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ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Euterpeedulis MART. SUBMETIDAS À AÇÃO ANTRÓPICA
UTILIZANDO MARCADORES ALOZÍMICOS EMICROSSATÉLITES
RUDIMAR CONTE
Tese apresentada à Escola Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, paraobtenção do título de Doutor em Agronomia, Área deConcentração: Genética e Melhoramento de Plantas.
P I R A C I C A B AEstado de São Paulo – Brasil
Fevereiro - 2004
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Euterpeedulis MART. SUBMETIDAS À AÇÃO ANTRÓPICA
UTILIZANDO MARCADORES ALOZÍMICOS EMICROSSATÉLITES
RUDIMAR CONTE
Engenheiro Agrônomo
Orientador: Prof. Dr. ROLAND VENCOVSKY
Tese apresentada à Escola Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, paraobtenção do título de Doutor em Agronomia, Área deConcentração: Genética e Melhoramento de Plantas.
P I R A C I C A B AEstado de São Paulo – Brasil
Fevereiro - 2004
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Conte, Rudimar Estrutura genética de populações de Euterpe edulis Mart. submetidas à ação
antrópica utilizando marcadores alozímicos e microssatélites / Rudimar Conte. - - Piracicaba, 2004.
124 p. : il.
Tese (doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2004. Bibliografia.
1. Deriva genética 2. Endogamia 3. Exploração florestal 4. Marcador molecular 5.Melhoramento genético vegetal 6. Palmito (extração) 7. Populações vegetais 8. Seleção natural 9. Variação genética I. Título
CDD 634.6
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
À minha esposa Lourdes BernardeteAos nossos filhos que virão
Aos nossos pais e irmãos
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram nodesenvolvimento deste trabalho. Em especial:
Ao Prof. Dr. Roland Vencovsky, pela orientação, amizade e, sobretudo, pelahumildade no repasse de seus conhecimentos;
Ao Prof. Dr. Maurício Sedrez dos Reis, pela co-orientação, amizade e apoiofinanceiro na geração dos dados deste trabalho;
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas,ESALQ/USP, pela oportunidade deste aperfeiçoamento;
Ao Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal,CCA/UFSC, pela infraestrutura concedida ao desenvolvimento deste trabalho;
À CAPES, pela concessão da bolsa de doutorado;Aos colegas do Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Juliano, Diogo,
Ricardo, Cristiano, Ângelo, Marcelo e Camila, pela ajuda nos trabalhos de campo;Aos estimados colegas da Esalq, Bira, Farias, Vanderlei, Rodrigo, Fernando,
Fred, Fábia, Eulália, Adalgisa, Clideana, Karina, Dyeme, Branco, Michel, Adriano,Ebert, Éder e Paulo pela grande amizade e convívio ao longo deste período;
Aos demais colegas de pós-graduação, professores e funcionários doDepartamento de Genética, pelos ensinamentos, convívio e amizade;
À minha esposa, Lourdes Bernardete, pelo apoio e paciência com a minhadisciplina no desenvolvimento deste trabalho;
Aos meus pais, Ricardo e Amélia, e irmãos, pelo apoio durante toda minhaformação pessoal e profissional;
Às demais pessoas que, de alguma forma, contribuíram neste trabalho.
SUMÁRIOPágina
RESUMO......................................................................................................... viSUMMARY..................................................................................................... viii1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 12 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................... 52.1 Características da espécie.......................................................................... 52.2 Exploração e manejo sustentável de Euterpe edulis.................................. 82.3 Sistema de reprodução em espécies vegetais............................................ 112.4 Variabilidade e estrutura genética de populações..................................... 142.5 Tamanho efetivo populacional, deriva e endogamia................................. 202.6 Marcadores genéticos................................................................................ 252.6.1 Marcadores alozímicos........................................................................... 272.6.2 Marcadores microssatélites..................................................................... 313 EFEITOS DO MANEJO NA ESTRUTURA GENÉTICA DEPOPULAÇÕES DE Euterpe edulis MART., COM BASE NAVARIABILIDADE DE LOCOS MICROSSATÉLITES................................ 35Resumo............................................................................................................ 35Summary.......................................................................................................... 363.1 Introdução.................................................................................................. 373.2 Material e métodos.................................................................................... 393.2.1 Populações, amostragem e extração de DNA......................................... 393.2.2 Amplificação dos locos SSR.................................................................. 423.2.3 Análise estatística................................................................................... 433.3 Resultados................................................................................................. 443.3.1 Variabilidade genética intrapopulacional............................................... 443.3.2 Estrutura genética................................................................................... 483.4 Discussão................................................................................................... 51
v
3.5 Conclusões................................................................................................. 564 ESTRUTURA GENÉTICA E SISTEMA REPRODUTIVO DEPOPULAÇÕES DE Euterpe edulis MART. AVALIADOS COMMARCADORES MICROSSATÉLITES E ISOENZIMAS............................ 58Resumo............................................................................................................ 58Summary.......................................................................................................... 594.1 Introdução.................................................................................................. 604.2 Material e métodos.................................................................................... 634.2.1 Populações e sistema de amostragem..................................................... 634.2.2 Eletroforese de isoenzimas e amplificação dos locos microssatélites.... 644.2.3 Análise estatística................................................................................... 654.3 Resultados.................................................................................................. 674.3.1 Polimorfismo de marcadores.................................................................. 674.3.2 Variabilidade genética intrapopulacional............................................... 684.3.3 Estrutura genética................................................................................... 714.3.4 Sistema reprodutivo................................................................................ 734.4 Discussão................................................................................................... 774.5 Conclusões................................................................................................. 825 TAMANHO EFETIVO EM POPULAÇÕES DE Euterpe edulisMART.: CONSEQÜÊNCIAS DO MANEJO................................................. 84Resumo............................................................................................................ 84Summary.......................................................................................................... 855.1 Introdução.................................................................................................. 865.2 Material e métodos.................................................................................... 885.2.1 Locais de estudo e sistema de amostragem............................................ 885.2.2 Análise genética...................................................................................... 895.2.3 Análise estatística................................................................................... 905.3 Resultados.................................................................................................. 915.3.1 Polimorfismos e níveis de endogamia nas populações........................... 915.3.2 Tamanho efetivo populacional............................................................... 925.4 Discussão................................................................................................... 955.5 Conclusões................................................................................................. 986 CONCLUSÕES GERAIS............................................................................. 99REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 101
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Euterpe edulis MART.
SUBMETIDAS À AÇÃO ANTRÓPICA UTILIZANDO MARCADORES
ALOZÍMICOS E MICROSSATÉLITES
Autor: RUDIMAR CONTE
Orientador: Prof. Dr. ROLAND VENCOVSKY
RESUMO
O palmiteiro (Euterpe edulis Mart.) é uma espécie nativa da Mata Atlântica
cujas populações naturais encontram-se degradadas pelo extrativismo. Considerando a
escassez de informações relativas às conseqüências genéticas da exploração de palmito,
o objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do processo de exploração sobre os níveis
de diversidade, estrutura genética e tamanho efetivo de populações da espécie. Também
foram estudados aspectos genéticos do recrutamento de plantas e o sistema reprodutivo
da espécie. O estudo foi realizado em duas localidades do Estado de Santa Catarina, nos
municípios de São Pedro de Alcântara e Ibirama. Em cada localidade foram escolhidas
duas áreas de ocorrência natural de E. edulis, uma sem influência antrópica e outra que
sofreu exploração de palmito, totalizando quatro populações. Os sistemas de exploração
foram: (i) extrativismo - onde todos os indivíduos acima de 2 m de altura são cortados,
incluindo plantas reprodutivas; and (ii) manejo - onde somente indivíduos acima de 9 cm
de DAP são cortados, com a manutenção de 50 plantas reprodutivas por hectare. Em
cada população foram examinadas plântulas, jovens e adultos, usando oito locos
microssatélites e dez locos alozímicos. Os resultados revelaram que a espécie sereproduz por alogamia ( mt = 0,996 para microssatélites e mt = 1,000 para isoenzimas),
porém a ocorrência de cruzamentos entre indivíduos aparentados (até 5%) e cruzamentos
biparentais (10%) indica a ocorrência de cruzamentos não aleatórios. Em locos
alozímicos, observaram-se as seguintes amplitudes de variação das estimativas de
vii
diversidade entre as categorias: A : 3,05 a 3,15; eH : 0,416 a 0,431; oH : 0,378 a 0,403.
Em locos microssatélites, a variação observada foi a seguinte: A : 14,12 a 14,72; eH :
0,781 a 0,785; oH : 0,678 a 0,709. Nas populações não exploradas, houve um aumento
na freqüência de heterozigotos na direção do estádio adulto, o que sugere a ação da
seleção favorecendo o aumento de heterozigotos. Valores altos e significativos do índicede fixação ( f ) foram observados, especialmente nos marcadores microssatélites,
indicando desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. De modo geral, ambos osmarcadores revelaram um aumento dos valores de f nas populações exploradas,especialmente entre as plântulas. As estimativas STG e STR não revelaram alterações na
estrutura genética das populações exploradas e demostraram uma divergência genética
inferior a 5% na maioria das comparações aos pares, em ambos os marcadores. Otamanho efetivo ( eN ) dos indivíduos adultos por hectare foi superior a 110 nas
populações não pertubadas, enquanto nas populações exploradas, o tamanho efetivo por
hectare foi reduzido para 45, sob manejo, e 14, sob extrativismo. Porém, o tamanho
efetivo total das populações exploradas ainda é elevado, o que explica a manutenção dos
altos níveis de diversidade nessas populações. Finalmente, a informação genética
conjunta desses marcadores demonstrou que os efeitos da exploração foram pouco
pronunciados até o momento em relação aos níveis de diversidade e estrutura genética
das populações de E. edulis. Entretanto, a redução da população de cruzamentos resultou
em alterações no comportamento reprodutivo dos indivíduos, promovendo um aumento
nos níveis de endogamia nas coortes mais jovens das populações exploradas. Contudo,
os resultados obtidos neste estudo indicaram questões adicionais a serem estudadas. Em
função do elevado nível de variabilidade dos locos microssatélites observado em E.
edulis, recomenda-se aumentar o tamanho das amostras visando otimizar a informação
genética proporcionada por esses marcadores. Além disso, novos estudos são
necessários sobre os efeitos do manejo tecnificado, uma vez que os resultados obtidos
podem ter sido influenciados por outros eventos de exploração ocorridos no passado e
pelas populações existentes nas proximidades devido ao elevado fluxo gênico da
espécie.
GENETIC STRUCTURE OF Euterpe edulis MART. POPULATIONS
SUBMITTED TO HUMAN EXPLOITATION USING ALLOZYMIC AND
MICROSATELLITE MARKERS
Author: RUDIMAR CONTE
Adviser: Prof. Dr. ROLAND VENCOVSKY
SUMMARY
Heart-of-palm tree (Euterpe edulis Mart.; Arecaceae) is a native species of the
Atlantic forest whose natural populations are degraded by extractivism. Regarding the
relative scarcity of information on the genetic consequences of palm heart exploitation,
the aim of this study was to investigate the effects of two exploitation systems -
extractivism and management - on the levels of variability, genetic structure and
effective size of Euterpe edulis Mart. populations. We also investigated genetic aspects
of the plant recruitment and the reproductive system of the species. Four natural
populations of E. edulis with different histories of disturbance were surveyed in the
districts of São Pedro de Alcântara and Ibirama, Santa Catarina, Brazil. At both sites, we
sampled an undisturbed and an exploited population. The exploitation systems were: (i)
extractivism - where most individuals higher than 2 m are harvested, including
reproductive plants; and (ii) management - where only individuals with more than 9 cm
of DBH are harvested, with the maintainance of 50 reproductive plants per ha. Three
categories of plants, from seedlings to adults, were examined using eight microsatellite
loci and ten allozyme loci. Results demonstrated the preferentially allogamic behaviour
of the species ( mt = 0.996 for microsatellites and mt = 1.000 for allozymes), but the
occurrence of matings among related individuals (5%) and biparental matings (10%)
indicated the existence of non-random matings in this species. For allozymic loci, the
ix
following diversity estimates were obtained among the categories: A : 3.05 to 3.15; eH :
0.416 to 0.431; oH : 0.378 to 0.403. For microsatellites, the estimates were as follows:
A : 14.12 to 14.72; eH : 0.781 to 0.785; oH : 0.678 to 0.709. In undisturbed populations,
there was an increase in heterozygote frequency towards the adult stages, suggesting the
action of natural selection favouring such heterozygote increase. Highly significant
values of fixation index ( f ) were observed, mainly at microsatellite loci, indicating
departures from Hardy-Weinberg expectation. Both markers displayed an increase of f
values in the exploited populations, especially for seedlings. The estimates of
interpopulation genetic variation ( STG ; STR ) revealed that more than 95% of the
molecular genetic variability of the species is distributed within populations, and there
was no evidence of changes in genetic structure of the exploited populations. Effective
size ( eN ) per hectare of the adult individuals was higher than 110 in the two undisturbed
populations, while in the exploited populations the effective size per hectare was
reduced to 45 under management, and 14 under extractivism. However, the total
effective size of the exploited populations was still high, which explains the maintenance
of high diversity levels in these populations. Finally, the genetic information from both
markers displayed small pronounced effects of the exploitation process on variability
and population genetic structure of E. edulis, with the exception of an increase in the
inbreeding levels among seedlings and juveniles of the exploited populations. However,
our results raised further questions for study. Because of the hypervariability of
microssatellite loci used in this work, we would recommend an increase in the sample
size (>100) in order to optimize the genetic information provided by these markers.
Moreover, new investigations are necessary on the effects of management, since the
results from this study could have been influenced by other exploitation events that have
occurred in the past and by the existence, due to the high gene flow of the species, of
surrounding undisturbed populations.
1 INTRODUÇÃO
O palmiteiro (Euterpe edulis Mart.) é uma palmeira nativa do Domínio da
Floresta Tropical Atlântica do Brasil. Considerando as principais referências (Klein,
1974; Pedrosa Macedo, 1973; Carvalho, 1993 e Reis et al., 2000a), sua área de
ocorrência se estende desde o Sul da Bahia (15° S) até o Norte do Rio Grande do Sul
(30° S) no litoral, adentrando, no Sul, até o Leste do Paraguai e Norte da Argentina (57°
W).
O palmito proveniente desta espécie, também conhecido por ençarova, juçara
ou içara, é um dos mais importantes produtos não madeiráveis explorados na Floresta
Atlântica. Originalmente o palmiteiro era extraído num processo com retorno a cada área
no médio ou longo prazo. Mas a pressão da produção industrial de palmito introduziu a
extração intensiva e em larga escala. A abundância de palmiteiros no subbosque da Mata
Atlântica, a forte demanda pelo produto, e a facilidade inicial da exploração e
processamento ofereceram suporte para a rápida proliferação de fábricas de palmito em
conserva, com conseqüente intensificação da exploração (Reis & Guerra, 1998).
Essa superexploração do palmiteiro, denunciada desde muito cedo,
comprometeu a sua regeneração natural a ponto de eliminar a espécie em vastas áreas do
Domínio da Mata Atlântica (Klein, 1974; Nodari & Guerra, 1986 e Batista et al., 2000).
Este fato, aliado ao processo de exploração madeireira e expansão das áreas agrícolas,
promoveu alterações significativas nas populações naturais desta espécie. Conforme
Reis et al. (2000a) a disponibilidade atual do palmiteiro no Brasil está restrita à
formação Ombrófila Densa, especialmente nas encostas da Serra do Mar, em reservas
(áreas privadas ou Unidades de Conservação públicas e privadas) localizadas nas regiões
de mais difícil acesso.
2
As potencialidades e possibilidades de manejo sustentável para o palmiteiro têm
sido bastante estudadas pelo Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais (NPFT) da
Universidade Federal de Santa Catarina (Nodari et al., 1987; Fantini et al., 1992, 1997;
Reis et al., 1989, 1994, 1998, 1999 e 2000c). Apesar dos aspectos biológicos,
tecnológicos e econômicos da realização de manejo sustentável de populações da
espécie estarem bem fundamentados, outros aspectos como a legislação, o fator preço e
a cultura do extrativismo ainda se mostram como entraves, (Reis, 2001). A produção
clandestina de palmito, que inclui a exploração excessiva e o roubo, e o seu posterior
processamento e comercialização ilegais, impõem fortes restrições à adoção de práticas
de manejo, colocando em risco os atuais remanescentes da espécie (Fantini et al., 2000).
A necessidade de conservação, manejo e recuperação de populações degradadas
requer uma abordagem que envolva não somente os aspectos demográficos e ecológicos,
mas também a genética de populações. O enfoque genético, através da caracterização da
estrutura genética e do tamanho efetivo, em populações com diferentes níveis de
intervenção antrópica, constitui uma ferramenta adequada para ser utilizada neste tipo de
estudo (Kageyama, 1987; Moran et al., 1989; Hall et al., 1996 e Nason et al., 1997).
Nas últimas décadas vêm-se intensificando os estudos genéticos em populações
de espécies arbóreas de florestas tropicais, com amostragens adequadas tanto de
populações como dentro das mesmas, além do uso de tecnologias genéticas adequadas
para quantificar essa diversidade. Esse acúmulo de dados vem apontando algumas
direções importantes para se tomar como referência para as ações de minimização dos
impactos ambientais nesses ecossistemas. Estudos genético-ecológicos em espécies
representativas, tanto em florestas não perturbadas como em matas secundárias, vêm
mostrando o efeito das ações antrópicas em suas populações, auxiliando na definição dos
parâmetros genéticos mais adequados para orientar e monitorar as ações nesses
ecossistemas (Kageyama et al., 1998).
Neste aspecto, os marcadores genéticos têm sido ferramentas bastante
adequadas no monitoramento e avaliação das conseqüências genéticas da exploração
florestal (Young et al., 1993; Ballal et al., 1994; Young & Merriam, 1994; Murawski et
al., 1994; Hall et al., 1996; Nason et al., 1997; Nason & Hamrick, 1997; Aldrich et al.,
3
1998; Dayanandan et al., 1999; Sebbenn et al., 2000 e Collevatti et al., 2001a,b). Na
grande maioria desses trabalhos os marcadores empregados têm apontado perdas de
diversidade, aumento nos níveis de endogamia e alterações na estrutura genética das
populações exploradas.
Entre os diversos marcadores genéticos existentes, os marcadores alozímicos e
microssatélites possuem um mecanismo de herança mendeliana e apresentam expressão
codominante, o que permite identificar os genótipos heterozigóticos e homozigóticos dos
indivíduos analisados e constitui, em geral, na informação necessária para a estimativa
dos diversos parâmetros genéticos de interesse (Ferreira & Grattapaglia, 1998;
Grattapaglia, 2001 e Souza, 2001). A diferença mais importante entre as duas categorias
de marcadores refere-se aos seus respectivos níveis de polimorfismo. Os marcadores
microssatélites são muito mais polimórficos do que as isoenzimas em populações
naturais, com mais alelos, e heterozigosidades geralmente superiores a 0,5 (Estoup et al.,
1998). Em populações naturais, alguns estudos relataram resultados divergentes nas
comparações desses marcadores, embora os microssatélites tenham sido apontados como
mais informativos na estimação de parâmetros genéticos populacionais (Streiff et al.,
1998; Estoup et al., 1998 e Gao et al., 2002).
Neste contexto e, considerando a escassez de informações relativas às
conseqüências genéticas da exploração de palmito em populações naturais de Euterpe
edulis Mart., este trabalho teve como principais objetivos:
1. Quantificar os níveis de variabilidade genética em populações naturais da espécie
com diferentes níveis de ação antrópica, empregando marcadores alozímicos e
microssatélites;
2. Avaliar o impacto do processo de exploração (extrativismo x manejo) da espécie em
relação à variabilidade, estrutura genética e tamanho efetivo populacional;
3. Comparar a informação genética gerada pelos marcadores alozímicos e
microssatélites na estimação de parâmetros genéticos populacionais da espécie;
E, em uma outra perspectiva:
4
4. Determinar o sistema de cruzamento em populações naturais da espécie, com base
em marcadores alozímicos e microssatélites;
5. Avaliar a existência de seleção que leve a aumento de heterozigotos no recrutamento
de plantas.
O estudo teve como base as seguintes hipóteses:
1. O processo de exploração florestal promove redução na variação genética, aumento
nos níveis de endogamia e conseqüente alteração na estrutura genética das
populações naturais da espécie;
2. Os marcadores microssatélites, devido ao seu alto nível de polimorfismo, são mais
informativos para estimação de parâmetros genéticos populacionais em relação aos
marcadores alozímicos;
3. Em determinados locos alozímicos, o processo de recrutamento resulta em um
aumento na freqüência de heterozigotos na direção dos indivíduos adultos, portanto,
os marcadores alozímicos são capazes de detectar efeitos de seleção.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Características da espécie
Euterpe edulis Mart. (Palmiteiro) é uma palmeira nativa da Mata Atlântica, cujo
porte adulto geralmente varia entre 10 e 20 m de altura, com estipe de 8 a 15 cm de DAP
e apresentando no ápice um agrupamento de 10 a 20 folhas pinadas (Reitz et al., 1978).
Seu principal habitat é a Floresta Ombrófila Densa da Encosta Atlântica, da Bahia ao
Rio Grande do Sul, onde é uma das espécies mais abundantes do estrato médio (Reis et
al., 1996; Henderson, 2000 e Reis et al., 2000a). Além disso, ela é considerada uma
espécie de sombra, necessitando desta condição para o seu desenvolvimento inicial
(Reitz et al., 1978 e Klein, 1980).
A demografia de populações naturais de E. edulis foi estudada tanto em estádio
de clímax (Nodari et al., 1987; Reis et al., 1991 e Reis et al., 1996) quanto em estádio
secundário de sucessão florestal (Reis et al., 1999; Conte et al., 2003). As populações
naturais apresentam uma estrutura demográfica em forma de pirâmide, com uma base
bastante ampla, constituída por indivíduos jovens (10.000 a 15.000 por hectare) e, no
topo, a existência de uma pequena proporção de indivíduos reprodutivos (50 a 150 por
hectare). Essa pequena proporção de indivíduos adultos é responsável pela manutenção
da estrutura demográfica, bem como da diversidade e estrutura genética das populações
da espécie. A estratégia reprodutiva típica da espécie envolve a manutenção de um
grande banco de plântulas, com média de 12.000 plântulas por hectare (Reis et al.,
1996).
A espécie é monóica, com flores unisexuadas (reunidas em tríades, sendo duas
flores masculinas e uma feminina), distribuídas em inflorescências do tipo panícula. A
6
inflorescência apresenta uma acentuada protandria, onde as flores masculinas
permanecem abertas por aproximadamente sete dias, e após um período de dois a quatro
dias, as flores femininas abrem e permanecem abertas por sete dias (Mantovani &
Morellato, 2000). Esse padrão de florescimento assegura a alogamia para a espécie,
exceto nos casos quando duas ou mais inflorescências são produzidas na mesma planta.
Tal evento ocorre em 6,4% das plantas reprodutivas (Reis et al., 1993), quando flores
masculinas e femininas estão abertas ao mesmo tempo.
Uma grande variedade de insetos visita as inflorescências de E. edulis durante o
seu período de florescimento (Reis et al., 1993 e Mantovani & Morellato, 2000), atraídos
por uma abundante produção de pólen, néctar e outras partes da inflorescência. A
espécie mais abundante observada em flores de palmiteiro tem sido a pequena abelha
Trigona spinipes, a qual parece ser uma importante polinizadora desta palmeira (Reis et
al., 2000d).
A produção de frutos é bastante elevada (mais de 300.000 frutos.ha-1.ano-1),
servindo de alimento para a fauna (grandes pássaros e mamíferos) durante um período
de aproximadamente 6 meses ao ano (Reis, 1995; Mantovani & Morellato, 2000). Essa
fauna, por sua vez, é responsável pela dispersão dos frutos, implicando numa
contribuição imprescindível para manutenção da dinâmica demográfica e do fluxo
gênico da espécie (Reis & Kageyama, 2000).
Conte et al. (2000b), apontam que a mortalidade dos indivíduos de Euterpe
edulis é superior a 80%, sendo que a maior parte dessa mortalidade ocorre antes que as
plantas atinjam 10 cm de altura de inserção da folha mais jovem. Além disso, o
crescimento dos indivíduos nos primeiros estádios de desenvolvimento é lento, embora
alguns apresentem uma taxa de crescimento mais acentuada. Entretanto, a elevada
produção anual de frutos (Reis, 1995; Mantovani & Morellato, 2000) garante a
manutenção de um banco de plântulas e o conseqüente recrutamento das plantas na
direção dos estádios adultos.
Alguns estudos mostraram que o processo de recrutamento de E. edulis também
está relacionado com aspectos genéticos das plantas. As primeiras evidências foram
apontadas por Reis (1996a), empregando marcadores alozímicos, quando diferentes
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populações naturais do palmiteiro mostraram um excesso de heterozigotos na fase
adulta, o qual não foi observado nas progênies. Evidências adicionais foram encontradas
quando amostras recrutadas de coortes com idades conhecidas exibiram maiores níveis
de heterozigosidade em relação a amostras não recrutadas (Reis et al., 1998). Mais
recentemente, essas evidências foram confirmadas por Conte et al. (2003), através do
estudo de diferentes fases do ciclo de vida, acompanhadas durante um período de dez
anos. Esses estudos revelaram que o aumento nos níveis de heterozigosidade está
concentrado na passagem da fase de plântulas para as demais, sendo este comportamento
relacionado à alta taxa de mortalidade encontrada na primeira categoria. Além disso,
houve um aumento linear na frequência de certos alelos na direção dos indivíduos
adultos, indicando que o processo de recrutamento também está ligado à sobrevivência
diferencial de indivíduos que são portadores desses alelos.
Estudos referentes ao sistema reprodutivo, fluxo gênico, variabilidade e estrutura
genética, foram realizados em diferentes populações naturais do palmiteiro. A taxa de
cruzamento (tm; Ritland & Jain, 1981) estimada com marcadores alozímicos (Reis et al.,
1998) e microssatélites (Gaiotto et al. (2003) apresentou valores próximos de 1,00,
confirmando a alogamia predominante da espécie conforme sugerido previamente por
Reis et al. (1993). As estimativas de fluxo gênico (Nm), em média, foram de 3,37 em
locos microssatélites (Gaiotto et al., 2003) e 10,7 em locos alozímicos (Reis, 1996a), o
que caracteriza uma acentuada movimentação de alelos entre as populações da espécie.
Reis et al. (1998, 2000e) encontraram níveis elevados de diversidade gênica, utilizando
locos alozímicos polimórficos, tanto a partir das progênies ( eH = 0,436), quanto a partir
de indivíduos adultos ( eH = 0,452). Valores similares de diversidade foram encontrados
por Conte et al. (2003), variando de 0,415 a 0,452 para progênies e adultos,
respectivamente. Com locos microssatélites, Gaiotto et al. (2003) encontraram valores
ainda mais elevados de diversidade gênica ( eH = 0,749). Todos esses trabalhos
mostraram reduzidos níveis de divergência genética entre populações, o que está de
acordo com as características reprodutivas e com a elevada taxa de fluxo gênico da
espécie. Além disso, estimativas de tamanho de vizinhança obtidas por Reis (1996a) em
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média foram de 67 indivíduos, com cada deme panmítica ocupando uma área de 13.000
m2, ou seja, os grupos parentais que trocam genes são compostos por aproximadamente
67 indivíduos.
A avaliação de características de desenvolvimento em ensaios de procedência e
progênies, com seis anos de avaliação, revelou herdabilidades reduzidas para todas as
situações analisadas (Nodari et al., 1993). A avaliação dos ganhos esperados com
seleção precoce foi realizada, por Bovi & Godoy Jr. (1991), a partir do acompanhamento
de 177 indivíduos por 10 anos. Os resultados desse trabalho indicaram que o número de
folhas e o diâmetro do caule são as características de maior relação com a produção e
apresentam estimativas expressivas de ganho por seleção a partir do terceiro ano.
Outros trabalhos que procuraram caracterizar as relações entre diversas
características das plantas e o rendimento, visando seleção indireta e/ou manejo e
comercialização da espécie, indicaram que as maiores associações com o rendimento
referem-se ao diâmetro das plantas, o número de folhas e as variáveis relativas à cabeça
do palmito (Reis et al., 1987; Bovi et al., 1991; Fantini et al., 1992 e Fantini et al., 1997).
2.2 Exploração e Manejo Sustentável de Euterpe edulis
O produto comercial obtido desta espécie, o palmito, é um dos mais importantes
recursos não madeiráveis explorados na Floresta Atlântica. A exploração comercial de
palmito representa uma importante fonte de renda suplementar por parte dos
proprietários de florestas, especialmente os pequenos proprietários (Bovi et al., 1987;
Nodari et al., 1987; Pereira, 1994; Reis et al., 1996; Reis et al., 1998, Conte et al., 2000a
e Reis et al., 2000b). Embora um sistema de manejo sustentável para a espécie tenha
sido proposto (Reis et al., 1992; Ribeiro et al., 1994; Reis et al., 1998; Reis et al., 2000b
e Reis et al., 2000d), a opção pelo retorno econômico imediato prevalece, e E. edulis tem
sido alvo de uma intensiva exploração predatória, tanto em áreas públicas quanto
privadas.
9
No sistema de exploração tradicional (extrativismo) todos os indivíduos
maiores de 2 m de altura são cortados, incluindo plantas reprodutivas. Em alguns casos,
somente os indivíduos mais produtivos, com DAP acima de 8 cm, são explorados, o que
inclui todos os indivíduos reprodutivos. De acordo com Reis et al. (1998), esse sistema
implica em uma expressiva erosão genética das populações e um colapso do sistema de
exploração. O declínio na densidade das populações dentro de áreas exploradas tem sido
observado em muitas regiões (Guerra et al., 1984) e, em casos extremos, a espécie tem
sido localmente eliminada (Batista et al., 2000).
Apesar do caráter predatório da exploração contribuir para a degradação da
Floresta Tropical Atlântica, E. edulis apresenta um grande potencial para utilização
como modelo para manejo de suas populações naturais de forma sustentável. Conforme
Reis et al. (2000d), a espécie apresenta algumas características favoráveis, a saber: (1) o
palmito é um produto de valor em um mercado bem estabelecido; (2) os ciclos de corte
são curtos em relação aos ciclos de espécies madeiráveis, contribuindo para o sucesso
econômico do seu manejo; (3) a alta densidade e a curva em J invertido em suas
populações naturais (Reis et al., 1996), permite a colheita periódica e a contínua
substituição das plantas extraídas em cada ciclo, desde que um certo número de matrizes
seja mantido na floresta; e (4) é uma espécie de sub-bosque tolerante à sombra,
requerendo a presença do ambiente florestal para o sucesso da regeneração e
crescimento inicial. Além disso, E. edulis é um importante recurso no ecossistema,
suprindo uma abundante quantidade de frutos durante um período de aproximadamente
seis meses ao ano (Reis, 1995).
O sistema de manejo proposto para E. edulis é baseado na autoecologia da
espécie (Fantini et al., 1992). O sistema propõe a retirada de um certo número de
indivíduos em cada ciclo de corte e sua substituição por indivíduos jovens, sendo esta
substituição promovida pelo próprio dinamismo da espécie. Neste modelo, é necessário
que a regeneração natural assegure a reposição dos indivíduos extraídos e haja um
contínuo suprimento de propágulos, o qual é dependente da permanência de um certo
número de indivíduos reprodutivos nas áreas sob manejo. Logo, a manutenção do
dinamismo demográfico da espécie é importante para a manutenção das expectativas de
10
rendimento em cada ciclo. Além disso, o nível de variabilidade genética das plantas
reprodutivas remanescentes do manejo é importante para assegurar a continuidade da
regeneração que depende também das possibilidades de ocorrência de recombinantes nas
próximas gerações.
A estimativa de tamanho de vizinhança obtida por Reis (1996a), é um índice
particularmente importante para a implementação de estratégias de manejo.
Considerando que as demes panmíticas são compostas por 67 indivíduos, ocupando uma
área de aproximadamente 13.000 m2, significa a necessidade de manutenção de 50 a 60
indivíduos reprodutivos por hectare de maneira a garantir os níveis de diversidade e
estrutura genética existentes.
Os conhecimentos científicos gerados nos últimos anos resultaram em uma
tecnologia de manejo para populações naturais de E. edulis (Reis et al., 1998). Essa
tecnologia de manejo foi incorporada em regulamentações oficiais e normas para
exploração de populações naturais da espécie nos Estados do Rio Grande do Sul, Santa
Catarina e São Paulo. Entre os critérios mínimos destacam-se: 1) a permanência de pelos
menos 50 indivíduos reprodutivos por hectare; 2) diâmetro limite de corte de 9 cm,
medido a 1,3 m do solo (DAP); e 3) a existência de um número mínimo de indivíduos
regenerantes menores de 1,3 m de estipe exposta, variando entre 5.000 e 10.000 plantas
por hectare, de acordo com as normas vigentes em cada Estado.
Algumas estimativas de rendimento de palmito foram realizadas com base na
correlação entre o diâmetro (DAP) das plantas e o rendimento em creme de palmito
(Fantini et al., 1992). A produtividade dos palmitais é muito variável, uma vez que está
relacionada com o estoque de indivíduos e o estádio de sucessão da floresta em que
ocorrem. Em uma área de Floresta Ombrófila Densa Montana (Blumenau, SC), de
formação primária, obteve-se uma estimativa de rendimento de 161 kg por hectare
(Nodari et al., 1987). Em uma floresta secundária em São Pedro de Alcântara, SC,
obteve-se uma estimativa de rendimento de 86,3 kg por hectare (Reis et al., 1999). Por
outro lado, em uma floresta secundária no município de Ibirama, SC, a estimativa de
rendimento foi de 147 kg por hectare (Conte et al., 2000a), o que, inclusive, demonstra o
potencial de rendimento da espécie sob manejo.
11
2.3 Sistema de Reprodução em Espécies Vegetais
O modo de reprodução de uma espécie de planta determina como a informação
genética é transferida de uma geração para a outra (Wright, 1921), e implica na forma
como a variabilidade genética se organiza no espaço e no tempo (Robinson, 1998). Em
vista disso, e considerando que a efetivação de programas de conservação e
melhoramento genético depende do conhecimento da estrutura genética das populações
é importante obter-se informações acuradas do sistema de reprodução (Sebbenn, 2001).
O sistema de reprodução das espécies arbóreas pode ser caracterizado
basicamente por dois modelos: o modelo aleatório e o modelo misto de reprodução
(Sebbenn, 2001). No entanto, existem outros modelos como o de autofecundação efetiva
e o de cruzamentos biparentais (Schoen & Clegg, 1984), porém, de menor aplicação em
essências florestais.
O modelo de cruzamentos aleatórios é o modelo do Equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Este modelo é o mais comum e abstrai o problema essencial da transmissão
das informações genéticas em populações, ou como a distribuição das freqüências
gênicas surge de uma geração para outra. Seu grande valor no estudo de populações é
que a pressuposição de cruzamentos aleatórios serve como padrão de referência,
permitindo a comparação com os cruzamentos observados (Clegg, 1980).
No modelo de reprodução mista, a taxa de cruzamento t pode ser estimada por
dois métodos: o primeiro baseado no Equilíbrio de Endogamia de Wright - EEW (Jain,
1979; Vencovsky, 1994 e Weir, 1996) e o segundo, baseado nos genótipos multilocos
observados em progênies de mães conhecidas (Brown & Allard, 1970 e Ritland & Jain,
1981). No primeiro método, as estimativas das taxas de cruzamento são obtidas a partir
da relação dada por Wright (1921),
( ) ( )fft ˆ1ˆ1ˆ +−=
12
sendo f a estimativa da endogamia existente ao nível de indivíduo. A pressuposição de
EEW garante que toda endogamia observada pode ser atribuída ao sistema de
reprodução, ou seja, autofecundação e cruzamento entre aparentados.
Contudo, o emprego de modelos multilocos permite a obtenção de estimativas
mais adequadas da taxa de cruzamento, pois levam em consideração as combinações
genotípicas envolvendo todos os locos. O modelo proposto por Ritland & Jain (1981)
vem sendo o mais empregado nos trabalhos recentes. As estimativas são obtidas por
máxima verossimilhança, e admite que as populações se reproduzem por autofencudação
a uma taxa s e por cruzamentos aleatórios a uma taxa t. As pressuposições básicas para
sua aplicação são: (i) que o conjunto de pólen é homogêneo para os cruzamentos com
todos os genótipos maternos; (ii) que os alelos de diferentes locos segregam
independentemente; e (iii) que os locos não são afetados pela seleção ou mutação entre o
evento reprodutivo e a análise (Ritland & Jain, 1981 e Ritland, 1990). No entanto,
segundo Ritland & Jain (1981), violações da pressuposição de homogeneidade das
freqüências alélicas dos óvulos e do pólen têm pouco efeito sobre a estimativa da taxa de
cruzamento multilocos da população (tm) quando o número de locos empregados nas
estimativas for superior a quatro ou cinco locos.
O programa MLTR desenvolvido por Ritland (1990), baseado no modelo de
cruzamento misto de Ritland & Jain (1981), fornece estimativas dos seguintes
parâmetros: 1) a taxa de cruzamento multilocos da população (tm); 2) a taxa de
cruzamento média unilocos da população (ts); 3) a taxa de cruzamento entre aparentados
(tm - ts); 4) o coeficiente de endogamia dos genótipos maternos (f); 5) a freqüência gênica
do pólen (p) e dos óvulos (o); 6) a correlação da taxa de cruzamento dentro de progênies
ou a variação de t entre as plantas-mãe (rt) e; 7) a correlação de paternidade de
cruzamento entre dois irmãos, ou a proporção de irmãos completos entre irmãos de
cruzamento dentro das progênies (rp).
A diferença entre a média das estimativas de t feita com base na média unilocos
da população (ts) e a estimativa feita a partir dos vários locos (tm) indica a presença de
estrutura interna na população. Essa estrutura se deve aos cruzamentos não ao acaso e
não afeta cada loco da mesma forma. Os cruzamentos não ao acaso se devem à formação
13
de vizinhanças genéticas e à heterogeneidade nas freqüências alélicas no pólen durante o
período de florescimento (resultantes da defasagem no florescimento ou das diferenças
em fecundidade entre as plantas). Os valores de st obtidos representam estimativas
independentes do valor de t . Para isso, os locos utilizados como marcadores precisam
segregar independentemente. A estimativa de tm baseia-se na distribuição da
probabilidade de se obterem os diferentes genótipos compostos. Como o número de
genótipos compostos possíveis é maior do que o número de genótipos formados,
tomando-se cada loco separadamente, os testes de significância para as estimativas de tm
proporcionam maior número de graus de liberdade, o que é desejável para sua maior
precisão estatística (Robinson, 1998).
Em ecossistemas tropicais, os primeiros estudos acerca da biologia reprodutiva
das árvores tropicais sugeriram que a auto-fertilização era o sistema de cruzamento
predominante, considerando a assincronia da abertura de flores entre plantas (Baker,
1959), ou a dificuldade de mobilidade dos polinizadores através da complexa estrutura
das florestas densas (Federov, 1966).
Somente após os estudos de fluxo de pólen a longas distâncias por Jansen
(1971), estudos de autoincompatibilidade e observações do comportamento dos
polinizadores (Ashton, 1969 e Bawa, 1974), seguidos de estudos com marcadores
alozímicos, levaram a descobertas de fortes barreiras à autofecundação e à conclusão de
que a maioria das espécies arbóreas tropicais se reproduzia preferencialmente por
fecundação cruzada (Bawa et al., 1985; Murawski & Hamrick, 1991 e Loveless, 1992).
Os estudos de Murawski (1995) mostraram que 90,9% das espécies arbóreas tropicais
que ocorrem no estrato superior (dossel), 75,0% das espécies do estrato intermediário e
34,2% das espécies de sub-bosque, apresentam algum mecanismo de
autoincompatibilidade. Além disso, estudos mais recentes empregando estimativas
multilocos com dados de isoenzimas e microssatélites têm revelado a preferência de
espécies tropicais pela fecundação cruzada (Alvarez-Buylla & Garay, 1994; Hall et al.,
1994; Reis, 1996a; Gandara, 1996; Souza, 1997, Seoane, 1998; Sebbenn et al., 2000;
Gaiotto et al., 2003; Collevatti et al., 2001a; Zucchi, 2002; Alves et al., 2003).
14
2.4 Variabilidade e Estrutura Genética de Populações
O estudo da variação genética em populações naturais de uma espécie envolve
basicamente duas questões: (i) quantificar os níveis de variabilidade dentro das
populações e (ii) caracterizar o nível de estruturação genética entre populações
(Hamrick, 1983).
A variabilidade genética intrapopulacional tem sido quantificada em termos de
número de alelos por loco (A), percentagem de locos polimórficos (P), heterozigosidade
observada (Ho) e esperada (He) sob equilíbrio de Hardy-Weinberg e índice de fixação (f)
(Hamrick, 1983 e Robinson, 1998).
O número de alelos por loco e a percentagem de locos polimórficos têm sido
empregados como índices de diversidade em populações naturais, no sentido de
caracterizar e comparar os níveis de variação genética nestas populações.
Weir (1996) considera a freqüência de heterozigotos como um importante
indicador da diversidade genética, uma vez que cada heterozigoto carrega alelos
diferentes e, portanto, representa melhor a variação existente. Contudo, o autor considera
que a heterozigosidade esperada, ou diversidade gênica, como proposto por Nei (1973),
uma medida mais apropriada por representar a variação tanto em populações de espécies
autógamas, como em alógamas. Além disso, o índice de fixação tem sido utilizado como
uma medida de desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg dentro de cada população.
A segunda questão, de particular importância, refere-se a maneira pela qual a
variabilidade genética é partida entre e dentro de populações, ou seja, o nível de
estruturação genética das populações. A estrutura genética refere-se à distribuição
heterogênea (não aleatória) dos alelos e genótipos no espaço e no tempo resultante da
ação de forças evolutivas, tais como: mutação, migração, seleção e deriva genética que
atuam dentro do contexto de cada espécie e população (Hamrick, 1982).
Os processos microevolutivos que promovem mudanças nas freqüências
gênicas e genotípicas podem ser divididos em duas classes: os “sistemáticos” (mutação,
seleção e migração), que tendem a mudar a freqüência gênica de uma maneira que pode
ser predita, tanto em quantidade quanto em direção, e o “dispersivo” (deriva genética),
15
que surge em pequenas populações pelos efeitos de amostragem, e pode ser predito em
quantidade, mas não em direção (Mettler & Gregg, 1973 e Mayr, 1977). Dentre estes
fatores, a migração e a mutação aumentam a variabilidade genética, enquanto que a
seleção e a deriva diminuem a variabilidade genética dentro das populações.
As populações de plantas não têm seus genótipos arranjados aleatoriamente,
mas sim estão estruturadas no espaço e no tempo. A estrutura espacial refere-se à
distribuição espacial dos indivíduos, sendo característica de cada espécie e determinada
principalmente pelo sistema de reprodução e pelos padrões de dispersão de pólen,
sementes ou outros propágulos. Já, a estrutura genética temporal refere-se à subdivisão
de gerações, por exemplo, entre pais e filhos, plântulas e jovens, jovens e adultos, ou
ainda, pode referir-se às diversas gerações contidas em um banco de sementes ou de
germoplasma (Brown, 1978; Loveless & Hamrick, 1984 e Hamrick, 1989).
A existência de estrutura espacial decorre principalmente das limitações físicas
no sentido de todos os indivíduos se cruzarem entre si, ou da ocorrência em maior
probabilidade de indivíduos próximos (Futuyma, 1992), formando demes panmíticas.
Isso produz uma tendência localizada no sentido da fixação de certos alelos (aumento da
freqüência de alguns e diminuição de outros), pois apenas uma amostra da população
estará trocando alelos ao acaso. Além disso, os efeitos de seleção irão favorecer alelos
com maior valor adaptativo local, ampliando ou reduzindo a divergência em função das
variações ambientais existentes.
A endogamia gerada por autofecundação ou o cruzamento entre aparentados
também tenderá a alterar a freqüência de certos alelos em relação ao total da população.
Assim, tanto por endogamia, deriva genética ou seleção poderá ocorrer formação de
grupos divergentes dentro das populações. No entanto, esta diferenciação pode ser
contraposta pelo fluxo gênico, conforme discutido por Wright (1931), sendo que
espécies com intenso movimento de pólen e sementes têm menor diferenciação do que
espécies com fluxo gênico restrito (Hamrick, 1989). Alguns estudos têm demonstrado
que somente uma pequena quantidade de fluxo gênico a longas distâncias é suficiente
para retardar a diferenciação da subpopulação para alelos neutros (Loveless & Hamrick,
1984 e Sork et al., 1999).
16
Desta forma, fatores como tamanho da população, modo de reprodução
(assexual, sexual), sistema de reprodução (autofecundação, cruzamento, misto), fluxo
gênico e tipos de ambientes em que a espécie ocorre, influenciam na distribuição da
variação genética entre e dentro de populações. Espera-se que espécies com grandes
populações, sistema misto de reprodução, mecanismos eficientes de dispersão de
sementes e pólen, apresentem alta variação genética dentro das populações e baixa entre.
Já, para as espécies com pequenas populações, de autofecundação e/ou reprodução
vegetativa, com limitada dispersão de pólen e sementes, espera-se uma baixa
variabilidade dentro e alta entre as populações (Loveless & Hamrick, 1984; Hamrick &
Schnabel, 1985 e Hamrick & Loveless, 1986).
A caracterização da estrutura genética entre populações, a partir de dados de
marcadores genéticos codominantes, tem sido realizada por três metodologias básicas:
(i) estatísticas F de Wright (Wright, 1965 e Nei, 1977); (ii) análise da variância de
freqüências gênicas (Cockerham, 1969; Vencovsky, 1992 e Weir, 1996); e (iii) análise
da diversidade genética em populações subdivididas (Nei, 1973, 1977, 1987). As
estatísticas F fornecem os índices de fixação de alelos para o total das populações, média
dentro e entre populações, com base em medidas de probabilidade de identidade por
descendência (Wright, 1965, Nei, 1977). A análise da variância de freqüências gênicas
fornece a distribuição da variabilidade genética em diversos níveis hierárquicos,
considerando o processo amostral nas estimativas (Cockerham, 1969). Já, a diversidade
genética de Nei fornece, a partir de uma metodologia estatística simples, a proporção da
variabilidade genética contida entre e dentro das populações e os níveis de
heterosigosidade esperados para o total e média das populações (Nei, 1973). Conforme
Reis (1996b), mesmo com bases estatísticas diferentes, as três abordagens são
complementares em relação ao significado biológico das estimativas.
As estatísticas F foram inicialmente desenvolvidas para o caso de um loco com
dois alelos (Wright, 1965). Posteriormente, Nei (1977) adaptou esta metodologia para
locos multialélicos, contrastando um alelo p contra os outros alelos (1-p), através dos
conceitos de heterosigosidade observada e esperada. Esta estatística admite que todos os
17
desvios de panmixia sejam exclusivamente devidos aos efeitos da deriva genética e do
sistema de reprodução.
Assim, conforme Wright (1965):
1 - FIT = (1 - FIS)(1 - FST)
onde,
FIT = índice de fixação ou coeficiente de endogamia para o conjunto das populações
(devido ao sistema reprodutivo e subdivisão),
FIS = índice de fixação ou coeficiente de endogamia intrapopulacional (devido ao
sistema reprodutivo),
FST = índice de fixação ou divergência genética entre populações (devido à subdivisão
populacional).
A análise de freqüências gênicas (Cockerham, 1969) foi desenvolvida baseada
na pressuposição de que as populações em estudo são oriundas de uma mesma
população ancestral, permitindo assim a estimativa do coeficiente de parentesco
(coancestralidade) e endogamia. Nesta metodologia, todos os desvios de panmixia
também são considerados devidos a deriva genética e ao sistema de reprodução.
Também neste caso, a análise de freqüências gênicas fornece os níveis de fixação
médios dentro das populações (f), do conjunto das populações (F) e a divergência
genética entre populações ou o coeficiente de parentesco entre dois indivíduos dentro de
populações (θP), parâmetros relacionados por:
f = (F - θP)/ (1 - θP)
A análise da diversidade genética em populações subdivididas foi desenvolvida
por Nei (1973), com o intuito de obter uma medida de estrutura de populações que
acomodasse locos multialélicos. Tal medida pode ser utilizada em qualquer população,
independente do número de alelos por loco, sistema de reprodução e da atuação de
forças evolutivas (seleção, migração, deriva e mutação). O grau de diferenciação entre
subpopulações é estimado, decompondo-se a heterozigosidade total (HT), referente ao
conjunto das populações, em seus componentes:
HT = HS + DST
18
em que HS corresponde à média ponderada dos valores de H calculados para
subpopulações e representa a parte atribuída à variabilidade genética dentro de
populações. DST é o componente de variabilidade atribuível à diferenciação entre
subpopulações e é calculado como DST = HT - HS. A razão entre DST e HT expressa a
proporção da variabilidade total explicada por diferenças genéticas entre as subdivisões
da população:
GST = DST /HT
Sob modelo aleatório, pode-se considerar que as populações amostradas
representam a espécie tendo história evolutiva comum. Mesmo que as populações
tenham se diferenciado com o decorrer do tempo, a análise é construída sob a hipótese
de que há uma única população de referência. A análise da diferenciação em modelos
aleatórios é subordinada ao fato de que a amostragem genética faz com que os diferentes
alelos na população sejam dependentes ou relacionados (Weir, 1996).
Assim, quando o interesse está voltado ao quanto as populações se
diferenciaram dentro de uma espécie, no decorrer do tempo, o modelo aleatório torna-se
o mais adequado, uma vez que essas populações possuem uma origem comum onde o
processo de diferenciação ocorreu ao acaso. Neste caso, o emprego das abordagens das
estatísticas F de Wright ou das medidas análogas de Cockerhan é bastante adequado na
estimação dos parâmetros de diferenciação genética das populações (Weir, 1996).
No entanto, quando as populações sofreram algum tipo de perturbação, como
no caso da ação antrópica, e que desta forma não possuem uma história evolutiva
comum, as análises devem ser elaboradas sob modelo fixo. Neste caso, a abordagem da
análise da diversidade em populações subdivididas de Nei (1973) torna-se a mais
adequada, uma vez que esta abordagem independe das pressuposições das estatísticas de
Wright e Cockerham. Além disso, sob a abordagem de populações fixas, diferentes
populações da mesma espécie são comparadas simplesmente pela comparação de
frequências ou médias (Weir, 1996).
Hamrick & Godt (1990) analisaram vários estudos com isoenzimas em plantas,
utilizando a abordagem de Nei (1973). Os resultados mostraram como valores médios:
TH = 0,31; SH = 0,23 e STG = 0,224. Como em estudos anteriores (Hamrick et al.,
19
1979 e Loveless & Hamrick, 1984), foi demonstrado que espécies perenes de ciclo
longo, com fecundação cruzada, de fase final de sucessão e polinizadas pelo vento,
apresentam maior variação dentro e menor entre populações, do que espécies com outras
combinações de categorias.
De fato, Hamrick et al. (1991), compilando informações a partir de 449 espécies,
concluíram que as espécies perenes, com ciclo de vida longo, reprodução sexuada por
fecundação cruzada predominante, distribuição geográfica ampla e típica de estádios
avançados de sucessão natural, são as que acumulam maior variabilidade genética dentro
de suas populações, com menor diferenciação entre populações.
Em espécies tropicais, os estudos realizados empregando marcadores
alozímicos têm mostrado uma alta variabilidade molecular dentro das populações e uma
reduzida divergência entre populações. Dados levantados por Sebbenn (2001),
envolvendo 16 espécies arbóreas tropicais revelaram que, em média, os valores de TH ,
SH e STG foram 0,335, 0,283 e 0,049, respectivamente. Em estudos onde foram
empregadas estimativas FST, a divergência média entre populações de espécies tropicais
foi de 0,042 (9 espécies). Outros trabalhos empregando a abordagem de Nei (1973), em
19 espécies tropicais, revelaram uma reduzida divergência ( STG = 0,075) entre
populações (Reis, 1996b). Em todos os casos, as espécies apresentavam um sistema
misto de reprodução com tendência para alogamia.
Considerando apenas os níveis de variabilidade genética molecular
intrapopulacionais, Hamrick et al. (1992), analisaram estudos com isoenzimas incluindo
655 espécies vegetais de 220 gêneros e concluíram que, em média, 51% dos locos foram
polimórficos e a diversidade gênica (He) foi de 0,15. Dentro de populações de plantas,
em média, 35% dos locos foram polimórficos e a diversidade gênica foi de 0,11. Os
mesmos autores mencionam que em geral os maiores índices foram associados a
espécies lenhosas perenes, de final de sucessão e polinizadas pelo vento, com destaque
para as gimnospermas que apresentaram os maiores valores médios.
Em espécies tropicais, Hamrick & Loveless (1986) analisaram 29 taxa da floresta
semidecídua do Panamá através de 20 sistemas enzimáticos, concluindo que as mesmas
20
apresentavam uma diversidade gênica por espécie de 0,111 (variando de 0 a 0,216),
similar à reportada para as dicotiledôneas e menor que a encontrada para as coníferas,
que de maneira geral apresentam os maiores níveis de diversidade. Para outras 38
espécies tropicais, Hamrick et al. (1992) mencionam que a diversidade gênica foi de
0,191, com 57,9% de locos polimórficos.
Reis (1996a) apresenta valores de diversidade gênica para espécies tropicais de
acordo com diferentes aspectos ecológicos. O autor menciona que os valores de eH
ficaram sempre próximos da média geral: 0,174 (29 espécies arbóreas de dossel); 0,131
(16 espécies arbóreas de sub-bosque); 0,167 (8 espécies colonizadoras); 0,136 (38
espécies comuns, exceto colonizadoras); e 0,157 (20 espécies raras).
Para espécies da Floresta Tropical atlântica, os valores de diversidade gênica em
locos alozímicos variaram de 0,085 para Araucaria angustifolia (Auler et al., 2002) até
0,351 para Cryptocaria moscata (Moraes, 1997), sendo que a média de eH para 11
espécies foi de 0,198, com 51,73% de locos polimórficos.
Por outro lado, considerando somente locos alozímicos polimórficos, Reis
(1996a) destaca que para 18 espécies tropicais o valor médio de eH foi de 0,413,
variando para espécies arbóreas, de 0,288 em Cedrela fissilis (Gandara, 1996), até 0,518
em Joanesia princeps (Herrit, 1991). Para 3 espécies de palmeiras a diversidade gênica
foi de: 0,436 para Phoenix dactylifera (Argélia / Bennacer et al., 1991); 0,375 para
Acrocomea aculeata (Brasil-Cerrado / Lopes et al., 1992); e 0,490 para Astrocarium
mexicanum (México / Eguiarte et al., 1992).
2.5 Tamanho Efetivo Populacional, Deriva e Endogamia
Uma medida muito importante utilizada na conservação genética é o tamanho
efetivo de populações (Ne). O Ne representa o tamanho de uma população ou vizinhança
que apresenta a mesma redução na variabilidade genética pela endogamia ou deriva de
uma população de referência, panmítica, de tamanho finito N (Crow & Kimura, 1970 e
21
Crossa & Vencovsky, 1999). Em outras palavras, relaciona-se com a representatividade
genética das populações (Vencovsky, 1987; Kageyama, 1987; Barret & Kohn, 1991;
Araújo, 1996 e Sebbenn et al., 2000). O tamanho efetivo de uma população depende do
número de indivíduos que efetivamente participam na reprodução e de suas
contribuições relativas para a geração seguinte (Crossa & Vencovsky, 1994 e Robinson,
1998).
O tamanho efetivo pode ser estimado para várias situações, como por exemplo,
para uma população de plantas adultas, uma população estruturada em progênies, várias
populações, populações em várias regiões, acessos de um banco de germoplasma e
assim por diante. O importante na estimativa do Ne é que a população de referência
esteja bem definida (Sebbenn, 2001).
A seguir são apresentados alguns exemplos para estimação do Ne, baseado em
Vencovsky (1997).
1. Estimativa do Ne para indivíduos adultos de uma simples população:
fnNe ˆ1
ˆ+
=
onde n é o tamanho físico da amostra e f a estimativa do índice de fixação. Para esta
estimativa é necessário admitir ausência de parentesco entre indivíduos amostrados (n) e
que os genes são correlacionados apenas dentro de indivíduos.
2. Estimativa do Ne para progênies maternas de uma simples população:
nF
nmC
Nf
f
e
2
ˆ111ˆ
5,0ˆ+
+
−
+=
θ
onde fθ é a coancestria entre indivíduos dentro de progênies ou a divergência genética
estimada entre progênies, m é o número de parentais ou de progênies avaliadas, n é o
22
número total de indivíduos avaliados nas progênies (n=Σni), Cf é o quadrado do
coeficiente de variação do número de indivíduos (ni) avaliados nas progênies (i=
1,2,...,f) e F é estimativa do índice de fixação para o conjunto das progênies.
3. Estimativa do Ne para várias populações:
nF
nmC
NP
P
e
2
ˆ111ˆ
5,0ˆ+
+
−+
=θ
onde Pθ é a coancestria entre indivíduos dentro de populações ou divergência genética
estimada entre populações, m é o número de populações avaliadas, n é o número total de
indivíduos avaliados nas populações(n=Σni), CP é o quadrado do coeficiente de variação
de ni sobre as populações (i= 1,2,...,m) e F é a estimativa do índice de fixação para o
conjunto das populações.
Muitos trabalhos têm mostrado que o tamanho efetivo costuma ser inferior ao
tamanho senso, ou seja, ao número de plantas amostradas. O tamanho efetivo é
dependente dos níveis de endogamia e parentesco existentes nas amostras, sendo que
quanto maiores estes níveis, menor é a representatividade genética da amostra
(Vencovsky, 1987). O Ne é afetado pelo número desigual de indivíduos masculinos e
femininos, variação no tamanho das progênies, flutuações temporais no tamanho da
população, sobreposição de gerações, presença de estruturação e endogamia dentro das
populações e assincronismo no florescimento (Wright, 1969; Loveless & Hamrick, 1984
e Lande, 1988). Além desses fatores, a apomixia e a reprodução vegetativa também
influenciam o Ne (Sebbenn, 2001).
O conhecimento do tamanho efetivo é uma informação muito importante para o
estudo da estrutura genética das populações. As reduções esporádicas no tamanho de
uma população têm efeito sobre as gerações subseqüentes (Robinson, 1998). Uma
diminuição acentuada no tamanho efetivo populacional, ocasionada pela exploração
23
florestal, por exemplo, ou mesmo por eventos estocásticos, tem sido denominada de
efeito de gargalo (Young et al., 1996). Isto porque após sua ocorrência é muito difícil
recuperar o tamanho efetivo original, a não ser que a redução do tamanho efetivo (Ne)
não seja muito acentuada (Vencovsky, 1987). Neste aspecto, uma geração ou algumas
gerações com menor número de indivíduos terá (terão) uma grande influência no valor
final do tamanho efetivo, uma vez que este será a média harmônica dos tamanhos
efetivos parciais (Crow & Kimura, 1970; Vencovsky, 1987; Falconer, 1989 e Araújo,
1996).
A manutenção de um tamanho efetivo populacional adequado diminui a
probabilidade de ocorrência das oscilações genéticas e da endogamia. Quanto maior o
tamanho efetivo menor será a magnitude da deriva genética. Isto significa que,
mantendo-se um tamanho efetivo adequado ao longo das gerações, maior é a
probabilidade de as freqüências alélicas permanecerem próximas da população de
origem (Templeton, 1990 e Ellstrand & Elam, 1993). Conforme Falconer (1989), as
flutuações nas freqüências alélicas podem resultar em aumento na diferenciação entre
subpopulações e na redução da variabilidade genética em populações pequenas.
Quando as populações permanecem pequenas por um longo período, os efeitos
da amostragem se tornam cumulativos. Isto dá origem a mudanças aleatórias na
freqüência gênica por causa da amostragem de gametas de geração para geração. Em
grandes populações, em média, somente pequenas mudanças aleatórias na freqüência
gênica ocorrem como resultado da deriva; entretanto, onde as populações são pequenas
(e.g. <100), as freqüências gênicas podem sofrer grandes flutuações em diferentes
gerações, levando a perda de alelos (Templeton, 1990; Barret & Kohn, 1991 e Ellstrand
& Elam, 1993). Os efeitos da redução no tamanho das populações foram investigados
em diferentes espécies vegetais, mostrando perdas de diversidade e alterações na
estrutura genética das populações (Ledig & Conkle, 1983; Hall et al., 1996; Nason et al.,
1997; Kageyama et al., 1998 e Sebbenn et al., 2000).
Da mesma forma, quanto maior o tamanho efetivo menor será o nível de
endogamia da população. O nível de endogamia (F) de uma população aumenta com o
tempo numa taxa dependente do tamanho efetivo populacional (Ne tal que ∆F = 1/2Ne),
24
por geração (Wright, 1922, 1931 e Falconer, 1989). Neste sentido, populações se tornam
endogâmicas mais rapidamente quando apresentam pequenos tamanhos (Barret & Kohn,
1991). Além disso, alterações na estrutura espacial dos indivíduos de uma população
podem levar a mudanças na densidade e no comportamento dos polinizadores, gerando
alterações nos níveis de cruzamento, como o aumento da autofecundação e
conseqüentemente da endogamia (Bawa & Krugman, 1990 e Murawski, 1995).
Populações de cruzamento, historicamente grandes, que repentinamente declinam para
uns poucos indivíduos, geralmente reduzem a variabilidade e a fecundidade (Falconer &
Mackay, 1996). Conforme Nason et al. (1997), a redução no número de indivíduos
reprodutivos pode levar a rápidas mudanças na composição genética e essas mudanças
ocorrem em conjunto com a estrutura genética pré-existente.
O efeito da endogamia em uma população é denominado de “depressão por
endogamia”, e este efeito é tanto maior quanto mais elevado for o grau de dominância
do caráter, e é causado pela diminuição da freqüência dos heterozigotos, nos vários locos
e pela carga genética da população (Falconer, 1989; Murawski & Hamrick, 1991 e
Barret & Kohn, 1991). Na prática, a depressão endogâmica implica na redução da
performance reprodutiva da espécie, causando alterações na fertilidade, viabilidade das
sementes, vigor, adaptação e produtividade de maneira geral (Crow & Kimura, 1970;
Allard, 1971; Mettler & gregg, 1973; Falconer & Mackay, 1996 e Wickneswari et al.,
2000).
O aumento rápido da endogamia em pequenas populações produz aumento da
homozigosidade de alelos recessivos deletérios, que por sua vez, são mantidos como
raros em heterozigose pela seleção natural em grandes populações, e pela probabilidade
de que tais alelos venham a se fixar em pequenas populações por deriva genética
(Allard, 1971 e Falconer & Mackay, 1996). Isto significa que se uma população de
cruzamentos aleatórios que abrigue alelos recessivos deletérios tornar-se endogâmica,
haverá, de início, uma considerável depressão por endogamia, à medida que os alelos
são expostos em homozigose. Eventualmente, a população poderá reconquistar um
maior valor adaptativo à medida que a seleção natural expurgar da população os alelos
deletérios. No entanto, tal população terá menos variação genética do que outra
25
praticando cruzamentos aleatórios e que não sofreu redução de tamanho (Futuyma,
1992).
2.6 Marcadores Genéticos
Marcadores genéticos são características qualitativas com herança mendeliana
simples, facilmente reconhecidas e cuja expressão não é influenciada pelo ambiente. Os
primeiros marcadores genéticos utilizados foram características morfológicas.
Entretanto, os marcadores morfológicos freqüentemente são controlados por genes
dominantes, não permitindo distinguir plantas heterozigotas. Marcadores morfológicos,
como a presença de pigmentos nas flores ou características de frutos e sementes, são
expressos somente na planta adulta, não sendo práticos quando se trabalha com espécies
de ciclo de vida longo. Esses marcadores podem ainda exercer influência sobre o valor
adaptativo da planta (Robinson, 1998). Além disso, o número de marcadores
morfológicos que se consegue é baixo, o que limita a sua aplicação e impossibilita a
estimativa de diversos parâmetros importantes para o estudo de populações naturais
(Ferreira & Grattapaglia, 1998).
A revolução neste quadro iniciou-se com o desenvolvimento de marcadores
bioquímicos na década de 1960 e dos marcadores moleculares a partir da década de
1970. Por definição, os marcadores genéticos bioquímicos são produtos da expressão de
genes (proteínas ou compostos secundários como os terpenóis). Marcadores genéticos
moleculares derivam da análise do polimorfismo presente no próprio DNA (Robinson,
1998).
A introdução da técnica de eletroforese de isoenzimas no início da década de
1960, além de iniciar a era dos marcadores moleculares, ampliou o número de
marcadores que poderiam ser utilizados. Os marcadores alozímicos podem ser obtidos
de uma maneira relativamente rápida, barata e são disponíveis para praticamente todas
as espécies de plantas. A utilização de isoenzimas permitiu a detecção de polimorfismo
entre plantas que não mostravam diferenças morfológicas. Assim, foi possível uma
26
melhor visualização da informação genética presente nas populações (Torggler et al.,
1995). Os marcadores alozímicos, já na década de 1960, foram utilizados para
importantes estudos como o de Lewontin & Hubby (1966), de estrutura genética
populacional, o que permitiu desde então uma grande disseminação desta técnica.
Os avanços da biologia molecular abriram novas perspectivas para a pesquisa
em conservação de espécies e para os estudos de biologia populacional como um todo.
Pela primeira vez a variação encontrada em plantas ou animais pôde ser analisada ao
nível do DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998 e Haig, 1998). Uma série de marcadores
moleculares que detectam o polimorfismo ao nível do DNA foram desenvolvidos nas
três últimas décadas. O primeiro deles, denominado de RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism), surgiu na década de 1970 e baseia-se em polimorfismos de
tamanho de fragmento, por meio do uso de enzimas de restrição (Grodzicker et al.,
1974). Na década de 1980 surgiram os marcadores minissatélites ou VNTR (Variable
Number of Tandem Repeats), que são regiões dispersas no genoma constituídas de um
número variável de seqüências idênticas repetidas lado a lado (tandem). Estas
seqüências repetitivas possuem de 15 a 100 pares de bases e, em cada loco hipervariável,
são repetidas até 50 vezes (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
O surgimento da técnica da reação da polimerase em cadeia ("PCR -
Polymerase Chain Reaction") na década de 1980, desenvolvida por Mullis & Faloona
(1987), permitindo a síntese enzimática de milhões de cópias de um segmento específico
de DNA, provocou uma verdadeira revolução nas técnicas de biologia molecular,
facilitando muito o trabalho de laboratório. Assim, surgiram diversos marcadores, como:
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - Welsh & McClelland, 1990 e Williams
et al., 1990), o qual destaca-se pela sua simplicidade e tem como base a amplificação de
um segmento de DNA, delimitado por dois iniciadores (primers), comumente com 10
pares de bases, que são complementares a dois sítios de nucleotídeos, um em cada fita
do DNA, posicionados inversamente a uma distância geralmente não superior a 4kb;
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Zabeau, 1993), resultante do uso
combimado de enzimas de restrição e da reação da polimerase em cadeia, apresenta alta
especificidade, resolução e poder de amostragem; microssatélites ou SSR (Simple
27
Sequence Repeats - Hamada et al., 1982; Tautz & Renz, 1984 e Litt & Luty, 1989),
constituídos por pequenas seqüências curtas de DNA de até 6 pares de bases repetidas
várias vezes de maneira idêntica e adjacente (tandem), são atualmente considerados os
marcadores com o maior conteúdo de informação genética por loco (Grattapaglia, 2001).
Além desses, existem outros marcadores que, muitas vezes, apresentam apenas uma
pequena modificação em relação a algum desses mencionados. Entretanto, os quatro
tipos de marcadores citados anteriormente (RFLP, RAPD, AFLP e SSR) são os mais
utilizados atualmente no estudo do genoma de plantas e animais (Souza, 2001).
Marcadores bioquímicos e moleculares têm sido utilizados no sentido de se
avaliarem parâmetros populacionais e reprodutivos, o que permitiu o desenvolvimento
de estudos que antes se restringiam a poucas plantas cultivadas, sobre as quais se detinha
um certo conhecimento do mecanismo de herança de caracteres qualitativos e de
fenótipos facilmente identificáveis experimentalmente. Esses marcadores genéticos
possuem um mecanismo de herança mendeliana e apresentam normalmente expressão
codominante (exceção feita em geral aos marcadores RAPDs e AFLPs), o que permite
identificar os genótipos heterozigotos e homozigotos dos indivíduos analisados e
constitui, em geral, na informação necessária para a estimativa dos diversos parâmetros
genéticos de interesse (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Grattapaglia, 2001 e Souza, 2001).
A seguir serão apresentados mais detalhes sobre marcadores alozímicos e
microssatélites, os quais foram empregados na caracterização genética das amostras no
presente trabalho.
2.6.1 Marcadores Alozímicos
As isoenzimas são diferentes formas moleculares de uma enzima catalisando a
mesma reação na célula. Quando as isoenzimas são controladas por alelos de um único
loco, elas são chamadas aloenzimas. Estas representam a conseqüência bioquímica da
substituição, deleção ou adição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeo, afetando a
sua carga elétrica e, conseqüentemente, a sua mobilidade durante a eletroforese. A
28
mobilidade da molécula através do gel depende também do seu peso molecular e da sua
conformação. Após a separação das isoenzimas por eletroforese, elas são identificadas
por meio de reações químicas baseadas em suas atividades catalíticas específicas
(Robinson, 1998).
A maioria das enzimas já reveladas em gel de amido tem mais de uma
isoenzima. Como conseqüência, uma grande quantidade de sistemas isoenzimáticos são
potencialmente informativos. A principal aplicação das isoenzimas é nos estudos de
diversidade genética e evolução. A eletroforese de isoenzimas tem proporcionado dados
úteis na abordagem de questões importantes em sistemática e evolução de plantas
(Crawford, 1989 e Doebley, 1989). Do ponto de vista da variação intraespecífica, as
isoenzimas têm contribuído para o estudo da organização da variabilidade genética e a
identificação de raças (Singh et al., 1991). Isoenzimas também vêm sendo usadas nos
procedimentos de estimativa de sistema de cruzamento por locos múltiplos (Ritland &
Jain, 1981, Torggler et al., 1995) e nos estudos do movimento gênico, monitorando o
transporte de pólen e de sementes (migração de genes por geração) (Barret & Husband,
1990). A literatura sobre estudos de isoenzimas em plantas é muito extensa, o que revela
sua utilidade em estudos de caracterização da diversidade e estrutura genética de
populações.
Esses marcadores apresentam uma série de características que são importantes
nos estudos de genética de populações, tais como: a) a expressão de muitas enzimas não
é afetada pelo ambiente; b) enzimas são ativas em diferentes estágios ontogenéticos ou
partes da planta (embrião, endosperma, cotilédones, folhas ou gemas de plantas adultas);
c) pequenas quantidades de tecido vivo são usualmente empregadas nos ensaios; d)
isoenzimas são geralmente codominantes, permitindo distinguir homozigotos de
heterozigotos; e) grandes quantidades de variabilidade isoenzimática têm sido
encontradas em espécies de plantas; f) a variabilidade em vários sistemas enzimáticos
pode ser examinada simultaneamente para cada amostra individual; g) os procedimentos
são simples, rápidos e relativamente baratos; h) a técnica pode ser rapidamente adaptada
para outras espécies (Bergmann, 1991; Hattemer, 1991; Ferreira & Grattapaglia, 1998 e
Finkeldey, 1998).
29
No entanto, as isoenzimas também possuem algumas limitações, especialmente
no que se refere ao número total de locos que podem ser detectados no genoma e ao
número de alelos por loco, isto é, o nível de polimorfismo genético detectável em cada
loco. Mesmo considerando que o número total de locos alozímicos que pode ser
detectado seja superior a 100 (Murphy et al., 1990), somente um número limitado de
sistemas isoenzimáticos polimórficos, geralmente entre 10 e 20, é usualmente
visualizado em cada espécie (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Além do número de locos
ser limitado, freqüentemente depara-se com o problema do baixo polimorfismo e da
ausência de polimorfismo genético para um ou vários locos isoenzimáticos disponíveis,
o que limita ainda mais o poder da técnica.
Outro aspecto a ser considerado nos marcadores alozímicos refere-se à
possibilidade de determinados locos não serem seletivamente neutros. A maioria dos
trabalhos empregando marcadores alozímicos na caracterização genética de populações
naturais tem se baseado no pressuposto da neutralidade desses marcadores. Por outro
lado, alguns trabalhos também têm apontado a existência de valor adaptativo associado
ao polimorfismo protéico (Hamrick, 1982; Bergmann & Ruetz, 1991; Gillespie, 1992;
Torggler et al., 1995; Eanes, 1999 e Conte et al., 2003). Esse fato tem gerado
controvérsias quanto à utilização desses marcadores em determinadas aplicações, pois
tem envolvido o componente seleção na manutenção da diversidade protéica, o que vai
de encontro com os pressupostos da teoria selecionista (Futuyma, 1992).
Para David (1998), a existência de valor adaptativo associado aos marcadores
alozímicos pode ter origem de duas maneiras. Primeiro, se os locos que promovem valor
adaptativo forem os próprios locos marcadores, então o polimorfismo enzimático
observado está sob direta seleção. Por outro lado, quando os locos marcadores não são
responsáveis diretamente pelo valor adaptativo dos indivíduos, o termo “associative
overdominance” (Ohta, 1971), ou sobredominância associada entre locos é
freqüentemente utilizada. Neste caso, os locos marcadores refletem o comportamento
dos outros locos do genoma, através de correlação genética associada ao desequilíbrio de
ligação.
30
Segundo Robinson (1998), a validade da informação obtida por meio de
isoenzimas para análises de processos evolutivos baseia-se na suposição de que essas
sejam marcadores neutros, ou seja, as diversas formas de cada enzima conferem o
mesmo valor adaptativo aos indivíduos. Em favor da hipótese da neutralidade, Kimura
(1968) propôs que o polimorfismo em isoenzimas deve-se à fixação ao acaso de alelos
neutros. Por esta hipótese, se as isoenzimas não fossem seletivamente neutras, o alto
grau de variabilidade que apresentam na natureza implicaria a manutenção de grande
quantidade de alelos com valor adaptativo abaixo do ótimo, resultando em uma carga
deletéria excessiva para a espécie. Em outras palavras, não seria possível manter todo
esse polimorfismo sob seleção constante.
Pelo pressuposto da neutralidade, a utilização dos marcadores alozímicos
apresenta como principal vantagem a possibilidade de caracterização das forças
evolutivas (eventos determinantes da organização da variabilidade genética) sem a
influência da seleção, permitindo uma maior compreensão do comportamento das
populações naturais (Reis, 1996b). Por outro lado, a existência de valor adaptativo em
determinados locos teria algumas vantagens em estudos como associações entre fatores
de ambiente e as freqüências alélicas de marcadores alozímicos (Hamrick & Allard,
1972 e Clegg & Allard, 1972) ou mesmo em estudos de recrutamento de plantas em
populações naturais (Tonsor et al., 1993; Lee et al., 2000 e Conte et al., 2003).
No entanto, a controvérsia selecionista versus neutralista, atualmente, não
constitui uma divergência completa. Conforme Futuyma (1992), a idéia mais aceita é a
de que somente algumas das muitas variantes de enzimas reveladas por eletroforese são
fixadas por seleção e que o restante da variação deve ser neutra. Esta idéia também é
defendida por Bergmann & Ruetz (1991), que afirmam que apenas os locos envolvidos
em importantes rotas biossintéticas estariam mais sujeitos à seleção.
Embora o número de outros marcadores (marcadores de DNA) tenha
aumentado significativamente nos últimos anos, o interesse e a importância das
isoenzimas de plantas não tem diminuído. Elas continuam sendo intensivamente
utilizadas por geneticistas de populações (Chung & Epperson, 2000; Mariot et al., 2002;
Telles, 2000; Sebbenn, 2001; Auler et al., 2002; Mantovani, 2003; Ribas, 2003 e Conte
31
et al., 2003). Apesar das limitações apresentadas, as isoenzimas continuam a responder
eficientemente questões particulares e, portanto, representam uma importante ferramenta
de estudo nas diversas áreas da genética.
2.6.2 Marcadores Microssatélites
Seqüências simples repetidas (SSRs), também denominadas microssatélites,
vêm se constituindo numa poderosa classe de marcadores moleculares com uma ampla
gama de aplicações no campo da genética. SSRs são pequenas seqüências de DNA,
consistindo de unidades repetidas de nucleotídeos (1-6 nucleotídeos, em tandem)
encontradas em todos os genomas de procariotos e eucariotos analisados até o momento
(Gupta et al., 1996; Souza, 2001 e Zane et al., 2002). Elas estão presentes tanto em
regiões codificadoras como não codificadoras e são geralmente muito polimórficas
devido ao alto nível de variação no número de repetições (Atherly et al., 1999).
Grande parte do conhecimento a respeito dos microssatélites foi obtido a partir
do reino animal, principalmente em mamíferos. Eles foram inicialmente estudados no
genoma humano, onde estão presentes em grande número de cópias, dispersas por todo o
genoma (Hamada et al., 1982). Em plantas, a presença das repetições (AC)n e (AG)n foi
descrita pela primeira vez por Condit & Hubbell (1991). No genoma de plantas
superiores a repetição (AC)n é geralmente menos freqüente do que em mamíferos, sendo
o motivo (AT)n o mais encontrado, seguido por (A)n e (AG)n. Repetições de
trinucleotídeos e tetranucleotídeos também foram encontrados nos genomas de plantas,
sendo os motivos mais freqüentes (AAT)n, (AAC)n, (AGC)n, (AAT)n, (AAG)n, (AATT)n
e (AAAT)n (Morgante & Olivieri, 1993; Wang et al., 1994; Akkaya et al., 1995 e Gupta
et al., 1996).
Enquanto o número de repetições em tandem de um microssatélite geralmente
varia, a seqüência de bases adjacente ao microssatélite pode ser única no genoma e
conservada (no mesmo loco) entre diferentes indivíduos da mesma espécie. Assim,
pode-se desenhar um oligonucleotídeo específico para as seqüências adjacentes a um
32
dado microssatélite, de forma que, através de uma reação de PCR será possível
amplificar este loco em diferentes genótipos. Como o número de unidades repetidas em
tandem em um microssatélite pode ser variável entre diferentes genótipos, os produtos
de amplificação dos diferentes indivíduos mostrarão um polimorfismo no tamanho do
fragmento amplificado (Souza, 2001).
Entre as classes de marcadores moleculares existentes, os microssatélites são os
que mais se aproximam do marcador ideal para estudos populacionais (Rafalski et al.,
1996 e Chase et al., 1996). Isto deve-se ao fato de tais marcadores possuírem
características extremamente favoráveis para este fim, entre as quais destacam-se: (i) são
muito abundantes na maioria dos genomas e, geralmente, são uniformemente
distribuídos; (ii) são hipervariáveis e codominantes, portanto o conteúdo informativo é
bastante elevado, permitindo uma precisa discriminação mesmo de indivíduos
proximamente relacionados; (iii) SSRs são baseados em PCR, o que requer pouco DNA
para sua amplificação; (iv) todo loco SSR é definido por um único par de primers
(iniciadores), de forma que a troca de informação entre laboratórios é facilitada; (v) a
genotipagem pode ser semi-automatizada em ensaios multiplex (vários locos ao mesmo
tempo); (vi) marcadores microssatélites são transferíveis entre pedigrees, populações, e
freqüentemente entre espécies geneticamente relacionadas do mesmo gênero (Rafalski et
al., 1996, Chase et al., 1996, Ferreira & Grattapaglia, 1998; Souza, 2001 e Grattapaglia,
2001).
A principal limitação refere-se ao custo e ao esforço inicial requerido para
clonagem e seqüenciamento das regiões que flanqueiam a região microssatélite, para a
obtenção dos primers. Os métodos atuais para o descobrimento de marcadores baseados
em SSR tipicamente requerem a construção de uma biblioteca genômica, triagem de
uma biblioteca para elementos repetitivos, sequenciamento do DNA de clones positivos,
desenho dos primers, seleção dos locos informativos e caracterização da variação alélica
(Zane et al., 2002; Souza, 2001 e Grattapaglia, 2001). Porém, este custo é facilmente
compensado pela ampla gama de potencialidades de pesquisa e desenvolvimento que se
abrem ao se possuir tal tecnologia para uma determinada espécie (Grattapaglia, 2001).
33
Além disso, uma vez desenvolvidos, o seu custo de utilização equivale ao de outros
marcadores baseados em DNA.
Como outras classes de DNA repetitivo, os microssatélites possuem altas taxas
de mutação, numa faixa entre 10-3 e 10-4 por loco por gameta por geração, portanto, uma
taxa de mutação superior em relação a outras regiões do genoma. Esta instabilidade
surge através de um mecanismo específico de mutação chamado deslizamento (slippage)
da DNA polimerase (Tautz & Schlötterer, 1994). Além disso, o crossing-over desigual,
causado pelo pareamento errôneo dessas seqüências durante o quiasma, também é um
dos responsáveis pela maior taxa de mutação em regiões microssatélites (Brown et al.,
1996 e Schlötterer et al., 1998). Esses dois fenômenos em conjunto são os responsáveis
pelas altas taxas de polimorfismo detectadas nestes marcadores.
Devido ao alto grau de polimorfismo, os microssatélites têm sido empregados
em diferentes situações da área vegetal. Tais marcadores foram empregados com
sucesso na discriminação entre acessos e cultivares de bancos de germoplasma,
detectando duplicações, mistura de sementes, deriva e cruzamentos não controlados
(Olufowote et al., 1997; Melo, 2000 e Souza, 2002). Também foram empregados na
determinação do grau de parentesco entre indivíduos (Yang et al., 1994 e Melo, 2000),
na determinação de origem parental por teste de paternidade (Kirst et al., 1998 e Gaiotto
et al., 2003), e na construção de mapas genéticos de ligação (Wu & Tanksley, 1993; Bell
& Ecker, 1994; Akkaya et al., 1995; Brondani, et al., 1998 e Cregan et al., 1999). Em
espécies arbóreas tropicais, os microssatélites foram descritos e empregados com
sucesso em estudos do sistema reprodutivo, fluxo gênico e estrutura genética de
populações, tais como: Pithecellobium elegans (Chase et al., 1996) Carapa guianensis
(Dayanandan et al., 1999), Caryocar brasiliense (Collevatti et al., 2001a, b), Euterpe
edulis (Gaiotto et al., 2003), Eugenia dysenterica (Zucchi et al., 2003), Theobroma
grandiflorum (Alves et al., 2003), entre outros.
Em genética de populações de plantas, o emprego de microssatélites teve uma
grande contribuição na melhoria das estimativas de parâmetros genéticos, especialmente
em populações com diversidade baixa ou não detectada por outros marcadores (Paetkau,
1995). Um aspecto geral dos estudos genéticos é que pouca informação pode ser obtida
34
sobre a estrutura de populações caso os marcadores empregados não sejam
suficientemente polimórficos. Neste aspecto, estimativas de parâmetros genéticos
populacionais críticos, tais como a diferenciação genética e endogamia para algumas
espécies e medidas diretas de fluxo gênico e tamanho efetivo populacional para muitas
espécies, foram grandemente beneficiadas com o advento dos marcadores moleculares
altamente polimórficos (Chase et al., 1996).
Entretanto, a interpretação da significância da variação nesses locos dentro e
entre grupos deve ser cuidadosamente considerada. Hedrick (1999) demonstrou que o
nível de diferenciação e distância genética entre grupos é altamente influenciado pelo
nível de heterozigosidade desses locos altamente variáveis. Além disso, a conexão entre
a significância estatística e biológica pode às vezes ser pequena. Portanto, cuidados
devem ser tomados na interpretação dos dados de microssatélites, uma vez que a
informação que eles fornecem pode ser um pouco diferente daquelas obtidas com
marcadores tradicionalmente menos variáveis.
3 EFEITOS DO MANEJO NA ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕESDE Euterpe edulis MART., COM BASE NA VARIABILIDADE DE LOCOSMICROSSATÉLITES
Resumo
Os efeitos da exploração tradicional e do manejo tecnificado sobre os níveis devariabilidade e estrutura genética de populações de Euterpe edulis (Arecaceae), foraminvestigados comparando-se duas populações não perturbadas com duas populaçõesexploradas, no sul do Brasil. Em cada população foram examinadas três categorias deplantas, usando oito locos microssatélites. Em média, as seguintes estimativas foramobtidas: A : 14,1, 14,5, 14,7; eH : 0,781, 0,785, 0,781; oH : 0,678, 0,709, 0,699; f :
0,133, 0,096, 0,105, para plântulas, jovens e adultos, respectivamente. A distribuição davariabilidade genética entre e dentro de populações ( STG ; STR ) revelou que mais de
95% da variabilidade genética molecular da espécie encontra-se distribuída dentro depopulações. A informação genética desses marcadores revelou que o processo deexploração, até o momento, não causou alterações nos níveis de diversidade e naestrutura genética das populações exploradas de E. edulis. Entretanto, houve umaumento nos níveis de endogamia nas coortes mais jovens das duas populaçõesexploradas. Embora os resultados da população manejada podem ter sido influenciadospor outros eventos de exploração ocorridos no passado, o aumento no coeficiente deendogamia das duas populações pode estar relacionado ao aumento na freqüência decruzamentos não aleatórios, uma vez que a autofecundação é um evento de ocorrênciamuito rara nesta espécie.
Palavras-chave: espécie tropical; extrativismo; manejo; microssatélites; diversidadegênica; endogamia.
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Effects of management on the genetic structure of Euterpe edulis Mart. populations
based on variability at microsatellite loci
Summary
We investigated the effects of two exploitation systems - extractivism and
management - on the levels of variability and genetic structure of Euterpe edulis Mart.
populations, by comparing two undisturbed populations with two exploited populations
in southern Brazil. Three categories of plants, from seedlings to adults, were examined
using eight microsatellite loci. The following average estimates were obtained: A : 14.1,
14.5, 14.7; eH : 0.781, 0.785, 0.781; oH : 0.678, 0.709, 0.699; f : 0.133, 0.096, 0.105
for seedlings, juveniles and adults, respectively. The estimates of interpopulation genetic
variation ( STG ; STR ) revealed that more than 95% of the molecular genetic variability of
the species was distributed within populations. Up to the time of the study, the
exploitation process had not caused changes in the levels of variability or in the genetic
structure of the disturbed populations of the species. However, according to the
information from eight microsatellite loci, there was an increase in the inbreeding
coefficients in the youngest cohorts of the two exploited populations. Although the
results of the managed population could have been influenced by other exploitation
events that have occurred in the past, the increase in the inbreeding coefficient of the
two exploited populations is probably due to an increase in the frequency of non-random
matings, since self-pollination is an event of rare occurrence in this species.
Keywords: tropical tree; extractivism; management; microsatellites; genetic variability;
inbreeding.
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3.1 Introdução
O palmiteiro (Euterpe edulis Mart.; Arecaceae) é uma espécie nativa da
Floresta Tropical Atlântica Brasileira. O produto comercial obtido desta espécie - o
palmito - é um dos mais importantes recursos não madeiráveis explorados na Floresta
Atlântica. Em populações naturais, a espécie apresenta uma alta densidade e uma
estrutura demográfica na forma de "J-invertido" (Reis et al., 1996). A espécie é monóica,
com acentuada protandria e polinizada por insetos (Mantovani & Morellato, 2000).
Devido à alta produção anual de frutos, a espécie é um importante recurso alimentar para
a fauna e portanto representa uma espécie-chave no ecossistema, considerando o
conceito de Terborgh (1986). Alguns estudos empregando marcadores alozímicos (Reis,
1996a; Reis et al., 1998, 2000e e Conte et al., 2003) e microssatélites (Gaiotto et al.,
2003) em populações naturais, revelaram que a espécie possui uma alta taxa de
fecundação cruzada, altos níveis variabilidade genética dentro das populações e baixa
divergência entre populações.
No entanto, a situação atual das populações naturais da espécie é de intensa
fragmentação e degradação com uma reduzida área de ocorrência (Reis et al., 2000a).
Embora um sistema de manejo tecnificado tenha sido proposto para a espécie (Reis et
al., 1992; Ribeiro et al., 1994; Reis et al., 1998; Reis et al., 2000b e Reis et al., 2000d), a
intensiva exploração realizada desde a década de 1960 resultou na eliminação de várias
populações e em sérias alterações das suas populações remanescentes (Galetti &
Fernandez, 1998; Reis & Guerra, 1998 e Batista et al., 2000). Esta situação das
populações da espécie também é um reflexo do estado de degradação em que se
encontra a floresta Atlântica e um forte indicador de áreas mais ou menos
comprometidas deste importante bioma.
As investigações sobre as conseqüências genéticas da exploração florestal têm
enfocado principalmente a redução no tamanho e o aumento do isolamento espacial dos
remanescentes florestais (Young et al., 1993; Ballal et al., 1994; Young & Merriam,
1994; Hall et al., 1996; Nason et al., 1997; Nason & Hamrick, 1997; Aldrich et al., 1998;
Dayanandan et al., 1999 e Scariot, 1999). A grande maioria desses trabalhos tem
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apontado perdas de diversidade, aumento nos níveis de endogamia e alterações na
estrutura genética das populações. Em geral, essas conseqüências são mais evidentes nas
coortes mais jovens das populações remanescentes (Murawski et al., 1994; Aldrich et
al., 1998 e Sebbenn et al., 2000). Entretanto, evidências a partir de estudos com espécies
temperadas e subtropicais sugerem que nem todos os eventos de fragmentação levam a
perdas genéticas, e também que diferentes tipos de variação genética (e.g. variação
alozímica e quantitativa) podem responder diferentemente (Young et al., 1996). Além
disso, em alguns casos a fragmentação pode até aumentar o fluxo gênico entre
populações remanescentes, quebrando a estrutura genética local (Foré et al., 1992 e
Ballal et al., 1994).
Embora a fragmentação e a exploração na forma de corte seletivo sejam
comuns em florestas tropicais, existe pouco conhecimento dos efeitos do segundo
processo sobre a diversidade e a estrutura genética das populações. A exploração na
forma de corte seletivo, tal como é realizada em E. edulis, envolve alterações no
tamanho populacional e nos padrões espaciais dos indivíduos dentro das populações,
conforme também observado em outras espécies (Bawa & Krugman, 1990 e Murawski,
1995). De acordo com a intensidade do manejo, tais alterações podem resultar em efeitos
negativos sobre a estrutura genética das populações de uma espécie, como a perda de
alelos raros, aumento da endogamia e redução na produtividade e adaptação das
gerações subseqüentes (Murawski et al., 1994 e Sebbenn et al., 2000). Uma redução
drástica no tamanho das populações, através do corte seletivo, pode levar à deriva
genética caracterizada pela perda e fixação aleatória de alelos, aumento do parentesco e
da endogamia dentro das populações (Mettler & Gregg, 1973; Futuyma, 1992; Ellstrand
& Elam, 1993; Alvarez-Buylla et al., 1996 e Falconer & Mackay, 1996), colocando em
risco a sustentabilidade do sistema de manejo. Segundo Reis et al. (1998), a base para a
sustentabilidade da floresta é a manutenção de seus componentes genéticos e ecológicos.
Desta forma, o manejo florestal deve ser realizado sob uma perspectiva
conservacionista, onde a dinâmica populacional, a estrutura genética das populações
naturais, bem como suas interações com as outras espécies do ambiente sejam
preservadas.
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Considerando a escassez de informações relativas às conseqüências genéticas
da exploração de palmito em populações naturais de Euterpe edulis Mart., o objetivo
deste estudo foi avaliar o impacto do processo de exploração da espécie em termos de
perda de diversidade e alteração da estrutura genética de populações. O estudo foi
baseado na hipótese de que o processo de exploração florestal promove redução na
variação genética, aumento nos níveis de endogamia e conseqüente alteração na
estrutura genética das populações naturais da espécie. Os dados genéticos foram gerados
usando marcadores microssatélites (seqüências simples repetidas; SSR), atualmente
considerados os marcadores moleculares mais informativos para estimativas de
parâmetros genéticos populacionais (Chase et al., 1996; Powell et al., 1996 e Souza,
2001).
3.2 Material e Métodos
3.2.1 Populações, Amostragem e Extração de DNA
O estudo foi realizado em duas localidades do Estado de Santa Catarina, Brasil,
sendo uma no Município de Ibirama, e outra no Município de São Pedro de Alcântara.
Em cada localidade foram escolhidas duas áreas de ocorrência natural de E. edulis, uma
sem influência antrópica (população natural) e outra onde foi realizada a extração de
palmito (população explorada), totalizando quatro populações (Tabela 1). Dois sistemas
de exploração foram considerados no presente estudo: (i) extrativismo (São Pedro), onde
a exploração é realizada através da extração da maioria dos indivíduos acima de 2 m de
altura, permanecendo poucos indivíduos reprodutivos na área; e (ii) manejo (Ibirama), o
qual caracteriza-se pela retirada apenas dos indivíduos acima de 9 cm de DAP,
respeitando-se a permanência de pelo menos 50 indivíduos reprodutivos por hectare,
sendo tais critérios definidos pela legislação florestal do Estado de Santa Catarina.
A cobertura vegetal das duas regiões é de Floresta Ombrófila Densa,
pertencente ao domínio da Mata Atlântica (IBGE, 1988). Apesar de a situação atual das
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populações da espécie ser de intensa fragmentação e degradação, existem muitos
fragmentos remanescentes em bom estado de conservação, como é o caso das duas
populações naturais amostradas neste estudo. Além disso, nas duas regiões estudadas os
fragmentos florestais apresentam uma certa conectividade em função da proximidade
entre os fragmentos e, portanto, populações degradadas podem sofrer a influência de
populações não degradadas do seu entorno. A história de exploração nas populações
estudadas é bastante diferente. Em São Pedro, a exploração foi realizada em diferentes
episódios, entre as décadas de 1970 e 1990, período em que a legislação apresentava
poucas restrições à exploração de palmito. Em Ibirama, embora a população possa ter
sofrido exploração no passado, o manejo foi realizado há três anos, com a retirada dos
indivíduos passíveis de corte, de acordo com os critérios técnicos mencionados
anteriormente. A distância geográfica entre as duas regiões é de aproximadamente 150
km. Na região de Ibirama, a distância entre as duas populações é de aproximadamente 2
km, enquanto em São Pedro essa distância é de 5 km.
Tabela 1. Algumas características das populações amostradas. Piracicaba-SP,Esalq/USP, 2004
CoordenadasPopulação Localidade Densidade(Adultos/ha)
Altitude(m) Latitude (S) Longitude (W)
Pop. 1: Extrativismo São Pedro 15 350 27°30' - 27°35' 48°45' - 48°50'Pop. 2: Manejo Ibirama 50 350 27°00' - 27°05' 49°25' - 49°30'Pop. 3: Natural Ib Ibirama 130 350 27°00' - 27°05' 49°25' - 49°30'Pop. 4: Natural SPA São Pedro 120 300 27°30' - 27°35' 48°45' - 48°50'
Para os estudos de variabilidade e estrutura genética, em cada população foram
coletadas amostras de plantas pertencentes a três categorias (Figura 1), de acordo com a
classificação de Reis et al. (1996), visando representar os indivíduos em diferentes fases
de desenvolvimento dentro de cada nível de ação antrópica. Assim, foram amostradas:
i) Plântulas - indivíduos com até 10 cm de altura de inserção da folha
flecha, representando os indivíduos da última frutificação;
ii) Jovem II - plantas entre 30 cm e um metro de altura de inserção, sem o
estipe exposto e com 4 a 5 folhas nitidamente pinadas;
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iii) Adultos - plantas em fase reprodutiva.
As coletas foram realizadas em três pontos distribuídos aleatoriamente em cada
população, onde foram amostrados cerca de 50 indivíduos por categoria. As amostras
foliares foram mantidas sobre gelo, transportadas para o laboratório e estocadas a uma
temperatura de 4°C. Na extração do DNA genômico, utilizou-se o método CTAB,
conforme as recomendações de Ferreira & Grattapaglia (1998).
Figura 1 - Categorias de plantas de E. edulis. A - Plântula; B - Jovem II; C - Adulto(Segundo Reis et al., 1996)
1 m
C
15 cm
B
2 cm
A
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3.2.2 Amplificação dos Locos SSR
Oito locos SSR previamente desenvolvidos e otimizados para E. edulis (Gaiotto
et al., 2001) foram usados na genotipagem de todos os indivíduos amostrados (Tabela
2). As reações de amplificação foram realizadas em termociclador modelo PTC 100 MJ
Research, através do seguinte protocolo: 94°C por 5 min; 30 ciclos de 94°C por 1 min,
temperatura de anelamento específica para cada par de “primers” por 1 min (Gaiotto et
al., 2001), 72°C por 1 min; e o último passo para extensão a 72°C por 7 min. Ao
coquetel da reação da polimerase em cadeia (PCR) foram adicionados os seguintes
componentes para um volume de 13µl: 3µl de DNA genômico (2,5ng/µl); 1,21µl de
água milli-Q autoclavada; 1,3µl de tampão PCR 10x (200mM Tris-HCl, 500mM KCl,
pH 8,4); 1,3µl de dNTPs (2,5mM); 1,3µl de DMSO 50%; 0,39µl de MgCl2 (50mM);
4,3µl de ”primer” (0,9µM); e 0,2µl de Taq DNA polimerase (5U/µl). Os fragmentos
amplificados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 4%, TBE 1x,
corrida a 60W/1300V/46mA por 1 hora, usando como marcador “ladder” 10 pb. Os géis
foram corados com nitrato de prata conforme descrito em Creste et al. (2001).
Tabela 2. Informações sobre os locos microssatélites de Euterpe edulis utilizados, comas respectivas amplitudes alélicas e temperatura de anelamento (Ta).Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Nome Número derepetições
Seqüências(5’-3’)
Amplitudealélica
Ta
(°C)N. de acesso
GenBank
EE3 (AG)11.(AG)16F: TTCgCgCACACTgAgAgR: ggTAgCgTTgAtTggTCC 194-210 56 AF328879
EE5 (AG)24F: gAgAACACATAAgCTgCR: gCtTCAgAATTAggACA 102-136 56 AF328882
EE8 (AG)20F: gTATTCCAATgTgCTCACAgR: gTgCAgTAggCTTCTAgTACC 110-132 58 AF328872
EE23 (A)14.(AG)23F: gTTCTgCgATTCATACTCCTgR: TACgAACCAAgATggAgCAA 100-132 58 AF328877
EE45 (AG)28F: AAAgAAATTggCgTgACATCR: AACCAgTCTTCTCCCTCTCg 70-154 56 AF328887
EE47 (AG)20F: CgAAATCAATggTTTCAgTgR: AATTATTgTTgTgggCAgC 214-246 56 AF328874
EE48 (AG)27F: CCTACCATTACgTACTgTCgR: CAATATCAAgCTCATCCATC 210-266 56 AF328875
EE52 (AG)22F:TTCTgTggAgAgTCAATCATCR: AATCTgACAAggCCTCAAC 230-260 56 AF328888
Adaptado de Gaiotto et al. (2001)
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3.2.3 Análise Estatística
A partir da interpretação do padrão de bandas nos géis foram obtidas as
freqüências alélicas e genotípicas de cada loco. Estas freqüências foram submetidas ao
teste exato de Fisher para verificar a aderência às proporções de Equilíbrio de Hardy-
Weinberg, conforme definido por Weir (1996), utilizando o programa TFPGA (Miller,
1997). Esse teste foi feito por meio do método convencional de Monte Carlo, utilizando
10 batches (grupos) com 1.000 permutações por batch.
A variabilidade genética molecular dentro das populações foi caracterizada pelo
número médio de alelos por loco (A) e pelas heterozigosidades observada (Ho) e
esperada (He) sob equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada população (Nei, 1978),
utilizando o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2000). Também foram obtidas as
estimativas do índice de fixação (f ou FIS de Wright) de cada população, através de
análise de variância, cuja significância foi testada pelo procedimento de reamostragem
sobre locos, utilizando 10.000 bootstraps, tendo em vista estimar a variação entre locos.
O índice de fixação também foi estimado mantendo-se o alelo mais freqüente e
agrupando-se os demais, uma vez que o alto nível de polimorfismo nos locos
microssatélites pode produzir desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg devido à baixa
freqüência de certos alelos em alguns locos (Weir, 1996).
A estrutura genética molecular entre populações foi investigada através da
análise da diversidade em populações subdivididas de Nei (Nei, 1973, 1977,1987), sob
modelo fixo para o efeito de populações, visto que algumas populações amostradas não
se enquadram no modelo aleatório por terem sofrido alterações pela ação antrópica. A
estimação dos parâmetros (HS, HT, DST, GST) foi realizada utilizando o programa FSTAT
(Goudet, 2001) e a significância testada pelo procedimento de reamostragem do tipo
bootstrap, utilizando 10.000 reamostragens sobre locos. A estruturação genética entre as
populações também foi quantificada através das estimativas das distâncias genéticas não
viesadas de Nei (1978). Os valores das distâncias foram utilizados na construção de
dendrogramas, empregando-se o método UPGMA de agrupamento conforme descrito
em Sneath & Sokal (1973), com auxílio do programa TFPGA (Miller, 1997).
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Como a maioria das mutações em locos microssatélites envolve a adição e a
subtração de um pequeno número de unidades repetidas, o processo mutacional não está
de acordo com o que se admite no modelo de alelos infinitos com baixa taxa de mutação.
Por essa razão, a estrutura genética molecular também foi quantificada pela estatística
RST (Slatkin, 1995), desenvolvida especificamente para dados de microssatélites. A
análise de variância do tamanho dos alelos foi baseada em Goodman (1997) utilizando o
programa FSTAT (Goudet, 2001).
3.3 Resultados
3.3.1 Variabilidade Genética Intrapopulacional
Todos os oito locos microssatélites apresentaram altos níveis de polimorfismo
entre categorias nas quatro populações (Figura 2), com o loco menos variável (EE5) e o
loco mais variável (EE47) mostrando, respectivamente, 13 e 26 alelos. Em média, foram
analisados 52 indivíduos por categoria por população, revelando um total de 161 alelos
nas amostras. Os valores médios das estimativas de parâmetros genéticos de diversidade
foram bastante altos e homogêneos entre as categorias (Tabela 3). O número de alelos
por loco ( A ) variou de 14,1 a 14,7, a diversidade gênica ( eH ) variou de 0,781 a 0,785, e
a heterozigosidade observada ( oH ) variou de 0,678 a 0,709. Ao nível de populações, o
número médio de alelos por loco das três categorias de plantas foi bastante homogêneo
entre as populações 1, 2 e 3, com um leve decréscimo na população 4. Esse mesmo
comportamento foi verificado para a diversidade gênica, uma vez que a sua magnitude é
dependente do número de alelos em cada população. Já a heterozigosidade observada
apresentou valores ligeiramente inferiores à diversidade gênica em todas as populações,
indicando excesso de homozigose, porém com exceção da população 4 (adultos), os
valores de oH tiveram uma pequena superioridade nas populações naturais sem
exploração (3 e 4) em relação às populações exploradas (1 e 2).
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Figura 2 – Polimorfismo de microssatélites no loco EE52 para 48 plantas de Euterpeedulis. Gel desnaturante de poliacrilamida corado com nitrato de prata;tamanho dos fragmentos em pares de bases (pb) indicado à esquerda.Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Tabela 3. Estimativas de parâmetros genéticos de diversidade de três categorias deplantas em quatro populações de Euterpe edulis, a partir de oito locosmicrossatélites, sendo N: número médio de indivíduos amostrados; A :número de alelos por loco; oH : heterozigosidade observada; eH :
heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg; f : índice defixação; IC: intervalo de confiança de f . Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Categoria/População N A eH oH f (a) IC95%
PlântulasPop. 1: Extrativismo 53,3 14,1 0,798 0,668 0,163 0,011 a 0,337Pop. 2: Manejo 51,1 14,2 0,787 0,662 0,159 0,035 a 0,262Pop. 3: Natural Ib 52,4 14,3 0,779 0,685 0,121 0,019 a 0,197Pop. 4: Natural SPA 52,5 13,7 0,760 0,695 0,085 ns -0,040 a 0,242
Média 52,3 14,1 0,781 0,678 0,133 0,013 a 0,254
JovensPop. 1: Extrativismo 50,7 14,0 0,797 0,722 0,095 ns -0,008 a 0,206Pop. 2: Manejo 52,1 15,2 0,792 0,644 0,188 0,051 a 0,331Pop. 3: Natural Ib 52,5 15,0 0,787 0,742 0,057 ns -0,039 a 0,162Pop. 4: Natural SPA 53,1 14,0 0,761 0,730 0,041 ns -0,089 a 0,168
Média 52,1 14,5 0,785 0,709 0,096 ns -0,010 a 0,211
AdultosPop. 1: Extrativismo 47,8 15,1 0,794 0,698 0,121 ns 0,000 a 0,230Pop. 2: Manejo 50,2 14,8 0,789 0,698 0,116 ns -0,043 a 0,300Pop. 3: Natural Ib 53,0 15,0 0,781 0,712 0,088 ns -0,008 a 0,184Pop. 4: Natural SPA 53,4 13,8 0,760 0,687 0,096 ns -0,028 a 0,224
Média 51,1 14,7 0,781 0,699 0,105 ns -0,007 a 0,222ns Não significativo (IC95%: 10.000 bootstraps); (a) ISFf ˆˆ =
230 pb
330 pb
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As diferenças encontradas entre as estimativas de He e Ho explicam o
aparecimento de endogamia nas populações (Tabela 3). Na média das populações, as
plântulas mostraram um valor significativo de f (0,133), enquanto os jovens e os
adultos apresentaram valores próximos entre si e não significativos (0,096 e 0,105,
respectivamente). Entretanto, considerando as populações individualmente, algumas
apresentaram valores altos e significativos nas três categorias estudadas. Nas plântulas,
as populações 1, 2 e 3 apresentaram valores significativos de f , sendo que os valores
mais expressivos foram encontrados nas duas populações exploradas (1 e 2). Entre os
jovens, a população 2 apresentou um valor de f significativo e, nos adultos, essa
significância não foi observada. Em geral, houve uma tendência de aumento nas
estimativas do índice de fixação na direção das populações exploradas, especialmente na
população 1 onde foi realizada exploração de forma extrativista.
Através do teste exato de Fisher (Tabela 4), verificou-se que algumas
populações não se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg, para a maioria dos
locos estudados. A amostra de plântulas da população 1 e as amostras de jovens das
populações 2 e 3 acusaram significância no teste exato de Fisher em 5 dos 8 locos,
portanto, em 8 locos estudados 5 deles não se encontram no equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Os locos EE48, EE8 e EE47 mostraram desvios significativos do equilíbrio
de HW em todas as categorias, sendo que esses mesmos locos apresentaram taxas
elevadas do índice de fixação, contribuindo significativamente para a manifestação de
endogamia nas populações. Entretanto, como o teste de EHW foi aplicado para
múltiplos locos, o nível de significância diminui quando a correção de Bonferroni é
considerada (Weir, 1996). Esta correção é particularmente importante para locos com
valores originais de p próximos de 0,05.
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Tabela 4. Probabilidade do Teste Exato de Fisher para aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, em três categorias de plantas com base em microssatélites.Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
LocosCategoria/PopulaçãoEE48 EE45 EE52 EE08 EE03 EE23 EE05 EE47
PlântulasPop. 1: Extrativismo 0,000 0,078 0,000 0,000 0,007 0,787 0,256 0,000Pop. 2: Manejo 0,000 0,449 0,000 0,000 0,376 0,304 0,154 0,000Pop. 3: Natural Ib 0,000 0,917 0,461 0,026 0,001 0,239 0,161 0,097Pop. 4: Natural SPA 0,099 0,662 0,082 0,000 0,164 0,309 0,029 0,002
JovensPop. 1: Extrativismo 0,012 0,498 0,000 0,000 0,625 0,080 1,000 0,013Pop. 2: Manejo 0,008 0,243 0,007 0,000 0,012 0,759 1,000 0,000Pop. 3: Natural Ib 0,002 0,131 0,019 0,000 0,009 0,924 1,000 0,037Pop. 4: Natural SPA 0,729 0,215 0,181 0,000 0,024 0,124 1,000 0,066
AdultosPop. 1: Extrativismo 0,000 0,094 0,001 0,000 0,662 0,542 0,336 0,062Pop. 2: Manejo 0,003 0,298 0,092 0,000 0,000 0,320 0,103 0,004Pop. 3: Natural Ib 0,000 0,521 0,626 0,000 0,041 0,207 1,000 0,000Pop. 4: Natural SPA 0,003 0,018 0,617 0,000 0,251 0,033 1,000 0,454
Uma análise das freqüências alélicas mostrou que todas as populações
estudadas apresentaram alelos exclusivos em quantidades expressivas nas três categorias
de plantas estudadas (Figura 3). No total, as três categorias apresentaram 25, 29 e 24
alelos exclusivos, respectivamente para plântulas, jovens e adultos, distribuídos nas
quatro populações. A população 3 apresentou valores elevados desses alelos nas três
categorias, enquanto a população 4 apresentou os menores valores em relação às demais.
Embora exista uma certa variação no número de alelos exclusivos entre populações, esta
variação parece estar mais relacionada às diferentes regiões do que propriamente
relacionada ao processo de exploração. Por outro lado, em função do elevado número de
alelos por loco, as freqüências alélicas podem ter sofrido o efeito da amostragem
estatística, uma vez que o tamanho das amostras empregado (~50) é limitado para
freqüências alélicas baixas. De qualquer maneira, a grande maioria desses alelos
48
apresentou freqüências inferiores a 0,03, portanto, tiveram pouca contribuição nas
estimativas dos parâmetros genéticos populacionais.
Figura 3 - Número de alelos exclusivos por categoria de plantas, em um total de 161alelos microssatélites encontrados em quatro populações de Euterpe edulis.Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
3.3.2 Estrutura Genética
A estrutura genética, avaliada através da análise da diversidade em populações
subdivididas (Nei, 1973), mostrou que a maior parte da variabilidade genética molecular
está concentrada dentro das populações (Tabela 5). No conjunto das populações, foram
observados baixos valores de divergência genética ( STG = 0,024; 0,021; 0,028 para
plântulas, jovens e adultos, respectivamente). Nas comparações aos pares, foram
observados valores maiores de divergência entre populações de diferentes regiões e
menores valores entre populações dentro da mesma região. Apesar dos baixos valores
observados nas diferentes comparações, todas as estimativas foram significativamente
diferentes de zero. Esta significância pode ter ocorrido devido ao grande número de
alelos existentes nos locos microssatélites, o que torna o teste estatístico extremamente
sensível.
0
2
4
6
8
10
12
Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4Populações
Plântulas Jovens Adultos
49
As estimativas de RST, apesar de mais elevadas, apresentaram um
comportamento similar ao GST. Entre as categorias de plantas as estimativas variaram de
0,033 a 0,048. Nas comparações aos pares, as estimativas variaram entre 0,004 a 0,091,
entretanto, manteve-se a tendência de uma maior divergência entre populações de
diferentes regiões. Com exceção da comparação 2 x 4, nos indivíduos adultos, todas as
demais estimativas foram significativamente diferentes de zero.
Tabela 5. Estimativas de parâmetros de estrutura genética populacional em Euterpeedulis com base em marcadores microssatélites, sendo: oH a heterozigosidade
observada, SH , TH e STD as diversidades genéticas dentro de populações,
total e entre populações, respectivamente. STG e STR : medidas de divergência
entre populações, tomadas aos pares. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Categoria / Combinação(a)oH SH TH STD STG STR
PlântulasPop.1 x Pop.2 0,666 0,794 0,815 0,021 0,025* 0,044*Pop.1 x Pop.3 0,677 0,790 0,810 0,020 0,024* 0,031*Pop.1 x Pop.4 0,682 0,780 0,794 0,013 0,017* 0,016*Pop.2 x Pop.3 0,674 0,784 0,794 0,010 0,013* 0,016*Pop.2 x Pop.4 0,679 0,775 0,794 0,019 0,024* 0,039*Pop.3 x Pop.4 0,691 0,770 0,801 0,031 0,038* 0,057*
Conjunto 0,678 0,782 0,801 0,019 0,024* 0,033*
JovensPop.1 x Pop.2 0,683 0,796 0,811 0,015 0,018* 0,049*Pop.1 x Pop.3 0,732 0,793 0,813 0,019 0,024* 0,018*Pop.1 x Pop.4 0,726 0,780 0,790 0,010 0,013* 0,037*Pop.2 x Pop.3 0,694 0,791 0,805 0,014 0,017* 0,021*Pop.2 x Pop.4 0,687 0,778 0,800 0,022 0,027* 0,091*Pop.3 x Pop.4 0,737 0,775 0,794 0,019 0,024* 0,069*
Conjunto 0,710 0,786 0,802 0,017 0,021* 0,048*
AdultosPop.1 x Pop.2 0,699 0,793 0,822 0,029 0,035* 0,058*Pop.1 x Pop.3 0,706 0,788 0,812 0,023 0,029* 0,071*Pop.1 x Pop.4 0,693 0,778 0,791 0,013 0,017* 0,025*Pop.2 x Pop.3 0,706 0,786 0,805 0,019 0,024* 0,004ns
Pop.2 x Pop.4 0,693 0,776 0,799 0,023 0,029* 0,054*Pop.3 x Pop.4 0,700 0,771 0,797 0,025 0,032* 0,067*
Conjunto 0,699 0,782 0,804 0,022 0,028* 0,045*(a) Extrativismo (1); Manejo (2); Natural Ib (3); Natural SPA (4)* P<0,05 (IC95%: 10.000 bootstraps); ns Não significativo
50
As distâncias genéticas de Nei (1978) calculadas entre as populações
apresentaram um comportamento similar às estatísticas GST e RST (Figura 4). Estas
variaram de 0,053 a 0,146 para as plântulas, 0,046 a 0,105 para os jovens e 0,063 a
0,154 para os adultos. A correlação cofenética dos agrupamentos UPGMA foi alta
(0,750, 0,820 e 0,823, respectivamente). Nas três categorias são observados dois
agrupamentos, o primeiro formado pelas populações oriundas de Ibirama (2 e 3) e o
segundo agrupamento formado pelas populações oriundas de São Pedro de Alcântara (1
e 4). Este comportamento demonstra que a exploração até o momento teve pouca
influência sobre o padrão de estruturação molecular, uma vez que os maiores níveis de
divergência foram encontrados entre populações de diferentes regiões.
Figura 4 - Dendrogramas UPGMA de quatro populações de E. edulis com diferentesníveis de ação antrópica usando a distância genética não viesada de Nei(1978). Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
51
Figura 4 (cont.) - Dendrogramas UPGMA de quatro populações de E. edulis comdiferentes níveis de ação antrópica usando a distância genética não viesadade Nei (1978). Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
3.4 Discussão
Os oito locos microssatélites empregados neste estudo detectaram altos níveis
de variação genética molecular, confirmando o alto conteúdo de informação genética
desses marcadores para os estudos de parâmetros genéticos populacionais de Euterpe
edulis (Gaiotto et al., 2003). Esta bateria de marcadores microssatélites mostrou-se
altamente eficiente para explicar a diversidade gênica, pois detectou 84,4% da máxima
diversidade possível (0,931), tomando-se por base o número médio de alelos por loco
das três categorias, onde He máx.=(Ā-1)/Ā. Considerando a informação molecular como
um indicador da diversidade gênica nos demais locos, a alta diversidade encontrada na
espécie apresenta especial relevância pela possibilidade de formação de novos
recombinantes nas próximas gerações, o que implica na capacidade de adaptação a
novos microambientes e também na manutenção da dinâmica populacional da espécie,
conforme discutido em Barret & Kohn (1991) e Reis (1996a).
A análise das estimativas dos parâmetros de diversidade, tais como o número de
alelos por locos e a diversidade gênica, revelou que as populações naturais e exploradas
apresentaram níveis similares de diversidade nas três categorias de plantas estudadas. A
52
manutenção dos níveis de heterozigosidade ao longo das gerações, na ausência de fluxo
gênico, é dependente do tamanho efetivo populacional (Ne), do número de gerações
transcorridas (t) e da heterozigosidade inicial (Ho), tal que Ht = (1 – 1/2Ne)tHo, para Ne
constante (Crow & Kimura, 1970). Assim, verifica-se que alterações significativas nos
níveis de heterozigosidade em algumas gerações somente são possíveis reduzindo-se
drasticamente o tamanho efetivo; ao contrário poucas alterações devem ser observadas.
Considerando que o tamanho efetivo das populações exploradas ainda seja elevado,
especialmente na população 2 (Ibirama), e que o número de gerações transcorridas
nessas populações é baixo (pelo menos 15 anos por geração), os níveis de diversidade
gênica até o momento não foram afetados pelo processo de exploração.
Young et al. (1993) estudou os efeitos da deriva genética em populações
remanescentes de Acer saccharum, comparando os níveis de variação alozímica entre
amostras similares de oito populações com tamanhos reduzidos e oito grandes
populações intactas da espécie. As populações remanescentes menores do que 96
árvores não mostraram sinais de redução na variação genética, sugerindo que o efeito da
deriva genética foi pequeno no período de 150-200 anos (2-3 gerações), desde a
ocorrência da fragmentação florestal. Por outro lado, em populações exploradas de
Tabebuia cassinoides, Sebbenn et al. (2000) observou perdas de alelos raros e uma
significativa redução na heterozigosidade observada e na diversidade gênica nas
primeiras gerações após a exploração. Conforme Young et al. (1996), as perdas de
variação genética são mais prováveis devido à formação de gargalos genéticos
decorrente da exploração e pela subseqüente endogamia em pequenas populações, do
que pelos efeitos da ação contínua da deriva genética aleatória.
No entanto, a ocorrência de fluxo gênico a partir de populações da vizinhança
pode ter um importante papel na manutenção dos níveis de diversidade nas populações
exploradas (Young et al., 1996 e Hall et al., 1996). Prober & Brown (1994) observaram
alguns efeitos do isolamento das populações sobre a variação genética. Pequenas
populações remanescentes (<500 indivíduos reprodutivos) de Eucaliptus albens que
estavam a menos de 250 m de uma grande população não exibiram redução na riqueza
alélica, enquanto os remanescentes mais isolados de tamanhos similares sofreram forte
53
erosão genética. De fato, foi observada a presença de populações de E. edulis em bom
estado de conservação próximo das duas populações exploradas, o que deve ter
contribuído na manutenção dos níveis de diversidade dessas populações. Entretanto, é
possível que no decorrer de várias gerações esses níveis de diversidade venham a
diminuir, principalmente na população com exploração extrativista, onde o tamanho
efetivo dos indivíduos adultos teve a maior redução.
As estimativas dos índices de fixação ( f ) variaram consideravelmente entre os
locos dentro das populações e foram relativamente maiores do que outros trabalhos já
realizados com a espécie (Reis et al., 1998 e Gaiotto et al., 2003). O tamanho finito de
populações na natureza tem sido considerado como uma das causas para explicar a
variação existente entre os locos. Coelho & Vencovsky (2003) verificaram por análise
de simulação que, em populações de tamanho finito, assumindo locos em equilíbrio de
ligação, o coeficiente de endogamia tem um comportamento independente entre os locos
ao longo das gerações. Desta forma, em populações com baixo tamanho efetivo, uma
amostragem numa determinada geração pode resultar em uma variação acentuada das
estimativas entre os locos. Por outro lado, os valores de f em alguns locos podem ter
sido superestimados em decorrência da amostragem estatística ou da interpretação
errônea das bandas no gel. Em locos hipervariáveis o emprego de amostras pequenas
pode causar distorções nas freqüências genotípicas, uma vez que o número de indivíduos
genotipados pode ser insuficiente para que sejam encontrados indivíduos em todas as
classes genotípicas possíveis (Weir, 1996 e Collevatti et al., 2001b). Uma análise com
dados colapsados (alelo mais freqüente vs. demais alelos, Tabela 6) visando testar o
efeito do tamanho das amostras na estimativa do coeficiente de endogamia, revelou uma
redução nas estimativas de f das três categorias de plantas nas quatro populações
estudadas, mostrando que o tamanho da amostra empregado pode ter contribuído na
magnitude dessas estimativas. Entretanto, verificou-se que o erro associado a cada
estimativa teve um aumento significativo, o que prejudica a interpretação desses novos
resultados.
54
Tabela 6. Estimativas dos coeficientes de endogamia de Wright ( f ) em locos
microssatélites de três categorias de plantas em quatro populações de E.edulis, agrupando os alelos, exceto o mais freqüente (dados colapsados).Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Plântulas Jovens AdultosPopulação f IC95% f IC95% f IC95%
Pop. 1: Extrativismo 0,091 ns -0,187 a 0,375 0,071 ns -0,152 a 0,321 0,040 ns -0,177 a 0,223Pop. 2: Manejo 0,053 ns -0,140 a 0,247 0,147 ns -0,078 a 0,419 0,079 ns -0,224 a 0,375Pop. 3: Natural Ib 0,054 ns -0,134 a 0,239 -0,013 ns -0,289 a 0,295 -0,002 ns -0,148 a 0,159Pop. 4: Natural SPA 0,085 ns -0,194 a 0,399 -0,118 ns -0,391 a 0,151 0,015 ns -0,268 a 0,294
Média 0,071 ns -0,158 a 0,273 0,024 ns -0,208 a 0,284 0,034 ns -0,188 a 0,248ns Não significativo (IC95%: 10.000 bootstraps)
O coeficiente de endogamia também pode ser influenciado pelo processo de
interpretação das bandas no gel. Conforme Aldrich et al. (1998), dois aspectos devem
ser observados no momento da interpretação. Primeiro, na presença de alelos nulos, a
quantidade de heterozigotos observada pode ser subestimada, elevando o coeficiente de
endogamia. Segundo, em locos hipervariáveis, o aumento do coeficiente de endogamia
pode ser o resultado da interpretação de homozigotos em lugar de heterozigotos quando
alelos possuem tamanhos muito próximos entre si e não podem ser distinguidos uns dos
outros, principalmente na presença de bandas duplicadas (stutter bands). Este fato pode
ter ocorrido com o loco EE08, o qual teve a maior contribuição para a elevação do
coeficiente de endogamia das populações. Da mesma forma, os desvios do equilíbrio de
Hardy-Weinberg observados nos locos EE8, EE48 e EE47, podem ter ocorrido em
função desses aspectos (alelos nulos, bandas duplicadas) ou também pela amostragem
estatística (Weir, 1996 e Collevatti et al., 2001b).
De qualquer maneira, os níveis de endogamia detectados pelo índice de fixação
( f ) foram ligeiramente superiores nas populações exploradas, principalmente entre as
categorias jovens. Uma das conseqüências da redução do número de indivíduos
reprodutivos em populações naturais é o aumento da autofecundação e dos cruzamentos
biparentais, levando ao aparecimento de endogamia nas gerações futuras (Bawa &
Krugman, 1990; Murawski, 1995 e Aldrich et al., 1998). Sebbenn et al. (2000),
55
verificaram um aumento acentuado no nível de endogamia em uma população explorada
de Tabebuia cassinoides, ocasionado pelo aumento da taxa de autofecundação. Em um
estudo similar, comparando populações naturais e exploradas de Shorea megistophylla,
Murawski et al. (1994) encontraram diferenças nos níveis de endogamia entre as
populações com alterações no comportamento reprodutivo das populações exploradas,
como o aumento da autofecundação. Entretanto, a biologia reprodutiva de E. edulis
dificulta a ocorrência da autofecundação, pois a espécie apresenta protandria acentuada,
onde a abertura das flores femininas ocorre somente após o término da florada masculina
(Reis et al., 1993 e Mantovani & Morellato, 2000). Além disso, estudos empregando
marcadores alozímicos (Reis et al., 1998) e microssatélites (Gaiotto et al., 2003), têm
mostrado que a espécie se reproduz preferencialmente por fecundação cruzada e
apresenta elevadas taxas de fluxo gênico. Por outro lado, é possível que a exploração
cause alterações no comportamento dos polinizadores, aumentanto a probabilidade da
ocorrência de cruzamentos não aleatórios ou biparentais, o que aumenta a chance de
cruzamentos entre indivíduos relacionados (Aldrich & Hamrick, 1998 e Dayanandan et
al., 1999). Em E. edulis,os cruzamentos não aleatórios podem ser ainda mais acentuados
devido a diferença na densidade de floração no decorrer do período de florescimento da
espécie, que pode durar de quatro a cinco meses, além da variação na quantidade de
indivíduos que se reproduzem anualmente (Reis et al., 1993 e Mantovani & Morellato,
2000). Assim, o aumento do índice de fixação entre os indivíduos mais jovens das
populações exploradas pode ter sido causado por alterações no comportamento
reprodutivo dessas populações. Embora os resultados foram similares entre os dois
sistemas de exploração estudados, a endogamia observada entre os jovens da população
manejada em Ibirama pode ser o reflexo de outros episódios de exploração ocorridos no
passado, uma vez que essas plantas são oriundas de eventos reprodutivos anteriores ao
manejo. Este fato também pode ser o responsável pelo alto nível de endogamia
observado entre as plântulas dessa mesma população.
A distribuição da variabilidade genética molecular entre e dentro de populações
revelou que mais de 95% da variabilidade genética da espécie encontra-se distribuída
dentro de populações, com uma baixa divergência entre populações. Tais resultados são
56
compatíveis com os de outras populações da espécie estudadas anteriormente (Reis,
1996a e Gaiotto et al., 2003). Além disso, esses resultados concordam com diferentes
estudos realizados com espécies tropicais, onde espécies que se reproduzem por
alogamia ou por sistema misto e que têm dispersão de sementes e pólen a longas
distâncias, mantêm a maior parte de sua variabilidade genética dentro das populações
(Hamrick & Godt, 1990). No entanto, a baixa diferenciação entre as populações naturais
e as exploradas indica que a intervenção, até este momento, não causou grandes
mudanças na estrutura genética das populações. Verificou-se que as maiores
divergências ocorreram entre as populações de diferentes regiões, principalmente entre
as duas populações naturais não exploradas, o que sugere ser o resultado da estrutura
genética pré-existente. Estes resultados reforçam o modelo de isolamento por distância
(Wright, 1943) para a espécie, pois indicam uma tendência de maior diferenciação com
distâncias maiores. Além disso, conforme Reis et al. (1998) a distribuição contínua e
abundante da espécie, originalmente, em toda a área do domínio da floresta Atlântica
produz uma expectativa que dá suporte a este modelo.
3.5 Conclusões
A informação genética obtida com oito locos microssatélites revelou que o
processo de exploração, até o momento, não causou alterações nos níveis de diversidade
e na estrutura genética das populações de E. edulis. Entretanto, a redução da população
de cruzamentos resultou em alterações no comportamento reprodutivo dos indivíduos,
promovendo um aumento nos níveis de endogamia nas coortes mais jovens das
populações exploradas. Embora os efeitos tenham sido pequenos, a persistência do
processo de exploração, especialmente o sistema extrativista de exploração, poderá
elevar ainda mais os níveis de endogamia e favorecer a ação da deriva genética. No
decorrer de várias gerações, esses efeitos poderão levar a espécie à depressão por
endogamia, perdas de diversidade e alteração da estrutura genética das populações.
Contudo, os resultados obtidos neste estudo indicaram questões adicionais a serem
57
estudadas. Em função do elevado nível de variabilidade dos locos microssatélites
observado em E. edulis, recomenda-se aumentar o tamanho das amostras (>100) visando
otimizar a informação genética proporcionada por esses marcadores. Além disso, novos
estudos são necessários sobre os efeitos do manejo tecnificado, uma vez que os
resultados obtidos neste estudo podem ter sido influenciados por outros eventos de
exploração ocorridos no passado e pelas populações existentes nas proximidades devido
ao elevado fluxo gênico da espécie. Finalmente, tendo em vista as tendências observadas
neste estudo, recomenda-se o monitoramento de áreas críticas de exploração da espécie
em gerações futuras.
4 ESTRUTURA GENÉTICA E SISTEMA REPRODUTIVO DE POPULAÇÕES
DE Euterpe edulis MART. AVALIADOS COM MARCADORES
MICROSSATÉLITES E ISOENZIMAS
Resumo
O objetivo deste estudo foi comparar a informação genética obtida commarcadores alozímicos e microssatélites em relação à estrutura genética e sistemareprodutivo de populações de Euterpe edulis com diferentes níveis de ação antrópica.Quatro populações naturais, sendo duas não perturbadas e duas exploradas, foramexaminadas usando oito locos microssatélites e dez locos alozímicos. Três categorias,envolvendo plântulas, jovens e adultos, foram amostradas em cada população. Nacomparação dos marcadores, os microssatélites revelaram um maior grau depolimorfismo em relação às isoenzimas, mas a análise do sistema reprodutivo ( mt = 0,99para microssatélites e mt = 1,00 para isoenzimas) e as medidas relativas de estrutura
genética como o coeficiente de endogamia de Wright (FIS) e o coeficiente dediferenciação genética de Nei (GST) foram da mesma ordem de magnitude para os doisconjuntos de marcadores. Alguns locos alozímicos foram afetados pela seleção,revelando um aumento significativo na freqüência de heterozigotos na direção do estádioadulto. A informação genética conjunta desses marcadores revelou que os efeitos daexploração foram pouco pronunciados até o momento, exceto um aumento nos níveis deendogamia entre os indivíduos jovens das populações exploradas. Portanto, ambos osmarcadores foram adequados no estudo da estrutura genética e sistema reprodutivoassim como no monitoramento das conseqüências genéticas da exploração da espécie.
Palavras-chave: espécie tropical; exploração florestal; microssatélites; isoenzimas;biologia reprodutiva; heterozigosidade; seleção; endogamia.
59
Genetic structure and mating system of Euterpe edulis Mart. populations
investigated with microsatellite and allozymic markers
Summary
The aim of this study was to compare the genetic information obtained from
allozymic and microsatellite markers on the genetic structure and mating system in
undisturbed and exploited populations of Euterpe edulis Mart. Three categories of
plants, from seedlings to adults, sampled from two undisturbed and two exploited
populations, were examined using eight microsatellite loci and ten allozymic loci. As
expected, microsatellite markers showed a much higher degree of polymorphism than
allozymes, but relative measures of multilocus outcrossing rate ( mt = 0.99 for
microsatellites and mt = 1.00 for allozymes) as well as measures of genetic structure such
as Wright’s inbreeding coefficient (FIS) and Nei’s coefficient of genetic differentiation
(GST) were similar for the two sets of markers. Some allozymic loci indicated the action
of natural selection, showing a significant increase in the heterozygote frequency
towards the adult stages. Both markers displayed few pronounced effects of the
exploitation process on variability and genetic structure, with the exception of an
increase in the inbreeding levels among seedlings and juveniles of the exploited
populations. Therefore, both markers were appropriate for the study of population
genetic structure and mating system of E. edulis and also in the monitoring of the
genetic consequences of palm heart exploitation.
Keywords: tropical tree; forest exploitation; microsatellites; isozymes; mating system;
heterozygosity; selection; inbreeding.
60
4.1 Introdução
Nas últimas décadas, os principais marcadores genéticos empregados nos
estudos de populações em várias espécies foram as isoenzimas (Lewontin, 1991 e
Hedrick, 1999). Embora o número de outros marcadores (marcadores de DNA) tenha
aumentado significativamente nos últimos anos, as isoenzimas continuam sendo as mais
utilizadas nos estudos de genética de populações (Hamrick et al., 1992; Torggler et al.,
1995; Bergmann & Hattemer, 1998; Sebbenn et al., 2000; Mariot et al., 2002; Auler et
al., 2002 e Conte et al., 2003). Um aspecto a ser considerado nos marcadores alozímicos
refere-se à neutralidade desses marcadores. Embora a maioria dos trabalhos empregando
marcadores alozímicos tenha se baseado no pressuposto da sua neutralidade, alguns
trabalhos têm apontado a existência de valor adaptativo associado ao polimorfismo
protéico (Hamrick, 1982; Bergmann & Ruetz, 1991; Gillespie, 1992; Torggler et al.,
1995; Eanes, 1999 e Conte et al., 2003). Esse fato tem gerado algumas controvérsias
quanto à utilização desses marcadores em genética populacional, pois tem envolvido a
seleção na manutenção da diversidade protéica. No entanto, essa controvérsia não
constitui uma divergência completa, pois a idéia mais aceita é a de que somente algumas
das muitas variantes de enzimas reveladas por eletroforese são fixadas por seleção e que
o restante da variação deve ser neutra (Futuyma, 1992).
O recente desenvolvimento de técnicas para o exame de regiões altamente
variáveis do genoma tem aumentado expressivamente o número de aplicações dos
marcadores genéticos (Jarne & Lagoda, 1996; Chase et al., 1996; Haig, 1998; Souza,
2001 e Grattapaglia, 2001). Entre eles, os marcadores microssatélites são atualmente
considerados como os que apresentam o maior conteúdo de informação genética por
loco, pois são altamente polimórficos quando comparados a outras classes de
marcadores (Rafalski et al., 1996; Chase et al., 1996 e Souza, 2001). Em função de que a
maioria das seqüências microssatélites estão localizadas em regiões não codificadoras e
nenhuma evidência exista em relação ao papel das seqüências simples repetidas em
genomas eucariotos, eles são provavelmente mais neutros do que marcadores funcionais
como as isoenzimas (Queller et al., 1993). O uso de microssatélites teve uma grande
61
contribuição na melhoria das estimativas de parâmetros genéticos, especialmente em
espécies com diversidade baixa ou não detectada por outros marcadores (Paetkau, 1995).
Atualmente, esses marcadores têm sido altamente difundidos nos estudos de genética de
populações (Dayanandan et al., 1999; Collevatti et al., 2001b; Yamamoto et al., 2002;
Gao et al., 2002; Zucchi et al., 2003; Gaiotto et al., 2003 e Alves et al., 2003).
A diferença mais importante entre as duas categorias de marcadores refere-se
aos seus respectivos níveis de polimorfismo. Os marcadores microssatélites são muito
mais polimórficos do que as isoenzimas em populações naturais, com mais alelos, e
heterozigosidades geralmente superiores a 0,5 (Estoup et al., 1998). As taxas de mutação
em locos microssatélites foram estimadas na ordem de 10-5 a 10-2 (Amos et al., 1996),
que é duas a quatro ordens de magnitude superiores em relação às isoenzimas.
Particularmente, o alto nível de variação nos locos microssatélites sugere que eles sejam
mais sensíveis do que as isoenzimas em relação a mudanças no tamanho da população
de cruzamentos, estrutura e taxa de dispersão. Em populações naturais, alguns estudos
relataram resultados divergentes nas comparações desses marcadores, embora os
microssatélites tenham sido apontados como mais informativos (Streiff et al., 1998;
Estoup et al., 1998 e Gao et al., 2002). Entretanto, de acordo com Hedrick (1999),
devido ao alto nível de polimorfismo e à natureza mutacional, cuidados devem ser
tomados na interpretação dos dados de microssatélites, uma vez que a informação que
eles fornecem pode ser um pouco diferente daquelas obtidas com marcadores
tradicionalmente menos variáveis.
Euterpe edulis Mart. (Arecaceae) é uma espécie nativa com uma ampla
distribuição no subbosque da Floresta Tropical Atlântica Brasileira. A espécie é valiosa
economicamente por ser a principal fonte de extração de palmito na floresta Atlântica.
Em populações naturais, a espécie apresenta uma alta densidade e uma estrutura
demográfica na forma de "J reverso" (Reis et al., 1996). A inflorescência de E. edulis
apresenta flores unissexuadas, com acentuada protandria, e polinizadas por insetos (Reis
et al., 1993 e Mantovani & Morellato, 2000). Devido à alta produção anual de frutos, a
espécie é um importante recurso alimentar para a fauna e, de acordo com o conceito de
Terborgh (1986), pode ser considerada uma espécie-chave no ecossistema. Alguns
62
estudos empregando marcadores alozímicos (Reis, 1996a; Reis et al., 1998 e Conte et
al., 2003) e microssatélites (Gaiotto et al., 2003) em populações naturais, revelaram que
a espécie possui uma alta taxa de fecundação cruzada, alta variabilidade genética dentro
das populações e baixa divergência entre populações. Entretanto, a situação atual das
populações naturais da espécie é de grande fragmentação e uma reduzida área de
ocorrência (Reis et al., 2000a). Embora um sistema de manejo tecnificado tenha sido
proposto para a espécie (Reis et al., 1992; Ribeiro et al., 1994; Reis et al., 1998; Reis et
al., 2000b e Reis et al., 2000d), a intensiva exploração realizada desde a década de 1960
resultou na eliminação de várias populações e em sérias alterações das populações
remanescentes (Galetti & Fernandez, 1998; Reis & Guerra, 1998 e Batista et al., 2000).
Segundo Reis et al. (1998), a base para a sustentabilidade de uma espécie sob manejo é a
manutenção de seus componentes genéticos e ecológicos. Dessa forma, o manejo deve
ser realizado sob uma perspectiva conservacionista, onde a dinâmica populacional, a
estrutura genética das populações naturais, bem como suas interações com as outras
espécies do ambiente sejam preservadas.
O objetivo deste estudo foi comparar a informação genética obtida com
marcadores alozímicos e microssatélites em relação à estrutura genética e o sistema
reprodutivo de populações de Euterpe edulis com diferentes níveis de ação antrópica. O
estudo foi baseado em duas hipóteses: (i) os marcadores microssatélites, devido ao seu
alto nível de polimorfismo, são mais informativos para estimação de parâmetros
genéticos em relação aos marcadores alozímicos; e (ii) em determinados locos
alozímicos, o processo de recrutamento de plantas jovens resulta em um aumento na
freqüência de heterozigotos na direção dos indivíduos adultos, portanto, os marcadores
alozímicos são capazes de detectar efeitos de seleção. A comparação da informação
genética realizada neste estudo deverá complementar o estudo prévio desenvolvido por
Conte et al. (2004), onde foram investigados, através de marcadores microssatélites, os
efeitos do manejo na estrutura genética de populações de E. edulis.
63
4.2 Material e Métodos
4.2.1 Populações e Sistema de Amostragem
O estudo foi realizado em duas localidades do Estado de Santa Catarina, Brasil,
sendo uma no Município de Ibirama, e outra no Município de São Pedro de Alcântara.
Em cada localidade foram escolhidas duas áreas de ocorrência natural de E. edulis, uma
sem influência antrópica (população natural) e outra onde foi realizada a extração de
palmito (população explorada), totalizando quatro populações (Tabela 1). Dois sistemas
de exploração foram considerados no presente estudo: (i) extrativismo (São Pedro), onde
a exploração é realizada através da extração da maioria dos indivíduos acima de 2 m de
altura, permanecendo poucos indivíduos reprodutivos na área; e (ii) manejo (Ibirama), o
qual caracteriza-se pela retirada apenas dos indivíduos acima de 9 cm de DAP,
respeitando-se a permanência de pelo menos 50 indivíduos reprodutivos por hectare,
sendo tais critérios definidos pela legislação florestal do Estado de Santa Catarina.
A cobertura vegetal das duas regiões é de Floresta Ombrófila Densa,
pertencente ao domínio da Mata Atlântica (IBGE, 1988). Apesar de a situação atual das
populações da espécie ser de intensa fragmentação e degradação, existem muitos
fragmentos remanescentes em bom estado de conservação, como é o caso das duas
populações naturais amostradas neste estudo. Além disso, nas duas regiões estudadas os
fragmentos florestais apresentam uma certa conectividade em função da proximidade
entre os fragmentos e, portanto, populações degradadas podem sofrer a influência de
populações não degradadas do seu entorno. A história de exploração nas populações
estudadas é bastante diferente. Em São Pedro, a exploração foi realizada em diferentes
episódios, entre as décadas de 1970 e 1990, período em que a legislação apresentava
poucas restrições à exploração de palmito. Em Ibirama, embora a população possa ter
sofrido exploração no passado, o manejo foi realizado há três anos, com a retirada dos
indivíduos passíveis de corte, de acordo com os critérios técnicos mencionados acima. A
distância geográfica entre as duas regiões é de aproximadamente 150 km. Na região de
64
Ibirama, a distância entre as duas populações é de aproximadamente 2 km, enquanto em
São Pedro essa distância é de 5 km.
Para os estudos de variabilidade e estrutura genética, em cada população foram
coletadas amostras de plantas pertencentes a três categorias (Figura 1), de acordo com a
classificação de Reis et al. (1996), visando representar os indivíduos em diferentes fases
de desenvolvimento dentro de cada nível de ação antrópica. Assim, foram amostradas:
i) Plântulas - indivíduos com até 10 cm de altura de inserção da folha
flecha, representando os indivíduos da última frutificação;
ii) Jovem II - plantas entre 30 cm e um metro de altura de inserção, sem o
estipe exposto e com 4 a 5 folhas nitidamente pinadas;
iii) Adultos - plantas em fase reprodutiva.
As coletas foram realizadas em três pontos distribuídos aleatoriamente em cada
população, onde foram amostrados cerca de 50 indivíduos por categoria. Para o estudo
do sistema reprodutivo, foram coletadas sementes de 13 plantas adultas distribuídas
aleatoriamente na população natural de São Pedro. As sementes foram germinadas em
casa de vegetação, sob condições ambientais controladas. Treze filhas de cada adulto
foram postas para crescer em viveiro com cobertura de sombrite. Estas progênies foram
utilizadas na estimação da taxa de cruzamento da população amostrada.
4.2.2 Eletroforese de Isoenzimas e Amplificação dos Locos Microssatélites
Os marcadores alozímicos foram revelados por eletroforese horizontal, usando
como meio suporte o gel de amido (penetrose 30), conforme as recomendações de
Kephart (1990) e Alfenas et al. (1998). A migração e separação das enzimas no gel foi
realizada em sistema contínuo de eletroforese, utilizando-se como sistemas de corridas
os tampões Tris Citrato (Alfenas et al.,1991) e Citrato Morfolina (Cheliack & Pittel,
1984). Um total de 10 sistemas enzimáticos foram usados a saber: α-esterase (α-EST,
EC 3.1.1.1), shiquimato desidrogenase (SKDH, EC 1.1.1.25), peroxidase (PRX, EC
1.11.1.7), 6-fosfogluconato desidrogenase (PGDH, EC 1.1.1.44), nicotinamida adenina
65
dinucleotídeo desidrogenase (NADHDH, EC 1.6.99.3), malato desidrogenase (MDH, EC
1.1.1.37), fosfoglucoisomerase (PGI, EC 5.3.1.9), isocitrato desidrogenase (IDH, EC
1.1.1.42), fosfoglucomutase (PGM, EC 5.4.2.2), e glucose-6-fosfato desidrogenase
(G6PDH, EC 1.1.1.49). Os procedimentos de coloração bem como a nomenclatura dos
locos e alelos é idêntica aos estudos prévios realizados (Conte et al., 2003). Entre os 10
sistemas empregados, 16 zonas com atividade enzimática foram observadas, revelando
10 locos polimórficos. Cada zona que apresentasse um comportamento aparentemente
independente das outras e com segregação mendeliana foi considerada um loco
alozímico, levando em consideração a possível estrutura quaternária de cada enzima em
questão (Kephart, 1990).
A extração do DNA genômico seguiu o procedimento padrão CTAB (Ferreira
& Grattapaglia, 1998). Um total de oito locos microssatélites previamente desenvolvidos
e otimizados para E. edulis (Gaiotto et al., 2001) foram também usados na genotipagem
de todos os indivíduos amostrados (Tabela 2). As reações de polimerização em cadeia
(PCR) foram realizadas em condições específicas conforme descrito em Gaiotto et al.
(2001). Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel
desnaturante de poliacrilamida 4%, TBE 1x, corrida a 60W/1300V/46mA por 1 hora,
usando como marcador “ladder” 10 pb. Os géis foram corados com nitrato de prata
conforme descrito em Creste et al. (2001).
4.2.3 Análise Estatística
A comparação entre os tipos de marcadores foi feita através de estimativas de
parâmetros genéticos. As freqüências genotípicas de cada loco foram submetidas ao
teste exato de Fisher para verificar a aderência às proporções de Equilíbrio de Hardy-
Weinberg, conforme definido por Weir (1996), utilizando o programa TFPGA (Miller,
1997). Este teste foi feito por meio do método convencional de Monte Carlo, utilizando
10 batches (grupos) com 1.000 permutações por batch.
A variabilidade genética molecular dentro das populações foi quantificada pelo
número médio de alelos por loco (A) e pelas heterozigosidades observada (Ho) e
66
esperada (He) sob equilíbrio de Hardy-Weinberg para cada população (Nei, 1978),
utilizando o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2000). O índice de fixação (f ou FIS de
Wright) de cada população foi estimado por análise de variância, cuja significância foi
testada pelo procedimento de reamostragem sobre locos, utilizando 10.000 bootstraps,
buscando quantificar a variação entre os locos. Para investigar possíveis efeitos de
seleção em locos alozímicos, foram comparadas as taxas de heterozigotos (Ho) entre as
categorias de plantas dentro das populações naturais. A significância dessas diferenças
foi testada por análise de permutação, utilizando o programa FSTAT (Goudet, 2001)
A estrutura genética molecular entre populações foi investigada através da
análise da diversidade em populações subdivididas de Nei (Nei, 1973, 1977,1987), sob
modelo fixo para o efeito de populações, visto que algumas populações amostradas não
se enquadram no modelo aleatório por terem sofrido alterações pela ação antrópica. A
estimação dos parâmetros (HS, HT, DST, GST) foi realizada utilizando o programa FSTAT
(Goudet, 2001) e a significância testada pelo procedimento de reamostragem do tipo
bootstrap, utilizando 10.000 reamostragens sobre locos.
O sistema de reprodução de Euterpe edulis foi analisado com base no modelo
de cruzamento misto de Ritland & Jain (1981), através do programa "Multilocos MLTR"
(Ritland, 1997). O modelo assume que as plântulas resultam de uma mistura de
cruzamentos aleatórios e autofecundação, cujas pressuposições básicas são: (i) que o
conjunto de pólen é homogêneo para os cruzamentos com todos os genótipos maternos;
(ii) que os alelos de diferentes locos segregam independentemente e; (iii) que os locos
não são afetados pela seleção ou mutação entre o evento reprodutivo e a análise (Ritland
& Jain, 1981 e Ritland, 1990). Foram estimados os seguintes parâmetros: 1) taxa de
cruzamento multilocos da população (tm); 2) taxa de cruzamento média unilocos da
população (ts); 3) taxa de cruzamento entre aparentados (tm - ts); 4) coeficiente de
endogamia dos genótipos maternos (f); 5) correlação de taxa de cruzamento dentro de
progênies ou a variação de t entre as plantas-mãe (rt); 6) correlação de paternidade de
cruzamento entre dois irmãos, ou a proporção de irmãos completos entre os irmãos de
cruzamento dentro das progênies (rp); e 7) freqüência gênica do pólen (p) e dos óvulos
(o). O erro padrão da média das estimativas foi obtido pelo procedimento de
67
reamostragem do tipo bootstrap, utilizando 10.000 reamostragens sobre progênies, tendo
em vista a obtenção de estimativas de variação entre as progênies.
A taxa de cruzamento aparente (ta) foi obtida a partir das estimativas do
coeficiente de endogamia ou índice de fixação alélica (f ou FIS) de cada população,
sendo pressuposta a existência de equilíbrio de endogamia, através da relação entre ataxa de cruzamento e a endogamia, ou seja, )ˆ1()ˆ1(ˆ ffta +−= .
4.3 Resultados
4.3.1 Polimorfismo de Marcadores
Na análise de locos alozímicos, um total de 41 alelos foi identificado nas
amostras, envolvendo as três categorias de plantas e quatro populações. Entre os 16
locos analisados, seis foram monomórficos (α-Est-1, α-Est-2, Pgdh-1, Nadhdh-1, Mdh-
2, Idh-1) e 10 foram polimórficos (Skdh-1, Prx-2, Prx-3, Prx-4, Prx-5, Pgdh-2, Mdh-1,
Pgi-2, Pgm-1, G6pdh-1). O loco Prx-5 apresentou um baixo nível de polimorfismo, com
o alelo mais freqüente próximo da fixação em todas as categorias analisadas. Entretanto,
alguns locos mostraram um expressivo polimorfismo (Prx-3, Prx-4, Pgm-1, com quatro
alelos cada, e Pgdh-2, com cinco alelos, Figura 5). Todos os oito locos microssatélites
empregados neste estudo foram polimórficos. Um total de 161 alelos foi detectado nas
amostras. Os locos EE48 e EE47 (Figura 2) foram os mais polimórficos com 24 e 26
alelos, respectivamente, enquanto o loco menos polimórfico foi o EE5, com 13 alelos.
Entretanto, os demais locos também apresentaram alto polimorfismo, com um número
de alelos variando entre 17 e 24.
Figura 5 - Perfil de um gel de amido mostrando o elevado nível de polimorfismo no locoPghd-2 em Euterpe edulis. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
68
4.3.2 Variabilidade Genética Intrapopulacional
As medidas de variação genética dentro de populações foram computadas
separadamente para marcadores alozímicos e microssatélites (Tabela 7). Em média,
foram analisados 52 indivíduos por categoria por população. Conforme esperado, as
estatísticas (A, Ho, He) foram muito mais expressivas nos locos microssatélites do que
nos alozímicos. Em dez locos alozímicos polimórficos observaram-se as seguintes
amplitudes de variação das estimativas: número de alelos por loco: 3,05 a 3,15;
diversidade gênica: 0,416 a 0,431; e heterozigosidade observada: 0,378 a 0,403. Em oito
locos microssatélites, a variação observada foi a seguinte: número de alelos por loco:
14,12 a 14,72; diversidade gênica: 0,781 a 0,785; e heterozigosidade observada: 0,678 a
0,709. Em relação à máxima diversidade gênica possível (He máx.=(Ā-1)/Ā), tomando-se
por base o número médio de alelos por loco das três categorias de ambos os marcadores,
verificou-se que os marcadores alozímicos detectaram 62,5% dessa diversidade máxima
possível (0,678), enquanto os marcadores microssatélites detectaram 84,0% dessa
mesma diversidade máxima possível (0,931).
Embora os valores variaram entre populações, os padrões de diversidade
genética com locos alozímicos dentro delas são consistentes com os dos locos
microssatélites. Em quase todas as populações, ambos os marcadores demonstraram
haver uma certa deficiência de heterozigotos, visto que os valores de oH foram
ligeiramente inferiores aos de eH (Tabela 7). Valores altos e significativos do índice de
fixação ( f ) foram observados, especialmente nos marcadores microssatélites, indicando
desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg, portanto também de cruzamentos aleatórios.
De modo geral, ambos os marcadores revelaram uma tendência de redução dos valores
de f na direção das populações não exploradas (3 e 4). Nessas populações, os valores
de oH dos indivíduos adultos foram superiores em relação às categorias mais jovens. De
fato, uma análise de permutação (Goudet, 2001) revelou que o valor de oH dos
69
indivíduos adultos da população 4 é significativamente diferente (P<0,05) do valor de
oH das plântulas.
Tabela 7. Estimativas de parâmetros genéticos de três categorias de plantas em quatropopulações de Euterpe edulis, obtidas com diferentes marcadores, sendo A :número de alelos por loco; oH : heterozigosidade observada; eH : diversidade
gênica; f : índice de fixação. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Isoenzimas MicrossatélitesCategoria / População A eH oH f (a) A eH oH f (a)
PlântulasPop. 1: Extrativismo 3,10 0,428 0,379 0,114 ns
[-0,162 a 0,374]14,12 0,798 0,668 0,163
[0,011 a 0,337]Pop. 2: Manejo 3,00 0,441 0,397 0,100 ns
[-0,135 a 0,329]14,25 0,787 0,662 0,159
[0,035 a 0,262]Pop. 3: Natural Ib 3,00 0,377 0,351 0,067 ns
[-0,152 a 0,269]14,37 0,779 0,685 0,121
[0,019 a 0,197]Pop. 4: Natural SPA 3,10 0,419 0,385 0,081 ns
[-0,072 a 0,220]13,75 0,760 0,695 0,085 ns
[-0,040 a 0,242]Média 3,05 0,416 0,378 0,092 ns 14,12 0,781 0,678 0,133
[-0,121 a 0,292] [0,013 a 0,254]
JovensPop. 1: Extrativismo 3,20 0,437 0,380 0,131 ns
[-0,052 a 0,308]14,00 0,797 0,722 0,095 ns
[-0,008 a 0,206]Pop. 2: Manejo 3,10 0,430 0,387 0,099 ns
[-0,078 a 0,275]15,25 0,792 0,644 0,188
[0,051 a 0,331]Pop. 3: Natural Ib 3,00 0,401 0,357 0,109 ns
[-0,105 a 0,294]15,00 0,787 0,742 0,057 ns
[-0,039 a 0,162]Pop. 4: Natural SPA 3,30 0,454 0,414 0,087 ns
[-0,089 a 0,217]14,00 0,761 0,730 0,041 ns
[-0,089 a 0,168]Média 3,15 0,431 0,385 0,107 ns
[-0,070 a 0,264]14,56 0,785 0,709 0,096 ns
[-0,010 a 0,211]
AdultosPop. 1: Extrativismo 3,00 0,434 0,406 0,064 ns
[-0,113 a 0,244]15,12 0,794 0,698 0,121 ns
[0,000 a 0,230]Pop. 2: Manejo 3,10 0,402 0,374 0,069 ns
[-0,131 a 0,259]14,87 0,789 0,698 0,116 ns
[-0,043 a 0,300]Pop. 3: Natural Ib 3,00 0,410 0,376 0,084 ns
[-0,174 a 0,317]15,00 0,781 0,712 0,088 ns
[-0,008 a 0,184]Pop. 4: Natural SPA 3,40 0,452 0,457 -0,011ns
[-0,217 a 0,174]13,87 0,760 0,687 0,096 ns
[-0,028 a 0,224]Média 3,12 0,424 0,403 0,050 ns
[-0,145 a 0,227]14,72 0,781 0,699 0,105 ns
[-0,007 a 0,222]ns Não significativo (IC95%: 10.000 bootstraps)(a)
ISFf ˆˆ =
70
Através do teste exato de Fisher (Tabela 8), verificou-se que os marcadores
microssatélites apresentaram uma maior quantidade de locos fora do equilíbrio de
Hardy-Weinberg (P<0,05), em relação aos marcadores alozímicos. Enquanto estes
últimos apresentaram em média 70% de locos em equilíbrio na maior parte das
populações, os marcadores microssatélites apresentaram em média 50% de locos em
equilíbrio; algumas populações no entanto apresentaram taxas ainda menores (37,5%)
dentro de algumas categorias. Deve-se ressaltar, entretanto, que o emprego da correção
de Bonferroni (Weir, 1996) para múltiplos testes tende a diminuir o número de
significâncias, especialmente nos locos com valores de p próximos de 0,05. De qualquer
maneira, esse comportamento dos locos microssatélites corrobora o aumento nos valores
dos índices de fixação nas populações genotipadas com este marcador.
Tabela 8. Percentagem de locos em equilíbrio de Hardy-Weinberg baseado no testeexato de Fisher, em quatro populações e três categorias de plantas, a partir de10 locos alozímicos e 8 locos microssatélites de Euterpe edulis. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Isoenzimas (%) Microssatélites (%)População Plântulas Jovens Adultos Plântulas Jovens AdultosPop. 1: Extrativismo 70,0 70,0 70,0 37,5 50,0 62,5Pop. 2: Manejo 60,0 70,0 70,0 50,0 37,5 50,0Pop. 3: Natural Ib 70,0 60,0 70,0 62,5 37,5 50,0Pop. 4: Natural SPA 70,0 50,0 60,0 62,5 75,0 50,0
A análise das freqüências alélicas de locos microssatélites mostrou que todas as
populações estudadas apresentaram alelos exclusivos em quantidades expressivas nas
três categorias de plantas amostradas (Figura 6). Portanto, a variação encontrada entre
populações parece estar mais relacionada às diferentes regiões do que propriamente ao
processo de exploração. De fato, existe uma congruência entre os dois tipos de
marcadores, uma vez que os marcadores alozímicos também demonstraram um
comportamento similar entre populações. Entretanto, o número de alelos exclusivos
neste marcador é bastante inferior ao do primeiro, tendo-se observado um alelo entre as
71
plântulas da população 1 (Prx-4, alelo 2), dois alelos entre os jovens da população 4
(Prx-4, alelo 3 e G6pd-1, alelo 3) e um alelo entre os adultos da população 4 (Prx-4,
alelo 2). Portanto, neste caso, foram encontrados alelos exclusivos apenas nas
populações de São Pedro, o que sugere de fato que a variação encontrada entre
populações é decorrente da estruturação espacial das mesmas.
Figura 6 - Número de alelos exclusivos em locos microssatélites (a) e locos alozímicos
(b), em quatro populações e três categorias de plantas de Euterpe edulis.
Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
4.3.3 Estrutura Genética
A análise da diversidade de Nei demonstrou grande concordância entre os dois
marcadores empregados, sendo encontrados baixos valores de divergência genética
molecular entre as populações (Tabela 9). No conjunto das populações, os locos
alozímicos apresentaram uma amplitude de variação de 0,011 a 0,023 nas estimativas de
GST entre as categorias, sendo o maior valor encontrado entre as plântulas e o menor
entre os adultos. Nos locos microssatélites, as estimativas de GST variaram de 0,021 a
0,028 entre as categorias, sendo o menor valor encontrado na categoria dos jovens. Nas
comparações aos pares, os valores estimados de GST nos locos microssatélites tiveram
0
0,5
1
1,5
2
Ale
los
excl
usiv
osPop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4
Populações
Plântulas Jovens Adultos
b
02468
1012
Ale
los
excl
usiv
os
Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4Populações
Plântulas Jovens Adultos
a
72
uma variação de 0,013 a 0,038, acusando significância em todas as comparações. Já, nos
locos alozímicos foi observada uma variação um pouco mais expressiva de GST entre as
diferentes comparações (0,008 a 0,041), sendo que a maior parte dessas comparações foi
não significativa, especialmente entre populações da mesma região. A diferença
significativa encontrada entre plântulas das populações 1 e 4 poderia ser um indicativo
do efeito da exploração sobre a estrutura genética dessas populações, no entanto, esse
comportamento não foi observado nos marcadores microssatélites. Além disso, nos
marcadores alozímicos as estimativas de GST foram mais expressivas entre as populações
3 e 4 (populações não exploradas), pertencentes a diferentes regiões, tendo-se observado
esse mesmo comportamento nos locos microssatélites, sugerindo que a exploração até o
momento teve pouca influência sobre o padrão de estruturação das populações
estudadas.
Tabela 9. Estimativas da divergência genética ( STG ) em diferentes agrupamentos de
populações em três categorias de Euterpe edulis, utilizando diferentesmarcadores genéticos. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Isoenzimas MicrossatélitesPopulações(a)Plântulas Jovens Adultos Plântulas Jovens Adultos
Pop.1 x Pop.2 0,018 ns 0,006* 0,000 ns 0,025* 0,018* 0,035*Pop.1 x Pop.3 0,009 ns 0,028* 0,010* 0,024* 0,024* 0,029*Pop.1 x Pop.4 0,031* 0,007 ns 0,005 ns 0,017* 0,013* 0,017*Pop.2 x Pop.3 0,008 ns 0,013 ns 0,000 ns 0,013* 0,017* 0,024*Pop.2 x Pop.4 0,031 ns 0,006 ns 0,022* 0,024* 0,027* 0,029*Pop.3 x Pop.4 0,041* 0,039* 0,027* 0,038* 0,024* 0,032*
Conjunto 0,023* 0,017* 0,011* 0,024* 0,021* 0,028*(a) Extrativismo (1); Manejo (2); Natural Ib (3); Natural SPA (4)* P<0,05 (IC95%: 10.000 bootstraps); ns Não significativo
73
4.3.4 Sistema Reprodutivo
O erro padrão das freqüências alélicas dos óvulos e do pólen (Tabelas 10 e 11)
foi baixo na maioria dos locos, em ambos os marcadores, indicando suficiência amostral.
As diferenças nas freqüências alélicas entre pólen e óvulos foram na sua maioria não
significativas, se confrontadas com o erro padrão, tanto nos locos alozímicos como nos
locos microssatélites, evidenciando que o pólen foi homogêneo nos cruzamentos
individuais das árvores maternas. De qualquer forma, segundo Ritland & Jain (1981),
violações da pressuposição de homogeneidade das freqüências alélicas dos óvulos e do
pólen têm pouco efeito sobre a estimativa da taxa de cruzamento multilocos da
população (tm) quando o número de locos empregados nas estimativas for superior a
quatro ou cinco locos.
As estimativas de parâmetros do sistema reprodutivo mostraram bastante
congruência entre os dois marcadores empregados (Tabela 12). A taxa de cruzamento
multilocos foi de 0,996 (0,006) nos locos microssatélites e de 1,000 (0,000) nos locos
alozímicos, revelando que a espécie se reproduz por alogamia completa. As taxas de
cruzamento unilocos ( st ) foram menores que as estimativas multilocos ( mt ),
especialmente nos locos microssatélites. As taxas de cruzamentos entre aparentados ( mt -
st ), que auxilia no incremento da endogamia dentro das populações, apesar de baixas,
foram significativas em ambos os marcadores, de acordo com os respectivos erros-
padrão, variando de 0,013 (0,001) nos locos alozímicos a 0,067 (0,017) nos locos
microssatélites. O índice de fixação dos genótipos maternos ( f ) foi nulo em ambos os
marcadores, indicando a ausência de endogamia. A probabilidade de dois indivíduos
escolhidos ao acaso dentro de progênies serem irmãos germanos ( pr ) foi de 0,109
(0,000) em locos alozímicos e 0,103 (0,012) nos locos microssatélites, sugerindo a
ocorrência de cruzamentos preferenciais dentro da população estudada. A variação da
taxa de cruzamento entre as progênies ( tr ) foi baixa e não significativa em ambos os
marcadores, sendo concordante com a biologia floral da espécie, a qual é marcada por
uma acentuada protandria.
74
Tabela 10. Estimativas das freqüências alélicas de pólen e óvulos em locos alozímicos
na população natural de Euterpe edulis em São Pedro de Alcântara, SC.
Asteriscos indicam diferenças significativas entre pólen e óvulos. Piracicaba-
SP, Esalq/USP, 2004
Loco Alelo Pólen Óvulo Loco Alelo Pólen ÓvuloSkdh-1 1 0,697 (0,033) 0,769 (0,067) Pgdh-1 1 0,308 (0,102) 0,444 (0,036)
2 0,303 (0,033) 0,231 (0,067) 2* 0,046 (0,011) 0,185 (0,078)3* 0,209 (0,037) 0,037 (0,026)
Prx-1 1 0,819 (0,027) 0,885 (0,048) 4 0,400 (0,076) 0,296 (0,062)2* 0,148 (0,023) 0,038 (0,026) 5 0,037 (0,017) 0,037 (0,001)3 0,033 (0,015) 0,077 (0,043)
Mdh-1 1* 0,650 (0,043) 0,778 (0,063)Prx-2 1 0,487 (0,045) 0,538 (0,098) 2* 0,160 (0,052) 0,037 (0,001)
2* 0,215 (0,037) 0,038 (0,026) 3 0,189 (0,031) 0,185 (0,063)3 0,154 (0,038) 0,269 (0,099)4 0,145 (0,031) 0,154 (0,061) Pgi-1 1 0,518 (0,041) 0,444 (0,079)
2 0,439 (0,042) 0,519 (0,078)Prx-3 1* 0,517 (0,034) 0,308 (0,085) 3 0,043 (0,021) 0,037 (0,001)
2* 0,236 (0,030) 0,385 (0,098)3 0,058 (0,018) 0,077 (0,045) Pgm-1 1 0,475 (0,054) 0,500 (0,093)4 0,189 (0,031) 0,231 (0,084) 2 0,201 (0,033) 0,192 (0,088)
3 0,324 (0,052) 0,308 (0,066)Prx-4 1 0,951 (0,018) 0,929 (0,008)
2* 0,006 (0,000) 0,036 (0,001) G6pd-1 1 0,948 (0,015) 0,962 (0,027)3 0,043 (0,018) 0,036 (0,001) 2 0,052 (0,015) 0,038 (0,027)
( ) Erro padrão estimado com 10.000 bootstraps
75
Tabela 11. Estimativas das freqüências alélicas de pólen e óvulos em locos
microssatélites na população natural de E. edulis em São Pedro de Alcântara,
SC. Asteriscos indicam diferenças significativas entre pólen e óvulos.
Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Loco Alelo Pólen Óvulo Loco Alelo Pólen ÓvuloEE48 1 0,025 (0,013) 0,037 (0,001) EE03 1* 0,019 (0,009) 0,036 (0,001)
2 0,078 (0,028) 0,148 (0,076) 2 0,130 (0,035) 0,179 (0,078)3 0,179 (0,044) 0,259 (0,105) 3 0,198 (0,048) 0,214 (0,063)4 0,087 (0,038) 0,074 (0,042) 4 0,234 (0,042) 0,214 (0,062)5 0,210 (0,031) 0,148 (0,076) 5 0,112 (0,036) 0,179 (0,060)6 0,206 (0,052) 0,148 (0,058) 6 0,112 (0,037) 0,071 (0,040)7 0,126 (0,041) 0,074 (0,043) 7 0,094 (0,020) 0,071 (0,040)8 0,088 (0,032) 0,111 (0,069) 8* 0,101 (0,032) 0,036 (0,001)
EE45 1* 0,242 (0,036) 0,036 (0,023) EE23 1 0,072 (0,021) 0,074 (0,042)2 0,481 (0,067) 0,571 (0,049) 2 0,109 (0,037) 0,074 (0,040)3 0,082 (0,029) 0,107 (0,048) 3 0,140 (0,029) 0,074 (0,041)
4* 0,012 (0,007) 0,036 (0,001) 4 0,211 (0,050) 0,222 (0,081)5 0,139 (0,043) 0,143 (0,054) 5 0,238 (0,043) 0,259 (0,080)6 0,032 (0,014) 0,036 (0,022) 6 0,101 (0,020) 0,185 (0,079)
7* 0,006 (0,000) 0,036 (0,024) 7* 0,083 (0,029) 0,037 (0,001)8* 0,006 (0,004) 0,036 (0,001) 8 0,047 (0,025) 0,074 (0,041)
EE52 1 0,244 (0,053) 0,346 (0,078) EE05 1* 0,931 (0,026) 0,857 (0,034)2* 0,192 (0,040) 0,038 (0,024) 2 0,017 (0,004) 0,036 (0,023)3 0,222 (0,036) 0,192 (0,063) 3* 0,013 (0,007) 0,036 (0,001)4 0,169 (0,040) 0,154 (0,060) 4 0,033 (0,026) 0,036 (0,024)5 0,092 (0,035) 0,077 (0,042) 5* 0,006 (0,005) 0,036 (0,001)
6* 0,020 (0,012) 0,077 (0,043)7 0,031 (0,014) 0,038 (0,026)8 0,028 (0,016) 0,077 (0,043)
EE08 1 0,221 (0,041) 0,296 (0,091) EE47 1* 0,007 (0,004) 0,037 (0,025)2 0,055 (0,018) 0,074 (0,040) 2* 0,177 (0,040) 0,037 (0,001)
3* 0,007 (0,005) 0,037 (0,023) 3 0,068 (0,019) 0,074 (0,043)4 0,416 (0,051) 0,296 (0,093) 4 0,137 (0,038) 0,222 (0,080)
5* 0,064 (0,018) 0,037 (0,002) 5 0,110 (0,040) 0,111 (0,050)6 0,045 (0,025) 0,037 (0,026) 6 0,192 (0,028) 0,259 (0,084)7 0,047 (0,028) 0,074 (0,040) 7 0,258 (0,045) 0,185 (0,062)8 0,145 (0,028) 0,148 (0,057) 8 0,052 (0,027) 0,074 (0,041)
( ) Erro padrão estimado com 10.000 bootstraps
76
Tabela 12. Estimativas de parâmetros do sistema reprodutivo a partir de dez locosalozímicos e oito locos microssatélites, sendo mt : taxa de cruzamentomultilocos; st : taxa de cruzamento baseado na média dos locos
individuais; f : endogamia dos genótipos maternos; pr : correlação depaternidade dentro de progênies resultantes de cruzamento e tr : correlação
da taxa de cruzamento dentro de famílias. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Estimativa Isoenzimas Microssatélitesmt 1,000 (0,000) 0,996 (0,006)
st 0,987 (0,001) 0,929 (0,018)
mt - st 0,013 (0,001) 0,067 (0,017)f 0,002 (0,006) 0,008 (0,009)
pr 0,109 (0,000) 0,103 (0,012)
tr 0,008 (0,009) 0,027 (0,034)( ) Erro-padrão estimado com 10.000 bootstraps
As estimativas da taxa de cruzamento aparente ( at ) são apresentadas na Tabela
13. De modo geral, as estimativas de ta foram ligeiramente inferiores às obtidas para tm,
em ambos os marcadores, com variação entre 0,684 a 1,022. A estimativa mais alta foi
obtida com isoenzimas ( at =1,022) entre os indivíduos adultos da população 4, o que
concorda com a estimativa multilocos das progênies desta mesma população. No
entanto, esses baixos valores de at encontrados podem estar subestimados, uma vez que
os valores de f empregados nas estimativas foram na sua maioria não significativos,
especialmente entre os marcadores alozímicos
77
Tabela 13. Taxa de cruzamento aparente ( at ) de quatro populações e três categorias de
plantas de Euterpe edulis, estimada a partir do índice de fixação de Wright( ISF ) com marcadores alozímicos e microssatélites. Piracicaba-SP,
Esalq/USP, 2004
Plântulas Jovens AdultosPopulação Isoenzimas SSR Isoenzimas SSR Isoenzimas SSRPop. 1: Extrativismo 0,795 0,720 0,768 0,826 0,880 0,784Pop. 2: Manejo 0,818 0,726 0,820 0,684 0,871 0,792Pop. 3: Natural Ib 0,874 0,784 0,802 0,892 0,845 0,838Pop. 4: Natural SPA 0,850 0,843 0,840 0,921 1,022 0,824
4.4 Discussão
Análises comparativas de marcadores alozímicos e microssatélites têm sido
realizadas em diversas espécies com o objetivo de comparar a informação genética
desses marcadores. Nos estudos com espécies de peixes, Shaw et al. (1999) verificaram
que para Clupea harengus os microssatélites foram mais adequados para explicar a
estrutura genética local, mas menos informativos numa escala mais ampla. Em
populações de Salmo trutta, Estoup et al. (1998) verificaram que o alto nível de
polimorfismo nos locos microssatélites resultou em um maior poder dos testes
estatísticos na detecção de diferenças entre populações, como no caso das distâncias
genéticas de Cavalli-Sforza e Edwards, mas as estimativas de FST não foram diferentes
entre os marcadores. No estudo de populações de plantas, Djè et al. (1999), trabalhando
com espécies selvagens de sorgo do noroeste de Marrocos, verificaram similaridades
entre os marcadores em relação às estimativas do coeficiente de endogamia de Wright
(FIS) e do coeficiente de diferenciação genética de Nei (GST). Da mesma forma, Zucchi
et al. (2004) verificaram similaridades entre os parâmetros populacionais obtidos com os
dois tipos de marcadores em populações naturais de Eugenia dysenterica do Cerrado
brasileiro, embora algumas discrepâncias tenham sido observadas como no caso das
estimativas de fluxo gênico, as quais foram mais elevadas com locos alozímicos. Por
78
outro lado, Gao et al. (2002) mencionam que os marcadores microssatélites foram mais
informativos nas estimativas de diferentes parâmetros genéticos em populações de
Oryza rufipogon do sul da China. Em populações de carvalho, Streiff et al. (1998)
detectaram uma maior estruturação genética a partir de dados de microssatélites em
relação às isoenzimas, mas apontaram que a principal diferença entre os dois marcadores
reside na variação interlocos de FST, a qual foi mais expressiva nos locos alozímicos.
Entretanto, as estimativas FST com locos microssatélites em Elymus fibrosus (Poaceae)
foram menores em relação a locos alozímicos (Sun et al., 1998). Resultados similares
foram observados em Anhopheles gambiae (Lehmann et al., 1996). Embora os
resultados sejam um pouco conflitantes, todos esses trabalhos foram concordantes
quanto à superioridade dos marcadores microssatélites em relação ao nível de
polimorfismo.
Neste estudo, os dez locos alozímicos e os oito locos microssatélites usados nas
análises genéticas detectaram altos níveis de variação genética molecular e foram
congruentes com outros estudos realizados com populações de E. edulis. Reis et al.
(2000e) usando marcadores alozímicos encontraram valores médios de eH de 0,452 em
adultos e 0,436 em progênies de sete populações da Floresta Atlântica. De forma similar,
em uma população da Floresta Atlântica, Conte et al. (2003) obteve valores médios de
eH de 0,450 e 0,415 para adultos e progênies, respectivamente. Com locos
microssatélites, Gaiotto et al. (2003) detectaram valores médios de eH de 0,745 em
adultos e 0,775 em progênies em duas populações do Cerrado brasileiro. Pela
comparação dos dois marcadores, verificou-se no presente estudo que os marcadores
alozímicos detectaram 62,5% da diversidade máxima possível (0,678), enquanto os
marcadores microssatélites detectaram 84,0% dessa mesma diversidade máxima possível
(0,931).
O nível de variabilidade genética observado em E. edulis é esperado dada a alta
taxa de fecundação cruzada da espécie. A taxa de cruzamento multilocos (tm) desta
espécie foi previamente investigada, variando de 0,94 a 1,04 em locos alozímicos (Reis
et al., 1998), e 0,91 a 0,98 em locos microssatélites (Gaiotto et al., 2003). Esses
79
resultados, juntamente com as estimativas obtidas no presente estudo ( mt =1,000 para
isoenzimas e mt =0,996 para microssatélites), corroboram que E. edulis é uma espécie
obrigatoriamente de fecundação cruzada. Embora as estimativas da taxa de cruzamento
aparente ( at ) tenham sido mais baixas do que a taxa de cruzamento multilocos ( mt ), as
estimativas mais corretas são as calculadas utilizando progênies, uma vez que a taxa
aparente (ta) é estimada a partir do índice de fixação (f ou FIS) intrapopulacional o que
torna a estimativa dependente da pressuposição do equilíbrio de Wright. As estimativas
de tm também são congruentes com os estudos previamente desenvolvidos de biologia
floral e ecologia da polinização da espécie. A inflorescência de E. edulis é formada por
conjuntos de flores em tríade, geralmente consistindo de duas flores masculinas e uma
feminina, com acentuada protandria, o que previne a autogamia. Uma grande variedade
de insetos visita a inflorescência, mas a espécie predominante tem sido a pequena abelha
Trigona spinipes, a qual parece ser um importante polinizador desta palmeira (Reis et
al., 1993 e Mantovani & Morellato, 2000).
Apesar da alta taxa de fecundação cruzada, cruzamentos não aleatórios foram
observados pelas diferenças nas estimativas das taxas multilocos ( mt ) e média unilocos
( st ) em ambos os marcadores, indicando que eventos de fecundação cruzada podem
ocorrer entre indivíduos aparentados. Cruzamentos não aleatórios também foram
observados na estimativa da correlação de paternidade dentro de progênies ( pr ),
revelando uma quantidade significativa de irmãos germanos provenientes de
cruzamentos biparentais. A fenologia da espécie é caracterizada por um amplo período
de floração, variando de quatro a cinco meses (Reis et al., 1993 e Mantovani &
Morellato, 2000). Durante este período, o número de indivíduos em floração não é
homogêneo, seguindo uma curva normal, com poucos indivíduos nos extremos da
distribuição e com um aumento gradativo até atingir o máximo da curva (Reis et al.,
1993 e Mantovani & Morellato, 2000). Além disso, existe uma certa variação em relação
à quantidade de indivíduos que se reproduzem anualmente, juntamente com uma
variação no número de inflorescências emitidas por planta ao longo dos anos
80
(Mantovani & Morellato, 2000). Estes aspectos, aliados às características de
microambientes, favorecem a possibilidade de ocorrência de cruzamentos não aleatórios
entre os indivíduos, conforme já verificado em outros estudos desenvolvidos com a
espécie (Reis, 1996a e Gaiotto et al., 2003).
Entre as categorias de plantas analisadas, houve um aumento na frequência de
heterozigotos na direção dos indivíduos adultos, em locos alozímicos, com destaque para
os locos G6pdh-1, Pgdh-2, Prx-2 e Prx-3, o que sugere a ação da seleção favorecendo o
aumento de heterozigotos. As primeiras evidências a esse respeito foram apontadas por
Reis (1996a), empregando marcadores alozímicos, quando diferentes populações
naturais do palmiteiro mostraram um excesso de heterozigotos na fase adulta, o qual não
foi observado nas progênies. Evidências adicionais foram encontradas quando amostras
recrutadas de coortes com idades conhecidas exibiram maiores níveis de
heterozigosidade em relação a amostras não recrutadas (Reis et al., 1998). Mais
recentemente, essas evidências foram confirmadas por Conte et al. (2003), através do
estudo de diferentes fases do ciclo de vida de E. edulis, acompanhadas durante um
período de dez anos. Conforme também observado em outros estudos, o aumento nos
níveis de heterozigosidade está concentrado na passagem da fase de plântulas para as
demais. Esse comportamento pode estar relacionado a uma maior pressão de seleção na
fase de plântulas, uma vez que a taxa de mortalidade dos indivíduos dessa categoria é
superior a 80% (Conte et al., 2000b). O modo de ação da seleção e o processo de
recrutamento de E. edulis são discutidos com detalhes por Conte et al. (2003).
O estudo mostrou que os dados de isoenzimas e microssatélites não aderiram ao
equilíbrio de Hardy-Weinberg em alguns locos, principalmente em locos microssatélites.
Entretanto, uma parcela desses desvios pode estar relacionada à amostragem estatística
(Weir, 1996), uma vez que os locos microssatélites usados são altamente polimórficos –
muito acima dos locos alozímicos – e o número de indivíduos genotipados por
população (~50) é relativamente limitado para a amostragem de todos os genótipos
possíveis de cada loco. Além disso, conforme Aldrich et al. (1998), algumas distorções
nas freqüências genotípicas podem ser geradas na interpretação do padrão de bandas no
81
gel devido à ocorrência de bandas duplicadas (stutter bands) ou à presença de alelos
nulos.
Os resultados de ambos os marcadores revelaram uma maior variação genética
dentro de populações do que entre populações. Esta observação corresponde exatamente
às informações obtidas previamente com marcadores alozímicos e microssatélites em
outras populações de E. edulis (Reis et al., 2000e, Conte et al., 2003 e Gaiotto et al.,
2003). A pequena quantidade de diferenciação genética populacional ( STG ) é também
consistente com a alta taxa de fecundação cruzada da espécie. Além disso, esses
resultados concordam com diferentes estudos realizados com espécies tropicais, em que
espécies que se reproduzem por alogamia ou por sistema misto e que têm dispersão de
sementes e pólen a longas distâncias, apresentam baixa diferenciação populacional,
mantendo a maior parte de sua variabilidade genética dentro das populações (Hamrick &
Godt, 1990). De fato, E. edulis apresenta fluxo gênico de longa distância, com valores de
Nm, em geral, superiores a 1,0 (Reis et al., 2000e e Gaiotto et al., 2003). Segundo
Wright (1951), quando Nm≥1, ou seja, quando um ou mais indivíduos migram por
geração, os efeitos da migração são suficientes para contrapor os efeitos da deriva e,
portanto, impedem a divergência entre populações por essa via.
Hedrick (1999) menciona que em função das elevadas taxas de
heterozigosidade nos locos microssatélites, a magnitude das medidas de diferenciação
genética entre populações tende a ser pequena. Porém, magnitudes semelhantes de
divergência genética também foram observadas empregando marcadores alozímicos, o
que demonstra a consistência das informações obtidas com os dois marcadores.
Conforme discutido por Conte et al. (2004), a baixa diferenciação entre as populações
exploradas e não exploradas indica que a intervenção, até este momento, não causou
grandes mudanças na estrutura genética das populações. As maiores divergências
ocorreram entre as populações de diferentes regiões, principalmente entre as duas
populações naturais sem exploração, o que sugere tratar-se do resultado da estrutura
genética pré-existente. Da mesma forma, a análise das estimativas dos parâmetros de
diversidade, tais como o número de alelos por locos e a diversidade gênica, revelou que
as populações exploradas e não exploradas apresentaram níveis similares de diversidade
82
nas três categorias de plantas estudadas, indicando que os níveis de diversidade das
populações exploradas até o momento também não foram afetados pelo processo de
exploração.
Por outro lado, os dois marcadores foram capazes de detectar alterações no
comportamento reprodutivo das populações exploradas, representado por uma indicação
de aumento nos níveis de endogamia nas coortes mais jovens dessas populações. Uma
das conseqüências da redução do número de indivíduos reprodutivos em populações
naturais é o aumento da autofecundação e dos cruzamentos biparentais, levando ao
aparecimento de endogamia imediata ou nas próximas gerações (Bawa & Krugman,
1990; Murawski, 1995 e Aldrich et al., 1998). Considerando que os cruzamentos não
aleatórios são relativamente comuns em E. edulis (Reis, 1996a e Gaiotto et al., 2003,
juntamente com dados deste estudo), o aumento do índice de fixação entre os indivíduos
mais jovens das populações exploradas pode ter sido causado pelo aumento da
freqüência de cruzamentos não aleatórios ou biparentais. Embora os resultados tenham
sido similares entre os dois sistemas de exploração estudados, a endogamia observada
entre os jovens da população manejada tecnicamente em Ibirama pode ser o reflexo de
outros episódios de exploração ocorridos no passado, uma vez que essas plantas são
oriundas de eventos reprodutivos anteriores ao último manejo (Conte et al., 2004). Este
fato também pode ser o responsável pelo nível de endogamia observado entre as
plântulas dessa mesma população.
4.5 Conclusões
Os marcadores microssatélites revelaram um maior grau de polimorfismo em
relação às isoenzimas, mas a análise do sistema reprodutivo e as medidas relativas de
estrutura genética como o coeficiente de endogamia de Wright (FIS) e o coeficiente de
diferenciação genética de Nei (GST) foram da mesma ordem de magnitude para os dois
conjuntos de marcadores. Os marcadores alozímicos foram capazes de detectar efeitos
de seleção, confirmando os resultados obtidos em estudos prévios com esta espécie. A
83
informação genética conjunta desses marcadores revelou que os efeitos da exploração
foram pouco pronunciados até o momento, exceto o aumento nos níveis de endogamia
entre os indivíduos jovens das populações exploradas. No entanto, novos estudos são
necessários sobre os efeitos do manejo tecnificado, uma vez que os resultados obtidos
neste estudo podem ter sido influenciados por outros eventos de exploração ocorridos no
passado.
5 TAMANHO EFETIVO EM POPULAÇÕES DE Euterpe edulis MART.:
CONSEQÜÊNCIAS DO MANEJO
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto de dois sistemas de exploraçãosobre o tamanho efetivo de populações de Euterpe edulis Mart., no sul do Brasil. Foramamostradas duas populações não perturbadas e duas populações exploradas (extrativismoe manejo) da espécie. Em cada população foram examinadas plântulas, jovens e adultos,usando oito locos microssatélites e dez locos alozímicos. A representatividade genética( nNe /ˆ ) das amostras variou de 0,892 a 1,011 nas populações não perturbadas e 0,842 a
0,935 nas populações exploradas. Os menores valores da relação nNe /ˆ foram
observados nas categorias mais jovens das populações exploradas, como resultado doaumento nos níveis de endogamia nessas categorias. Entretanto, o número de indivíduosremanescentes, ao contrário do coeficiente de endogamia, teve a maior contribuição naredução do tamanho efetivo das populações exploradas. O tamanho efetivo ( eN ) dos
indivíduos adultos por hectare foi superior a 110 nas populações não pertubadas,enquanto nas populações exploradas, o tamanho efetivo por hectare foi reduzido para 45,sob manejo, e 14, sob extrativismo. Portanto, o impacto do sistema tradicional deexploração (extrativismo) sobre o tamanho efetivo das populações remanescentes daespécie é bastante acentuado e a sua persistência pode levar a uma forte erosão genéticanas gerações futuras.
Palavras-chave: Euterpe edulis; exploração florestal; microssatélites; isoenzimas;tamanho efetivo, endogamia.
85
Effective size of Euterpe edulis Mart. populations: consequences of
exploitation systems
Summary
The aim of this study was to evaluate the impact of two exploitation systems -
extractivism and management - on the effective size of Euterpe edulis Mart. populations,
by comparing two undisturbed populations with two exploited populations in southern
Brazil. Three categories of plants, from seedlings to adults, were examined using eight
microsatellite loci and ten allozymic loci. The genetic representativeness ( nNe /ˆ ) of the
samples varied from 0.892 to 1.011 in undisturbed populations and from 0.842 to 0.935
in exploited populations. The lowest genetic representativeness was observed among
seedlings and juveniles from the exploited populations, resulting from an increase in the
inbreeding levels of such categories. However, the number of remaining individuals
rather than the inbreeding coefficient was the main component for the reduction of
effective size of the exploited populations. The effective size ( eN ) per hectare of the
adult individuals was higher than 110 in the two undisturbed populations, while in the
exploited populations the effective size per hectare was reduced to 45 under
management, and 14 under extractivism. Therefore, the impact of the traditional
exploitation system (extractivism) on the effective size of the remnant populations of the
species is quite expressive and its persistence can lead to strong genetic erosion in future
generations.
Keywords: Euterpe edulis; forest exploitation; microsatellites; isozymes; effective size;
inbreeding.
86
5.1 Introdução
O manejo de populações naturais é um processo que promove modificações no
tamanho populacional e na estrutura espacial dos indivíduos dentro das populações
(Bawa & Krugman, 1990 e Murawski, 1995). Uma redução no tamanho das populações,
envolvendo a retirada de indivíduos reprodutivos, pode levar à deriva genética que
promove perda e fixação aleatória de alelos, e ao aumento do parentesco e da endogamia
dentro das populações (Futuyma, 1992; Alvarez-Buylla et al., 1996 e Falconer &
Mackay, 1996). Do ponto de vista da Genética de Populações, a perda de diversidade
genética e as medidas de controle para minimizar seus efeitos, podem ser enfocados sob
a ótica do tamanho efetivo populacional (Vencovsky, 1987). Esse conceito, introduzido
por Sewall Wright, há mais de 50 anos, relaciona-se intimamente com a questão da
representatividade genética das populações (Vencovsky, 1987; Kageyama, 1987; Barret
& Kohn, 1991; Araújo, 1996 e Vencovsky & Crossa, 1999).
O conhecimento do tamanho efetivo é uma informação muito importante para o
estudo da estrutura genética de populações sob manejo, uma vez que a redução no
tamanho de uma população têm efeitos sobre as gerações subseqüentes (Robinson,
1998). Uma diminuição acentuada no tamanho efetivo populacional, ocasionada pela
exploração florestal, por exemplo, ou mesmo por eventos estocásticos, tem sido
denominada de efeito de gargalo (Young et al., 1996). Isto porque após sua ocorrência é
muito difícil recuperar o tamanho efetivo original, a não ser que a redução do tamanho
efetivo não seja muito acentuada (Vencovsky, 1987). Neste aspecto, uma geração ou
algumas gerações com menor número de indivíduos terá uma grande influência no valor
final do tamanho efetivo, uma vez que este será a média harmônica dos tamanhos
efetivos parciais (Crow & Kimura, 1970; Vencovsky, 1987; Falconer, 1989 e Araújo,
1996).
A manutenção de um tamanho efetivo populacional adequado diminui a
probabilidade de ocorrência das oscilações genéticas e da endogamia. Quanto maior o
tamanho efetivo menor será a magnitude da deriva genética. Isto significa que,
mantendo-se um tamanho efetivo adequado ao longo das gerações, maior é a
87
probabilidade de as freqüências alélicas permanecerem próximas da população de
origem (Templeton, 1990 e Ellstrand & Elam, 1993). Da mesma forma, quanto maior o
tamanho efetivo menor será o nível de endogamia da população. O nível de endogamia
(F) de uma população aumenta com o tempo numa taxa dependente do tamanho efetivo
populacional (Ne tal que ∆F = 1/2Ne), por geração (Wright, 1922, 1931 e Falconer,
1989). Neste sentido, as populações tornam-se endogâmicas mais rapidamente quando
elas apresentam pequenos tamanhos (Barret & Kohn, 1991). Além disso, alterações na
estrutura espacial dos indivíduos de uma população podem levar a mudanças na
densidade e no comportamento dos polinizadores, gerando alterações nos níveis de
cruzamento, como o aumento da autofecundação e conseqüentemente da endogamia
(Bawa & Krugman, 1990 e Murawski, 1995). Populações de cruzamento, historicamente
grandes, que repentinamente declinam para uns poucos indivíduos, geralmente reduzem
a variabilidade e a fecundidade (Falconer & Mackay, 1996). Conforme Nason et al.
(1997), a redução no número de indivíduos reprodutivos pode levar a rápidas mudanças
na composição genética e essas mudanças ocorrem em conjunto com a estrutura genética
pré-existente.
Euterpe edulis Mart. (Arecaceae) é uma espécie nativa muito abundante no
subbosque da Floresta Tropical Atlântica Brasileira. A espécie é valiosa
economicamente por ser a principal fonte de extração de palmito na floresta Atlântica. A
situação atual das populações naturais da espécie é de grande fragmentação e uma
reduzida área de ocorrência (Reis et al., 2000a). Embora um sistema de manejo
tecnificado tenha sido proposto para a espécie (Reis et al., 1992; Ribeiro et al., 1994;
Reis et al., 1998; Reis et al., 2000b e Reis et al., 2000d), a intensiva exploração realizada
desde a década de 1960 resultou na eliminação de várias populações e em sérias
alterações das populações remanescentes (Galetti & Fernandez, 1998; Reis & Guerra,
1998 e Batista et al., 2000). Alguns estudos empregando marcadores alozímicos (Reis,
1996a; Reis et al., 1998, 2000d e Conte et al., 2003) e microssatélites (Gaiotto et al.,
2003) em populações naturais, revelaram que a espécie possui uma alta taxa de
fecundação cruzada, alta variabilidade genética dentro das populações e baixa
divergência entre populações. Além disso, estimativas de tamanho de vizinhança, em
88
média foram de 67 indivíduos, com cada deme panmítica ocupando uma área de
aproximadamente 13.000 m2 (Reis, 1996a).
Neste estudo, foram utilizados dados genéticos de marcadores alozímicos e
microssatélites para obtenção de estimativas do tamanho efetivo populacional (Ne) em
populações de Euterpe edulis Mart. com diferentes níveis de ação antrópica. O objetivo
foi avaliar o impacto de diferentes sistemas de exploração na redução do tamanho
efetivo de populações da espécie.
5.2 Material e Métodos
5.2.1 Locais de Estudo e Sistema de Amostragem
O estudo foi realizado em duas localidades do Estado de Santa Catarina, Brasil,
sendo uma no Município de Ibirama, e outra no Município de São Pedro de Alcântara.
Em cada localidade foram escolhidas duas áreas de ocorrência natural de E. edulis, uma
sem influência antrópica (população natural) e outra onde foi realizada a extração de
palmito (população explorada), totalizando quatro populações (Tabela 1). Dois sistemas
de exploração foram considerados no presente estudo: (i) extrativismo (São Pedro), onde
a exploração é realizada através da extração da maioria dos indivíduos acima de 2 m de
altura, permanecendo poucos indivíduos reprodutivos na área; e (ii) manejo (Ibirama), o
qual caracteriza-se pela retirada apenas dos indivíduos acima de 9 cm de DAP,
respeitando-se a permanência de pelo menos 50 indivíduos reprodutivos por hectare,
sendo tais critérios definidos pela legislação florestal do Estado de Santa Catarina.
A cobertura vegetal das duas regiões é de Floresta Ombrófila Densa,
pertencente ao domínio da Mata Atlântica (IBGE, 1988). Apesar de a situação atual das
populações da espécie ser de intensa fragmentação e degradação, existem muitos
fragmentos remanescentes em bom estado de conservação, como é o caso das duas
populações naturais amostradas neste estudo. Além disso, nas duas regiões estudadas os
fragmentos florestais apresentam uma certa conectividade em função da proximidade
entre os fragmentos e, portanto, populações degradadas podem sofrer a influência de
89
populações não degradadas do seu entorno. A história de exploração nas populações
estudadas é bastante diferente. Em São Pedro, a exploração foi realizada em diferentes
episódios, entre as décadas de 1970 e 1990, período em que a legislação apresentava
poucas restrições à exploração de palmito. Em Ibirama, embora a população possa ter
sofrido exploração no passado, o manejo foi realizado há três anos, com a retirada dos
indivíduos passíveis de corte, de acordo com os critérios técnicos mencionados
anteriormente. A distância geográfica entre as duas regiões é de aproximadamente 150
km. Na região de Ibirama, a distância entre as duas populações é de aproximadamente 2
km, enquanto em São Pedro essa distância é de 5 km.
Para os estudos de variabilidade e estrutura genética, em cada população foram
coletadas amostras de plantas pertencentes a três categorias (Figura 1), de acordo com a
classificação de Reis et al. (1996), visando representar os indivíduos em diferentes fases
de desenvolvimento dentro de cada nível de ação antrópica. Assim, foram amostradas:
i) Plântulas - indivíduos com até 10 cm de altura de inserção da folha
flecha, representando os indivíduos da última frutificação;
ii) Jovem II - plantas entre 30 cm e um metro de altura de inserção, sem o
estipe exposto e com 4 a 5 folhas nitidamente pinadas;
iii) Adultos - plantas em fase reprodutiva.
As coletas foram realizadas em três pontos distribuídos aleatoriamente em cada
população, onde foram amostrados cerca de 50 indivíduos por categoria. A área de
coleta dentro de cada ponto variou de acordo com a densidade de indivíduos
reprodutivos presentes em cada população. As amostras foliares foram mantidas sobre
gelo, transportadas para o laboratório e estocadas a 4°C até a extração das proteínas e do
DNA.
5.2.2 Análise Genética
Dez sistemas enzimáticos foram revelados por eletroforese em gel de amido
(Conte et al., 2003). A migração e separação das enzimas no gel foi realizada em sistema
90
contínuo de eletroforese, utilizando-se como sistemas de corridas os tampões Tris
Citrato (Alfenas et al.,1991) e Citrato Morfolina (Cheliack & Pittel, 1984). Os
procedimentos de coloração bem como a nomenclatura dos locos e alelos é idêntica aos
estudos prévios realizados (Conte et al., 2003). Entre os 10 sistemas empregados, 16
zonas com atividade enzimática foram detectadas, revelando 10 locos polimórficos, os
quais foram empregados nas análises.
A extração do DNA genômico seguiu o procedimento padrão CTAB (Ferreira
& Grattapaglia, 1998). Um total de oito locos microssatélites previamente desenvolvidos
e otimizados para E. edulis (Gaiotto et al., 2001) foram usados na genotipagem de todos
os indivíduos amostrados (Tabela 2). As reações de polimerização em cadeia (PCR)
foram realizadas em condições específicas conforme descrito em Gaiotto et al. (2001).
Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel desnaturante de
poliacrilamida 4%, TBE 1X, corrida a 60W/1300V/46mA por 1 hora, usando como
marcador “ladder” 10 pb. Os géis foram corados com nitrato de prata conforme descrito
em Creste et al. (2001).
5.2.3 Análise Estatística
A partir da leitura dos dados nos géis foram obtidas as freqüências alélicas e
genotípicas em cada loco. A seguir foram calculadas medidas de variabilidade (Ho:
heterozigosidade observada; He: diversidade gênica) que possibilitaram a obtenção dos
níveis de endogamia das populações. O índice de fixação de Wright (f) não-viesado foi
estimado para cada população segundo Weir (1996) pela média entre locos, de acordo
com a seguinte expressão:
( )∑ ∑
∑∑ ∑−
+−=
one
onoe
HH
HHHf
ˆˆ
ˆˆˆˆ
21
21
91
Para verificar a significância dos valores médios de f , estimou-se o intervalo
de confiança a 95% de probabilidade, pelo método de reamostragem tipo bootstrap,
utilizando-se 10.000 reamostragens sobre locos, através do programa GDA (Lewis &
Zaykin, 2000).
O tamanho efetivo de populações (Ne) foi estimado de acordo com Vencovsky
& Crossa (1999), considerando que o parentesco entre indivíduos é baixo em populações
naturais. Assim, a estimativa Ne foi obtida para cada população com base no número
físico de indivíduos (n), e no nível de endogamia (f) desses indivíduos, de maneira que o
limite superior do tamanho efetivo foi obtido pela expressão )ˆ1/(ˆ fnNe += . O nível de
endogamia aqui considerado é equivalente ao FIS de Wright, calculado para cada
população. A representatividade genética das amostras empregadas foi testada a partir da
relação nNe /ˆ e da estimativa do número de indivíduos que representam um tamanho
efetivo de 50 plantas de uma população panmítica ideal (população grande de
cruzamentos aleatórios). Além disso, estimou-se o tamanho efetivo dos indivíduos
adultos remanescentes do processo de exploração, o que permitiu relacionar essas
estimativas com o tamanho das demes panmíticas da espécie. O intervalo de confiança
de eN (95% de probabilidade) foi obtido do intervalo de confiança do f (Sebbenn et
al., 2000).
5.3 Resultados
5.3.1 Polimorfismos e Níveis de Endogamia nas Populações
Na análise dos locos alozímicos foram encontrados dez locos polimórficos
(Skdh-1, Prx-2, Prx-3, Prx-4, Prx-5, Pgdh-2, Mdh-1, Pgi-2, Pgm-1, G6pdh-1), onde
foram identificados 35 alelos nas amostras. O loco Prx-5 apresentou o mais baixo nível
de polimorfismo, com o alelo mais freqüente próximo da fixação em todas as categorias
analisadas. Entretanto, outros locos mostraram um expressivo polimorfismo (Prx-3, Prx-
92
4, Pgm-1, com quatro alelos cada, e Pgdh-2, com cinco alelos). Todos os oito locos
microssatélites empregados neste estudo foram polimórficos. Um total de 161 alelos foi
detectado nas amostras. Os locos EE48 e EE47 foram os mais polimórficos com 24 e 26
alelos, respectivamente, enquanto o loco menos polimórfico foi EE5, com 13 alelos.
Algumas estimativas dos índices de fixação ( f ) foram altas e significativas,
especialmente nos marcadores microssatélites, indicando desvios do equilíbrio de
Hardy-Weinberg (Tabela 14). De modo geral, ambos os marcadores revelaram uma
tendência de redução nos valores de f na direção das populações naturais não
exploradas (3 e 4). Com locos microssatélites, os valores de f tiveram as seguintes
amplitudes de variação: 0,163 a 0,085 nas plântulas; 0,188 a 0,041 nos jovens; e 0,121 a
0,088 nos adultos. Com locos alozímicos, a variação observada foi a seguinte: 0,114 a
0,067 nas plântulas; 0,131 a 0,087 nos jovens; e 0,084 a -0,011 nos adultos. O maiores
valores de f observados nas populações exploradas, especialmente entre as plântulas,
podem ter sido causados pela redução do número de indivíduos reprodutivos decorrente
do processo de exploração.
5.3.2 Tamanho Efetivo Populacional
Os resultados evidenciaram altos valores de eN e da relação nNe /ˆ em ambos
os marcadores (Tabela 14). A representatividade genética ( nNe /ˆ ) das amostras foi
superior a 90% nas populações naturais em praticamente todas as categorias, chegando a
atingir 100% nos locos alozímicos dos indivíduos adultos da população 4. Em virtude do
comportamento dos valores de f , as menores representatividades genéticas foram
encontradas entre as populações exploradas, embora as diferenças em relação às
populações naturais não sejam significativas. De qualquer forma, a menor
representatividade genética observada nas populações exploradas, especialmente na
população 1, sugere um pequeno efeito do processo de exploração na redução do
tamanho efetivo populacional.
93
Tabela 14. Estimativas do coeficiente de endogamia de Wright ( f ), do tamanho efetivo( eN ) e da relação entre o tamanho efetivo e o tamanho amostral ( nNe /ˆ ) de
três categorias de plantas em quatro populações Euterpe edulis comdiferentes níveis de ação antrópica, utilizando marcadores microssatélites eisoenzimas. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Microssatélites IsoenzimasCategoria /População n f eN nNe /ˆ n f eN nNe /ˆPlântulas
Pop. 1: Extrativismo 53 0,163* 45,6 ± 5,91 0,860 54 0,114 ns 48,5 ± 9,2 0,898Pop. 2: Manejo 51 0,159* 44,0 ± 3,6 0,863 51 0,100 ns 46,4 ± 8,0 0,909Pop. 3: Natural IB 52 0,121* 46,4 ± 2,9 0,892 54 0,067 ns 50,6 ± 8,0 0,937Pop. 4: Natural SPA 52 0,085 ns 47,9 ± 6,0 0,921 54 0,081 ns 49,9 ± 5,6 0,924
JovensPop. 1: Extrativismo 51 0,095 ns 46,6 ± 4,3 0,914 52 0,131 ns 46,0 ± 6,2 0,884Pop. 2: Manejo 52 0,188* 43,8 ± 4,7 0,842 52 0,099 ns 47,3 ± 6,5 0,910Pop. 3: Natural IB 52 0,057 ns 49,2 ± 4,4 0,946 54 0,110 ns 48,6 ± 6,9 0,900Pop. 4: Natural SPA 53 0,041 ns 50,9 ± 5,5 0,960 54 0,087 ns 49,7 ± 5,3 0,920
AdultosPop. 1: Extrativismo 48 0,121* 42,8 ± 3,8 0,892 50 0,064 ns 47,0 ± 6,8 0,940Pop. 2: Manejo 50 0,116 ns 44,8 ± 6,3 0,896 51 0,069 ns 47,7 ± 7,2 0,935Pop. 3: Natural IB 53 0,088 ns 48,7 ± 3,9 0,919 54 0,084 ns 49,8 ± 8,8 0,922Pop. 4: Natural SPA 53 0,096 ns 48,4 ± 5,1 0,913 54 -0,011ns 54,6 ± 8,6 1,011* P<0,05 (IC95%: 10.000 bootstraps); ns Não significativo1 Intervalo de confiança a 95% de probabilidade
As estimativas do Ne para 50 plantas mostraram pouca variação entre
populações em quase todas as categorias analisadas (Tabela 15). Com locos
microssatélites, variações mais expressivas foram observadas nas plântulas da população
1 (58,2 ± 8,6) e nos jovens da população 2 (59,4 ± 7,2). Com locos alozímicos, a maior
variação foi encontrada nos indivíduos adultos da população 4 (49,4 ± 9,3), como
reflexo do comportamento do índice de fixação. A grande amplitude no intervalo de
confiança das estimativas está associada ao intervalo de confiança de f das populações.
94
Tabela 15. Número de indivíduos que representam um eN de 50 plantas de uma
população panmítica ideal, utilizando dois tipos de marcadores. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Microssatélites IsoenzimasPopulação Plântulas Jovens Adultos Plântulas Jovens AdultosPop. 1: Extrativismo 58,2 ± 8,61 54,8 ± 5,5 56,0 ± 5,5 55,7 ± 13,0 56,6 ± 8,8 53,2 ± 9,0Pop. 2: Manejo 57,9 ± 5,2 59,4 ± 7,2 55,8 ± 9,2 55,0 ± 11,4 54,9 ± 8,8 53,4 ± 9,5Pop. 3: Natural IB 56,1 ± 3,7 52,8 ± 5,3 54,4 ± 4,8 53,4 ± 10,0 55,5 ± 9,2 54,2 ± 11,6Pop. 4: Natural SPA 54,2 ± 7,9 52,0 ± 6,4 54,8 ± 6,4 54,0 ± 6,9 54,4 ± 6,5 49,4 ± 9,3
1 Intervalo de confiança a 95% de probabilidade
Entretanto, as estimativas de Ne baseadas na densidade de indivíduos adultos
por hectare, revelaram uma expressiva variação entre as quatro populações estudadas
(Tabela 16). De acordo com o sistema de exploração empregado, o número de
indivíduos remanescentes por hectare foi bastante variável e isso teve implicações
diretas sobre o tamanho efetivo de cada população. Nas populações 3 e 4 o valor de eN
permaneceu alto em ambos os marcadores (119,48.ha-1 e 109,49.ha-1 para microssatélites
e 119,93.ha-1 e 121,33.ha-1 para isoenzimas, respectivamente). Entre as populações
exploradas, a população 2 manteve um valor de eN intermediário, tanto com base nos
locos microssatélites (44,80.ha-1) quanto nos alozímicos (46,67.ha-1). Por outro lado, a
população 1 sofreu a maior redução em relação ao número físico de indivíduos e
conseqüentemente ao tamanho efetivo populacional ( eN =13,38.ha-1 e eN =14,08.ha-1
para microssatélites e isoenzimas, respectivamente). Apesar de os valores de f serem
mais expressivos nas populações exploradas, verificou-se que o número físico de
indivíduos teve a maior contribuição na redução dos valores do eN das populações.
Além disso, os pequenos valores de f tiveram mais influência nas populações
exploradas, uma vez que sua contribuição reduziu ainda mais o tamanho efetivo dessas
populações.
95
Tabela 16. Tamanho efetivo populacional ( eN ) baseado no número de indivíduos
adultos por hectare (N) e no coeficiente de endogamia de Wright ( f ) em
quatro populações de Euterpe edulis com diferentes níveis de ação antrópica,empregando-se dois tipos de marcadores. Piracicaba-SP, Esalq/USP, 2004
Microssatélites IsoenzimasPopulação N.ha-1
f eN .ha-1 f eN .ha-1
Pop. 1: Extrativismo 15 0,121 * 13,38 ± 1,21 0,064 ns 14,08 ± 2,0Pop. 2: Manejo 50 0,116 ns 44,80 ± 6,3 0,069 ns 46,77 ± 7,1Pop. 3: Natural IB 130 0,088 ns 119,48 ± 9,7 0,084 ns 119,93 ± 21,2Pop. 4: Natural SPA 120 0,096 ns 109,49 ± 11,4 -0,011 ns 121,33 ± 19,1
* P<0,05 (IC95%: 10.000 bootstraps); ns Não significativo1 Intervalo de confiança a 95% de probabilidade
5.4 Discussão
O tamanho efetivo populacional em populações naturais de E. edulis é
geralmente elevado e é responsável pelo alto nível de variabilidade genética das
populações da espécie (Reis, et al., 1998, 2000d; Conte et al., 2003 e Gaiotto et al.,
2003). Essa alta variabilidade é favorecida principalmente pelas características
demográficas, ecológicas e reprodutivas da espécie. E. edulis é uma das espécies mais
abundantes no estrato médio da Floresta Atlântica (Reis et al., 1996; Henderson, 2000 e
Reis et al., 2000a). A estratégia reprodutiva típica da espécie envolve a manutenção de
um grande banco de plântulas, com média de 12.000 plântulas por hectare (Reis et al.,
1996). A espécie é monóica, com flores unisexuadas distribuídas em inflorescências do
tipo panícula, a qual apresenta uma acentuada protandria, o que previne a autogamia
(Reis et al., 1993 e Mantovani & Morellato, 2000). Uma grande variedade de insetos
visita as inflorescências de E. edulis durante seu longo período de florescimento,
contribuindo para o fluxo de pólen desta palmeira (Reis et al., 2000d). Os frutos servem
de alimento para a fauna, a qual é responsável pela dispersão de sementes, implicando
em uma contribuição imprescindível para manutenção da dinâmica demográfica e do
fluxo gênico da espécie (Reis & Kageyama, 2000).
96
A representatividade genética das amostras usadas neste estudo foi bastante
alta, especialmente nas populações não exploradas onde os valores foram superiores a
90%. Nas populações exploradas, a representatividade genética das amostras foi menor,
principalmente entre as plântulas. Em um estudo similar, Sebbenn et al. (2000)
verificaram uma representatividade genética de 74% e 84%, respectivamente, em
progênies de populações exploradas e não exploradas de Tabebuia cassinoides. Neste
caso, os efeitos da exploração foram bastante significativos na redução do tamanho
efetivo populacional. No caso de E. edulis, embora a diferença na representatividade
genética tenha sido menos expressiva, as diferenças encontradas entre os indivíduos
mais jovens, detectadas com marcadores microssatélites, reflete um possível efeito do
processo de exploração na redução do tamanho efetivo dessas categorias de plantas. Este
comportamento está relacionado aos maiores níveis de endogamia detectados nessas
categorias.
No entanto, as diferenças no tamanho efetivo por hectare foram mais
expressivas comparando-se as densidades dos indivíduos adultos entre as populações
naturais e a população explorada de forma extrativista. No sistema de exploração
tradicional (extrativismo) todos os indivíduos maiores de 2 m de altura são cortados,
incluindo plantas reprodutivas. Em alguns casos, somente os indivíduos mais produtivos,
com DAP acima de 8 cm, são explorados, o que inclui todos os indivíduos reprodutivos
(Reis et al., 1998). Esse sistema implica em uma expressiva redução da população
reprodutiva e um colapso do sistema de exploração. Por outro lado, o sistema de manejo
tecnificado proposto para E. edulis consiste na retirada de um certo número de
indivíduos em cada ciclo de corte e sua substituição por indivíduos jovens, sendo esta
substituição promovida pelo próprio dinamismo da espécie. Neste modelo, é necessário
que a regeneração natural assegure a reposição dos indivíduos extraídos e haja um
contínuo suprimento de propágulos, o qual é dependente da permanência de um certo
número de indivíduos reprodutivos nas áreas sob manejo (Reis et al., 1998).
Considerando que as demes panmíticas de E. edulis correspondem a
aproximadamente 67 indivíduos, ocupando uma área de 13.000 m2, segundo Reis
(1996a) a redução no número de indivíduos por hectare abaixo de 50, implicaria em um
97
aumento da divergência entre as unidades panmíticas em decorrência do aumento
interno dos níveis de endogamia, alterando a estrutura genética das populações no médio
prazo. Além disso, os efeitos da deriva genética se acentuariam, levando, possivelmente,
a perda dos alelos de menor freqüência. Desta forma, a redução do tamanho efetivo
populacional traria conseqüências diretas sobre o dinamismo populacional da espécie.
Em um estudo prévio sobre os efeitos do manejo nos níveis de diversidade e
estrutura genética molecular das mesmas populações empregadas neste estudo, Conte et
al. (2004) não encontraram diferenças entre populações exploradas e não exploradas da
espécie. Porém, os efeitos da redução no tamanho das populações investigados em
diferentes espécies vegetais, mostraram perdas de diversidade e alterações na estrutura
genética das populações (Ledig & Conkle, 1983; Hall et al., 1996, Nason et al., 1997,
Kageyama et al., 1998 e Sebbenn et al., 2000). Quando as populações permanecem
pequenas por um longo período, os efeitos da amostragem tornam-se cumulativos. Isto
dá origem a mudanças aleatórias na freqüência gênica (deriva genética) por causa da
amostragem de gametas de geração para geração. Em grandes populações, em média,
somente pequenas mudanças aleatórias na freqüência gênica ocorrem como resultado da
deriva; entretanto, onde as populações são pequenas (e.g. <100), as freqüências gênicas
podem sofrer grandes flutuações em diferentes gerações, levando a perda de alelos
(Templeton, 1990; Barret & Kohn, 1991 e Ellstrand & Elam, 1993).
No entanto, Young et al. (1996) afirmam que as perdas de variação genética são
mais prováveis devido à formação de gargalos genéticos no momento da exploração e na
subseqüente endogamia das populações pequenas, do que aos efeitos da ação contínua
da deriva genética aleatória. Além disso, alterações na estrutura espacial dos indivíduos
de uma população podem levar a mudanças na densidade e no comportamento dos
polinizadores, gerando alterações nos níveis de cruzamento, como o aumento da
autofecundação e conseqüentemente da endogamia (Bawa & Krugman, 1990 e
Murawski, 1995). De fato, conforme observado no presente estudo, os maiores níveis de
endogamia detectados entre as plântulas e jovens das populações exploradas sugerem
que a redução da população de cruzamentos resultou na alteração do comportamento
reprodutivo dos indivíduos remanescentes. De acordo com Sebbenn et al. (2000), em
98
populações exploradas de Tabebuia cassinoides, que sofreram redução no tamanho
efetivo, houve um aumento nos níveis de endogamia devido ao aumento na taxa de
autofecudação dos indivíduos remanescentes. Entretanto, no caso de E. edulis a
autofecundação é um evento de ocorrência muito rara, devido às características
reprodutivas e ecológicas da espécie. Por outro lado, cruzamentos não aleatórios ou
biparentais de baixa freqüência ocorrem naturalmente em populações naturais de E.
edulis (Reis, 1996a; Gaiotto et al., 2003). Assim, as alterações na população reprodutiva,
causadas pela exploração podem ter contribuído para o aumento na freqüência de
cruzamentos não aleatórios, aumentando a chance de cruzamentos entre aparentados e,
assim, elevando os níveis de endogamia nas categorias mais jovens dessas populações.
5.5 Conclusões
Pela comparação das populações naturais exploradas e não exploradas,
verificou-se que o sistema extrativista de exploração resultou na maior redução no
tamanho efetivo dos indivíduos adultos por hectare. No entanto, considerando que o
tamanho efetivo é uma medida que envolve toda a população, as populações exploradas
de E. edulis ainda apresentam um bom tamanho efetivo populacional, uma vez que essas
populações apresentam áreas superiores a 20 hectares. Porém, a persistência do sistema
tradicional de exploração (extrativismo) poderá causar uma redução drástica no tamanho
efetivo, elevando os níveis de endogamia por deriva genética e cruzamento entre
aparentados. Conforme Falconer & Mackay (1997), o efeito da endogamia em uma
população é denominado de “depressão por endogamia”, a qual pode implicar na
redução da performance reprodutiva da espécie, causando alterações na fertilidade,
viabilidade das sementes, vigor, adaptação e produtividade de maneira geral. Assim, no
decorrer de várias gerações esses efeitos podem resultar em perdas de variabilidade e
alteração na estrutura genética, colocando em risco as populações remanescentes da
espécie.
6 CONCLUSÕES GERAIS
Com base nos resultados obtidos e considerando as hipóteses levantadas e os
objetivos propostos, as principais conclusões deste trabalho foram:
As populações de Euterpe edulis, nas duas regiões estudadas, apresentaram uma
grande variabilidade genética molecular, detectada pelos marcadores alozímicos
e microssatélites.
Os marcadores microssatélites revelaram um maior grau de polimorfismo em
relação às isoenzimas, mas a análise do sistema reprodutivo e as medidas
relativas de estrutura genética como o coeficiente de endogamia de Wright (FIS)
e o coeficiente de diferenciação genética de Nei (GST) foram da mesma ordem de
magnitude para os dois conjuntos de marcadores.
A informação genética conjunta desses marcadores revelou que os efeitos da
exploração foram pouco pronunciados até o momento em relação aos níveis de
diversidade e estrutura genética molecular das populações de E. edulis.
Entretanto, a redução da população de cruzamentos resultou em alterações no
comportamento reprodutivo dos indivíduos, promovendo um aumento nos níveis
de endogamia nas coortes mais jovens das populações exploradas.
O sistema extrativista de exploração resultou em uma maior redução no tamanho
efetivo dos indivíduos adultos por hectare, porém, o tamanho efetivo total das
100
populações exploradas ainda é elevado, o que explica a manutenção dos altos
níveis de diversidade observados neste estudo.
A análise do sistema reprodutivo corrobora os estudos anteriores de que a
espécie se reproduz por fecundação cruzada.
Os marcadores alozímicos foram capazes de detectar efeitos de seleção,
evidenciados por um aumento na taxa de heterozigotos na direção dos indivíduos
adultos e, portanto, confirmando os resultados obtidos em estudos prévios com
esta espécie.
Contudo, os resultados obtidos neste estudo indicaram questões adicionais a
serem estudadas:
Em função do elevado nível de variabilidade dos locos microssatélites observado
em E. edulis, recomenda-se aumentar o tamanho das amostras (>100) visando
otimizar a informação genética proporcionada por esses marcadores.
Novos estudos são necessários sobre os efeitos do manejo tecnificado, uma vez
que os resultados obtidos neste estudo podem ter sido influenciados por outros
eventos de exploração ocorridos no passado e pelas populações existentes nas
proximidades devido ao elevado fluxo gênico da espécie.
Finalmente, em virtude do baixo número de gerações transcorridas após a
exploração, recomenda-se o monitoramento das gerações futuras, principalmente
em áreas críticas de exploração da espécie, tendo em vista as tendências
observadas no presente estudo.
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/Submetido/