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CENTRO UNIVERSITÁRIO ESTADUAL DA ZONA OESTE

COLEGIADO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS E DA SAÚDE

DESENVOLVIMENTO DE POMADA À BASE DO

EXTRATO DE AÇAÍ (EUTERPE OLERACEA) E SEU

EFEITO CICATRIZANTE

Aline Cristina Silva de Jesus

Rio de Janeiro

2012

ii

ALINE CRISTINA SILVA DE JESUS

Aluna do curso de Farmácia

Matricula: 0823800073

DESENVOLVIMENTO DE POMADA À BASE DO

EXTRATO DE AÇAÍ (EUTERPE OLERACEA) E SEU

EFEITO CICATRIZANTE

Trabalho de Conclusão de Curso, TCCII,

apresentado ao Curso de Graduação em

Farmácia da UEZO como parte dos requisitos

para a obtenção do grau de Farmacêutico

Generalista, sob a orietação da Profª. Drª Jamila

Alessandra Perini.

Rio de Janeiro

Junho de 2012

iv

Dedico este trabalho ao meu Deus que

tem me proporcionado muito mais de

tudo àquilo que tenho pedido ou pensado.

Aos meus pais e irmão que sempre

estiveram ao meu lado, por todo amor e

carinho que me proporcionaram durante

toda a minha vida.

Amo muito vocês!!!

v

“Bem-aventurado aquele que teme ao

SENHOR e anda nos seus caminhos.

Pois comerás do trabalho das tuas mãos;

feliz serás, e te irá bem.”

Salmos 128:1-2

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pelo amor incondicional. Por ter enviado

seu filho para o propósito de me dar vida e foi pela sua graça que estou aqui hoje

e pela mesma Ele tem me capacitado para agradá-lo e por me proporcionar

saúde para completar mais uma etapa da minha vida, por estar presente e me

manter forte frente às dificuldades.

Agradeço especialmente aos meus pais, Paulo Roberto de Jesus e Magaly

Silva de Jesus, que sempre estiveram ao meu lado me proporcionando amor e

carinho e por todo apoio, incentivo e dedicação durante toda minha vida. A minha

mãe em especial, pois desde criança mostrou a mim e ao meu irmão como é bom

estar junto de Deus, nos fez conhecer esse caminho em que Jesus está à frente

lutando pelas nossas causas. E por sempre me fazer ver o lado bom das coisas.

Agradeço ao meu irmão, Paulo Roberto de Jesus Junior, pelo apoio e

carinho que me proporcionou durante toda a minha vida e por ser meu grande

amigo.

Agradeço ao meu noivo, Hugo Gondim Souza dos Santos, por estar

sempre ao meu lado participando dos bons momentos e me apoiando nos

momentos difíceis em minha vida.

Agradeço à minha orientadora, Professora Dra. Jamila Alessandra Perini,

uma das minhas maiores referências profissionais, pelo seu acolhimento e

amizade, pela compreensão, paciência, com a qual pude adquirir grandes

conhecimentos.

Agradeço ao Professor e Reitor Dr. Roberto Soares de Moura pela

oportunidade de aprendizado que me proporcionou durante a graduação.

A todos os jovens da minha igreja por toda ajuda e companheirismo. Em

especial a Thainan minha eterna amiga por longos anos de amizade, por

participar de grandes etapas da minha vida sempre me apoiando e orando por

mim. Sem esquecer todas as minhas amigas do coração Lorrane, Kátia, Natália,

Fernanda e Francine por todos os momentos especiais.

Aos meus primos, Davi e Daniel. Em especial as minhas primas Renata,

Juliana e Silvia por estarem sempre presentes e vivenciando comigo mais uma

vii

fase importante em minha vida e por demonstrar carinho, compreensão e

disponibilidade em todos os momentos em que precisei.

Agradeço também as minhas tias Sonia e Marta, aos meus tios Geraldo,

Reynaldo e Zeca pela convivência, ao incentivo, apoio e estímulo para enfrentar

as barreiras da vida. Um obrigado muito especial a minha vó Nicinha pelo amparo

do dia a dia e por toda a preocupação que sempre teve comigo, meu irmão e

meus primos.

Aos meus amigos de classe Juliana, Bruno, Samira, Rosilane e Barbara,

pelos anos juntos, os quais serviram para aprimorar meus conhecimentos ao

longo de minha formação. Em especial à Roberta Soares, Mayara Regina e

Isabela Cruz pelos momentos de amizade, pelo apoio e por estarem presentes

em distintos e importantes momentos da minha graduação.

À minha amiga e companheira Tais Angeli, pelos incansáveis momentos

dedicados a nossa pesquisa, pelo incentivo e ajuda nos experimentos desta

monografia. A técnica Vanessa pelo auxílio nos experimentos. Sem esquecer, da

Karina Cristina e do João Marcos, que também tiveram sua contribuição neste

projeto.

À UEZO e aos meus professores, pela contribuição no meu aprendizado,

em especial a todos do laboratório LaPesF (Laboratório de Pesquisa

Farmacêutica). Sem esquecer, da Marcela e da Elizete, as secretarias da

Graduação em Farmácia, sempre pelo pronto atendimento.

viii

RESUMO

O Açaí (Euterpe oleracea) tem sido extensamente estudado e sua participação

em diversos processos fisiológicos tem sido bem definida. A cicatrização de

feridas é um processo altamente complexo envolvendo várias fases e diversas

substâncias têm sido utilizadas para estimular o processo de cicatrização. Nesse

contexto desenvolver uma pomada à base do caroço do açaí e verificar sua ação

cicatrizante. Foram testados diferentes excipientes que facilitaram a penetração

do princípio ativo e sua estabilidade foi avaliada pelas características

organolépticas. A atividade antimicrobiana do açaí foi avaliada utilizando quatro

cepas diferentes de microrganismos. A quantificação dos polifenóis totais do açaí

foi efetuada pelo método Folin-Ciocalteau. O efeito cicatrizante foi avaliado em

modelo in vivo. A pomada à base de extrato de açaí foi desenvolvida na

concentração de 10% do ativo e os testes de estabilidade apresentaram

resultados satisfatórios, uma vez que a pomada apresentou consistência e

aspecto adequados, cor e odor característicos. A quantificação do teor médio de

polifenóis no extrato de açaí foi de 123,67 µg/ml equivalente a 41% de polifenóis.

Com relação à sua ação antimicrobiana, o extrato apresentou efeito inibitório a

cepa de Staphylococcus aureus. Observou–se efeito favorável da pomada

desenvolvida no processo de cicatrização. O ativo extraído do caroço do açaí

apresenta concentração considerável de polifenóis e também pelo efeito

antimicrobiano é possível que o açaí tenha efeitos tópicos cicatrizantes

considerando os resultados preliminares obtidos no modelo in vivo. Outros

estudos são necessários para concluir o real efeito do açaí sob a cicatrização.

Palavras-chaves: Cicatrização de Feridas. Fitoterapia. Euterpe oleracea.

Fisiologia da Pele. Polifenóis. Pomada.

ix

ABSTRACT

The Açaí (Euterpe oleracea) has been extensively studied and its involvement in

several physiological processes has been well defined. Wound healing is a highly

complex process involving many stages and various substances have been used

to stimulate the healing process. In this context Develop an ointment based on the

stone of açaí and verify its healing action. We tested different excipients which

facilitated the penetration of the active and its stability was evaluated by the

organoleptic characteristics. The antimicrobial activity of açaí was assessed using

four different strains of microorganisms. The quantification of total polyphenols in

açaí was performed by the Folin-Ciocalteau. The healing effect was evaluated in

vivo model. The açaí extract ointment was developed at a concentration of 10% of

assets and stability tests satisfactory results, since the ointment had adequate

consistency and appearance, color and smell characteristic. Quantification of the

average content of polyphenols in açaí extract was 123.67 µg/ml equivalent to

41% polyphenols. With respect to its antimicrobial action, the extract showed

inhibitory effect to Staphylococcus aureus. There was developed favorable effect

of the ointment on the healing process. The core of the açaí extract has significant

concentration of polyphenols and the antimicrobial effect is also possible that açaí

has healing effects topics considering the preliminary results obtained in vivo

model. Further studies are needed to complete the actual effect of açaí in

healing.

Keywords: Wound healing. Phytotherapy. Euterpe oleracea. Skin Physiology.

Polyphenols. Ointment.

x

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Euterpe oleracea ................................................................................... 3 Figura 2: Esquema do corte transversal de pele, demonstrando as três camadas e os principais tipos celulares presentes em cada camada................................... 7 Figura 3: Representação esquemática da composição da substância intersticial. 8 Figura 4: Esquema da formação do coágulo imediatamente após a lesão, na cicatrização de primeira e segunda intenção........................................................11 Figura 5: Evolução do número relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais do processo de cicatrização................................................... 12 Figura 6: Esquema da fase proliferativa na cicatrização de primeira e segunda intenção ............................................................................................................... 13 Figura 7: Fases do processo de cicatrização na pele......................................... 14 Figura 8: Representação esquemática da angiogênese..................................... 14 Figura 9: Esquema do período e duração de cada evento na cicatrização. ....... 16 Figura 10: Esquema da atividade do colágeno na cicatrização.......................... 17 Figura 11: Evolução da cicatrização, e correlação entre o aparecimento do colágeno maduro e o aumento da resistência tênsil da ferida............................. 18 Figura 12: Esquema da fase de maturação, na cicatrização de primeira e segunda intenção. ............................................................................................... 19 Figura 13: Estrutura química da Hidroxiprolina................................................... 20 Figura 14: Pomada do extrato do caroço do açaí (Euterpe oleracea) ................ 30 Figura 15: Teste de estabilidade da pomada de Açaí quanto à consistência e aspecto adequados, cor e odor característicos, durante 6 meses....................... 31 Figura 16: Tubo de pomada metálico onde a formulação ficou estável .............. 32 Figura 17: Gráfico da curva padrão da solução de ácido gálico para dosagem de polifenóis totais. ................................................................................................... 33 Figura 18: Atividade antimicrobiana do extrato de açaí no meio Ágar Mueller-Hinton .................................................................................................................. 35

xi

Figura 19: Evolução macroscópica da área total da lesão acompanhada por medições e fotografias das áreas no 8° e 12° dia após a lesão. ......................... 37 Figura 20: Histologia das amostras de pele de ratos coletados 12 dias após provocar os ferimentos excisionais no dorso dos animais................................... 38 Figura 21: Concentração de hidroxiprolina após 8 dias de tratamento nos diferentes grupos................................................................................................. 42 Figura 22: Concentração de hidroxiprolina, como indicador do conteúdo de colágeno nos tecidos em cicatrização, após 12 dias de tratamento.................... 43 Figura 23: Concentração de óxido nítrico após 8 dias de tratamento................. 44 Figura 24: Concentração de óxido nítrico após 12 dias de tratamento............... 45

xii

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Especificações dos reagentes utilizados para preparação da pomada e

suas respectivas quantidades ............................................................................. 23 Tabela 2: Avaliação dos principais parâmetros organolépticos da pomada

contendo o extrato do caroço do Açaí ................................................................. 32 Tabela 3: Concentrações de polifenóis em três diferentes amostras do extrato . 33 Tabela 4: Neutrófilo Segmentado nos diferentes grupos analisados após 12 dias

de tratamento....................................................................................................... 39 Tabela 5: Linfócitos nos diferentes grupos analisados após 12 dias de

tratamento.. ......................................................................................................... 40 Tabela 6: Monócitos nos diferentes grupos analisados após 12 dias de

tratamento ........................................................................................................... 41 Tabela 7: Concentração de Óxido Nítrico - NO (ug/mL) com 8 dias de

tratamento.. ......................................................................................................... 44

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BHT Di-terc-butil-metil-fenol (Butylated hydroxytoluene

cm Centímetro

cm2 Centímetro quadrado

CN Controle Negativo

CO2 Dióxido de carbono

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

EROs Espécies reativas de oxigênio

g Grama

GMPc Monofosfato de guanosina cíclico

HE Hematoxilina–Eosina (hematoxylin-eosin)

IL-1 e 8 Interleucinas 1 e 8

iNOS Óxido nítrico sintase índuzivel

Laspef Laboratório de pesquisa Farmacêutica

LPS Lipopolissacarídeo

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido Nítrico

NO2 Óxido Nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

VEGF Vascular endothelial growth factor

PA Pomada Açaí

PC Pomada Comercial

t/ano Toneladas por ano

TGF-1beta Fator de crescimento tissular 1 beta 1

UV Radiação ultravioleta

1

SUMÁRIO

RESUMO.......................................................................................................................... viii

ABSTRACT ....................................................................................................................... ix

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ..................................................................... xiii

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 3

1.1. FRUTO DO AÇAIZEIRO................................................................................... 3

1.2. POLIFENOIS ...................................................................................................... 5

1.3. DESENVOLVIMENTO DE UMA POMADA.................................................... 6

1.4. PELE.................................................................................................................... 6

1.5. CICATRIZAÇÃO................................................................................................. 9

1.5.1. Fase Inflamatória ................................................................................... 10

1.5.2. Fase Proliferativa................................................................................... 12

1.5.2.1. Epitelização....................................................................................... 13

1.5.2.2. Angiogênese..................................................................................... 14

1.5.2.3. Formação de tecido de granulação .............................................. 15

1.5.2.4. Deposição de colágeno .................................................................. 16

1.5.3. Fase De Maturação................................................................................ 18

1.6. HIDROXIPROLINA - MARCADOR DE COLÁGENO................................. 19

1.7. ÓXIDO NÍTRICO NA PELE............................................................................ 20

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 22

2.1. OBJETIVO GERAL.......................................................................................... 22

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................... 22

3. METODOLOGIA ...................................................................................................... 23

3.1. DESENVOLVIMENTO DA POMADA À BASE DO EXTRATO DO AÇAÍ 23

3.2. ESTABILIDADE DA POMADA À BASE DO EXTRATO DO AÇAÍ ........... 24

3.3. DETERMINAÇÃO DOS POLIFENÓIS TOTAIS .......................................... 24

3.4. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO DE AÇAÍ......................... 24

2

3.5. AVALIAÇÃO DA AÇÃO CICATRIZANTE DA POMADA À BASE DE

EXTRATO DE AÇAÍ..................................................................................................... 25

3.5.1. Análise macroscópica da ferida ........................................................ 26

3.5.2. Análise microscópica da ferida ......................................................... 26

3.5.3. Leucograma ............................................................................................ 26

3.5.4. Análise do colágeno ............................................................................. 26

3.5.5. Análise do óxido nítrico....................................................................... 27

3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 27

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 29

4.1. DESENVOLVIMENTO DA POMADA............................................................ 29

4.2. ESTABILIDADE DA POMADA À BASE DO EXTRATO DO AÇAÍ ........... 30

4.3. DETERMINAÇÃO DOS POLIFENÓIS TOTAIS .......................................... 32

4.4. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO DE AÇAÍ......................... 34


EXTRATO DE AÇAÍ..................................................................................................... 36

4.5.1. Análise macroscópica da ferida ........................................................ 36

4.5.2. Análise microscópica da ferida ......................................................... 37

4.5.3. Leucograma ............................................................................................ 39

4.5.4. Análise do colágeno ............................................................................. 41

4.5.5. Análise do óxido nítrico....................................................................... 43

5. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 47

6. REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 48

3

1. INTRODUÇÃO

1.1. FRUTO DO AÇAIZEIRO

Figura 1: Euterpe oleracea (Disponível em SOUSA, L. A. S.; 2006)

Atualmente, o uso de derivados de substâncias vegetais despertou o

interesse da sociedade, tendo como principal vantagem o fato de ser uma fonte

renovável e, em grande parte, controlável pelo ser humano. Uma planta que tem

se mostrado promissora no campo fitoterapêutico é a espécie Euterpe oleracea

(Figura 1), popularmente conhecida como Açaí. Diversos trabalhos científicos

desenvolvidos demonstraram que o açaí apresenta potente ação anti-oxidante

tanto in vitro quanto in vivo (LICHTENTHALER et al., 2005; ROCHA et al., 2007)

por ser rico em polifenóis (RODRIGUES et al., 2006).

O Açaí (Euterpe oleracea), que é nativo da América do Sul recentemente,

se tornou popular como um alimento funcional devido ao seu potencial

antioxidante (SCHAUSS, 2006). A fruta comestível é redonda, na cor preto-

púrpura, cerca de 1 a 2 cm de diâmetro, um peso médio de 0,8 a 2,3g e contém

uma única semente grande. A maceração da polpa do fruto produz um líquido

viscoso que é de aproximadamente 2,4% de proteína e lipídio de 5,9% (em peso)

(DEL POZO-INSFRAN, 2004).

Este fruto tem sido objeto de alguns estudos em função, principalmente,

de seu valor nutritivo (MENEZES, 2005; SOUTO, 2001; ROGEZ, 2000), sendo

inclusive a polpa do açaí considerada como um alimento nutracêutico, perante o

4

seu rico conteúdo de antocianinas - pigmentos hidrossolúveis pertencentes ao

grupo dos flavonóides responsáveis pela cor avermelhada do fruto (OZELA et al.,

1997; IADEROZA et al., 1992; BOBBIO et al., 2000; MENEZES 2005). A função

das antocianinas é a proteção do fruto contra a luz ultravioleta (UV) e evitam a

produção de radicais livres, por isso elas são geralmente consideradas como os

principais contribuintes para a atividade antioxidante da polpa.

O açaí é um fruto de uma palmeira cultivada no norte e no nordeste, e

contribui substancialmente para o suporte econômico de populações carentes

nestas localidades. O Estado do Pará é o maior produtor nacional de açaí com

112.676 t/ano (toneladas por ano) do fruto (IBGE, 2003), 95% da produção

nacional de açaí (HOMMA, FRAZÃO, 2002; OLIVEIRA et al., 2002; MENDES,

2003). Deste total, 93.521 t/ano é de resíduo (caroço), ou seja, cerca de 83%. O

caroço deste fruto é formado por um pequeno endosperma sólido ligado a um

tegumento que na maturidade é rico em celulose, hemecelulose e cristais de

inulina e lipídios (CHAVES, 1948). Apresenta um pericarpo fibroso, rico em sílica

e um endocarpo pouco lenhoso (ROGEZ, 2000). Devido ao grande consumo do

açaí no mercado nacional, muitas pesquisas têm sido feitas a respeito deste fruto,

porém a grande maioria desses estudos tem sido com a polpa, quase nenhuma

relacionada aos resíduos. O aproveitamento integral do fruto traria benefícios

socioeconômicos para a sociedade em geral, pois permitiria promover a

sustentabilidade socioambiental.

A utilização de plantas na prevenção e cura de doenças é muito antiga e

data dos primórdios da civilização e muitas foram ou ainda são usadas no

tratamento de feridas (MESQUITA, 2002). Apesar da transferência de

conhecimento, dos povos antigos para a nova geração, a maior parte dele é

fundamentada no empirismo. Por isso é de suma importância não esquecer que

algumas plantas utilizadas pela população de fato apresentam propriedades

terapêuticas, mas também, outras podem causar grande toxicidade. Este fato

torna o uso indiscriminado de fitoterápicos um risco a população (OLIVEIRA,

2001). Assim sendo, é importante garantir a qualidade dos produtos fitoterápicos,

desde a matéria-prima até o produto acabado para assegurar ao consumidor um

produto padronizado em condições apropriadas para o uso, e que não impliquem

em prejuízos futuros. (Ministério da Saúde do Brasil, por intermédio da Secretaria

5

de Vigilância Sanitária, publicou a Portaria nº 06 de 31 de janeiro de 1995).

Estudos recentes de bioatividade dos compostos do açaí revelaram um

grupo de flavonóides polifenólicos que podem entrar no citosol e reduzir os danos

oxidativos associados com inflamação dentro da célula (SCHAUSS e et al.,

2006). Tendo em vista o crescente interesse da população por tratamentos com

fitoterápicos e considerando o potencial terapêutico demonstrado pela Euterpe

oleracea, torna-se importante o desenvolvimento de uma formulação com ação

cicatrizante contendo extrato de Euterpe oleracea, e o estudo de sua ação

cicatrizante.

1.2. POLIFENOIS

Atualmente o interesse no estudo dos compostos fenólicos tem aumentado

muito, devido principalmente à habilidade antioxidante destas substâncias em

sequestrar radicais livres, os quais são prejudiciais a saúde humana (DORMAN et

al., 2003). Alguns estudos in vitro demonstram que a atividade antioxidante de

alguns polifenóis como os flavonoides é maior que a das vitaminas E e C (RICE-

EVANS et al., 1996).

Os polifenóis constituem um grupo heterogêneo, composto de várias

classes de substâncias com propriedade antioxidante. Os antioxidantes são

substâncias que retardam a velocidade da oxidação, inibindo os radicais livres e

prevenindo a formação de doenças, contribuindo, dessa maneira, para uma maior

longevidade. Dessa forma, torna-se essencial o equilíbrio entre os radicais livres

e o sistema de defesa antioxidante.

O açaí é um fruto rico em polifenóis, especialmente em antocianinas, com

um teor relativamente alto, variando de 50 a 180 mg para cada 100g de polpa

(POZO-INSFRAN, BRENES, TALCOTT, 2004). Outros compostos fenólicos como

ácidos fenólicos e flavonóides também foram identificados e quantificados na

polpa de açaí (POZO-INSFRAN, BRENES, TALCOTT, 2004; GALORI, et al.,

2005; BRITO, et al., 2007; PACHECO-PALENCIA, HAWKEN, TALCOTT, 2007).

Nesse contexto, a possibilidade do desenvolvimento de uma pomada à base do

extrato do açaí com efeito benéfico sobre a cicatrização, a qual está prejudicada

pelo aumento do estresse oxidativo, é perfeitamente consubstanciada e

6

justificável do ponto de vista científico e sócio-econômico.

1.3. DESENVOLVIMENTO DE UMA POMADA

As pomadas são formulações farmacêuticas semi-sólidas, estáveis, de

consistência mole, destinadas ao uso externo (aplicadas sobre a pele ou sobre

certas mucosas), constituídas pelos princípios ativos e por excipientes com

características lipofílicas ou hidrofílicas. A fim de exercer uma ação local ou de

realizar a penetração percutânea de princípios ativos, a pomada deve apresentar

aspecto homogêneo. Elas são constituídas basicamente por excipientes (simples

ou composto), nos quais são dispersos um ou mais princípios ativos (RANG,

DALE, 2004; KATZUNG, 2001; FONSECA, FERREIRA, 2004; ANSEL, 2007).

No desenvolvimento de uma pomada, que pode atuar nos diferentes tipos

de pele, devem ser considerados diferentes aspectos como: a natureza do

princípio ativo e do excipiente; propriedades físicas e mecânicas; hidro ou lipofilia

da pomada; presença ou não de agentes tensioativos; a concentração dos

excipientes e do princípio ativo; e a região onde será aplicada a pomada (esta

considera: desde a camada de queratina; pelos; grau de hidratação da pele; pH

da região e outros fatores relevantes para a penetração da pomada) (FERREIRA,

2002; ANSEL, 2007; NOGUEIRA PRISTA, et al., 2003).

Embora a reparação tecidual seja um processo sistêmico, ás vezes é

necessário favorecer as condições locais da pele utilizando uma terapia tópica

adequada para viabilizar o processo fisiológico.

1.4. PELE

A pele, que recobre a totalidade da superfície externa do corpo, é o maior

órgão, atingindo 16% do peso corporal. Além disso, o tecido cutâneo e as

estruturas a ele associadas (especialmente queratina) protegem o organismo

contra a perda de água por dessecação, garantem a homeostasia de líquidos e

minerais produzindo o suor, atuam na secreção e excreção de moléculas

endógenas, participam na regulação térmica e atuam como receptores para a

percepção do meio ambiente (DE ROBERTIS, et al., 1993; JUNQUEIRA,

7

CARNEIRO, 2008).

Por ser a primeira barreira com o meio externo é constantemente sujeita a

lesões e invasões de patógenos que podem gerar diversas desordens

inflamatórias. Assim, possui um papel importante na manutenção e

desenvolvimento da defesa contra esses invasores ou lesões, desencadeando

um processo inflamatório que é produzido e mantido pela interação de vários

tipos celulares residentes como: queratinócitos, mastócitos, plasmócito, células

endoteliais, terminações nervosas, fibroblastos, e macrófagos, além de células

que migram para o tecido inflamado como eosinófilos, neutrófilos, monócitos e

linfócitos (Figura 2) (LEHNINGER, et al., 2007).

Figura 2: Esquema do corte transversal de pele, demonstrando as três camadas e os principais

tipos celulares presentes em cada camada. (Disponível em <http://dspace.c3sl.ufpr.br>)

A pele é constituída, essencialmente, de três grandes camadas distintas

(Figura 2), firmemente unidas entre si: uma camada superior – a epiderme; uma

camada intermediária – a derme ou cório; e uma camada profunda, a hipoderme

ou tecido subcutâneo (SAMPAIO et al, 2000). Alguns autores preferem

8

considerar, que a pele é constituída fundamentalmente por dois tecidos

justapostos que são a epiderme e a derme, logo abaixo, e em continuidade com a

derme está à hipoderme, que não faz parte da pele segundo esses autores, mas

apenas lhe serve de suporte e união com os órgãos subjacentes. (SKIN, et al.,

1983).

A derme, localizada imediatamente sob a epiderme, é um tecido conjuntivo

que contém fibras protéicas (Figura 3), vasos sanguíneos, terminações nervosas,

órgãos sensoriais e glândulas. As principais células da derme são os fibroblastos,

responsáveis pela produção de fibras e de uma substância gelatinosa,

a substância amorfa, na qual os elementos dérmicos estão mergulhados. São as

fibras da derme que conferem resistência e elasticidade à pele.

Figura 3: Representação esquemática da composição da substância intersticial.

(Disponível em OLIVEIRA, 2009)

A interação coordenada entre os diferentes tipos celulares presentes nas

camadas da pele permite que este órgão responda prontamente e efetivamente

frente a uma variedade de estímulos nocivos que ocorrem na interface do

organismo com o meio externo, como a ação de toxinas, radiação ultravioleta,

organismos patogênicos e extremos de temperatura, garantindo assim

manutenção da homeostase cutânea. E nesse contexto a pele demonstra ser

muito mais do que simplesmente uma barreira física entre o meio externo e o

meio interno, mais sim, também uma extensão do sistema imunológico (WILLMS,

KUPPER, 1996; HAKKE, et al, 2001).

Quando ocorre uma ruptura da continuidade normal da pele temos uma

9

ferida. Ferimentos são definidos como o rompimento e dano da pele que protege

e mantém íntegros os órgãos e tecidos internos em qualquer parte do corpo

humano. Os ferimentos são caracterizados pelo tamanho, profundidade e

estruturas anatômicas envolvidas. Diversos fatores dificultam o processo de

reparo e cicatrização da pele. Dentre estes podemos destacar a etiologia da

ferida, sua posição anatômica e presença de infecção (CHAMPE, et al., 2007).

1.5. CICATRIZAÇÃO

A cicatrização é um processo orgânico de restauração da lesão e consiste

em uma perfeita e coordenada cascata de eventos celulares e moleculares que

interagem para que ocorra a repavimentação e reconstituição do tecido

(ORTONNE e CLÉVY, 1994; MANDELBAUM et al., 2003).

O poder auto-regenerativo é um fenômeno universal em todos os

organismos, tanto organismos unicelulares quanto em organismos superiores

(BALDEZ RN, 2006). Danos tissulares de qualquer natureza (física, química ou

biológica) desencadeiam, de imediato, uma série de eventos que de forma

simplista se traduzem como rubor, tumor, edema, calor e dor.

A maneira pela qual uma ferida é fechada é essencial para o processo de

cicatrização. Existem duas formas principais, pelas quais uma ferida pode

cicatrizar que dependem da quantidade de tecido perdido ou danificado e da

presença ou não de infecção, são elas: primeira intenção e segunda intenção. Na

primeira intenção (união primária) a perda de tecido é muito pequena e este tipo

de cicatrização ocorre quando as bordas da ferida são aproximadas, quando

ocorre, ausência de infecção e o edema mínimo. A formação de tecido de

granulação quase não é visível. Na segunda intenção (granulação) os bordos da

ferida não são aproximados e pode ter a presença de infecção. O processo de

reparo, neste caso, é mais complicado, demorado e ocorre maior deposição de

colágeno. No abscesso formam-se brotos minúsculos chamados granulações, por

isso esse método de reparo é também denominado cicatrização por granulação

(STRYER, et al., 2004; LEHNINGER, et al., 2007).

A cicatrização das feridas é processo altamente complexo, com várias

fases, com uma sequência de estágios sobrepostos e interdependentes

10

(CARREL, 1910). O processo de cicatrização das feridas é dividido em cinco

fases por alguns autores, sendo elas coagulação, inflamação, proliferação,

contração da ferida e remodelação (FAZIO et al., 2000). Mas classicamente, a

cicatrização é dividida em três fases: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de

maturação (CLARK RAF, 2005) como será dividido no presente trabalho, em que

são consideradas, prioritariamente, os aspectos macroscópicos e histológicos

predominantes em cada uma delas. Porém, na realidade, todas as etapas

ocorrem em sobreposição, simultâneas e interdependentes (STRYER, et al.,

2004; CHAMPE, et al., 2007; LEHNINGER, et al., 2007).

1.5.1. Fase Inflamatória

Após a lesão tecidual, começa a ocorrer a liberação local de histamina,

serotonina e bradicinina que causam vasodilatação e aumento de fluxo

sanguíneo local e, a conseqüência disso são sinais inflamatórios como calor e

rubor. A permeabilidade capilar aumenta devido a histamina, causando

extravasamento de líquidos para o espaço extracelular, e consequente edema.

(GUYTON, HALL, 1997; MARZZOCO, TORRES, 2007).

A fase inflamatória se inicia imediatamente após esta lesão, sendo no

início também denominado como coagulação, pois o endotélio lesado e as

plaquetas estimulam a cascata da coagulação. O coágulo formado estabelece

uma barreira impermeabilizante que protege da contaminação, conforme

observado na figura 4 (JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2008, LEHNINGER, et al.,

2007).

11

Figura 4: Esquema da formação do coágulo imediatamente após a lesão, na cicatrização de

primeira e segunda intenção. (Disponível em <http://dc201.4shared.com/doc/BQ2ZfcCv/preview.html>)

A resposta inflamatória perdura cerca de três dias, e se destaca nesta fase

a liberação de substâncias que provocam intensa vasoconstricção: favorecendo a

exsudação plasmática, aumentando a permeabilidade vascular e a passagem de

elementos celulares para o leito da ferida (WITTE MB, et al., 1997).

Uma vez que os neutrófilos são as células mais abundantes no sangue,

eles são as primeiras células a chegar à ferida (Figura 5). Ao final de 24 horas

após a lesão eles constituem cerca de 50% das células migradas ao local

(ENGELHARD, 1998). Logo depois deste extravasamento passivo, os neutrófilos

acabam migrando para a superfície da ferida o que forma uma barreira contra a

invasão de microorganismos e promove o recrutamento ativo de mais neutrófilos

a partir dos vasos adjacentes não lesados (FOXMAN, et al., 1997; ENGELHARD,

et al., 1998). Esses produzem radicais livres, que auxiliam no processo de

destruição de bactérias (BROUGHTON, et al., 2006).

12

Figura 5: Evolução do número relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais

do processo de cicatrização. (Adaptado de TAZIMA, et al., 2008)

Conforme a figura 5, os neutrófilos são gradativamente substituídos por

macrófagos (BROUGHTON, et al., 2006). Os macrófagos migram para a ferida

após 12 a 24 horas da lesão. Eles são as principais células antes dos fibroblastos

migrarem e iniciarem a replicação. Os macrófagos têm papel fundamental na

transição para a fase proliferativa (BROUGHTON, et al., 2006).

1.5.2. Fase Proliferativa

A fase proliferativa é constituída por quatro eventos fundamentais, que

sucedem o período de maior atividade da fase inflamatória: epitelização,

angiogênese, formação de tecido de granulação e deposição de colágeno

(LAWRENCE, DIEGELMANN, 1994). Esta fase é constituída por um leito capilar,

macrófagos, um frouxo arranjo de colágeno, fibroblastos, fibronectina e ácido

hialurônico, tendo início ao redor do 3º dia após a lesão, e se estendendo por

aproximadamente 2 a 3 semanas. Conforme a figura 6, está fase é o marco inicial

da formação da cicatriz.

13

Figura 6: Esquema da fase proliferativa na cicatrização de primeira e segunda intenção.

(Disponível em <http://dc201.4shared.com/doc/BQ2ZfcCv/preview.html>)

1.5.2.1. Epitelização

A epitelização ocorre precocemente pois nas primeiras 36 horas, após a

lesão, fatores de crescimento epidérmicos estimulam a proliferação de células do

epitélio. Células primitivas da camada basal do tecido epidermal possuem

potencial mitótico latente. Em tecidos normais, este potencial se encontra inibido

pelo contato existente entre as células, como se fosse uma “inibição por contato”.

As células epiteliais migram desordenadamente, a partir das bordas, sobre a

ferida e os folículos pilosos próximos, induzindo a contração e a neoepitelização

da ferida e, assim, reduzindo a sua superfície, na tentativa de restabelecer a

barreira protetora (LAWRENCE, DIEGELMANN, 1994). Com exceção das células

epiteliais, os queratinócitos são as células mais presentes na epiderme, que

migram para recobrir a ferida (Figura 7).

14

Figura 7: Fases do processo de cicatrização na pele: (1) Formação do tampão de coagulação; (2) nova epitelização por queratinócitos; (3a) e (3b) fim do processo de epitelização e formação da cicatriz. (Adaptado de <http://cienciahoje.uol.com.br>)

1.5.2.2. Angiogênese

A angiogênese é o processo de formação de novos vasos sangüíneos a

partir de um já existente, pela migração de células endoteliais e formação de

capilares, essencial para manter o ambiente de cicatrização da ferida. O processo

de angiogênese envolve uma série de etapas que estão ilustradas na figura 8.

Figura 8: Representação esquemática da angiogênese. (Adaptado de SILVA, et al., 2007)

15

A formação de novos vasos capilares a partir de células endoteliais

(angiogênese) está envolvida em vários processos fisiológicos e patológicos. Ela

é essencial no desenvolvimento dos órgãos, na cura de ferimentos e em

processos inflamatórios, sendo rigorosamente regulada pelo organismo

(HAUBNER, et al., 1997).

Nas feridas, os fibroblastos responsáveis pela síntese de colágeno tem

seu suprimento sanguíneo pelo crescimento de novos vasos que formam-se a

partir de brotos endoteliais sólidos e que migram no sentido da borda periférica

da ferida para o seu centro sobre a malha de fibrina depositada no leito da ferida.

A neo-angiogênese é responsável não apenas pela nutrição do tecido, com uma

demanda metabólica maior, mas também pelo aumento do aporte de células,

como macrófagos e fibroblastos para o local da ferida (LIOTTA, et al., 1991;

GIANNIS, et al., 1997).

1.5.2.3. Formação de tecido de granulação

É a parte mais característica do processo de cicatrização. Representa o

novo tecido que cresce para preencher o defeito. Como se pode observar na

figura 9, existe uma sobreposição das fases da cicatrização (GUIDUGLI-NETO,

1987).

O tecido de granulação consiste basicamente em macrófagos, fibroblastos

e vasos neoformados que estão suportados por uma matriz frouxa de

fibronectina, ácido hialurônico e colágeno tipos I e II (GUIDUGLI-NETO, 1992).

Os novos vasos que vascularizam essa região são essências neste estágio

porque permite a troca de gases e a nutrição das células metabolicamente ativas

(ECKERSLEY, et al., 1988).

16

Figura 9: Esquema do período e duração de cada evento na cicatrização.


1.5.2.4. Deposição de colágeno

O colágeno é a proteína mais abundante do tecido conjuntivo em fase de

cicatrização, tem alto peso molecular, composta de glicina, prolina, hidroxiprolina,

lisina e hidroxilisina, que se organiza em cadeias longas de três feixes

polipeptídicos em forma de hélice, responsáveis pela força da cicatriz (ROBSON,

et al., 2001). O colágeno é o principal componente da matriz extracelular dos

tecidos epiteliais.

O colágeno tipo I é mais predominante em tecidos denso e o tipo III é mais

comumente encontrado em tecidos frouxo. A derme sã contém aproximadamente

80% de colágeno tipo I e 20% de colágeno tipo III. Já o tecido de granulação

expressa 30 a 40% de colágeno do tipo III, sendo considerado colágeno imaturo

(ROBSON, et al., 2001). O colágeno é o material responsável pela sustentação e

pela força tensil da cicatriz, produzido e degradado continuamente pelos

fibroblastos.

Inicialmente, a síntese de colágeno novo é a principal responsável pela

força da cicatriz, sendo substituída ao longo de semanas, pela formação de

ligações cruzadas entre os feixes de colágeno, conforme consta na figura 10. A

taxa de síntese declina por volta de quatro semanas e se equilibra com a taxa de

destruição e, então, se inicia a fase de maturação do colágeno que continua por

meses, ou mesmo anos.

17

Figura 10: Esquema da atividade do colágeno na cicatrização. (A) Corte inicial abrindo a porta para a saída de sangue e para a entrada a micro-organismos estranhos, (B) Vários tipos de célula migram para a região, a fim de vedar a ferida. (C) Os fibroblastos responsáveis pela produção de colágeno, proteína essencial à cicatrização, também migram para o leito do ferimento. Em um primeiro momento há uma deposição desordenada de colágeno causando o endurecimento da pele. (D) Após cerca de 40 dias, as fibras de colágeno são parcialmente reorganizadas. Como resultado, a cicatriz perde a textura inicial e fica mais fina e suave. (Adaptado de < http://saude.abril.com.br>)

O colágeno produzido inicialmente é mais fino do que o colágeno presente

na pele normal. Com o tempo, o colágeno inicial (colágeno tipo III) é reabsorvido

e um colágeno mais espesso é produzido e organizado ao longo das linhas de

tensão. Estas mudanças se refletem em aumento da força tênsil da ferida.

(BROUGHTON, 2006)

Na figura 11 pode ser observada a degradação do colágeno que se inicia

precocemente e é muito ativa durante o processo inflamatório. A formação da

matriz extracelular é resultante de um balanço entre a deposição (síntese) e

18

degradação de colágeno estrutura-se em rede densa e dinâmica resultante da

sua constante deposição e reabsorção. (JIBON, AHONEN, ZEDERFELDT, 1980).

Figura 11: Evolução da cicatrização, e correlação entre o aparecimento do colágeno maduro e o

aumento da resistência tênsil da ferida (Adaptada de WITTE, BARBUL, 1997)

1.5.3. Fase De Maturação

Por volta do décimo dia, o leito da ferida está totalmente preenchido pelo

tecido de granulação (GUIDUGLI- NETO, 1987). E neste mesmo período a

maturação da ferida tem início e caracteriza-se por um aumento da resistência.

O tecido de granulação vai sendo enriquecido com mais fibras de colágeno

e começa a adquirir a aparência de massa fibrótica característica da cicatriz,

conforme a figura12, mas não há aumento na quantidade de colágeno, pois

existe um equilíbrio de produção e destruição das fibras de colágeno neste

período. O desequilíbrio desta relação favorece o aparecimento de cicatrizes

hipertróficas e quelóides (CLARK, et al., 1988).

Com a evolução do processo, acentua-se a deposição de colágeno e a

maioria das células desaparecem formando finalmente a cicatriz. Mesmo após

19

um ano a lesão apresenta um colágeno menos organizado do que o da pele sã, e

a força tênsil jamais retornará a 100%, atingindo em torno de 80% após três

meses (BROUGHTON G, et al., 2006).

A característica mais importante da fase de maturação é que o aumento da

resistência de uma cicatriz é dada pela quantidade de colágeno depositada e

pela forma com que as fibras estão organizadas, por isso é a mais importante

clinicamente. A resolução completa de uma ferida, somente pode ser considerada

após concluída a maturação e remodelagem da matriz extracelular. (BALBINO,

PEREIRA, CURI, 2005).

Figura 12: Esquema da fase de maturação, na cicatrização de primeira e segunda intenção.


1.6. HIDROXIPROLINA - MARCADOR DE COLÁGENO

O colágeno é o principal componente do tecido conjuntivo, é a proteína

mais abundante do organismo e é uma das proteínas mais conservadas ao longo

do processo evolutivo. Ele é uma glicoproteína composta por três cadeias

polipeptídicas em conformação de tríplice hélice (PROCKOP, et al., 1979), e é

constituído, principalmente, pelos aminoácidos glicina, alanina, lisina, prolina,

hidroxilisina e hidroxiprolina (YAMAUCHI, WOODLEY, MECHANIC, 1988). A

20

prolilhidroxilase transforma a prolina em hidroxiprolina (Figura 13), que passa a

ser um aminoácido exclusivo do colágeno (FORREST, 1983).

Figura 13: Estrutura química da Hidroxiprolina. (Adaptado de <http://www.merckmillipore.com>)

A hidroxiprolina está presente em concentrações elevadas no colágeno,

sendo indispensável para a estabilidade da tríplice hélice da molécula de

colágeno (FORREST, 1983). Embora a hidroxiprolina seja também encontrada

em outras proteínas, como a elastina, ela é considerada um aminoácido

característico do colágeno, e sua quantificação por métodos experimentais pode

ser considerada um indicador do conteúdo de colágeno em tecidos (BERG RA,

1982; NEUMAN, et al., 1950).

1.7. ÓXIDO NÍTRICO NA PELE

O óxido nítrico (NO) é formado pela ação de uma enzima denominada

óxido nítrico sintase (NOS), sendo um mediador inflamatório. Existem três

isoformas principais de NOS, duas constitutivas, eNOS, presente no endotélio e

nNOS, presente nos neurônios, e uma induzível (iNOS), expressa nos

macrófagos, células de Kupfer, neutrófilos, fibroblastos, músculo liso vascular e

células endoteliais em resposta a estímulos patológicos, sendo a principal

isoforma presente nas reações inflamatórias (FUJII et al, 1998).

É uma molécula pequena, relativamente instável. É um radical livre que,

dependendo da sua quantidade pode ter efeitos benéficos ou maléficos sobre o

organismo. Sabe-se que o NO atua como mecanismo fundamental de sinalização

nos sistemas cardiovascular e nervoso e desempenha a função de defesa do

organismo. (FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980).

21

A NOS usa como substrato a L-arginina, presente nas células endoteliais e

produz citrulina e NO, que, por ser um gás, se difunde facilmente para dentro da

célula do músculo liso (BREDT, 1999). A principal função do óxido nítrico no

músculo liso é promover uma vasodilatação, dessa forma o fluxo sanguíneo no

vaso é aumentado, e consequentemente tem aumentado o estresse de

cisalhamento.

O óxido nítrico tem sido relacionado a numerosas funções homeostáticas,

como angiogênese, melanogênese, síntese de colágeno, cicatrização, e

vasodilatação (ROMERO-GRAILLET, et al., 1997; FRANK, et al., 2000; BOISSEL

et al., 2004; BROWN et al., 2006).

Na pele, células como queratinócito, fibroblastos, melanócitos, células

endoteliais expressam NOS e parecem ser capazes de liberar NO (CALS-

GRIERSON e ORMEROD, 2004). No que diz respeito ao queratinócito humano

normal, além de um contínuo e baixo nível de NO atribuído as isoformas

constitutivas, também podem ser produzidos níveis mais altos de NO através da

expressão da isoforma induzível (NO2) em resposta as citocinas pró-

inflamatórias, LPS e radiação ultravioleta (UV) (CHANG et al., 2003; BOISSEL et

al., 2004; PAUNEL et al., 2005; NAKAI et al., 2006).

Tendo em vista o crescente interesse da população por tratamentos com

fitoterápicos, considerando os níveis de polifenóis, a ação sob o NO e o potencial

terapêutico da planta Euterpe oleracea, torna-se importante o desenvolvimento

de uma formulação à base do extrato do açaí para avaliar seu real papel como

agente cicatrizante.

22

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Desenvolvimento de uma pomada à base do extrato do açaí (Euterpe

oleracea) para avaliação do seu efeito na cicatrização.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

· Verificar a estabilidade da pomada à base do extrato do açaí;

· Dosar a concentração de polifenóis totais na semente do extrato do açaí;

· Avaliar o efeito antimicrobiano do extrato do açaí;

· Avaliar o efeito cicatrizante da pomada à base do extrato do açaí em

modelo in vivo.

23

3. METODOLOGIA

3.1. DESENVOLVIMENTO DA POMADA À BASE DO EXTRATO DO AÇAÍ

No desenvolvimento deste trabalho foram utilizadas as seguintes matérias-

primas, vidrarias e equipamentos: Glicerina Farmacêutica, Lanolina, Vaselina, di-

terc-butil-metil-fenol (Butylated hydroxytoluene - BHT), Água destilada, gral,

pistilo, buretas graduadas, pipetas automáticas, bastões de vidro, espátulas,

papel para pesagem, Becker de vidro, balança analítica e semi-analítica. E como

principio ativo foi utilizado o caroço do Açaí, que era enviado por um ex-aluno do

professor Roberto S. de Moura, nosso colaborador.

No Laboratório Didático de Farmacotécnica da UEZO, em colaboração com

a Farmacêutica Fernanda Marques Peixoto, foi desenvolvida uma base para

incorporação do extrato de açaí a partir do pó liofilizado. Para 30g de pomada

(quantidade desejada para a utilização durante 11 dias de tratamento) com o

ativo em estudo na concentração de 10% foi estabelecida a seguinte formulação

(Tabela 1):

Tabela 1: Especificações dos reagentes utilizados para preparação da pomada e suas respectivas quantidades

Matéria-prima Quantidade

Ativo (extrato de açaí) 3 g

Lanolina 8,1 g

Vaselina 18,1 g

BHT 0,0027 g

Água destilada 5 mL (q.s.p.)

Glicerina 5 mL

Os reagentes foram pesados separadamente na balança analítica e em

seguida o princípio ativo (3 g do extrato do caroço do açaí). Em resumo o extrato

foi solubilizado em 5 mL de água destilada em um gral de porcelana. O BHT foi

adicionado e após a dissolução foi acrescentado 5 mL de glicerina, seguido da

vaselina sólida e a lanolina, misturando-se bem com a ajuda do pistilo. O extrato

24

de Euterpe oleracea foi incorporado na concentração de 10%.

3.2. ESTABILIDADE DA POMADA À BASE DO EXTRATO DO AÇAÍ

Para avaliar a estabilidade da pomada à base do extrato do açaí foram

avaliadas as características organolépticas, conforme o Guia de Estabilidade de

Produtos Cosméticos (www.anvisa.gov.br/cosmeticos/index.htm). Desta forma,

os parâmetros avaliados foram aspecto, cor e odor.

Para acompanhar a estabilidade física do produto, as pomadas

submetidas aos testes de controle de qualidade foram mantidas sempre nas

mesmas condições, em um recipiente hermeticamente fechado para protegê-lo

da luz, pois pode provocar reações de oxidação e fotólise, em temperatura

ambiente (37°C), pois o calor pode levar a desnaturação dos excipientes, sem

umidade pois pode gerar reações de hidrólise. Para determinação da cor e do

aspecto os produtos foram avaliados por identificação visual, além disso, as

pomadas foram fotografadas para registro; e para o odor, foi utilizado o olfato

como sentido.

3.3. DETERMINAÇÃO DOS POLIFENÓIS TOTAIS

A determinação dos polifenóis totais no extrato do caroço do açaí foi

efetuada pelo método Folin-Ciocalteau com leitura calorimétrica (700nm) em

espectrofotômetro de UV/VIS, utilizando ácido gálico como padrão de referência

(50, 100, 150, 250 e 1000 µg/mL).

3.4. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO DE AÇAÍ

A atividade antimicrobiana do extrato de açaí foi realizada utilizando os

microorganismos Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus e Bacillus cereus em 5mg/mL de extrato de açaí no meio Ágar Mueller-

Hinton. Foi então comparado com um Controle Negativo - MH (Sem nada), um

Controle Positivo – MH + Antib. (na presença de um antibiótico de amplo espectro

a Cefepima – uma cefalosporinas de quarta geração com atividade contra Gram-

25

negativas e Gram-positivas).


EXTRATO DE AÇAÍ

O estudo da ação cicatrizante da pomada foi realizado em feridas cutâneas

de ratos, conforme modelo estabelecido pelo nosso grupo na UEZO no LaPesf

(Aprovado pela Comissão de Ética com Uso de Animais – CEUA, do Centro de

Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro, número de

referência DAHEICB08). Estudamos 36 animais (Rattus norvegicus albinus) da

linhagem Wistar, com 7 a 9 semanas de idade, pesando aproximadamente 120 g,

machos e fêmeas. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno,

individualmente, em temperatura (21±1ºC) e umidade controladas (60±10%). O

ambiente era submetido a ciclos de 12 horas de claro e escuro. Os animais foram

submetidos às condições de manejo idênticas, alimentados com ração comercial

e água à vontade.

Para o delineamento geral do experimento, os animais foram divididos,

aleatoriamente, em três grupos: CN – Controle Negativo (o ferimento foi exposto

as mesmas condições dos outros grupos, porém sem aplicação de nenhuma

pomada), PA – Pomada Açaí (foi aplicada a pomada de extrato do caroço do açaí

na concentração de 10%) e PC – Pomada Comercial (foi aplicada uma pomada

comercial – referência no tratamento da cicatrização). O tratamento começou no

dia da lesão e uma nova camada de pomada foi aplicada todos os dias.

No dia dito “zero” foi realizada uma lesão no dorso dos animais. Para tal, os

animais foram anestesiados com 0,02mg/mL de Zoletil® (associação de 125,0

mg de Cloridrato de Tiletamina e 125,0 mg de Cloridrato de Zolazepam),

administrada por via intramuscular. Após anestesia foi feita assepsia com álcool

70% no local cirúrgico e, em seguida, o dorso dos animais foi depilado para o

procedimento cirúrgico e para melhor absorção da pomada durante todo o

período do experimento. Durante o procedimento cirúrgico foi realizada uma

lesão excisional (1cm2) com retirada de toda a derme com auxílio de lâmina de

bisturi, tesoura romba e pinça de dissecção. A lesão não foi suturada para

cicatrizar por segunda intenção. A pomada foi aplicada imediatamente após

26

cirurgia e, posteriormente, uma vez ao dia com auxílio de espátulas estéreis.

A eutanásia foi realizada em câmara de CO2, no 8º dia após a lesão na

metade do grupo e 12 dias após lesão na outra metade. No dia da eutanásia, a

área da lesão junto com a pele sã adjacente foi recolhida, todas as amostras

foram divididas em quatro partes iguais para que pudéssemos proceder todas as

análises.

3.5.1. Análise macroscópica da ferida

Em todos os animais as lesões cutâneas foram observadas diariamente

quanto à presença de hiperemia, edema, sangramento, secreção, odor e crostas.

A evolução macroscópica da área total da lesão foi acompanhada por

medições e fotografias das áreas. As medidas foram realizadas no dia da lesão e

nos dias 8 e 12 após a lesão.

3.5.2. Análise microscópica da ferida

A histologia, para demonstrar a ação cicatrizante da pomada foi realizada

nos dias 8 e 12 após a lesão. As amostras dos tecidos foram fixadas em formol

4%, os fragmentos foram processados e os cortes histológicos foram corados

com Hematoxilina-Eosina (HE) (LUNA, 1968).

3.5.3. Leucograma

No momento do sacrifício, no 12º dia após a lesão, foi coletado sangue da

calda dos animais em estudo para realização de um leucograma para verificação

do estado geral dos animais e para avaliar um possível processo inflamatório.

3.5.4. Análise do colágeno

No dia do sacrifício dos animais (no 8º e 12° dia após lesão) a área da

lesão junto com a pele sã adjacente foi recolhida e a ¼ foi armazenada em

congelador a -80°C sem nenhum conservante até a determinação bioquímica da

27

concentração de hidroxiprolina. Para estimar a deposição de colágeno foram

quantificados os níveis de hidroxiprolina nas amostras congeladas de cicatriz

como previamente descrito por Woessner (Woessner,1961; Souza,2006).

As determinações das concentrações de hidroxiprolina nos fragmentos de

tecido cicatrizado foram feitas em triplicatas. Foram também preparados padrões

de hidroxiprolina, em triplicatas, nas concentrações de 0,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 e

10,0µg/mL para confecção de curva de calibração. A amostra foi resfriada e a

leitura do cromóforo vermelho formado foi feita em espectrofotômetro (550nm)

logo em seguida.

Os valores para as concentrações de hidroxiprolina obtidos com o uso da

curva de calibração foram corrigidos, levando-se em consideração o rendimento

do método. Após essas correções, as concentrações foram convertidas para µg

de hidroxiprolina/mL.

3.5.5. Análise do óxido nítrico

A produção de NO foi avaliada indiretamente pela leitura colorimétrica do

nitrito nas diferentes amostras pelo reagente de Griess. As amostras de cada

grupo foram misturadas na proporção de 1:1 com o reagente de Griess (1 volume

de 1 % de Sulfanilamida em 5 % de ácido ortofosfórico em água deionizada com

volume igual de 0,1 % de N-[1-Naftil] Etilenodiamina em água deionizada). Após

10 minutos, a mistura foi lida em leitor de ELISA Spectra Softmax (540 nm) e a

quantificação da produção de NO foi baseada na curva padrão feita com

quantidades de nitrito de sódio definidas (GREEN, et al., 1982).

3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA

As diferenças observadas nas análises macroscópica, microscópica,

bioquímica e molecular nos três diferentes grupos propostos para o

estabelecimento do modelo animal de cicatrização foram avaliadas utilizando-se

o teste de ANOVA (one way analysis of variance) e o teste de Student-Newman-

Keuls para comparações par a par.

28

O programa que foi utilizado para a realização de todas as análises

estatísticas está disponível como ferramenta web

(faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html e http://department.obg.cuhk.edu.hk),

e o nível de significância fixado será em P menor ou igual 0,05.

29

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Anteriormente, já havia sido determinado pelo nosso colaborador, Prof.

Roberto Soares de Moura, o grande poder benéfico, vasodilatador e antioxidante

do fruto do Açaí (SOARES DE MOURA R., et al., 2011, 2012, DE OLIVEIRA, et

al., 2010, ROCHA, ET AL., 2007, 2008). Como a conclusão foi verificado que o

extrato mais ativo foi o obtido do caroço do açaí, sendo assim, o nosso estudo

para desenvolvimento de uma pomada à base de extrato de açaí passou a se

concentrar no extrato extraído do caroço do fruto que foi cedido pelo pesquisador

Roberto Soares de Moura.

4.1. DESENVOLVIMENTO DA POMADA

Quando se trabalha com o extrato de produto natural com o objetivo de

incorporá-lo a uma formulação, o primeiro passo é colocá-lo em uma formulação

compatível com seus constituintes, para que dessa forma, o produto final, além

de ter uma boa aparência e atrair o consumidor, possua também estabilidade e

que consiga também auxiliar na ação do extrato e assim obter um produto

completo. Pensando nisso, dentre as diversas formas farmacêuticas existentes

para veicular ativos cicatrizantes foi escolhida uma pomada. As bases de

pomadas são utilizadas por seus efeitos físicos como protetoras, emolientes ou

lubrificantes (ANSEL, 2007), assim além do ativo auxiliar no processo de

cicatrização, a base tem função protetora e emoliente, protegendo o local da

cicatrização, o qual geralmente é sensível por estar agredido (ANSEL, 2007;

DEALEY, 1996; YAMADA, 1999).

A pomada a base de extrato de açaí foi desenvolvida utilizando 10% do

extrato de açaí, 30% de lanolina anidra, que é um emoliente e doador de

consistência, 66,9% de vaselina que permite a lubricidade na aplicação sobre a

pele, glicerina que é um agente de levigação e 0,01% de BHT como agente

antioxidante e conservante. Conforme observado na figura 14 o extrato do açaí

incorporou de forma adequada à formulação obtendo resultados satisfatórios no

desenvolvimento desta formulação.

30

Figura 14: Pomada do extrato do caroço do açaí (Euterpe oleracea)

4.2. ESTABILIDADE DA POMADA À BASE DO EXTRATO DO AÇAÍ

Os caracteres organolépticos constituem o indicativo mais fácil e acessível

para avaliação da qualidade de uma preparação semissólida e para detectar

alguma eventual alteração e determinar os parâmetros de aceitação do produto

pelo consumidor. Um simples exame visual pode funcionar como um indicativo,

da homogeneidade da preparação (NOGUEIRA PRISTA, et al., 2003). São

propriedades organolépticas às características que podem ser percebidas pelos

sentidos humanos, como a cor, o brilho, o paladar, o odor e a textura. Qualquer

indivíduo, após a aplicação de um creme na pele, submete-o, involuntariamente a

uma análise visual, olfativa e táctil. A cor e o aroma são dois índices seguros para

elucidar quanto ao estado de conservação da preparação, pois uma mudança da

cor ou um cheiro diferente, mais ou menos pronunciado, podem ser indícios de

que houve alteração na preparação (NOGUEIRA PRISTA, et al., 2003).

Neste trabalho foi realizado o acompanhamento da pomada desenvolvida

a base do extrato de açaí para verificar se a formulação mantém suas

características físicas. A estabilidade de produtos farmacêuticos depende de

fatores ambientais como temperatura, umidade e luz, e de outros relacionados ao

próprio produto como propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e

excipientes farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de

31

fabricação, tipo e propriedades dos materiais de embalagem (RE 1 de 29.07.2005

Guia para realização de estudos de estabilidade).

Em um período de seis meses as pomadas preparadas somente para o

estudo de estabilidade foram observadas quanto a consistência e aspecto

adequados, cor e odor característicos. Foi observado neste período que a

estabilidade da pomada desenvolvida não foi satisfatória (Figura 15), pois houve

um escurecimento do produto dando indício de uma oxidação (processo que

envolve a perda de elétrons para outra molécula ou átomo, causando a redução

da molécula receptora). Uma explicação para esse processo seria a significativa

concentração de polifenóis que quantificamos no extrato do caroço de Açaí, já

que os compostos fenólicos são susceptíveis à oxidação (BRITTON, G., 1992;

DAVEY, M.W. 2000).

Figura 15: Teste de estabilidade da pomada de Açaí quanto à consistência e aspecto adequados,

cor e odor característicos, durante 6 meses. (A) Logo após a preparação; (B) 3 meses após o preparo e (C) 6 meses após o preparo.

Para garantir a qualidade da formulação desenvolvida e posterior

aplicação em modelo in vivo de cicatrização verificou-se na literatura (CAMILO,

2006; FIORENTINO, 2008; FORCINO, 2001; TWEDE, GODDARD, 2010) a

importância de um material de acondicionamento adequado e dessa forma foram

efetuados testes de compatibilidade entre o material de acondicionamento e a

formulação desenvolvida, a fim de determinar a melhor relação entre eles. Sendo

assim, foi verificado que no tubo metálico de embalagem de pomada (Figura 16)

as características de estabilidade do produto foram asseguradas e a oxidação do

extrato incorporado à formulação foi evitada.

32

Figura 16: Tubo de pomada metálico onde a formulação ficou estável

Os testes de estabilidade foram novamente realizados após a adequação

da embalagem ao produto e observamos que os parâmetros organolépticos

avaliados foram mantidos uma vez que a pomada apresentou consistência e

aspecto adequados, cor e odor característicos. Os testes de estabilidade foram

realizados até seis meses após o desenvolvimento do produto (Tabela 2), até o

momento de conclusão deste trabalho. O acompanhamento prolongado desta

pomada será continuado para que o panorama geral de amostragem seja

satisfatório para determinar o prazo de validade do produto (D’LEÓN, 2001).

Tabela 2: Avaliação dos principais parâmetros organolépticos da pomada contendo o extrato do caroço do Açaí.

Característica Tempo

1 mês 2 meses 3 meses 6 meses

Cor Marrom (Mel) Normal sem alteração

Normal sem alteração


Odor Característico Normal sem alteração


Levemente alterado

Aspecto Característico Normal sem alteração



4.3. DETERMINAÇÃO DOS POLIFENÓIS TOTAIS

A quantificação de polifenóis foi realizada na curva padrão (R²= 0,9983) com

solução de ácido gálico em diferentes concentrações (µg/ml), conforme figura 17.

33

Figura 17: Gráfico da curva padrão da solução de ácido gálico para dosagem de polifenóis totais.

O teor médio de polifenóis totais de três diferentes amostras de extrato de

açaí foi de 123,67 µg/ml equivalente a 41% de polifenóis (Tabela 3).

Tabela 3: Concentrações de polifenóis em três diferentes amostras do extrato de açaí. Amostra Absorbância (nm)

Açaí 1 0,820

Açaí 2 0,798

Açaí 3 0,804

Média 0,807

Concentração 123,67mg/mL

% 41

Existe uma vasta literatura em relação às propriedades curativas dos

polifenóis (NAYAK, PINTO, 2006; KATIYAR, et al., 2001; MUKHTAR, 2000).

Compostos fenólicos incorporados em produtos podem desempenhar um

Concentração de Ácido Gálico (µg/mL)

y = 0,0054x - 0,1891

R2 = 0,9983

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0 50 100 150 200 250 300

Absorbância (nm)

34

importante papel referente a ação anti-inflamatória, antimicrobiana e antioxidante

(SHI, et al., 1999). A atividade antioxidante de alguns polifenóis é grande, muitas

vezes maior que a das vitaminas E e C, que tem seu poder antioxidante já bem

definido (RICE-EVANS et al., 1996). Devido aos nossos resultados satisfatórios

em relação a quantificação de polifenóis no extrato do caroço do açaí é de se

supor que a pomada desenvolvida a base deste extrato pode ter efeito benéfico

na cicatrização de feridas.

4.4. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO DE AÇAÍ

O extrato do caroço do açaí (5mg/mL) foi testado em quatro tipos diferentes

de microorganismos (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus e Bacillus cereus) e comparado com um Controle Negativo - MH (Sem

nada), um Controle Positivo – MH + Antib. (na presença de um antibiótico de

amplo espectro a Cefepima – uma cefalosporinas de quarta geração com

atividade contra Gram-negativas e Gram-positivas). Foi possível concluir, dentro

das condições experimentais, que extrato do caroço de açaí na concentração de

5% possui ação antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus (Figura 18), um

coco gram positivo, considerado um patógeno oportunista que costuma colonizar

a pele e frequentemente está associada a infecções adquiridas.

O Staphylococus aureus é responsável por vários tipos de infecção em

nosso organismo, sendo as de pele as mais comuns, e qualquer porta de

entrada, como por exemplo, uma ferida não cicatrizada, pode ser suficiente para

o desenvolvimento de infecções graves (ARBUTHNOTT, 1990). Sendo assim, o

resultado antimicrobiano positivo obtido neste trabalho justifica a utilização do

extrato do açaí como princípio ativo de uma pomada com possível ação

cicatrizante.

As infecções de pele mais comumente causadas pelo Staphylococus aureus

são o impetigo, foliculite, terçol, furúnculo, síndrome de pele escaldada

estafilocócica, mastite puerperal e a celulite. O Staphylococus aureus, após a

entrada no organismo, pode não ficar restrito a pele, invadindo o sangue e

levando a infecções graves, sepse e choque séptico (BULL, et al., 2000;

COLWELL, 1997).

35

Microorganismos usados neste trabalho: Bacillus cereus é uma bactéria

Gram-positiva, considerada um agente etiológico de doenças de origem alimentar

(HARMON et al., 1992); Staphylococcus aureus são cocos Gram-positivos

(TRABULSI et al., 2004) em indivíduos saudáveis são encontrados na pele e nas

fossas nasais, entretanto pode causar infecções piogênicas como (celulite), até

infecções mais graves na pele (JAWETZ et al., 2005); Escherichia coli é um

bacilo Gram-negativo, pertence à família Enterobacteriaceae, encontrado no

trato intestinal, faz parte da microbiota normal, embora esteja relacionada a

diversas infecções (KONEMAN et al., 2008; MIMS et al.,1999) e Pseudomonas

aeruginosa é um bacilo Gram-negativo e é um microrganismo natural da

microbiota do intestino e da pele, embora se comporte como oportunista em

pacientes imunocomprometidos, em queimaduras extensas, em indivíduos que

tenham passado por processos invasivos e em ambiente hospitalar (SOUZA O.

C., et al., 2007; TORTORA et al., 2005).

Figura 18: Atividade antimicrobiana do extrato de açaí no meio Ágar Mueller-Hinton (5mg/mL de

extrato)

Como a utilização de plantas no tratamento de doenças é uma prática

muito comum, principalmente nos países subdesenvolvidos como o Brasil, onde a

36

população de baixa renda acaba não tendo acesso imediato ao serviço de saúde

pública, a atividade antibacteriana do extrato de Açaí descrita neste trabalho tem

grande importância socioeconômica.


EXTRATO DE AÇAÍ

4.5.1. Análise macroscópica da ferida

O procedimento operatório e o tratamento pós-operatório transcorreram

sem complicações. Todos os animais recuperaram-se bem da anestesia,

demonstrando bom estado geral e atividades física e comportamental normais

para a espécie.

Com os animais fixados à mesa cirúrgica foram medidos os tamanhos das

lesões para comparação com a medida inicial padronizada em 1 cm2. Neste

tempo, foi feito o registro fotográfico digital à distância padrão de 35 cm do

animal, conforme figura 19.

Ao exame macroscópico não houve diferença estatística significativa do

tamanho da lesão não cicatrizada entre o grupo de animais tratados com a

aplicação de pomada a base de extrato de açaí 10% (PA) e o grupo controle

(CN), tanto no 8° quanto no 12° dia após a lesão. Entretanto, no oitavo dia pós-

operatório, as feridas dos animais pertencentes ao grupo tratado com a pomada

de extrato do caroço do açaí (PA) e o grupo tratado com a pomada comercial

(PC) referência em cicatrização, apresentaram-se recobertas por uma crosta fina,

nivelada com a pele e sem evidências de inflamação, porém, estas alterações

não foram observadas no mesmo período no grupo controle negativo (CN), cujas

feridas permaneceram hiperêmicas, com bordas edemaciadas e exudato

purulento em alguns animais (Figura 19).

Nesse estudo utilizou-se técnica asséptica para manter as feridas sem

qualquer contaminação, no entanto, verificou-se secreção purulenta em animais

do grupo controle, que era ausente nos animais do grupo tratado com extrato do

caroço do açaí e tratados com a pomada comercial referência. Esse fato pode ser

atribuído a uma possível atividade antimicrobiana da Euterpe oleracea.

37

Figura 19: Evolução macroscópica da área total da lesão acompanhada por medições e fotografias das áreas no 8° e 12° dia após a lesão. Os animais dos grupos PA e PC foram tratados todos os dias com aplicação de pomada local. CN – controle negativo (sem aplicação de pomada); PA – Pomada Açaí (foi aplicada a pomada de extrato do caroço do açaí na concentração de 10%) e PC – Pomada Comercial (foi aplicada uma pomada comercial – referência no tratamento da cicatrização).

4.5.2. Análise microscópica da ferida

Considerando a análise microscópica das amostras das feridas dos grupos

de animais tratados com a pomada a base de extrato do caroço do açaí (PA) e o

grupo controle (CN - sem administração tópica de pomada) observamos uma

diferença na histologia no 12º dia pós-operatório (figura 20). Apesar de não

encontrarmos diferença macroscópica entre os dois grupos (PA x CN), sugere-se

que a pomada de açaí proporcionou uma melhora no processo de cicatrização, já

que no 12º dia observamos uma reepitelização do tecido e presença de fibras

colágenas no grupo tratado com Açaí. Além disso, observa-se a presença

acentuada de células inflamatórias nas lâminas do grupo controle quando

comparado com o grupo PA.

38

O reparo consiste na substituição das células e tecidos alterados

por um tecido neoformado derivado do parênquima e/ou estroma do local

injuriado (GRABB, et al., 1984). Se a reparação for feita principalmente pelos

elementos parenquimatosos, uma reconstrução igual a original pode ocorrer

(regeneração) (CAFFESSE, et al., 1990), mas se for feita em grande parte pelo

estroma, um tecido fibrosado não especializado será formado (cicatriz). A cicatriz

é um tecido fibroso, portanto diferente dos tecidos normais para o reparo dos

quais a cicatriz foi produzida. Sendo apenas um tecido fibroso que tem por

finalidade unir os tecidos lesados não possui as mesmas características que o

tecido normal tem.

Os resultados observados nas figuras 21B e 21D sugerem o efeito

benéfico da pomada à base de extrato de açaí sob o processo de cicatrização,

entretanto, estudo mais abrangentes são necessários para confirmar esses

achados.

Figura 20: Histologia das amostras de pele de ratos coletados 12 dias após provocar os ferimentos excisionais no dorso dos animais. A (Controle negativo aumento 10X), B (Grupo tratado com extrato do caroço do Açaí aumento 20X), C (Controle Negativo aumento 40X) e D (Grupo tratado com extrato do caroço do Açaí aumento 40X).

39

4.5.3. Leucograma

O leucograma é a parte do hemograma que avalia os leucócitos. Estes são

também conhecidos como série branca ou glóbulos brancos. São as células de

defesa responsáveis por combater agentes invasores. Os leucócitos são, na

verdade, um grupo de diferentes células, com diferentes funções no sistema

imune. O neutrófilo é o tipo de leucócito mais comum e representa em média de

45% a 75% dos leucócitos circulantes. Os neutrófilos são especializados no

combate a bactérias. Quando há uma infecção bacteriana, a medula óssea

aumenta a sua produção, fazendo com que sua concentração sanguínea se

eleve.

Na tabela 4 constam os valores do número de neutrófilos de cada grupo

analisado: Pomada Açaí (PA), Pomada Comercial (PC) e Controle Negativo (CN).

Foi verificado que não houve diferença estatística entre os três grupos (ANOVA –

Valor de P=0,741). Os neutrófilos têm um tempo de vida de aproximadamente 24-

48 horas, assim que o processo infeccioso é controlado, e a medula reduz a

produção de novas células, seu nível sanguíneo retorna rapidamente aos valores

basais (BERNARD, 1986).

Tabela 4: Neutrófilo Segmentado nos diferentes grupos analisados após 12 dias de tratamento.

Número de Neutrófilo Segmentado

(média ± desvio padrão) ANOVA (Valor P)

Pomada Açaí 52,33% ± 10,21

Pomada Comercial 54,33% ± 10,11

Controle Negativo 44,66% ± 23,15

0,741

Dados expressos como média ± desvio padrão. Nível de significância fixado P <0.05. Valores de referência do neutrófilo segmentado: 45 a 75% do total de leucócitos.

Os linfócitos são o segundo tipo mais comum de leucócito e representam

de 22 a 40% dos leucócitos no sangue. Eles são as principais linhas de defesa

contra infecções por vírus e contra o surgimento de tumores. São eles também os

responsáveis pela produção dos anticorpos (VERRASTRO, 1996). Considerando

os três grupos analisados PA, PC e CN, referente aos valores dos linfócitos

40

(Tabela 5) também não houve diferença estatística entre os três grupos (ANOVA

– Valor de P=0,156).

Tabela 5: Linfócitos nos diferentes grupos analisados após 12 dias de tratamento.

Número de Linfócitos


Pomada Açaí 31,66% ± 7,76



0,156

Dados expressos como média ± desvio padrão. Os grupos não foram significativamente diferentes, (P <0.05) (Student-Newman-Keuls test). Valores de referência de linfócitos: 22 a 40% do total de leucócitos.

Os monócitos normalmente representam de 3 a 10% dos leucócitos

circulantes. São ativados tanto em processos virais e quanto em bacterianos.

Quando um tecido está sendo invadido por algum organismo estranho o sistema

imune encaminha os monócitos para o local infectado. Este se ativa,

transformando-se em macrófago, uma célula capaz de digerir microorganismos

invasores (WILLIAMS, 1976). Na tabela 6 estão apresentados os números de

monócitos para os três grupos analisados neste estudo (PA, PC e CN) e

novamente não houve diferença estatística significativa entre eles (ANOVA –

Valor de P= 0,819). Os valores de monócitos estão acima do ideal em todos os

grupos, o que pode indicar um processo infeccioso como resultado da injúria nos

grupos PA, PC e CN. Monócitos sanguíneos são quimiotaticamente atraídos para

a ferida, onde, através de complexos processos, se transformam em macrófagos

para combater o processo infeccioso local.

41

Tabela 6: Monócitos nos diferentes grupos analisados após 12 dias de tratamento.

Número de Monócitos


Pomada Açaí 17,66% ± 4,16



0,819

Dados expressos como média ± desvio padrão. Os grupos não foram significativamente diferentes, (P <0.05) (Student-Newman-Keuls test). Valores de referência de monócitos: 3 a 10% do total de leucócitos.

4.5.4. Análise do colágeno

Para avaliar o processo de cicatrização entre os três diferentes grupos

estudados (Controle Negativo - CN, Pomada Açaí - PA e Pomada Comercial - PC)

foi estimada a deposição de colágeno pela quantificação dos níveis de

hidroxiprolina que é um aminoácido exclusivo do colágeno (CATTANEO, et al.,

1991; STRYER, 1992).

O segmento coletado durante o sacrifício dos animais, observando a

retirada cuidadosa da parte onde ocorreu a cicatrização, dos três grupos

analisados foi comparado a uma amostra de tecido normal do dorso do animal,

coletada durante o experimento.

42

Concentração de Hidroxiprolina (ug/mL)

0

1

2

3

4

5

6

7

Normal CN 8° PC 8° PA 8°

OH

pro

lina

(ug

/mL

)

Figura 21: Concentração de hidroxiprolina após 8 dias de tratamento nos diferentes grupos. Normal – Tecido normal (retirado do dorso do animal); CN – controle negativo (sem aplicação de pomada); PA – Pomada Açaí (foi aplicada a pomada de extrato do caroço do açaí na concentração de 10%) e PC – Pomada Comercial (foi aplicada uma pomada comercial – referência no tratamento da cicatrização)

A deposição de colágeno, estimado pela quantificação dos níveis de

hidroxiprolina, nos dias 8 e 12 após a ferida provocada no dorso dos animais,

está expressa nas figuras 21 e 22, respectivamente. No 8º e 12° dia de

tratamento, não houve diferença significativa na concentração de hidroxiprolina

entre os grupos Controle Negativo (CN) e Pomada de Açaí 10% (PA), enquanto

que a Pomada Comercial (PC), como esperado, mostrou diferença significativa

em relação ao grupo CN. Na figura 22, observamos que tanto o grupo tratado

com PA quanto o CN recuperam as concentrações de hidroxiprolina, que não são

diferentes significativamente da pele normal, indicando a presença de colágeno

em concentrações normais 12 após a incisão no dorso dos animais.

43

Concentração de Hidroxiprolina (ug/mL)

0

1

2

3

4

56

7

Normal CN 12° PC 12° PA 12°

OH

pro

lina

(ug

/mL

)

Figura 22: Concentração de hidroxiprolina, como indicador do conteúdo de colágeno nos tecidos em cicatrização, após 12 dias de tratamento Normal – Tecido normal (retirado do dorso do animal); CN – controle negativo (sem aplicação de pomada); PA – Pomada Açaí (foi aplicada a pomada de extrato do caroço do açaí na concentração de 10%) e PC – Pomada Comercial (foi aplicada uma pomada comercial – referência no tratamento da cicatrização)

Nesta análise não foi observado ação cicatrizante da pomada a base de

extrato de açaí. Entretanto, é necessário repetir os experimentos para obter

resultados conclusivos.

4.5.5. Análise do óxido nítrico

O NO é um gás produzido pelo endotélio vascular, que desempenha um

importante papel no processo de reparo tecidual e cicatrização atuando em todos

os seus mecanismos fisiopatológicos (LUO e CHEN, 2005).

Nesse estudo, foi usada a pomada de açaí desenvolvida, a fim de verificar

seu efeito sob a concentração de NO no processo de cicatrização, com o intuito

de provar que os compostos fenólicos presentes no caroço do açaí teriam

habilidade em seqüestrar radicais livres. Na figura 23, após 8° dias de tratamento,

é possível verificar concentrações significativas de NO. A ação da Pomada a base

de extrato de açaí teve a mesma eficiência da pomada comercial, referência em

cicatrização, quando comparado com o grupo controle, pois os níveis de NO

estão equiparados, e mais altos do que no tecido normal (tecido que não foi

44

lesionado), em um período de tratamento de 8 dias (tabela 7). Foi feita a

comparação par a par com Student-Newman-Keuls, e todos os grupos

apresentaram diferença estatística significante (P<0,05).

Tabela 7: Concentração de Óxido Nítrico - NO (ug/mL) com 8 dias de tratamento. Dados expressos como média ± desvio padrão

Concentração de Óxido Nítrico - NO (ug/mL) com 8 dias de tratamento


Normal 5,944 ± 0,065

CN 8º 4,183 ± 0,042

PC 8º 6,225 ± 0,018

PA 8º 6,507 ± 0,050

0,0001

Teste de Student-Newman-Keuls (P <0.05).Todos os grupos foram signficativamente diferentes na

comparação par a par.

Concentração de Oxido Nitrico - NO (ug/mL)

0

2

4

6

8

10

TecidoNormal

CN 8° PC 8° PA 8°

NO

(ug

/mL

)

Figura 23: Concentração de óxido nítrico após 8 dias de tratamento. Normal – Tecido normal (retirado do dorso do animal); CN – controle negativo (sem aplicação de pomada); PA – Pomada Açaí (foi aplicada a pomada de extrato do caroço do açaí na concentração de 10%) e PC – Pomada Comercial (foi aplicada uma pomada comercial – referência no tratamento da cicatrização)

Considerando 12 dias após o tratamento (figura 24), os níveis de NO dos

grupos PA e PC estavam menores quando comparados com o CN e tecido

45

normal. Esse resultado mostra que a ação do açaí, assim como da pomada

comercial, sob os níveis de NO são imediatos no processo de cicatrização

quando comparados com o controle que levou 12 dias para obter níveis normais

de NO.

Concentração de Oxido Nitrico - NO (ug/mL)

0

2

4

6

8

10

TecidoNormal

CN 12° PC 12° PA 12°

NO

(ug

/mL

)

Figura 24: Concentração de óxido nítrico após 12 dias de tratamento. Normal – Tecido normal (retirado do dorso do animal); CN – controle negativo (sem aplicação de pomada); PA – Pomada Açaí (foi aplicada a pomada de extrato do caroço do açaí na concentração de 10%) e PC – Pomada Comercial (foi aplicada uma pomada comercial – referência no tratamento da cicatrização). Comparações estatísticas: Normal e CN (ANOVA – Valor de P = 0,397); Normal e PC, Normal e PA, CN e PC, CN e PA, PC e PA (ANOVA – Valor de P < 0,001).

Diversos estudos experimentais corroboram que tratamentos

farmacológicos que aumentam a biodisponibilidade do NO podem ter efeito

benéfico sobre o processo de cicatrização. Por exemplo, preparações

farmacêuticas de uso tópico que contêm substâncias doadoras de NO melhoram

a cicatrização de ferimentos excisionais, incisionais e os causados por

queimaduras em ratos e camundongos normais e diabéticos (WITTE e BARBUL,

2002; AMADEU et al., 2007; ZHU et al., 2008). Demonstrou-se ainda que

fármacos tópicos com ação anti-oxidante, como os derivados do curcumino,

aceleram a cicatrização através da redução na produção de radicais livre de

oxigênio e aumento da síntese de colágeno tipo III na ferida (PANCHATCHARAM

46

et al., 2006). Além disto, a terapia gênica com NO sintase e com superóxido

dismutase acelera o processo de cicatrização de camundongos com diabetes

melitus tipo I (LUO et al, 2004).

O processo de cicatrização é prejudicado pelo aumento do estresse

oxidativo e como hoje há um grande interesse no estudo de compostos fenólicos,

devido principalmente à habilidade antioxidante destas substâncias em

sequestrar radicais livres, os quais são prejudiciais a saúde humana (DORMAN et

al., 2003), comprovar a eficiência da pomada de açaí sobre o processo de

cicatrização é fundamental. Estudos mais abrangentes são necessários para

confirmar e explicar o mecanismo de ação do açaí sob os níveis de NO.

47

5. CONCLUSÃO

Com os nossos resultados preliminares foi possível concluir que: (i) é

possível desenvolver uma formulação tópica (pomada) estável incorporada com

extrato de açaí até na concentração de 10%; (ii) que a embalagem influência nas

condições de estabilidade do produto, como mostrado com a oxidação da

pomada em embalagens não próprias; (iii) que o extrato do caroço do açaí possui

concentrações significativas de polifenóis e poder antimicrobiano devido a

inibição do crescimento de bactérias Staphylococcus aureus na concentração de

5mg/ml; e (iv) que a pomada a base de extrato de açaí pode ter algum efeito

cicatrizante devido aos resultados preliminares obtidos no modelo in vivo durante

a análise microscópica e das concentrações de NO. Entretanto, estudos mais

abrangentes são necessários para avaliar o real poder cicatrizante da pomada a

base de extrato de açaí.

48

6. REFERÊNCIAS

1. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA) – Manual de

Microbiologia Clínica para Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Disponivel em: <www.anvisa.gov.br>. Acesso em: 8 fev. 2012.

2. ALVES T.M.A., SILVA A.F., BRANDÃO M., GRANDI T.S.M., SMÂNIA E.F.,

SMÂNIA Jr.A., ZANI C.L., Biological screening of Brazilian medicinal plants. Mem. Inst. Oswaldo Cruz n.95, p.367-373, 2000.

3. AMADEU, T.P., et al., S-nitrosoglutathione-containing hydrogel accelerates rat

cutaneous wound repair. J Eur Acad Dermatol Venereol,. v. 21,n. 5, p.629-637, 2007.

4. ANSEL, H. C., ALLEN Jr, L. V., POPOVICH, N. G.; Formas Farmacêuticas e Sistemas de Liberação de Fármacos. 8. Ed. Porto Alegre: Editora Artmed, 2007.

5. ARBUTHNOTT, J. P.; Staphylococcal toxins in human disease. J. of Appl. Bacteriol. Symposium Suplement, p. 101-107, 1990.

6. BALBINO, C. A., PEREIRA, L. M., CURI, R.; Mechanisms involved in wound healing: a review. Brasil J. of Pharmaceutic Science. v. 41, n. 1, p. 27-51, 2005.

7. BALDEZ, R. N., MALAFAIA, O., CZESCKO, N. G., MARTINS, N. L. P., FERREIRA L. M. , RIBAS C. A. P. M., SALLES JR. G., DEL CLARO R. P., SANTOS L. O. M., GRAÇA NETO L., ARAÚJO L. R. R.; Análise da cicatrização do colon com uso do extrato aquoso da Orbignya phalerata (babaçu) em ratos. Acta Cir Brasil, v. 21, n. 2, p. 31-38, 2006.

8. BAQUERO F., BLÁZQUEZ J.; Evolution of antibiotic resistance. Tree v. 12, p.

482-487, 1997. 9. BERG R. A.; Determination of 3- and 4-hydroxyproline. Methods Enzymol; v.

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