claudine maria alves feio a euterpe oleracea (açaí) modifica o

Claudine Maria Alves Feio

A Euterpe oleracea (açaí) modifica o

metabolismo de esteróis e atenua a

aterosclerose induzida experimentalmente

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção

do título de Doutor em Ciências

São Paulo 2011





Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo –

Escola Paulista de Medicina para obtenção

do título de Doutor em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Francisco Antonio Helfenstein Fonseca

Co-orientador: Profa. Dra. Maria Cristina de Oliveira Izar

Co-orientador: Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara

São Paulo 2011

Feio, Claudine Maria Alves A Euterpe oleracea (açaí) modifica o metabolismo de esteróis e atenua a

aterosclerose induzida experimentalmente / Claudine Maria Alves Feio ; orientador,

Francisco Antonio Helfenstein ; co-orientadoras, Maria Cristina Oliveira Izar, Silvia

Saiuli Miki Ihara. - 2011

xiii, 53 p.

Tese (doutorado)-Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de

Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cardiologia. São Paulo, 2011.

Título em inglês: Euterpe oleracea (açai) modifies sterol metabolism and

attenuates experimentally-induced atherosclerosis 1. Euterpe olerácea. 2. Aterosclerose. 3. Lípides. 4. Desmosterol. 5. Fitosteróis.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA – DISCIPLINA DE CARDIOLOGIA

Chefe do Departamento: Reinaldo Salomão

Coordenador do Curso de Pós Graduação: Valdir Ambrósio Moisés





Presidente da Banca: Prof. Dr. Francisco Antonio Helfenstein Fonseca

Banca Examinadora:

Prof. Dr.

Prof. Dr.

Prof. Dr.

Prof. Dr.

Aprovada em: ____ / _____/ ______

ii

DEDICATÓRIA

Aos meus queridos pais Antonio e Fernanda,

(in memoriam), pelo amor incondicional e

dedicação durante tantos anos.

Ao Max, meu marido, meu amigo e companheiro

obrigada por todo o amor, respeito e

felicidade durante todos esses anos .

Ao meu filho e amigo Thiago

obrigada pelo incentivo,

amor e carinho

iii

AGRADECIMENTOS

Um agradecimento especial ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Fonseca, por toda a confiança depositada em mim, pelo apoio constante e amizade, pela paciência, orientações pertinentes e incentivo. Que Deus o conserve sempre assim e lhe dê toda a felicidade que o senhor merece;

À minha querida co-orientadora e amiga Prof. Dra. Maria Cristina Izar, por toda a paciência, ajuda e incentivo, sempre disposta a ajudar os mais necessitados;

À minha amiga e co-orientadora Prof. Dra. Sílvia Saiuli Miki Ihara, sempre disponível e interessada na pesquisa;

Ao prof. Dr. Antonio Carvalho pela confiança e oportunidade deste doutorado;

A minha querida amiga e colaboradora Soraia Kasmas, pela inestimável ajuda;

Aos meus irmãos (ãs), cunhadas (os) e sobrinhos pela ajuda e compreensão em todos os momentos;

À Universidade Federal do Pará (UFPA) pela oportunidade deste Doutorado;

À Universidade do Estado do Pará (UEPA) pela oportunidade deste Doutorado;

À professora Eliete da Cunha Araújo, Coordenadora do Instituto Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará pela ajuda e incentivo na realização deste Doutorado;

À professora Tânia de Fátima D’Almeida Costa, Diretora da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Pará;

À professora Laélia Feio Brasil pela ajuda e apoio na realização deste projeto

Ao professor Paulo Amorim pela inestimável ajuda na concretização deste estudo;

Aos queridos amigos e funcionários do setor de Lípides, Aterosclerose e Biologia Vascular (UNIFESP);

À secretária da pós-graduação a Sra. Christina Almeida, pela paciência e disponibilidade;

Ao laboratório Paulo Azevedo pela grande ajuda na realização da bioquímica dos coelhos em especial à pessoa do Dr. Paulo Azevedo e a Dra. Lígia;

iv

Às minhas queridas amigas Maria Elizabeth Caetano, Sonia Conde Cristino e Heloisa Guimarães pelo constante incentivo e ajuda;

Aos meus colegas, professores da Disciplina de Cardiologia da UFPA, pela compreensão e ajuda;

Aos meus colegas, professores da Disciplina de Propedêutica Médica da UEPA, pela compreensão e ajuda;

Ao doutorando Luís Antonio Maués pela importante contribuição na realização dos exames;

Às alunas Luana Relvas, Thais Tapajós e Daniel Charone, pela importante contribuição em todas as fases da realização deste projeto;

À bibliotecária do Instituto de Ciências da Saúde, Sra. Vilma Bastos, pela inestimável ajuda, durante todo este tempo;

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste projeto.

v

Este trabalho foi realizado, em parte, com auxílio financeiro da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) processo: 2008/55443-6. Aprovado pelo Comitê de Ética animal em Pesquisa da UFPA sob o número 002/2006.

vi

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA _______________________________________________ ii

AGRADECIMENTOS _________________________________________ iii

LISTA DE FIGURAS _________________________________________ viii

LISTA DE TABELAS _________________________________________ ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS _________________________ x

RESUMO __________________________________________________ xii

ABSTRACT ________________________________________________ xiii

1 INTRODUÇÃO _____________________________________________ 1

1.1 EPIDEMIOLOGIA ___________________________________________________ 1

1.2 FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR ______________________________ 2

1.3 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE ______________________________ 7

1.3.1 Indução de Aterosclerose em coelhos ______________________________ 10

1.3.2 Evolução da Aterosclerose em Humanos ____________________________ 12

1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A EUTERPE OLERACEA ____________________ 13

2 OBJETIVOS ______________________________________________ 18

2.1 OBJETIVOS GERAIS ______________________________________________ 18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS _________________________________________ 18

3 MÉTODOS________________________________________________ 19

3.1. DESENHO EXPERIMENTAL ________________________________________ 19

3.2 ANIMAIS ________________________________________________________ 21

3.3 DIETA __________________________________________________________ 21

3.4 INDUÇÃO DE HIPERCOLESTEROLEMIA ______________________________ 22

3.5. EUTERPE OLERACEA (AÇAÍ)_______________________________________ 22

3.5.1 Composição Química da Euterpe Oleracea_________________________ 22

3.6 PARAMETROS AVALIADOS NO PROTOCOLO EXPERIMENTAL ___________ 24

3.6.1 Aspectos laboratoriais ___________________________________________ 24

3.6.1.1 Dosagens bioquímicas __________________________________________ 24

3.6.1.2 Metodologia empregada ________________________________________ 24

3.6.1.3 Lípides _______________________________________________________ 24

3.6.1.4 Quantificação dos Esteróis ______________________________________ 25

3.7 SACRFÍCIO DOS ANIMAIS __________________________________________ 25

3.7.1 Aspectos cirúrgicos - Retirada da Artéria Aorta _______________________ 25

vii

3.7.2 Análise Histopatológica das Aortas ___________________________________ 26

3.7.2.1 Avaliação Macroscópica ________________________________________ 26

3.7.2.2 Avaliação da Extensão das Lesões Ateromatosas ___________________ 26

3.7.2.2.1 Avaliação Microscópica _______________________________________ 27

3.7.2.2.2 Avaliação Histológica por Microscopia óptica _____________________ 27

3.7.3 Estudo Imuno-histoquímico _______________________________________ 27

3.7.4 Estudo Histopatológico __________________________________________ 28

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ___________________________________________ 29

4 RESULTADOS ____________________________________________ 30

5 DISCUSSÃO ______________________________________________ 36

6 CONCLUSÕES ____________________________________________ 39

REFERÊNCIAS _____________________________________________ 40

ANEXOS _____________________________________________________

Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética Institucional ____________________

Anexo 2: Manuscrito _____________________________________________________

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismo de ação do fitosterol________________________________33

Figura 2: Palmeira do Euterpe oleracea (açaí)_____________________________33

Figura 3: Cachos e frutos do Euterpe oleracea (açaí)_______________________33

Figura 4: Euterpe oleracea (açaí) sendo despolpado_______________________33

Figura 5: Extrato (vinho) do Euterpe oleracea (açaí)________________________33

Figura 6: Organograma do desenho experimental_________________________33

Figura 7: Box plots da área de placas no arco aórtico e relação íntima/média___33

Figura 8: Box plots da área das placas mensuradas por planimetria__________34

Figura 9: Box plots de imagens representativas de aortas coradas pelo Sudam

III__________________________________________________________________35

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição química da Euterpe oleracea_____________________22

Tabela 2. Pêso dos animais nas semanas 12 e 24________________________29

Tabela 3. Perfil lipídico e glicemia nas semanas 12 e 24__________________30

Tabela 4. Desmosterol, campesterol e beta-sitosterol ao final do estudo____31

Tabela 5. Composição das placas das aortas ao final do estudo por grupo__32

x

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AVC: Acidente vascular cerebral

CT : Colesterol total

DAC: Doença arterial coronariana

DCNT: Doenças crônicas não transmissíveis

DCV: Doenças cardiovasculares

DHA: Ácido graxo docosahexaenóico

DM2: Diabetes mellitus tipo 2

DNA: Ácido desoxirribonucleico

ECA: Enzima conversora de angiotensina

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EMI: Espessura médio-intimal

eNOS: Óxido nítrico sintetase endotelial

EPA: Ácido graxo eicosapentaenóico

FR: Fatores de risco

H2O2: Peróxido de hidrogênio

HÁ: Hipertensão arterial

HDL: Lipoproteína de alta densidade

HE: Hematoxilina e eosina

I/M: Relação íntima média

IAM: Infarto agudo do miocárdio

ICAM-1: Molécula de adesão inter-celular 1

IgG: imunoglobulinas G

IMC: Índice de massa corpórea

ICAM-1: Molécula de adesão intercelular 1

xi

LDL: Lipoproteína colesterol de baixa densidade

LDLox: Lipoproteína de baixa densidade oxidada

NCEP: Programa de Educação Nacional do Colesterol

NF-KB: Fator nuclear kappa B

NPC1L1: Proteína Niemann-Pick C1 Like 1

PBS: Tampão fosfato salino

PCR: Proteína C-reativa

PECAM-1: Molécula de adesão de plaquetas/célula endotelial

RI: Resistência a insulina

SEM: Erro padrão da média

SM: Síndrome metabólica

VCAM-1: Molécula de adesão ao endotélio vascular

VLDL: Lipoproteína de muito baixa densidade

WHO: Organização mundial de saúde

xii

RESUMO

Introdução: Euterpe oleracea (açaí) é uma fruta da região amazônica, cuja

composição química pode ser benéfica para indivíduos com aterosclerose. Nós

hipotetizamos que o consumo de Euterpe oleracea poderia reduzir o desenvolvimento

da aterosclerose por uma redução na absorção e síntese de colesterol. Métodos:

Coelhos machos Nova Zelândia foram alimentados com uma dieta enriquecida em

colesterol (0.5%) por 12 semanas, quando foram aleatoriamente distribuídos para

tratamento com Euterpe oleracea ou água além de dieta enriquecida em colesterol

(0,05%) por 12 semanas adicionais. Fitosteróis plasmáticos e desmosterol foram

determinados por cromatografia líquida de alto desempenho e espectrometria de

massa. As lesões ateroscleróticas foram estimadas por planimetria computadorizada.

Resultados: Ao sacrifício, os animais tratados com Euterpe oleracea tiveram menores

níveis de colesterol total (p=0.03) e de colesterol não-HDL (p=0.03) em comparação

aos controles. Estes animais tiveram menores areas de aterosclerose em suas aortas

((p=0.001) e menor relação íntima/média (p=0.002) em comparação aos controles. Ao

final do estudo, os valores plasmáticos de campesterol, β-sitosterol, e desmosterol não

diferiram entre os grupos. Entretanto, os animais tratados com Euterpe oleracea

mostraram menores valores para as relações desmosterol/campesterol (p=0.026) e

desmosterol/β-sitosterol (p=0.006) em comparação aos controles. Conclusões:

Consumo do extrato de Euterpe oleracea marcadamente melhora o perfil lipídico e

atenua a aterosclerose. Estes efeitos foram em parte relacionados a um melhor

balanço entre síntese e absorção de esteróis.

Palavras-chave: Euterpe oleracea, aterosclerose, lípides, desmosterol, fitosteróis.

xiii

ABSTRACT

Background: Euterpe oleracea (açaí) is a fruit from the Amazon region, whose

chemical composition may be beneficial for individuals with atherosclerosis. We

hypothesized that consumption of Euterpe oleracea would reduce therosclerosis

development by a decrease in cholesterol absorption and synthesis. Methods: Male

New Zealand rabbits were fed a cholesterol-enriched diet (0.5%) for 12 weeks, when

they were randomized to receive Euterpe oleracea extract or water plus a 0.05%

cholesterol-enriched diet for additional 12 weeks. Plasma phytosterols and

desmosterol were determined by ultra performance liquid chromatography and mass

spectrometry. Atherosclerotic lesions were estimated by computerized planimetry.

Results: At sacrifice, animals treated with Euterpe oleracea had lower levels of total

cholesterol (p=0.03) and non-HDL-cholesterol (p=0.03) as compared to controls.

These animals had smaller atherosclerotic plaque area in their aortas (p=0.001) and

a smaller intima/media ratio (p=0.002) in comparison with controls. At the end of the

study, campesterol, β-sitosterol, and desmosterol plasma levels did not differ

between groups. However, animals treated with Euterpe oleracea showed lower

values for the desmosterol/campesterol (p=0.026) and desmosterol/β-sitosterol

(p=0.006) ratios as compared to controls. Conclusion: Consumption of Euterpe

oleracea extract markedly improved the lipid profile and attenuated atherosclerosis.

These effects were related in part to a better balance in the synthesis and absorption

of sterols.

Key words: Euterpe oleracea, atherosclerosis, lipids, desmosterol, phytosterols

1

INTRODUÇÃO

1.1 EPIDEMIOLOGIA

As doenças cardiovasculares (DCV) assumem importante destaque na

mortalidade mundial, tanto em países desenvolvidos como em países em

desenvolvimento, sendo responsáveis por aproximadamente 50% das mortes em

países ocidentais. Desde a década de 1970 a taxa de mortalidade por idade foi

reduzida pela metade em países industrializados, inclusive nos Estados Unidos,

talvez devido ao maior controle de fatores de risco como hipercolesterolemia,

hipertensão arterial e tabagismo (FORD et al., 2007; CAPEWELL et al., 2010).

Estima-se que 2/3 das mortes por DCV ocorram em países em desenvolvimento,

como o Brasil, taxa que corresponde ao dobro da observada em países

desenvolvidos (LAURENTI; BUCHALLA, 2001). No Brasil, a principal causa de morte

ainda é o acidente vascular cerebral (AVC), entretanto em alguns locais, como o

Estado de São Paulo o perfil de mortalidade se assemelha ao de países mais

desenvolvidos, ou seja, a maior mortalidade decorre da doença coronária

aterosclerótica (DAC) e o AVC ocupa o segundo lugar (LOTUFO; LOLIO, 1993;

LOTUFO, 2005; WHO, 2008).

A doença cardiovascular tem custo mais elevado em países em

desenvolvimento que em países desenvolvidos (MARTINEZ et al., 2003; RIBEIRO et

al., 2005), e a previsão para esses países é de piora desse quadro nos próximos

anos se não conseguirmos realizar o controle adequado dos fatores de risco. (LUZ et

al., 2003; SCHERR; RIBEIRO, 2009; SPOSITO et al., 2007; BLASI, 2008), elas são

responsáveis por grande parte da mortalidade dos brasileiros, correspondendo a

31% do total, sendo proporcionalmente maior nas mulheres em relação aos homens

(BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006). Essas doenças representam um crescente

encargo para a sociedade, para a família e para o indivíduo (MURRAY; LOPEZ,

1996; WHO, 2005). Entre os 58 milhões de óbitos mundiais em 2005, 35 milhões

foram causados pelas doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), o que

representa o dobro do número total de óbitos por todas as doenças de notificação

obrigatória. Em 2006 a World Health Statistics apontou que entre as doenças

crônicas não transmissíveis (DCNT), as doenças circulatórias despontam como a

2

principal causa de óbito, responsável por 31% de todos os casos, cerca de 17,5

milhões de óbitos (WHO, 2006).

A experiência de países desenvolvidos indica que intervenções sustentadas

na prevenção primária e secundária da doença aterosclerótica podem reduzir em até

4% a mortalidade média anual em pessoas na faixa etária entre 60 - 69 anos, e em

até 3% na faixa etária entre 70 - 79 anos. Essas faixas etárias, após intervenções

contínuas, foram as que mais evidenciaram queda na mortalidade em vários países

na década de 1990 (YACH, 2004; Australian Institute of Health And Welfare (AIHW),

2006; STRONG; MHATERS; BONITA, 2007). Além das medidas de intervenção na

prevenção primária e secundária, a efetiva implementação dos resultados de vários

ensaios clínicos aleatorizados, como, por exemplo, o uso de drogas trombolíticas, de

novas drogas antitrombóticas, a anticoagulação na fibrilação atrial crônica, a

disseminação de unidades de AVC, e a endarterectomia carotídea conseguiram

reduzir em até 80% a incidência de AVC (SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et al.,

2003; WALD; LAW, 2003).

Apesar dos grandes avanços nas áreas de diagnóstico e tratamento das

doenças cardiovasculares, a prevenção continua sendo o principal caminho para

combater esse problema. A prevenção tem como base o conhecimento dos fatores

de risco que levam à doença aterosclerótica, e entre esses fatores, a dislipidemia

destaca-se como um dos mais importantes, pois, representa um dos seus principais

desencadeantes, sendo o aumento dos níveis de colesterol o principal fator

envolvido no seu desenvolvimento (JALDIN et al., 2006).

1.2 FATORES DE RISCO

Na primeira metade do século passado, experimentos com animais e

observações clínicas ligaram certas condições, como por exemplo, a

hipercolesterolemia, ao risco aumentado de eventos aterotrombóticos

(BRAUNWALD, 2002). Após a avaliação de desfechos de estudos clássicos, como o

de Framingham e o Seven Countries Study, houve melhor compreensão das

doenças cardiovasculares e também, da relação entre alguns fatores e o risco de

desenvolver doenças cardiovasculares (DCV) (KEYS, 1970; PETER et al., 1998;

GORDON et al., 1981). A partir de então, a lista desses fatores continua crescendo,

3

dentre estes já implicados na patogênese da aterosclerose, podemos listar: idade,

sexo, hipertensão arterial, tabagismo, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), dislipidemia,

história familiar de infarto precoce do miocárdio, resistência periférica à insulina (RI),

obesidade e sedentarismo. Atualmente outros fatores, como níveis séricos

aumentados de homocisteína, lipoproteína (a), fibrinogênio e proteína C reativa, bem

como algumas infecções crônicas por organismos do gênero Chlamydia vêm sendo

investigados quanto a suas possíveis implicações neste processo (BRAUNWALD et

al., 2002; RIDKER et al., 2009), assim como também, a idéia de que tais fatores

possam ter uma etiopatogenia comum, pois, um hábito de vida sedentário, um

ambiente ansiogênico e uma alimentação hipercalórica rica em carboidratos e

gorduras saturadas, ao longo do tempo, podem levar à obesidade, aumento gradual

da resistência a insulina (RI), dislipidemia, hipertensão arterial (HA), diabetes

mellitus tipo 2 e síndrome metabólica (SM) (KANNEL, 2000; NCEP, 2002; SILVA;

LIMA, 2002; LINDSAY; HOWARD, 2004; TEIXEIRA et al., 2005; BRANDÃO et al.,

2005; MICHA et al., 2010; CHEN et al., 2010).

Alguns estudos mostram os benefícios do controle dos FR, como o estudo de

Ciorlia e Godoy, com seguimento de até 20 anos (CIORLIA; GODOY, 2005), o de

Caterina, demonstrando a relação entre a redução do colesterol e a incidência de

AVC (DE CATERINA et al., 2010). No Brasil, por meio dos dados do estudo

AFIRMAR, foi verificado que a maioria dos fatores de risco (FR) para infarto agudo

do miocárdio (IAM) é passível de prevenção (PIEGAS et al., 2003). Outros estudos

no Brasil, também enfatizam a grande importância do controle dos fatores de risco

na prevenção do infarto agudo do miocárdio (AVEZUM; PIEGAS; PEREIRA, 2005;

BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006).

O INTERHEART (YUSUF, 2004), um estudo destinado ao exame de fatores

de risco para doença arterial coronariana, foi desenvolvido em 262 centros de 52

países dos cinco continentes, onde pacientes com infarto do miocárdio nas

primeiras 24 horas foram comparados com um grupo controle e se verificou que

nove fatores de risco explicaram mais de 90% do risco para o infarto do miocárdio.

O tabagismo e a dislipidemia representaram mais de dois terços deste risco. Em

outro estudo que incluiu 22 países e 6.000 pessoas, metade das quais tinha sofrido

um acidente vascular cerebral, os investigadores identificaram dez fatores de risco

4

comuns, entre os quais tabagismo, pressão arterial e gordura abdominal,

apresentado no World Congresso of Cardiology (O’DONNELL et al., 2010). Dentre

os fatores de risco encontrados no estudo INTERSTROKE, cinco foram mais

prevalentes a hipertensão arterial, o tabagismo, o consumo de álcool, a gordura

abdominal e a má alimentação que são fatores de risco passíveis de intervenção. De

acordo com uma revisão feita pela American Heart Association (AHA), três classes

de compostos encontrados nas frutas e vegetais como os esteróis, flavonóides e

compostos contendo enxofre, ácidos graxos monoinsaturados (AGMI) e

poliinsaturados (AGPI), de vitaminas e minerais com ação antioxidante (A, C, E, Se),

de ligninas, podem ser importantes na redução do risco de arteriosclerose

(MOREIRA et al., 2006; NAGAO; YANAGITA, 2008; O’DONNELL et al., 2010).

Os esteróis vegetais ou fitosteróis são substâncias de origem vegetal, cuja

estrutura química é muito similar à do colesterol. A sua ação hipocolesterolêmica

parece resultar da inibição da absorção do colesterol no intestino delgado, resultante

do fato de haver competição entre os fitosteróis e o colesterol na solubilização da

micela, alterando a atividade de enzimas envolvidas no metabolismo e excreção do

colesterol. Os fitoesteróis são mais hidrofóbicos e têm maior afinidade pelas micelas

do que o colesterol, logo estes são menos absorvidos e mais excretados (Fig.1). Os

principais tipos de fitoesteróis são o β-sitosterol, sitostanol e campesterol. O β-

sitosterol, principal fitosterol extraído dos óleos vegetais, e o sitostanol-éster, produto

de sua esterificação, reduzem a absorção do colesterol alimentar, em torno de 30 a

40% (ROBERFROID; CALDERON, 1994;

LOTTENBERG, 2002; LU, 2007).

Alguns estudos clínicos e também

experimentais têm mostrado que a adição de 3

g/dia de fitoesteróis na dieta pode reduzir os

níveis plasmáticos tanto do colesterol total como

da fração LDL-colesterol, mas as concentrações

de HDL-colesterol e de triglicérides não

apresentam modificações significativas (SANTOS, 2001; SALGADO et al., 2008). O

consumo diário de 1,6g de esteróis vegetais reduziu eficazmente o LDL-colesterol

em indivíduos com hipercolesterolemia moderada sem efeitos deletérios nos

biomarcadores de stress oxidativo (LOTTENBERG et al., 2002; HANSEL et al.,

2007). O EPIC NORTFOLK, estudo realizado com mais de 22 mil pessoas, observou

Fig.1 Mecanismo Ação do Fitosterol

5

que quanto maior o consumo de fitosteróis, menor é o valor plasmático do LDL, tanto

em homens quanto em mulheres (ANDERSSON et al., 2004). Uma metanálise que

envolveu mais de 6.000 pacientes observou que o consumo de aproximadamente

2,0 g/dia de fitosterol levou a uma redução de 10% do nível do LDL-C plasmático e

que existe uma relação linear, de forma que quanto maior o consumo de fitoesterol

maior é a redução do LDL, até 3,0 g/dia, consumidos num único período ou ao longo

do dia (DEMONTY et al., 2009). Os transportadores responsáveis pela eliminação

do colesterol e fitosteróis são ABCG5 e ABCG8, devolvendo estes esteróis à luz

intestinal. Foram também descritos no fígado, onde secretam na bile, pela mesma

via, os fitosterois e o colesterol, mecanismo este diferente da ação da ezetimiba que

também reduz a absorção do colesterol, mas por meio da inibição do transportador

NPC1L1 que é o responsável pela absorção de esteróis livres na parede intestinal

(KATRAGADDA; RAI; ARORA, 2010). Os fitosteróis, quando associados à estatina

podem reduzir em até 17% o colesterol plasmático (BLAIR et al., 2000).

Os flavonóides têm estruturas químicas variadas e são encontrados nas

frutas, vegetais, nozes e sementes. Alguns têm mostrado efeito antioxidante, outros

possuem efeitos antiplaquetários. As principais fontes de flavonóides incluem o

vinho tinto e os produtos da soja (isoflavonas). O Euterpe oleracea Mart. contém

78mg de fitosteróis por litro do suco da fruta, os habitantes locais costumam

consumir até um litro do suco dessa fruta /dia (ROGEZ, 2000), que contém 1,28 g de

flavonóides por litro de suco, sendo o principal a cianidina-3 glucosídeo,

comprovadamente três a cinco vezes mais forte do que o trolox (análogo da vitamina

E) e um volume 10 a 30 vezes maior de antocianinas que o vinho tinto (ROGEZ,

2000; O’DONNELL et al., 2010). Os compostos fenólicos, ou polifenóis, presentes no

Euterpe oleracea Mart., são os grandes responsáveis por sua atividade antioxidante,

que atuam na prevenção da aterosclerose reduzindo a oxidação do LDL-colesterol.

Também possuem alto teor de lipídios, o que lhes conferem alto valor energético. O

Euterpe oleracea Mart. é uma fruta tropical rica em compostos bioativos como

carotenóides, antocianinas e compostos fenólicos. Os carotenóides, como o beta-

caroteno e o licopeno, são pigmentos naturais com algumas propriedades como

atividade antioxidante, anticancerígena e pró-vitamina A. As antocianinas pertencem

à classe dos flavonóides e possuem ação hipolipemiante, antiplaquetária,

antitrombótica e antioxidante. Esta fruta possui aproximadamente 0,2 a 3,8mg/100g

de carotenóides totais, 14,0 a 54,0mg/100g de antocianinas e 183,0 a 600 mg/100g

6

de compostos fenólicos e encontra-se entre as frutas que apresentam maior

capacidade antioxidante, sendo também rica em proteínas, vitaminas, minerais e

fibras, mantendo suas propriedades mesmo sob a forma de polpa congelada

(KUSKOSKI et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; SANTOS et

al., 2008).

Estudos experimentais e clínicos mostram ação protetora de vitaminas

antioxidantes (beta-caroteno e vitamina E) na aterosclerose (KANG; LEAF, 2000).

Os flavonóides também são antioxidantes, encontrados nos alimentos,

principalmente verduras, frutas, grãos, sementes, castanhas, condimentos e ervas e

também em bebidas como vinho e chá (RIBEIRO; SHINTAKU, 2004).

O estudo realizado por Lin mostrou que a suplementação com fitosteróis na

dieta pode modificar o metabolismo do LDL-colesterol (LIN et al., 2010),

principalmente com o uso de doses mais elevadas (RACETTE et al., 2010).

Tão importante quanto os fitosteróis, são as fibras vegetais. Na década de

1970 começaram a surgir estudos relacionando as fibras com a saúde, em

pesquisas demonstrando que em comunidades que consumiam poucos alimentos

processados industrialmente, eram raras as doenças como hipertensão, infarto do

miocárdio, obesidade e distúrbios gastrointestinais, (NEVES, 1997; GONÇALVES,

2007). Em nosso País, não existe uma avaliação precisa do consumo de fibras

dietéticas, muito embora, alguns trabalhos já alertem para o baixo consumo de fibras

em todas as classes sociais, como conseqüência da ingestão reduzida de frutas e

hortaliças (MATTOS; MARTINS, 2000).

Estudos realizados tanto com animais (RIBEIRO et al., 1998; ROSA et al.,

1998: PIEDADE; CANNIATTI-BRAZACA, 2003; ODETOLA; IRANLOYE, Y;

IRANLOYE, O, 2004), quanto com humanos (OLIVEIRA; SICHIERI, 2004; JENKINS

et al., 2005; DIKEMAN; MURPHY; FAHEY, 2006; ROGOVIC et al., 2006), permitem

evidenciar os efeitos benéficos das fibras solúveis na atenuação da dislipidemia, a

partir de diferentes mecanismos de ação, ligados principalmente a redução da

absorção intestinal do colesterol dietético, ao aumento da excreção fecal dos ácidos

biliares, forçando o fígado a degradar mais colesterol, para produzir novos ácidos

biliares, e pela própria inibição da síntese endógena do colesterol pela succinil-CoA,

formada a partir do propionato originado do metabolismo das fibras solúveis no

intestino (LÓPEZ et al., 1997; RAUP et al., 2000; MARLETT; MCBURNEY; SLAVIN,

2002).

7

Mais recentemente, num estudo transversal de menor porte com cerca de

2.000 mulheres que fizeram parte da população do estudo National Health and

Nutrition Examination Survey (1999-2000), onde se avaliou a relação entre a

ingestão de grãos integrais e o IMC, demonstrou que mulheres que costumavam

consumir mais frequentemente grãos integrais tinham valores de IMC e

circunferência da cintura menores, e menor predisposição para terem sobrepeso

(SAVAGE; MARINI; BIRCH, 2008; GOOD et al., 2008). Todavia, faz-se necessário

um maior número de estudos (GONÇALVES et al., 2007; MELLO; LAAKSONEN,

2009).

Várias pesquisas têm demonstrado uma redução da taxa de mortalidade para

doenças cardiovasculares após o uso de ácidos graxos poliinsaturados ômega 3 de

cadeia longa (EPA, DHA) e de cadeia mais curta (Ácido α-linolênico - ALA)

(CONNOR, 2000; MORISE, 2004; RIBEIRO; SHINTAKU, 2004).

1.3 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE

Estudos experimentais e clínico–epidemiológicos comprovam que a

aterosclerose é uma doença multifatorial, e como tal é necessária uma abordagem

mais abrangente no controle dos múltiplos fatores de risco cardiometabólicos, dentre

estes fatores a hipercolesterolemia exerce um papel muito importante. (KANNEL,

2000; NCEP, 2002; LINDSAY; HOWARD, 2004; TEIXEIRA et al., 2005; BRANDÃO

et al., 2005). Atualmente não se discute mais a influência da hipercolesterolemia na

doença arterial coronária. Os níveis sanguíneos de colesterol são determinados em

grande parte por fatores genéticos e fatores ambientais (NCEP, 2001; POZZAN;

POZZAN, R; BRANDÃO, 2005; BAIGENT et al., 2006; GIROLDO; ALVES; BATISTA,

2007; KOLANKIEWICZ; GIOVELLI; BELLINASO, 2008).

Atualmente se sabe que a história natural da aterosclerose, vai muito além da

dislipidemia (LIBBY, 2002). Ela consiste em um processo crônico, progressivo,

sistêmico, degenerativo de etiologia multicausal caracterizada por resposta

inflamatória e fibroproliferativa da parede arterial, a qual é determinada por

agressões à superfície arterial (SOWERS; EPSTEIN; FROHLICH, 2001). O distúrbio

da função do endotélio vascular é o passo inicial para a aterogênese (GORDON et

al., 1981; BRAUNWALD, et al.,2002), sendo a hipercolesterolemia um dos seus

8

principais desencadeantes (NCEP, 2002).

Em 1999, Russel Ross, um dos principais estudiosos da fisiopatologia da

aterosclerose, mostrava a aterosclerose como doença inflamatória (ROSS, 1999),

demonstrou que a elevação dos níveis de lipídios e de lipoproteínas, além da

elevação de outras moléculas do sangue como a homocisteína, infecções e

hipertensão, podem, induzir ou promover inflamações associadas à aterosclerose

(ROSS, 1999). Essa pesquisa mudou a visão sobre a aterosclerose, surgindo então

o conceito da aterosclerose como uma doença inflamatória crônica de origem

multifatorial em resposta à agressão endotelial, uma doença generalizada da parede

arterial, que pode evolutivamente progredir, regredir ou estabilizar-se, na

dependência de uma série de fatores (AIKAWA; LIBBY, 2004). Esse processo

dinâmico é caracterizado por remodelamento na parede arterial que pode

permanecer silencioso por muito tempo ou pode manifestar-se como um evento

vascular agudo, tornando-se clinicamente aparente, ou seja, a doença vascular

aterosclerótica deve ser entendida como um complexo processo fisiopatológico, em

que a inflamação crônica vascular se associa com ciclos de agudização da

inflamação e de acentuação do estado pró-trombótico (NISSEN et al., 2004;

SOLIMAN; KEE, 2008), acomete principalmente a camada íntima de artérias de

médio e grande calibre, é um processo que se inicia na infância, apresenta

progressão lenta, acometendo basicamente as artérias elásticas, como a aorta,

carótidas e ilíacas e as artérias musculares de grande e médio calibre, como

coronárias e poplíteas (ROSS; GLOMSET, 1976; LIBBY, 2002; ENGELHORN et al.,

2005; SPOSITO et al., 2007).

A American Heart Association classifica as lesões ateroscleróticas em dois

grupos: lesões precursoras e avançadas. As lesões do tipo precursoras são

silenciosas, discretas e não provocam desorganização da íntima, da média e nem da

adventícia, elas podem ainda ser subdivididas segundo um critério

predominantemente morfológico em lesões do tipo I, II e III (ZHAN-LONG et al.,

2008).

As lesões do tipo avançadas envolvem a desorganização da íntima arterial,

promovem um aumento significativo de sua espessura, provocando sérios danos

como trombose, embolia, necrose, infarto e hemorragia, assim como também o

excesso de lipídios pode modificar a morfologia da média e da adventícia. Elas se

classificam em lesões do tipo IV a VIII. É indiscutível que as lesões avançadas

9

podem trazer conseqüências deletérias à saúde do indivíduo, entretanto, é

importante lembrar que as lesões precursoras provêm o caminho para que as lesões

avançadas se desenvolvam (FRANÇA, T; FRANÇA, N, 2001).

A formação da placa aterosclerótica tem início com a agressão ao endotélio

vascular que pode ocorrer por diversos fatores como, a hipertensão arterial, o

tabagismo, a elevação de lipoproteínas aterogênicas que levam a disfunção

endotelial, manifesta principalmente por deficiência de óxido nítrico (NO) e

prostaciclina e por aumento dos níveis circulantes de endotelina-1 (ET-1),

angiotensina II (ang. II) e inibidores do ativador do plasmonogênio-1(PAI-1)

(PACKARD; LIBBY, 2008), aumentando assim a permeabilidade da íntima às

lipoproteínas plasmáticas favorecendo a retenção das mesmas no espaço

subendotelial. O mecanísmo inicial da aterogênese é o depósito de lipoproteínas na

parede arterial que ocorre de modo proporcional à concentração dessas

lipoproteínas no plasma. Outra manifestação da disfunção endotelial é o surgimento

de moléculas de adesão leucocitária na superfície endotelial processo esse

estimulado pela presença de LDL minimamente oxidada. Em uma edição de 1989,

do New England Journal of Medicine, o pesquisador Daniel Steinberg postulou que

os radicais livres alteram ou oxidam o colesterol LDL e que se a esses pacientes

fosse fornecido antioxidantes adequados seria possível evitar essa oxidação

(STEINBERG, 1989). As moléculas de adesão leucocitária são indutoras da

produção de substâncias quimiotáxicas pelos macrófagos, levando a um processo

de adesão monocitária e interiorização no espaço subendotelial, ou seja, são

responsáveis pela atração de monócitos e linfócitos T para a parede arterial. Os

monócitos migram para o espaço subendotelial onde se diferenciam em macrófagos

que captam as LDL oxidadas, ficam repletos de lípides e passam a ser chamados de

células espumosas, sendo os principais componentes das estrias gordurosas que

são as lesões macroscópicas iniciais da aterosclerose. Alguns mediadores da

inflamação estimulam a migração e proliferação das células musculares lisas da

camada média arterial que ao migrarem para a íntima passam a produzir citocinas,

fatores de crescimento e matriz extracelular que formará parte da capa fibrosa da

placa aterosclerótica. A placa aterosclerótica é constituída por elementos celulares,

componentes da matriz extracelular, núcleo lipídico que é rico em colesterol e uma

capa fibrosa rica em colágeno. (LIBBY, 2003; SPOSITO et al., 2007; ARAÚJO, 2007;

BLASI, 2008).

10

1.3.1 Indução de aterosclerose em coelhos

A primeira investigação sobre indução experimental de aterosclerose ocorreu

em 1908 com Ignatowski, que utilizou coelhos alimentados com leite, carne e ovo e

observou espessamento da íntima em suas aortas. Logo depois, Lubarsch (1910,

1912) e Steimbiss (1913) desenvolveram aterosclerose em aorta de coelhos com

dietas envolvendo fígado, adrenal e músculo (IGNATOWSKI, 1908;

MOGHADASIAN, 2002).

Na Rússia, em 1912, o pesquisador Nicolai Anitschkov induziu aterosclerose

em coelhos alimentados com gemas de ovos misturadas a óleo de girassol. No ano

seguinte o próprio Nicolai publicou o que veio a ser o primeiro experimento de

reprodução de aterosclerose em animais na história da medicina. Esses trabalhos

foram praticamente esquecidos, mas retornaram com toda força por volta de 1954,

quando também da Rússia o pesquisador David Kritchevsky confirmou que coelhos

alimentados com gorduras e colesterol apresentavam lesões ateromatosas, afirmou

também que a administração de gorduras poliinsaturadas tinha provocado

diminuição nos níveis de colesterol dos animais pesquisados (KRITCHEVSKY et al.,

1989; KRITCHEVSKY, 2001; PUPPIN, 2004).

Em 1926, Clarkson e Newburgh, alimentaram coelhos com dieta rica em

colesterol e encontraram moderada aterosclerose em 71% dos coelhos alimentados

com 507 mg/dia de colesterol por 47-87 dias. Meeker e Kesten (1940-1941)

dissolveram 60 ou 250 mg de colesterol em óleo vegetal e acrescentaram à dieta de

coelhos por três meses e verificaram que os animais desenvolveram lesões

ateroscleróticas típicas, similares àquelas vistas em humanos, permanecendo, deste

modo, a teoria de que o colesterol é o precursor para o desenvolvimento de doença

vascular aterosclerótica (KRITCHEVSKY, 1995).

Para induzir hipercolesterolemia em animais, têm-se utilizado dietas contendo

1% de colesterol em rações, em várias pesquisas, alcançando hipercolesterolemia

moderada com níveis de colesterol plasmáticos na faixa de 200 a 800 mg/dl

(HOLVOET; COLLEN, 1997; IHARA et al.,2001), mas essas lesões produzidas são

topográfica e morfologicamente dissimilares àquelas vistas em humanos, devido em

parte, ao fato de que humanos comumente não ingerem grandes quantidades de

colesterol, e em geral, seus níveis de colesterol plasmático não excedem 800mg/dl,

11

além do que processam e toleram o consumo de colesterol melhor do que os

coelhos (KOLODGIE et al., 1996). Essa indução é para investigarmos substâncias

que podem ser viabilizadas, no futuro, como medicamentos no controle do

metabolismo lipídico e no desenvolvimento de testes de potenciais terapias e

diagnósticos entre diferentes procedimentos experimentais (PERCEGONI et al.,

2004; LIMA et al., 2008).

As lesões ateroscleróticas observadas são compostas por três componentes

maiores, o primeiro é o componente celular, que predominantemente compreende

células musculares lisas e macrófagos, o segundo componente é o tecido conectivo

matriz e lipídio extracelular e o terceiro componente é o lipídio intracelular, que se

acumula dentro de macrófagos, convertendo-se, então, em células espumosas

(CROWTHER, 2005). Tem sido observada a presença de leucócitos aderidos ao

arco aórtico torácico e abdominal de coelhos após três semanas de dieta

enriquecida com 0,2% de colesterol; ao se aumentar o tempo de indução para 3-5

semanas com essa mesma dieta, numerosas células espumosas são encontradas

no espaço subendotelial e constituem o desenvolvimento de camadas de gordura na

mesma localização em que monócitos aderentes foram observados anteriormente

(ROSENFELD et al., 1987).

O coelho é a espécie mais estudada, em especial a linhagem Nova Zelândia,

citada pela primeira vez por IGNATOWSKI (1908) e isso se deve ao fato desta

espécie desenvolver hipercolesterolemia, em poucos dias, quando se administra

uma dieta acrescida de colesterol entre 0,1 a 2% por aproximadamente 12 semanas

(BOCAN et al., 1993; YANNI, 2004; JALDIN et al., 2006; RIEDMÜLLER et al., 2010).

Esse modelo permite a formação de lesões ateroscleróticas nas aortas torácica e

abdominal (PATEL et al., 2008; DUCKWORTH et al., 2009) assim como, em

carotídas (YANNI, 2004; HERTZEL et al., 2008). Bocan et al (1993) forneceram a

coelhos uma dieta composta por níveis variáveis de colesterol, mostrando que a

extensão e o tipo de lesão aterosclerótica eram proporcionais à concentração de

colesterol plasmático, o qual, por sua vez, aumentava de acordo com a percentagem

de colesterol na dieta. As alterações no perfil lipídico ocorriam precocemente, cerca

de duas semanas após a introdução da dieta hipercolesterolêmica. Já as lesões nas

aortas de coelhos dependiam da concentração do colesterol, assim como também

da duração da dieta, sendo que uma baixa concentração de colesterol quando

administrada por um longo período provocava lesões na artéria aórtica bastante

12

semelhantes às lesões que ocorrem em humanos (KOLODGIE et al., 1996;

FINKING; HANKE, 1997; AIKAWA et al., 1998; SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et al.,

2003, HELFENSTEIN et al., 2011).

A extensão da aterosclerose em aorta de coelhos pode ser quantificada pela

superfície de lesões sudanofílicas (STAPRANS et al., 1998) e por análise imuno-

histoquímica (NAKAZATO et al., 1996). O grau de aterosclerose em coelhos tende a

ser maior na aorta abdominal do que na torácica, o que pode ser devido ao efeito

hemodinâmico ou pelo fato de que a aorta abdominal de coelhos diminui

gradualmente abaixo na bifurcação aórtica e dessa forma, a aorta mais distal pode

ter mais lesão em relação à aorta proximal (JOHNSTONE et al., 2001). Mudanças

ateromatosas com 08 semanas em coelhos alimentados com colesterol são

formadas na aorta torácica e, então, estendem para a aorta abdominal, artéria

coronária e outros vasos, predominando lesões concêntricas na aorta torácica e na

porção proximal da artéria coronária (KAMIMURA et al., 1999).

1.3.2 Evolução da aterosclerose em humanos

A doença aterosclerótica quando clinicamente manifesta progride

rapidamente, com conseqüências fatais, logo é fundamental a abordagem preventiva

na história natural das doenças cardiovasculares, sendo a prevenção um caminho

viável, pois estudos epidemiológicos como os de Framingham, o MRFIT, nos

Estados Unidos e o PROCAM na Europa (ASSMANN et al., 1998), já demonstraram

claramente a importância dos fatores de risco para o desenvolvimento da

aterosclerose e suas complicações e têm identificado fatores de risco que podem ser

modificáveis e que levam a redução do risco cardiovascular (GORDON et al., 1981;

PETER et al., 1998; NEATON et al., 1981; ASSMANN et al., 1998; NCEP, 2002;

BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006). A importância da redução dos níveis de

colesterol e LDL-C elevados na etiologia da doença arterial coronária (DAC) na

prevenção tanto primária quanto secundária desta doença já está bem

documentada, assim como também níveis elevados de HDL-C relacionados à

proteção cardiovascular, tanto na prevenção primária quanto secundária (CASTELLI,

1986; CONSENSUS, 2002; GRUNDY et al., 2004), pois, estudos indicam que o HDL

participa do transporte reverso do colesterol, inibindo o processo de aterogênese

13

(CASTELLI et al., 1986) e apesar da escassez de estudos que avaliem o benefício

da manutenção dos triglicerídeos abaixo de 150mg/dl, todas as diretrizes

aconselham a redução e manutenção como uma medida de prevenção

cardiovascular, particularmente nos diabéticos, onde a hipertrigliceridemia em geral

se associa a LDL-C pequena e densa e a redução do HDL-C, constituindo uma

dislipidemia aterogênica (DUCKWORTH et al., 2009).

O consumo de dietas ricas em ácidos graxos monoinsaturadas (ácido oléico)

e poliinsaturados, em substituição a gorduras saturadas, assim como também a

dieta rica em fitosteróis e fibras exercem efeitos fisiológicos sobre humanos,

reduzindo os níveis plasmáticos de colesterol (REBOLLO et al., 1998; TURATTI et

al., 1985; DE ANDELIS, 2001; MAGALHÃES;CHAGAS; LUZ, 2002; FEIO et al.,

2003; HU, 2003; OPAS, 2003).

1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A EUTERPE OLERACEA (AÇAÌ)

O Brasil é o maior produtor, consumidor e exportador do açaí, bebida símbolo

do país, rica em gorduras mono e poliinsaturadas, em fitosteróis e fibras, produzida

a partir dos frutos do açaí. A bebida extraída da fruta é normalmente comercializada

à temperatura ambiente ou então na forma congelada (MENEZES; TORRES;

SABAA-SRUR, 2008). A Euterpe oleracea (açaí) é uma fruta típica da região

Amazônica largamente consumida no Brasil e exportada para muitos países da

Europa, Ásia e Américas. Estudos químicos revelam que a Euterpe oleracea é rica

em antocianinas e em vários polifenóis (DEL POZO- INSFRAN; BRENES;

TALCOTT, 2004; RODRIGUES et al.,, 2006; METENS-TALCOTT et al., 2008; CHIN,

2008; SANTOS, 2008). Alguns estudos demonstram que promove melhora da

função endotelial além de aumentar a biodisponibilidade do óxido nítrico e a

liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio (ROCHA et al., 2007).

Apresenta na sua composição ácidos graxos de boa qualidade (60%

monoinsaturado e 13% poliinsaturado), e é também rico em fibras e vitamina E

(EMBRAPA, 2006). Recentemente, alguns benefícios da Euterpe oleracea no perfil

lipídico foram demonstrados num estudo envolvendo ratos hipercolesterolêmicos

(DE SOUZA et al., 2010). Apesar de todos esses aspectos interessantes, seus

efeitos no metabolismo lipídico e na aterosclerose são muito pouco conhecidos.

14

O açaí ocorre predominantemente na região Norte, e entre os estados mais

valorizados produtores de açaí podemos citar o Pará, o Maranhão, o Amapá, o Acre

e Rondônia, sendo o primeiro, responsável por 95% da produção, calculada em 100

a 180 mil litros/dia em Belém (HOMMA; FRAZÃO, 2002; OLIVEIRA et al., 2002;

MENDES, 2003). Atualmente sua expansão econômica, já atinge novos mercados,

no próprio país (sudeste) e até mesmo em alguns países da Europa, Estados

Unidos, Japão e China (SOUTO, 2001; SILVA, 2002).

O açaizeiro (Euterpe oleracea)

destaca-se na rica floresta amazônica,

como sendo a palmeira mais produtiva

desse estuário, tanto em frutos como em

gêneros derivados, sendo o fruto o

principal produto oriundo da palmeira.

Faz parte da família das palmáceas

(MENEZES; TORRES; SABAA-SRUR,

2008). Esta palmeira brasileira é uma

planta que se desenvolve próxima aos ribeirões, rios, igapó, várzea e nas matas de

terra firme, e com menos freqüência, em terrenos mais afastados e locais

pantanosos (figura 2). É uma palmeira delgada

e alta que pode atingir uma altura de 20 a 25

metros. O açaizeiro apresenta farta perfilhação

e alcança, no estado nativo, cerca de 20

palmeiras por "touceira" (das quais pelo

menos três em produção). Cada touceira

produz entre 6 e 8 cachos com 2,5 kg cada

um, representando de 15 a 20 quilos de frutos

por palmeira (em duas safras) e de 12 a 25

toneladas de frutos/ano. Os troncos são lisos, roliços, longos, de cor clara, sem

espinhos. A palmeira do açaí apresenta folhas grandes, compridas e recortadas em

tiras, de cor verde-escura, atingindo até 2 metros de comprimento. As folhas são

usadas na cobertura das casas (MATTOS, 1993). A frutificação mais intensa do

Euterpe oleracea é de outubro a janeiro (MENEZES; TORRES; SABAA-SRUR,

2008).Os frutos são pequenos, redondos, roxos, quase pretos e agrupados em

Figura 2: Palmeira do açaí

Figura 3: Cachos e frutos do açaí

15

cachos pendentes. Tem um caroço grande e polpa muito fina (figura 3). O fruto é

colhido subindo-se na palmeira com o auxílio

de um trançado de folha amarrado aos pés

(a peçonha).

O principal produto oriundo do fruto é

uma bebida de consistência pastosa,

denominada açaí. A consistência pastosa da

bebida é devido aos elevados teores de

amido (9,30%) e pectina (0,67%)

encontrados na parte comestível do fruto.

São necessários cerca de 2,5 quilos de frutos maduros para a produção de um litro

de suco de açaí. De cor arroxeada, a bebida é

assim extraída: colocam-se os caroços do açaí

de molho na água para amolecer a casca fina

que os reveste, em seguida os caroços são

amassados com certa quantidade de água e

com o auxilio de pequenas despolpadeiras

(Figura 4), originando assim o extrato de açaí

(Figura 5), seu armazenamento se faz em

pequenos sacos plásticos lacrados.

(EMBRAPA, 2006).

No Estado do Pará existe um consumo extremamente elevado desta bebida

que é rica em fibras, fitosteróis, ácidos graxos mono e poliinsaturados e

antioxidantes (DEL POZO-INSFRAM; BRENES; TALCOTT, 2004). Segundo Rogez,

o açaí possuí, em grande quantidade, o mesmo corante presente nas uvas, a

antocianina e, segundo o pesquisador, um litro de açaí médio (entre a consistência

fina e grossa) contém 33 vezes mais antocianina que um litro de vinho tinto

“francês”. Na região, esta fruta é muito consumida sob a forma de “suco” ou “vinho”,

sorvetes, cremes, geléias e etc. (ROGEZ, 2000).

Alguns estudos sugerem vários benefícios à Euterpe oleracea (açaí), dentre

eles podemos citar a sua ação vasodilatadora, anti-hipertensiva, antiinflamatória, sua

ação na redução dos fatores de risco e nas desordens metabólicas como sugeriu

Figura 4: Açaí sendo despolpado

Figura 5: Extrato (vinho) de açaí

16

Oliveira, que realizou um estudo em que induziu a síndrome metabólica em ratos e

observou que no grupo alimentado com a Euterpe oleracea houve uma redução da

Síndrome metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010). Um estudo realizado por Udani,

também observou redução nos fatores de risco para síndrome metabólica ao

alimentar 10 adultos que apresentavam sobrepeso, com 100g de Euterpe oleracea

ao dia por um período de 30 dias e observou que ocorreu redução dos níveis dos

marcadores de risco selecionados para síndrome metabólica (UDANI, et al., 2011).

Noratto também sugeriu uma possível ação anti-inflamatória da Euterpe oleracea

num estudo realizado em que observou uma inibição da expressão das moléculas

de adesão e da atividade do NF-kB, por diminuírem a proteína ICAM-1 e a PECAM -

1 (NORATTO et al.,2011).

Apesar de possuir um alto teor de gordura, 66% destas gorduras são

monoinsaturadas, que são gorduras benéficas ao organismo porque diminuem os

níveis de colesterol LDL e ajudam a aumentar os níveis de colesterol HDL,

auxiliando, assim, na proteção do sistema cardiovascular (HORTON;

KUTHBERT;SPADY, 1993; SESSIONS; SALTER, 1995). Segundo as

recomendações nutricionais atuais o perfil ideal é 50% de ácidos graxos

monoinsaturados, máximo de 33% de ácidos graxos saturados e 17% de

poliinsaturados. No açaí temos a seguinte proporção de gorduras: 60% de gorduras

monoinsaturadas, 13% poliinsaturados e < 3% de saturadas. (EMBRAPA, 2006;

NEPA-UNICAMP, 2006).

O açaí contém 60% de ácido oleico, 22% de ácido palmítico, 12% de ácido

linoléico e quanto aos fitosteróis um número recente do Journal of Agricultural and

Food Chemistry, publicou uma pesquisa realizada com 12 voluntários saudáveis que

consumiam o suco de açaí diariamente. De acordo com a pesquisadora

responsável, Dra. Susanne Talcott, o açaí é pobre em açúcares e em sua visão, os

benefícios são tantos que a fruta pode ser considerada uma "mistura de vinho tinto e

chocolate". O estudo conduzido na Univesidade do Texas conseguiu mostrar que os

antioxidantes (antocianinas e vitamina C) do açaí são muito bem absorvidos, o que

pode contribuir para a prevenção de muitas doenças e condições como o câncer, os

problemas cardiovasculares e o envelhecimento precoce (DEL POZO-INSFRAN;

PERCIVAL; TALCOTT, 2006). Outros estudos, também referem importantes

propriedades antioxidantes da Euterpe oleracea (METENS-TALCOTT et al., 2008;

PACHECO-PALENCIA; MERTENS-TALCOTT; TALCOTT, 2008).

17

O açaí em si é uma fruta de grande valor energético e rico em valores

nutricionais e até mesmo funcionais, então a sua ingestão deve ser o mais natural

possível e em substituição a pequenas refeições. pois, como vimos na constituição

do açaí a concentração de fibras alimentares totais é notavelmente elevada (em

torno de 30g/100 g de matéria seca), lipídios totais em torno de 48g / 100g e as

antocianinas em torno de 1.28 g em 1 litro de açaí do tipo médio, ou seja 1% da

matéria seca. As fibras têm um papel muito importante na regulação do transito

intestinal, sendo sua ingestão diária recomendada de cerca de 35g / adulto. A

população do Pará consome esta fruta diariamente e em grande quantidade,

portanto, atingindo facilmente essa cota, pois 1 litro de açaí do tipo médio contém

31,5 g de fibras alimentares totais, o que corresponde a 90% da recomendação

diária, podendo o açaí realmente ser considerado uma excelente fonte de fibras e de

lípides, pois, representam cerca de 90% das calorias contidas nessa bebida. Logo, o

consumo de açaí permite assegurar um bom aproveitamento em ácidos graxos

mono e poliinsaturados, de antioxidantes (flavonóides) e também de proteínas (12,6

g em 1 litro de açaí médio), sendo o valor nutricional muito semelhante ao do ovo

(EMBRAPA, 2006). O Açaí é também uma importante fonte de fitoesteróis e

apresenta a seguinte proporção: Sitosteróis (78%), stigmasterol (6.5%), campesterol

(6.0%), avenasterol (6.5%) e colesterol (2.0%). (LUBRANO; ROBIN; KHAIAT, 1994;

LEEDES; HUSSAIN, 1998; SILLBERBERG, 2000; COOK-FULLER, 2000; ROGEZ,

2000; RODRIGUES et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006; PACHECO-PALENCIA;

MERTENS-TALCOTT; TALCOTT, 2008; CHIN et al., 2008; METENS-TALCOTT et

al., 2008).

Segundo Rocha, o Euterpe oleracea Mart. melhora a função endotelial,

provavelmente por aumentar a vasodilatação endotélio dependente, assim como a

biodisponibilidade do óxido nítrico e do fator de hiperpolarização derivado do

endotélio (ROCHA et al., 2007).

Recentemente, foram relatados alguns benefícios do Euterpe oleracea nos

biomarcadores do estresse oxidativo e no perfil lipídico de ratos

hipercolesterolêmicos induzidos experimentalmente (de SOUZA et al., 2010). Em

outro estudo semelhante, foi observado melhora dos componentes da síndrome

metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010).

18

2. OBJETIVOS

Gerais:

Avaliar os efeitos da Euterpe oleracea (açai) na aterosclerose induzida

experimentalmente.

Específicos:

Analisar as modificações induzidas pela Euterpe oleracea (açai) no perfil

lipídico e desenvolvimento de aterosclerose, no modelo de coelhos induzido por

dieta rica em colesterol.

Examinar as modificações na síntese e absorção de colesterol, pelas

quantificações plasmáticas de desmosterol e dos fitosteróis (campesterol e

sitosterol).

19

3. MÉTODOS

3.1 Desenho Experimental

O estudo foi constituído por 30 coelhos, da raça Nova Zelândia, brancos,

machos, com cerca de três meses de idade e peso entre 2,5 – 3,0 Kg, que

permaneceram os primeiros 15 dias em adaptação. Após este período inicial foram

coletados 10 ml de sangue total para as dosagens laboratoriais basais, sendo então

a ração normal consumida anteriormente substituída por uma ração enriquecida com

colesterol a 0,5%, para indução de hipercolesterolemia e desenvolvimento de

aterosclerose, por um período de 12 semanas. Após novas determinações

laboratoriais e verificação dos níveis de colesterolemia, os animais foram

aleatoriamente alocados em dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). Os

animais de ambos os grupos passaram a receber dietas enriquecidas com colesterol

a 0,05%, para indução de hipercolesterolemia moderada, mas diferenciadas como

descritas a seguir:

Grupo I – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol)+ 80 ml de açaí/dia

+ água

Grupo II – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol) + água

Após 12 semanas deste tratamento, novamente foram coletados 10 ml de

sangue total para avaliação dos parâmetros. Neste momento, os animais foram

sacrificados, retirando-se a artéria aorta em toda a sua extensão para quantificação

da área ocupada pelas lesões ateroscleróticas e estudo histopatológico das placas

de ateroma.

20

30 Coelhos

1º coleta de sangue - laboratório basal

Dieta hipercolesterolêmica ( 0,5% de colesterol) 12 semanas

2º coleta de sangue: Glicemia Lipidograma

Randomização dos Animais

15 coelhos

Grupo Controle

15 coelhos

Euterpe oleracea

Ração + 0,05%

colesterol +água Ração + 0,05% CT Euterpe oleracea

12 semanas

12 semanas

3 coelhos morreram

12 coelhos

controle

15 coelhos

Eut.. oleracea excluídosssssssss

3ª col. de sangue : Glicemia, Lipidograma e Fitosteróis

Sacrifício dos animais, retirada das aortas e coloração pelo Sudam III

Coloração pelo SUDAM III

Análise Histopatológica das Aortas - Avaliação macroscópica - Aval. extensão lesões ateromatosas - Avaliação microscópica - Aval. histológica por microsc. óptica - Estudo Imuno-histoquímico

- Estudo Histopatológico

Figura 6. – Organograma do desenho experimental do estudo

21

3.2 Animais

Os animais foram adquiridos da empresa Criex Cunicultura Ltda / Mogi das

Cruzes - São Paulo e durante todo o período do estudo foram alojados no biotério do

laboratório de cirurgia experimental da Universidade Federal do Pará, localizado no

"Hospital Universitário João de Barros Barreto", mantidos em gaiolas individuais (50

x 50 cm), de ferro galvanizado e pintadas, dispostas lado a lado, com fundo

removível, para que não tivessem contato com seus dejetos, sendo higienizadas

diariamente. A temperatura local foi mantida constante em torno de 22ºC, com ciclo

de luz claro-escuro de 12 h, receberam água à vontade e ração peletizada Nuvilab

cobaias (Nuvital, Brasil) nos primeiros 15 dias de adaptação. Posteriormente, como

indicado em nosso protocolo, a ração foi enriquecida com colesterol 0,5% nas

primeiras 12 semanas e 0,05% nas 12 semanas finais de forma similar em ambos os

grupos. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa animal da

Universidade Federal do Pará sob o número 002/2006.

Todos os dias pela manhã foram recolhidas as sobras de ração do dia

anterior, que era pesada para controle da ingestão de colesterol; foi realizado

também o controle da ingestão de açaí por animal, diariamente. Os animais foram

pesados mensalmente e o consumo de ração também foi controlado mensalmente.

3.3 Dieta

A ração oferecida aos coelhos (Nuvilab Cobaias Nuvital, Brasil) apresentava a

seguinte composição: milho integral moído, farelo de alfaia, farelo de soja, farelo de

trigo, calcário calcítico, fosfato bicálcico, cloreto de sódio e vitaminas A, B, C, D, E,

K, microelementos minerais e aminoácidos (DL- metionina).

Durante os primeiros 15 dias de adaptação a ração foi oferecida livremente e

se calculou a média da quantidade diária consumida por cada coelho que era cerca

de 100 g ao dia.

Os coelhos passaram então a receber a mesma ração acrescida de colesterol

conforme já descrito. O colesterol em pó (Sigma C8503, EUA) foi misturado à ração,

após a mesma ser moída, com uma pequena quantidade de água, para hidratá-la,

formando então uma massa semi-pastosa que em seguida era colocada em uma

22

máquina industrial de moer carne formando, como produto final, pequenos pellets

que foram colocados em uma estufa industrial a 60ºC, por 24 h, para secagem. Após

o preparo, a ração foi separada em porções individuais de 100 g, para uso diário,

sendo então colocada em sacos plásticos lacrados. Os animais foram pesados

mensalmente e o consumo de ração controlado diariamente.

3.4 Indução de Hipercolesterolemia

A hipercolesterolemia foi induzida por meio de uma dieta hipercolesterolêmica

preparada na proporção de 0,5 g de colesterol em pó para 100 g de ração (0,5%); o

colesterol foi obtido junto a empresa Sigma-Aldrich Brasil Ltda, representante

exclusivo da Sigma Corporation (Sigma C8503, EUA). Após o preparo, a ração foi

separada em porções individuais de 100 g, para uso diário, sendo então colocada

em sacos plásticos lacrados. Após 12 semanas de dieta hipercolesterolêmica para o

desenvolvimento de aterosclerose, os coelhos foram aleatoriamente designados

para compor dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). O açaí foi fornecido

aos coelhos com base nos estudos realizados anteriormente por

CONSTANTINIDES,1960; FANI,1987; JORGE, 1997; IHARA, 2001.

3.5 Euterpe oleracea (Açaí)

A Euterpe oleracea foi obtida da região amazônica (Estado do Pará, Brasil). O

vinho do açaí do tipo médio foi obtido por meio dos frutos maduros colocados de

molho em água morna para que amoleçam e soltem do caroço. Em seguida, foram

amassados em pequenas despolpadeiras (máquinas de inox artesanais), diluídos

com uma pequena quantidade de água, na proporção de 2,5 Kg desses frutos para

40 ml de água, para se obter um litro do extrato, produzindo-se assim vinho de

consistência pastosa e de cor vermelha-arroxeada. Após produzido, o vinho do açaí

foi embalado em sacos plásticos que foram lacrados imediatamente para se evitar

possíveis contaminações, fornecido pela empresa Francisco Ltda, grande produtora

na cidade de Belém, que obedece às normas preconizadas de higienização. O

mesmo foi produzido diariamente e enviado ao biotério, sendo oferecido

imediatamente aos animais do grupo açaí em vasilhas de vidro, na quantidade de 80

23

ml/dia, puro sem acréscimos de água ou qualquer outra substância, durante 12

semanas.

3.5.1 COMPOSIÇÃO QUÍMCA DA EUTERPE OLERACEA

A composição do extrato de Euterpe oleracea é descrita na Tabela 1,

conforme dados de ROGEZ (2000).

Tabela 1: Composição Química da Euterpe oleracea

COMPOSIÇÃO UNIDADE QT. DE MATÉRIA

SECA

Matéria Seca % 15.00

Proteínas g/100 g(1) 13.00

Lipídios Totais g/100 g(1) 48.00

Gord. monoinsaturada g/100 g(1) 28.8

Gord. Poliinsaturada g/100 g(1) 6.24

Carboidratos g/100 g(1) 1.50

Frutose g/100 g(1) 0.00

Glicose g/100 g(1) 1.50

Sacarose g/100 g(1) 0.00

Fibras g/100 g(1) 34.0

Energia Kcal/100 g(1) 66.3

Cinza g/100 g(1) 3.50

Sódio mg/100 g(2) 56.9

Potássio mg/100 g(2) 932

Cálcio mg/100 g(2) 286

Magnésio mg/100 g(2) 174

Ferro mg/100 g(2) 1.50

Cobre mg/100 g(2) 1.7

Zinco mg/100 g(2) 7.0

Fósforo mg/100 g(2) 124

Vitamina B1 mg/100 g(2) 0.25

Alfa-tocoferol mg/100 g(2) 45.0

(1)Matéria seca; (2)Cálculo por diferença.

Fonte: Rogez (2000).

24

Em adição aos dados fornecidos pela EMBRAPA sobre a composição

química da Euterpe oleracea (Tabela 1), quantificamos os níveis de fitosteróis da

mesma. Observamos uma concentração de 15 mg de fitosteróis por 100 g da fruta,

principalmente às custas de β-sitosterol, em nossa análise por espectrometria de

massa.

3.6. PARÂMETROS AVALIADOS DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL

3.6.1 Aspectos Laboratoriais

Para a coleta da amostra de sangue, após jejum de 12-14 horas, foram

utilizados escalpes 21G (Becton Dickinson Indústrias Cirúrgicas Ltda), por meio dos

quais foram colhidas amostras de sangue da artéria central da orelha dos coelhos

que encontravam-se previamente imobilizados em uma caixa de contensão. Utilizou-

se o EDTA (BD VacutainerTM , Brasil) e o fluoreto de sódio (BD VacutainerTM , Brasil)

como anticoagulantes. Foram colhidos 10 ml de sangue que foram centrifugados por

10 min a 3000 rpm para obtenção do soro para dosagens bioquímicas de colesterol

total e do HDL-C, assim como dos triglicerídeos e glicemia. As dosagens

bioquímicas foram processadas no Laboratório Paulo Azevedo

.

3.6.1.1 DOSAGENS BIOQUÍMICAS

Foi realizado um total de três coletas sanguíneas para a dosagem do perfil

lipídico e glicemia dos animais, a 1ª, logo no início do estudo, para verificar o perfil

lipídico basal dos coelhos, a 2ª, após as 12 semanas de indução de

hipercolesterolemia, para poder se realizar a randomização dos animais e a 3ª, após

as 12 semanas seguintes, no final do estudo.

3.6.1.2 MÉTÓDOS EMPREGADOS

3.6.1.3 LÍPIDES

Os lípides foram determinados pelo método enzimático colorimétrico, usando

os reagentes apropriados (Olympus) para o colesterol total (CT), HDL- colesterol

25

(HDL-C) e triglicerídeos (TG). Os níveis de glicose no sangue foram dosados pelo

método enzimático colorimétrico (Advia, 1650, Bayer, Japan).

3.6.1.4 QUANTIFICAÇÃO DO FITOSTERÓIS

Para a quantificação do β-sitosterol e do campesterol (marcadores da

absorção do colesterol), assim como do desmosterol (precursor endógeno da

síntese do colesterol) foi usada a cromatografia líquida de ultra performance (UPLC)

e espectrometria de massas (MS). Estes esteróis foram quantificados em amostras

de plasma por um método desenvolvido pela Synchrophar (Campinas, SP, BRASIL).

O método consiste na extração líquido a líquido, seguido pela separação no sistema

UPLC e detecção com o ion APCI nascente da massa espectrofométrica operando

sobre “íon simples monitorados” para cada esterol (β-sitosterol, campesterol e

desmosterol). A extração foi realizada com uma mistura de dietil éter e hexanes (80 ∕

20; v ∕ v) por centrifugação seguida de evaporação da camada orgânica a 50ºC sob

um leve vapor de nitrogênio. O resíduo da evaporação foi reconstituído com

isoproterenol e injetado no sistema UPLC (Acquity Waters Co.,Milford). O sistema

MS (Quattro Premier-XE, Waters Co., Manchester) foi ajustado pela monitoração do

íon simples formado pela ionização química da pressão atmosférica (APCI) do íon

nascente. Os esteróis foram detectados em suas formas livres e não esterificadas;

monitoramos os íons com m ∕ z, 367.30 para desmosterol, 397.25 para β-sitosterol e

383.60 para campesterol. Os níveis dos compostos foram determinados pela

comparação da resposta pico sobre uma curva de calibração de 0.5 μg ∕ mL para

10.0 μg ∕ mL. As amostras que apresentaram altos níveis (mais do que 10.0 μg ∕ mL)

foram diluídas para comparar com os níveis de calibração.

3.7 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E RETIRADA DAS AORTAS

3.7.1 Aspectos cirúrgicos do protocolo experimental

Ao final do experimento, os animais foram sacrificados retirando-se a artéria

aórtica em toda a sua extensão para avaliação da área ocupada por lesões

ateroscleróticas e estudo histopatológico das placas de ateroma. Na ocasião do

sacrifício os animais foram pesados e anestesiados com cloridrato de cetamina 35

26

mg/kg de peso (Ketalar, Parke-Davis, EUA ) e cloridrato de xilazina 15 mg/kg de

(Rompum, Bayer, EUA), por via intramuscular. A anestesia foi potencializada com

éter etílico quando necessário. Sob anestesia profunda, os animais foram colocados

em uma canaleta para dissecação e realizada incisão mediana toraco-abdominal,

sendo obtidas amostras de sangue por punção intra-cardíaca. Em seguida, os

órgãos abdominais foram rebatidos para isolamento da aorta que foi seccionada

desde o arco aórtico até a bifurcação ilíaca. Foram então perfundidas por uma

solução de papaverina a 12% em PBS – 37ºC, abertas longitudinalmente, presas em

placas de isopor e fixadas em formol tamponado por 24horas, quando então foram

retiradas do isopor e coradas pelo Sudam III, para que o conteúdo lipídico da placa

fosse evidenciado.

3.7.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS AORTAS

3.7.2.1 Avaliação macroscópica

Após a fixação, as aortas foram coradas com Sudam III, para que o conteúdo

lipídico da placa fosse evidenciado. As aortas coradas foram analisadas

comparativamente em ambos os grupos I e II, para avaliação macroscópica em

relação à intensidade de presença de placas gordurosas.

3.7.2.2 Avaliação da extensão das lesões ateromatosas

As aortas abertas, fixadas e coradas, foram reproduzidas em folhas de

acetato, para quantificarmos a extensão da área de aorta comprometida por meio da

planimetria computadorizada, realizada em mesa digitadora acoplada a um

microcomputador. Os resultados foram expressos em percentagem de área lesada

em relação à área total da aorta.

27

3.7.2.2.1 Avaliação microscópica

Foram seccionados nove fragmentos de aproximadamente 5 mm cada, sendo

três do arco aórtico, três da aorta torácica e três da aorta abdominal.

3.7.2.2.2 Avaliação histológica por microscopia óptica

Estes fragmentos foram embebidos em parafina e obtidos cortes de 4 µm. A

histomorfometria foi realizada em cortes histológicos corados por Verhoeff para

melhor identificar os limites entre a camada média e a íntima da artéria (SILVA,

2002). As imagens obtidas em um aumento de 6,5 x foram capturadas com auxílio

de uma vídeo-câmera Sony CCD-IR15 (Sony, Japão) conectadas a um microscópio

Olympus BX-40. As imagens foram então digitalizadas e transmitidas a um

microcomputador, e com a utilização de um programa para morfometria, IMAGE

TOOL FOR WINDOWS VS 3.0 ( The University of Texas Health Science Center in

San Antonio UTHSCSA, EUA), foi mensurada então a maior altura das placas (µm),

as áreas das camadas íntima e média (mm2) e calculada a relação íntima-

média(I/M).

3.7.3 Estudo imuno-histoquímico

Por meio de reação imuno-histoquímica identificou-se macrófagos e células

musculares lisas, utilizando-se os seguintes anticorpos monoclonais: anti-

macrófagos de coelhos na diluição de 1:200 em BSA 1% (RAM-11, Dako

Laboratories, EUA) e anti-α actina para músculo liso humano na diluição de 1:200

em BSA 1% (HHF-35, Dako Laboratories, EUA). Este ensaio baseou-se no método

imunoenzimático indireto em três etapas, utilizando-se o complexo estreptoavidina-

biotina-peroxidase. Foram colhidos cortes histológicos com 2 µm de espessura em

lâminas silanizadas (Sigma, St Louis, MD) e após serem desparafinizados, foi

realizado o bloqueio da peroxidase endógena com uma solução de H2O2 na

concentração de 8% sendo após lavados em PBS (pH: 7,4). Os anticorpos primários

foram incubados à 4ºC overnight. Após a lavagem em solução de PBS, as seções

foram incubadas com o anticorpo secundário IgG de cabra anti IgG de camundongo

biotinilado na diluição de 1:100 (Dako Laboratories, Dinamarca) durante uma hora à

28

temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram então incubados com a

solução do complexo estreptoavidina-peroxidase na concentração de 1:100 (Strept

ABComplex, Dako, Dinamarca) por uma hora, seguida de lavagens em PBS. A

revelação foi realizada com substrato cromógeno 3,3 diamino-benzidina (DAB)

(Sigma, A3648) 0,06% em PBS acrescido de 100 µL de H2O2 30% (Merck,

Alemanha). Após, os cortes foram lavados em água corrente, contracorados com

Hematoxilina de Harris e montados em Entellan (Merck-Alemanha). As imagens

capturadas foram inicialmente tratadas no programa Corel Photo-paint 9 (Corel,

EUA), afim de se isolar as áreas positivamente coradas pela reação de imuno-

histoquímica. As áreas positivas foram determinadas utilizando-se novamente o

programa de morfometria citado anteriormente (ENGELMAN, 2001).

De acordo com este programa determinou-se a área marcada positivamente

pela reação imuno-histoquimica e a área da íntima na mesma imagem, calculando-

se a percentagem de área da íntima ocupada por macrófagos ou células musculares

lisas.

3.7.4 Estudo Histopatológico

Foram analisados os aspectos histopatológicos da placa para a

caracterização do seu estágio evolutivo nos fragmentos obtidos da aorta, em cortes

de 4 µm corados por HE, sendo avaliados os seguintes parâmetros: maior ou menor

celularidade, matriz extracelular, presença de cristais de colesterol, formação de

capa fibromuscular com colágeno e células musculares lisas, desestruturação da

camada média junto à limitante elástica interna (LEI), desestruturação da camada

média junto à limitante elástica externa (LEE) e processo inflamatório na adventícia.

A caracterização do estágio evolutivo das placas teve como base a

classificação de Stary (STARY, 1994), considerando-se como placas tipo II as

lesões nas quais havia predominância de células espumosas dispostas em camadas

estratificadas, com predomínio em relação à matriz. As lesões foram consideradas

tipo III quando apresentavam lipídeos extracelulares formando cristais confluentes e

grande quantidade de matriz extracelular, além da formação de capa fibromuscular.

29

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados numéricos foram expressos como média (EPM) ou mediana

(interquartis). As variáveis contínuas foram examinadas pela distribuição de

normalidade pelo teste kolmogorov-Smirnov. As variáveis com distribuição normal

foram comparadas entre os grupos usando o teste t de Student não pareado ou o

teste de Mann-Whitney em casos de distribuição não gaussiana. Teste de Friedman

foi utilizado para comparar o peso ao longo do estudo. O coeficiente de Spearman

foi usado para examinar a correlação entre as variáveis. A significância estatística

considerada foi de um risco alfa inferior a 5%. Todas as análises foram analisadas

usando o SPSS 17.0 por Windows (SPSS inc, Chicago, IL, USA).

30

4. RESULTADOS

4.1. Dieta e ganho de peso

Os animais consumiram uma média de 100 g/dia da dieta e 80 mL de água

contendo ou não o extrato da Euterpe oleracea. A dieta e o extrato de Euterpe

oleracea foram bem tolerados e os animais ganharam peso ao longo do estudo

(p<0,0005, teste de Friedman), em ambos os grupos.

A Tabela 2 mostra que não foram observadas diferenças no peso dos animais

no momento em que foram aleatoriamente alocados para o tratamento com Euterpe

oleracea ou controle com água (semana 12) ou ao final do estudo (semana 24).

Tabela 2. Peso dos animais nas semanas 12 e 24.

Euterpe oleracea

N=15

Controle

N=12

Valor de p

12 semanas

Peso, média (DP)

24 semanas

Peso, média (DP)

2893 (137)

3108 (197)

2867 (171)

2930 (267)

0,44

0,07

Valores expressos em gramas, DP = desvio-padrão. Diferenças entre os grupos

foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney.

31

4.2 Modificações no perfil lipídico e glicemia

As análises bioquímicas realizadas por ocasião da semana 12 mostraram que

a dieta enriquecida de colesterol (0,5%) promoveu expressiva hipercolesterolemia.

Os valores de colesterol total, HDL-colesterol, colesterol não-HDL e os triglicérides

não diferiram nesta ocasião. Entretanto, ao final do estudo, os animais tratados com

a Euterpe oleracea tiveram menores níveis destas variáveis lipídicas, com exceção

do HDL-colesterol. Os níveis de glicemia não diferiram entre os grupos (Tabela 3).

Tabela 3. Perfil lipídico e glicemia nas semanas 12 e 24

Euterpe oleracea

N=15

Controle

N=12

Valor de p

12 semanas

CT, média (DP)

HDL-C, média (DP)

Não-HDL-C, média (DP)

Triglicérides, média (DP)

Glicose, média (DP)

24 semanas

CT, média (DP)

HDL-C, media (DP)

Não-HDL-C, média (DP)

Triglicérides, média (DP)

Glicose, média (DP)

1124 (96)

36 (11)

1088 (91)

305 (234)

124 (13)

167 (113)

28 (9)

139 (109)

83 (91)

118 (19)

1087 (84)

37 (12)

1050 (86)

424 (282)

139 (36)

341 (224)

30 (10)

310 (220)

164 (112)

112 (17)

0,31

0,85

0,28

0,25

0,68

0,03

0,56

0,03

0,02

0,86

Valores expressos em mg/dL, DP = desvio-padrão; CT = colesterol total; HDL=

colesterol da lipoproteína de alta densidade. Diferenças entre os grupos foram

analisadas pelo teste t de Student, exceto para triglicérides e glicose, cujos valores

foram comparados pelo teste de Mann-Whitney.

32

4.3. Modificações nos parâmetros de absorção e síntese de colesterol

A Tabela 4 mostra, ao final do estudo, que os níveis dos marcadores de

absorção de colesterol analisados (campesterol e β-sitosterol) não diferiram entre os

grupos. Tampouco houve diferença entre os grupos para o marcador de síntese

endógena de colesterol avaliado (desmosterol).

Entretanto, observamos menores valores para as relações

desmosterol/campesterol e desmosterol/ β-sistosterol para os animais tratados com

o extrato de Euterpe oleracea (Tabela 4).

Tabela 4. Desmosterol, campesterol e β-sitosterol ao final do estudo

Euterpe

oleracea

N=15

Controle

N=12

Valor

de p

Campesterol, média (DP)

β-Sitosterol, média (DP)

Desmosterol, média (DP)

Desmosterol/campesterol, média (DP)

Desmosterol/β-sitosterol, média (DP)

10,5 (11,0)

3,00 (2,0)

0,50 (0,6)

0,04 (0,04)

0,12 (0,12)

16,7 (15,6)

3,90 (3,2)

1,20 (1,3)

0,08 (0,04)

0,25 (0,11)

0,260

0,370

0,140

0,026

0,006

Valores expressos em mg/dL, DP = desvio-padrão. Diferenças entre os grupos foram

analisadas pelo teste de Mann-Whitney.

33

4.4. Parâmetros histomorfométricos

Em nosso modelo experimental, os aspectos clássicos da aterosclerose

induzida pela dieta foram observados nas aortas dos animais controles. Entretanto,

uma marcante redução da aterosclerose foi observada no grupo de animais tratados

pela Euterpe oleracea. Nestes animais, uma menor área da placa foi observada,

especialmente no arco aórtico e na aorta torácica, bem como menores valores da

relação íntima/média, quando comparado com os controles (Figuras 7 e 8).

A camada média não diferiu entre os grupos, bem como o percentual das

aortas ocupadas por macrófagos e células musculares lisas (Tabela 5). Não foram

observadas diferenças nos aspectos histológicos das placas, bem como na

composição de fibras elásticas, colágeno, ou no conteúdo de células musculares

lisas ou de macrófagos, quanto analisados por histomorfometria (Tabela 5).

A Figura 9 mostra as características de espécimes de aortas, representativos

destes achados histológicos.

Tabela 5. Composição das placas das aortas ao final do estudo, por grupo

Componentes da placa Euterpe

oleracea

N=15

Controle

N=12

Valor

de p

Macrófagos, média (DP)

Célula muscular lisa, média (DP)

Tecido elástico, média (DP)

20,4 (15,5)

13,3 (4,8)

0,5 (0,6)

22,7 (18,3)

12,7 (7,0)

1,2 (1,3)

0,56

0,66

0,26

Valores expressos em porcentagens das áreas das aortas; DP = desvio-padrão;

Diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney.

34

Figura 7: (A) Box plots da área das placas no arco aórtico. Uma marcada redução deste parâmetro

foi observada nos animais tratados com extrato de Euterpe oleracea (p=0.001 x grupo controle, teste

de Mann-Whitney). (B) Arco aórtico, relação íntima/média. Os animais tratados com Euterpe oleracea

apresentaram menores valores da relação íntima/média (p=0.002 x grupo controle, teste de Mann-

Whitney).

Figura 8: Box plots da área da placa mensurada pela planimetria. (A) Box plots da área da placa.

Menores áreas de placa foram observadas nas aortas dos animais tratados com extrato de Euterpe

oleracea (p=0.005 x grupo controle, teste de Mann-Whitney). (B) Box plots do percentual da área da

placa da aorta. Áreas de placas reduzidas foram observadas nas aortas dos animais tratados com

extrato de Euterpe oleracea apresentavam menores taxas da relação íntima/média (p=0.0028 x grupo

controle, teste de Mann-Whitney).

35

Figura 9: Imagens representativas das aortas coradas pelo Sudam III dos coelhos alimentados de

uma dieta com elevado conteúdo de colesterol. (A) Grupo Controle; (B) Animais tratados com Euterpe

oleracea. A fotomicrografia mostra as secções da aorta coradas por HE (C e H), Verhoeff para fibras

elásticas (D e I magnificadas 100x); a reação de imunohistoquímica para macrófagos (E e J); actina

para músculo liso vascular (F e K); e colágeno corado por picrosirius polarizado (G e L; magnificadas

400x). A fotomicrografia nas colunas verticais de C para G são do grupo controle e de H para L são

do grupo de que recebeu extrato de Euterpe oleracea.

36

5. DISCUSSÃO

O estudo confirmou a nossa hipótese de que o consumo de Euterpe oleracea

pode atenuar a aterosclerose. Os mecanismos propostos para explicar a atenuação

da aterosclerose são, em parte, mecanismos previamente descritos, como suas

propriedades antioxidantes (DEL POZO-INSFRAN; BRENES; TALCOTT, 2004;

CHIN et al., 2008; RODRIGUES et al., 2006; PACHECO-PALENCIA; MERTENS;

TALCOTT, 2008a), ou a ação na função endotelial (ROCHA et al., 2007). Nosso

estudo mostrou adicionalmente, que esta substância tem uma ação sinérgica no

metabolismo do esterol, melhorando o balanço entre a absorção e a síntese do

colesterol, determinando, portanto, um melhor perfil lipídico.

O clássico modelo de indução de aterosclerose em coelhos por meio da dieta

é altamente dependente da absorção do colesterol, então a atenuação da

aterosclerose poderia ser uma conseqüência da inibição da absorção do colesterol,

entretanto não foram observadas diferenças nas taxas de absorção do colesterol,

estimadas pelos níveis plasmáticos de campesterol e β-sitosterol. Um segundo

mecanismo que poderia estar envolvido seria a inibição da síntese do colesterol,

mas não se observou diferença nos níveis plasmáticos de desmosterol. Entretanto,

nós observamos uma diferença nas relações entre síntese e absorção de esteróis,

evidenciada por redução em ambas as relações desmosterol/campesterol e

desmosterol/sitosterol, logo, o consumo da Euterpe oleracea parece ter contribuído

em ambas as direções para reduzir as taxas da síntese endógena e da absorção do

colesterol.

Esses achados interessantes sugerem que outros mecanismos possam estar

envolvidos na atenuação da aterosclerose pela Euterpe oleracea, tais como sua

ação antioxidante, pelo elevado conteúdo de compostos polifenólicos, além do alto

teor em ligninas e outros constituintes (SANTOS et al., 2008).

Além dos elementos já citados, a composição química da Euterpe oleracea

apresenta um elevado conteúdo de ácidos graxos mono e poliinsaturados, os quais

podem ter contribuído para a redução nos níveis de colesterol total e colesterol não-

HDL, possivelmente devido ao aumento da expressão dos receptores LDL

(HORTON; CUTHBERT; SPADY, 1993; SESSIONS; SALTER, 1995).

37

Outro mecanismo que pode estar envolvido na atenuação da aterosclerose é

a melhora da função endotelial. Rocha et al (2007), mostraram que o extrato de açaí

promove um aumento da vasodilatação endotélio dependente, efeito esse reduzido

pela adição de NG-nitro-L-arginina (L-NAME) e abolido pelo KCL+L-NAME.

Alguns estudos haviam mostrado previamente que a melhora da função

endotelial pela estatina ou pelo inibidor da enzima conversora da angiotensina foi

acompanhada pela redução da aterosclerose nos coelhos, independentemente das

alterações nos níveis plasmáticos do colesterol (SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et

al., 2003).

Recentemente, efeitos favoráveis nos níveis de glicose e da resistência a

insulina foram mostrados com o uso do extrato da Euterpe oleracea, num modelo

experimental de síndrome metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010).

Baseado nesses mecanismos e nos achados do nosso estudo, a redução da

aterosclerose observada nestes animais provavelmente resultou da ação conjunta

dos múltiplos benefícios da Euterpe oleracea, envolvendo redução da síntese e da

absorção dos esteróis, redução das modificações oxidativas das lipoproteínas e

melhora da função endotelial.

38

Limitações do estudo

Nós examinamos os efeitos da Euterpe oleracea em animais com estímulo

aterogênico pelos altos níveis de colesterol em suas dietas. É possível que os

efeitos benéficos na aterosclerose do extrato dessa fruta neste modelo possam ser

mais expressivos do que na aterosclerose em humanos, determinada por outros

fatores de risco que não apenas a hipercolesterolemia.

Não avaliamos a função endotelial e a ação antioxidante da Euterpe oleracea;

é possível que os efeitos benéficos nesses parâmetros tenham contribuído para

nossos achados anatômicos.

Sumarizando, o consumo da Euterpe oleracea pelos coelhos com

hipercolesterolemia induzida pela dieta, marcadamente melhorou o perfil lipídico e

reduziu a aterosclerose em suas aortas. Estes efeitos foram observados em parte

pelo melhor balanço entre a síntese e a absorção dos esteróis.

39

6. CONCLUSÕES

A aterosclerose induzida pela dieta aterogênica em coelhos foi

significantemente atenuada pela adição à dieta do extrato de Euterpe oleracea

(açaí).

O consumo de Euterpe oleracea (açaí) em coelhos recebendo dieta

aterogênica, significantemente melhorou o perfil lipídico.

A análise de marcadores de síntese (desmosterol) e de absorção de

colesterol (campesterol e β-sitosterol) mostrou que as relações entre estes

marcadores (desmosterol/campesterol; desmosterol/β-sitosterol) foram

significantemente reduzidas nos animais tratados pela Euterpe oleracea.

Os resultados em conjunto sugerem que a adição da Euterpe oleracea à

dieta, neste modelo experimental, promove marcante atenuação da aterosclerose,

em parte, por um melhor balanço dos marcadores de síntese e absorção de esteróis.

40

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COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO DA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PARECER MED002/2006

Projeto: Efeitos do açaí no perfil lipídico em coelhos hipercolesterolêmicos

Coordenador: Prof. Dr. Francisco Antonio Helfstein Fonseca

Área Temática: Medicina

Vigência: 05/2006 a 05/2010

N0 no CEPAE-UFPA: MED002/2006

O projeto acima identificado foi avaliado pelo Comitê de Ética Em Pesquisa Com

Animais de Experimentação da Universidade Federal do Pará (CEPAE). O tema eleito para

a investigação e de alto teor científico justificando a utilização do modelo animal proposto.

Os procedimentos experimentais utilizados seguem as normas locais e internacionais para

tratamento e manipulação de animais de experimentação. Portanto, o CEPAE, através de

seu presidente, no uso das atribuições delegadas pela portaria N0 1568/2005 do Reitor da

Universidade Federal do Pará, resolve APROVAR a utilização de animais de

experimentação nas atividades do projeto em questão, no período de vigência estabelecido.

As atividades experimentais fora do período de vigência devem receber nova autorização

deste comitê.

Presidente do Comitê de Ética Em Pesquisa

Com Animais de Experimentação da Universidade

Federal do Pará

1Journal of Atherosclerosis and Thrombosis　Vol.18, No.●

Basic Research

Euterpe Oleracea (Açai) Modifies Sterol Metabolism and Attenuates Experimentally-Induced Atherosclerosis

Claudine A Feio1, Maria C Izar2, Silvia S Ihara3, Soraia H Kasmas2, Celma M Martins2, Max N Feio1, Luís A Maués1, Ney C Borges4, Ronilson A Moreno4, Rui M Póvoa2 and Francisco A Fonseca2

1Department of Medicine, Federal University of Para, PA, Brazil2Department of Medicine, Federal University of Sao Paulo, SP, Brazil3Department of Pathology, Federal University of Sao Paulo, SP, Brazil4Synchrophar, Campinas, SP, Brazil

Background: Euterpe oleracea (açai) is a fruit from the Amazon region whose chemical composition may be beneficial for individuals with atherosclerosis. We hypothesized that consumption of Euterpe oleracea would reduce atherosclerosis development by decreasing cholesterol absorption and synthesis.Methods: Male New Zealand rabbits were fed a cholesterol-enriched diet (0.5%) for 12 weeks, when they were randomized to receive Euterpe oleracea extract (n=15) or water (n=12) plus a 0.05% cho-lesterol-enriched diet for an additional 12 weeks. Plasma phytosterols and desmosterol were deter-mined by ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Atherosclerotic lesions were estimated by computerized planimetry and histomorphometry.Results: At sacrifice, animals treated with Euterpe oleracea had lower levels of total cholesterol (p=0.03), non-HDL-cholesterol (p=0.03) and triglycerides (p=0.02) than controls. These animals had smaller atherosclerotic plaque area in their aortas (p=0.001) and a smaller intima/media ratio (p=0.002) than controls, without differences in plaque composition. At the end of the study, campes-terol, β-sitosterol, and desmosterol plasma levels did not differ between groups; however, animals treated with Euterpe oleracea showed lower desmosterol/campesterol (p=0.026) and desmosterol/β-sitosterol (p=0.006) ratios than controls.Conclusion: Consumption of Euterpe oleracea extract markedly improved the lipid profile and atten-uated atherosclerosis. These effects were related in part to a better balance in the synthesis and absorption of sterols.

J Atheroscler Thromb, 2011; 18:000-000.

Key words; Euterpe oleracea (açai), Atherosclerosis, Lipids, Desmosterol, Phytosterols

Introduction

Euterpe oleracea (açai) is a typical fruit from the Amazon region, largely consumed in Brazil and exported to many countries in Europe, Asia, and the Americas.

Chemical studies revealed that Euterpe oleracea is rich in anthocyanic compounds and several polyphe-

Address for correspondence: Francisco A Fonseca, Departamento de Medicina, Disciplina de Cardiologia, Rua Pedro de Toledo 276, São Paulo, SP, BrazilE-mail: [email protected]: AAAAccepted for publication: AAA

nols1-3). Beyond the presence of compounds with anti-oxidant properties, Euterpe oleracea improves endothe-lial function through the action of nitric oxide and release of endothelium-derived hyperpolarizing fac-tor4).

The oil from Euterpe oleracea is composed of fatty acids of nutritional value (60% monounsaturated and 13% polyunsaturated) in addition to fiber and vitamin E5).

Recently, some beneficial effects of Euterpe olera-cea on the lipid profile were reported in a study of hypercholesterolemic rats6); however, these properties for lipid metabolism and atherosclerosis are poorly reported and understood.

2 Feio et al.

CA, USA). After this period, the cholesterol content of the diet was reduced to 0.05% and the animals were randomized to receive the Euterpe oleracea extract (n=15) or water (n=12) for an additional 12-week period.

Biochemical AnalysesAfter a 12-h fasting period, blood samples were

collected from the central ear artery of all animals and assayed. Samples were stored at －80℃ and defrosted at room temperature for 2 h prior analysis. Measure-ments were assayed by automated techniques in an Olympus AU-640 system (Olympus, Nagano, Japan). Serum lipids were determined by enzymatic colori-metric methods using appropriate reagents (Olympus) for total cholesterol (TC), HDL-cholesterol (HDL-C) and triglycerides. Non-HDL-cholesterol was calcu-lated by differences between TC and HDL-C. Blood glucose levels were determined by an automated enzy-matic method (Advia 1650; Bayer, Germany).

β-sitosterol and campesterol (markers of sterol absorption) as well as desmosterol (precursor of endogenous cholesterol synthesis) were measured at week 24 by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) and mass spectrometry (MS). Plasma samples

Thus, we decided to investigate the potential benefits of Euterpe oleracea in rabbits with diet-induced atherosclerosis. Beyond the effects of Euterpe oleracea on the lipid profile and atherosclerosis, its effects on markers of cholesterol absorption and syn-thesis were also examined. These markers and their ratios have been studied in prospective studies and are considered reliable surrogates for measures of choles-terol absorption and synthesis, and predictors of car-diovascular events7-10).

Methods

Extract of Euterpe OleraceaFruits from Euterpe oleracea were obtained in the

Amazon region (Para State, Brazil) at the same food store. Briefly, the extract was prepared daily by com-bining water and fruit in a blender. The extract was filtered, separated from the seeds, packed in plastic bags, which were sealed immediately to avoid contam-ination, and sent daily to the animal facility. Experi-mental and control animals were immediately offered bowls containing water with and without fresh extract (80 mL) from Euterpe oleracea, respectively.

The chemical composition of Euterpe oleracea was provided by EMBRAPA5) and the plant sterol content was determined in samples of the Euterpe oleracea extract by gas chromatography with flame ionization detection (GC FID)11) (presented in Table 1). Euterpe oleracea has 15.4 mg plant sterols in 100 g extract, of which 85.0% is β-sitosterol (13.1 mg/100 g), 8.2% stigmasterol (1.3 mg/100 g), and 2.0% campestanol (0.3 mg/100 g), with traces of other plant sterols.

Animals and DietAdult male New Zealand white rabbits (n=27,

age=3 months, weight=2,600-3,000 g) were studied. The study protocol was approved by the local ethics committee and all animals received proper care, in compliance with guidelines of the Brazilian College of Experimental Animals. The animals were individually housed and provided with a light/dark cycle. Every day, the cages were cleaned and chow and water (with or without the Euterpe oleracea extract) were changed.

The rabbits were weighed at the beginning of the study and thereafter at 12 and 24 weeks. Before sacri-fice, the animals were anesthetized with xylazine (5 mg/kg, Rompun; BayerAG, SP, Brazil) and ketamine (35 mg/kg, Ketalar; Parke-Davis, USA). The animals initiated the study protocol after an adaptation period of 15 days. During the first 12 weeks, the animals were fed a regular diet (Nuvilab; Nuvital, Brazil) plus 0.5% cholesterol (C8503; Sigma-Aldrich, San Diego,

Table 1. Chemical composition of Euterpe oleracea [5]

Content Amount＊

Dried matter (%)Proteins (g/100 g)Lipids (g/100 g)Monounsaturated fat (g/100 g)Polyunsaturated fat (g/100 g)Carbohydrates (g/100 g)Fructose (g/100 g)Glucose (g/100 g)Sucrose (g/100 g)Fibers (g/100 g)Energy (kcal/100 g)Ash (g/100 g)Sodium (mg/100 g)Potassium (mg/100 g)Calcium (g/100 g)Magnesium (g/100 g)Iron (g/100 g)Copper (g/100 g)Zinc (g/100 g)Phosphorus (g/100 g)Vitamin B1 (g/100 g)α-tocopherol (g/100 g)

15.013.048.028.86.241.500.001.500.0034.066.33.5056.49322861741.501.707.001240.2545.0

＊in dried form

3Euterpe Oleracea (Açai), Lipids and Atherosclerosis

The streptavidin-biotin-peroxidase complex (C-004; DAKO Corp.) method was used; the sections were stained by adding diaminobenzidine solution and counterstained with Harris hematoxylin (Nuclear, Alkimia). For quantification of macrophages and smooth muscle cells in the intima layer, the greatest lesion observed in the histological section was ana-lyzed. Digitalized images of two atherosclerotic plaque sections (magnification: 400) including the most stained areas were recorded using an imaging system QColor3 (Olympus America Inc.), and positively stained areas were determined by morphometric Image Tool software version 3.0. The histological structure of the atherosclerotic lesions was analyzed in HE-stained sections, the collagen content was observed under polarized light in sections stained by Sirius red, and collagen was quantified by a computer-assisted image system. All histological analyses were performed in a blinded fashion.

Statistical AnalysisNumerical data were expressed as the mean (SD).

Continuous variables were examined for normal dis-tribution by the Kolmogorov-Smirnov test. Variables with normal distribution were compared between groups using Student’s unpaired t test; in the case of non-Gaussian distribution, the Mann-Whitney U-test was used. The Friedman test was used to compare repeated measures of weight throughout the study. All tests were two-tailed and statistical significance was set at p＜0.05. Analyses were performed using SPSS 17.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Results

Food Intake and Weight GainThe animals consumed an average of 100 g/day

of the diet and 80 mL water with/without Euterpe oleracea extract. The diet and the extract of Euterpe oleracea were well tolerated and the animals gained weight throughout the study (p＜0.0005, Friedman test) in both groups. No difference in animal weight was observed between groups at randomization in week 12 and week 24 (Table 2).

BiochemistryThe biochemical analyses performed at week 12

(before randomization) showed that the cholesterol-enriched diet (0.5%) promoted marked hypercholes-terolemia. All lipid values were comparable between groups at this time point. Conversely, at the end of the study, animals treated with Euterpe oleracea extract showed lower serum levels of total cholesterol, non-

were evaluated for these sterols by a method developed at Synchrophar (Campinas, SP, Brazil)12). This method consisted of liquid-liquid extraction, followed by sepa-ration in a UPLC system and detection in an Atmo-spheric Pressure Chemical Ionization (APCI) ion-source MS operating on “single-ion monitoring” for each sterol (β-sitosterol, campesterol, and desmo-sterol). Extraction was carried out with diethyl ether and n-hexane (80/20; v/v) by vortex mixing followed by evaporation of the organic phase at 50℃ under a gentle N2 stream. After evaporation, the residue was reconstituted with isopropanol and injected onto the UPLC column (Acquity Waters Co., Milford). The MS system (Quattro Premier-XE; Waters Co., Man-chester, UK) was adjusted to monitor single ions formed by an APCI ion source. Sterols were detected in their free (non-esterified) forms, monitoring the ions for desmosterol (m/z=367.30), β-sitosterol (m/z =397.25), and campesterol (m/z=383.60). Com-pound concentrations were determined by comparing the peak response with the linear portion of the cali-bration curve (0.5-10.0 μg/mL). Samples with con-centrations higher than 10.0 μg/mL were properly diluted for comparison with the calibration curve. Results are presented in mg/dL. To evaluate the rela-tion between cholesterol absorption and synthesis, the ratios between desmosterol/campesterol and desmo-sterol/β-sitosterol were calculated7).

Histopathology and ImmunohistochemistrySpecimens of the aortas were excised from the

ascending arch to the iliac bifurcation and examined as previously reported13). The aortas were cut longitu-dinally, fixed in 10% buffered (pH 7.4) formalin (Labsynth, SP, Brazil), and the lipid-enriched areas were identified with 1-[4-(Phenylazo) Phenilazo]-2-Naphthol (Sudan red Ⅲ) dye (Science Lab, TX, USA). Plaque-containing areas in the aortas were estimated by computerized planimetry using Image Tool soft-ware version 3.0 (University of Texas Health Science Center at San Antonio (UTHSCSA), TX, USA). The percentage of the lesion area was calculated as the ratio between the lesion and the total areas of the aorta. Fragments from the arch, thoracic and abdominal aor-tas were processed for histology with hematoxylin and eosin (Nuclear, Alkimia, PR, Brazil) staining. Sections (4-μm thick) of these specimens were stained with Verhoeff ’s elastic fiber (Nuclear, Alkimia), evaluated for intima (I) and media (M) areas using Image Tool software version 3.0 and the I/M ratio was then calcu-lated. Monoclonal antibodies were used to determine macrophages (RAM-11; DAKO Corp., CA, USA) and smooth muscle actin (HHF-35; DAKO Corp.).

4 Feio et al.

intima/media ratios in the same regions than in con-trols (Fig.1 and 2). No differences were observed between groups regarding the media layer in the areas of the arch, thoracic or abdominal aortas and the per-cent areas occupied by macrophages and smooth mus-cle cells in their aortas (Table 4). No difference was observed either in the histological aspect of the plaques or in plaque composition regarding elastic fibers, collagen, smooth muscle cells, and macrophage content when analyzed by histomorphometry (Table 4). Fig.3 shows pictures of representative specimens of the aortas from animals in both groups and photomi-crographs of the aorta sections.

Discussion

The present study confirmed our initial hypothe-

HDL-C and triglycerides than control animals. Serum glucose levels did not differ between groups at weeks 12 and 24 (Table 2).

At the end of the study, plasma levels of campes-terol, β-sitosterol, and desmosterol did not differ between groups; however, lower desmosterol/campes-terol and desmosterol/β-sitosterol ratios were observed in animals treated with Euterpe oleracea extract (Table 3).

Histopathology and ImmunohistochemistryIn our model, classic atherosclerosis was observed

in the aortas of control rabbits challenged by the cho-lesterol-enriched diet; however, marked attenuation in the degree of atherosclerosis was observed among ani-mals treated with Euterpe oleracea extract. In these ani-mals, a smaller plaque area was observed, especially in the aortic arch and thoracic aorta, as well as smaller

Table 2. Body weight, lipids and glucose serum levels at 12 and 24 weeks, by group

Euterpe oleracea(n=15)

Control(n=12)

p values

12 weeksBody weight, mean (SD)Total cholesterol, mean (SD)HDL-C, mean (SD)Non HDL-C, mean (SD)Triglycerides, mean (SD)Glucose, mean (SD)

24 weeksBody weight, mean (SD)Total cholesterol, mean (SD)HDL-C, mean (SD)Non HDL-C, mean (SD)Triglycerides, mean (SD)Glucose, mean (SD)

2,893 (137)1,124 (96)

36 (11)1,088 (91)

305 (234)124 (13)

3,108 (197)167 (113)

28 (9)139 (109)

83 (91)118 (19)

2,867 (171)1,087 (84)

37 (12)1,050 (86)

424 (282)139 (36)

2,930 (267)341 (224)

30 (10)310 (220)164 (112)112 (17)

0.440.310.850.280.250.68

0.070.030.560.030.020.86

Abbreviations: HDL-C: high-density lipoprotein-cholesterol; SD: standard deviation; TC: total cholesterol. Mean values and SD are expressed in mg/dL; comparisons between groups were made using Student’s t test, except for body weight, glucose levels and triglycerides, compared using the Mann-Whitney U-test.

Table 3. Plasma markers of cholesterol absorption and synthesis at week 24, by group

Euterpe oleracea(n=15)

Control(n=12)

p value

Campesterol, mean (SD)Sitosterol, mean (SD)Desmosterol, mean (SD)Desmosterol/campesterol, mean (SD)Desmosterol/β-sitosterol, mean (SD)

10.5 (11.0)3.0 (2.0)0.5 (0.6)

0.04 (0.04)0.12 (0.12)

16.7 (16.7)3.9 (3.2)1.2 (1.3)

0.08 (0.04)0.25 (0.11)

0.2600.3700.1400.0260.006

SD: standard deviation. Mean values and SD are expressed in mg/dL; comparisons between groups were made using the Mann-Whitney U-test.


the balance between cholesterol absorption and syn-thesis, decreased serum cholesterol and triglycerides, and attenuated atherosclerosis. It has been reported by Matthan et al. that impaired cholesterol homeostasis, reflected by increased cholesterol absorption and low synthesis markers, is the profile associated with preva-

sis that consumption of Euterpe oleracea can attenuate atherosclerosis. In addition to the previously reported possible antiatherosclerotic properties of Euterpe olera-cea, mainly based on the high content of antioxidant compounds in their fruits14-16), our study has shown that consumption of Euterpe oleracea extract improved

Fig.2. Box plots of plaque area as measured by planimetry. (A) Box plots of plaque area. Smaller plaque areas were observed in the aortas of animals treated with Euterpe oleracea extract (p=0.005 vs control group, Mann-Whitney U-test). (B) Box plots of the aortic plaque percent area. Reduced plaque areas were observed in the aortas of animals treated with Euterpe oleracea extract (p=0.028 vs control group, Mann-Whitney test).

A B

Fig.1. (A) Box plots of aortic arch plaque area. A marked reduction in this parameter was observed in animals treated with Euterpe oleracea extract (p=0.001 vs control group, Mann-Whitney U-test). (B) Box plots of the aortic arch intima/media ratio. Animals treated with Euterpe oleracea extract had lower intima/media ratios (p=0.002 vs control group, Mann-Whitney U-test).

A B

6 Feio et al.

Fig.3. Representative images of the aorta stained by Sudan Ⅲ of rabbits fed a high-cholesterol diet-Euterpe oleracea-treated animal (A) and Control (B). The photomicrographs show histological aorta fragments stained by HE (C and H), Verhoeff for elas-tic fibers (D and I); immunohistochemical reaction for macrophages (E and J) and SMA (F and K) and picrosirius polarized stain for collagen ( G and L) (magnification 100x). Photomicrographs C to G are from Euterpe oleracea group and H to L are from Control group.

HE=hematoxylin & eosin; SMA= smooth muscle actin

A B

G

F

E

D

C

L

K

J

I

H


of Euterpe oleracea, which has these two constituents, may be associated with a lower rate of cholesterol absorption by the small intestine.

In addition, part of the benefits in the lipid pro-file could also be attributed to the fatty acids present in the Euterpe oleracea extract5). One or more com-pounds in the chemical composition of Euterpe olera-cea, with a high content of monounsaturated and polyunsaturated fatty acids, can reduce cholesterol lev-els due to increased expression of LDL receptors in the liver22, 23) followed by cholesterol excretion via the bili-ary tract.

It is also possible that other cholesterol-indepen-dent mechanisms of absorption and synthesis are involved in decreased atherosclerosis development, as observed among animals treated with Euterpe oleracea extract. In this context, the high content of antioxi-dants, mainly polyphenolic compounds, lignans, and other constituents, may have contributed to the decrease in plaque formation24).

Improved endothelial function is another mecha-nism that might be involved in atherosclerosis attenu-ation. Rocha et al.4) showed that Euterpe oleracea extract increases endothelium-dependent vasodilation, an effect that is attenuated by the addition of N?-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and abol-ished by the addition of KCl＋L-NAME.

We previously demonstrated improved endothe-lial function by statins25) and by angiotensin convert-ing-enzyme inhibitor26), accompanied by attenuation of atherosclerosis development in rabbits, independent of changes in serum cholesterol levels.

Recently, favorable effects on glucose levels and insulin resistance were reported following the use of Euterpe oleracea extract in an experimental model of metabolic syndrome27).

Based on the findings of our study and the mechanisms discussed above, the reduction of athero-sclerosis observed in these animals probably results from the sum of multiple beneficial actions of Euterpe oleracea, including decreased ratios of markers of cho-lesterol synthesis and absorption, reduced oxidative

lent cardiovascular disease in the Framingham Off-spring population8). In addition, in the Prospective Cardiovascular Munster Study high β-sitosterol or campesterol levels were markers of cardiovascular events among middle-aged males9); however, recent data from the Spanish EPIC cohort have shown that phytosterols levels were inversely associated with inci-dent cardiovascular disease17). Furthermore, Gylling et al. have demonstrated that cholesterol absorption and synthesis are inherited traits18).

The classic rabbit model of diet-induced athero-sclerosis is highly dependent on the rates of cholesterol absorption and the levels of serum cholesterol achieved. Thus, attenuation of atherosclerosis by the Euterpe oleracea extract could be a consequence of decreased absorption of dietary cholesterol; however, this hypothesis appears insufficient to explain our findings, since there were no significant differences between the two groups of animals for markers of cholesterol absorption (β-sitosterol and campesterol).

Inhibition of cholesterol synthesis could be the second mechanism involved in the reduced develop-ment of atherosclerosis among animals receiving the Euterpe oleracea extract. Again, attenuation of athero-sclerosis in animals treated by the Euterpe oleracea extract may not be explained by reduced synthesis of cholesterol, since these animals did not differ in the levels of desmosterol; however, differences in the des-mosterol/campesterol and desmosterol/β-sitosterol ratios were observed between groups. Thus, consump-tion of Euterpe oleracea seems to contribute to a better balance between cholesterol synthesis and absorption.

We investigated the content of phytosterols in Euterpe oleracea and found that 15 mg in 100 g extract were plant sterols, of which β-sitosterol was the most abundant. This amount of plant sterols may have con-tributed, at least in part, to the lower absorption of cholesterol added to the diet, explaining the reduction in total cholesterol observed in our study19). In fact, previous studies have shown that a high content of fiber and phytosterols can decrease the rate of choles-terol absorption20, 21). The composition of the extract

Table 4. Plaque composition of aortas at week 24, by group

Plaque componentEuterpe oleracea

(n=15)Control(n=12)

p value

Macrophages, mean (SD)Smooth muscle actin, mean (SD)Elastic tissue, mean (SD)

20.4 (15.5)13.3 (4.8)

0.5 (0.6)

22.7 (18.3)12.7 (7.0)

1.2 (1.3)

0.560.660.26

Macrophages, smooth muscle actin and elastic tissue are expressed as the percentages of aortic areas. Compari-sons between groups were made using the Mann-Whitney U-test.

8 Feio et al.

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Study LimitationsOur study examined the effects of Euterpe olera-

cea in animals challenged by an atherogenic diet. It is possible that the beneficial effects observed on athero-sclerosis in this model could be of a higher magnitude than on atherosclerosis related to other classic risk fac-tors observed in humans.

Our study did not evaluate endothelial function or the antioxidant actions of Euterpe oleracea. Regard-ing these parameters, the known beneficial effects of antioxidant compounds present in the Euterpe oleracea extract may have contributed to our histological find-ings.

We did not assess intestinal expression of NPC1L1 due to the unavailability of commercial anti-bodies for rabbits.

Conclusion

Consumption of Euterpe oleracea extract by rab-bits with diet-induced hypercholesterolemia markedly improved the lipid profile and attenuated aortic ath-erosclerosis. These effects were related, at least in part, to a better balance between synthesis and absorption of sterols, surrogate markers of cholesterol homeosta-sis.

Conflicts of Interests

None.

Acknowledgements

This study was supported in part by the National Council of Science and Technology (CNPq), grant # 2008/57685-7. We acknowledge Dr. Paulo Bos-chcov, former professor at the Federal University of Sao Paulo, for his assistance with revising the manu-script.


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