanto, células mononucleares serão separadas pela

técnica de gradiente de densidade utilizando-se o reagente Lymphocyte

Separation Medium (Lonza, Walkersville, USA), e destas, será isolada a

população de células CD14+, utilizando-se o método de imuno-separação

magnética por esferas revestidas com anticorpos anti- CD14 (Miltenyi Biotec,

Auburn, CA), de acordo com as recomendações do fabricante. Estas células

CD14+ serão cultivadas por 6-7 dias em meio RPMI 1640 contendo 100 ng/mL

de Interleucina-4 (IL-4) e 50 ng/mL Fator Estimulante de Colônias de Monócitos

e Granulócitos (GM-CSF; PeproTech, Rocky Hill, NJ), 10% de soro fetal bovino

(FBS), 100 IU/mL de Penicilina, 100 µg/mL Estreptomicina e 2 mM de L-

Glutamina (reagentes da marca Gibco-BRL, Grand Island, NY), sendo

realizando uma troca de meio no dia 3- 4 de cultivo. Após este período, as

culturas serão avaliadas para determinar o fenótipo de mdDCs utilizando-se a

técnica de citometria de fluxo (FACS, Becton Dickson – BD). Para tanto, serão

utilizados seis marcadores distintos: CD14, CD1a, CD11b, CD11c, CD209 e

HLA-DR. As células dentríticas isoladas serão cultivadas sobre lamínulas em

densidade de 4 x 105 células/cm2 em meio RPMI 1640.

Parâmetros de avaliação do desempenho: Isolamento e cultivo de células

dendriticas, análise e caracterização das células isoladas.

Isolamento e cultura de células tronco de tecido adiposo: As células

tronco adultas do tecido adiposo serão removidas de material excedente de

cirurgia bariátrica. O material será coletado no Instituto de Medicina e Cirurgia

do Paraná, em pacientes submetidos à cirurgia bariátrica, após consentimento

livre e esclarecido dos doadores, com a aprovação do Comitê de Ética em

Pesquisa da FIOCRUZ (número 419/07). Logo após a retirada do tecido

adiposo, este será lavado com solução salina para remover resíduos

contaminantes e hemácias. Em seguida o material será digerido com 0,02

mg/mL de colagenase A (Roche Diagnostic) em meio HAM-F12 e meio de

Dulbecco´s (DMEM-F12, GIBCO), contendo 2% de albumina bovina por 45

minutos a 37ºC. O tecido digerido será filtrado duas vezes com um filtro de

100μm e outro de 25μm de membrana de nylon, para eliminar os fragmentos

não digeridos. Em seguida o material será centrifugado a 600 g por 10 minutos

e as células que formam a fração vascular do estroma do tecido adiposo serão

coletadas e as células vermelhas lisadas com um tampão contendo 155mmol/L

de NH4CL, 20 mmol/L Tris pH 7,6, durante 5 minutos.

As células estromais isoladas serão cultivadas sobre lamínulas em

densidade de 2 x 104 células/cm2 em meio DMEM-F12 (1:1), suplementado

com 5% de soro bovino fetal, 100μg/mL de ácido pantotênico, 100μmol/L de

ácido ascórbico, 16μmol/L de biotina, 250 μg/mL de anfotericina, 5 μg/mL de

estreptomicina e 5 U/mL de penicilina. Após 24 horas as células não aderentes

serão removidas e o meio será trocado duas vezes por semana.

Parâmetros de avaliação do desempenho: Isolamento de adipócitos,

caracterização fenotípica das células e cultivo das mesmas.

Indução de estresse celular por arsenito de sódio: Células dendriticas e

células tronco serão tratadas com concentrações crescentes de arsenito de

sódio (0,5 – 2 mM) por diferentes tempos de incubação (10 – 60 minutos). Com

esta abordagem, esperamos estabelecer o melhor protocolo para a indução de

estresse e verificar a presença e a dinâmica de formação dos grânulos de RNA

nos diferentes tipos celulares.

Parâmetros de avaliação do desempenho: Observação da formação de

grânulos de RNA em resposta ao tratamento, estabelecimento do protocolo

experimental.

Infecção das células:

Infecção com o protozoário T. cruzi: Células dendriticas e células tronco,

previamente cultivadas sobre lamínulas em placas de 24 poços, serão

infectadas com as formas tripomastigotas de T. cruzi provenientes de cultivo

celular na proporção de dez parasitas por célula. Após quatro horas, as

monocamadas serão lavadas com PBS para remoção dos parasitas não

interiorizados e mantidas por 6, 12, 24, 48 e 72 horas em 500 l/poço de

DMEM ou RPMI suplementado com SFB 10% a 37C e 5% de CO2. Serão

realizados experimentos de infecção celular com e sem indução de estresse.

Para a indução do estresse as células infectadas serão incubadas com arsenito

de sódio nas condições pré-estabelecidas de acordo com o item anterior. Para

se certificar de que a diminuição do número de células infectadas não tenha

ocorrido pela lise da célula hospedeira, decorrente do ciclo de multiplicação

intracelular, as monocamadas serão observadas em microscópio invertido para

verificar a presença de tripomastigotas no sobrenadante. As lamínulas serão

lavadas com PBS e processadas para os ensaios de imunofluorescência

indireta.

Infecção com o vírus da Dengue: Células dendriticas e células tronco,

previamente cultivadas sobre lamínulas em placas de 24 poços, serão

infectadas com os vírus DENV/3/290 e DENV/3/5532 (MOI = 5) por 2 horas a

37C e 5% de CO2. As células serão lavadas com meio fresco para remoção

dos vírus não interiorizados e mantidas por 6, 12, 24, 48 e 72 horas em 500

l/poço de DMEM ou RPMI + SFB 10% a 37C e 5% de CO2. Nos tempos de

incubação estabelecidos, serão retiradas alíquotas do sobrenadante das

culturas para determinar a presença de citocinas e quimiocinas inflamatórias

através da tecnologia CBA (Cytometric Bead Array) de acordo com instruções

do fabricante. Serão realizados experimentos de infecção celular com e sem

indução de estresse. Para a indução do estresse as células infectadas serão

incubadas com arsenito de sódio nas condições pré-estabelecidas de acordo

com o item anterior. As lamínulas serão lavadas com PBS e processadas para

os ensaios de imunofluorescência indireta.

Parâmetros de avaliação do desempenho: Estabelecimento da cinética de

infecção com cada patógeno.

Detecção das proteínas dos grânulos de RNA, de proteínas virais e de

proteínas envolvidas com a resposta imune inata por ensaios de

imunofluorescência indireta: Células dendriticas e células tronco

previamente cultivadas em lamínulas, não infectadas ou infectadas com os

diferentes patógenos e submetidas ou não ao estresse com arsenito de sódio,

serão fixadas com paraformaldeído 4% em PBS por 10 minutos em

temperatura ambiente, permeabilizadas com Triton X-100 0,5% por 5 minutos,

lavadas três vezes com PBS e incubadas com solução de bloqueio (PBS

contendo 5% de soro fetal bovino e 1% de soro humano) por 1 hora em

temperatura ambiente. Os anticorpos primários serão diluídos na solução de

bloqueio e incubados com as células a 37ºC por 1 hora. As células serão

lavadas 3 vezes por 10 minutos com PBS e incubadas com os anticorpos

secundários conjugados aos fluoróforos Alexa 488 ou Alexa 546 e as etapas de

incubação e lavagem serão repetidas. Os núcleos das células serão corados

durante 15 minutos com DAPI, diluído em solução de bloqueio na concentração

final de 1 µg/µl. Após esta etapa as lamínulas serão lavadas cinco vezes por 10

minutos e montadas sobre lâminas de vidro com 10 µL de n-propil-galato na

concentração de 200 µg/ml. A fluorescência será observada em microscópio

confocal.

Os anticorpos primários utilizados para a detecção das proteínas dos

grânulos de estresse e P-bodies serão anti-TIA1/TIAR e anti-Dcp1a,

respectivamente. As proteínas virais serão detectadas com o uso dos

anticorpos anti-NS3 e anti-flavivírus (4G2). A presença e/ou ausência das

proteínas envolvidas com a resposta imune inata nos grânulos de RNA serão

evidenciadas com o uso de anticorpos direcionados contra citocinas pró-

inflamatórias (TNF- e IL-12) e antiinflamatórias (IL-10).

Ensaios de coimunoprecipitação: Células dendriticas e células tronco

não infectadas e infectadas com os diferentes patógenos serão lisadas em um

mililitro de tampão de lise (KCl 100 mM; MgCl2 5 mM; Hepes 10 mM pH 7,0;

NP-40 1% e inibidores de proteases) por 1 hora a 4°C sob agitação. As células

serão centrifugadas a 2.000 g por 5 minutos a 4°C e o sobrenadante será

incubado com proteína A/G Sepharose por 30 minutos a 4°C. A mistura será

centrifugada nas mesmas condições acima e o sobrenadante será incubado

com anti-TIA1/TIAR e com anti-Dcp1a por 1 hora a 4°C sob agitação. Após

esta etapa será adicionada a resina de proteína A/G Sepharose e a mistura

será incubada por 1 hora nas mesmas condições. A resina será coletada por

centrifugação e lavada 5 vezes com tampão de lise. Para as análises do

conteúdo protéico presente nas frações imunoprecipitadas com as proteínas

dos grânulos de RNA, a resina será fervida por 5 minutos e as proteínas serão

separadas em gel SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose e

analisadas por Western blotting utilizando os anticorpos primários

especificados no item anterior. Os RNAs presentes nos imunocomplexos serão

purificados utilizando o kit RNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do

fabricante e identificados através da técnica de RT-PCR, como descrito a

seguir.

Reação da transcriptase reversa seguida da reação da polimerase em

cadeia (RT-PCR). Para verificar a presença de RNA viral e de RNAs celulares

dos genes envolvidos na resposta imune inata (por exemplo, IFIT, Usp18,

MHC-I e II, APOBEC, entre outros) os RNAs presentes nos imunocomplexos

serão concentrados em microcon e submetidos à transcrição reversa para

obtenção do cDNA correspondente, utilizando oligonucleotídeos degenerados,

dNTPs (GE Healthcare) e transcriptase reversa M-MLV (Promega). As reações

serão incubadas a 42 °C durante 60 minutos. Para as amplificações (PCRs)

será utilizado 1/10 do cDNA obtido, oligonucleotídeos iniciadores específicos

para cada gene, DNA polimerase Pfx Platinum® (Invitrogen) e condições de

amplificação previamente padronizadas. Os produtos obtidos serão resolvidos

em gel de agarose contendo brometo de etídio (Sigma) e visualizados em

transiluminador UV.

Obtenção de exossomos. O sobrenadante das culturas de células

dendriticas, correspondente a 1x106 cel/mL, infectadas com T. cruzi ou com o

vírus da dengue será coletado e centrifugado à 2500 X g por 5 minutos. Em

seguida esse sobrenadante será filtrado em 0,22 mM e submetido a uma

ultracentrifugação à 100.000 X g por 3 horas. O sedimento será ressuspenso

PBS 1X e estocado à -80C até o momento do uso. Procedimento semelhante

será utilizado para o isolamento de exossomos a partir de cultivos axênicos de

T.cruzi. As células serão sedimentadas e o sobrenadante tratado.

Avaliação da captura de exossomos por células dendríticas

Uma alíquota contendo exossomos secretados por T. cruzi será processada

com o reagente Alexa Fluor kit ULYSIS Alexa Fluor 594 de acordo com as

recomendações do fabricante, a fim de promover a formação de um complexo

exossoma - Alexa Fluor. Os exossomos marcados serão ressuspensos em

PBS para posterior estimulação de células dendriticas previamente

diferenciados. Aproximadamente 2 x 105 células (células dendriticas) serão

incubadas em cada câmara de uma lâmina (Lab-Tek Chamber Slide System,

Nalge Nunc Internacional, Rochester, NY) contendo 300 L de meio RPMI

suplementado. Estas células serão estimuladas com exossomos complexados

ao Alexa Fluor durante 4 horas. Decorrido este período, a lâmina será lavada

gentilmente com PBS, três vezes, para retirada de material excedente.

Posteriormente, as culturas serão fotografadas em microscópio de

fluorescência Nikon Eclipse E800 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY). As

imagens serão adquiridas com câmera digital Nikon DXM-1200 (Nikon

Instruments Inc., Melville, NY) conectada ao microscópio, para a avaliação da

captura dos exossomos.

Ensaios distintos serão realizados com células dendriticas (2 x 105), cultivadas

em placas de 96 poços, fundo reto (Corning, NY, USA), em 200 L de meio

RPMI suplementado, estimuladas com exossomos complexados ao Alexa Fluor

durante 4 horas. Como controle negativo, células serão estimuladas com

exossomos não marcados. Decorridas quatro horas de cultura, a placa será

centrifugada a 400 x g, durante 10 minutos para retirada do sobrenadante.

Posteriormente, as células aderentes serão removidas da placa com solução

PBS gelada e transferidas para tubos utilizados na citometria de fluxo e

centrifugadas a 400 x g durante 10 minutos para remoção do PBS, sendo em

seguida, marcadas com o anticorpo monoclonal contra CD11c, CD86 e HLA-

DR. Serão adquiridos 25.000 eventos por amostra para a realização da análise.

Inicialmente, as células serão selecionadas através dos parâmetros de

tamanho (FSC) e granularidade (SSC), e na população selecionada, será

analisada a porcentagem de células com dupla marcação positiva: para a

molécula CD11c e para Alexa Flúor com intuito de se determinar a

porcentagem de células que capturarão os exossomos, bem como se a captura

dos exossomos é capaz de induzir a maturação das DCs (CD86 e HLA-DR).

Cultivo de células dendríticas para avaliação da resposta inata.

Células dendriticas previamente diferenciados a partir de PBMC em placas de

cultura de 48 poços (Corning; NY, USA) contendo meio RPMI suplementado, e

incubadas a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2 serão estimuladas com

exossomos secretados por T. cruzi, tendo como controle negativo células

cultivadas apenas com meio de cultura. Decorridas 12, 24 e 48 horas de

estimulação, os sobrenadantes serão coletados e armazenados a – 70ºC para

posterior dosagem de citocinas. As células cultivadas também serão avaliadas

por citometria de fluxo para determinação da expressão da molécula co-

estimuladora CD86 e da molécula de classe-II HLA-DR. Serão adquiridas 5.000

células dentro da população CD11c por amostra.

Co-cultivo de células apresentadoras de antígeno estimuladas com exossomos provenientes de T. cruzi e linfócitos TCD4+ ou CD8+ Avaliação da proliferação celular - Linfócitos TCD4+ ou TCD8+ (ou células não

aderentes), com concentrações celulares previamente determinadas, serão

ressuspensos em 1 mL de PBS para cada 106 células, e acrescidas de 1 mL de

uma solução CFSE (5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl Ester)

(Invitrogen, Molecular Probes) a 2,5 M. As células serão incubadas ao abrigo

da luz, durante 5 minutos a temperatura ambiente, sob agitação periódica. A

reação de incorporação de CFSE será interrompida com a adição de 5% de

SBF. Proceder-se-á a lavagem com 10 mL de PBS, seguida de centrifugação a

400 x g, a 4C, durante 10 minutos. Após novo procedimento de lavagem, as

células serão ressuspensas em meio RPMI suplementado com 10% de plasma

autólogo, penicilina (100U/mL), estreptomicina (100 g/mL), gentamicina (10

g/mL) e polimixina B (30 g/mL). A viabilidade e a concentração celular serão

novamente determinadas em câmara de Neubauer com Azul de Trypan.

Aproximadamente 1 x 105 células dendriticas e estimuladas com

exossomos secretados por T. cruzi, serão co-cultivados com 5 x 105 linfócitos

TCD4+ ou TCD8+ previamente marcados com CFSE, em placas de cultura de

96 poços (Corning; NY, USA) contendo meio RPMI suplementado e incubadas

a 37ºC, com atmosfera de 5% de CO2. Como controle da fluorescência da

marcação com CFSE também serão realizadas co-culturas com linfócitos não

marcados. Como controle negativo, as células serão cultivadas apenas em

presença de meio de cultura, e como controle positivo, as células serão

estimuladas com PHA (1%) (Gibco, Grand Island, NY. As culturas serão

mantidas durante 5 a 7 dias.

Decorrido o período de cultura, as células serão transferidas para tubos

de poliestireno (Falcon, BD, USA). Adicionar-se-á 100 L de EDTA 2 mM, e

após homogeneização, as células serão incubadas durante 10 minutos, à

temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Posteriormente, serão adicionados 4

mL de solução PBS acrescida de 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica (PBS-

Wash), e as células serão centrifugadas a 400 x g, durante 10 minutos, a 4C.

O sedimento celular será ressuspenso em 100 L de PBS-Wash (PBS-W) , e

no mesmo dia, proceder-se-á à marcação celular com anticorpos monoclonais

específicos para os receptores de superfície celular e posterior análise da

proliferação celular por citometria de fluxo (50.000 eventos adquiridos).

Inicialmente, os linfócitos serão selecionados através dos parâmetros de

tamanho (FSC) e granularidade (SSC). Em seguida, dentro da população

selecionada, correspondente aos linfócitos, será avaliada a porcentagem de

células positivas para os receptores CD4 ou CD8. A avaliação da capacidade

de proliferação das células estimuladas será obtida através da análise de

histogramas das populações positivas para CD4 ou CD8. Células que

apresentarem grande intensidade da marcação com CFSE corresponderão às

células que não proliferarão após cultivo. Células com diminuição na

intensidade de marcação para CFSE corresponderão às células que

proliferarão após estimulação. Os resultados serão expressos pela

porcentagem das células que proliferaram.

Determinação da freqüência de células produtoras de citocinas -

Aproximadamente 1 x 105 células dendriticas previamente diferenciados a partir

de PBMC e estimulados com exossomos secretados por T. cruzi, serão co-

cultivados com 5 x 105 linfócitos TCD4+ ou TCD8+, em placas de cultura de 96

poços (Corning; NY, USA) contendo meio RPMI suplementado e incubadas a

37ºC, com atmosfera de 5% de CO2. As culturas deverão ser realizadas em

triplicata para obtenção de número suficiente de células para a análise. Como

controle negativo, as células serão cultivadas apenas em presença de meio de

cultura, e como controle positivo, as células serão estimuladas com PHA (1%).

Decorridos 24 e 48 horas de cultura, o transporte de proteínas para

vesículas intracelulares será abolido com a adição de 10 g/mL de Brefeldina A

(Sigma, St Louis, USA). As células permanecerão em cultura por mais 4 horas

e, em seguida, serão centrifugadas a 400 x g, durante 10 minutos, a 4C. Os

sobrenadantes serão coletados e armazenados a –70ºC para posterior

dosagem de citocinas secretadas. A marcação dos receptores CD4 e CD8,

assim como de citocinas intracitoplasmáticas IFN-, IL-4, IL-10, IL-17 e Foxp3,

será realizada de acordo com Sathler-Avelar [74]. A aquisição das amostras

será realizada no citômetro de fluxo, FACS Canto II (Becton & Dickinson), e a

análise realizada no programa Cell Quest a partir de 50.000 eventos

adquiridos.

Avaliação da produção de citocinas. A detecção de citocinas IFN-, IL-10,

TNF-, IL-5, IL-17, IL-12p70 nos sobrenadantes das culturas será realizada por

ensaio imunoenzimático (ELISA) ou por CBA (Cytometric Bead Array).

Utilizaremos o Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (Becton & Dickinson), que

quantifica a concentração de IFN-, TNF-, IL-17, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2. A

leitura do ensaio será realizada no citômetro de fluxo (BD FACS Canto II) de

acordo com as recomendações do fabricante. A análise dos dados será

realizada utilizando-se software específico denominado FCAP Array (Becton &

Dickinson), por meio da obtenção de curvas de calibração obtidas com os

padrões de citocinas do kit. Após a construção das curvas, a concentração das

amostras será determinada em pg/mL, a partir dos valores obtidos na leitura

referentes à Intensidade Média de Fluorescência (MFI).

Extração do RNA total. O RNA total das células dendriticas, cultivadas na

presença ou na ausência de exossomos provenientes de T. cruzi será extraído

utilizando-se o kit RNeasy, sendo estocado a –80ºC, até o momento de uso

Quantificação e avaliação da integridade das amostras de RNA. A

quantificação do RNA total bem como a integridade do mesmo será verificada

por eletroforese capilar utilizando o equipamento Bioanalyzer (Agilent).

Análise da expressão gênica relativa por PCR em tempo real. A partir do

RNA mensageiro serão obtidas amostras de cDNA para realização da PCR em

tempo real (Real Time – PCR). A quantificação de cDNA será realizada em

espectrofotômetro (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, USA) a partir de uma

solução de cDNA (50 ng/L) em um volume de 100 L. Serão realizados

ensaios para amplificação dos genes constitutivos GAPDH (Glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase) e HuPO (human ribosomal protein) e para os genes

de interesse, relacionados à resposta imune. As reações serão realizadas no

aparelho AB 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Em paralelo,

serão realizadas amplificações de genes constitutivos utilizados para a

normalização dos dados de expressão gênica. Os dados serão normalizados

de acordo com a expressão dos genes GAPDH e HuPO de cada amostra,

utilizando o método do Ct (cycle threshold) e a equação 2-CT [75].

Sequenciamento em massa dos RNAs isolados dos exossomos.

Para o sequenciamento das amostras provenientes do isolamento dos

exossomos ou amostras tratadas com essas vesículas, utilizaremos 100 ng do

RNA purificado. Os RNAs serão fragmentados com a utilização de 1 U de

RNase III por 5 minutos à 37 ºC para obtenção de fragmentos de 150 a 250

nucleotídeos. Após a incubação a reação será parada com a adição de água

RNase free e as amostras serão imediatamente acondicionadas em gelo. A

purificação dos RNAs é feita com o kit RiboMinusTM Concentration Module

(Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. Após a

purificação, será feita uma reação de hibridização por 16 horas à 16 ºC, na qual

um adaptador é ligado na extremidade 3’. O adaptador é utilizado como

oligonucleotídeo iniciador numa reação de transcrição reversa para a síntese

de uma fita de cDNA. A fita simples de cDNA será purificada com o kit MinElute

PCR purification kit (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante.

Após a purificação, o cDNA fita simples será submetido a uma eletroforese em

gel de acrilamida 6% (NovexR – Invitrogen) por 25 minutos à 180 V. O gel será

então corado com SYBR Gold por 5 minutos e posteriormente os fragmentos

de 150 a 250 nucleotídeos serão excisados do gel. Para a obtenção da

biblioteca de cDNA a amplificação será feita a partir da banda cortada do gel,

sendo que, nesse momento cada amostra recebe dois adaptadores (P1 e P2),

sendo que o P1 é específico e único que funciona como um código de barras

que identifica cada amostra. Após a amplificação do cDNA este será purificado

com o kit PureLinkTM PCR Micro kit (Invitrogen) de acordo com as

recomendações do fabricante. O tamanho e a concentração das amostras

serão analisados no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer com o kit DNA

1000. A PCR em emulsão (ePCR) tem como objetivo a amplificação clonal dos

fragmentos de DNA modificados e sua ligação às esferas (beads) de

sequenciamento pelo adaptador P1. A escala de preparação da PCR em

emulsão (ePCR) será a full scale que gera entre 400 e 500 milhões de esferas.

Para a reação de ePCR, o cDNA obtido cada amostra será misturado gerando

uma biblioteca que contém até 16 amostras diferentes, cada uma

individualizada pelo adaptador que confere o código de barras (P1). Essa

biblioteca será diluída para duas titulações, 0,5 e 1,0 pM, para cada biblioteca.

Assim sendo, serão feitas duas ePCRs para cada biblioteca, permitindo

selecionar qual titulação produz melhores resultados, tanto no que se refere à

quantidade de esferas quanto à qualidade da sequência. Após a ePCR, as

esferas passam por um processo de enriquecimento para maximizar a

quantidade de esferas P2 positivos, ou seja, que possuem fragmentos de DNA

completos contendo os adaptadores P1, interno e P2. Desse modo as esferas

sem produtos de PCR serão eliminadas. A contagem final de esferas após o

enriquecimento será feita em câmara de Neubauer e encaminhadas para o

sequenciamento. As lâminas utilizadas pelo sequenciador SOLiD apresentam

as configurações full (1 poço), quad (4 poços) e octeto (8 poços). A

configuração quad permite um número máximo de 60 milhões de esferas. O

tempo total de sequenciamento é de aproximadamente sete dias, sendo que no

primeiro dia será sequenciado adaptador código de barras e nos últimos 6 dias

o fragmento de 50 pb referente ás amostras. As análises das sequências

geradas pelo sequenciador SOLiD serão realizadas com base no mapeamento

das sequências obtidas no genoma de referência utilizando-se o programa CLC

Genomics WorkbenchTM.

Identificação do conteúdo protéico dos exossomos. As proteínas que

compões os exossomos serão solubilizadas em tampão de desnaturação (uréia

6 M / tiouréia 2 M em HEPES 10 mM (pH 8,0)). Em seguida será adicionado 1

μg (1 μl) de DTT para 50 μg de proteína por 30 minutos à temperatura

ambiente. Posteriormente adiciona-se 5 μg (1 μl) de iodoacetamida (IAA) para

50 μg de proteína e incuba-se por 20 minutos à temperatura ambiente, seguido

de diluição das amostras com 4 volumes de tampão de digestão. Para

obtenção dos peptídeos, adiciona-se 1 μg (0,5 μl) tripsina e incuba-se durante

a noite a temperatura ambiente, a reação é interrompida por acidificação a pH

menor que 2,5 com 100% de TFA (concentração final 0,5% TFA). Os peptídeos

são purificados usando C18-StageTips previamente equilibrados em tampão A.

Os peptídeos são lavados em tampão A e posteriormente eluídos em tampão

B. Após a secagem das amostras as mesmas são ressuspensas em solução A

e analisadas no espectrômetro de massas de acordo com as recomendações

do fabricante.

Clonagem, expressão e purificação de antígenos recombinantes.

Os dados obtidos a partir do seqüenciamento massivo e das análises

proteômicas permitirão evidenciar alvos de interesse para estudos

individualizados. Para produção de antissoros e para caracterização funcional e

estrutural das proteínas de interesse será necessária a produção de proteínas

recombinantes. Inicialmente as proteínas de interesse serão analisadas quanto

à complexidade estrutural e a escolha do sistema de expressão será feita

conforme a necessidade de cada caso. Proteínas monoméricas ou domínios

extracelulares e intracelulares de estrutura menos complexa poderão ser

expressos em sistemas de Escherichia coli utilizando os vetores da série pET

(Novagen) baseados na RNA polimerase do fago T7 (Studier et al., 1986). A

produção de proteínas de membrana pode ser de particular importância para

este projeto. Para expressão deste tipo de proteína primeiramente serão

testadas as cepas de E. coli C41, C43 ou Lemo21(DE3) (Miroux & Walker

1996; Wagner et al., 2008) que foram selecionadas para produção de altos

níveis de proteínas de membrana e para proteínas tóxicas. Para as proteínas

complexas e para as proteínas cuja expressão não seja viável em E. coli, será

usado o sistema de baculovírus e células de inseto modificado a partir do

sistema “pFastBacDual” (Invitrogen). Este sistema permite expressar duas

proteínas recombinantes simultaneamente, uma sob o promotor da proteína

P10 e outra sob o promotor da polihedrina. As principais dificuldades deste

sistema são, primeiro determinar a taxa de infecção das células de inseto pelo

baculovírus recombinante e, segundo, determinar os níveis de expressão da

proteína de interesse. Visando contornar a primeira dificuldade, clonamos a

proteína GFP, a qual serve como gene marcador, sendo fácil de visualizar e

quantificar o número de células infectadas em microscópio de fluorescência.

Visando contornar a segunda dificuldade, as proteínas de interesse são

clonadas em fusão com uma sequência de seis histidinas que servem tanto

para detecção por immunoblotting como para purificação por cromatografia de

afinidade. Assim, a etapa inicial de purificação será por cromatografia de

afinidade a metal imobilizado. As etapas subsequentes de purificação serão

definidas de acordo com a necessidade de cada caso, e a resolução das

colunas cromatográficas seguindo uma ordem de prioridade de interação

iônica, interação hidrofóbica e exclusão por tamanho. A sequencia das etapas

cromatográficas seguirá a lógica utilizada em estudos anteriores (Smetana et

al., 2006, Navarro et al., 2008).

Produção de antisoros. As proteínas recombinantes de interesse serão

utilizadas para a inoculação de camundongos, seguindo protocolos padrão,

visando a produção de antissoros policlonais e monoclonais. Para a confecção

de antissoros policlonais os animais (Balb/C) serão inoculados de 10 a 50

g/dose/animal em volume 1:1 com adjuvante hidróxido de alumínio (Alu-Gel-S;

Serva Heidelberg, Germany). Serão realizadas de 4 a 6 doses por via

intraperitoneal em intervalos de 7 a 15 dias entre as mesmas, sendo a última

dose por via endovenosa. Três dias após a última dose os animais serão

sacrificados e o soro coletado por punção cardíaca. Após a coagulação do

sangue, o soro policlonal será separado por centrifugação (1500 g por 5

minuto), aliquotado e armazenado a -20C até sua análise. Para a confecção

dos anticorpos monoclonais será utilizado o baço dos animais imunizados. O

baço será dissociado entre duas lâminas de vidro, e os esplenócitos serão

filtrados em membranas de nylon. Após a separação dos esplenócitos, será

realizada a lise dos eritrócitos residuais com solução de cloreto de amônio (166

mM de NH4Cl, 9 M de EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) e 95 mM de

NaHCO3 (Merck, Rio de Janeiro, Brasil) 5 minutos no gelo. As células serão

lavadas duas vezes em PBS 1 X e fusionadas com o mieloma murino

Ag8XP3653 com a utilização de polietilenoglicol (Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA) 1:1 em meio RPMI sem SFB por 2 minutos. Após a fusão, as células

serão lavadas duas vezes com PBS 1 X e plaqueadas na confluência de 2.5 x

106 células/mL em placas de 96 orifícios (100 L/orifício). Após 24h de cultivo

será adicionado ao meio a droga de seleção dos hibridomas (esplenócitos +

mieloma) Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT; Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA) e a seleção irá ocorrer por 12 dias com troca de metade do meio a cada

48 h. Após a seleção com meio HAT será adicionado o meio Hipoxantina-

Timidina (HT; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) por mais 4 dias, com trocas a

cada 48h. Finalmente, o cultivo seguirá com meio RPMI + 20% de SFB, 100

UI/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina, 2.5 g/mL de anfotericina B,

2 mM de glutamina e 1 mM de piruvato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA). A triagem de clones positivos será realizada pela técnica de ELISA,

assim como, a isotipagem dos clones positivos após diluição limitante (SBA

Clonotyping HRP System, Southern Biotech, Birminghan, USA).

Ensaios de microscopia eletrônica. Para os ensaios de microscopia eletrônica

de transmissão, serão utilizados exossomos isolados e purificados bem como as

células dendríticas e tronco não infectadas e infectadas com dengue ou T. cruzi.

Após lavagem com PBS os exossomos ou células serão fixados uma solução de

glutaraldeído 0,1% / paraformaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M,

pH 7,2. Após incubação por 60 minutos à temperatura ambiente os parasitas

serão lavados com tampão cacodilato 0,1 M, e submetidos a diversas etapas de

desidratação em temperaturas e tempos variáveis: etanol 30% a 4ºC por 30 min;

etanol 50% a -20ºC por 60 min; etanol 70% a -20ºC por 60 min; etanol 90% a -

20ºC por 60 min; e por fim etanol 100% a -20ºC por 60 min. Em seguida, o

material será infiltrado em solução de metanol 100% e resina Lowicryl MonoStep

na proporção de 2:1 e o material incubado a -20ºC, por 16 horas. Em seguida, a

proporção de metanol será diminuída, e seguiu-se incubação em solução

metanol 100% e resina na proporção 1:1 a -20ºC por 16 horas. Após as etapas

de infiltração, o material será emblocado em resina pura e submetido a

incubação a -20ºC pelo período de 48 a 72 horas sob incidência de luz

ultravioleta UVA (360 nm), para que ocorra a polimerização da resina. As

amostras serão então cortadas em um em um ultramicrótomo Leica modelo M6,

de modo a se obter cortes ultrafinos que foram coletados em grades de níquel.

Para a marcação das grades com anticorpo de interesse, estas serão incubadas

por 30 min em solução de cloreto de amônio 50 mM em PBS. Em seguida as

grades serão incubadas por 30 min em solução de bloqueio para

imunolocalização e incubadas por 1 hora nesta mesma solução contendo o

anticorpo primário diluído 1:20. Após duas lavagens, o material será incubado

por 1 hora com o anticorpo secundário anti IgG de coelho conjugado a partículas

de ouro diluido 1:20. Em seguida as grades serão lavadas em solução de

bloqueio para imunolocalização e em água destilada. Finalmente as grades

serão contrastadas por 30 min com acetato de uranila (5% em água) e por 2 min

em citrato de chumbo e então observadas no Microscópio Eletrônico de

Transmissão JEOL modelo 1200EXII de 80 kV (Centro de Microscopia

Eletrônica, UFPR).

Análise estatística. Para as análises estatísticas serão empregados testes T

não pareados, pareados não-paramétrico (teste de Wilcoxon) para

comparações dentro do mesmo grupo, e o teste não pareado não-paramétrico

(teste de Mann-Whitney) para comparação entre os diferentes grupos, de

acordo com a necessidade. Os dados serão analisados no programa de

computador PRISM (versão 4.0, GraphPad, San Diego, USA). Valores de p<

0,05 serão considerados significativos.

d- Relação da pesquisa com trabalhos realizados anteriormente

Trabalhos anteriores de grande parte do Núcleo foram centrados nos

mecanismos de regulação da expressão gênica em T.cruzi, destacando-se o

papel de grânulos de RNA na modulação pós-transcricional. Desta forma o

estudo de grânulos de RNA, seja grânulos de estresse seja P-bodies, passou a

ser um interesse da equipe em outros modelos de estudo no Núcleo (por

exemplo, células tronco) e no processo de infecção de células de mamífero

pelo T.cruzi. Dados preliminares indicam que células tronco apresentam um

comportamento bastante peculiar no sentido em que grânulos de estresse são

muito mais abundantes do que em células diferenciadas. Considerando o

importante papel de grânulos de RNA na modulação pós-transcricional da

expressão gênica é interessante determinar seu papel no processo de

infecção. Assim, a comparação de um patógeno que utiliza a maquinaria

celular (vírus dengue) e outro que utiliza sua própria maquinaria (T.cruzi) para a

síntese protéica proverá novos dados para o nosso conhecimento do processo

de patogênese na dengue e na doença de Chagas. Soma-se ainda o interesse

de determinar o efeito espacial da ocupação do citoplasma por estes

patógenos na geração de grânulos de RNA e consequentemente na modulação

da expressão gênica celular. A análise ribonômica (sequenciamento dos RNAs)

contidos nas células infectadas e não infectadas permitirá determinar se vias

metabólicas específicas são afetadas pelo processo de patogênese.

No caso da pesquisa envolvendo os exossomos, a pesquisa é nova para os

componentes do Núcleo, mas os modelos biológicos por nós estudados

prestam-se de maneira muito positiva para a compreensão do papel dos

exossomos no processo de patogênese tanto da dengue como na doença de

Chagas. Resultados preliminares permitiram estabelecer a metodologia para

isolamento de exossomos de células dendriticas e assim a comparação de

células infectadas e não infectadas abre novas perspectivas para a

compreensão do papel de exossomos como mediadores do processo de

infecção (teriam os exossomos um papel parácrino na infecção?). No caso

particular do modelo dengue, esta questão é bastante estimulante em vista das

diferenças biológicas das cepas que serão estudadas.

Assim, a presente proposta é baseada essencialmente nos modelos de

trabalho dos pesquisadores do Núcleo, mas trazendo novos aspectos e

metodologias à pesquisa. É importante destacar que a maior parte dos

aspectos abordados na pesquisa proposta são originais e não se tratam de

simples contribuições aditivas a dados já existentes na literatura.

e- Impactos ambientais, econômicos, avanços científicos, tecnológicos e/ou de inovação

A presente proposta não apresenta qualquer impacto ambiental ou econômico

(pelo menos a curto prazo). Todavia carrega embutida uma grande perspectiva

de avanços científicos tanto para a compreensão dos processos de patogênese

da dengue e do T.cruzi como na relação patógeno-hospedeiro. Há também o

grande potencial de geração de novos conhecimentos sobre o papel de

grânulos de RNA na modulação da expressão gênica de células de mamíferos

infectadas com diferentes patógenos. Adicionalmente, a área que trata do

estudo dos exossomos e seu papel na interação célula-célula no hospedeiro e

na interação célula do hospedeiro-patógeno, será bastante enriquecida.

É importante destacar que esta proposta apresenta um grande efeito

multiplicador no tocante à formação de recursos humanos capacitados nas

tecnologias de ponta da biologia moderna, e seu impacto regional não pode ser

negligenciado em virtude da carência de grupos de pesquisa nas áreas de

estudo no Estado do Paraná.

f- Proposta orçamentária e justificativa

A maior parte dos recursos solicitados refere-se a despesas de custeio, sejam

materiais de consumo, sejam passagens e diárias para as atividades do Núcleo

ou então serviços de terceiros para eventuais reparos nos equipamentos

danificados e despesas acessórias de importação. A destinação da maior parte

dos recursos para consumo é justificada em virtude do elevado custo dos

reagentes e kits para sequenciamento e amplificação de ácidos nucleicos,

anticorpos marcados para citometria e microscopia confocal e reagentes para

análise proteômica, sendo que a maior parte destes reagentes será adquirida

por importação direta. Assim, previmos gastos relativos às despesas

acessórias de importação. Parte dos insumos será adquirida diretamente no

mercado nacional, principalmente vidraria descartável para cultivo de células,

ponteiras, tubos de centrifugação, meios de cultivo, soro fetal bovino de padrão

cultura de tecidos, reagentes químicos diversos para o preparo de meios e

soluções. A necessidade de equipamentos é importante e prioritária para a

equipe da Universidade Estadual de Londrina, mais especificamente a

aquisição de um citômetro de fluxo, o que permitiria que parte dos

experimentos fosse executado diretamente in loco, e um PCR em tempo real

(Real Time PCR) que permitiria que os trabalhos de quantificação de mRNAs

específicos fossem feitos em Londrina, sem a necessidade de deslocamento

dos pesquisadores até Maringá ou até Curitiba (que é o que ocorre

atualmente).É importante ressaltar que estes dois equipamentos não existem

na UEL e certamente beneficiariam outros grupos de pesquisa não associados

diretamente ao Núcleo desta proposta ao Pronex.

g- Cronograma detalhado de execução do projeto

ATIVIDADE DESENVOLVIDA

SEMESTRE*

1 2 3 4 5 6

Isolamento de células dendriticas

Isolamento e diferenciação de células tronco

Infecção de células com T. cruzi

Infecção de células com vírus dengue

Caracterização de grânulos de RNA em células dendriticas

Caracterização de grânulos de RNA em células tronco

Isolamento de exossomos de células não infectadas

Isolamento de exossomos de células infectadas

Infecção de células nas presença de exossomos

Sequenciamento dos RNAs extraídos de exossomos

Análise proteômica (Orbitrap) dos exossomos

Seleção dos genes de interesse e análise bioinformática

Clonagem e expressão dos genes de interesse

Produção de antisoros (policlonais e monoclonais) contra as proteínas de interesse

Estudos de localização celular e ultra-estrutura por microscopia confocal de fluorescência e por microscopia de transmissão dos exossomos.

*INICIO PREVISTO JULHO DE 2012

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