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AANNDDRREEIIAA IISSAABBEELL GGOONNÇÇAALLVVEESS LLOOPPEESS

Estudo comparativo dos metabolitos do exemestano num modelo

celular de cancro da mama estrogénio-dependente

Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente

ao Grau de Mestre em Toxicologia Analítica Clínica e Forense

Trabalho realizado sob a orientação de

Professora Doutora Natércia Teixeira

Professora Doutora Georgina Correia-da-Silva

Outubro, 2012

ii

Declarações

É autorizada a reprodução parcial desta dissertação apenas para efeitos de investigação,

mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.

iii

Comunicações em Painel (“Poster”) em Encontros Científicos

Lopes, A., Amaral, C., Varela, C., Roleira, F.M., Tavares da Silva, E., Correia da

Silva, G., e Teixeira, N. Biological Effects of Exemestane Metabolites In An Estrogen-

receptor-positive Aromatase-overexpressing Breast Cancer Cell Line. Apresentado no 5º

Encontro de Investigação Jovem da Universidade do Porto, Fevereiro 2012, Porto,

Portugal.

Lopes, A., Amaral, C., Varela, C., Roleira, F.M., Tavares da Silva, E., Correia da

Silva, G., e Teixeira, N. Comparative study of exemestane metabolites in breast cancer

cell model. Apresentado no XXI Porto Cancer Meeting 2012, Abril 2012, Porto, Portugal.

v

Agradecimentos

À Prof. Doutora Natércia agradeço, desde o início, a disponibilidade e a atenção.

Agradeço o apoio, a exigência, a partilha do saber e as valiosas contribuições para este

trabalho. Acima de tudo, obrigada por me acompanhar nesta jornada e por estimular o

meu interesse pelo conhecimento.

Agradeço à Prof. Doutora Georgina, que sempre manteve a porta aberta, a prontidão e

disponibilidade. Obrigada pelos conhecimentos transmitidos e capacidade de estímulo ao

longo de todo o trabalho. Agradeço também a paciência na hora das fotografias e o seu

olhar crítico sobre os resultados. A sua boa disposição é contagiante!

À Professora Maria de Lourdes pela atenção que sempre demonstrou desde o início do

mestrado. Obrigada pela preocupação demonstrada nestes dois anos para podermos

chegar ao fim desta etapa tranquilamente.

Agradeço ainda ao grupo de investigação do Prof. Doutor Elisiário Tavares do Centro de

Estudos Farmacêuticos, do Laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de

Farmácia da Universidade de Coimbra pela síntese dos compostos e pela disponibilidade

demonstrada.

Aos meus colegas de laboratório que tão bem me acolheram! Obrigada ao Bruno, à

Marta, à Mariana! À Sandra, ao Henrique, ao João e à Filomena obrigada pelas

gargalhas e palhaçadas. Um agradecimento particular ao David e à Susana pela

disponibilidade nos pequenos percalços. Agradeço também ao Daniel e à Dona Casimira

por todo o apoio prestado.

Um obrigado especial à Cristina por todo o apoio, mesmo! Obrigada pelas explicações e

pela paciência, pelo incentivo e compreensão. Nem sempre temos a sorte de encontrar

no nosso caminho alguém que nos identifiquemos. Obrigada pelas palavras de ânimo e

pelos sorrisos! Foi muito bom partilhar a câmara contigo!

Às minhas companheiras do número 93, à Marina e à Helena, por me terem tirado de

casa quando mais precisava e por ouvirem sempre os meus desabafos. Obrigada por me

fazerem ver a vida de outra perspetiva. Mas, acima de tudo, obrigada pela amizade!

Obrigada às amigas que estão longe, mas sempre presentes. Obrigada Flor, Sandra,

Carina, Neca e Tico por sempre se preocuparem comigo, e por me fazerem crer que a

amizade preenche uma vida!

vi

Jorge, obrigada por me fazeres ver que o dia nem sempre é tão cinzento. Obrigada pela

compreensão, encorajamento, carinho e amizade. Por muitas vezes que te agradeça

nunca será suficiente!

Agradeço à minha família, que sempre compreendeu os momentos em que não estive

presente durante todo o meu percurso académico e que sempre me apoiou e encorajou!

Um obrigado especial aos meus avós, que sempre se preocuparam e perguntavam

“Então, ainda falta muito?!”.

Ao meu irmão que permaneceu a meu lado durante as noites de estudo e trabalho

durante estes anos e que teimava em não ceder ao sono!

Aos meus pais, que nunca duvidaram e questionaram as minhas escolhas, que sempre

me apoiaram! Foi convosco que aprendi que com trabalho e humildade se chega a

qualquer lado, e o que sou hoje, sou graças a vocês. Obrigado pelo amor, pelo carinho,

pela confiança! Obrigada por tornarem tudo possível!

vii

Resumo

O cancro da mama é a patologia maligna mais frequente nas mulheres em todo o mundo.

A terapia dos cancros da mama estrogénio-dependentes em mulheres pós-menopáusicas

através da inibição da enzima aromatase, que catalisa a conversão de androgénios a

estrogénios, tem sido muito bem-sucedida. Assim, os inibidores da aromatase (AIs) são

uma alternativa ao tratamento com o tamoxifeno ou com o fulvestrant.

O exemestano, um AI esteróide de terceira geração, é um inativador irreversível da

enzima aromatase frequentemente utilizado na segunda linha terapêutica do cancro da

mama estrogénio-dependente. No entanto, apesar dos estudos epidemiológicos de

segurança clínica e toxicidade, permanecem por elucidar as suas vias de metabolização

bem como a identificação dos seus metabolitos. Este trabalho pretende avaliar os efeitos

celulares de metabolitos do exemestano, sintetizados no Centro de Estudos

Farmacêuticos, do Laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da

Universidade de Coimbra, numa linha celular humana de cancro da mama estrogénio-

dependente, que sobreexpressa a aromatase (MCF-7aro). Foram determinados os IC50 e

a avaliação dos efeitos biológicos demonstrou a presença de condensação de cromatina,

formação de blebbs de membrana e formação de vesículas acidas (AVOs) para as

concentrações mais elevadas. Verificou-se a diminuição da viabilidade e proliferação

celular, sendo o composto C33 o mais eficiente. Por outro lado, todos os compostos

conduziram à retenção de ciclo celular na fase G0/G1. Avaliou-se ainda os efeitos dos

compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade das células LTEDaro, uma linha celular que

mimetiza as células resistentes à terapia hormonal, demonstrando que, contrariamente

ao exemestano, os seus metabolitos conduzem à diminuição da viabilidade celular de

forma dose-dependente. No entanto, tendo em vista a elucidação do papel da autofagia

na indução de morte ou sobrevivência das células cancerígenas sensíveis (MCF-7aro) e

das células resistentes à terapia hormonal (LTEDaro), avaliaram-se os efeitos dos

compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular na presença ou ausência de um

inibidor da autofagia (3-MA) sugerindo que, como no caso do exemestano, a autofagia

não está envolvida nos mecanismos de sobrevivência das células MCF-7aro. No entanto,

a autofagia parece estar associada aos mecanismos de morte celular nas células

hormono-resistentes. Estas observações são importantes para elucidar os efeitos

biológicos induzidos pelos metabolitos do exemestano nas células mamárias malignas,

resistentes ou não, ao tratamento com o exemestano.

Palavras-chave: metabolitos do exemestano, aromatase, cancro da mama, estrogénio,

autofagia, apoptose.

ix

Abstract

Breast cancer is the most common malignancy in women worldwide. The breast cancer

estrogen-dependent therapy in pos-menopausal woman by the inhibition of the enzyme

aromatase, that is responsible for catalysing the last step in the conversion of androgens

to estrogens, has been very successful. The aromatase inhibitors (AIs) have proven to be

good alternatives to the tamoxifen or fulvestrant treatment.

Exemestane, a third generation steroidal AI, is an irreversible inactivator of aromatase. It

is frequently used as second-line therapy for breast cancer estrogen-dependent. Despite

its epidemiological studies of clínical safety and toxicity the metabolic pathways and

identification of its metabolites remain to be elucidate. In this work, we evaluated the

cellular effect of exemestano metabolites, synthesized by Centro de Estudos


Universidade de Coimbra, in an estrogen-dependent human breast cancer cell line, that

overexpress high levels of aromatase (MCF-7aro). It was determined the IC50 of

compounds and evaluated the biological effects in this cell line. It was observed formation

of chromatin condensation, membrane blebbs and the presence of acidic vesicles (AVOs)

in the highest concentrations. Exemestane metabolites induced a decline in cell

proliferation and viability, being compound C33 the most potent. On the other hand,

exemestane metabolites induced cell cycle arrest in G0/G1 phase. It was also evaluated

the effects of compounds C32, C33 e 17-βHE on the cell line LTEDaro, that over-expresse

aromatase and mimics the late stage of acquired resistance. It was demonstrated that,

contrary to exemestane, the metabolites lead to a decrease in cell viability in a dose-

dependent manner. However, in order to elucidate the role of autophagy in the induction

of cell death or survival of cancer cells sensitive (MCF-7aro) and cells resistant to

hormone therapy (LTEDaro), it was evaluated the effects of compounds C32, C33 and 17-

βHE on cell viability in the presence or absence of an inhibitor of autophagy (3-MA). Our

data suggest that autophagy is not involved with mechanisms of cell survival, as with

exemestane, in the hormone sensitive cell line. However, it appears that autophagy is

associated to cell death in the hormone resistant cell line. These observations are

important to elucidate the biological effects induced by the exemestano metabolites in

cells sensitive or resistant to exemestano therapy.

Keywords: exemestane metabolites, aromatase, breast cancer, estrogen, autophagy,

apoptosis.

xi

Índice

Declarações............................................................................................................ ii

Comunicações em Painel (“Poster”) em Encontros Científicos ............................... iii

Agradecimentos ...................................................................................................... v

Resumo ................................................................................................................. vii

Abstract ................................................................................................................. ix

Índice ..................................................................................................................... xi

Lista de imagens .................................................................................................. xiii

Lista de tabelas .................................................................................................... xiv

Lista de abreviaturas ............................................................................................ xv

Capítulo I: Introdução ........................................................................................................ 3

1.1. Cancro da mama estrogénio-dependente ........................................................... 5

1.1.1. Estrogénios .................................................................................................. 6

1.1.2. Recetores de estrogénio .............................................................................. 6

1.1.3. Vias de sinalização ...................................................................................... 8

1.1.4. Síntese de estrogénios .............................................................................. 11

1.1.5. Aromatase.................................................................................................. 13

1.2. Terapia endócrina ............................................................................................. 15

1.2.1. Modeladores e inativadores dos recetores de estrogénio ........................... 15

1.2.2. Inibidores da aromatase ............................................................................. 16

1.3. Exemestano ...................................................................................................... 18

1.3.1. Farmacocinética e farmacodinâmica .......................................................... 21

1.3.2. Metabolitos do exemestano ....................................................................... 22

1.3.3. Efeitos biológicos ....................................................................................... 24

1.3.4. Eficácia terapêutica .................................................................................... 25

1.3.5. Segurança e efeitos secundários ............................................................... 28

1.4. Resistência à terapia endócrina ........................................................................ 31

1.4.1. ER e os co-reguladores .......................................................................... 31

1.4.2. Crosstalk entre ER e recetores de tirosina cinases (RTK) ...................... 35

xii

1.4.3. Regulação do ciclo e morte celular ......................................................... 37

1.4.4. Autofagia e apoptose ............................................................................. 39

Objetivos ..................................................................................................................... 43

Capítulo II: Materiais e Métodos ...................................................................................... 45

2.1. Materiais .......................................................................................................... 47

2.2. Compostos ........................................................................................................ 47

2.3. Culturas celulares ............................................................................................ 48

2.3.1. MCF7-aro ................................................................................................... 48

2.3.2. LTEDaro ..................................................................................................... 48

2.4. Determinação do IC50 nas células MCF-7aro .................................................... 49

2.5. Estudos morfológicos ........................................................................................ 49

2.5.1. Coloração de Giemsa ................................................................................. 50

2.5.2. Coloração de Hoechst ................................................................................ 50

2.5.3. Coloração com laranja de acridina ............................................................ 50

2.6. Viabilidade e proliferação celular....................................................................... 51

2.7. Ciclo celular ...................................................................................................... 51

2.8. Análise estatística ............................................................................................. 52

Capítulo III: Resultados ................................................................................................... 53

3.1. Determinação do IC50 nas células MCF-7aro .................................................... 55

3.2. Estudos morfológicos ........................................................................................ 56

3.3. Análise da viabilidade e proliferação celular nas células MCF-7aro .................. 61

3.4. Ciclo celular ...................................................................................................... 65

3.5. Avaliação da presença de vesículas ácidas por coloração com laranja de

acridina .................................................................................................................... 67

3.6. Análise da viabilidade celular nas células LTEDaro .......................................... 68

3.7. Efeito do inibidor da autofagia na viabilidade celular ......................................... 70

Capítulo IV: Discussão e Conclusões ............................................................................. 73

Capítulo V: Referências Bibliográficas ............................................................................ 81

xiii

Lista de imagens

Figura 1. Domínios estruturais do ERα e o ERβ. .............................................................. 7

Figura 2. Via de sinalização dos ER ................................................................................. 8

Figura 3. Via não genómica ou de sinalização esteróide iniciada na membrana (MISS). . 9

Figura 4. Representação esquemática das várias vias de sinalização intracelulares do

estrogénio.. ..................................................................................................................... 10

Figura 5. Biossíntese de estrogénios a partir do colesterol. ............................................ 12

Figura 6. Estrutura terciária da aromatase isolada de placenta humana. ........................ 14

Figura 7. Inibidores da aromatase (AIs).. ........................................................................ 17

Figura 8. Estrutura química do exemestano. .................................................................. 18

Figura 9. Mecanismo de inibição da aromatase pelo exemestano .................................. 18

Figura 10. Mamografia do mesmo tumor mamário antes e após 3 meses de tratamento

com exemestano (25 mg/dia) .......................................................................................... 19

Figura 11. Principais vias metabólicas envolvidas no metabolismo do exemestano. ...... 22

Figura 12. Metabolitos do exemestano.. ......................................................................... 23

Figura 13. 1α,2α-epoxi-6-metilenandrost-4-ene-3,17-diona ............................................ 24

Figura 14. Relação entre o ERα e ERβ.. ........................................................................ 33

Figura 15. Vias de sinalização dos recetores de estrogénio (ER).. ................................. 36

Figura 16. Regulação do ciclo celular. ............................................................................ 38

Figura 17. Regulação da autofagia. ................................................................................ 40

Figura 18. Compostos em estudo ................................................................................... 47

Figura 19. Determinação do IC50 dos compostos C32, C33 e 17-βHE em células MFC-7aro.

........................................................................................................................................ 55

Figura 20. Células MCF-7aro tratadas com testosterona a 1 nM, examinadas por

microscopia de contraste de fase, coloração de Giemsa e coloração de Hoechst, após 72

horas ............................................................................................................................... 56

Figura 21. Efeito do composto C32 (10 e 15 µM) na morfologia celular, verificada por

microscopia de contraste de fase, coloração de Giemsa e coloração de Hoechst.. ......... 57

Figura 22. Efeito do composto C33 (0,5; 1; 2,5 e 5 µM) na morfologia celular, verificada

por microscopia de contraste de fase.. ............................................................................ 58

Figura 23. Efeito do composto C33 na morfologia celular, verificada por coloração de

Giemsa e coloração de Hoechst. ..................................................................................... 59

Figura 24. Efeito do composto 17-βHE (10 e 15 µM) na morfologia celular, verificada por

microscopia de contraste de fase, coloração de Giemsa e coloração de Hoechst .......... 60

xiv

Figura 25. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular, avaliado pelo

ensaio de MTT. ............................................................................................................... 62

Figura 26. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na síntese de DNA. ......................... 63

Figura 27. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na integridade da membrana celular.

....................................................................................................................................... 64

Figura 28. Histograma representativo do efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE no ciclo

celular das células MCF-7aro.. ........................................................................................ 66

Figura 29. Coloração de laranja de acridina das células MCF-7aro, tratadas com

testosterona a 1 nM e com os compostos C32, C33 e 17-βHE, durante 144 horas.. .......... 67

Figura 30. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular das células

LTEDaro, avaliado pelo ensaio de MTT. ......................................................................... 69


MCF-7aro, na presença ou ausência de 3-MA. ............................................................... 70


LTEDaro, na presença ou ausência de 3-MA. ................................................................. 71

Lista de tabelas

Tabela 1. Classificação dos inibidores da aromatase. .................................................... 16

Tabela 2. Ensaios clínicos do exemestano realizados em diferentes linhas de tratamentos

em mulheres pré e pós-menopausicas ........................................................................... 25

Tabela 3. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE no ciclo celular das células MCF-7aro.

....................................................................................................................................... 65

xv

Lista de abreviaturas

17-βHE 17β-hidroexemestano

3-MA 3-metiladenina

4-OHA Formestano

AIs Inibidores da aromatase

Akt Proteína cinase B

AMPK Proteína cinase AMP

AP1 Proteína ativadora 1

AR Recetores de androgénio

AREG Proteína anfiregulina

ARHI Proteína G relacionada com a Ras

AVOs Vesículas ácidas

C32 6α/β-spirooxiranandrosta-1,4-dieno-3,17-diona

C33 1α,2α-epoxi-6-metilenandrost-4-ene-3,17-diona

CDK Proteínas cinases

COX-2 Ciclooxigenase-2

DBD Domínio de ligação de DNA

DHEA Desidroepiandrosterona

DHEAS Desidroepiandrosterona sulfato

DHT 5α-dihidrotestosterona

DMSO Dimetilsulfóxido

DRAM Damage-regulated autophagy modelator

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EGFR Recetor do fator de crescimento epidérmico

EORTC European Organisation for Research and Treatment of Cancer

ER Recetores de estrogénio

ERE Elemento de resposta ao estrogénio

GFR Recetores de fatores de crescimento

HDL Lipoproteínas de alta densidade

http://en.wikipedia.org/wiki/European_Organisation_for_Research_and_Treatment_of_Cancer

xvi

HER Recetor epidérmico humano

HER2 Recetor epidérmico humano 2

IES Intergroup Exemestane Study

IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I

IGFR Recetor do fator de crescimento semelhante à insulina

IL-11 Interleucina 11

LBD Domínio de ligação de ligando

LDH Lactato desidrogenase

LDL Lipoproteínas de baixa densidade

LH Hormona luteinizante

LTED Long Term Estrogen Deprivation

MA Mesgestrol acetato

MAPK Proteína cinase ativada por mitogénios

MEM Meio de cultura Eagle’s

MISS Via de sinalização esteróide iniciada na membrana

MNAR Modulador da ação não genómica do recetor de estrogénio

mTOR Mammalian target of rapamycin

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NCOA3 Recetor nuclear co-ativador 3

NEM Meio de cultura sem vermelho de fenol

NF-ĸB Fator nuclear ĸB

NISS VIA de sinalização iniciada no núcleo

NSABP B33 National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B33

PGE2 Prostaglandina E2

PI Iodeto de Propídio

PI3K Fosfatidilinositol-3 cinase

PINP Peptídeo de pró-colagénio tipo I

PKA Proteína cinase A

PKC Proteína cinase C

PR Recetores de progesterona

xvii

PTEN Proteína supressora de tumor homóloga à tensina

PTH Hormona paratiroide

PUMA p53 modeladora da apoptose

RB Proteína do retinoblastoma

ROS Espécies reativas de oxigénio

SBF Soro bovino fetal

SBF-CT SBF inativado pelo calor e tratado com carvão ativado

SEM Erro padrão da média

SERDs Inativadores seletivos dos recetores de estrogénio

SERMs Modeladores seletivos dos recetores de estrogénio

SP1 Proteína específica 1

T Testosterona

TEAM The Tamoxifen Exemestane Adjuvant Multinational

TKR Recetores de crescimento

TKR Recetores Tirosina cinase

TNF-α Fator de necrose tumoral α

EESSTTUUDDOO CCOOMMPPAARRAATTIIVVOO DDOOSS MMEETTAABBOOLLIITTOOSS DDOO EEXXEEMMEESSTTAANNOO NNUUMM

MMOODDEELLOO CCEELLUULLAARR DDEE CCAANNCCRROO DDAA MMAAMMAA EESSTTRROOGGÉÉNNIIOO--DDEEPPEENNDDEENNTTEE

Capítulo I: Introdução

2

Estudo comparativo dos metabolitos do exemestano num modelo celular de cancro da mama estrogénio-dependente

3



4


5

1.1. Cancro da mama estrogénio-dependente

O cancro da mama é a patologia maligna mais frequente nas mulheres, no entanto a taxa

de mortalidade tem vindo a diminuir devido ao desenvolvimento de rastreios e

tratamentos mais adequados e eficazes. Estima-se que cerca de 60 a 75% dos tumores

mamários são estrogénio-dependentes [1]. As hormonas esteróides (estrogénio e

progesterona) estão envolvidas, respetivamente, na regulação do crescimento ductal e do

desenvolvimento alveolar na glândula mamária normal, podendo estar implicadas no

desenvolvimento e progressão do cancro da mama [2].

Os ovários são a principal fonte de estrogénios circulantes nas mulheres pré-

menopáusicas. Após a menopausa, os ovários cessam a produção de estrogénios, sendo

a síntese de hormonas esteróides assegurada por outros tecidos, nomeadamente, o

tecido mamário, ocorrendo a aromatização dos androgénios circulantes, androstenediona

e testosterona, a estrogénios, estrona e estradiol, respectivamente. Esta reação é

catalisada pela enzima aromatase, um dos passos essenciais, na biossíntese de

estrogénios. A síntese periférica de estrogénios conduz a um aumento da concentração

de estrogénios in situ. De facto, dois terços dos cancros da mama apresentam atividade

aromatásica e os níveis de estrogénios nos tecidos malignos são mais elevados do que

nos tecidos mamários normais [3].

A presença de biomarcadores no cancro tornou ainda mais eficaz a identificação dos

tipos de tumores, bem como, a escolha de tratamentos específicos. Os marcadores mais

analisados são os recetores de estrogénio (ER), os recetores de progesterona (PR) e o

recetor epidérmico humano 2 (HER2). No entanto, verificam-se diferenças na expressão

destes marcadores. Esta heterogeneidade intratumoral pode conduzir a uma

classificação errada do tipo de tumor, ou a tratamentos ineficientes, sendo, por isso,

necessário mais estudos [4].

O tratamento deste tipo de carcinomas mamários está associado à terapia endócrina que

inclui os modeladores seletivos dos recetores de estrogénio (SERMs) [5], com atividade

antagonista parcial ou total, os inativadores seletivos dos recetores de estrogénio

(SERDs) [6] e os inibidores da aromatase (AIs) [7].


6

1.1.1. Estrogénios

Os estrogénios estão envolvidos no desenvolvimento de vários órgãos e tecidos, tais

como os ossos, cérebro, sistema cardiovascular e diversos tecidos do trato urogenital [8].

Desempenham também um papel importante na regulação da secreção de

gonadotrofinas, na ovulação, desenvolvimento das características sexuais femininas e na

regulação da síntese de lipoproteínas [9]. No entanto, fatores hormonais como os

estrogénios, a progesterona, a prolactina e outras hormonas podem estimular o

crescimento do tecido epitelial da mama, podendo, deste modo, devido ao crescimento

exacerbado, acumular lesões no DNA, aumentando, assim, o risco de cancro da mama

[10]. A enzima aromatase presente no tecido adiposo da mama, promove a síntese de

estrogénios, existindo, assim, concentrações locais mais elevadas do que as existentes

na corrente sanguínea [11].

1.1.2. Recetores de estrogénio

As ações biológicas dos estrogénios são mediadas pelos seus ER específicos, ERα e

ERβ. Estes recetores pertencem à superfamília de recetores nucleares. O ERα e o ERβ

são codificados por diferentes genes, o ESR1 e ESR2, respetivamente [12].

Estes recetores têm cinco domínios estruturais semelhantes, classificados de A a F,

representados na figura 1. O domínio A/B, na região N-terminal, é altamente variável na

sua sequência e está envolvido nas interações proteína-proteína. Esta baixa

percentagem de homologia (17%) pode indicar que o ERα e o Erβ interagem de forma

distinta com as proteínas. O domínio C é altamente conservado e é responsável pela

ligação ao DNA (DBD). A região D, que contém um sinal de localização nuclear, é

importante para a estrutura tridimensional dos recetores. O domínio E está envolvido nas

ligações ao ligando (LBD) e encontra-se associado à dimerização e interação com co-

fatores. Por fim, a região C-terminal (domínio F) é altamente variável e está envolvida na

transativação dos recetores [13-15].


7

Figura 1. Domínios estruturais do ERα e o ERβ. Adaptado de [14].

Os ER encontram-se amplamente distribuídos pelo organismo. Estes recetores têm um

papel importante no desenvolvimento de vários órgãos, como os pulmões, o cólon e o

sistema vascular [14]. No entanto, a sua abundância relativa pode variar consoante as

regiões do próprio órgão [15]. Assim, como os ERα e ERβ estão envolvidos na regulação

do crescimento celular (proliferação e diferenciação), a sua desregulação pode conduzir a

uma proliferação exacerbada das células tumorais, bem como influenciar o processo de

metastização. Embora estes recetores estejam presentes em cerca de metade dos

cancros da mama, pensa-se que a sua expressão pode perder importância com o

desenvolvimento e progressão do tumor [16].

Através de estudos moleculares, o mecanismo de ação dos ER trouxe novos horizontes

no que toca ao aumento de eficácia nos tratamentos. De facto, a determinação dos níveis

destes recetores no cancro da mama é uma ferramenta essencial para prever a

progressão da doença, a escolha do tratamento, bem como a elucidação dos

mecanismos associados à resistência de fármacos [2]. Alguns estudos demonstraram o

aumento da razão ERα/ERβ nos cancros da mama quando comparada com tumores

benignos ou tecidos normais, sugerindo que o ERα está mais associado com a

carcinogénese, enquanto que o ERβ atua como protetor contra a atividade mitogénica

dos estrogénios nas lesões malignas [17].

Os mecanismos e as diferentes vias de transcrição mediadas pelos ER envolvem

múltiplos genes, no entanto a terapia envolvendo o uso de antagonistas (SERDs) ou

modeladores (SERMs) destes recetores pode trazer enormes benefícios no tratamento

desta patologia.


8

1.1.3. Vias de sinalização

Como outros membros da família dos recetores nucleares, os ER, após ligação ao

estrogénio, regulam a transcrição de genes por ligação direta ao DNA. No entanto,

respostas mais rápidas (em segundos ou minutos) podem também ocorrer caso o

estrogénio se ligue a ER membranares ou a outros recetores membranares que não são

nem estrutural nem geneticamente relacionados com os ER, levando à ativação de

diferentes vias de transdução de sinal. Estes mecanismos de ação podem ser

classificados como via genómica e via não-genómica.

Na via genómica ou de sinalização iniciada no núcleo (NISS), os estrogénios ligam-se

aos seus recetores, ocorrendo a formação de homo ou heterodímeros de ER. Esta via

pode ocorrer sob duas formas, a via clássica e a via não clássica (figura 2).

Figura 2. Via de sinalização dos ER: NISS (sinalização esteróide iniciada no núcleo). Na via clássica, A) o

ER liga-se diretamente ao DNA, na região ERE, recrutando co-reguladores. Na via não clássica, B) a

regulação e transcrição génica é assegurada por interações com outras proteínas. Adaptado de [18].

Na via clássica, o complexo nuclear liga-se à região do elemento de resposta ao

estrogénio (ERE), resultando no recrutamento de proteínas coreguladoras (co-

activadores ou co-repressoras). Esta ligação resulta na ativação ou supressão da

expressão de genes. Na via não clássica os ER regulam a transcrição génica através de

interações com outras proteínas reguladas por fatores de transcrição, como o complexo

Fos-Jun, que se ligam a sequências de DNA alternativas (AP-1). Os ER interagem com


9

estes fatores, promovendo a ligação ao DNA e consequente ativação do processo de

transcrição [18].

Na via não-genómica, ou de sinalização esteróide iniciada na membrana (MISS), os

estrogénios atuam nos ER localizados perto ou na membrana plasmática ou através das

proteínas associadas à membrana dependentes de estrogénio (figura 3). A resposta da

via não-genómica resulta na ativação de vias de sinalização que levam ao aumento dos

níveis de cálcio ou de óxido nítrico e à ativação de múltiplas cascatas de cinases,

incluindo a proteína cinase ativada por mitogénios (MAPK), fosfatidilinositol-3 cinase

(PI3K), proteína cinase A (PKA) e a proteína cinase C (PKC). Estas induzem a

transcrição de genes envolvidos em múltiplos processos, como proliferação,

diferenciação e apoptose [12].

Figura 3. Via não genómica ou de sinalização esteróide iniciada na membrana (MISS) [19].

A via genómica e não genómica não são totalmente independentes, verificando-se uma

convergência de múltiplas respostas desencadeadas por estas vias, designado por

mecanismo de crosstalk (figura 4). A ativação da via genómica conduz a um aumento da

transcrição de genes importantes na via de ativação do recetor do fator de crescimento

epidérmico (EGFR). Consequentemente, o ER ativo, e através da interação com

moléculas sinalizadoras intermediárias, tais como Shc e o modulador da ação não

genómica do ER (MNAR), pode conduzir à ativação de recetores tirosina cinase (TKR),

como o EGFR, o recetor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), recetores

acoplados à proteína G, o que pode resultar na indução da atividade da via EGFR/2 e de

fatores como a HER2 o c-Scr. A família de proteínas HER é constituída por recetores de

fatores de crescimento epidérmicos incluindo o EGFR (HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3


10

(HER3) e o ErbB4 (HER4). À exceção do HER2, todos estes recetores têm ligandos

específicos, que após a ligação promovem a formação de homo ou heterodímeros com

consequente ativação de tirosinas cinases. Assim, as proteínas EGFR estão envolvidas

em múltiplas vias de sinalização como a PI3K/Akt/mTOR, a Ras/Raf/Mek e a STATS, que

desempenham um papel importante na proliferação, angiogénese e diferenciação [5, 20].

O HER3 contém vários locais de ligação para a proteína PI3K. Por sua vez, o HER2

encontra-se sobreexpresso em 20-25% dos cancros da mama estrogénio-dependentes. A

ativação destas tirosinas cinases leva à ocorrência de fosforilações, levando à ativação

de várias vias de sinalização envolvendo a PI3K e à perda da atividade da proteína

supressora de tumor homóloga à tensina (PTEN) [21].

Figura 4. Representação esquemática das várias vias de sinalização intracelulares do estrogénio. A via 1 representa a via clássica, atuando os ER como factores de transcrição nucleares. A via 2 envolve ER e proteínas membranares (via não genómica) e a via 3 apresenta a ligação de estrogénio ao recetor GPR30/GPER, que leva à transdução de sinal através de cinases citoplasmáticas. As vias de sinal 2 e 3 são vias de resposta rápida, comparativamente à via 1. Adaptado de [8].

De facto, a via PI3K/Atk/mTOR é umas vias mais importantes no desenvolvimento do

cancro, pois regula a proliferação, o crescimento e a sobrevivência celular (figura 4).

Nesta via, os fatores de crescimento ligam-se aos EGFR, ativando a PI3K [22]. Uma vez

ativada interage com o mediador central desta via, a serina/treonina cinase Akt que

estimula a síntese proteica e o crescimento através da ativação da serina/treorina cinase


11

mTOR. Esta, por sua vez, pode exercer feedback positivo na Akt, amplificando a ativação

desta via. A desregulação desta via pode ocorrer pela mutação na proteína PI3K,

amplificação da Akt e da disfunção do gene supressor de tumor PTEN.

Por outro lado, as proteínas cinases fosforilam os ER nucleares que recrutam os seus co-

activadores e outros fatores de transcrição, conduzindo ao aumento da expressão

genética, e consequentemente proliferação celular. Todos os produtos resultantes destas

vias aumentam a ativação dos TKRs por fatores de crescimento, completando a atividade

dos ER e o seu crosstalk com os recetores de fatores de crescimento e ativação de

cinases [23]. Por sua vez, outros estudos demonstraram que o crosstalk entre o ER e a

via HER1/2 parece ser determinante no desenvolvimento de resistência de novo e de

resistência adquirida ao tratamento do cancro da mama [18, 24], desempenhando um

papel importante na regulação da proliferação celular bem como na inibição da apoptose

[25].

1.1.4. Síntese de estrogénios

A síntese de estrogénios ocorre em locais distintos nas mulheres pré e pós-

menopáusicas. As células teca dos ovários são a principal fonte de estrogénio na mulher

antes da menopausa. O estrogénio é libertado para a corrente sanguínea exercendo a

sua ação nos tecidos alvo (tecido adiposo e epitelial, endotélio vascular, ossos e cérebro)

[11, 26]. No entanto, na pós-menopausa, há uma diminuição da síntese de estrogénios

pelos ovários, passando a ocorrer a sua síntese essencialmente no tecido adiposo.

Durante a gravidez a síntese ocorre essencialmente na placenta.

O colesterol é a molécula percursora das hormonas esteróides (figura 5). A partir deste

percursor inicia-se a síntese de estrogénios mediada por enzimas altamente específicas

como enzimas citocromo P450, desidrogenases esteróides e redutases [26].

Os principais precursores androgénicos dos estrogénios são a androstenediona, a

desidroepiandrosterona (DHEA) e a desidroepiandrosterona sulfato (DHEAS), cujas

concentrações circulantes são mais elevadas que as dos esteróides, constituindo assim

um grande reservatório de precursores [26]. Por fim, a aromatase (enzima da família do

citocromo P450) cataliza a conversão de androgénios a estrogénios [27].


12

Figura 5. Biossíntese de estrogénios a partir do colesterol. 3β-HSB: 3β-hidroxiesteróide desidrogenase-∆5,4

-

isomerase; 17β-HSB: 17β-hidroxiesteróide desidrogenase. Adaptado de [28].

A biossíntese de estrogénios ocorre em três passos. A primeira e a segunda hidroxilação

ocorrem no grupo 19-metil. O terceiro passo envolve a clivagem da ligação C10-C19,

conduzindo à aromatização do anel A [29]. Existe também outra via relacionada com a

síntese de estrogénios no tecido mamário e no endométrio, que tem como finalidade a

inativação de estrogénios. A via da sulfatase é caracterizada pela conversão de sulfato

de estrona em estrona pela enzima sulfatase e pela sua biotransformação a derivados

sulfatados inativos por ação das sulfotransferases [30].

Os estrogénios sintetizados nos tecidos periféricos atuam essencialmente nesses

tecidos, de forma autocrina, não ocorrendo libertação para o fluido intersticial, nem para a

corrente sanguínea [31]. Não é, assim, possível correlacionar os níveis sanguíneos com a

atividade hormonal que ocorre nos tecidos alvo, dado que estes podem atingir níveis

elevados no local de síntese e de ação.

A síntese in situ de estrogénios, especialmente em mulheres pós-menopáusicas, tem um

papel importante na patogénese e desenvolvimento do cancro da mama estrogénio-

dependente. No entanto, a sobre-expressão da enzima aromatase, envolvida na síntese

destas hormonas, também parece estar associada ao desenvolvimento mais agressivo

desta patologia e ao aumento de recorrências a curto e médio prazo [32]. Alguns autores

defendem, ainda, que os estrogénios podem ser transformados em metabolitos

genotóxicos e/ou estar envolvidos em ciclos de oxidação-redução, conduzindo à

formação de espécies reativas de oxigénio (ROS), que podem levar a lesões no DNA,

causando mutações [33].


13

1.1.5. Aromatase

A aromatase pertence à superfamília do citocromo P450 que é constituída por 460

elementos distribuídos por 74 famílias. É uma hemoproteína expressa em vários tecidos

do organismo, como ovários, placenta, cérebro e tecido adiposo [34]. A aromatase é uma

proteína glicosilada com 58 kDa [35]. Localiza-se na membrana do reticulo

endoplasmático e é constituída por duas proteínas, o citocromo P450 e a flavoproteína,

NADPH-citocromo P450 reductase [36]. Este complexo enzimático é responsável pela

catalisação das reações que levam à formação do anel aromático característico dos

estrogénios [37, 38]. A aromatase é codificada pelo gene CYP19A1, com 10 exões e

aproximadamente 120 kb, localizado no braço mais curto do cromossoma 15 (15q21)

[35].

A regulação da aromatase em cada tecido é muito complexa envolvendo promotores

associados a enhancers e a supressores específicos. No cancro da mama, há um

aumento do mRNA transcrito pela regulação do promotor I.4. Este aumento poderá ser

devido à maior libertação de fatores de necrose tumoral α (TNF-α) e de interleucinas 11

(IL-11) por parte das células epiteliais malignas [39]. No entanto, nem todos os transcritos

da aromatase são devidos ao promotor I.4 sendo os outros resultantes da ação dos

promotores II e I.3. Ao contrário do promotor I.4, os promotores II e I.3 possuem TATA

boxes distantes por 215 bp, o que pode indicar que estes promotores partilham os

mesmos fatores de regulação [39]. Os promotores II e I.3 podem ainda ser ativados pela

prostaglandina E2 (PGE2), sintetizada e excretada pelas células malignas [39, 40],

conduzindo ao aumento da expressão da enzima e consequente atividade quando

comparada à atividade desta enzima no tecido mamário normal. Este processo é a

principal razão para o aumento da síntese de estrogénios neste tecido podendo conduzir

ao desenvolvimento de cancro da mama. Muitos tumores expressam ainda grandes

quantidades de ciclooxigenase-2 (COX-2) e de PGE2. Estas estimulam a expressão da

aromatase, estando demonstrado que os inibidores da COX-2 também inibem a

transcrição da aromatase [35]. De facto, cerca de 80-90% da transcrição da aromatase

no cancro da mama é assegurada por estes promotores, podendo ainda haver

transcrição mediada pelo promotor I.7 [40]. Este promotor existe nas células epiteliais e é

sobre-expresso no cancro da mama [35], podendo conduzir à sobre-expressão da

aromatase na mama. Por outro lado, estudos comprovaram que a expressão da

aromatase é mais elevada nos adipócitos que se encontram perto das células

cancerígenas do que nas células epiteliais e no estroma da mama, havendo, assim,

acumulação de estrogénios devido à sua maior produção in situ [41].


14

A estrutura da aromatase permaneceu desconhecida durante anos, dificultando deste

modo o conhecimento do seu mecanismo de ação. No entanto, muito recentemente foi

possível determinar a estrutura da aromatase presente na placenta humana, por

cristalografia (figura 6) [42]. A estrutura terciária da aromatase consiste em 12 hélices α

principais (identificadas de A a L) e 10 folhas β (numeradas de 1 a 10) [43]. O centro

catalítico da enzima é constituído pelos resíduos Ile305, Ala306, Asp309 e Thr310 da

hélice I, Phe221 e Trp224 da hélice F, Ile133 e Phe134 do loop B-C, Leu372 e Val373 da

hélice K e do loop β3, Met374 da folha β3 e da Leu477 e Ser478 do loop β8-β9 [42]. Os

loops entre as hélices B’ e C, β7 e β8, β9 e β10 fazem parte do local ativo da enzima [43].

Figura 6. Estrutura terciária da aromatase isolada de placenta humana. A azul-escuro está representado o

terminal amina e a vermelho o terminal carboxilo. As hélices α principais estão identificadas de A a L e as folhas β numeradas de 1 a 10. A ligação da androstenediona está também representada com a cor magenta [43].


15

1.2. Terapia endócrina

O cancro da mama apresenta diversos estados clínicos que variam com a evolução

característica de cada tumor e a reação ao tratamento. É portanto, necessário, adaptar

cada plano de tratamento a cada paciente, aumentando a taxa de sobrevivência, sem

interferir com a qualidade de vida do doente.

A terapêutica do cancro da mama pode ser assegurada por tratamentos locais, como a

cirurgia e radioterapia, e por terapias sistémicas, tais como a quimioterapia e terapia

hormonal. O desenvolvimento da terapia endócrina para tratamento do cancro da mama

é um dos mais notáveis progressos na história da terapêutica do cancro [44].

Nas mulheres pré-menopaúsicas, a biossíntese de estrogénio pode ser bloqueada por

ablação dos ovários, por cirurgia ou radioterapia, ou pelo tratamento com agonistas dos

recetores da hormona luteinizante (LH), responsável pela ação da aromatase nos

ovários. Os modeladores seletivos dos ER (SERMs), como o tamoxifeno [45], ou os

inativadores seletivos dos ER (SERDs), como o fulvestrant [46] também são terapêuticas

eficazes. Nas mulheres pós-menopáusicas, para além da terapêutica com os SERMs e

SERDs, os inibidores da aromatase (AIs) de terceira geração são também propostos,

conduzindo à redução dos níveis de estrogénios in situ.

1.2.1. Modeladores e inativadores dos recetores de estrogénio

Os SERMs atuam como antagonistas ou agonistas do ER, inibindo ou ativando os ER.

Um dos fármacos desta categoria, mais utilizado mundialmente, é o tamoxifeno, descrito

como sendo um fármaco essencial no tratamento do cancro da mama. O tamoxifeno é

administrado geralmente como terapia de primeira linha. Atua nos tecidos mamários,

ligando-se aos ER permitindo a sua dimerização e ligação ao ERE, recrutando co-

repressores e impedindo, assim, a transcrição de genes. Inicialmente foi utilizado para

tratamento de cancro da mama em estado avançado, sendo posteriormente utilizado na

terapia adjuvante. Mais recentemente foi aprovado como fármaco para reduzir o risco de

desenvolvimento de tumores mamários em fase inicial em mulheres pré e pós-

menopáusicas. Apesar da sua eficiência clínica nos tumores mamários, o tamoxifeno

também modela o perfil lípido devido à sua atividade anti-estrogénica, verificando-se uma

redução de lipoproteínas de baixa densidade e mantendo ou aumentando as


16

lipoproteínas de alta densidade. No entanto, apresenta também alguns efeitos

secundários, nomeadamente o aumento do risco de eventos tromboembólicos, de

carcinoma do endométrio e de outras patologias malignas [47].

Os SERDs ligam-se aos ER impedindo a sua dimerização, acelerando a degradação

destes, e conduzindo, assim, à inativação da via de sinalização iniciada por estas

hormonas [48]. O SERD fulvestrant é bem tolerado, sendo eficaz no tratamento de

cancros da mama estrogénio-dependentes [49], no entanto, também se verificam efeitos

secundários como náuseas, vómitos e dores de estômago [50].

1.2.2. Inibidores da aromatase

Os AIs atuam de forma distinta, inibindo a função da enzima aromatase responsável pela

conversão de androgénios a estrogénios, diminuindo, desta forma, a síntese de

estrogénios. Estes fármacos caraterizam-se pela sua estrutura química sendo

classificados em AIs esteróides e não-esteróides. Os AIs esteróides, ou do tipo I, são

derivados da androstenediona e ligam-se irreversivelmente à aromatase. Por sua vez, os

AIs não esteróides, ou do tipo II, são inibidores competitivos da aromatase (tabela 1) [1].

Tabela 1. Classificação dos inibidores da aromatase (AIs).

Esteróides (Tipo I) Não Esteróides (Tipo II)

Primeira Geração Testolactona Aminoglutetimida

Segunda Geração Formestano Fadrozol

Terceira Geração Exemestano Anastrozol e Letrozol

O desenvolvimento dos AIs levou à descoberta de fármacos mais eficazes e mais

potentes. De facto, a terceira geração de AIs esteróides, como o exemestano, e não

esteróides, como o anastrozol e letrozol, é a mais potente e demonstra um espetro de

ação mais reduzido, cujos efeitos secundários resultantes da terapia são menores, sendo

atualmente a mais utilizada nas mulheres pós-menopaúsicas (figura 7). Paralelamente,

estudos clínicos demonstraram que o uso de AIs no tratamento de cancro da mama

apresenta uma maior eficácia comparativamente ao tratamento com o tamoxifeno [51].


17

Figura 7. Inibidores da aromatase (AIs). A terceira geração de AIs atua exclusivamente sobre a aromatase,

tendo efeitos colaterais minimos. A potência dos AIs é determinada pela percentagem de inibição no organismo. 4-OHA (4-hidroxiandrostenediona ou Formestano®).

Estudos, utilizando a linha celular de cancro da mama MCF-7, revelaram que os AIs de

terceira geração induzem uma retenção de ciclo celular na fase G0/G1 e morte celular, por

apoptose. A via de sinalização apoptótica induzida envolve as proteínas supressoras de

tumor p53 e a p21 e a ativação de caspases, havendo diminuição da expressão da Bcl-2

e da ciclina D1 [52].

Os AIs podem ser administrados durante um longo período, embora o risco de

desenvolvimento de resistência a estes fármacos não possa ser ignorado [53]. O

tratamento com AIs de terceira geração leva ao decréscimo dos níveis séricos de

estrogénios de cerca de 81%-94% para o anastrozol, 88%-98% para o letrozol e 52-72%

para o exemestano [44]. Esta diminuição está associada à perda de massa óssea,

ocorrência de eventos cardiovasculares, complicações ginecológicas e alterações do

sistema músculo-esquelético [54-57].


18

1.3. Exemestano

O exemestano (6-metilenandrosta-1,4-dieno-3,17-diona) pertence à classe dos AIs

esteróides, atuando como o substrato natural da aromatase, a androstenediona (figura 8).

O exemestano liga-se covalentemente à enzima, inativando-a irreversivelmente.

Figura 8. Estrutura química do exemestano.

Estudos, relacionando a estrutura e função do exemestano, sugerem que após ligação ao

local ativo da aromatase, este é convertido em intermediários reativos que se ligam

irreversivelmente à enzima, causando a sua inativação. A interação entre o exemestano e

a aromatase é feita em três etapas. A primeira consiste na ligação do fármaco à enzima.

Na segunda, o exemestano é convertido a um intermediário que se liga à enzima,

resultando, assim, num complexo que conduz à inativação irreversível da aromatase [29,

58]. Por último, ocorre a degradação da enzima por proteossomas (figura 9) [58].

Figura 9. Mecanismo de inibição da aromatase pelo exemestano [58].


19

O exemestano é altamente específico para a enzima, e embora se verifique uma

diminuição significativa de estrogénios circulantes, não se verificam alterações na síntese

de corticosteróides ou de aldosterona a nível adrenal, nem nos níveis plasmáticos de 17-

hidroxiprogesterona e de dehidroepiandrostenediona (DHEA) [59]. Estudos envolvendo

mulheres com cancro da mama em estado avançado, mostraram que uma dose de

exemestano de 10 ou 25 mg suprime os níveis de estradiol, estrona e de estrona sulfato

(cerca de 85% a 95% comparativamente aos níveis basais) após 12 a 13 semanas de

tratamento [60]. Uma dose única de 25 mg de exemestano, induz um decréscimo máximo

dos níveis de estrogénios circulantes dois a três dias após a ingestão, persistindo durante

quatro a cinco dias [61]. Este valor mínimo de atividade da aromatase persistiu durante

cinco dias, com tomas diárias de 25 mg do fármaco. Verificou-se também, com a dose

mais baixa de 5 mg, 50% de inibição dos níveis de estrogénios séricos e dos níveis

urinários de estrona [59].

Estudos in vivo demonstraram que o exemestano é altamente específico e um potente

inibidor da aromatase, levando a profundas alterações endócrinas no ambiente tumoral,

bem como nos tecidos adjacentes. Estes efeitos verificam-se na redução do volume do

tumor, na mudança da sua morfologia e na taxa de proliferação (figura 10) [62].

Figura 10. Mamografia do mesmo tumor mamário antes e após 3 meses de tratamento com exemestano (25

mg/dia) [62].

Após tratamento com o exemestano, verifica-se uma diminuição significativa da

proliferação do tumor, sendo este efeito observado em cerca de 80% dos casos, após

três meses de tratamento. No entanto, a redução da taxa de proliferação verifica-se

desde muito cedo, após início do tratamento, demonstrando uma diminuição da


20

expressão do Ki67, um marcador da proliferação celular, após 10 a 14 dias de terapêutica

[63].

O exemestano em baixas doses tem, comparativamente ao 17β-estradiol, efeitos

estrogénicos em baixas doses, verificando-se uma fraca interação com o ER α [64]. Este

AI demonstra também uma ínfima afinidade para o recetor de androgénio (0,28%

comparativamente à dihidrotestosterona). Doses diárias de 25 mg de exemestano não

produziram nenhum efeito nos níveis circulantes de androstenediona, sulfato de

desidroepiandrosterona (DHEAS) ou 17-hidroxiprogesterona, nem foram associadas aos

ligeiros decréscimos dos níveis circulantes de testosterona. Aumentos dos níveis basais

de testosterona e androstenediona têm sido observados após tomas de doses iguais ou

superiores a 200 mg [61]. Por sua vez, um estudo sugere que durante o tratamento com

o exemestano, a atividade androgénica intratumoral é mais elevada nos doentes com

cancro da mama comparativamente a pacientes sem terapia com exemestano [27, 65].

De facto, verificam-se maiores concentrações de 5α-dihidrotestosterona (DHT), um

metabolito resultante da transformação da testosterona, nos tecidos mamários

cancerígenos tratados com exemestano. A DHT é sintetizada in situ a partir da

testosterona nos tecidos mamários cancerígenos, sendo o nível intratumoral de DHT

condicionado pela quantidade do seu percursor, a testosterona. A expressão da

aromatase está inversamente associada às concentrações intratumorais de DHT nos

carcinomas mamários sem terapia, suprimindo a síntese de DHT a partir da

androstenediona, indicando, assim, que a aromatase é um regulador negativo da

produção de DHT no cancro da mama, através da redução da concentração da

testosterona. Por outro lado, a razão DHT/testosterona sugere que os níveis da atividade

da 5α-redutase, enzima responsável pela conversão de testosterona a DHT, é similar

aquando o tratamento com exemestano. Assim, a inibição da aromatase está relacionada

com o aumento das concentrações locais de DHT. Este efeito, mediado pelo

exemestano, pode ocorrer devido ao bloqueio da síntese de estrogénios, que conduz à

formação de mais percursores androgénicos, ou através da ativação da expressão de

genes específicos dependentes de androgénios [65].


21

1.3.1. Farmacocinética e farmacodinâmica

O exemestano é administrado oralmente e a sua farmacocinética foi estudada em

mulheres menopáusicas saudáveis bem como em pacientes com cancro da mama

avançado. A distribuição e metabolismo do exemestano foram estudados com o auxílio

de um composto marcado radioactivamente. Após ingestão, o exemestano é absorvido

no trato gastrointestinal (aproximadamente 42%), sendo que os seus níveis plasmáticos

aumentam cerca de 40% após um pequeno-almoço rico em gorduras [61].

Posteriormente é distribuído pelos tecidos, ligando-se em cerca de 90% às proteínas

plasmáticas (maioritariamente à albumina e à α1-glicoproteína ácida). O seu pico de

concentração plasmática verifica-se duas horas após ingestão, sendo o seu tempo de

semi-vida aproximadamente 24 horas. No entanto, embora permaneça sem explicação, o

exemestano parece ser absorvido mais rapidamente em mulheres com cancro da mama

do que em mulheres saudáveis (1,2 horas para doentes com cancro da mama e 2,9

horas para mulheres saudáveis) [61]. Os níveis plasmáticos do principal metabolito do

exemestano, 17-beta-hidroexemestano, são dez vezes menores do que os níveis do

exemestano [59].

O exemestano é eliminado através da urina e das fezes, detetando-se quantidades do

fármaco inalterado inferiores a 1% da dose ingerida [66]. Após tomas repetidas, a

clearence do fármaco é 45% menor nas mulheres com cancro da mama do que em

mulheres pós-menopáusicas saudáveis [61, 67].

Pouco se conhece sobre as vias de metabolização do exemestano e as enzimas

envolvidas e metabolitos resultantes. No entanto, sabe-se que a CYP3A4, CYP2B6,

CYP1A e CYP4A11 estão envolvidas na transformação do exemestano (figura 11). O

exemestano é metabolizado a 17-hidroexemestano, através da redução do grupo

carbonilo na posição 17, pelas enzimas CYP4A11 e CYP1A1/2, no entanto, a formação

deste metabolito é mediada primeiramente por aldocetoredutases. Por sua vez, a

formação do 6-hidroximetilexemestano é catalisada essencialmente pela CYP3A, devido

à oxidação do grupo metileno na posição 6 [68]. A formação destes dois metabolitos varia

amplamente entre as amostras de fígado humano. Contrariamente à CYP3A, as CYP1A,

CYP2B6 e CYP4A11 estão praticamente ausentes do fígado, portanto a atividade destas

isoenzimas devido a polimorfismos genéticos e interações com outros medicamentos

e/ou xenobióticos pode alterar a biodisponibilidade do exemestano [68].


22

Figura 11. Principais vias metabólicas envolvidas no metabolismo do exemestano. O exemestano e

extensivamente metabolizado pela família de enzimas citocromo P450, originando vários metabolitos, entre

eles, o 17-hidroexemestano e o 6-hidroximetilexemestano. Adaptado de [68].

Como os esteróides são rapidamente metabolizados e excretados na urina, são

frequentemente utilizados como agentes dopantes. Por esse facto, e para uma mais

rápida deteção do consumo de exemestano como agente dopante em desportos de alta

competição, foi proposto um novo método por LC-MS/MS para deteção do exemestano e

dos seus metabolitos, levando à descoberta de três novos metabolitos: 6ξ-hidroxi-6ξ-

hidroximetilandrosta-1,4-dieno-3,17-diona, 6ξ-hidroxiandrosta-1,4-dieno-3,17-diona e o

3ξ-hidroxi-5ξ-androst-1-eno-6-metileno – 17-ona [69].

1.3.2. Metabolitos do exemestano

Como referido anteriormente, o principal metabolito do exemestano é o 17β-

hidroexemestano (17-βHE) (figura 12), e pode ser identificado por GC-MS [70]. O seu nível

plasmático é sempre inferior a 10% do pico plasmático do exemestano, sendo o

metabolito maioritário na urina [71]. A glucuronidação é aparentemente a via principal

para eliminação deste metabolito (cerca de 42% do 17-βHE ligado ao glucuronídio

encontrado na urina). Este estudo sugere ainda que a enzima UGT2B17 é a isoforma da


23

UGT responsável por esta reação [72]. O 17-βHE, tal como o exemestano, possui

atividade anti-aromatásia, no entanto, é menos potente apresentando um IC50 em

microssomas da placenta de 69 nM [71] e um IC50 de 2,3 ± 0,83 µM em células que

sobreexpressam a enzima aromatase (HEK293-aro) [72]. Tal como o exemestano, tem

atividade androgénica, apresentando uma afinidade para os recetores de androgénios

cerca de 100 vezes superior ao exemestano. Simultaneamente, o 17-βHE, para além da

inibição da aromatase, também previne a perda óssea e não influencia os níveis séricos

do colesterol [73, 74].

O metabolito 6α/β-spirooxiranandrosta-1,4-dieno-3,17-diona, referido neste trabalho como

composto 32 (figura 12), foi inicialmente descrito por Buzzetti et al. [71], apresentando um

valor de IC50, em microssomas de placenta humana, de 206 nM. Este metabolito é

referido em vários estudos como um composto intermediário do metabolismo do

exemestano, resultando da epoxidação do grupo metileno na posição 6, estando também

envolvido na síntese de outros metabolitos [69, 75]. Por sua vez, o metabolito 6-

hidroximetilexemestano ou 6-hidroximetilandrosta-1,4,6-trieno-3,17-diona (figura 12),

também foi descrito inicialmente por estes autores, apresentando um valor de IC50 de 560

nM [71].

Figura 12. Metabolitos do exemestano. A) 17β-hidroexemestano; B) 6-hidroximetilexemestano e C) 6α/β-

spirooxiranandrosta-1,4-dieno-3,17-diona.

Recorrendo à técnica de GC/MS foi possível, então, identificar outros metabolitos do

exemestano: 6ξ-hidroxi-6ξ-hidroximetilandrosta-1,4-dieno-3,17-diona, 6ξ-hidroxiandrosta-

1,4-dieno-3,17-diona e o 3ξ-hidroxi-5ξ-androst-1-eno-6-metileno – 17-ona. O perfil de

excreção destes metabolitos foi determinado, verificando-se a excreção máxima entre

quatro a seis horas após a toma de 25 mg de exemestano [69].


24

Embora novos estudos sobre o metabolismo e metabolitos do exemestano estejam a ser

desenvolvidos, muito ainda permanece por esclarecer. Com base nas vias de

metabolização propostas, novas moléculas são projetadas como intermediários. A

molécula 1α,2α-epoxi-6-metilenandrost-4-ene-3,17-diona, referida neste trabalho como

composto 33, parece ser, também, um composto intermediário na via de metabolização do

exemestano (figura 13) [69, 75, 76].

Figura 13. 1α,2α-epoxi-6-metilenandrost-4-ene-3,17-diona, possível metabolito do exemestano.

1.3.3. Efeitos biológicos

Poucos são os estudos relativos aos efeitos biológicos do exemestano nas células. O

exemestano tem um IC50 de 27 nM em microssomas de placenta humana [71] e de 1,4 ±

0,42 µM em células HEK293-aro, que expressam a enzima aromatase [72].

Os estudos, conduzidos no nosso laboratório, numa linha celular de cancro da mama

recetor de estrogénio positivo que sobre-expressa a aromatase (MCF-7aro), indicam que

após tratamento durante 6 dias o exemestano induz a formação de blebs membranares,

fragmentação e condensação da cromatina e vacuolização do citoplasma [77]. Tal como

os AIs não esteroides de terceira geração [52], o exemestano também promove retenção

do ciclo celular na fase G0/G1, acompanhado de uma diminuição da viabilidade e

proliferação celular. No entanto, para longos tempos de tratamento, o exemestano

conduz à retenção do ciclo em G2/M, efeito este, que se encontra associado à ocorrência

de apoptose. Verifica-se ainda, após o tratamento com o exemestano, o aumento da

atividade das caspases 9 e 7, formação de ROS bem como a presença de vesículas

ácidas (AVOs), indicando a ocorrência de apoptose e de autofagia [77]. Este estudo

demonstra ainda que a mitocôndria desempenha um papel importante na morte celular

por apoptose e que a autofagia poderá desempenhar um papel de pró-sobrevivência das

células MCF-7aro, protegendo as células da morte celular por apoptose. Outros estudos


25

sugerem que o papel da autofagia nas células malignas do cancro da mama está

associado à menor frequência da ocorrência da apoptose e ao prolongamento da

sobrevivência destas células [78-80].

1.3.4. Eficácia terapêutica

Cada vez é mais evidente que o uso de AIs é equivalente ou superior à terapia com o

tamoxifeno. No entanto, é menos claro o papel da terapia combinada com um AI e o

tamoxifeno. De facto, o tamoxifeno e o exemestano são extensivamente metabolizados

pelas enzimas P450, podendo existir interações farmacocinéticas quando combinados.

No entanto, um estudo clínico demonstrou que a combinação dos dois fármacos foi bem

tolerada durante 8 semanas, não sendo necessário alterações no ajustamento das doses

administradas [81].

A eficácia clínica do exemestano foi avaliada nas diversas fases de desenvolvimento do

cancro da mama estrogénio-dependente, bem como nas diferentes linhas de tratamento,

tendo sido comparado com tamoxifeno e outros AIs de terceira geração (tabela 2).

Tabela 2. Ensaios clínicos do exemestano realizados em diferentes linhas de tratamentos em mulheres pré e

pós-menopausicas. Abreviaturas: TAM, tamoxifeno, EXE, exemestano, ST, sem tratamento, MA, mesgestrol acetato.

Estratégia de Tratamento Estudo Protocolo Referências

Terapia alternada

IES TAM vs. TAM → EXE [82]

TEAM EXE vs TAM → EXE

TAM vs EXE [59]

Terapia sequencial NSABP B33 EXE vs. ST [83]

Primeira linha EORTC EXE vs. TAM [84]

Terceira linha EXE vs. TAM → MA [85]

Na procura de alternativas ao tratamento com o tamoxifeno, os AIs de terceira geração

ganharam importância ao demonstrarem ser clínicamente mais eficazes que o

tamoxifeno. De facto, os AIs são mais efetivos na taxa de resposta global e no benefício

clínico, não se verificando diferenças significativas nos efeitos secundários, excluindo os

efeitos tromboembólicos e as complicações ginecológicas [86].


26

O estudo desenvolvido pela European Organisation for Research and Treatment of

Cancer (EORTC), consta de duas fases (II e III), tendo como base a comparação do

tratamento com o exemestano ou com o tamoxifeno. Enquanto que na fase II foi avaliada

a eficácia e a segurança clínica do exemestano, na fase III, foi determinado o tempo

médio sem progressão da doença na primeira linha de tratamento do cancro da mama

hormono-dependente mestastizado. O exemestano demonstrou ser eficaz e bem

tolerado, conduzindo a um aumento da taxa de resposta ao tratamento com o

exemestano (46%) comparativamente ao tamoxifeno (31%). Os resultados revelam ainda

um aumento do tempo médio sem progressão da doença com exemestano (11,8 meses

contra os 8,1 meses após tratamento com tamoxifeno) [84]. Outros estudos de fase II

demonstraram a eficácia do exemestano na primeira linha de terapia para o cancro da

mama com metástases [87]. No entanto, estudos futuros serão necessários para

esclarecer a eficácia do exemestano como primeira linha de tratamento especialmente

com a combinação de outros fármacos, como agentes angiogénicos e inibidores da

HER2, podendo o exemestano ser considerado uma opção para a primeira linha de

tratamento para o cancro estrogénio-dependente [88].

O estudo IES (Intergroup Exemestane Study) foi desenhado de modo a comparar a

terapia com o tamoxifeno durante 5 anos e a terapia alternada de tamoxifeno com

exemestano, após 2 a 3 anos de terapêutica com tamoxifeno, num total de 5 anos de

tratamento, em pacientes pós-menopáusicas com cancro da mama estrogénio-

dependente. Os resultados desse estudo revelaram que a terapia com tamoxifeno e

exemestano, após 2 a 3 anos de tratamento apenas com tamoxifeno, está associada ao

aumento significativo do benefício clínico, do tempo de sobrevivência sem a doença e à

diminuição da ocorrência de metastases. Verificou-se também uma diminuição no risco

de ocorrência de cancro da mama contralateral, cancro do endométrio e outros cancros

primários [82]. Quando os resultados do estudo IES foram revelados, foi projetado outro

estudo, The Tamoxifen Exemestane Adjuvant Multinational (TEAM), com o objetivo de

avaliar o exemestano comparativamente à terapia alternada de tamoxifeno seguido de

exemestano. Neste estudo não se verificaram diferenças no tempo sem progressão da

doença, nem na taxa de sobrevivência, nem no tempo de ocorrência. No entanto,

comparando apenas o tratamento com o exemestano ou com o tamoxifeno nos dois

primeiros anos do estudo, verifica-se o aumento no tempo de ocorrências e na diminuição

do risco de recaída [59]. No entanto, nos estudos IES e TEAM verifica-se uma redução

de 3% de recaídas associado ao tratamento com exemestano comparativamente à

terapêutica com o tamoxifeno [89].




27

O projeto NSABP B33 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B33), que

comparou a eficácia do tratamento com o exemestano comparativamente a um grupo

sem tratamento, após 4 a 5 anos de terapia com o tamoxifeno, revelou o aumento do

tempo de sobrevivência sem a doença e de remissão do tumor com tratamento com

exemestano contra um grupo placebo após cinco anos de terapia com tamoxifeno [83].

O tratamento com exemestano no cancro da mama mestastizado demonstrou ser uma

alternativa quando há a falha do tratamento com outros fármacos. Outros estudos vieram

comprovar a eficácia do exemestano como terceira linha de tratamento em cancro da

mama, avaliando o benefício clínico do exemestano após falha do tratamento com

tamoxifeno e com mesgestrol acetato (MA). Estes estudos demonstraram o aumento da

resposta em 13% bem como em 30% de benefício clínico, com duração de resposta de 9

e 8 meses comparativamente ao tamoxifeno e ao MA. Além disso, os pacientes tratados

com exemestano tem 23% menor risco de morte, comparativamente aos pacientes

sujeitos ao tratamento com MA. Verifica-se também um aumento significativo no tempo

de progressão do tumor e no tempo de falha do tratamento, demonstrando também um

aumento do tempo de sobrevivência [85]. Outro estudo verificou um aumento no tempo

médio de sobrevivência após o tratamento e uma diminuição de peso nos pacientes

tratados com o exemestano [90]. Foi também avaliada a ingestão de AIs de terceira

geração comparativamente ao MA após tratamento com o tamoxifeno, demonstrando que

os AIs possuem uma eficácia e uma segurança superior quando comparado com o MA

[91].

Todos estes estudos (EORTEC, IES, TEAM e NSABP B33) demonstram a eficácia do

exemestano na primeira linha de tratamento bem como após terapêutica com o

tamoxifeno, verificando-se benefícios no tempo de sobrevivência sem a doença e no

tempo de recorrência [59].

Os AIs de terceira geração são, de facto, extremamente potentes e eficientes, e os seus

resultados clínicos sugerem que possuem maior potencial do que o tamoxifeno na terapia

contra o cancro da mama [92]. No entanto, verificam-se diferenças a nível de mecanismo

de ação e de eficácia clínica neste grupo de fármacos [93]. Apesar de o tratamento com

AIs ser altamente eficiente, verificam-se diferenças significativas após o tratamento com

AIs esteróides e não esteróides. Estas divergências podem estar relacionadas com a

natureza das moléculas [94], efeitos androgénicos, diferenças de potência de inibição de

cada AI [95] bem como das diferentes doses administradas. No entanto, tem havido uma

maior frequência do uso de exemestano como primeira linha da terapia hormonal bem

como o seu uso após falha do tratamento com outros AIs.


28

Um dos estudos demonstrou a segurança e a eficácia do exemestano na terceira ou

quarta linha de tratamento com cancro da mama mestastizado após tratamento com AIs

não-esteróides. O exemestano levou a um aumento da resposta de 4,8% contra o

tratamento com os AIs não-esteróides. Também se verificou que o exemestano é mais

eficaz em pacientes com doença em tecidos moles (50%) relativamente ao tratamento

com anastrozol e o letrozol. Verifica-se também um aumento em cerca de 24% de

benefício clínico durante mais de um ano em mulheres com cancro da mama com

tratamento com tamoxifeno e um AI não esteróide. Deste modo, o tratamento com

exemestano pode ser uma boa alternativa para o cancro da mama cujas distintas terapias

hormonais não resultaram [74]. Nos pacientes que não responderam ao tratamento com

AIs não esteroides e foram submetidos à terapêutica com o exemestano, verificou-se um

decréscimo na recorrência da doença e uma diminuição não significativa na mortalidade

[96].

1.3.5. Segurança e efeitos secundários

Comparativamente ao tamoxifeno, os pacientes tratados com AIs de terceira geração

revelaram uma menor incidência de cancro endometrial, tromboembolismo venoso e

eventos cerebrovasculares. Em contrapartida demonstraram uma maior incidência de

fraturas e um aumento da ocorrência de eventos cardiovasculares. No entanto, não se

verificou o aumento do risco cardiovascular durante a terapia com AIs comparativamente

com o grupo placebo (sem tratamento), mas verifica-se um aumento desse risco

comparativamente ao tamoxifeno [59, 97].

Devido à diminuição dos níveis de estrogénios nas mulheres pós-menopáusicas através

da terapia hormonal, seria de esperar efeitos relacionados com a menopausa. Estes

efeitos são classificados em categorias (inexistentes, leves, moderados ou graves),

sendo os mais frequentes os afrontamentos, a transpiração, mudanças de humor,

sintomas ginecológicos e musculares, como artralgia e decréscimo da densidade óssea.

Estudos demonstraram o aumento de cãibras musculares e artralgia para o tratamento

com o exemestano comparativamente com o tratamento com o tamoxifeno [59]. No

entanto, outros autores defendem que a ocorrência de artralgia ou mialgia ou de sintomas

menopáusicos durante o tratamento está relacionada com o aumento significativo da taxa

de sobrevivência [98]. Outro estudo revela que uma maior incidência da síndrome do

túnel cárpico (patologia que afeta o nervo mediano da mão e pulso) está relacionada com


29

o tratamento do cancro da mama comparativamente ao tamoxifeno, embora a sua

frequência seja baixa [99].

A terapia endócrina está também associada à perda de massa óssea. No entanto, o

aumento de fraturas ósseas é mais acentuado no tratamento com AIs não esteróides,

comparativamente ao tamoxifeno [100]. De facto, a forma como os estrogénios exercem

os seus efeitos a nível ósseo permanece por esclarecer, no entanto estima-se que sejam

mediados pelos seus recetores. A modelação da atividade de citoquinas pelos

estrogénios parece exercer um papel importante no metabolismo ósseo nas mulheres

pós-menopáusicas, mediando a atividade dos osteoclastos e osteoblastos, resultando

numa diminuição da ocorrência de apoptose dos osteoclastos e num decréscimo da

atividade dos osteoblastos [57, 101]. Para além disso, a reabsorção de cálcio no trato

gastrointestinal e no rim pode estar condicionada, levando à estimulação da hormona

paratiroide (PTH) [102, 103]. Por sua vez, o aumento dos níveis séricos da PTH estimula

os osteoclastos, conduzindo, deste modo, à perda de massa óssea [101]. Estes efeitos

são verificados a nível celular através da interferência nas interações entre os

osteoclastos, osteoblastos e osteócitos, interpondo-se na remodelação do osso, levando

à perda de massa óssea e aumentando a probabilidade de ocorrência de fraturas. Nos

casos de tratamento inicial do cancro da mama, a perda óssea pode ser revertida

recorrendo a terapias auxiliares [104]. Portanto, é necessário a administração de terapias

complementares, como bisfosfonatos [105] ou suplementos de cálcio e de vitamina D

[101], tentando minimizar este efeito verificado no tratamento a longo prazo com os AIs

[106, 107]. No entanto, estudos recentes demonstraram que o exemestano pode estar

associado a um efeito protetor a nível ósseo. Este efeito é devido às propriedades

androgénicas do exemestano e do seu principal metabolito, o 17-βHE [95, 108]. Estudos

pré-clínicos sugerem que o exemestano pode estimular a formação de massa óssea. O

exemestano conduz à melhoria do metabolismo e força óssea em ratos

ovariectomizados, tal como o 17-hidroexemestano [109]. Para além disso, outro estudo

demonstrou que há um aumento significativo dos níveis séricos da fração N-

terminal do peptídeo de pró-colagénio tipo I (PINP), um marcador da formação óssea

[110]. Em ratos, a testosterona parece estar relacionada com a inibição da formação de

osteoclastos através da ação da hormona paratiróide que atua nos recetores de

androgénio (AR) [111]. No entanto, no homem, apenas os osteoblastos possuem AR.

Deste modo, o exemestano pode exercer benefícios a nível ósseo nestas células, através

das suas propriedades androgénicas [112].

Comparações indiretas entre AIs de terceira geração sugerem ainda que o exemestano

pode levar a uma maior incidência do aumento de peso comparativamente com o


30

anastrozol ou o letrozol devido às suas propriedades androgénicas [113]. Para além

disso, quando administrado em doses elevadas, o exemestano pode conduzir ao

desenvolvimento de acne [114]. Por outro lado, os efeitos mais frequentes induzidos pelo

exemestano são as náuseas, o cansaço e afrontamentos (7,5% a 10,8% dos pacientes)

comparativamente a AIs não esteróides [74].

A diminuição dos níveis de estrogénios associada à terapia hormonal apresenta também

impactos a nível do perfil lipídico levando a um aumento do risco de doenças

cardiovasculares. De facto, a terapia com AIs induz variações dos níveis circulantes de

colesterol total, lipoproteínas de alta densidade (HDL), lipoproteínas de baixa densidade

(LDL) e triglicéridos. A correlação entre as alterações hormonais e o perfil lipídico está

envolvida no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como o enfarte do

miocárdio, embora o seu mecanismo permaneça por elucidar [54].

Comparativamente ao tamoxifeno, o exemestano não apresenta efeitos protetores no

perfil lípido, verificando-se uma diminuição dos níveis de HDL nos pacientes com

tratamento a longo prazo [115]. No entanto, outro estudo demonstrou que o exemestano

apresenta efeitos benéficos nos níveis de triglicéridos, em relação ao tamoxifeno, durante

um ano de tratamento, não apresentando alterações nos outros parâmetros lipídicos

[116].


31

1.4. Resistência à terapia endócrina

A resistência à terapia endócrina traduz-se na não-resposta dos pacientes à terapia,

podendo designar-se resistência de novo, quando os tumores são resistentes ao

tratamento endócrino, ou resistência adquirida, quando se tornam resistentes à terapia,

limitando, assim, a eficácia deste tratamento. Torna-se portanto necessário a elucidação

e compreensão dos mecanismos moleculares característicos desta condição. A utilização

de linhas celulares que mimetizam o ambiente dos cancros da mama resistentes ou não

(células LTEDaro e MCF-7aro) tem demonstrado ser fundamental para a elucidação dos

mecanismos associados à resistência, bem como no desenvolvimento e avaliação de

novos fármacos [117].

O mecanismo de resistência é dependente do fármaco usado na terapia hormonal. De

facto, para além das diferenças entre os mecanismos de resistência observadas entre o

tamoxifeno e os AIs, verificam-se também divergências entre AIs esteróides e não

esteróides. Estas podem estar relacionadas com a natureza das moléculas e a sua

interação com o local ativo da enzima [94] e com os efeitos androgénicos [95]. Um estudo

com as células MCF-7aro que se tornaram resistentes, revelou uma expressão génica

diferente para cada AI, sugerindo mecanismos de resistência distintos [95].

1.4.1. ER e os co-reguladores

A desregulação de vários aspetos envolvidos na atividade e sinalização dos ERs é um

dos mecanismos da resistência endócrina, conduzindo as células tumorais a vias

alternativas de proliferação e de sobrevivência. Estudos recentes sobre o perfil de

expressão génica dos ER demonstraram haver uma grande heterogeneidade de ER no

cancro da mama, levando à identificação molecular de dois subtipos distintos: o cancro

ER luminal A e o ER luminal B. O cancro da mama tipo luminal A é caraterizado pela alta

expressão dos ER e dos genes envolvidos na via clássica, com uma taxa baixa de

proliferação, um comportamento menos agressivo e uma alta taxa de resposta à terapia

endócrina. Por sua vez, o cancro da mama tipo luminal B está associado à baixa

expressão de ER e dos genes relacionados com os ER, tendo uma elevada taxa de

proliferação celular, um comportamento mais agressivo e uma menor sensibilidade à

terapia endócrina [118].


32

A expressão dos ERs é a principal via para a resposta da terapia endócrina, sendo

portanto o biomarcador de referência para a escolha do tratamento endócrino. Assim, a

perda de expressão destes recetores é apontada como primeiro mecanismo para o

desenvolvimento de resistência de novo à terapia endócrina e desenvolvimento de um

fenótipo mais agressivo. A expressão dos ERs é controlada, primeiramente, por

mecanismos epigenéticos e de pós-transcrição, podendo estar relacionada com o

aumento das histonas deacetilases, responsáveis pela condensação de cromatina,

resultando numa estrutura do nucleossoma mais compacta. Por outro lado, a ocorrência

de variantes do ERs por slipcing alternativo foi verificada em tecidos normais e

cancerígenos, indicando que este pode ser um mecanismo de perda de expressão destes

recetores [118].

Geralmente, nos cancros da mama ER- verifica-se o aumento da expressão de EGFR e

HER2, comparativamente aos tumores ER+, podendo, deste modo, a ativação da via dos

fatores de crescimento conduzir à diminuição ou perda da função dos ERs. A ativação

desta via pode ainda levar à repressão da transcrição dos genes codificantes dos ERs,

conduzindo à resistência endócrina [119]. A perda de expressão dos ERs pode ser

responsável pela resistência adquirida ao tamoxifeno. De facto, cerca de 20% dos

tumores com resistência adquirida não expressam ERs, sendo que, posteriormente,

aproximadamente 1/5 desses tumores responde, na segunda linha de tratamento, aos

AIs ou ao fulvestrant. Por outro lado, a resistência adquirida através do tratamento com

fulvestrant pode estar relacionada com a perda de função dos ERs, aumentando a via

EGFR/MAPK [119].

A variação da expressão génica ou dos níveis proteicos dos ERs pode contribuir para a

resistência endócrina e o desenvolvimento de um fenótipo mais agressivo [120]. O ERα é

uma proteína que regula a expressão de vários genes envolvidos na proliferação e

sobrevivência celular, tendo assim um papel importante no desenvolvimento do cancro da

mama, bem como na sua progressão. Foram descritas várias variantes do RNA

codificante dos ERα e ERβ em cancros da mama primários, tendo sido detetadas

mutações pontuais nos ERα em doentes com metastases [17]. As mutações no ERα

podem afetar a resposta dos agentes anti-estrogénios. Estas mutações, apenas ocorrem

em menos de 1% dos cancros da mama, não contribuindo significativamente para a

resistência dos SERMs [119].

Por sua vez, os recetores β, como já foi referido anteriormente, parecem possuir funções

antagonistas às funções dos ERα (figura 14), regulando a transcrição mediada pelo

recetor α, sendo a expressão nos tumores mamários de ER beta associada a um melhor


33

prognóstico. A expressão e atividade do ERβ podem estar implicadas na resistência aos

SERMs. Verificaram-se altos níveis destes recetores em células mamárias cancerígenas

tratadas com tamoxifeno. No entanto, outro estudo demonstrou que baixos níveis de ERβ

podem estar relacionados com o desenvolvimento da resistência ao tamoxifeno. Deste

modo, o papel do ER beta na resistência, permanece por elucidar [119].

Figura 14. Relação entre o ERα e ERβ. Enquanto que o ERα diminui a apoptose e aumenta a diferenciação e

proliferação celular, o ERβ tem funções opostas aumentando a apoptose e diminuindo a diferenciação e proliferação celular.

Os ERs exercem a sua ação na expressão génica associados a proteínas reguladoras,

formando o complexo de transcrição. Deste modo, a expressão destas proteínas

influencia a transcrição mediada pelos ERs, pois a sua presença a nível nuclear pode

condicionar os níveis de expressão ou atividade dos ERs, mediando assim, a sua

sinalização. Na maioria dos cancros hormono-dependentes, é a via clássica que contribui

para a proliferação e progressão das células malignas. No entanto, a ativação de outras

vias, como a via não clássica e a via não genómica, poderá ter influência na resistência à

terapia hormonal. Estas vias alternativas podem induzir alterações na expressão de co-

ativadores, co-repressores, recetores tirosina cinases e outras moléculas envolvidas

contribuindo, assim, para a resistência endócrina [118, 121].

Deste modo, estudos realizados com AIs e o tamoxifeno demonstraram o papel relevante

que os ER desempenham na resistência. De facto, em células resistentes ao letrozol,

verificou-se que os ERα são ativos [18]. Sabe-se, que esta atividade pode conduzir à


34

ativação de genes e vias de sinalização que resultam na proliferação celular [122]. Uma

das funções do ERα passa por regular modificações pós-transcrição, como a fosforilação,

metilação e ubiquitinação, influenciando a interação com outras proteínas, como os co-

reguladores transcripcionais e moléculas sinalizadoras no citoplasma como a proteína

ativadora 1 (AP1), proteína especifica 1 (SP1) e o fator nuclear ĸB (NF-ĸB). O aumento

da atividade transcripcional da AP1 e do NF-ĸB está associado à resistência endócrina

[123]. Por outro lado, a sobre-expressão e o aumento da fosforilação de co-ativadores

dos ERα, como o recetor nuclear co-ativador 3 (NCOA3), leva à transcrição de genes

mediada pelo ERα, que confere resistência in vitro, estando também associada à baixa

eficácia do tamoxifeno nos doentes [123]. Os ER e as proteínas co-reguladoras podem

ainda sofrer alterações pós-tradução. Os recetores de fatores de crescimento, como o

EGFR/HER2 e o IGF-1, e cinases envolvidas na resposta ao stress celular (Akt, MAPKs,

PKA, entre outras) regulam múltiplas modificações pós-transcripcionais, influenciando,

deste modo, a atividade dos ER e a sensibilidade das células às várias terapias

endócrinas [120]. No entanto, a resistência também se verifica em células com baixos

níveis de co-repressores, interferindo, deste modo, com a atividade do tamoxifeno [119].


35

1.4.2. Crosstalk entre ER e recetores de tirosina cinases (RTK)

A via dos recetores de crescimento é uma alternativa para estimular o crescimento e

proliferação das células malignas, podendo contornar os efeitos que advêm da terapia

endócrina, como a inibição ou modelação da via dos ERs.

Como já foi referido, o crosstalk entre os ER e a HER2/fatores de crescimento é uma via

de sinalização fundamental para o desenvolvimento da resistência à terapia hormonal

[18, 124]. A via genómica e não genómica, mediada pelos ERs, pode ser regulada

também pelos RTK, pois os ERs e os co-ativadores podem ser fosforilados pelos RTK e

por outras cinases intracelulares, como a MAPK e PI3K/Akt, conduzindo à ativação dos

ERs na presença de anti-estrogénios, levando, deste modo, à ativação da via genómica

não clássica [118].

Por outro lado, a desregulação da via PI3K/Atk/mTOR pode conduzir à amplificação

desta via, fomentando, deste modo, a proliferação, o crescimento e a sobrevivência

celular (figura 15). A desregulação desta via pode ocorrer pela mutação na proteína PI3K,

amplificação da Akt e disfunção do gene supressor de tumor PTEN. A perda de função da

PTEN ocorre em aproximadamente 40 a 50% dos cancros da mama e resulta na ativação

da mTOR [20]. Verifica-se ainda que a híper-ativação da sinalização PI3K está associada

à redução de ER e à expressão génica mediada por estes recetores, que, por sua vez,

estão mais associados a tumores mamários do tipo luminal B [118]. Assim, as

modificações desta via estão relacionadas com a resistência à terapia, bem como ao

desenvolvimento de metastases. Atualmente existe um enorme foco no desenvolvimento

de inibidores desta via de sinalização, nomeadamente de inibidores da mTOR [22].

Estudos indicam que o tamoxifeno juntamente com inibidores de mTOR, nomeadamente

a rapamicina, pode reverter os efeitos da resistência associada a esta proteína. Verifica-

se ainda que os efeitos da resistência mediada pela mTOR são independentes dos

mecanismos dos ERα [125]. Embora ainda não haja resultados conclusivos do estudo de

fase III, em que se faz a comparação entre a eficácia do tratamento com o exemestano e

com ou sem o everolimus, um outro inibidor da mTOR, parece ocorrer um aumento do

tempo médio sem progressão da doença [20]. Deste modo, a combinação entre a inibição

da mTOR e a terapia endócrina pode conduzir a um benefício clínico no tratamento de

cancros da mama resistentes à terapia.


36

Figura 15. Vias de sinalização dos recetores de estrogénio (ER). O estrogénio pode ligar-se a ERs nucelares e conduzir à transcrição génica (a). A presença de ERs fora do núcleo celular e associados à membrana

celular auxiliam a resposta dos estrogénios através dos recetores de fatores de crescimento (GFR), como o EGFR, HER2 e o IGF1 (b) e do recrutamento de outras moléculas ativadoras (c), conduzindo à ativação de

múltiplas vias de cinases, como a PI3K/Akt e a Ras/MAPK. Esta ativação leva, por sua vez, à fosforilação de vários co-reguladores que medeiam, nomeadamente, a via dos ERs. Por outro lado, os sinais do microambiente conduzem à ativação das vias relacionadas com o stress celular e das proteínas integrinas. Estas vias, mediadas por cinases, como a cinase de adesão focal (FAK), cinase c-Jun N terminal (JNK) e a MAPK, podem modular componentes envolvidos na transcrição, incluindo os ERs (d). As alterações que

possam ocorrer em qualquer uma destas vias podem conduzir à resistência à terapia endócrina, de modo a contornar a inibição da via dos ERs [120].

A resistência de novo ou adquirida ao tamoxifeno, pode apresentar a sobre-expressão ou

hiper-ativação dos RTKs, conduzindo ao crosstalk entre os ERs e os GFRs, um ciclo

responsável pela proliferação celular e o envolvimento da via genómica e não genómica.

No entanto, os AIs e o fulvestrant são capazes de inibir a atividade dos ERs, continuando

a ser eficazes em tumores ER+ e que sobre-expressam HER2. Os tumores tornam-se

eventualmente resistentes aos estrogénios, desenvolvendo outras vias de sobrevivência,

na ausência de estrogénio. Um estudo demonstrou que o exemestano induz a expressão

do fator de crescimento epidérmico e da proteína anfiregulina (AREG) que é essencial

para a proliferação das células da mama hormono-resistentes (LTEDaro), sendo a

expressão de AREG dependente dos ER. Verificou-se ainda que, neste modelo celular, a

expressão de AREG mediada pelos ER é crucial na resistência ao exemestano [126]. No

entanto, uma das consequências da resistência da terapia endócrina é o aumento da


37

sensibilidade ao estrogénio, levando a que as células malignas sejam capazes de

proliferar mesmo na presença de baixos níveis de estrogénios [127]. Estudos em células

LTEDaro demonstram o aumento dos níveis de ER, comparativamente às células

sensíveis MCF-7aro. Assim, a resistência aos AIs pode passar pela sensibilização das

células aos estrogénios, levando à adaptação da resposta mediada pelos ERs, como o

aumento da expressão do HER2 e IGFR1 que, por sua vez, levam à ativação da MAPK e

da fosforilação dos ERs. Este processo sugere a presença do crosstalk entre ER e GFRs

[119].

1.4.3. Regulação do ciclo e morte celular

A sensibilidade ao tratamento endócrino também pode ser condicionada pelos

reguladores, positivos e negativos, do ciclo celular, pois a taxa de proliferação das células

malignas é menor durante o tratamento [123].

A sobre-expressão dos reguladores positivos do ciclo celular, como o MYC e a ciclina E1

e D1 envolvidas na resistência endócrina, ocorre ou por ativação de ciclinas dependentes

de cinases, responsáveis pela regulação na fase G1 ou pela inibição das proteínas

reguladoras do ciclo, a p21 e a p27 [118]. A reduzida expressão, estabilidade ou atividade

da proteína p21 e p27, bem como a inativação da proteína do retinoblastoma (RB), está

associada à baixa eficácia da terapia endócrina. A perda de função da proteína RB, uma

proteína supressora de tumor, foi identificada na maior parte das terapias endócrinas sem

sucesso. Os ER estimulam o crescimento celular através da transcrição de ciclina D1

[128]. Por sua vez, a ciclina D1 promove o ciclo celular através da ligação a proteínas

cinases (CDK4/6), que são importantes na progressão do ciclo celular quando a célula se

encontra na fase G1. Outra das funções das ciclinas D é a fosforilação e inativação da

proteína RB, conduzindo à dissociação do complexo RB/fator de transcrição E2F (figura

16). O fator de transcrição E2F dissociado e em conjunto com outros constituintes

moleculares regula a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular [129].


38

Figura 16. Regulação do ciclo celular. Sinais mitogénicos convergem até ao nível da regulação da ciclina D1

e da sua associação à CDK4/6. As CDK4/6 fosforilam e inativam as proteínas RB supressoras de tumor, conduzindo à dissociação do factor de transcrição E2F, que em conjunto com outros constituintes moleculares, está envolvido na regulação da transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular [129].

No cancro da mama, a via de sinalização RB caracterizada pela perda de função da RB

está associada à resistência ao tamoxifeno. Estudos demonstraram que as linhas

celulares resistentes à ação do tamoxifeno respondem à ação dos inibidores da CDK4/6

e demonstram altos níveis de ciclina D1 e de RB fosforilada [130]. Assim, os inibidores da

CDK4/6 inibem a progressão do ciclo celular em grande parte de linhas celulares

resistentes [129].

Múltiplos recetores de fatores de crescimento (GFRs) são ativados por moduladores

específicos, conduzindo à alteração da expressão ou da atividade dos reguladores

negativos do ciclo celular, como a sobre-expressão do HER2 e a hiperativação da Akt e

da cinase Src [120]. A tirosina cinase Src tem um papel importante em várias vias de

sinalização celular regulando a proliferação, diferenciação, sobrevivência, invasão e

angiogénese. Esta cinase interage com múltiplas proteínas celulares, incluindo os ER,

estando assim envolvida na ativação da via não genómica [131]. A sua interação entre o

recetor EGF e os ER leva à estimulação mitogénica nas células cancerígenas MCF-7,

permitindo, assim, que estas proliferem e sobrevivam mesmo na presença do tamoxifeno,

da mesma forma que a expressão da Src atenua a sensibilidade das células ao fármaco.

Também se verificou a resistência ao tamoxifeno nas células malignas que apresentavam

um aumento da atividade da Src. Este aumento de atividade estava associado à


39

migração celular e ao desenvolvimento de um fenótipo mais agressivo. Para além disso,

os estrogénios e a Src estão também envolvidos na inibição da p27. No tratamento com

anastrozol verificou-se o aumento da atividade da Src nas células malignas, in vivo e in

vitro, sugerindo a possível importância que os inibidores da Src podem ter na terapia

destes cancros [132].

1.4.4. Autofagia e apoptose

As alterações no balanço entre a proliferação e a morte celular podem afetar a resposta

ao tratamento. O tratamento com agentes anti-estrogénios ou com AIs conduz à ativação

da resposta de stress celular e da via apoptótica nas células cancerígenas da mama. A

apoptose, ou morte celular programado do tipo I, é caraterizada pela condensação de

cromatina, degradação do DNA, fragmentação da célula em corpos apoptóticos e é

mediada pela ativação das caspases [133]. Os mecanismos envolvidos ainda não estão

completamente esclarecidos mas as respostas celulares incluem a regulação dos

membros da família da Bcl-2 e o aumento da ceramida. O crosstalk entre os efeitos

apoptóticos dos anti-estrogénios e a via do TNF mediada pelo PI3K, Akt e NF- ĸB,

conduz à apoptose. Por outro lado, a sobre-expressão de moléculas anti-apoptoticas

como a BCL-XL, e a diminuição da expressão de constituintes pro-apoptóticos como a

BIK, BAK e a caspase 9, podem conduzir à resistência endócrina [123]. No entanto, estas

alterações na atividade destes modeladores pode ser uma das consequências da

ativação da via PI3K/Akt/mTOR, através da sobre-expressão dos RTKs e o aumento da

via não genómica mediada pelos ERs [120]. Estas moléculas podem também ser

moduladas pelas proteínas da membrana e os seus fatores de sinalização, como o fator

NF-ĸB [118].

Mais recentemente, foi sugerido que, em células tumorais da mama resistentes, a

autofagia está envolvida na resistência à terapia endócrina [123]. A autofagia é um

processo catabólico que tem como função degradar proteínas e outros constituintes

celulares, reaproveitando os seus componentes para produção de energia e síntese de

constituintes celulares [134]. Este processo, também conhecido como morte celular

programada do tipo II, é caraterizado pela presença de vesículas citoplasmáticas que

englobam componentes ou constituintes celulares, sendo estes degradados pela via

lisossomal (figura 17) [135]. Por outro lado, a autofagia pode, também, desempenhar um

papel protetor na sobrevivência de células tumorais, tendo um papel importante na

progressão da patologia e desenvolvimento de metastases [136].


40

Figura 17. Regulação da autofagia. A autofagia ocorre a nível basal, mas pode ser induzida em resposta a

nutrientes ou hormonas. A via regulatória mais caraterizada é via PI3K/Atk/mTOR. Adaptado de [137]

A regulação da autofagia é assegurada pela via de sinalização PI3K/Akt/mTOR, mas

existem outras vias que tornam este processo mais complexo [136]. Esta pode ser

ativada por mutações na PI3K, por amplificação da Akt ou por perda da atividade da

PTEN. Após a sua ativação, a autofagia é inibida, estimulando o crescimento e

proliferação celular [136]. Tal como a PTEN, a proteína G relacionada com a Ras

supressora de tumor (ARHI) também pode induzir a autofagia, inibindo a sinalização pelo

PI3K-Atk [138]. Por outro lado, a proteína cinase AMP (AMPK) é ativada nas condições

de alterações dos níveis de energia e de stress celular, aumentando a razão AMP/ATP,

reprimindo a mTOR e ativando a autofagia. No entanto, a AMPK é regulada por outras

proteínas cinases dependentes de cálcio. Assim, alterações na via

AMPK/mTOR/Autofagia, pode contribuir para a progressão tumoral e resistência à terapia

endócrina. A proteína supressora de tumor, a p53, está envolvida na regulação da

autofagia, visto estar associada à resposta de stress celular e à reparação de DNA. Por

um lado, a p53 pode ativar a AMPK, conduzindo à autofagia. Simultaneamente, a p53

pode promover a autofagia através de outras moléculas reguladoras, a DRAM (damage-

regulated autophagy modelator), a Bcl-2 associada à proteína X (Bax) e a p53

modeladora da apoptose (PUMA), proteínas também associadas à indução da apoptose.


41

Assim, a compreensão do duplo papel da p53 na regulação da autofagia pode ser

determinante para a compreensão de aspetos do metabolismo do cancro, bem como da

resistência associada à terapia endócrina [138]. A beclina 1 está envolvida na formação

do autofagossoma, nos primeiros estadios da autofagia, sendo que a ativação da beclina

1 está envolvida na inibição da tumorogénese [135]. Por sua vez, a Bcl-2, uma proteína

oncogénica, sobre-expressa em 50 a 70% dos cancros da mama, está associada à

resistência à terapia hormonal. A Bcl-2 pode inibir a autofagia, através na inativação da

beclina, podendo, desta forma, potenciar os efeitos oncogénicos mediados pela Bcl-2

[138, 139]. Deste modo, a inibição da autofagia pode atuar sinergicamente com as outras

terapêuticas utilizadas no cancro [136], apostando na modelação do processo autofágico

através da sua maior via regulatória, a PI3K/Akt/MTOR como uma nova estratégia

terapêutica (figura 17) [140].


42


43

Objetivos

Atualmente, a frequência do cancro da mama é elevada em todo o mundo. Estima-se que

cerca de 75% dos cancros da mama são dependentes de estrogénios, verificando-se a

presença de recetores de estrogénio (ER+). A terapia através da inibição da aromatase

nos cancros da mama estrogénio-dependentes em mulheres pós-menopáusicas tem sido

muito bem-sucedida. O desenvolvimento de fármacos como os inibidores da aromatase

(AIs) levou à descoberta de moléculas eficazes e mais potentes. De facto, a terceira

geração de AIs é a mais potente e aquela cujo espectro de ação é mais reduzido,

minimizando, deste modo, os efeitos adversos, sendo portanto, a que é mais utilizada

atualmente nas mulheres pós-menopáusicas.

O exemestano é, atualmente, o AI esteróide mais utilizado na segunda linha de

tratamento deste tipo de tumores. Apesar dos inúmeros estudos epidemiológicos e de

segurança clínica desenvolvidos, permanecem por esclarecer os efeitos biológicos deste

fármaco a nível celular. De facto, as suas vias de metabolização bem com os seus

metabolitos continuam a ser alvo de estudo, não estando, ainda, complemente

elucidados. Por outro lado, sabendo-se que o exemestano é rapidamente metabolizado,

permanece por saber se os efeitos induzidos são devidos a este AI ou aos seus

metabolitos. Deste modo, o objetivo deste trabalho é avaliar a atividade bioquímica e os

efeitos biológicos in vitro de três metabolitos do exemestano, o 17β-hidroexemestano,

6α/β-spirooxiranandrosta-1,4-dieno-3,17-diona e 1α,2α-epoxy-6-methylenandrost-4-ene-

3,17-diona, na linha celular de cancro da mama estrogénio-dependente, MCF-7aro.

Para além disso, o desenvolvimento de resistência à terapia hormonal não pode ser

ignorado, sendo necessário continuar a elucidar os mecanismos associados a esta

condição. Deste modo, um outro objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos dos

metabolitos do exemestano na viabilidade celular da linha LTEDaro, uma linha celular

que mimetiza as células do cancro da mama estrogénio-dependente resistente à terapia

hormonal.


44


45

Capítulo II: Materiais e Métodos


46


47

2.1. Materiais

O meio de cultura Eagle’s (MEM), soro bovino fetal (SBF), L-glutamina, antibiótico-

antimicótico, geneticina e a tripsina foram adquiridos à Gibco Invitrogen Co. (Paisley,

Scotland, UK). O 17-βHE foi adquirido à @rt Molecule (Poitiers, France).

O azul de tripano, testosterona (T), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA),

dimetilsulfóxido (DMSO), carvão ativado, piruvato de sódio, formestano (4-OHA), 3-

metiladenina (3-MA), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e Hoechst foram

fornecidos pela Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). O corante de Giemsa foi

fornecido pela Merck (Damnstadt, Germany) e o meio de montagem Vectashield pelo

Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA, USA). O líquido de cintilação foi adquirido à

ICN Radiochemicals (Irvine, CA, USA) e o reagente de Bradford à Bio-Rad (Bio-Rad

Labs, Munich, Germany), enquanto que os filtros do cell harvester foram obtidos da

Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA).

2.2. Compostos

Os compostos 32 (6α/β-spirooxiranandrosta-1,4-dieno-3,17-diona) e 33 (1α,2α-epoxy-6-

methylenandrost-4-ene-3,17-diona) foram sintetizados no Centro de Estudos


Universidade de Coimbra. Foram preparadas soluções stock de 20 mM dos compostos

C32, C33 e 17-βHE, em DMSO, e armazenadas a -20˚C. As diluições apropriadas dos

compostos foram preparadas antes de cada ensaio. O formestano e o exemestano foram

usados como compostos de referência.

Figura 18. Compostos em estudo; A) 17β-hidroexemestano (17-βHE); B) 6α/β-spirooxiranandrosta-1,4-dieno-

3,17-diona (composto C32) e C) 1α,2α-epoxy-6-methylenandrost-4-ene-3,17-diona (composto C33).


48

2.3. Culturas celulares

2.3.1. MCF7-aro

A linha celular de cancro da mama recetor de estrogénio positivo que sobre-expressa a

aromatase, MCF-7aro, foi obtida pela transfecção estável da linha celular MCF-7 com o

gene da aromatase humana da placenta e cedida pelo Dr. Shiuan Chen (Beckman

Research Institute, City of Hope, Duarte, CA, U.S.A.). As células MCF-7aro foram

mantidas a 37˚C com 5% de CO2 em meio de cultura MEM (Meio Mínimo Essencial de

Eagle) com vermelho de fenol contendo sais de Eagle, piruvato de sódio (1 mmol/L),

glutamina (2 mmol/L), penicilina-estreptomicina-anfotericina B (1%), geneticina G418 (700

ng/ml) e 10% de soro bovino fetal (SBF) inativado pelo calor. Para evitar a interferência

dos esteróides presentes no SBF e o efeito estrogénico do vermelho de fenol, três dias

antes do início da experiência, o meio de cultura foi substituído por um meio sem

vermelho de fenol, contendo 5% de SBF tratado previamente com carvão ativado (SBF-

CT). Todas as experiências foram realizadas com 1nM de testosterona (T), substrato da

aromatase e agente indutor da proliferação celular, e com os compostos C32, C33 e 17-

βHE. Todos os ensaios foram realizados em triplicado, e os resultados representam pelo

menos três experiências realizadas independentemente.

2.3.2. LTEDaro

A linha celular LTEDaro foi obtida da linha celular MCF-7aro. As células LTEDaro são

privadas durante 6 meses de estrogénios (Long Term Estrogen Deprivation),

mimetizando as células do cancro da mama estrogénio-dependente resistente à terapia

hormonal. Esta linha celular foi também cedida pelo Dr. Shiuan Chen. As células

LTEDaro foram mantidas a 37˚C com 5% de CO2 em meio de cultura sem vermelho de

fenol (NEM), contendo piruvato de sódio (1 mmol/L), glutamina (2 mmol/L), penicilina-

estreptomicina-anfotericina B (1%), geneticina G418 (700 ng/ml) e 10% de SBF inativado

pelo calor e tratado com carvão ativado (SBF-CT). Todas as experiências foram

realizadas na ausência de testosterona e com os compostos C32, C33 e 17-βHE. Todos os

ensaios foram realizados em triplicado, e os resultados representam pelo menos três

experiências realizadas independentemente.


49

2.4. Determinação do IC50 nas células MCF-7aro

A determinação do IC50 dos vários compostos foi avaliada através da quantificação da

água tritiada libertada, de acordo com o método descrito por Thompson e Siiteri, usando

[1β-3H] androstenediona como substrato da enzima aromatase. A avaliação da atividade

da aromatase por esta técnica foi validada previamente por Zhou e colaboradores [141].

As células foram cultivadas em placas de 24 poços, na densidade de 3,5 x 105 células/ml

com meio de cultura MEM. Quando atingida a confluência, as células foram colocadas

em meio MEM sem soro, e incubadas com os inibidores a diferentes concentrações (0,1

a 25 µM), 50 nM de [1β-3H] androstenediona e 500 nM de progesterona, durante uma

hora, a 37˚C com 5% de CO2. A progesterona inibe a ação da enzima 5α-redutase, que

tal como a aromatase, tem a androstenediona como substrato. Após uma hora, a reação

enzimática foi terminada por adição de 300 µl de ácido tricloroacético (20%).

Posteriormente, recolheu-se a mistura para tubos de microcentrífuga com um pellet de

carvão/dextrano, onde permaneceu durante uma hora à temperatura ambiente, sendo de

seguida centrifugada a 15000xg durante 10 min. O sobrenadante foi retirado para outro

tubo contendo carvão/dextrano, de modo a garantir a remoção de todos os resíduos de

androstenediona e de outros componentes esteróides, e centrifugado. Após

centrifugação, retiraram-se 200 µl de sobrenadante para tubos de cintilação, contendo 3

ml de cocktail de cintilação. A leitura foi realizada num contador de cintilação (LS 6500,

Beckman Instruments, CA, U.S.A.).

Para determinação do conteúdo proteico, as células foram incubadas com 500 µl de

NaOH durante a noite, com agitação e à temperatura ambiente. A concentração de

proteínas foi determinada pelo método de Bradford. Neste ensaio, o formestano (5 µM),

um inibidor esteróide da aromatase, foi usado como controlo positivo. Todos os ensaios

foram realizados em triplicado e os resultados representam, pelo menos, três

experiências realizadas independentemente.

2.5. Estudos morfológicos

As alterações morfológicas foram analisadas por microscopia de contraste de fase e

pelas colorações de Giemsa e Hoechst. Para se verificar a presença de vesiculas ácidas,

procedeu-se à coloração com laranja de acridina. Para a realização destes ensaios, as

células foram cultivadas durante 48, 72 e 144 horas e com diferentes concentrações dos

compostos (5 a 15 µM), em placas de 24 poços, sendo a densidade celular de 1,0 x 106

células/ml.


50

2.5.1. Coloração de Giemsa

A coloração de Giemsa permite-nos observar alterações morfológicas a nível do núcleo e

citoplasma. Após o tratamento e lavagem com PBS, as células foram fixadas com

metanol durante 30 minutos à temperatura ambiente, sendo posteriormente coradas com

corante de Giemsa, diluído em PBS (1:10), durante 30 minutos. Após lavagem com água

e secagem, as lâminas foram montadas em DPX. As células foram observadas ao

microscópio Eclipse E400, Nikon, equipado com o software de análise de imagem

LeicaQwin.

2.5.2. Coloração de Hoechst

Através da coloração de Hoechst é possível avaliar alterações na morfologia nuclear,

nomeadamente alterações a nível da condensação da cromatina. Após o período de

incubação, as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído (4% em

PBS) durante 30 min. Após fixação, as células foram incubadas com a solução de

Hoechst 33258 a 0,5 mg/ml em PBS durante 30 min. Após incubação, as lâminas foram

lavadas com PBS, e montadas em meio de montagem Vectashield sendo imediatamente

observadas ao microscópio de fluorescência (Eclipse E400, Nikon, Japan), equipado com

um filtro de excitação com o máximo de transmissão aos 360/400 nm, e processadas

pelo software de imagem Nikon ACT-2U.

2.5.3. Coloração com laranja de acridina

A coloração com laranja de acridina permite analisar a existência de vesículas ácidas

(AVOs). Após os períodos de incubação, as células foram incubadas com o corante

laranja de acridina (0,1 µg/ml) durante 30 minutos. De seguida, o corante foi removido, e

as lâminas montadas em PBS, sendo imediatamente observadas ao microscópio de

fluorescência (Eclipse E400, Nikon, Japan), equipado com um filtro de excitação com o

máximo de transmissão aos 490 nm. A presença de AVOs foi observada através da

fluorescência amarela/laranja/vermelha emitida.


51

2.6. Viabilidade e proliferação celular

A viabilidade celular foi avaliada pela determinação da atividade mitocondrial recorrendo

ao uso de um sal de tetrazólio, o 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) que é

convertido a um sal de formazano, e pela libertação da enzima latacto desidrogenase

(LDH). As células MCF-7aro e LTEDaro foram cultivadas em placas de 96 poços, sendo

aplicada uma densidade celular de 2,5 x 104 células/ml para o período de incubação de

24, 48 e 72 horas e de 1 x 104 células/ml para o período de incubação correspondente às

144 horas. Posteriormente, as células foram incubadas com diferentes concentrações

dos compostos C32, C33 e 17-βHE (0,01 – 15 µM) durante 24, 48, 72 e 144h, com ou sem

3-metiladenina (3-MA, 1 mM), um inibidor da autofagia. Após a adição do MTT (0,5

mg/ml), a quantidade de azul de formazano formada foi analisada por espectrofotometria

a 540 nm. Por sua vez, a atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) libertada foi

doseada pelo Kit de LDH (Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega Corporation) de

acordo com o protocolo fornecido.

Para avaliar a proliferação celular, após o tratamento com cada um dos metabolitos,

realizou-se o ensaio de incorporação de [H3]-timidina. Uma vez que a timidina se

incorpora no DNA durante o processo de replicação, a quantidade de [H]3–timidina

incorporada é um indicador da síntese de DNA e consequentemente de proliferação

celular. Para a realização deste ensaio, a [H3]-timidina (0,5 μCi) foi adicionada a cada

poço, 8 horas antes do final do período de incubação correspondente a cada tratamento.

Após este período, as células foram sujeitas a um ciclo de congelação/descongelação e o

conteúdo celular foi recolhido recorrendo ao cell harvester (Skatron Instruments,

Noruega). Os filtros contendo o DNA foram colocados em tubos de cintilação, aos quais

foi adicionado 1 ml de cocktail de cintilação. A [H3]-timidina incorporada foi determinada

num contador de cintilação (LS 6500, Beckman Instruments, CA, U.S.A.).

2.7. Ciclo celular

As células foram cultivadas em placas de 6 poços, com densidade celular de 1,0 x 106

células/ml. Após 72h de incubação com os diferentes inibidores (5 a 15 µM), o meio foi

retirado, as células não aderentes recolhidas, e procedeu-se à tripsinização.

Posteriormente, as células foram centrifugadas (1200xg, 5 mim, 4˚C) e lavadas com PBS.

Após nova centrifugação, as células foram fixadas com etanol a 70% diluído em PBS

(1:10), sendo mantidas a 4ºC por um período de 2 horas. Após fixação, as células foram,

de novo, centrifugadas e o pellet obtido foi lavado com PBS. As células foram re-

suspendidas em 0,5 ml de PBS contendo 5 μg/ml de iodeto de propídio (PI), 0,1% triton


52

X- 100 e 200 μg/ml DNAse-free Rnase A, e mantidas 30 min à temperatura ambiente.

Esta solução permite a degradação do RNA presente nas amostras, a permeabilização

das membranas através do Triton X-100 e a marcação das células com PI, garantindo

deste modo que a análise se refere apenas ao conteúdo de DNA. Esta análise é efetuada

por citometria de fluxo e baseada na aquisição de 10000 células num citómetro, Becton

Dickinson FACSCalibur (San Jose, CA, U.S.A.) equipado com o software CELLQuest

Pró. Os três canais fluorescentes (FL-1, FL-2 e FL-3) foram mantidos na escala linear. Os

efeitos dos compostos foram indicados pela percentagem de células nas fases G1, S e

G2/M do ciclo celular. Após a aquisição, a análise dos resultados foi realizada usando o

programa CELLQuest Pró.

2.8. Análise estatística

O tratamento de dados foi realizado através do programa GraphPad Prism 4 (GraphPad

Software Inc., San Diego, CA, USA). Os resultados são apresentados como Média ± Erro

Padrão da Media (SEM). A diferença significativa entre as médias dos resultados foi

calculada usando os testes t-student e One e Two-Way Analysis of Variance (ANOVA)

com o teste de multicomparação de Bonferroni. As diferenças foram consideradas

significativas para p ≤ 0,05.


53

Capítulo III: Resultados


54


55

3.1. Determinação do IC50 nas células MCF-7aro

A determinação do IC50 dos compostos C32, C33 e 17-βHE foi avaliada nas células MCF-

7aro recorrendo a um método radiométrico, no qual a água tritiada libertada da [1β-3H]

androstenediona, por ação da aromatase, foi usada como índice de formação de

estrogénio. O formestano (4-OHA), um potente inibidor da aromatase, com uma

percentagem de inibição na ordem dos 99%, foi utilizado como inibidor de referência.

Figura 19. Determinação do IC50 dos compostos C32, C33 e 17-βHE em células MFC-7aro. O gráfico

representa a inibição da atividade da aromatase pelos compostos em estudo. Para realização do ensaio, as

células foram incubadas com 50 nM de [1β-3H] androstenediona (1 µCi), com os compostos (0,1 a 25 µM) e

500 nM de progesterona. O formestano a 5 µM foi utilizado como composto de referência. Os ensaios foram

realizados em triplicado e os resultados representam pelo menos três experiências independentes. Os

valores representam a média ± SEM.

Os resultados obtidos indicam que o composto C32 é o composto mais potente com um

IC50 de 0,70 µM. Para o composto C33 e para o 17-βHE, o IC50 é de 0,75 e 4,20 µM,

respetivamente (figura 19). O valor do IC50 do exemestano nas células MCF7-aro é de

0,90 µM.


56

3.2. Estudos morfológicos

De forma a avaliar as possíveis alterações morfológicas induzidas pelos compostos C32,

C33 e 17-βHE em células MFC-7aro, estas foram cultivadas na presença de testosterona a

1 nM, com ou sem os compostos, durante 48, 72 e 144 horas. As células foram

analisadas por microscopia de contraste de fase e coradas pelas colorações de Giemsa e

Hoechst. As células tratadas apenas com testosterona foram consideradas como grupo

controlo (figura 20), não se verificando alterações durante os vários períodos de

incubação.

Figura 20. Células MCF-7aro tratadas com testosterona a 1 nM, examinadas por microscopia de contraste de

fase (A) coloração de Giemsa (B) e coloração de Hoechst (C), após 72 horas de cultura. Ampliação original:

200x.


57

Após as 48 horas de incubação com os compostos não se verificaram alterações

morfológicas visíveis pela microscopia de contraste de fase, coloração de Giemsa e

Hoechst.

Ao fim de 72 horas de tratamento, com o composto C32, verifica-se através da coloração

de Hoechst, a presença de condensação de cromatina para a concentração mais elevada

(15 µM) (figura 21).

Figura 21. Efeito do composto C32 (10 e 15 µM) na morfologia celular, por microscopia de contraste de fase

(A e B), coloração de Giemsa (C e D) e coloração de Hoechst (E e F). As células MCF-7aro foram cultivadas

na presença do composto C32, durante 72 horas, com 10 µM (A, C e E) e 15 µM (B, D e F). As células

tratadas apresentam condensação de cromatina observada pela coloração de Hoechst ( ). Ampliação

original: 200x.


58

Na presença do composto C33, após 72 horas de incubação, verifica-se a presença de

um grande número de células mortas dependente da concentração (figura 22).

Figura 22. Efeito do composto C33 (0,5; 1; 2,5 e 5 µM) na morfologia celular, por microscopia de contraste de

fase. As células MCF-7aro foram cultivadas na presença do composto C33, durante 72 horas, com 0,5 µM

(A), 1 µM (B), 2,5 µM (C) e 5 µM (D). Ampliação original: 200x.


59

Através das colorações de Giemsa e de Hoechst é possível verificar alguma

condensação de cromatina (figura 22).

Figura 23. Efeito do composto C33 na morfologia celular, por coloração de Giemsa (A e C) e coloração de

Hoechst (B e D). As células MCF-7aro foram cultivadas na presença do composto C33, durante 72 horas,

com 1 µM (A e B) e 2,5 µM (C e D). As células tratadas apresentam condensação de cromatina observada

pela coloração de Hoechst ( ). Ampliação original: 200x.

O composto 17-βHE foi o metabolito que induziu mais alterações morfológicas nas células.

Observou-se a presença de vacuolização do citoplasma através da coloração de Giemsa,

e pela coloração de Hoechst verificou-se a condensação de cromatina para as

concentrações mais elevadas (figura 24).


60

Figura 24. Efeito do composto 17-βHE (10 e 15 µM) na morfologia celular, por microscopia de contraste de

fase (A e B), coloração de Giemsa (C e D) e coloração de Hoechst (E e F). As células MCF-7aro foram

incubadas com o composto 17-βHE, durante 72 horas, com 10 µM (A, C e E) e 15 µM (B, D e F). As células

tratadas apresentam vacuolização do citoplasma observada através da coloração de Giemsa ( ) e

condensação de cromatina observada pela coloração de Hoechst ( ). Ampliação original: 200x.

Verifica-se uma diminuição da densidade celular para as concentrações mais elevadas e

tempos mais prolongados para todos os compostos, sendo que esta redução é muito

acentuada para o composto C33. Para além disso, as alterações morfológicas, como a

condensação de cromatina e a formação de blebbs de membrana, sugerem um efeito

dependente da concentração.


61

3.3. Análise da viabilidade e proliferação celular nas células MCF-7aro

O efeito dos compostos na viabilidade da linha celular MCF-7aro foi determinado pela

conversão de um sal de tetrazólio a sal de formazano, pela mitocôndria (ensaio de MTT).

Os resultados demonstram que há uma redução da viabilidade celular dependente da

concentração, sendo mais acentuada para as maiores concentrações dos compostos em

estudo (figura 25). Após 48 horas de incubação, para a concentração de 1 µM, verifica-se

que os compostos C32, C33 e 17-βHE conduzem a uma redução significativa da viabilidade

celular para 84%, 60% e 91%, enquanto que a 15 µM se verifica uma diminuição para

62%, 14% e 54%, respetivamente. Às 72 horas, os compostos C32 e 17-βHE, para a

concentração de 1 µM, induzem uma redução da viabilidade celular de 15% e 28%, e a

15 µM de 59% e 49%, respetivamente. Por sua vez, o composto C33, a 1 µM, conduz a

um decréscimo na ordem dos 50%, enquanto que para as restantes concentrações (2,5 a

15 µM), a diminuição da viabilidade é superior a 85%. Após as 144 horas de incubação

verifica-se a diminuição da viabilidade celular induzida pelos compostos C32, C33 e 17-βHE,

a 1 µM, para 84%, 20% e 85%, respetivamente. No entanto, a 15 µM, essa redução é

mais acentuada (48% de viabilidade para o C32, 11% para o C33 e 35% para o 17-βHE).

O composto C33 é o mais eficaz, verificando-se uma maior diminuição da viabilidade

celular nos diferentes tempos de incubação comparativamente aos outros compostos em

estudo. Verifica-se, ainda, que nos períodos de incubação de 72 e 144 horas, as

concentrações mais elevadas do composto C33 (2,5 a 15 µM) induzem um decréscimo

acentuado da viabilidade celular, não se verificando diferenças significativas entre as

várias concentrações. Dada a redução acentuada de viabilidade celular induzida pelo C33

nas concentrações testadas (1 a 15 µM), foi também avaliado o seu efeito a

concentrações mais baixas, a 0,1 e 0,5 µM. Deste modo, verificou-se um decréscimo da

viabilidade celular aproximadamente 9 e 20% (48 horas), 10 e 14% (72 horas) e de 28 e

48% (144 horas), respetivamente.


62

Figura 25. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular, avaliado pelo ensaio de MTT. As

células MCF-7aro foram cultivadas durante 48, 72 e 144 horas, em meio com 1 nM de testosterona na

ausência ou presença do composto C32 (A), composto C33 (B) e composto 17-βHE (C). As células cultivadas

em meio apenas com testosterona representam o máximo de viabilidade celular e foram consideradas como

grupo controlo. Os valores representam a média ± SEM. As diferenças significativas em relação ao controlo

são conotadas como * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ****p<0,0001 (Two-Way ANOVA com o teste de

multicomparação de Bonferroni).

Para analisar os efeitos dos compostos C32, C33 e 17-βHE na proliferação das células

MCF-7aro, foi utilizado o ensaio de incorporação de [3H]-timidina, uma vez que a timidina

se incorpora no DNA durante o processo de replicação. De acordo com os resultados

obtidos, estes compostos induzem uma diminuição da proliferação celular dependente da

concentração (figura 26). Mais uma vez, o composto C33 é muito mais eficaz que os


63

compostos C32 e 17-βHE, causando uma redução acentuada da síntese de DNA em todas

as concentrações testadas (após 48 horas de incubação verifica-se uma diminuição da

proliferação de 61%, 77%, 93% e 99% para as concentrações de 1; 2,5; 5 e 10 µM,

respetivamente, e às 72 horas de 78%, 81%, 98% e 99%). Às 48 horas, para a

concentração de 1 µM, verifica-se uma diminuição da síntese de DNA para valores de

80% e 71% para os compostos C32 e 17-βHE, respetivamente, enquanto que, para a

concentração de 15 µM, se observa uma redução para valores de 43% e 33%. Às 72

horas, o comportamento é semelhante, induzindo uma diminuição da síntese de DNA

para 64% e 65%, a 1 µM, e de 30% e 27%, a 15 µM, para os compostos C32 e 17-βHE,

respetivamente.

Figura 26. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na síntese de DNA. As células MCF-7aro foram

cultivadas durante 48 e 72h horas, em meio com 1 nM de testosterona na ausência ou presença do composto

C32 (A), composto C33 (B) e do composto 17-βHE (C). As células cultivadas em meio apenas com

testosterona representam o máximo de proliferação celular e foram consideradas como grupo controlo. Os

compostos induzem um decréscimo na proliferação celular dose-dependente. Os valores representam a

média ± SEM. As diferenças significativas em relação ao controlo são conotadas como *** p<0,001 (Two-Way

ANOVA com o teste de multicomparação de Bonferroni).


64

Por sua vez, a integridade da membrana celular foi avaliada pela determinação dos níveis

de atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH), uma enzima citosólica libertada

para o meio extracelular após a lise da membrana celular. Os resultados demonstram

que apenas o composto C33 conduz à perda da integridade da membrana (figura 27).

Esta perda de integridade membranar é significativa para as concentrações de 5, 10 e 15

µM.

Figura 27. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na integridade da membrana celular. As células MCF-

7aro foram cultivadas durante 48 e 72 horas, em meio com 1 nM de testosterona na ausência ou presença do

composto C32 (A), composto C33 (B) e do composto 17-βHE (C). As células cultivadas em meio apenas com

testosterona representam o grupo controlo. Apenas o composto C33 provoca a libertação de LDH. Os valores

representam a média ± SEM. As diferenças significativas em relação ao controlo são conotadas como ***

p<0,001 (Two-Way ANOVA com o teste de multicomparação de Bonferroni).


65

3.4. Ciclo celular

Para avaliar quais os mecanismos associados aos efeitos anti-proliferativos dos

compostos em estudo, foram analisadas as fases do ciclo celular das células MCF-7aro

através na quantificação de DNA por citometria de fluxo, após marcação das células com

iodeto de propídio (PI). Esta análise foi realizada, após 72 horas de incubação com os

compostos em estudo e através da aquisição de 10000 células. As células tratadas

apenas com testosterona (T) foram consideradas o grupo controlo, apresentando 66,31 ±

3,00% das células na fase G0/G1, 18,07 ± 2,27% na fase S e 14,15 ± 1,14% na fase G2/M

(tabela 3). Por sua vez, após tratamento com os compostos C32, C33 e 17-βHE, verifica-se

um aumento significativo da percentagem de células na fase G0/G1 e uma diminuição

significativa da percentagem de células na fase S. Na fase G2/M não se observam

diferenças significativas (tabela 3). Não se verificaram alterações significantes entre as

doses testadas. Na figura 28 apresentam-se histogramas representativos do efeito dos

compostos em estudo.

Tabela 3. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE no ciclo celular das células MCF-7aro. As células, após

tratamento com os compostos em estudo em diferentes concentrações, durante 72 horas, foram recolhidas e

o conteúdo de DNA avaliado, por marcação com iodeto de propídio (PI), em citometria de fluxo. Os resultados

representam as percentagens referentes às fases G0/G1, S e G2/M do ciclo celular. Os valores representam

a média ± SEM. Os ensaios foram realizados em triplicado e os resultados representam, pelo menos, três

experiências realizadas independentemente. As diferenças significativas em relação ao controlo são

conotadas como * p<0,05, ** p<0,01 *** p<0,001, **** p<0,0001 (Two-Way ANOVA com o teste de


Controlo T + 5 µM C32 T + 10 µM C32 T + 15 µM C32

G0/G1 66,31 ± 3,00 83,73 ± 0,91****

83,58 ± 1,73****

83,50 ± 1,66****

S 18,07 ± 2,27 5,77 ± 0,68**

5,82 ± 0,58**

5,73 ± 1,03**

G2/M 14,15 ± 1,14 6,29 ± 0,63 6,16 ± 0,34 6,04 ± 0,52

Controlo T + 1 µM C33 T + 2,5 µM C33 T + 5 µM C33

G0/G1 66,31 ± 3,00 76,59 ± 1,54***

78,19 ± 1,14****

82,30 ± 0,57****

S 18,07 ± 2,27 6,57 ± 0,36**

6,98 ± 0,23**

6,96 ± 0,74**

G2/M 14,15 ± 1,14 10,60 ± 0,86 8,91 ± 0,65 7,95 ± 0,79

Controlo T + 5 µM 17-βHE T + 10 µM 17-βHE T + 15 µM 17-βHE

G0/G1 66,31 ± 3,00 81,94 ± 1,93****

81,51 ± 0,79****

81,57 ± 1,83****

S 18,07 ± 2,27 7,90 ± 1,39***

7,91 ± 0,76***

6,73 ± 0,80****

G2/M 14,15 ± 1,14 7,05 ± 0,89* 7,67 ± 1,02 7,41 ± 0,66

*


66

Figura 28. Histogramas representativos do efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE no ciclo celular das

células MCF-7aro. As células foram tratadas com testosterona a 1 nM (A) e os compostos C32 (B), C33 (C) e

17-βHE (D), a diferentes concentrações (2,5 e 5 µM) durante 72 horas. Posteriormente, as células foram

marcadas com iodeto de propídeo (PI) e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados

sobre a forma de histogramas obtidos pelo software FlowJo (Tree Star, Inc.), através da aplicação do modelo

matemático Watson, e representam um ensaio independente.


67

3.5. Avaliação da presença de vesículas ácidas por coloração com laranja de

acridina

A coloração com laranja de acridina permite visualizar a presença de vesiculas ácidas

(AVOs). Esta técnica permite, através de fluorescência, identificar as AVOs que

apresentam tonalidades amarelas, laranja e vermelhas, consoante a acidez da vesícula.

As células MFC-7aro foram cultivadas com e sem os compostos C32, C33 e 17-βHE, na

presença de testosterona a 1 nM, durante 72 e 144 horas. Todos os compostos parecem

induzir a formação de AVOs às 72 horas, dependente da concentração. No entanto, a

formação destas vesículas é mais acentuada no período de incubação de 144 horas. O

composto 17-βHE é o esteróide que induz a formação de um maior número de AVOs

(figura 29).

Figura 29. Coloração de laranja de acridina das células MCF-7aro, tratadas com testosterona a 1 nM (A) e

com os compostos C32 (10 µM) (B), C33 (5 µM) (C) e 17-βHE (10 µM) (D), durante 144 horas. Ampliação original:

200x.


68

3.6. Análise da viabilidade celular nas células LTEDaro

As células LTEDaro são obtidas através da privação a estrogénios (Long Term Estrogen

Deprivation), mimetizando, deste modo, as células do cancro da mama estrogénio-

dependente resistentes à terapia hormonal. Estudos demonstraram que esta linha celular

é resistente ao tratamento com o exemestano [77].

Assim, o efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular das células

LTEDaro foi avaliado, recorrendo, uma vez mais, ao ensaio de MTT. Os resultados

demonstraram que há uma redução da viabilidade celular, sendo essa redução mais

acentuada para as maiores concentrações dos compostos em estudo (figura 30). No

entanto, o composto C33, tal como acontece nas células MCF7-aro, parece ser mais

eficaz, comparativamente aos outros esteróides. Às 48 horas de incubação verifica-se um

decréscimo significativo da viabilidade celular induzido pelos compostos C32, C33 e 17-

βHE, a 1 µM, para 93%, 85% e 91%, e a 15 µM para 68%, 18% e 64%, respetivamente.

Às 72 horas, o composto C33 conduz à redução da viabilidade celular para 77%, na

concentração de 1 µM, enquanto que os compostos C32 e 17-βHE reduzem a viabilidade

celular para 89 e 85%, respetivamente. Na concentração de 15 µM, verifica-se a redução

da viabilidade para 65% para o C32, 10% para o C33 e 55% para o 17-βHE.Por fim, às 144

horas, para a concentração de 1 µM verifica-se uma diminuição da viabilidade para 83%,

41% e 69% induzida, respetivamente, pelos compostos C32, C33 e 17-βHE, enquanto que a

15 µM, essa redução é mais acentuada (50% para o C32, 6% para o C33 e 36% para o 17-

βHE).


69

Figura 30. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular das células LTEDaro, avaliado pelo

ensaio de MTT. As células LTEDaro foram cultivadas durante 48, 72 e 144 horas, na ausência ou na

presença do composto C32 (A), composto C33 (B) e do composto 17-βHE (C). As células cultivadas apenas

com o meio representam o máximo de viabilidade celular e foram consideradas como grupo controlo. Os

valores representam a média ± SEM. As diferenças significativas em relação ao controlo são conotadas como

* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 (Two-Way ANOVA com o teste de multicomparação de Bonferroni).


70

3.7. Efeito do inibidor da autofagia na viabilidade celular

Visto que, tal como descrito para o exemestano, os compostos em estudo induziam o

aparecimento de AVOs, estudou-se o efeito de um inibidor da autofagia. Assim, as

células MCF-7aro foram tratadas com o composto 3-metiladenina (3-MA), a 1 µM,

juntamente com os vários compostos em estudo. Uma vez mais, os efeitos dos

compostos na viabilidade celular nas linhas celulares MCF-7aro e LTEDaro foram

determinados pelo ensaio de MTT. Em geral, nas células MCF-7aro, não se verificam

alterações significativas na viabilidade celular na presença ou ausência de 3-MA (figura

31).

Figura 31. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular das células MCF-7aro, na presença

ou ausência de 3-MA. As células MCF-7aro foram cultivadas com testosterona durante 72 (A, C e E) e 144

horas (B, D e F), na presença de testosterona e do composto C32 (A e B), composto C33 (C e D) e do

composto 17-βHE (E e F). Os compostos induzem um decréscimo na viabilidade celular, avaliado pelo ensaio

de MTT. Os valores representam a média ± SEM. As diferenças significativas em relação ao ensaio sem a


71

presença de 3-MA e são conotadas como * p<0,05; *** p<0,001 (Two-Way ANOVA com o teste de


Ao contrário do que acontece na linha celular MCF-7aro, na linha celular LTEDaro, o 3-

MA parece reverter ligeiramente o efeito induzido pelos compostos C32 e 17-βHE às 72

horas, sendo mais significativo após 144 horas de incubação. Por sua vez, o composto

C33 apresenta o mesmo perfil quer na ausência, quer na presença de 3-MA (figura 32).

Figura 32. Efeito dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular das células LTEDaro, na presença

ou ausência de 3-MA. As células LTEDaro foram cultivadas durante 72 (A, C e E) e 144 horas (B, D e F), na

presença do composto C32 (A e B), composto C33 (C e D) e do composto 17-βHE (E e F). Os compostos

induzem um decréscimo na viabilidade celular, avaliado pelo ensaio de MTT. Os valores representam a

média ± SEM. As diferenças significativas em relação ao controlo são conotadas como * p<0,05; ** p<0,01;

*** p<0,001 (Two-Way ANOVA com o teste de multicomparação de Bonferroni).


72


73

Capítulo IV: Discussão e Conclusões


74


75

O cancro da mama é uma das patologias com maior taxa de mortalidade em todo o

mundo. Estima-se que cerca de 60% das mulheres pré-menopáusicas e 75% das

mulheres pós-menopáusicas possuam cancros da mama dependentes de estrogénios

(ER+) [1, 3, 88]. Os estrogénios desempenham um papel importante no desenvolvimento

e tratamento deste tipo de tumores. Assim, a supressão dos efeitos destas hormonas

esteróides é considerada uma potente arma terapêutica nos cancros da mama

dependentes de estrogénio. Enquanto que os SERMs e os SERDs limitam os efeitos dos

estrogénios através da modelação dos seus recetores, os AIs bloqueiam o ultimo passo

da conversão de androgénios a estrogénios, através da inibição da enzima aromatase.

O exemestano é o AI esteróide mais utilizado na terapêutica do cancro da mama ER+,

que atua inibindo irreversivelmente a enzima aromatase através dos seus intermediários

reativos [29]. Apesar dos estudos epidemiológicos e de segurança clínica, pouco se sabe

sobre os seus efeitos a nível celular, bem como as suas vias de metabolização e os seus

metabolitos. Assim, neste trabalho pretendeu-se elucidar os efeitos biológicos do 17-beta-

hidroxiexemestano (17-βHE), do 6α/β-spirooxiranandrosta-1,4-dieno-3,17-diona (C32), e do

1α,2α-epoxy-6-methylenandrost-4-ene-3,17-diona (C33), in vitro, nas linhas celulares

MF7-7aro e LTEDaro. Os compostos 17-βHE e C32 já foram descritos na literatura como

metabolitos do exemestano [69, 71, 75], enquanto que o C33 é considerado um potencial

metabolito [76].

De modo a verificar se os compostos em estudo seriam, tal como o exemestano,

inibidores da aromatase, determinou-se os respetivos IC50 nas células MCF-7aro. Os

resultados obtidos indicam que os compostos C32 e o C33 são os mais potentes, com um

IC50 de 0,70 e 0,75 µM, respetivamente, enquanto que o composto 17-βHE apresenta um

valor de IC50 bastante superior (4,2 µM). Comparativamente ao exemestano, que

apresenta um IC50 de 0,9 µM em células que expressam a enzima aromatase (MCF-

7aro), verifica-se que os metabolitos C32 e C33 são inibidores mais potentes.

A nível celular, os compostos induziam a condensação de cromatina e formação de

blebbs na membrana, características morfológicas associadas à morte celular

programada tipo I, a apoptose. No entanto, o composto 17-βHE parece ser mais eficaz a

induzir a condensação de cromatina. Para além destas alterações, verificou-se que os

compostos induziam a vacuolização do citoplasma das células MCF-7aro, nas

concentrações e tempos de incubação mais elevados, sendo estas alterações mais

frequentes com o composto 17-βHE. A formação de vesiculas ácidas (AVOs), visível

através da coloração de Giemsa e laranja de acridina é uma característica do processo

de autofagia.


76

Estas alterações morfológicas induzidas pelos esteróides em estudo são concordantes

com as alterações induzidas pelo exemestano já descritas nas células MCF-7aro, em que

se verifica que este induz formação de blebbing, fragmentação e condensação de

cromatina e vacuolização do citoplasma sendo estas alterações mais visíveis após seis e

nove dias de tratamento, a 15 µM [77].

Dado que as alterações morfológicas sugerem a ocorrência de morte celular, foram

avaliados os efeitos dos compostos C32, C33 e 17-βHE, na viabilidade e proliferação das

células MCF-7aro. Esta linha celular expressa a aromatase em quantidade suficiente para

estimular a proliferação através da conversão da testosterona a estradiol. A testosterona,

por sua vez, estimula o crescimento e proliferação das células MCF-7aro em

concentrações que atingem valores mínimos de 1 nM, e que se encontram dentro da

concentração fisiológica média para esta hormona. Verificou-se que os compostos em

estudo conduzem ao decréscimo da viabilidade e da proliferação de forma dose-

dependente, sendo, no entanto, o composto C33 o mais eficaz, e o único que conduz à

perda de integridade da membrana celular. A diminuição da viabilidade/proliferação

mediada pelos compostos C32, C33 e 17-βHE pode estar associada à retenção do ciclo ou

à indução de morte celular. Quando analisado o ciclo das células MCF-7aro, após

tratamento com os compostos, verifica-se a retenção do ciclo celular na fase G0/G1

bloqueando, assim, a transição da fase G1 para a fase S do ciclo ou prolongando a

permanência das células na fase G1. Por outro lado, estes resultados são concordantes

com a diminuição da incorporação de timidina tritiada no DNA, sugerindo, um decréscimo

da proliferação celular. Dos inibidores em estudo, o C33, mais uma vez, é o composto

mais eficaz.

Comparativamente ao exemestano, verificaram-se diferenças na viabilidade e

proliferação das células MCF-7aro, após 72 horas de incubação [77]. O efeito na

viabilidade celular do exemestano a 5 µM apenas é significativo após nove dias de

incubação, enquanto que os metabolitos em estudo, induzem um decréscimo da

viabilidade a partir das 48 horas. Por outro lado, após o tratamento com os compostos

C32, C33 e 17-βHE verifica-se a diminuição significativa da proliferação celular após 48

horas de incubação, sugerindo que os metabolitos são mais eficientes que o exemestano

na redução da viabilidade/proliferação das células MCF-7aro. No entanto, tal como o

exemestano [77], os metabolitos conduzem à retenção do ciclo na fase G0/G1. O

exemestano e o 17-βHE possuem efeitos androgénicos [64], e, por outro lado, sabe-se que

os androgénios exercem predominantemente efeitos anti-proliferativos nas células do

cancro da mama. Assim, a retenção do ciclo poderá ser devido não só à atividade anti-

aromatásica, levando a uma redução dos estrogénios, mas também, caso do 17-βHE, aos


77

efeitos androgénicos, dado que estes ocorrem independentemente da presença de

estrogénios, estando associados a um aumento da proporção de células MCF-7 na fase

G0/G1 [27].

Apesar do desenvolvimento de terapias mais eficientes, a resistência endócrina

associada à terapia hormonal não pode ser ignorada, condicionando, assim, a eficácia do

tratamento. Torna-se portanto necessário continuar a elucidar os mecanismos associados

a esta condição. Recentemente, foi sugerido que a autofagia estaria envolvida na

resistência à terapia endócrina, em células tumorais da mama AI-resistentes [123]. A

autofagia é um processo conhecido de morte celular programada tipo II, caraterizado pela

presença de vesículas citoplasmáticas que englobam constituintes celulares, sendo estes

degradados pela via lisossomal [135]. No entanto, a autofagia pode, também,

desempenhar um papel importante na sobrevivência de células tumorais e na progressão

da patologia e desenvolvimento de metastases [136]. De facto, estudos conduzidos no

nosso laboratório revelaram que o exemestano induz a formação de AVOs, sugerindo o

envolvimento do processo autofágico [77]. Por outro lado, o exemestano não causa

alterações na viabilidade das células hormono-resistentes da mama, LTEDaro, que

mimetizam o ambiente tumoral resistente à terapia. No entanto, o exemestano, na

presença de um inibidor da autofagia, induz uma diminuição da viabilidade destas

células, indicando que a autofagia desempenha um papel importante nos mecanismos de

sobrevivência das células tumorais (dados não publicados).

Assim, estudou-se a eficácia dos metabolitos do exemestano na resistência endócrina

adquirida, avaliando-se os efeitos dos compostos C32, C33 e 17-βHE na viabilidade celular

das células LTEDaro. Contrariamente ao exemestano, que não tem qualquer efeito nas

nestas células [142, 143], os compostos C32, C33 e 17-βHE conduzem a um decréscimo da

viabilidade celular dependente da dose e do tempo, sendo, uma vez mais, o composto

C33 o mais eficaz. No entanto, após 144 horas de tratamento com os esteróides, a 15 µM,

a redução da viabilidade é superior a 50%.

Visto que, o tratamento com o exemestano induzia a ocorrência da autofagia, estando

esta relacionada com a menor frequência da apoptose e sobrevivência das células MCF-

7aro e LTEDaro [77, 144], analisou-se, ainda, o papel que esta poderia desempenhar na

redução da viabilidade celular induzida pelos esteróides C32, C33 e 17-βHE. Deste modo,

foram avaliados os efeitos dos compostos em estudo nas células MCF-7aro e LTEDaro,

na presença de um inibidor da autofagia, o 3-metiladenina (3-MA), que bloqueia a

formação de auto fagossomas, através da inibição da PI3K [145]. Os compostos C32, C33

e 17-βHE na presença do inibidor não induziam alterações na viabilidade das células MCF-


78

7aro, indicando que a autofagia, ao contrário do que acontece com o exemestano, não

está relacionada com mecanismos de sobrevivência nas células sensíveis à terapia

hormonal. No entanto, nas células hormono-resistentes, os compostos C32 e 17-βHE

conduzem a uma menor perda de viabilidade na presença do 3-MA, ao contrário do

composto C33 que induz, tal como nas células MCF-7aro, o mesmo tipo de resposta, quer

na ausência, quer na presença do 3-MA. Estes resultados são concordantes com a

presença mais frequente de AVOs induzida pelos compostos C32 e 17-βHE, do que com o

C33, às 72 e 144 horas, sugerindo que, neste caso, a autofagia induzida pelos compostos

está relacionada com a morte e não com a sobrevivência, indicando que os metabolitos

induzem um decréscimo da viabilidade celular por mecanismos diferentes do

exemestano. Assim, a eficácia do tratamento com o exemestano poderá estar associada

não só a este, mas também aos seus metabolitos, que parecem atuar por mecanismos

diferentes. No entanto, mais estudos terão de ser realizados para elucidar os

mecanismos envolvidos.

Em suma, tal como o exemestano, os compostos C32, C33 e 17-βHE conduzem a uma

diminuição da viabilidade e proliferação das células MFC-7aro, facto este, que pode estar

relacionado com a retenção do ciclo celular da fase G0/G1. No entanto, tal como acontece

com o exemestano, outros mecanismos podem estar associados, tal como a formação de

espécies reativas de oxigénio (ROS) e ativação de caspases, podendo estes processos

estar envolvidos na apoptose, devido à ativação da via mitocondrial. Deste modo, os

efeitos anti-proliferativos dos compostos C32, C33 e 17-βHE nas células MCF-7aro podem

também estar relacionados com a morte celular por apoptose. De facto, verifica-se

condensação de cromatina e formação de blebbs de membrana após o tratamento com

os compostos em estudo. No entanto, mais estudos são necessários para confirmar o

envolvimento da apoptose nos efeitos anti-proliferativos/viabilidade induzidos por estes

esteróides. Nas concentrações elevadas, os compostos C32, C33 e 17-βHE, induzem o

aparecimento de AVOs, característico do processo autofágico. No entanto, ao contrário

do que acontece com o exemestano, este processo não pode ser considerado um

mecanismo de sobrevivência, dado que a inibição da autofagia não induz a diminuição da

viabilidade das células MCF-7aro mediada pelos compostos C32, C33 e 17-βHE. Por outro

lado, contrariamente ao exemestano, os compostos em estudo conduzem à diminuição

da viabilidade das células LTEDaro. Esta linha celular quando tratada com os metabolitos

C32 e 17-βHE na presença do inibidor da autofagia conduz a um aumento da viabilidade o

que parece indicar que a autofagia está envolvida nos processos de morte neste tipo de

células. No entanto, embora a autofagia pareça estar envolvida na redução da


79

viabilidade, mais estudos serão necessários para esclarecer o papel deste processo na

viabilidade das células LTEDaro.

O uso do exemestano no tratamento do cancro da mama estrogénio-dependente

pressupõe a elucidação das suas vias de metabolização, dos metabolitos envolvidos,

bem como das suas consequências a nível celular. Assim, pretende-se que este primeiro

estudo sobre os metabolitos do exemestano conduza ao esclarecimento dos seus efeitos

biológicos, tendo em vista, o desenvolvimento de novos esteróides inibidores da

aromatase, resultando, deste modo, na maior eficácia das terapias hormonais, bem como

no sucesso terapêutico dos cancros da mama hormono-resistentes.


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Capítulo V: Referências Bibliográficas


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