estrés por inundación en leguminosas del género lotus · declaro que el material incluido en...

Estrés por inundación en leguminosas del género Lotus:

estudios morfológicos, anatómicos, fisiológicos, moleculares y

de su relación simbiótica con rizobios

Tesis para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires,

Área Ciencias Agropecuarias

Cristian Javier Antonelli

Ingeniero Agrónomo - Universidad Nacional de La Plata - 2010

Lugar de trabajo:

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de Chascomús

CONICET / Universidad Nacional de General San Martín

Escuela para Graduados Ing. Agr. Alberto Soriano

Facultad de Agronomía – Universidad de Buenos Aires

COMITÉ CONSEJERO

Director de tesis

Oscar Adolfo Ruiz

Bioquímico (Universidad Nacional del Nordeste)

Doctor (Universidad de Buenos Aires)

Consejero de estudios

Gustavo Gabriel Striker

Ingeniero Agrónomo (Universidad de Buenos Aires)

Doctor (Universidad de Buenos Aires)

JURADO DE TESIS

JURADO

Orlando Mario Aguilar

Licenciado en Biología (Universidad Nacional de La Plata)

Doctor (Universidad Nacional de La Plata)

JURADO

Carlos Guillermo Bartoli

Licenciado en Biología (Universidad Nacional de La Plata)

Doctor (Universidad Nacional de La Plata)

JURADO

Edith Liliana Taleisnik

Bióloga (Universidad Nacional de Córdoba)

Doctora (Ben Gurion University of the Negev, Israel)

JURADO

Marina Omacini

Licenciada en Ciencias Biológicas (Universidad CAECE)

Doctora (Universidad de Buenos Aires)

Fecha de defensa de la tesis: 13 de marzo de 2017

iii

Agradecimientos

A mi director Oscar Ruiz, que me brindó su apoyo a lo largo de todo el doctorado y que

además siempre trató que yo encontrara lo mejor de mí para cumplir con los objetivos.

A todos los compañeros de la Unidad de Biotecnología N° 1 del IIB-INTECH en

Chascomús, y en especial a aquellos que más cerca estuvieron en discusiones y

colaboraciones a lo largo de mi trabajo de la tesis: Francisco Escaray, Pablo Calzadilla,

María Paula Campestre, María Florencia Babuin, César Bordenave, Ana Perea García,

Santiago Maiale, Rubén Rocco; y también a Matías Bailleres de la Chacra Experimental

Integrada de Chascomús (CEICH-MAIBA-INTA).

A todos los demás integrantes del INTECH que en mayor o menor grado participaron

en mi tarea de alcanzar el grado de doctor, en especial a María Marina por ayudarme en

la revisión del manuscrito, a Julia Estrella por ayudarme con los ensayos con rizobios y

a Patricia Uchiya por la ayuda en varios experimentos.

A Gustavo Striker por su tarea como consejero de estudios en la Escuela para

Graduados “Ing. Agr. Alberto Soriano” de la FAUBA.

A la Comisión de Investigaciones Científicas de Buenos Aires (CIC) y al Consejo Nacional

de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por el financiamiento de las becas de

doctorado.

Por último, y no por ello menos importante, a toda mi familia, principalmente a mis

padres que me apoyaron en todo momento, aunque mi padre en la última etapa del

doctorado no lo haya podido hacer “terrenalmente”, siempre sentí su apoyo.

iv

Declaración

Declaro que el material incluido en esta tesis es, a mi mejor saber y entender, original

producto de mi propio trabajo (salvo en la medida en que se identifique explícitamente

las contribuciones de otros), y que este material no lo he presentado, en forma parcial o

total, como una tesis en ésta u otra institución.

Ing. Agr. Cristian Javier Antonelli

v

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ VIII

ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... IX

ABREVIATURAS ........................................................................................................... X

RESUMEN ...................................................................................................................... XI

ABSTRACT .................................................................................................................. XII

1. CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................ 1

1.1. IMPORTANCIA MUNDIAL Y REGIONAL DE LAS INUNDACIONES ................................. 2

1.2. CONSECUENCIAS DEL ANEGAMIENTO DE LOS SUELOS ............................................. 4

1.3. LEGUMINOSAS FRENTE AL ANEGAMIENTO DEL SUELO: IMPORTANCIA DEL GÉNERO

LOTUS ............................................................................................................................. 5

1.4. ACLARACIÓN DE TÉRMINOS Y OBJETIVO GENERAL .................................................. 7

2. CAPÍTULO 2. EFECTOS DE LA INUNDACIÓN (SUMERSIÓN PARCIAL) EN

ESPECIES DEL GÉNERO LOTUS ................................................................................. 9

2.1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 10

2.2. HIPÓTESIS ............................................................................................................. 11

2.3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 11

2.3.1. Sumersión parcial sobre plantas adultas de Lotus spp. ................................ 11

2.3.1.1. Material vegetal ...................................................................................... 11

2.3.1.2. Sistema de cultivo y tratamientos .......................................................... 11

2.3.1.3. Cosecha y determinación de parámetros de crecimiento ....................... 12

2.3.1.4. Determinación del intercambio neto de gases ........................................ 13

2.3.1.5. Determinación de parámetros de la eficiencia del fotosistema II .......... 13

2.3.1.6. Estimación de estabilidad de membranas mediante la técnica de pérdida

de electrolitos ...................................................................................................... 14

2.3.1.7. Determinación de aerénquima................................................................ 14

2.3.1.8. Diseño experimental y análisis de datos ................................................ 14

2.3.2. Germinación de Lotus spp. en inundación .................................................... 17

2.3.2.1. Material vegetal ...................................................................................... 17

2.3.2.2. Sistema de cultivo y tratamientos .......................................................... 17

2.3.2.3. Determinación de germinación .............................................................. 17

2.3.2.4. Diseño experimental y análisis de datos ................................................ 17

2.4. RESULTADOS ......................................................................................................... 17

2.4.1. Incidencia de la sumersión parcial y de un período de recuperación en la

acumulación de biomasa ......................................................................................... 17

2.4.2. Efecto de la sumersión parcial sobre el intercambio de gases, fotosistema II

y pérdida de electrolitos .......................................................................................... 22

2.4.3. Efecto de la sumersión parcial en la formación de aerénquima y en el

diámetro de la base de los tallos ............................................................................. 24

2.4.4. Germinación de Lotus spp. en inundación .................................................... 25

2.5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 26

2.5.1. Efecto de la inundación sobre la producción de biomasa y variables

asociadas ................................................................................................................. 26

vi

2.5.2. Efecto de la inundación sobre la fijación de CO2, el estado del PSII y la

estabilidad de membrana ........................................................................................ 29

2.5.3. Generación de aerénquima en inundación ................................................... 30

2.5.4. Período de recuperación ............................................................................... 31

2.5.5. Efecto de la inundación sobre la germinación ............................................. 32

2.6. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 33

3. CAPÍTULO 3. EFECTOS DEL ESTRÉS MIXTO DE INUNDACIÓN Y

SALINIDAD EN LOTUS SPP. ....................................................................................... 34

3.1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 35

3.1.1. La salinidad y las plantas ............................................................................. 35

3.1.2. Salinidad e inundación .................................................................................. 36

3.1.3. Lotus spp. para ambientes salinos con inundaciones frecuentes .................. 37

3.2. HIPÓTESIS ............................................................................................................. 38


3.3.1. Material vegetal ............................................................................................ 38

3.3.2. Sistema de cultivo y tratamientos .................................................................. 38

3.3.3. Cosecha de biomasa ...................................................................................... 39

3.3.4. Determinación del intercambio neto de gases .............................................. 40

3.3.5. Determinación de parámetros de la eficiencia del fotosistema II ................ 40

3.3.6. Determinación de la concentración de iones ................................................ 40

3.3.7. Expresión relativa de genes de compartimentalización subcelular de los

iones Cl– y Na+ ........................................................................................................ 41

3.3.8. Diseño experimental y análisis de datos ....................................................... 42

3.4. RESULTADOS ......................................................................................................... 43

3.4.1. Efecto del estrés mixto de inundación y salinidad sobre la acumulación de

biomasa y sus componentes .................................................................................... 43

3.4.2. Efecto del estrés mixto de inundación y salinidad sobre la concentración de

iones en las diferentes fracciones de la biomasa .................................................... 46

3.4.3. Efecto del estrés mixto de inundación y salinidad sobre la expresión relativa

de genes vinculados a la compartimentalización subcelular de iones Na+ y Cl– ... 50

3.4.4. Efecto del estrés mixto de inundación y salinidad sobre la fotosíntesis neta y

parámetros del fotosistema II ................................................................................. 51

3.5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 52


biomasa y fotosíntesis neta ..................................................................................... 52


iones en la biomasa de las plantas .......................................................................... 54

3.5.3. Regulación de genes vinculados a la compartimentalización subcelular de

iones Na+ y Cl– ........................................................................................................ 56

3.6. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 58

4. CAPÍTULO 4. EFECTOS DE LA INUNDACIÓN SOBRE LA FIJACIÓN

BIOLÓGICA DE NITRÓGENO ATMOSFÉRICO DE LA SIMBIOSIS

MUTUALISTA ENTRE LOTUS SPP. - MESORHIZOBIUM LOTI ............................. 59

4.1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 60

4.2. HIPÓTESIS ............................................................................................................. 61


4.3.1. Material vegetal ............................................................................................ 61

4.3.2. Sistema de cultivo y tratamientos .................................................................. 61

vii

4.3.3. Evaluación de biomasa ................................................................................. 62

4.3.4. Determinación de nitrógeno ......................................................................... 62

4.3.5. Determinación de parámetros de la eficiencia del fotosistema II ................ 63

4.3.6. Expresión relativa de genes .......................................................................... 63

4.3.7. Diseño experimental y análisis de datos ....................................................... 64

4.4. RESULTADOS ......................................................................................................... 64

4.4.1. Parámetros de crecimiento y formación de nódulos..................................... 64

4.4.2. Concentración de nitrógeno en la planta ..................................................... 66

4.4.3. Expresión relativa de genes vinculados a la FBN y a la hipoxia en raíces .. 67

4.4.4. Parámetros de la eficiencia del fotosistema II .............................................. 68

4.5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 69

4.6. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 71

5. CAPÍTULO 5. CONSIDERACIONES FINALES ..................................................... 72

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 79

7. ANEXO ....................................................................................................................... 91

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

F

Figura 1.1. Inundaciones a nivel mundial en las últimas 6 décadas. ............................... 2

Figura 1.2. Región pampeana argentina........................................................................... 3

Figura 1.3. Densidad (carga) bovina en Argentina mostrada por partido o departamento

....................................................................................................................................... 4

Figura 2.1. Esquema del diseño y los momentos de cosecha del experimento para una

accesión dada. ............................................................................................................. 16

Figura 2.2. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inundado) sobre plantas adultas de

5 accesiones de Lotus spp. .......................................................................................... 19

Figura 2.3. Efecto de 54 días de sumersión parcial (Inundado) sobre el intercambio de

gases de plantas adultas de 5 accesiones de Lotus spp. .............................................. 23

Figura 2.4. Índice de performance (PIabs) de plantas de Lotus spp. de 5 meses de edad

..................................................................................................................................... 23

Figura 2.5. Integridad de membranas............................................................................. 24

Figura 2.6. Formación de tejido aerenquimático en secciones transversales de raíces y

diámetro de tallos primarios de plantas de Lotus spp. de 5 meses de edad................. 25

Figura 2.7. Efecto de la inundación (5cm) sobre la germinación de 5 accesiones de

Lotus spp. .................................................................................................................... 26

Figura 3.1. Biomasa seca (en g de MS) de plantas de 4 accesiones del género Lotus

sometidas a 21 días de tratamientos de sumersión parcial (Inund), salinidad (NaCl),

mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) y condición control (Cont). ..................... 44

Figura 3.2. Estado fenotípico de las plantas de 4 accesiones del género Lotus en el día 8

desde que se completaron los tratamientos de aclimatación salina............................. 45

Figura 3.3. Concentración de iones Na+ y Cl– en hojas apicales y basales (en μmol por

g de MS) de las plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de

tratamientos de salinidad (NaCl) y mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) .......... 47

Figura 3.4. Concentración de K+ (en μmol por g de MS) y relación molar K+/Na+ en

hojas de plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de tratamientos de

sumersión parcial (Inund), salinidad (NaCl), mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) y

condición control (Cont). ................................................................................................ 49

Figura 3.5. Efecto de 21 días de tratamiento mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund)

sobre 3 accesiones del género Lotus. .......................................................................... 50

Figura 3.6. Expresión relativa de los genes CLC-f (A) y LtNHX (B) en plantas de 4

accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de tratamiento mixto salinidad-

inundación (NaCl-Inund) y condición control (Cont). ................................................ 50

Figura 3.7. Respuestas fisiológicas de plantas de 4 accesiones del género Lotus

sometidas a 21 días de tratamientos de sumersión parcial (Inund), salinidad (NaCl),

mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) y condición control (Cont). ..................... 52

Figura 4.1. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre la biomasa de

plantas de Lotus japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con Mesorhizobium loti.

..................................................................................................................................... 65

Figura 4.2. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre los nódulos de

plantas de Lotus japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con Mesorhizobium loti.

..................................................................................................................................... 66

Figura 4.3. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre la FBN en

plantas de L. japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con M. loti. ....................... 67

ix

Figura 4.4. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre la expresión

relativa de genes vinculados a la FBN y al metabolismo fermentativo en plantas de L.

japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con M. loti. ............................................. 68

Figura 4.5. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre dos parámetros

de la eficiencia del fotosistema II en plantas de L. japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en

simbiosis con M. loti. .................................................................................................. 69

ÍNDICE DE TABLAS

T

Tabla 2.1. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) y de 35 días de recuperación

sobre la biomasa total (g de materia seca/planta) y la formación de raíces adventicias

en plantas adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. .............................................. 20

Tabla 2.2. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) y de 35 días de recuperación

sobre las relaciones de biomasa en peso seco (Vástago/Raíz y Hoja/Tallo) de plantas

adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. ............................................................... 21

Tabla 2.3. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) y 35 días de recuperación

sobre las tasas de crecimiento relativo en peso seco (TCR, g g-1 día-1) de la biomasa

aérea (vástago) y total de plantas adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. .......... 22

Tabla 3.1. Lista de cebadores utilizados ........................................................................ 42

Tabla 4.1. Lista de cebadores utilizados ........................................................................ 63

x

ABREVIATURAS

- ADH = alcohol deshidrogenasa

- CLC = familia de canales subcelulares de cloruros

- DE = desvío estándar

- FBN = fijación biológica del nitrógeno

- MS = materia seca

- NHX = familia de intercambiadores subcelulares Na+/H+

- PCR = reacción en cadena de la polimerasa

- PDC = piruvato descarboxilasa

xi

RESUMEN

Estrés por inundación en leguminosas del género Lotus: estudios morfológicos,

anatómicos, fisiológicos, moleculares y de su relación simbiótica con rizobios

Una importante proporción de los suelos de la Pampa Deprimida (PD) se encuentran

afectados por condiciones salinas y/o alcalinas. A su vez, la ocurrencia de inundaciones

periódicas provoca el anegamiento de suelos. La combinación de condiciones

estresantes para las plantas limita la aptitud agrícola de la PD. Si bien algunas

leguminosas forrajeras del género Lotus son capaces de prosperar en la PD, la obtención

de cultivares mejorados incrementaría la oferta forrajera. Con este objetivo, se investigó

la respuesta de diferentes materiales de Lotus sometidos a estrés por anegamiento, así

como a la combinación entre anegamiento y salinidad. Las accesiones más tolerantes

durante el anegamiento, y además las que mejor respondieron luego de un período de

recuperación, fueron L. tenuis (Lt) y un híbrido interespecífico L. tenuis x L.

corniculatus (LtxLc). Se determinó una clara asociación entre la tolerancia al

anegamiento y la capacidad de formar aerénquima. Por su parte, bajo las condiciones de

estrés mixto de inundación y salinidad, se observó una mejor respuesta del material

LtxLc, evidenciada entre otras características, por una mayor acumulación de biomasa

en comparación a las otras accesiones. Destacablemente, el anegamiento morigeró los

efectos del estrés salino, tanto para LtxLc como en su parental L. corniculatus diploide

de origen español, encontrándose una conexión con la inducción en la expresión relativa

de genes que codifican para transportadores de membranas intracelulares vinculados a

la compartimentalización subcelular de los iones Na+ y Cl–. Por último se evaluó el

efecto del estrés por inundación sobre la FBN en dos especies de Lotus (Lt y L.

japonicus, Lj) contrastantes en su tolerancia a la inundación. Se determinó que la FBN

resultó más afectada en Lj debido a una menor cantidad y tamaño de nódulos y a una

menor eficiencia de los mismos. Los resultados obtenidos en la tesis, podrían utilizarse

como criterios para la obtención de nuevos cultivares tolerantes al estrés por

anegamiento y mixto entre anegamiento y salinidad.

Palabras clave: Lotus spp., anegamiento, tolerancia, hibridación interespecífica,

aerénquima, salinidad, canal de Cl–, intercambiador Na+/H+, fijación biológica de

nitrógeno.

xii

ABSTRACT

Flooding stress in legumes of the Lotus genus: morphological, anatomical,

physiological and molecular studies, and their symbiotic relationship with rhizobia

An important proportion of the Flooding Pampa soils (FP) are affected by saline and/or

alkaline conditions. Moreover, flooding periods usually cause waterlogging in the

region. These combined stress conditions reduce FP agronomic aptitude, being cattle

production based on natural grasslands (with legumes deficiency) the main activity.

Although forage legumes of the Lotus genus are able to growth in the FP, obtaining

tolerant cultivars would increase the forage availability. With this aim, the flooding and

combined saline-flooding stress response was evaluated in different Lotus spp.

accessions. The most tolerant accessions during the flooding period, and after a

recovery period, were L. tenuis (Lt) and an interspecific hybrid L. tenuis x L.

corniculatus (LtxLc). A positive relationship between waterlogging tolerance and

aerenchyma formation, relative growth rates and biomass production was observed for

all the accessions evaluated. Meanwhile, LtxLc presented the best response to the

combined stress conditions when compared with the others Lotus spp. Interestingly,

waterlogging reduced saline stress effects in LtxLc and its parental L. corniculatus

(LcD), and a positive connection was found with the induction of relative expression of

genes coding for intracellular membrane transporters linked to subcellular

compartmentalization of Na+ and Cl– ions. Lastly, the flooding effect on symbiotic

nitrogen fixation (SNF) was evaluated between two Lotus spp. (Lt and L. japonicus, Lj)

contrasting in their tolerance response. The SNF was more affected in Lj due to a lower

nodule development and a lower efficiency of them. Our results could be used as

breeding criteria for new tolerant cultivars to waterlogging and combined salinity and

waterlogging stresses.

Key words: Lotus spp., waterlogging, stress tolerance, interspecific hybridization,

aerenchyma, salinity, Cl– channel, exchanger Na+/H+, symbiotic nitrogen fixation.

1

1. CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN GENERAL

2

1.1. Importancia mundial y regional de las inundaciones

Los períodos de inundación constituyen una perturbación natural de importancia

creciente que afecta el rendimiento de cultivos y la producción de forraje en muchas

regiones del mundo (Rosenzweig et al., 2002). Actualmente se estiman grandes áreas

con problemas de anegamiento e inundaciones (>1700 Mha), y se predice un

incremento de las mismas para las próximas décadas debido al cambio climático global

(Arnell y Liu, 2001; Hirabayashi et al., 2013).

Figura 1.1. Inundaciones a nivel mundial en las últimas 6 décadas. Las barras representan el

número de inundaciones por cada década, clasificadas como “desastre” en la Base de Datos

Internacional de la Universidad de Lovaina (Bélgica). Se muestra el período que comprende

desde 1950 a 2009 por continentes. (Adaptado de Bailey-Serres et al., 2012).

La situación en la Pampa Deprimida de la provincia de Buenos Aires, se ve agravada

por ser una llanura totalmente plana o con pendiente muy reducida (menor a 0,1 %), por

lo tanto el escurrimiento es muy limitado. A dicha condición se suma la existencia de

horizontes del suelo muy arcillosos que condicionan una rápida infiltración del agua.

Por todo ello, en la Pampa Deprimida las inundaciones significan un disturbio natural

de ocurrencia casi anual (Figura 1.2). Dichas inundaciones ocurren en los puntos

topográficos más bajos, los cuales abarcan gran parte de toda la región, y suceden

generalmente a comienzos de cada primavera (Paruelo y Sala, 1990). La totalidad de la

región abarca un área muy significativa de la provincia de Buenos Aires y cuenta con

una superficie de aproximadamente 10,5 millones de ha (Burkart et al., 2005).

3

Figura 1.2. Región pampeana argentina. A: esquema de las subregiones de la región pampeana

argentina. (A): Pampa Ondulada; (B): Pampa Interior; (C): Pampa Austral y (D): Pampa

Deprimida. B: imagen que muestra en diferentes colores, las comunidades potenciales de

pastizales distribuidas según las características geomorfológicas. En azul las zonas inundables

de praderas húmedas de mesófitas y de hidrófilas, en rojo estepas de halófitas y en verde

praderas de mesófitas. (Adaptado de Burkart et al., 2005).

Por otra parte, además de los problemas de anegamiento antes mencionados en esta

región, se encuentran frecuentemente rasgos de salinización y/o alcalinidad con alta

sodicidad. En este sentido, alrededor de un 80 % de toda la superficie de la Pampa

Deprimida cuenta con al menos una de las limitantes mencionadas (León et al., 1979;

Soriano, 1991; Maiola et al., 2003). Por todo lo expuesto es que dichos suelos presentan

una escasa aptitud agrícola que obliga a la mayoría de los productores a dedicarlos a la

ganadería de cría utilizando pastizales naturales como principal recurso forrajero

(Montes, 1988; Soriano, 1991). De hecho esta región es considerada la zona de

ganadería de cría más importante del país (Rearte, 1997), siendo la región con mayor

número de ganado bovino, así como con los valores más altos de densidad (carga)

bovina del país (Figura 1.3). Por otra parte, en las últimas décadas, el avance de la

agricultura hacia zonas de suelos más restrictivos, ha restado superficie a la práctica

ganadera, incrementando la carga animal y la presión de pastoreo sobre los pastizales

naturales. Como resultado se ha llegado en la actualidad a sistemas de producción

sensiblemente más intensivos (Rearte, 2004, Manuel-Navarrete et al., 2007).

A B

4

Figura 1.3. Densidad (carga) bovina en Argentina mostrada por partido o departamento.

(Fuente: SENASA, 2015).

Este tipo de ambientes restrictivos para la agricultura, que es por naturaleza escaso en

leguminosas originarias (Vervoorst 1967, León et al. 1979), también es limitante para el

establecimiento y persistencia de forrajeras leguminosas tradicionales como la alfalfa y

el trébol blanco. Los intentos por implantarlas en esta región han sido muy poco

exitosos (Mazzanti et al., 1988; León et al., 2007). Cabe mencionar, que la

incorporación de leguminosas forrajeras a los sistemas ganaderos mejora la

sustentabilidad y producción de estos ya que, incorporadas a las pasturas, incrementan

el aporte de proteína y la digestibilidad del forraje en comparación con pasturas basadas

únicamente en gramíneas (Buxton, 1996).

1.2. Consecuencias del anegamiento de los suelos

Poco después de que se produce el anegamiento del suelo, la actividad de las raíces y de

los microorganismos derivan en un rápido agotamiento de la disponibilidad de oxígeno

(Ponnamperuma, 1984). Mientras permanece el anegamiento, el oxígeno no es

reincorporado al suelo, debido a su baja solubilidad en agua (0,28 mol m-3 a 20 °C) y a

la baja capacidad de difusión de este gas a través de los poros saturados de agua

(calculándose dicha difusión alrededor de 320.000 veces menor que a través de dichos

poros con presencia exclusivamente de gas) (Armstrong y Drew, 2002). La tasa de

consumo de oxígeno depende no solo de la actividad microbiana y de las raíces, sino de

la temperatura y del contenido de carbono del suelo. Además del efecto en la

5

disminución de la concentración de oxígeno, el anegamiento puede provocar a largo

plazo la acumulación de otros compuestos que influyen en el crecimiento de las plantas,

tales como dióxido de carbono, etileno y productos orgánicos del metabolismo

anaeróbico (etanol y ácidos orgánicos). Por otro lado, los organismos anaerobios, con

actividad creciente en estos suelos con baja oxigenación, pueden generar una reducción

en los niveles de NO3–, Mn4+, Fe3+ y SO4

2– y acumular sus formas reducidas (Mn2+,

Fe2+, H2S y S2–) causantes de fitotoxicidad (Ponnamperuma, 1984; Greenway et al.,

2006).

Un suelo anegado con sus características, tiene consecuencias sobre las plantas que se

encuentren sobre éste. En este sentido, el ambiente hipóxico o anóxico, provoca una

secuencia de cambios en las plantas relacionados con su supervivencia que incluyen

alteraciones de los procesos fisiológicos, así como ajustes anatómicos y morfológicos

(Armstrong, 1979; Koslowski y Pallardy, 1984; Voesenek y Blom, 1989). A nivel

fisiológico, el cierre de estomas, con o sin deshidratación de la hoja, la reducción de la

transpiración y la inhibición de la fotosíntesis, son respuestas comunes que pueden

ocurrir en horas o días, dependiendo de la tolerancia a la inundación de cada especie.

Cuando la inundación es intensa, las plantas de especies sensibles reducen

drásticamente su actividad fisiológica y frecuentemente mueren en poco tiempo (Else et

al., 1996). Por el contrario, se han descrito especies tolerantes que frente a un evento de

anegamiento, no modifican algunos parámetros como la conductancia estomática, el

potencial hídrico y la fotosíntesis (Naidoo y Naidoo, 1992; Insausti et al., 2001). A

nivel anatómico, la generación de tejido aerenquimático, o simplemente denominado

aerénquima, es la respuesta más frecuentemente observada frente a esta situación de

estrés (Justin y Armstrong, 1987). Dicho tejido constituye un sistema de lagunas o

espacios de aire interconectados el cual provee un camino de resistencia más baja al

oxígeno, facilitando su transporte desde los vástagos a las raíces, permitiendo su

crecimiento y la exploración del suelo en esas condiciones (Armstrong, 1979; Colmer y

Greenway, 2005). Además, entre las respuestas comunes a la inundación también se

incluye un incremento en la altura de la planta y consecuentemente, en la proporción de

biomasa sobre el nivel del agua (Naidoo y Mundree, 1993; Grimoldi et al., 1999). Esto

también contribuye a la oxigenación de los tejidos sumergidos, por medio del tejido

aerenquimático (Laan et al., 1990).

En anegamientos transitorios, los efectos adversos sobre las plantas pueden ocurrir

durante el propio evento así como también después que retrocede el agua, sobre todo si

las raíces remanentes son superficiales y se seca el horizonte superficial del suelo

(Barrett-Lennard, 2003).

1.3. Leguminosas frente al anegamiento del suelo: importancia del género Lotus

Las leguminosas asociadas a rizobios, presentan la capacidad de fijar el nitrógeno

atmosférico mediante la denominada fijación biológica de nitrógeno (FBN), la cual

constituye uno de los mecanismos más eficientes y menos contaminantes para la

nutrición vegetal. La FBN les otorga a las leguminosas una ventaja para la adaptación a

ecosistemas marginales en los cuales actúan como “especies pioneras” durante la

colonización. La infección de los rizobios en las raíces de leguminosas, produce una

formación de nuevos órganos, que se denominan nódulos (Hirsch et al., 2001). En las

leguminosas terrestres, el sistema de raíces noduladas que permite la FBN, parece ser

muy sensible a la condición de anegamiento del suelo, ya que se ha encontrado que la

6

misma se reduce fuertemente por dicha condición ambiental (Bacanamwo y Purcell,

1999; Shimamura et al., 2002; Loureiro et al., 2010; Sánchez et al., 2011).

Por otro lado, las especies del género Lotus presentan gran adaptabilidad a diversos

ecosistemas, entre otros, aquellos sujetos a períodos de inundación. Este género, nativo

de la cuenca del Mediterráneo, se encuentra ampliamente distribuido alrededor del

mundo, con especies adaptadas a las más diversas condiciones ambientales y del suelo,

condiciones donde otras leguminosas forrajeras más tradicionales generalmente no

prosperan, por lo que representan una alternativa para incrementar la productividad

primaria y la calidad forrajera de los pastizales naturales (Blumenthal y McGraw, 1999;

Striker et al., 2005; Escaray et al., 2012).

Lotus corniculatus L. y L. tenuis Waldst. et Kit. son leguminosas perennes estivales

frecuentemente utilizadas para incrementar la producción de pasturas en suelos pobres y

en pastizales naturales (Dear et al., 2003). L. tenuis se ha naturalizado en la región de la

Pampa Deprimida, la cual como ha sido mencionado anteriormente, sufre periódicos

eventos de inundación (Soriano, 1991). Esta leguminosa le debe su éxito de

implantación en dichas condiciones, en parte a su capacidad para alterar fácilmente su

hábito de crecimiento. Así, en respuesta a muy diversas situaciones ambientales que

condicionan su desarrollo, presenta fenotipos con crecimiento postrado bajo condición

de pastoreo, y con crecimiento erecto, cambiando sus vástagos a una posición

ortotrópica, bajo condiciones de inundación (Striker et al., 2008) o bajo condiciones de

canopia cerrada (Striker et al., 2011). La capacidad de esta especie para cambiar su

morfología de acuerdo al ambiente en el que se encuentra, le otorga mejores

oportunidades de prosperar bajo diversas condiciones de crecimiento (Sultan, 2000).

Ambas especies difieren agronómicamente ya que ocupan dos hábitats distintos; L.

tenuis se adapta a los bajos inundables, mientras que L. corniculatus, si bien es

considerada una especie de mayor valor agronómico debido a su mayor producción de

forraje y a un nivel óptimo de taninos condensados (Hagerman y Butler, 1981), solo

logra implantarse en zonas de mejores condiciones edáficas y no tolera las condiciones

marginales en forma similar a L. tenuis (Vignolio et al., 2002; Lagler, 2003; Striker et

al., 2005). Con respecto a los taninos condensados, estos son de gran importancia en

concentraciones adecuadas en el forraje. Se sabe que niveles de hasta 45 mg g-1 de MS

otorgan beneficios a la dieta de los rumiantes, tales como evitar el meteorismo o

empaste, mejorar el aprovechamiento de la fracción proteica de la dieta, efectos contra

parásitos intestinales y disminución de fermentación entérica con la consecuente

reducción de emisión de gases del efecto invernadero (principalmente metano) (Min et

al., 2003). Por estos beneficios, radica la importancia de obtener materiales forrajeros

con niveles adecuados de taninos condensados que sean aptos para establecerse en la

extensa superficie con ambientes inundables de la Pampa Deprimida.

Por otra parte, se ha descrito que L. tenuis realiza una eficiente utilización de fósforo

(Mendoza, 2001; Kade et al., 2003; Sannazzaro et al., 2004), establece asociaciones

simbióticas con rizobios y micorrizas aún bajo condiciones de inundación (Mendoza et

al., 2005) y tiene una buena calidad nutricional, incluso cuando está creciendo bajo

estrés salino (Robinson et al., 2004).

Tradicionalmente, a las especies de Lotus cultivadas como forrajeras se las ha definido

como especies alógamas obligadas, lo que resulta en un alto grado de heterocigosis

dentro de las poblaciones (Fernandes, 1981; Kramina, 1999). En este sentido, la

variabilidad inter- e intra-específica en el género Lotus, hace que sea un género

auspicioso de explorar con objetivos de mejoramiento genético de posibles nuevas

variedades. Es menester destacar que L. tenuis constituye una especie diploide

(2n=2x=12) mientras que las poblaciones comerciales de L. corniculatus en América

7

del Sur se han descrito como tetraploides (2n=4x=24). La diferencia en el nivel de

ploidía genera dificultad para lograr cruzamientos exitosos y obtener híbridos

interespecíficos fértiles. Sin embargo, nuestro grupo de trabajo, ha sumado una nueva

población diploide europea identificada como L. corniculatus subsp. corniculatus la

cual es nativa del Parque Natural de la Albufera de Valencia (España), donde existen

zonas que comparten características edáficas marginales similares a los suelos de la

Pampa Deprimida. En estas zonas, denominadas “malladas”, se encuentran especies

adaptadas a condiciones de anegamiento, deficiencia de nutrientes, salinidad y

alcalinidad. Debido a sus particulares características, en nuestro laboratorio hemos

utilizado la misma como parental para la obtención de un híbrido interespecífico: L.

tenuis x L. corniculatus. El otro parental usado fue una población de L. tenuis argentina

(Escaray et al., 2014). El material híbrido obtenido, es altamente fértil y posee

características de ambos parentales. Por ejemplo, la población diploide de L.

corniculatus presenta niveles altos de taninos condensados foliares y rizomas (los

rizomas son importantes en la persistencia de las plantas en las pasturas), y las dos

características han sido encontradas en la F1 híbrida. En cuanto a los contenidos de

taninos foliares la descendencia presenta valores intermedios entre los parentales,

siendo estos últimos valores potencialmente óptimos para la alimentación bovina

(Escaray et al., 2014).

Este híbrido interespecífico, aún no ha sido evaluado frente a estrés por inundación y

estrés de tipo mixto entre inundación y salinidad comunes en suelos restrictivos.

Por otro lado, es importante mencionar que el género Lotus presenta además una ventaja

comparativa de relevancia con respecto a otros géneros vegetales, dado que la especie L.

japonicus, ha sido seleccionada como especie modelo, lo que ha dado lugar a

numerosos estudios genéticos, bioquímicos y fisiológicos (Udvardi et al., 2005). Esta

especie se encuentra taxonómicamente muy cercana a las especies antes mencionadas

(Young et al., 2003).

1.4. Aclaración de términos y objetivo general

En trabajos previos en donde se evalúa el estrés por inundación, se ha detectado una

amplia variación en las condiciones de evaluación y en el uso de los términos

implementados para describir dicha condición de estrés. La mayor diversidad se

encuentra dada fundamentalmente en aspectos de intensidad (relacionado a la

profundidad de la inundación) y a la duración del estrés. En este trabajo de tesis los

términos vinculados al concepto general de “inundación” se definen de la siguiente

manera: Anegamiento: constituye la inundación de todo el sistema radicular de la

planta.

Sumersión parcial: considerada como aquella inundación del sistema radicular y una

parte del vástago que comúnmente se la denomina como encharcamiento. Cabe aclarar

que este fue el tipo de estrés empleado en los tres capítulos del presente trabajo de tesis.

Sumersión total: considerada cuando se genera una inundación de toda la planta, sin que

quede en contacto ninguna parte de la misma con la atmósfera.

Con respecto al material vegetal del género Lotus evaluado en esta tesis, y el cual fue

detallado en cada capítulo experimental, debe considerarse que todos ellos son

heterogéneos, incluyéndose poblaciones de colecta propia, otros de variedades

cultivadas comerciales (cv), una población híbrida interespecífica y un ecotipo

autógamo. A los fines de generalizar una denominación común, a lo largo del trabajo se

denominan indistintamente a todos ellos como “accesiones”.

8

Como objetivo general de este trabajo de tesis se propuso: Ampliar el conocimiento

existente sobre el género Lotus y su relación simbiótica con rizobios, mediante estudios

fisiológicos, morfológicos, anatómicos y moleculares con la finalidad de incrementar su

aprovechamiento en áreas inundables, tales como los de la Pampa Deprimida.

9

2. CAPÍTULO 2. EFECTOS DE LA INUNDACIÓN (SUMERSIÓN PARCIAL)

EN ESPECIES DEL GÉNERO Lotus

10

2.1. Introducción

La sumersión parcial, como se mencionó en la introducción general, provoca una rápida

disminución del oxígeno a nivel de la rizósfera lo que ocasiona una serie de efectos y

respuestas sobre las plantas que quedan con sus tejidos sumergidos. Las respuestas

generales son observadas en diferentes niveles: a nivel fisiológico (reducción absorción

de agua, cierre estomático, cambios en el balance hormonal); a nivel morfológico

(desarrollo de raíces adventicias, número de tallos y ramificaciones) y anatómico

(aparición de hipertrofias, aerénquima). Generalmente se asocia a una mayor tolerancia

a la inundación a aquellas plantas capaces de desarrollar tales características

eficazmente (revisado por Voesenek y Bailey-Serres, 2015).

Considerando las especies del género Lotus, la única especie que se ha naturalizado en

la Pampa Deprimida hasta el momento ha sido L. tenuis. Se le adjudica la capacidad de

naturalizarse a una serie de características que le posibilitan el estar adaptada a los

suelos presentes en esta región. Entre esas características, la principal ha sido su

capacidad de tolerar períodos en que el suelo se encuentra anegado y/o encharcado,

tolerando en mayor medida esta condición que los cultivares de L. corniculatus. Esta

tolerancia relativa superior de L. tenuis ha sido principalmente adjudicada a una mayor

capacidad de formar tejido aerenquimático y raíces adventicias (Vignolio et al., 1999;

Striker et al., 2005; Real et al., 2008). Sin embargo, la especie L. corniculatus, tal cual

se mencionó anteriormente, es considerada de mejor valor agronómico debido

principalmente a su mayor potencial en producción de forraje y a su nivel óptimo de

taninos condensados foliares (Hagerman y Butler, 1991). Como desventaja, los

cultivares disponibles de L. corniculatus no han sido capaces de persistir en las

condiciones de suelos anegables, por lo que se justifica la búsqueda de materiales con

características forrajeras óptimas como las de L. corniculatus pero con tolerancia a

suelos anegables.

Por lo anteriormente mencionado, mediante la hibridación interespecífica entre estas

especies, (detallada en la sección 1.3 de este trabajo de tesis) se podrían obtener

materiales promisorios con potencial forrajero que posean características de ambos

parentales (forraje de mejor calidad para suelos de baja aptitud agrícola).

En este capítulo de tesis, se propuso como objetivo evaluar las respuestas de

crecimiento, morfológicas, fisiológicas y anatómicas en plantas adultas de distintas

accesiones de especies del género Lotus, frente al estrés por inundación. Se aplicó un

estrés de inundación del tipo sumersión parcial en un período prolongado durante la

primavera (55 días), condiciones las cuales simularon sucesos frecuentes de la región de

la Pampa Deprimida (Paruelo y Sala, 1990). También se incluyó en la evaluación un

período de recuperación post-inundación de 35 días. Las accesiones evaluadas fueron: el

híbrido interespecífico mencionado, sus accesiones parentales, el cultivar tetraploide de

L. corniculatus “San Gabriel” ampliamente utilizado y un ecotipo de L. japonicus,

(especie modelo de leguminosas de nodulación determinada). Complementariamente a

los estudios de inundación en estadios adultos, las mismas accesiones se evaluaron bajo

inundación en la etapa de germinación con el fin de determinar si existe una relación de

la tolerancia en los distintos estadios fenológicos.

11

2.2. Hipótesis

Considerando que la población de Lotus corniculatus diploide con la cual se trabaja en

nuestro laboratorio evolucionó en un ambiente inundable y que se conoce la elevada

tolerancia de L. tenuis frente al estrés por inundación, se realizan las siguientes

predicciones como hipótesis:

a) La población diploide de L. corniculatus de la Albufera de Valencia, por estar

adaptada a zonas inundables en su lugar de origen, tiene características morfológicas y

anatómicas más aptas para tolerar períodos prolongados de sumersión parcial que el cv.

comercial tetraploide de L. corniculatus (San Gabriel).

b) Las características morfológicas y fisiológicas (la capacidad de generar abundante

aerénquima y raíces adventicias entre otras) que le conceden a la especie L. tenuis una

elevada tolerancia frente a la sumersión parcial son transferidas a la descendencia

híbrida en el cruzamiento interespecífico con L. corniculatus de la Albufera de

Valencia. De esta manera el híbrido interespecífico obtenido en procura de realizar una

mejora de la calidad forrajera, posee también las características de tolerancia al estrés

por sumersión parcial.

2.3. Materiales y métodos

2.3.1. Sumersión parcial sobre plantas adultas de Lotus spp.

2.3.1.1. Material vegetal

El material vegetal utilizado consistió en lotes de semillas de las siguientes accesiones:

- Una población de Lotus tenuis naturalizada en un bajo inundable de la Pampa

Deprimida (Lt).

- Una población diploide de colecta propia de L. corniculatus proveniente de las

malladas salinas en la Devesa de la Albufera de Valencia, España (LcD).

- La primera generación de un híbrido interespecífico de población (LtxLc), obtenido

entre las poblaciones Lt y LcD.

- El cultivar comercial “San Gabriel” de L. corniculatus tetraploide (LcT).

- El ecotipo Miyakojima MG-20 de L. japonicus (Lj).

2.3.1.2. Sistema de cultivo y tratamientos

A principios del mes de mayo, se tomaron semillas de las accesiones anteriormente

descritas y se las escarificó con ácido sulfúrico concentrado (98 %). Para ello, se

colocaron las semillas en tubos plásticos de 50 ml y se agregó ácido en una cantidad

suficiente para cubrirlas. Luego se las agitó vigorosamente con un agitador durante 3

minutos. El ácido sulfúrico se retiró de los tubos e inmediatamente se hicieron 10

lavados con agua destilada. Las semillas así escarificadas se sembraron en placas de

Petri que contenían agar-agua al 0,8 % (p/v), y luego se trasladaron a la cámara de

cultivo. Una vez que las plántulas tuvieron los cotiledones expandidos, se transplantaron

(una plántula por cada maceta) y se ubicaron en invernáculo. Se usaron macetas de

polietileno de 4 l de capacidad, conteniendo una mezcla de suelo y arena (1:1)

previamente tamizada y homogeneizada. El suelo usado provino de los primeros 20 cm

del horizonte superficial de un bajo “dulce” inundable de un lote que posee el campo

experimental del IIB-INTECH en el partido de Chascomús. El suelo utilizado tuvo las

características típicas de los ambientes de bajos inundables (Fósforo: 6,3 ppm; pH: 6,28;

12

CE: 0,54 dS; MO: 8,8 %; N total: 0,25 %). Las plantas se regaron con agua de lluvia

acumulada en tanques destinados a este propósito y no se agregó ningún tipo de

fertilizante a lo largo del cultivo de las mismas.

Las plantas se cultivaron durante 5 meses hasta la aplicación de los tratamientos

“control” e “inundación” en el comienzo del mes de octubre. Esto simularía

encharcamiento o anegamiento propios de principios de primavera, como

frecuentemente ocurren en los suelos de bajo y de media loma con las lluvias

abundantes de dicha época en la región de la Pampa Deprimida.

El tratamiento de inundación en este experimento consistió en someter a las plantas a

una sumersión parcial con agua de lluvia, manteniendo el nivel de agua en 6 cm (±1 cm)

sobre el nivel de la superficie de suelo de la maceta, durante 55 días. El mismo se logró

colocando por fuera de cada maceta, una más grande pero sin vías de drenaje. El

tratamiento control consistió en el cultivo de las plantas regadas diariamente y con libre

drenaje, manteniendo la humedad del sustrato en no menos del 80 % de capacidad de

campo. Posteriormente, a los 55 días de aplicada y mantenida la inundación, y luego de

la cosecha denominada fin de inundación realizada solo a un grupo de plantas, a un

grupo similar se las retiró de la situación de estrés eliminándose el tratamiento de

sumersión, y cambiándolas a un sistema con libre drenaje similar al utilizado en los

individuos controles. Luego de 35 días, a este último grupo de plantas se las cosechó en

el momento denominado a los fines experimentales como fin de recuperación.

2.3.1.3. Cosecha y determinación de parámetros de crecimiento

Se realizaron cosechas en tres fechas a lo largo del experimento, y en cada fecha se

cosecharon plantas tanto del tratamiento en sumersión parcial como de la condición

control de todas las accesiones evaluadas (Figura 2.1):

- Día cero o inicio de tratamiento. Se consideró como día cero el momento en que se

comenzó con el tratamiento de sumersión parcial a las plantas de 5 meses de

crecimiento otoño-invernal. En esta fecha se cosecharon 10 plantas por cada accesión

evaluada.

- Fin de inundación. Se consideró esta fecha de cosecha de biomasa una vez

transcurridos 55 días desde el inicio del tratamiento de sumersión parcial. En esta

instancia se cosecharon 14 plantas elegidas aleatoriamente por cada tratamiento, es decir

que por cada accesión se tomaron 14 plantas controles y 14 plantas en sumersión

parcial.

- Fin de recuperación. Esta fecha de cosecha se realizó después de 35 días desde el

momento en que se terminó con el tratamiento aplicado de sumersión, dejando a las

plantas con libre drenaje tal cual las controles.

La cosecha para cada una de las tres fechas, consistió en descalzar cada planta del

sustrato, lavando cuidadosamente las raíces y separando la biomasa total de cada

individuo en tres fracciones: hojas, tallos y raíces. Estas fracciones de biomasa se

colocaron en sobres de papel y secadas en estufa a 70 °C durante 3 días hasta peso

constante. Luego de secadas las muestras, se pesaron con balanza analítica.

En el momento de cada una de las fechas de cosecha y por cada planta, también se

registraron los siguientes parámetros: el número de tallos primarios y secundarios de

más de 5 cm de longitud; el número de raíces adventicias y la longitud de los 5 tallos

más largos. En la cosecha de fin de inundación, también por cada planta se midió el

diámetro de 3 tallos principales a 3 cm desde la corona, registrado con un calibre

manual con escala de Vernier o nonio con precisión de 0,1 mm. Los 3 valores de grosor

13

por cada planta se promediaron y así se obtuvo un solo valor por planta para el análisis

de esta variable.

A partir de los datos de biomasa determinados en las tres diferentes fechas de cosecha

se calculó la tasa de crecimiento relativo (TCR) para los diferentes períodos del

experimento: para el período transcurrido entre las fechas de inicio y fin de inundación

(período de inundación), para el período transcurrido entre fin de inundación y fin de

recuperación (período de recuperación) y para el período total transcurrido entre la

fecha de inicio de inundación y fin de recuperación (período total). La TCR se calculó

usando la ecuación descrita por Malik et al. (2011):

TCR = (LN MS2 – LN MS1) / (t2 – t1)

donde, para los distintos períodos evaluados: MS1 es la biomasa seca (g) en el inicio del

período considerado; MS2 es la biomasa seca (g) al final del mismo período; t1 y t2 son

los días del comienzo y del final del período evaluado, siempre contados desde el día

cero, el cual corresponde al día del transplante de cada plántula; LN es el logaritmo

natural. En el cálculo de la TCR se asume que las tasas de crecimiento diario, son

constantes durante cada período considerado.

También se calcularon las relaciones entre la biomasa aérea (vástagos) y la biomasa de

raíz (V/R) y entre la biomasa de hojas y la biomasa de tallos (H/T).

2.3.1.4. Determinación del intercambio neto de gases

Un día antes de la cosecha de fin de inundación, a 54 días desde el comienzo del

tratamiento de inundación, se determinó el intercambio de gases utilizando un

analizador de gases portátil (TPS-2 PP System, Amesbury, MA, USA) en condición de

concentraciones atmosféricas de CO2 (aproximadamente 380 ppm), y de irradiancias

saturantes para plantas de metabolismo C3 (1500 μmol fotones m-2 seg-1, suministrada

por luz LED del propio equipo). Las mediciones se realizaron sobre una hoja totalmente

desarrollada del tercio medio de cada planta. De esta manera se midieron las tasas de

intercabio neto de CO2 a luz saturante (Asat) y conductancia estomática (GS).

2.3.1.5. Determinación de parámetros de la eficiencia del fotosistema II

Dos días antes de la cosecha de fin de inundación, es decir a los 53 días del comienzo

del tratamiento de inundación, se determinaron los parámetros de la eficiencia del

fotosistema II (PII), mediante la florescencia transitoria de la clorofila. Las

determinaciones consistieron en análisis OJIP utilizando un fluorómetro portátil (Pocket

Pea, Hansatech Instrument, UK) en hojas preadaptadas a la oscuridad por no menos de

20 minutos. Las determinaciones se realizaron en la tercera hoja expandida desde el

ápice. Las lecturas obtenidas se analizaron mediante el programa Handy PEA (PEA

Plus V1.10), calculándose el rendimiento cuántico máximo de la fotoquímica primaria

(ϕPo =TRo/ABS = Fv/Fm). También se calculó la contribución a la regulación de la

fotosíntesis por los tres pasos funcionales de absorción de energía de la luz (ABS), de

captura de la energía de excitación (TR) y la conversión de la energía de excitación de

transporte de electrones (ET) los cuales se expresaron a través del término multi-

paramétrico denominado índice de performance (PIabs; Strasser et al., 2000): PIabs =

(RC/ABS)·[ϕPo/(1−ϕPo)]·[Ψo/(1−Ψo)].

14

2.3.1.6. Estimación de estabilidad de membranas mediante la técnica de pérdida de

electrolitos

En la fecha de cosecha fin de inundación, se colectaron los tres foliolos apicales de la

quinta hoja expandida, contando a partir del ápice, de tres ramas diferentes por cada

planta de los distintos tratamientos. Posteriormente se colocó un volumen de 15 ml de

agua bi-destilada en tubos de plástico de 50 ml y se determinó la conductividad eléctrica

(CE), la cual se denominó conductividad a tiempo cero (t0). Luego se sumergieron los 9

foliolos en cada tubo y se los dejó 24 horas en agitación. Luego de finalizado ese

tratamiento se determinó nuevamente la CE y se denominó conductividad a tiempo 1

(t1). Finalmente se autoclavaron los tubos durante 20 minutos, a una presión de 1 atm y

a 120 °C y posteriormente se determinó la CE a tiempo 2 (t2). Con los tres valores de

CE, se calcularon la pérdida de electrolitos porcentual (E) conforme a la ecuación E

total = (t1 – t0)/(t2 – t0)*100 y la integridad de membranas (I%) según la ecuación I% =

(1–(t1 – t0)/(t2 – t0))*100 (Lee et al., 1993).

2.3.1.7. Determinación de aerénquima

La anatomía de los cortes transversales de raíz se observó con microscopio óptico. Para

ello se colectaron segmentos de raíces de aproximadamente 1 cm de largo, a partir de

2,5 cm medidos desde el ápice. Estos segmentos se lavaron cuidadosamente y luego se

preservaron en el fijador Formaldehído : Alcohol : Ácido Acético : Agua (FAA)

(2:10:1:7) hasta que se procesaron. Los segmentos de raíces así fijados, se deshidrataron

en series crecientes de concentraciones de etanol, y luego se embebieron en parafina. Se

cortaron secciones de 10 μm de espesor con ayuda de un micrótomo manual, luego se

tiñeron con Safranina y Fast-Green y se montaron en Bálsamo de Canadá. Por cada

tratamiento, las observaciones anatómicas se realizaron tomando aleatoriamente 5

secciones de raíces de plantas diferentes. De esta manera se determinó la proporción de

aerénquima del área de las secciones transversales de las raíces utilizando el programa

analizador de imágenes Image-ProPlus v4.1 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2.3.1.8. Diseño experimental y análisis de datos

Se implementó un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial de los

tratamientos en 2 factores fijos: factor “accesión” con 5 niveles (esto corresponde a las 5

accesiones evaluadas) y el factor “inundación” con 2 niveles (plantas en sumersión

parcial y plantas con libre drenaje en condición control). La unidad experimental fue

una planta cultivada individualmente en una maceta. Debido a que cada cosecha fue

destructiva de la biomasa total de la planta, el número de repeticiones de los parámetros

de biomasa dependió de cada fecha de cosecha: para la fecha de inicio de inundación

hubo 10 repeticiones, para la fecha de fin de inundación, 14 repeticiones y para la de fin

de recuperación, 10 repeticiones (Figura 2.1 del esquema del experimento). En las

determinaciones no destructivas el número de repeticiones se indica en cada cuadro o

tabla de la sección 2.4 de este capítulo correspondiente a los resultados.

Para las variables determinadas, se probaron los supuestos de homogeneidad de

varianzas mediante la prueba de Levene y de normalidad de los errores a través de la

prueba de Shapiro-Wilks. El análisis de las variables se realizó implementando un

análisis de la varianza (ANVA) a 2 vías, excepto para la variable “Número de raíces

15

adventicias” que se analizó mediante un ANVA a una vía (ya que las raíces adventicias

solo se registraron en un solo nivel del factor inundación). Para cada variable en la que

se detectó interacción significativa, se analizaron las medias de los 10 tratamientos, los

cuales consistieron en todas las combinaciones entre los niveles de los dos factores (5 x

2), mediante una prueba de comparación múltiple de medias de Duncan. Para las

variables en que el ANVA no detectó interacción significativa, se analizaron los efectos

principales de los factores, y si alguno de estos fue significativo, también se aplicó la

prueba de Duncan para diferenciar entre medias de los diferentes niveles de cada factor.

Se empleó el nivel de significancia del 5 %, tanto para el ANVA como para las pruebas

de Duncan.

Las variables que correspondieron a valores porcentuales (por ejemplo la proporción de

aerénquima en secciones de raíces), previo al análisis estadístico se transformaron

mediante arcseno √p, donde p es la variable en valores de proporción (0 ≤ p ≤ 1). Para

todos los análisis estadísticos se utilizó el programa InfoStat versión 2011 (Grupo

InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina) (Di Rienzo et al., 2011).

16

Figura 2.1. Esquema del diseño y de los momentos de cosecha del experimento para una

accesión dada.

Período de crecimiento (5

meses) y cosecha de

“inicio de inundación”

Período de inundación (55

días) y cosecha de “fin de

inundación”

Período de recuperación

(35 días) y cosecha de

“fin de recuperación”

= Inundadas

(Sumersión parcial

sin drenaje)

= Recuperación

(Sin sumersión,

drenaje libre)

= Cosecha de

toda la biomasa

de la planta

= Controles

(drenaje libre)

17

2.3.2. Germinación de Lotus spp. en inundación

2.3.2.1. Material vegetal

Se utilizaron las mismas accesiones que para el apartado anterior de esta tesis (2.3.1.1).

2.3.2.2. Sistema de cultivo y tratamientos

Las semillas se escarificaron químicamente con ácido sulfúrico de la misma manera que

se explicó en el apartado anterior 2.3.1.2. Una vez escarificadas, se sembraron en

macetas conteniendo una mezcla arena:tierra (2:1). Cada maceta se dividió en 6 sectores

de igual tamaño. Por cada sector se sembraron 20 semillas de las accesiones. A estas

macetas, inmediatamente después de sembradas se las inundó con agua de lluvia,

manteniendo una profundidad de agua de 5 cm por sobre la superficie del sustrato.

Además se pusieron a germinar semillas, también escarificadas de la misma manera, de

todas las accesiones en macetas sin inundación para registrar el porcentaje de

germinación en una condición testigo. El ensayo se llevó a cabo en condiciones de

invernáculo, a principios de septiembre.

2.3.2.3. Determinación de germinación

Las determinaciones realizadas consistieron en el recuento de las semillas germinadas

tanto para la condición testigo como para la de inundación. Se realizó un seguimiento de

la germinación en una frecuencia de dos o tres días durante un período total de 30 días.

Considerándose una plántula “emergida o germinada” aquella que logró expandir sus

dos cotiledones.

2.3.2.4. Diseño experimental y análisis de datos

Se empleó un diseño experimental en bloques completos al azar (DBCA) con 4

repeticiones. Cada bloque correspondió a una maceta, que se dividió en 6 sectores. En

cada uno de los sectores se sembraron las diferentes accesiones evaluadas.

Los valores se registraron y convirtieron en porcentajes de germinación, siendo el 100

% de cada accesión, el número de plántulas germinadas en la situación testigo. Para

analizar en un ANVA, los datos de porcentajes de germinación, se transformaron

previamente mediante arcseno √p, donde p es la proporción de las semillas germinadas

en inundación respecto al total de semillas germinadas en situación control (0 ≤ p ≤ 1).

2.4. Resultados

2.4.1. Incidencia de la sumersión parcial y de un período de recuperación en la

acumulación de biomasa

Si bien en todas las accesiones sometidas a 55 días de sumersión parcial (inundación) se

redujo la acumulación de biomasa con respecto a la situación control, el efecto fue

diferente dependiendo de las accesiones (interacción significativa entre los dos factores

accesión e inundación, p<0,05) para el período de inundación y el de recuperación en

18

todas las fracciones de biomasa analizadas (biomasa de hojas, de tallos, de raíces y

total) (Figura 2.2 y Tabla 2.1. Tablas S.2.1 y S.2.2 del anexo). En este sentido, y con

respecto a su control, en Lotus tenuis (Lt) se observó la menor reducción de la biomasa

durante el período de inundación y también durante el período de recuperación (28 y 34

% de reducción en la biomasa aérea y total en el período de inundación y 15 y 21 %

respectivamente para el período de recuperación). Mientras que en L. corniculatus

tetraploide (LcT) en inundación se observó que fue la accesión en que más se redujo la

biomasa con respecto a su control (63 y 74 % de reducción en la biomasa aérea y total

en el período de inundación y 54 y 64 % respectivamente para el período de

recuperación). En el híbrido interespecífico L. tenuis x L. corniculatus (LtxLc) se

observó que se redujo la biomasa de manera intermedia a Lt y LcT en el período de

inundación (50 y 52 % de reducción en la biomasa aérea y total) pero con una fuerte

recuperación de biomasa en el período post-inundación (25 % de reducción en la

biomasa aérea y total) (Figura 2.2 y Tabla 2.1).

Entre las plantas sometidas al estrés por inundación, las que mayor biomasa aérea

acumularon en los dos períodos fueron las de Lt seguidas por las de LtxLc (13,95 y 8,99

g por planta en el período de inundación y 20,65 y 18,53 g por planta en el período de

recuperación respectivamente). Cabe mencionar que la acumulación de biomasa

determinada en la cosecha de fin de recuperación, LtxLc no se diferenció de Lt. Las

plantas sometidas a inundación de las demás accesiones tuvieron menor acumulación de

biomasa aérea en ambos períodos evaluados (5,99, 5,07 y 3,72 g por planta en LcT,

LcD y Lj en el período de inundación y 10,46, 8,98 y 3,67 g por planta respectivamente

en las mismas accesiones) (Figura 2.2.C y D). Comparando esos valores de biomasa

aérea de las dos cosechas, se observó que en promedio las plantas de LtxLc acumularon

casi 10 g de materia seca por planta en el período de 35 días de recuperación post-

inundación, mientras que en el mismo período las demás accesiones acumularon 6,70,

4,47, 3,91 y 0 g por planta en Lt, LcT, LcD y Lj respectivamente.

La biomasa de raíces se redujo fuertemente en las plantas inundadas de LcT con

respecto a sus plantas controles en ambos períodos evaluados (88 y 84 % de reducción

en el período de inundación y recuperación respectivamente) (Figura 2.2.C). Mientras

que en las demás accesiones dicha biomasa se redujo entre un 48 y 64 % en promedio

para el período de inundación. En el período de recuperación post-inundación lo más

destacable fue que la biomasa de raíces de las plantas del híbrido LtxLc, se equiparó con

la biomasa de las plantas controles (Figura 2.2.D).

Comparando plantas inundadas, Lt fue la que más biomasa de raíces acumuló (4,4 g por

planta; Figura 2.2.C), lo que concuerda con el número de raíces adventicias formadas

bajo dicho estrés (más de 200 raíces adventicias por planta en Lt) (Tabla 2.1). En este

sentido, todas las accesiones formaron raíces adventicias únicamente en las plantas

inundadas durante el período de inundación, y persistieron en el período de

recuperación. Sin embargo, las accesiones respondieron diferencialmente entre ellas

(p<0,05; ANVA a una vía). Las accesiones LcT y LtxLc formaron menor cantidad de

raíces que Lt, con alrededor de 100 raíces adventicias por planta, mientras que LcD y Lj

formaron en promedio algo más de 50 raíces adventicias por planta (Tabla 2.1). Además

se observó que gran parte del sistema radicular original se desintegró en todas las

accesiones por el efecto de la inundación, siendo casi íntegramente reemplazado por la

formación de las raíces adventicias (se puede observar en las fotografías de las plantas

inundadas de la Figura 2.2.A).

Es menester mencionar que en las raíces de todas las accesiones se observó la formación

de nódulos resultantes de la simbiosis con rizobios.

19

Figura 2.2. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inundado) y 35 días de recuperación sobre

la biomasa de plantas adultas de 5 accesiones de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L.

tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus

tetraploide y Lj: L. japonicus). A y B: fotografías tomadas en el momento de la cosecha de fin

de inundación. Las líneas blancas sobre las fotos, representan 25 cm. C y D: biomasa aérea y de

raíces, ambos en peso seco. Los porcentajes muestran la reducción de crecimiento de las plantas

inundadas con respecto a las controles. Las columnas (medias, n=14 o n=10, ±DE) sin ninguna

letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05).

Período de inundación Período de recuperación C D

Lt LtxLc LcD LcT Lj0

10

20

30

d

eee

ab

f

a

bc

a

c37%

54%

68%

15% 25%

Bio

masa a

ére

a (

g p

lan

ta-1

)

0

10

20

30

c

dd

d

a

d

b

cc

c

73%

80%

55%

37%24%

Bio

masa d

e r

aíc

es (

g p

lan

ta-1

)


10

20

30ControlInundado

d

ef

d

f

b

e

a

c

ab

d

53%

63%

66%

28%50%

Bio

masa a

ére

a (

g p

lan

ta-1

)

0

10

20

30

eef

ff

a

e

b

dc

e

61%

88%

64%

48%

57%

Bio

masa d

e r

aíc

es (

g p

lan

ta-1

)

Cont Inund Cont Inund Cont Inund Cont Inund Cont Inund

A

Lt LtxLc LcD LcT Lj

B

Período de inundación

Período de recuperación

20

Tabla 2.1. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) y 35 días de recuperación sobre la

biomasa total (g de materia seca/planta) y la formación de raíces adventicias en plantas adultas

de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus

diploide; LcD: L. corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus tetraploide y Lj: L. japonicus).

Período de inundación Período de recuperación

Tratamientos Biomasa Total Raíces adventicias* Biomasa Total Raíces adventicias*

(Acc x Inund) media ± DE media ± DE media ± DE media ± DE

Lt Cont 27,78 ± 4,59 a 33,56 ± 4,15 ab

Inund 18,32 ± 4,68 c 206,6 ± 67,44 a 26,43 ± 2,57 c 192,6 ± 61,54 a

LtxLc Cont 24,11 ± 4,55 b 31,55 ± 3,71 b

Inund 11,54 ± 3,71 d 95,6 ± 49,54 b 23,61 ± 4,97 cd 110,6 ± 47,14 b

LcD Cont 13,29 ± 2,54 d 19,69 ± 4,09 d

Inund 6,08 ± 2,54 e 53,9 ± 36,05 c 10,46 ± 2,23 e 18,7 ± 6,03 c

LcT Cont 28,64 ± 6,50 a 36,77 ± 4,96 a

Inund 7,46 ± 2,32 e 114,3 ± 67,78 b 13,21 ± 4,24 e 100,3 ± 59,51 b

Lj Cont 13,60 ± 2,81 d 13,60 ± 1,71 e

Inund 4,65 ± 0,86 e 56,2 ± 12,07 c 4,62 ± 1,18 f 37,3 ± 10,98 c

Los valores son las medias de 14 (período de inundación) o 10 (período de recuperación) plantas ± el

desvío estándar. Para cada variable (columnas), las medias sin ninguna letra en común son

significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05).

** En la variable “Raíces adventicias” se realizó un ANVA a una vía, de las plantas inundadas con las

accesiones como clasificación, porque solo en esta condición se desarrollaron este tipo raíces.

La relación biomasa aérea (vástagos)/biomasa de raíces (V/R) aumentó en las plantas

inundadas con respecto a las controles en ambas accesiones de L. corniculatus durante

el período de inundación, pero en mayor grado en LcT que en LcD (250 y 44 %

respectivamente, con respecto a sus controles). El incremento de la relación en ambas

accesiones persistó en el período de recuperación. Las plantas inundadas de Lt y LtxLc

no se diferenciaron de sus plantas controles para esta relación en ninguno de los dos

períodos considerados. En la especie modelo Lj, la relación V/R de las plantas

inundadas se observó invariable con respecto a las controles en el período de

inundación, pero disminuyó en el período de recuperación (Tabla 2.2).

En la relación hoja/tallo (H/T), nuevamente la accesión más afectada por la inundación

respecto a su control fue LcT (57 % menor), seguida por la otra accesión de L.

corniculatus, LcD (37 % menor, también respecto a su control) durante el período de

inundación (Tabla 2.2). En Lt, LtxLc y Lj la relación H/T no se modificó por la

inundación durante el mismo período. En las plantas controles de la accesión LcD se

observó el valor más alto de la relación H/T (1,05).

Para el período de recuperación, en las plantas que transcurrieron por la inundación, no

se observó efecto de la misma sobre la relación H/T y sólo se observaron diferencias

entre las accesiones independientemente de la inundación (Tabla 2.2).

21

Tabla 2.2. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) y de 35 días de recuperación sobre las

relaciones de biomasa en peso seco (Vástago/Raíz y Hoja/Tallo) de plantas adultas de 5

accesiones (Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus



Tratamientos Vástago/Raíz Hoja/Tallo Vástago/Raíz Hoja/Tallo*


Lt Cont 2,49 ± 0,83 ef 0,46 ± 0,10 def 2,83 ± 0,75 cd 0,26 ± 0,07

bc Inund 3,50 ± 0,97 cde 0,52 ± 0,14 cde 3,82 ± 1,21 bc 0,37 ± 0,11

LtxLc Cont 3,20 ± 0,80 de 0,65 ± 0,14 c 3,97 ± 1,09 bc 0,29 ± 0,09

bc Inund 3,57 ± 0,84 cde 0,58 ± 0,12 cd 4,17 ± 1,39 bc 0,38 ± 0,12

LcD Cont 4,67 ± 2,44 bc 1,05 ± 0,38 a 3,02 ± 1,63 bcd 0,53 ± 0,26

ab Inund 6,75 ± 3,30 a 0,66 ± 0,25 c 6,23 ± 1,69 a 0,31 ± 0,12

LcT Cont 1,42 ± 0,42 f 0,84 ± 0,12 b 1,83 ± 0,68 d 0,44 ± 0,23

a Inund 4,97 ± 1,80 b 0,36 ± 0,17 f 4,48 ± 1,71 b 0,63 ± 0,29

Lj Cont 4,61 ± 1,63 bc 0,41 ± 0,06 ef 5,83 ± 1,42 a 0,15 ± 0,04

c Inund 4,19 ± 0,95 bcd 0,36 ± 0,12 f 3,98 ± 0,77 bc 0,31 ± 0,08




* En la relación H/T del período de recuperación no hubo interacción entre los factores. La inundación no

tuvo efecto y el factor accesión sí lo tuvo (se muestran las diferencias por accesión).

En las plantas inundadas de las accesiones Lt, LtxLc y LcT en comparación con las

controles, se observó una reducción del número de tallos primarios (o basales) en el

período de inundación, que persistió en el período de recuperación, mientras que LcD y

Lj no alteraron dicho número en ningunos de los períodos (Tablas S.2.5 y S.2.6 del

anexo).

Por otra parte, el número de tallos secundarios se redujo en todas las accesiones cuando

las plantas se sometieron al tratamiento de inundación. Sin embargo, en el período de

recuperación las plantas del tratamiento de inundación aumentaron considerablemente

el número de tallos secundarios (o ramificaciones laterales) alcanzando los valores de

las plantas controles en todas las accesiones e incluso superándolo ampliamente en el

caso de Lt (Tablas S.2.5 y S.2.6 del anexo).

En cuanto a las tasas de crecimiento relativo de la biomasa aérea (TCRv), de las raíces

(TCRr) y la total (TCRt), para el período de inundación de 55 días, se observó una

reducción de las mismas en todas las plantas inundadas de las diferentes accesiones con

respecto a sus controles. Sin embargo, esas reducciones fueron diferenciales

dependiendo de las accesiones en las tres fracciones (interacción significativa entre los

dos factores, p<0,05) (Tabla 2.3 y Tabla S.2.3 del anexo).

Las TCRv de las plantas inundadas disminuyeron en un 20, 29, 52, 78 y 86 % con

respecto a las controles en Lt, LtxLc, LcD, LcT y Lj respectivamente (Tabla 2.3). En la

accesión LcT, la TCRr se observó severamente afectada por la inundación, con valor

negativo de la tasa (-0,009 g g-1 día-1), lo que indicó una pérdida de biomasa con

respecto a la situación de inicio de inundación (Tabla S.2.3 del anexo). La TCRt se

22

encontró más severamente afectada en LcT que en las demás accesiones (25, 30, 55, 93

y 86 % para Lt, LtxLc, LcD, LcT y Lj respectivamente) (Tabla 2.3).

Cabe destacar, que las TCR de las distintas fracciones de biomasa y la TCRt de la

accesión LtxLc en ambas condiciones, fueron las más altas entre todas las accesiones

evaluadas (Tabla 2.3 y Tabla S.2.3 del anexo).

Las TCRv y TCRt durante el período de 35 días de recuperación de las plantas que se

sometieron a inundación, también respondieron diferencialmente dependiendo de las

accesiones (interacción entre factores, p<0,05) (Tabla 2.3). En la accesión LtxLc, las

TCRv y TCRt fueron mayores en las plantas que transcurrieron la inundación que las

que permanecieron siempre en condición control. Lo mismo se observó en la TCRv de

LcD y en la TCRt de LcT.

Tabla 2.3. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) y 35 días de recuperación sobre las

tasas de crecimiento relativo en peso seco (TCR, g g-1 día-1) de la biomasa aérea (vástago) y

total de plantas adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L.

tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus

tetraploide y Lj: L. japonicus).


Tratamientos TCR Vástago TCR Total TCR Vástago TCR Total


Lt Cont 0,030 ± 0,003 c 0,031 ± 0,003 bc 0,006 ± 0,002 de 0,005 ± 0,003 cd

Inund 0,024 ± 0,004 d 0,023 ± 0,004 e 0,011 ± 0,003 bcd 0,010 ± 0,003 bc

LtxLc Cont 0,048 ± 0,003 a 0,047 ± 0,003 a 0,009 ± 0,003 cd 0,008 ± 0,003 c

Inund 0,034 ± 0,007 b 0,033 ± 0,007 b 0,020 ± 0,005 a 0,020 ± 0,006 a

LcD Cont 0,029 ± 0,005 c 0,028 ± 0,004 cd 0,008 ± 0,007 d 0,011 ± 0,006 bc

Inund 0,014 ± 0,007 e 0,013 ± 0,008 f 0,016 ± 0,007 ab 0,015 ± 0,006 ab

LcT Cont 0,023 ± 0,004 d 0,027 ± 0,004 d 0,009 ± 0,004 cd 0,007 ± 0,004 c

Inund 0,005 ± 0,005 f 0,002 ± 0,006 g 0,015 ± 0,009 abc 0,015 ± 0,01 ab

Lj Cont 0,022 ± 0,004 d 0,023 ± 0,004 e 0,001 ± 0,003 ef 0,000 ± 0,004 de

Inund 0,003 ± 0,003 e 0,003 ± 0,003 g -0,001 ± 0,007 f -0,001 ± 0,007 e




2.4.2. Efecto de la sumersión parcial sobre el intercambio de gases, fotosistema II y

pérdida de electrolitos

La tasa de intercambio neto de CO2 a luz saturante (Asat) se afectó diferencialmente por

la inundación dependiendo de las accesiones (interacción significativa entre los factores,

p<0,05). En las plantas inundadas de las accesiones LcT y Lj se observó un 68 y 71 %

menos de fijación de CO2 que en sus controles respectivamente, mientras que en las

accesiones Lt y LtxLc dicha tasa de fijación no se afectó con respecto a sus controles y

en LcD tendió a disminuir (Figura 2.3.A). La conductancia estomática (GS) (Figura

2.3.B) tendió a repetir lo observado para ASat, pero ni la interacción entre los factores,

ni los efectos principales, fueron significativos (p>0,05).

23

Figura 2.3. Efecto de 54 días de sumersión parcial (Inundado) sobre el intercambio de gases de

plantas adultas de 5 accesiones de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L.

corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus tetraploide y Lj: L.

japonicus). A: Intercambio neto de CO2 a luz saturante (Asat) y B: Conductancia estomática

(GS) determinadas un día antes de la cosecha de fin de inundación. Los porcentajes muestran la

reducción de las tasas de las plantas inundadas con respecto a las controles. Las columnas

(medias, n=4, ±DE) sin ninguna letra en común, son significativamente diferentes según la

prueba de Duncan (p<0,05). Para la GS, ni la interacción entre los factores, ni los efectos

principales fueron significativos.

Si bien en las plantas de todas accesiones bajo estrés por inundación se redujo el índice

multiparamétrico PIabs, en la accesión Lt se observó menor reducción, y la mayor

reducción se produjo en LcT (50, 64, 68, 83 y 93 % de reducción en Lt, LtxLc, LcD, Lj

y LcT con respecto a sus controles respectivamente) (Figura 2.4).

Para el parámetro Fv/Fm no se encontró un efecto de la inundación con respecto a la

situación control en ninguna de las diferentes accesiones (datos no mostrados).


5

10

15

Control

Inundado

bc

a

b

c

a

c

a

b

bc

a 68%

93%

83%

50% 64%

PIa

bs

Figura 2.4. Efecto de 53 días de sumersión parcial (Inundado) sobre el índice de performance

(PIabs) en plantas de Lotus spp. de 5 meses de edad (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L.


japonicus). Los porcentajes muestran la reducción del índice de las plantas inundadas respecto a

las controles. Las columnas (medias, n=6, ±DE) sin ninguna letra en común, son


A B


10

20

30

cde

abc

ab

de

a

e

abcd

ab

bcdebcde

Asat

( m

ol

CO

2 m

-2 s

-1)


200

400

600

800

Control

Inundado

GS

24

La técnica de pérdida de electrolitos, usada como una estimación de integridad de

membranas, mostró interacción significativa entre los factores inundación y accesión

(p<0,05). Las accesiones LcT y Lj fueron las únicas que tuvieron una pérdida de

electrolitos en las plantas inundadas mayor con respecto a sus controles (Figura 2.5)

sugiriendo un mayor daño de membranas que en las restantes accesiones.

Lt LtxLc LcD SG Lj0

20

40

60

80

95

96

97

98

99

100

Control

Inundado

aab

c

ab

c

ab ab abab

Inte

gri

da

d d

e m

em

bra

na

s (

%)

Figura 2.5. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inundado) sobre la integridad de

membranas (I%), según la ecuación I% = (1–(t1 – t0)/(t2 – t0))*100 (detallada en la sección

2.3.1.6), en plantas de Lotus spp. de 5 meses de edad (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L.


japonicus). Las columnas (medias, n=6, ±DE) sin ninguna letra en común, son


2.4.3. Efecto de la sumersión parcial en la formación de aerénquima y en el

diámetro de la base de los tallos

Los cortes histológicos a 2,5 cm desde el ápice, de secciones transversales de raíces,

demostraron un claro incremento de la proporción de lagunas de tejido aerenquimático

en la situación de inundación en Lt, LtxLc y LcD (34,9, 32 y 31,3 % respectivamente),

lo que contrastó con lo observado en LcT y Lj (7,4 y 3,4 % respectivamente) (Figura

2.6.A y C). En la situación control, la proporción de lagunas de tejido aerenquimático,

es decir aerénquima constitutivo, también se diferenció (p<0,05) siendo Lt y LtxLc las

que presentaron mayores niveles sin diferenciarse entre sí (10,6 y 16,5 %

respectivamente). Las tres accesiones restantes, LcD, LcT y Lj, fueron las que menores

proporciones de aerénquima presentaron en situación control (3,1, 2,8 y 2,1 %

respectivamente).

El diámetro de tallos principales, medido a 3 cm desde la superficie del suelo (la

inundación cubrió hasta los primeros 6 cm), se incrementó en todas las accesiones en la

situación de inundación debido a la formación de un tejido hipertrófico esponjoso, pero

el grado de aumento dependió de las accesiones (interacción significativa entre los dos

25

factores, p<0,05). En las accesiones Lt, LtxLc y LcD el aumento en el diámetro fue

alrededor de 140 % con respecto a sus controles y en LcT y Lj el incremento fue

aproximadamente del 60 % (p<0,05; Figura 2.6.B).

Figura 2.6. Formación de tejido aerenquimático en secciones transversales de raíces y diámetro

de tallos primarios, de plantas de Lotus spp. de 5 meses de edad sometidas a un período de 55

días en condiciones de sumersión parcial (Inundado) y control (Control) (Lt: L. tenuis; LtxLc:

híbrido L. tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus

tetraploide y Lj: L. japonicus). A: Proporción de aerénquima con respecto al área de la sección

transversal de cada raíz. B: Diámetro de tallos primaros (mm) tomado a 3 cm desde la corona de

las plantas. Las columnas (medias, n=5 en A y n=14 en B, ±DE) sin ninguna letra en común,

son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05). C: Fotografías

representativas tomadas con microscopio óptico (10X) de secciones transversales de raíces

cortadas a 2,5 cm desde el ápice. Los asteriscos indican la presencia de aerénquima lagunar. La

letra “C” muestra la fila de las raíces controles y la letra “I” la fila de las inundadas. Las barras

negras sobre las fotografías representan 150 μm. Cada fotografía es representativa de 5

secciones de raíces de plantas diferentes.

2.4.4. Germinación de Lotus spp. en inundación

El porcentaje de germinación (%G) bajo inundación (5 cm) (relativizado al %G de cada

testigo a tiempo final) de las accesiones evaluadas, se distribuyó en tres grupos

claramente diferentes (Figura 2.7). Por un lado, se halló a la población de Lt con un %G

en promedio del 90 % (relativo a su testigo). En forma intermedia, y levemente por

encima del 60 %, se observaron los %G de LcD y LtxLc. Por último y sin llegar al 20 %

se encontraron las accesiones de LcT y Lj.

C

I

Lt LtxLc LcD LcT Lj

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Lt LtxLc LcD LcT Lj0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

Control

Inundado

a

d d

cd

dd

bc

aa

b

Ae

rén

qu

ima

s e

n r

aíc

es (

%)


1

2

3

4

5Control

Inundado

b

e

d

c

d

e

de

a a

de

141%

60% 59%

137% 143%

Diá

me

tro

de

ta

llo

s 1

° (m

m t

all

o-1

)

A B

C

26

Figura 2.7. Efecto de la inundación (5cm) sobre la germinación de 5 accesiones de Lotus spp.

(Lt: L. tenuis; LcD: L. corniculatus diploide; LtxLc: L. tenuis x L. corniculatus diploide; Lj: L.

japonicus; LcT: L. corniculatus tetraploide).

2.5. Discusión

En este capítulo se caracterizaron las respuestas de plantas adultas de 5 accesiones del

género Lotus sometidas a un estrés por sumersión parcial a comienzos de la primavera,

el cual representa una situación típica de la región de la Pampa Deprimida, y que a

continuación se discuten.

2.5.1. Efecto de la inundación sobre la producción de biomasa y variables

asociadas

La reducción en la materia seca de las plantas cultivadas en diferentes situaciones de

estrés, entre las que se encuentra la inundación, con respecto a sus controles, constituye

el parámetro más determinante para la clasificación de la tolerancia en diferentes

especies vegetales. Teniendo como referencia dicho criterio, recientemente Striker y

Colmer (2016) realizaron una clasificación de las especies leguminosas forrajeras más

frecuentemente cultivadas a nivel mundial, frente al estrés por anegamiento. Teniendo

en cuenta el mismo criterio, los resultados obtenidos en nuestro trabajo mostraron el

siguiente ranking de tolerancia para las accesiones evaluadas: Lotus tenuis (Lt) >

híbrido interespecífico L. tenuis x L. corniculatus (LtxLc) > L. corniculatus diploide

(LcD) > L. japonicus (Lj) > L. corniculatus tetraploide (LcT). Los resultados

observados para Lt, concuerdan con lo reportado en varios trabajos previos (Vignolio et

al., 1994; Mendoza et al., 2005; Striker et al., 2005; Real et al., 2008; Manzur et al.,

2009), donde se indica su tolerancia a condiciones similares de estrés. Es menester

destacar que la menor reducción de la biomasa total, se evidenció principalmente en la

parte aérea (Figura 2.2; Tabla 2.1).

La accesión más sensible a las condiciones de estrés, fue LcT (Figura 2.2.B). Sin

embargo, en el meta-análisis llevado a cabo por Striker y Colmer (2016) la especie L.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30

Días desde la siembra

%Lt

LcD

LtxLc

Lj

LcT

27

corniculatus se describió como tolerante, por tener una reducción de la biomasa del 35

% en promedio. Es oportuno tener presente que en la mayoría de los trabajos incluidos

en el análisis de esos autores, se utilizaron períodos más cortos de inundación que el

utilizado en nuestro trabajo. No obstante en otros reportes (Vignolio et al., 2002; Striker

et al., 2005; Real et al., 2008), al igual que lo observado en nuestros ensayos,

encontraron que LcT fue menos tolerante que Lt. Asimismo, bajo nuestras condiciones

experimentales, Lj presenta una reducción de su biomasa similar a LcT (Lj redujo el 66

% de la biomasa aérea con respecto a sus controles, mientras que LcT lo hizo en un 63

%). Otros autores han evaluado a Lj en condiciones de anegamiento. Recientemente

Striker et al. (2014) trabajando con dos ecotipos de dicha especie modelo (MG-20 y

Gifu B-129) y líneas recombinantes entre ambos ecotipos, reportaron una reducción de

biomasa solo del 32 %. Sin embargo, es importante considerar que el período de

anegamiento en dicho trabajo fue solo de 21 días, lo que presumiblemente justifique la

diferencia con nuestro trabajo. En otro trabajo realizado con el ecotipo Gifu B-129 de L.

japonicus, Rocha et al. (2010) reportaron al mismo como “altamente tolerante”,

trabajando con una solución hipóxica y con 28 días de anegamiento en un sustrato

inerte. Esto último difiere de nuestras condiciones, debido a que cuando se utiliza suelo

como sustrato (nuestro caso), la disminución de oxígeno provocada por el anegamiento

y la consecuente caída en el potencial rédox del suelo, pueden ejercer otros efectos en

detrimento del crecimiento y la fisiología de las plantas, que no podrían ser observados

trabajando con sustratos inertes. Un ejemplo constituye la posible toxicidad producida

sobre las plantas por elementos reducidos bajo estas condiciones como el Fe2+ o el Mn2+

(Ponnamperuma, 1984; Colmer, 2003).

Con respecto a la accesión diploide de colecta propia de L. corniculatus (LcD),

debemos destacar que este trabajo constituye el primero entre sus similares, donde se

estudia una accesión diploide de esta especie frente al estrés por anegamiento. En este

caso, si bien proporcionalmente esta accesión redujo su biomasa en mayor medida que

Lt y el híbrido LcxLt, también es cierto que esta reducción fue menor que en LcT. Esta

diferencia entre respuestas comparado a LcT se podría deber al nivel de ploidía, pues

recientemente se ha reportado que bajo condiciones ambientales con restricción de

macronutrientes como el N y el P (se debe recordar que en el caso de anegamiento la

adquisición de N se ve disminuida), las especies con mayor ploidía son más afectadas

que las de menor ploidía (Guignard et al., 2016). También es importante considerar que

la accesión LcD se colectó de una población originaria de la región de las malladas de la

Devesa de “El Saler” en Valencia (España), región que cuenta con varios factores de

estrés abiótico comunes a los encontrados en la Pampa Deprimida, y que podría tener

características adaptativas que le otorguen mayor tolerancia que su par tetraploide. Estas

características podrían ser transferidas a la descendencia híbrida. Con respecto a la

utilización de híbridos interespecíficos para programas de mejoramiento en el género

Lotus, un inconveniente común es la diferencia en el nivel de ploidía entre las especies.

De todas maneras se han logrado cruzamientos efectivos con diferentes técnicas como el

uso de L. tenuis autotetraploides para el cruzamiento con L. corniculatus tetraploides

mediante el rescate y cultivo de embriones (Grant, 1999), pero la baja fertilidad y la

poca viabilidad en las semillas de la descendencia, ha dificultado la aplicación

biotecnológica de estas herramientas. Sin embargo, el hecho de que nuestro grupo de

trabajo seleccionara una accesión española diploide, nos ha permitido trabajar con

materiales con el mismo nivel de ploidía (2n=2x), obteniéndose una población F1 con

alta viabilidad y fertilidad lo que evidencia un elevado potencial tecnológico (Escaray et

al., 2014).

28

En este sentido, en el presente trabajo se estudió la respuesta del híbrido interespecífico

obtenido en nuestro laboratorio, en vistas de evaluarlo como un material potencialmente

cultivable en suelos anegables. En estrés por inundación, dicho material híbrido tuvo la

menor reducción de biomasa después de la especie altamente tolerante L. tenuis (Figura

2.2 y Tabla 2.1).

En un trabajo previo, el mismo material híbrido obtenido en nuestro laboratorio, se

evaluó en cuanto a las características agronómicas de importancia mencionadas

anteriormente (el nivel óptimo de taninos condensados y producción de rizomas), y se

encontraron valores intermedios entre sus parentales (Escaray et al., 2014); lo cual fue

consistente con lo observado por Castillo et al., (2012) que trabajando con híbridos de

L. corniculatus y L. uliginosus tetraploides, generados por rescate de embriones,

también reportaron características agronómicas intermedias entre los parentales.

Otra característica de interés para los cultivares de las plantas forrajeras leguminosas,

radica en una alta relación hoja/tallo (H/T). Desde el punto de vista del mejoramiento,

este es un indicador importante de su calidad. En el caso de la alfalfa, este criterio es

ampliamente utilizado en programas de mejoramiento debido a su estrecha relación

positiva con la digestibilidad y con el consumo del forraje por parte del ganado bovino,

que surge de la mayor digestibilidad de las hojas en relación con los tallos (Kephart et

al., 1990; Lemaire y Allirand, 1993). Además, para esta misma especie, se observó que

es una característica con alta heredabilidad (Annicchiarico, 2015). Por su parte, para el

género Lotus, la relación H/T también ha sido propuesta como un criterio importante de

selección para facilitar la cantidad de taninos condensados de la ingesta del ganado. Es

dable recordar que en algunas especies de este género, los taninos son

proporcionalmente más abundantes en las hojas que en los tallos (por ejemplo en L.

corniculatus y L. uliginosus) (Häring et al., 2007). De las accesiones evaluadas en este

trabajo de tesis, LcD presentó la relación H/T más alta tanto en condición control como

en estrés. Es importante mencionar que en el material híbrido LtxLc, se observó la

segunda relación H/T más alta, lo que sugiere que también podría ser una característica

transferible por hibridación entre especies del género (Tabla 2.2). A su vez, vale la pena

aclarar que LcT, presentó la mayor reducción en la relación H/T en situación de estrés

con respecto a su control; lo que podría conducir a una fuerte reducción en la calidad

forrajera de esta especie en suelos anegables. Lo mencionado justificaría realizar

mayores esfuerzos en la generación de nuevos cultivares con características mejoradas

en la relación H/T.

En estreses por inundación que no comprenden la sumersión total de la planta

(anegamiento y sumersión parcial), los órganos que quedan en contacto directo con la

inundación, sufren mayores efectos que los que quedan fuera del alcance de ésta

(Smethurst y Shabala, 2003, Colmer y Voesenek, 2009). En este sentido, la relación

vástago/raíz (V/R) de las plantas inundadas de LcT, aumentó en promedio más de tres

veces con respecto a las controles, mientras que dicha relación en las plantas inundadas

de Lt y el híbrido interespecífico no se diferenció de las plantas controles (Tabla 2.2).

Cabe aclarar que si bien el aumento de la relación V/R en las plantas inundadas es

tomado frecuentemente como una mayor partición relativa de los fotosintatos hacia la

parte aérea de la planta (Rubio et al., 1995; Mendoza et al., 2005), en nuestras

condiciones experimentales, el fuerte aumento de la relación en LcT, también se debió a

una marcada desintegración del sistema radicular original. Esto último se evidenció

además por los valores negativos de la TCR de las raíces de LcT en el período de

inundación (Tabla S.2.3 del anexo). De esta manera, el “componente raíz” incluido en la

relación V/R, estaría influenciado a su vez por un equilibrio entre el mantenimiento de

29

las raíces formadas anteriormente al período de inundación, la desintegración de esas

raíces y las formadas durante dicho período.

La capacidad de formar raíces adventicias ha sido considerada como una característica

muy importante frente al estrés por anegamiento durante períodos prolongados (Colmer

y Voesenek, 2009; Voesenek y Bailey-Serres, 2015). Diversos autores han demostrado

una asociación positiva entre la tolerancia a períodos prolongados de inundación y el

número de raíces adventicias, en diferentes especies vegetales (Real et al, 2008; Song et

al, 2011). En coincidencia con la literatura, en nuestros resultados se observó que la

accesión más tolerante (Lt) presentó un mayor número de raíces adventicias (Tabla 2.1).

Por otro lado, si bien el número de raíces entre LcT y LtxLc fue similar, es importante

destacar que el tamaño de las mismas en LcT fue inferior que en LtxLc (Figura 2.2.A,

comparar las plantas inundadas de las fotografías entre LtxLc y LcT).

Con respecto a las tasas de crecimiento relativo (TCR) de las diferentes fracciones de

las plantas, las mismas también reflejaron las respuestas contrastantes de las accesiones

evaluadas frente a la inundación. La TCR del total de la biomasa de la planta (TCRt), ha

sido utilizada para evaluar el crecimiento de plantas frente a estrés por anegamiento en

diferentes especies (Alamri et al., 2013; Imaz et al., 2015), incluyendo Lotus spp.

(Teakle et al., 2010). En nuestro trabajo, la TCRt de las plantas de LtxLc durante el

período de inundación mostró ser la más alta, tanto en el tratamiento control como en el

de estrés (Tabla 2.3); las TCR de LcT y Lj fueron las más afectadas, siendo esto

consistente con los resultados obtenidos de biomasa acumulada. Es importante

mencionar que aunque LtxLc presentó una alta TCR con respecto a las demás

accesiones, tuvo menor acumulación de biomasa que Lt en la cosecha de fin de

inundación. Esto se debió a que la materia seca acumulada hasta el inicio del período de

inunación de LtxLc fue menor que la de Lt. Y como el valor que toma la TCR es

relativo precisamente al peso inicial de cada accesión en el comienzo del período, hace

que sean posibles valores más altos en una planta con menor acumulación final de

biomasa. Los datos sugieren que LtxLc tendría un crecimiento inicial en los meses

otoño-invernales más lento que las demás accesiones, pero durante los períodos de

inundación, y ya comenzada la primavera, incrementaría su crecimiento a tasas

elevadas, alcanzando o incluso superando los valores de acumulación de biomasa del

resto de las accesiones.

2.5.2. Efecto de la inundación sobre la fijación de CO2, el estado del PSII y la

estabilidad de membrana

Previamente ha sido reportado que el anegamiento modifica la fijación de carbono de

las plantas (Else et al., 1996; Insausti et al., 2001), observándose reducciones de la tasa

de fotosíntesis neta (A) y de la conductancia estomática (gs) en diferentes especies

(McCarron et al., 1998, Ashraf, 2003). En nuestras condiciones, los resultados revelaron

que la Asat no se redujo en las plantas inundadas de Lt y LtxLc y sí se redujo

fuertemente en LcT y Lj con respecto a sus respectivos controles, (Figura 2.3.A). Este

resultado fue consistente con los valores de acumulación de biomasa de esas accesiones

durante el período de inundación (Figura 2.2) y con los resultados obtenidos por otros

autores en L. corniculatus (Striker et al., 2005). A grandes rasgos, nuestros resultados

sugieren que esta respuesta podría estar vinculada al componente de difusión de gases,

debido a la tendencia que presentaron los valores de gs (Figura 2.3.B). Sin embargo, las

reducciones durante anegamientos de largo plazo también podrían estar asociadas a

daños en el fotosistema II (PSII) como ha sido demostrado previamente en alfalfa

30

(Smethurst y Shabala, 2003; Irving et al., 2007). En este sentido, en nuestro trabajo se

encontraron indicios de que se afectaron algunos componentes del PSII, lo cual estuvo

evidenciado por el índice multiparamétrico PIabs (Figura 2.4). El indicador de la

eficiencia cuántica máxima del PSII (Fv/Fm), no se modificó fuertemente en el estrés

estudiado, aunque mostró una tendencia de disminución en la accesión más afectada

(LcT) y no en las demás accesiones.

Cabe mencionar que el Fv/Fm es usualmente utilizado para caracterizar el estado

fisiológico de las plantas sometidas a diferentes tipos de estreses abióticos. Sin embargo

en condiciones no muy severas de estrés, el Fv/Fm carece de sensibilidad para

diferenciar la respuesta del PSII a los cambios ambientales, tal como se reportó por

ejemplo en el estrés a temperaturas bajas en oscuridad para soja (Van Heerden et al.,

2004, Strauss, 2006). Nuestros resultados concordaron con reportes previos que indican

que bajo condiciones no muy severas de estrés, el PIabs es un parámetro más sensible

permitiendo diferenciar con mayor precisión los efectos negativos de la inundación

entre las accesiones que presentaron similar tolerancia a dicho estrés. La diferencia de

información entre ambos parámetros radica en que el PIabs es una expresión

multiparámetrica que combina tres funciones principales (absorción de energía,

excitación de la energía atrapada y conversión de la energía de excitación para el

transporte de electrones) y el Fv/Fm sólo relaciona la fluorescencia inicial (F0) y la

fluorescencia máxima (Fm) del PSII (Strasser et al., 2000).

A su vez una disminución de la fotosíntesis podría estar asociada a una mayor

producción de especies reactivas del O2 (EROs) (Foyer y Shigeoka, 2011). Una

cantidad excesiva de las EROs, podría conducir a daños en membranas celulares (Foyer

y Noctor, 2005). El daño en las mismas ha sido estimado en diversos trabajos mediante

el método de pérdida de electrolitos (Bajji et al, 2002; Koyro et al, 2013). Bajo nuestras

condiciones de estudio se evidenció que LcT y Lj sometidos a la situación de

inundación perdieron más electrolitos que las demás accesiones (Figura 2.5). Esto

podría estar indicando un mayor daño de las membranas en estas dos accesiones, que

estaría en correspondencia a que fueron las más afectadas en la mayoría de los demás

parámetros.

2.5.3. Generación de aerénquima en inundación

El transporte de O2 a través de los tejidos desde la parte aérea de la planta, hacia

órganos que están inundados, es trascendental para mantener la oxigenación de las

raíces (Armstrong, 1979; Colmer, 2003). Como consecuencia, la baja resistencia interna

al movimiento de los gases debida a una alta porosidad de los tejidos (aerénquima) es

una característica que ha sido ampliamente asociada a la tolerancia de diversas plantas a

condiciones de inundación (Armstrong, 1979; Laan et al., 1989; Colmer y Voesenek

2009). La porosidad se puede deber tanto a tejido aerenquimático constitutivo (aquel

que ya está formado incluso en condiciones de libre drenaje) como al formado por

efecto de la inundación.

Striker y Colmer (2016), realizando un meta-análisis de diversos trabajos de

leguminosas forrajeras sometidas a anegamiento/hipoxia, sugieren un umbral de

porosidad de raíces (10-12 %), en que las especies que quedan por debajo del mismo,

sufren severas reducciones en la biomasa de las plantas. Nuestros resultados concuerdan

con este último concepto, ya que las accesiones con mayor capacidad de desarrollar

aerénquima en las raíces adventicias (Lt, LtxLc y LcD), son las que menos reducciones

de biomasa sufrieron durante el estrés (Figura 2.6). Estos resultados también

31

concuerdan con lo observado en trabajos previos en L. tenuis (Striker et al., 2005, 2006;

Teakle et al., 2006). Sin embargo Striker et al., (2014) trabajando con L. japonicus (dos

ecotipos y 94 líneas recombinantes entre ellos) no encontraron correlación entre la

proporción de aerénquima y la acumulación de biomasa aérea, ni tampoco con otras

características del vástago de las plantas de esa especie. Esa falta de conexión entre la

proporción de aerénquima de las raíces y las características del vástago pudo deberse

principalmente a que se trató de la especie, que al menos en nuestras condiciones, fue

una de las más sensibles, por lo que no tendría la capacidad de desarrollar

adecuadamente una red de tejido aerenquimático y también del período de inundación al

cual se sometieron las plantas en dicho trabajo, que fue mucho menor al aplicado en

nuestro trabajo (21 días frente a 55 días).

Por otra parte en nuestras condiciones, al tratarse de una inundación del tipo de

sumersión parcial (6-7 cm sobre la superficie del suelo), significó que las bases de los

tallos quedaran sumergidas. Esto condujo a la formación de una hipertrofia, un tejido

secundario blanco muy esponjoso, el cual podría contener una gran proporción de

aerénquima secundario (Jackson y Armstrong, 1999; Yamauchi et al., 2013) como los

reportados previamente en Melilotus siculus (Teakle et al., 2011; Verboven et al.,

2012). Para estimar esta característica, utilizamos la medición del diámetro en la base de

los tallos sumergidos, encontrando un incremento notoriamente superior, en Lt, LtxLc y

LcD con respecto a sus correspondientes controles, lo que contrasta claramente con lo

observado en LcT y en la especie modelo Lj, coincidiendo esto con lo que se observó en

la formación de aerénquima en raíces (Figura 2.6). Esto sugiere que la formación de este

tejido esponjoso en la base de los tallos, podría estar relacionada también a la capacidad

de formar aerénquima en las raíces. En este sentido, se ha reportado una gran

importancia de ese tipo de tejido secundario en la oxigenación de las raíces sumergidas

(Shimamura et al., 2002; Teakle et al., 2011).

2.5.4. Período de recuperación

Mediante una revisión bibliográfica hemos detectado que los trabajos en los que se

analiza este tipo de estrés, hay pocos reportes que incluyan la evaluación del período de

post-inundación o de recuperación (Striker, 2012). De hecho, aproximadamente solo el

20 % de los estudios de inundación de las leguminosas forrajeras perennes han incluido

un período de recuperación en la evaluación de las respuestas a este estrés (Striker y

Colmer, 2016). Entendiendo que evaluar la recuperación post-inundación constituye un

factor muy importante, ya que se ha encontrado que las respuestas de las plantas durante

el período de inundación, no siempre concuerdan con las respuestas que muestran una

vez finalizada la exposición al estrés (Striker, 2012, Parad et al., 2013). Nuestros

resultados demostraron que entre las plantas que son sometidas al período de

inundación, y posteriormente a un período 35 días de recuperación, las accesiones de Lt

y LtxLc tuvieron una recuperación superior a las demás accesiones (Figura 2.2.D). En

este sentido, ambas accesiones presentaron una alta acumulación de biomasa aérea,

tanto en términos absolutos (duplicando la biomasa aérea lograda por las accesiones de

L. corniculatus) como en comparación con sus respectivos controles.

En general, podemos concluir que, al menos en nuestras condiciones, las plantas que

demostraron mayor tolerancia durante el período de inundación, también lo hicieron en

el período de recuperación. Sin embargo, Striker et al. (2012) reportaron que tres de las

especies de Lotus que también se utilizaron en nuestro trabajo, respondieron en el

período de recuperación de manera opuesta a lo observado durante el período de

32

inundación. Estas aparentes contradicciones, podrían justificarse por el tipo de estrés

realizado (sumersión total) y por el estado ontogénico evaluado (plántulas) en dicho

trabajo.

Por otro lado, Vignolio et al. (1994), en coincidencia con lo observado en nuestros

estudios, reportaron que después de un período de 42 días de inundación y 90 días de

recuperación, las plantas de L. tenuis alcanzaron valores de biomasa total similares a los

de las controles. Dicha observación era simultánea con lo observado en plantas de L.

corniculatus, las cuales presentaron una débil recuperación en el período posterior al del

estrés.

Por su parte, la especie modelo L. japonicus, respondió muy débilmente en el período

de recuperación post-estrés, con bajos valores en la acumulación de biomasa y en las

tasas de crecimiento, perdiendo hojas y raíces con respecto al período de inundación. Es

importante mencionar que esta tendencia se observó tanto en las plantas sometidas al

estrés por anegamiento como las que se cultivaron en situación control (Tabla 2.1). En

cierto sentido podemos considerar estas respuestas como previsibles, ya que la especie

modelo se trata de una especie de ciclo anual, y en la fecha de cosecha del final del

período de recuperación, las plantas se encontraban finalizando su ciclo biológico,

desarrollando y madurando vainas y semillas. Es importante destacar que una búsqueda

bibliográfica no nos ha permitido encontrar en la especie modelo otros estudios de

estrés por inundación a largo plazo.

Para nuestro estudio también hemos tenido en cuenta que, en términos de uso forrajero

en las condiciones edafo-climáticas de la región de la Pampa Deprimida, es de mucha

importancia conocer la respuesta de las plantas una vez que haya terminado el período

de anegamiento primaveral, porque constituye el período de mayor utilización de este

recurso en la producción ganadera. Asimismo se ha demostrado que el pastoreo

temprano, previo a la finalización del período de inundación, provocaría la desaparición

de estas leguminosas de las pasturas, como consecuencia del pisoteo del ganado (Striker

et al., 2006). Teniendo en cuenta todo ello, nuestros resultados sugieren que el híbrido

LtxLc sería tan apto como Lt en ofrecer forraje para el ganado, pues alcanza el mismo

nivel de acumulación de biomasa aérea luego de 35 días de recuperación (Figura 2.2.D).

2.5.5. Efecto de la inundación sobre la germinación

Los resultados encontrados sugieren que habría una conexión entre las respuestas de las

accesiones más tolerantes en estado de planta adulta y la germinación bajo inundación.

Esto podría estar debido a que la profundidad del agua en nuestras condiciones de

estudio, no fue muy profunda (5 cm), y aquellas accesiones que estarían más adaptadas

a inundaciones frecuentes, podrían establecerse tempranamente una vez retirada la

inundación. En este sentido, el establecimiento temprano post-inundación significaría

una ventaja adaptativa, que justificaría, en parte, la exitosa naturalización de L. tenuis en

la Pampa Deprimida.

Por otro lado, desde otro punto de vista, también para la etapa de germinación, Vignolio

et al. (1995) estudiando períodos largos de anegamientos sobre semillas de L. tenuis y

L. corniculatus, le adjudicaron mayor tolerancia a L. tenuis por presentar la capacidad

de mantener mayor cantidad de semillas duras viables que L. corniculatus, sugiriendo

que la mayor dureza de las mismas permitiría que persistan viables para el momento en

que el agua se disipe. En nuestro trabajo esto no se contempló porque se escarificaron

químicamente las semillas antes de comenzar con el tratamiento de inundación.

33

2.6. Conclusiones

En este capítulo se analizó la respuesta de cinco accesiones de Lotus a un período de

estrés prolongado de anegamiento, y a su posterior período de recuperación. También se

evaluó la germinación durante el anegamiento. Los resultados obtenidos tomados en

forma conjunta, demostraron que L. tenuis y el híbrido interespecífico presentaron

mejores características de respuestas a la situación de estrés (en lo que se refiere a la

acumulación de biomasa, al desarrollo de tejido aerenquimático y de raíces adventicias,

a la tasa fotosintética, integridad de membranas, entre otras características) y también

mostraron una mejor recuperación post-inundación en cuanto a acumulación de

biomasa, en comparación con las dos accesiones de L. corniculatus y la de L. japonicus

que se afectaron en mayor grado en dichas características. En este sentido, la tolerancia

superior de L. tenuis se observó en la mayoría de las variables morfológicas y

fisiológicas evaluadas. Sin embargo, con el objetivo en el que se pretende disponer

forraje con niveles de taninos condensados foliares adecuados en ambientes anegables,

se concluye que entre los materiales evaluados, el material híbrido es el más apto en

cumplir con las dos condiciones (se tuvo en cuenta entre las dos accesiones de L.

corniculatus y el híbrido interespecífico L. tenuis x L. corniculatus). Además, entre las

dos accesiones de L. corniculatus, teniendo en cuenta todos los parámetros antes

mencionados, se pudo concluir que la población diploide de colecta propia fue más

tolerante que el material comercial tetraploide. Como conclusión general, la hibridación

interespecífica en el género Lotus podría constituir una herramienta útil para

incrementar la tolerancia al estrés por inundación de materiales con otras características

forrajeras importantes (como el nivel de taninos condensados foliares, rizomas, etc.).

34

3. CAPÍTULO 3. EFECTOS DEL ESTRÉS MIXTO DE INUNDACIÓN Y

SALINIDAD EN Lotus spp.

35

3.1. Introducción

3.1.1. La salinidad y las plantas

En un sentido amplio, incluyendo el punto de vista productivo, el problema de salinidad

edáfica existe si las concentraciones de sales en el suelo, provocan reducciones en el

crecimiento de las plantas, así como en el rendimiento de los cultivos (Ayers y Westcot

1985). Se estima que cerca de 800 millones de hectáreas están afectadas por salinidad,

las cuales cubren más del 6 % de la superficie terrestre del mundo (FAO, 2008).

Además de la salinidad natural, la salinización secundaria (antrópica) debido a

irrigaciones de cultivos con aguas salinas y otras prácticas agrícolas inadecuadas, se ha

convertido en una amenaza para la producción agropecuaria (Pannell y Ewing, 2004).

El impacto de la salinidad en las plantas es esencialmente observado desde dos

perspectivas: el estrés osmótico y la toxicidad iónica (Munns, 2002). El estrés osmótico

es causado por los iones en la solución del suelo, que disminuyen la disponibilidad de

agua para las raíces. La toxicidad iónica tiene lugar cuando las raíces de las plantas

absorben Na+ y/o Cl– y esos iones se acumulan en niveles perjudiciales en las hojas

generando disrupción de las estructuras de enzimas, dañando organelas e interfiriendo

con el metabolismo de la célula provocando desequilibrios iónicos y deficiencias

nutricionales (revisado por Munns y Tester, 2008). Los efectos osmóticos se producen

de manera inmediata, mientras que la toxicidad iónica requiere de un tiempo mayor

(días o semanas) (Munns, 2002).

Las plantas superiores poseen diferentes mecanismos al enfrentar situaciones de estrés

salino destinados a prevenir el efecto tóxico de los iones nocivos en sus tejidos. Estos

mecanismos pueden ser agrupados en dos: 1- tolerancia por “exclusión” de Na+ y Cl– y

2- tolerancia “de tejido”, sobrellevando concentraciones altas de esos iones en los

propios tejidos.

Entre los mecanismos que se denominan de “exclusión”, están incluidos aquellos que

extraen los iones nocivos de la planta, por ejemplo mediante glándulas especializadas de

secreción de sales como ocurre en las gramíneas perennes Diplachne fusca y Distichlis

spicata (Qureshi et al., 1982; Yensen et al., 1988), y aquellos que directamente no

permiten la entrada de los iones nocivos desde la solución del suelo, a las células de las

raíces (Teakle y Tyerman, 2010). Si bien, en la mayoría de las plantas, los iones Na+ y

Cl– son efectivamente excluidos por las raíces cuando absorben agua del suelo, se ha

demostrado que las halófitas (aquellas que pueden cumplir su ciclo de vida en

concentraciones altas de salinidad del suelo) son capaces de mantener la exclusión de

iones a mayor salinidad que las glicófitas (aquellas que no logran completar su ciclo de

vida en concentraciones altas de salinidad del suelo) (Munns, 2005).

Por otro lado, los mecanismos que otorgan tolerancia “de tejido”, requieren de la

adecuada compartimentalización a nivel subcelular de los iones, con el objetivo de

impedir que su acumulación en el citoplasma alcance niveles tóxicos (Munns y Tester,

2008). Cabe mencionar, que las enzimas distribuidas en el citoplasma, tanto de plantas

halófitas como glicófitas, son igualmente sensibles al efecto tóxico de estos iones

(Flowers et al., 1977).

Ambos tipos de mecanismos de tolerancia, en mayor o menor medida, requieren del

transporte activo de iones con gasto de energía. Esto último toma especial relevancia en

el caso de los estreses mixtos de salinidad e inundación, pues como se retomará en el

siguiente apartado de la tesis (3.1.2), la inundación del suelo conduce a un déficit

energético en las plantas.

Existen otros efectos importantes provocados por la salinidad que están relacionados en

mayor o menor medida con lo anterior, como por ejemplo: incrementos significantes de

36

especies activas del oxígeno en raíces (Xie et al., 2011) y en hojas (Tanou et al., 2009) e

interferencia en la homeostasis del K+ (Maathuis y Amtmann, 1999; Shabala y Cuin,

2008), lo que conlleva a la activación de los mecanismos de respuesta conducentes a

una muerte celular acelerada (Shabala, 2009; Joseph y Jini, 2010).

3.1.2. Salinidad e inundación

En el mundo, una gran parte de los suelos salinos se encuentra agravada por el

anegamiento. Ambas situaciones del suelo son causantes conjuntas de estrés vegetal

(Barrett-Lennard, 2003; Bennett et al., 2009; Barrett-Lennard y Shabala, 2013). Las

causas del anegamiento en suelos salinos pueden deberse a una irrigación intensiva en

sistemas de producción agrícola (Smedema y Shiati, 2002), al ascenso de las napas

freáticas salinas (Hatton et al., 2003), a la intrusión de agua de mar a los ambientes

costeros (Carter et al., 2006), a la estructura débil del suelo que reduce el drenaje y/o a

las inundaciones estacionales de áreas salinizadas (Drew et al., 1988; Rengasamy et al.,

2003; Smedema y Shiati, 2002).

A pesar de diversos estudios sobre los estreses individuales de salinidad y anegamiento

de suelos (también estudios de anoxia o hipoxia), pocas investigaciones han sido

llevadas a cabo sobre la combinación de los mismos. Al estar combinados, los cuales

pueden interactuar afectando a las plantas más severamente que la suma de ambos

efectos en forma independiente (Barrett-Lennard, 2003; Teakle et al., 2010).

En plantas glicófitas, la mayoría de las investigaciones coinciden en la observación de

que la interacción de ambos estreses, en comparación al estrés por salinidad de manera

aislada, causa un mayor incremento en la tasa de transporte de Na+ y Cl– hacia el

vástago, y una reducción en la tasa de transporte de K+. También interactúan en sus

efectos sobre las relaciones iónicas, sobre el crecimiento y la supervivencia de las

plantas (Drew et al., 1988; Galloway y Davidson, 1993; Barrett-Lennard et al., 1999;

Barrett-Lennard, 2003).

El hecho de que la hipoxia combinada con salinidad a nivel de las raíces pueda causar

aumentos en las concentraciones de Na+ y/o Cl– en hojas, es más claro para las plantas

glicófitas que para las halófitas (Barrett- Lennard, 2003; Colmer y Flowers, 2008). En

las glicófitas, Barret-Lennard (2003) ha reportado que la hipoxia causó más del 30 % de

incremento en la concentración de Na+ o Cl– en vástagos u hojas en 20 de las 21

especies evaluadas. Por el contrario, en halófitas, incrementos de esta magnitud solo

ocurrieron en 7 de las 15 especies evaluadas bajo condiciones experimentales similares

(Colmer y Flowers, 2008).

El anegamiento, al reducir la aireación del suelo y por lo tanto el suministro de oxígeno

a las raíces, inhibe fuertemente la respiración aeróbica, disminuyendo drásticamente la

producción de ATP (Datta y de Jong, 2002; Smedema y Shiati, 2002; Rengasamy et al.,

2003; Bailey-Serres y Voesenek, 2008; Bennett et al., 2009), lo que podría interferir en

los mecanismos que las plantas poseen para hacer frente a la toxicidad de los iones Na+

y Cl–, ya que para el transporte activo de iones se requiere energía para mantener el

gradiente de H+ a través de las membranas. Esto último implica la actividad de las

bombas H+-ATPasas, siendo esencial para activar el transporte activo secundario, por

ejemplo de Na+ (Greenway y Munns, 1980; Barrett-Lennard, 2003; Munns, 2005;

Teakle et al., 2007). En este sentido, existe una gran cantidad de evidencias que

sugieren que la hipoxia afecta la selectividad de membranas y el transporte de nutrientes

(Buwalda et al., 1988; Morard y Silvestre, 1996).

37

En el caso particular del Na+, su transporte hacia el vástago depende de numerosos

procesos que ocurren tanto en raíces como en la parte aérea de la planta. En ellos se

incluyen, la absorción y la exclusión de Na+ hacia y desde las raíces, la acumulación de

dicho catión en la vacuola de células radicales y posteriormente la captación del mismo

desde el xilema. Cada uno de estos procesos depende de diversas proteínas

generalmente de membrana (Tester y Davenport, 2003; Volkov y Amtmann, 2006; Byrt

et al., 2007). Por lo tanto, el transporte de Na+ en raíz, que depende de gradientes

transmembranales, podría ser afectado por el déficit energético en hipoxia, lo que

incluye: i) transportadores de alta afinidad que extraen Na+ desde el xilema (por

ejemplo HKT; James et al., 2006; Byrt et al., 2007), ii) antitransportadores Na+/H+ de

membrana plasmática que excluyen Na+ (por ejemplo: SOS1; Martinez-Atienza et al.,

2007) o iii) intercambiadores de Na+/H+ a nivel de tonoplasto, los cuales acumulan Na+

en vacuolas de células, como es el caso de NHX1 (Xue et al., 2004; Pardo et al., 2006).

El secuestro vacuolar de Na+ protege a las enzimas citoplasmáticas y, simultáneamente

contribuye a mantener la turgencia celular (Flowers et al., 1977; Greenway y Munns,

1980), por lo tanto, los transportadores NHX1 cumplen un rol importante en la

tolerancia a la salinidad (Apse et al., 1999) y bajo el estrés mixto de salinidad e hipoxia

(Teakle et al., 2010). En este sentido, bajo condiciones de estrés mixto de salinidad e

hipoxia en plantas de L. tenuis, y a diferencia de lo observado en L. corniculatus, se ha

encontrado que son capaces de sostener la expresión del gen NHX1 en células radicales

(Teakle et al., 2010).

En general, para el caso del anión Cl– existe menor información que para el Na+, pero se

ha reportado que la regulación del transporte del Cl– y su exclusión desde el vástago,

están correlacionados con la tolerancia a la salinidad en muchas especies leguminosas

(revisado por Teakle y Tyerman, 2010).

3.1.3. Lotus spp. para ambientes salinos con inundaciones frecuentes

Teniendo en cuenta el estrés causado por la combinación de las restricciones de

salinidad e inundación, resultan muy interesantes las especies del género Lotus, ya que

se sabe que varias especies de este género se destacan por una excelente adaptabilidad a

los ambientes restrictivos, lo que las diferencia de otras leguminosas forrajeras

(Blumenthal y McGraw, 1999, Escaray et al., 2012). Tal cual se ha mencionado

anteriormente en la presente tesis, la Pampa Deprimida además de los períodos

frecuentes de anegamiento, sufre problemas de salinidad en gran parte de su superficie,

otorgándole a los suelos de la región características hidro-halomórficas restrictivas para

el establecimiento y persistencia de las forrajeras leguminosas tradicionales.

Entre las especies del género Lotus, se han reportado mayores niveles de tolerancia

frente al estrés mixto, inundación y salinidad, de L. tenuis con respecto a L.

corniculatus. Esto resulta consistente con lo observado en condiciones de campo, ya

que L. tenuis se encuentra naturalizado en los ambientes restrictivos de la Pampa

Deprimida, mientras que las poblaciones comerciales tetraploides de L. corniculatus, no

lo están. Por otra parte, se ha observado que si bien L. tenuis persiste en tales

condiciones, la disminución en su rendimiento (biomasa) es mayor si se la compara con

la observada en otros ambientes inundables pero no salinos. Teniendo en cuenta esta

observación, se justifica el intento por desarrollar materiales forrajeros que puedan

producir forraje en las condiciones más desfavorables.

Por otro lado, es conocida la existencia de poblaciones de L. corniculatus capaces de

crecer y desarrollarse en regiones salinas, frecuentemente inundables, en ambientes

38

cercanos al mar Mediterráneo de los cuales son nativas. En este sentido, nuestro grupo

de trabajo ha identificado una población de L. corniculatus, detallada en el apartado 1.3.

de la presente tesis, con la particularidad de haber sido colectada de ambientes salinos,

frecuentemente inundables y además de ser diploide (Escaray et al., 2014). Es

importante destacar, que la tasa de crecimiento en situaciones control de esa población

de L. corniculatus, es menor que la de las especies del género Lotus que habitualmente

se utilizan como forrajeras. A su vez, con el objeto de obtener un híbrido

interespecífico, se utilizó como segundo parental una población naturalizada de L.

tenuis colectada de los bajos inundables de la Pampa Deprimida. Teniendo en cuenta los

orígenes en que se adaptaron dichos parentales, se presumía que el híbrido

interespecífico tendría una mejor respuesta frente al estrés mixto de inundación y

salinidad, tal vez adoptando los mecanismos de tolerancia de ambos parentales, con una

mejor performance en la producción de biomasa. Por lo antedicho hemos planteado

como objetivo parcial del presente trabajo de tesis, estudiar al híbrido interespecífico

frente al estrés mixto de inundación y salinidad, mediante determinaciones de biomasa,

fisiológicas, de expresión de genes involucrados en la compartimentalización de iones

tóxicos, y compararlo con sus parentales, así como con un cultivar comercial tetraploide

de L. corniculatus (San Gabriel).

3.2. Hipótesis

La mayor tolerancia frente al estrés mixto de inundación y salinidad que poseen algunas

accesiones de Lotus spp. se debe a la capacidad de mantener activos los mecanismos

que tienen para tolerar al estrés por salinidad, aún bajo condiciones de sumersión

parcial:

a) Mecanismos que evitan la acumulación perjudicial de iones en vástago (“de

exclusión”).

b) Mecanismos de compartimentalización subcelular de iones nocivos (“de tejido”).


3.3.1. Material vegetal

Se utilizó una población naturalizada en la Pampa Deprimida de L. tenuis (Lt); un

cultivar comercial tetraploide de L. corniculatus (LcT); una población diploide de L.

corniculatus (LcD) y la primera generación del material híbrido de población L. tenuis x

L. corniculatus diploide (LtxLc).

3.3.2. Sistema de cultivo y tratamientos

La escarificación química con ácido sulfúrico de las semillas y la obtención de plántulas

se realizó de la misma manera que lo explicado para la sección 2.3.1.2. de este trabajo

de tesis.

Las plántulas así obtenidas se transplantaron a macetas de 300 cm3 de capacidad, con

una mezcla de arena y perlita (en proporción 1:1) estéril. Las macetas con una plántula

por cada una de ellas, se colocaron en una cámara de cultivo en condiciones controladas

con un fotoperiodo de 16/8 horas a 24 °C / 21 °C ± 2 °C (día/noche) y una humedad

relativa de 55/65 ± 5 %. La intensidad de luz (250 μmol fotones m-2 s-1) fue provista por

39

lámparas fluorescentes Grolux (F 40W). La solución de riego utilizada fue Hoagland 0,5

X (Hoagland y Arnon, 1950) conteniendo 3 mM KNO3; 2 mM Ca(NO3)2.4H2O; 1 mM

MgSO4.7H2O; 0,5 mM NH4H2PO4; 50 μM NaFeO8EDTA.2H2O; 4,5 μM MnCl2, 23 μM

H3BO3, 0,16 μM CuSO4.5H2O, 0,09 μM ZnSO4.7H2O y 0,06 μM Na2MoO4.2H2O.

Luego de transcurridos 21 días desde el transplante, las plantas se sometieron a una

aclimatación escalonada de los tratamientos con salinidad y luego se aplicaron los

diferentes tratamientos completos mantenidos por otros 21 días y que son detallados a

continuación:

- Control (Cont), las plantas usadas como controles continuaron en las condiciones de

los primeros 21 días de crecimiento, es decir regadas con solución de Hoagland 0,5 X

con libre drenaje.

- Salinidad (NaCl), agregado de NaCl progresivamente a la solución nutritiva hasta

alcanzar la concentración 150 mM en condiciones de drenaje libre.

- Inundación (Inund), se mantuvo sin drenaje la solución nutritiva sobre 3 cm desde el

nivel del sustrato. Antes de cada riego, la solución nutritiva se burbujeó con gas N2 para

disminuir el nivel de O2 a niveles considerados como hipóxicos.

- Salinidad e inundación (NaCl-Inund), combinación de los dos tratamientos anteriores,

es decir las plantas se irrigaron con solución nutritiva Hoagland 0,5 X salina hipóxica

sin drenaje.

Para evitar efectos de un “choque” osmótico, los tratamientos de salinidad y mixto de

inundación-salinidad, se llevaron a cabo con incrementos progresivos en la

concentración salina (aclimatación). Las plantas inicialmente recibieron 50 mM de

NaCl y la concentración fue incrementándose (25 mM cada 3 días) durante 12 días hasta

alcanzar la concentración final de 150 mM de NaCl.

La solución nutritiva utilizada en las plantas que se sometieron al tratamiento de

inundación y mixto inundación-salinidad contuvo 0,1 % (p/v) de agar y además se

burbujeó con nitrógeno gaseoso (N2). Este procedimiento disminuye el nivel de O2

disuelto a menos del 10 % que en la solución saturada en aire (Gibbs y Greenway,

2003), mientras que el agar disuelto previene los movimientos convectivos y por lo

tanto, evita la re-oxigenación de la solución nutritiva (Wiengweera et al., 1997).

Después del período de aclimatación de 12 días, es decir una vez alcanzada la

concentración de 150 mM de NaCl en los tratamientos de salinidad y mixto, las plantas

de los 4 tratamientos se mantuvieron en estas condiciones durante 21 días hasta la

cosecha de la biomasa total de las plantas.

3.3.3. Cosecha de biomasa

Transcurridos los 21 días de aplicación de tratamientos completos, se realizó la cosecha

del total de la biomasa por planta, lavándola cuidadosamente con agua destilada, y

separándola en 4 fracciones: hojas apicales (4 hojas apicales de cada tallo); hojas

basales (todas las hojas de cada planta excepto las apicales); tallos y raíces. Las

fracciones de biomasa así separadas se colocaron en sobres de papel y se secaron en

estufa a 70 °C durante 3 días hasta peso constante. Luego de secadas las muestras, se

pesaron con ayuda de una balanza analítica.

40

3.3.4. Determinación del intercambio neto de gases

Un día antes de la cosecha de la biomasa, es decir a 32 días del inicio de los

tratamientos de inundación y de la aclimatación salina, se determinó el intercambio neto

de gases de la misma manera que lo detallado en el capítulo anterior en la sección

2.3.1.4.

3.3.5. Determinación de parámetros de la eficiencia del fotosistema II

Dos días antes de la cosecha de la biomasa se determinaron los parámetros de la

eficiencia del fotosistema II a través de la fluorescencia transitoria de la clorofila, de la

misma manera en que se explicó para el capítulo 2 en el apartado 2.3.1.5.

3.3.6. Determinación de la concentración de iones

De las fracciones de biomasa seca de cada planta, correspondientes a hojas apicales,

hojas basales y raíces, se tomó una alícuota de 10 mg finamente molida. En esa alícuota

se determinó la concentración de los iones Na+ y K+. El método consistió en agregar a

cada muestra 1 ml de HCl 0,1 N y se incubó durante dos horas a 60 ºC. Luego se

enfriaron a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 rpm. Se

extrajo el sobrenadante para utilizarlo en la determinación de las concentraciones de

Na+ y K+ mediante un fotómetro de llama (Marca Zeltec, Modelo ZF 250). Los valores

obtenidos se interpolaron en una curva de calibración para los dos iones determinados.

Por otro lado, también se determinó la concentración de iones Cl–. Para ello, 25 mg de

muestra seca finamente molida, se digerió en tubos cerrados, con una solución

extractora compuesta por 1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 %, 1 ml de ácido nítrico

concentrado y una gota de alcohol isoamílico durante 15 minutos a temperatura

ambiente. Tras la digestión, se llevó la solución resultante a 10 ml con agua destilada y

ésta se centrifugó durante 5 minutos a 10.000 rpm. Para las muestras correspondientes a

plantas cultivadas bajo tratamiento control y de inundación sin salinidad, se tomó una

alícuota de 320 µl del sobrenadante recuperado y se le añadió 1 ml de reactivo de color,

compuesto por 15 ml de solución de tiocianato de mercurio (4,17 g/l metanol), 15 ml de

solución de nitrato de hierro (202 g de nitrato de hierro + 21 ml de ácido nítrico

concentrado, enrasado a 1 l con agua destilada) y 50 µl de Brij® 35 (polietilenglicol-

dodeciléter) al 4 %. Para las muestras de las plantas que se sometieron a los tratamientos

de salinidad y mixto de inundación y salinidad, se procedió de manera similar, pero

comenzando con una alícuota de 50 µl del sobrenadante a la que se le agregaron 270 µl

de solución extractora y 1 ml de reactivo de color. Luego de mezclar se procedió a

medir la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm (utilizando un

espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25) y los valores obtenidos se interpolaron en

una curva de calibración comprendida entre 0-40 mg/l obtenida luego de emplear una

solución patrón de KCl.

41

3.3.7. Expresión relativa de genes de compartimentalización subcelular de los iones

Cl– y Na+

Para poder evaluar la expresión relativa de genes mediante PCR en tiempo real (qRT-

PCR), se obtuvo el ADN copia (ADNc) de los ápices de los vástagos, tomando

aproximadamente 100 mg de peso fresco. Se congeló el material vegetal

inmediatamente en N2 líquido y luego se almacenó a -80 °C hasta su utilización para la

extracción de ARN. Para dicha extracción se molieron las muestras en mortero con la

utilización constante de N2 líquido y se empleó el kit de extracción “Total RNA Plant

Isolation kit” (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se evaluó la integridad

del ARN por electroforesis en gel de agarosa (1 %) en solución tampón TBE 0,5 X, con

8 µl de BrEt/100 ml, durante 30 minutos a 10 V/cm. Se colocaron en cada pocillo 5 µl

del ARN total con 3 µl de tampón de carga. Las bandas correspondientes a los ARNr se

visualizaron mediante un transiluminador de luz UV y la observación de bandas

discretas permitió comprobar la integridad del ARN extraído. Una vez obtenido el

ARN, se realizó el tratamiento con DNasa para eliminar alguna posible contaminación

con ADN genómico. Para esto se tomó una alícuota del ARN total y se le aplicó el

tratamiento con la enzima “Turbo DNA-free™ Kit” (Ambion) de acuerdo al manual de

uso del fabricante. El siguiente paso hacia la obtención del ADNc fue comprobar la

ausencia de ADN en el ARN extraído. Para ello se realizó una reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) amplificando la región nrITS utilizando un control positivo de ADN

de referencia para comprobar que la reacción en cadena haya funcionado y agua como

control negativo. Por lo tanto, la ausencia de producto amplificado en las muestras de

ARN, indicó que se encontraban libres de ADN genómico contaminante.

Posteriormente se cuantificó y se evaluó el ARN tratado con un “nanodrop”,

depositando 2 µl de muestra de ARN en un adaptador con un lector múltiple de placas

(Synergy H1) midiendo la absorbancia a dos longitudes de onda: 260 nm y 280 nm. Se

utilizaron las muestras que presentaron una relación de absorbancia 260/280

comprendida entre 2 y 2,2. Para la cuantificación se utilizó el valor obtenido a una

absorbancia de 260 nm considerando que, a esta longitud de onda, una unidad de

absorbancia corresponden a 40 mg de ARN/ml.

Para la síntesis de ADNc se utilizó una alícuota de las muestras conteniendo 3 µg del

ARN tratado, usando la enzima transcriptasa reversa “Moloney Murine Leukemia

Virus” (MMLV-RT) (Promega, WI, USA) y 100 pmol de hexámeros (Pharmacia

Biotech) siguiendo las recomendaciones del fabricante. De esta manera se obtuvo el

ADNc en un volumen final de 40 µl de agua estéril, el cual se almacenó a -20 °C hasta

su utilización.

Con la finalidad de identificar un gen candidato que estuviera vinculado con el

transporte subcelular del Cl– se comenzó con una búsqueda in silico a partir de la

secuencia aminoacídica de un gen de canal transportador de cloruros (CLC) de arroz

(OsCLC1), sobre la base de datos “GenBank” de secuencias disponible de L. japonicus

y otras especies modelos. Esa búsqueda arrojó una posible región con la función

predictiva de un CLC. Para diseñar los cebadores, se utilizó esa información además de

la información de transcriptómica de las especies L. tenuis y L. corniculatus obtenida en

nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados, manuscrito en preparación), realizándose

un alineamiento de las secuencias de las diferentes especies para obtener una secuencia

ortóloga consenso de CLC para Lotus spp. Con el objetivo de diseñar el par de

cebadores que luego se utilizó en el análisis por qRT-PCR, se alinearon las secuencias

nucleotídicas deducidas del CLC de L. tenuis, L. corniculatus y L. japonicus más

conservadas entre las especies, con el programa “BioEdit” (Hall, 1999) y se analizaron

42

con la interfase de internet “Primer3Plus” (http://www.bioinformatics.nl/cgi-

bin/primer3plus/primer3plus.cgi). La secuencia consenso se analizó en diversas bases

de datos y herramientas in silico (por ejemplo BLAST contra toda la base de datos del

NCBI, PFAM, GenOntology) y se encontró que este gen codifica para un tipo de canal

transportador de Cl– ubicado en membranas de compartimentos del aparato de Golgi y

que en la literatura especializada se lo denomina CLC-f.

Además, se utilizó un par de cebadores diseñado para evaluar la expresión relativa del

gen LtNHX1 en L. tenuis y en L. corniculatus según lo reportado por Teakle et al.

(2010). Finalmente, se utilizó un par de cebadores diseñado para el gen EF-1α, el cual

constituyó el gen de referencia (Escaray et al., 2014). Los cebadores utilizados para la

evaluación de expresiones relativas de genes de este capítulo son presentados en la

Tabla 3.1.

Los cebadores obtenidos de la forma reportada con anterioridad, se evaluaron

inicialmente en su especificidad y eficiencia de amplificación en qRT-PCR sobre ADNc

de vástagos de las especies de Lotus utilizadas en este capítulo. Para comprobar la

especificidad de los mismos se realizó un análisis de disociación después de cada

corrida de amplificación, seguido de secuenciamiento del amplicón. Por otro lado la

eficiencia de la PCR se evaluó realizando una curva estándar para cada gen, usando seis

puntos de dilución, cada uno por triplicado. Todos los pares de cebadores produjeron el

amplicón esperado y presentaron similares eficiencias de qRT-PCR en las distintas

accesiones de Lotus aquí evaluadas.

Tabla 3.1. Lista de cebadores utilizados

Nombre del gen Dirección Secuencia del cebador (5’→3’) Referencia

L. tenuis NHX1-

like (LtNHX1)

Sentido TACTTCACTGCGGTCCAATG Teakle et al., 2010

Antisentido GATCTAGGGAAGCCATGCTG Teakle et al., 2010

Chloride channel-

like (CLC-f)

Sentido TTAGTTGGAATGGCCGCTAC Esta tesis

Antisentido ACTGAGGGAACCCATATTGC Esta tesis

Elongation factor

1-alpha (EF-1α)

Sentido TGACAAGCGTGTGATCGAGAGG Escaray et al., 2014

Antisentido GATACCTCTTTCACGCTCAGCCTT Escaray et al., 2014

3.3.8. Diseño experimental y análisis de datos

El diseño experimental fue completamente al azar con arreglo factorial de los

tratamientos en 3 factores fijos. Los factores fueron “accesión” (con 4 niveles,

correspondiente a las 4 accesiones evaluadas), “inundación” (con dos niveles: inundado

y no inundado) y el factor “salinidad” (con dos niveles: 150 mM de NaCl y 0 mM de

NaCl). El análisis para todas las variables se comenzó con un ANVA de tres vías

(debido a los 3 factores), para las variables que surgieron interacciones dobles, se separó

el análisis en dos ANVAs de dos vías para las dos situaciones de salinidad, uno para el

nivel 0 de NaCl y otro para el nivel 150 mM de NaCl. Se realizó de dicha manera

porque la salinidad fue el factor que más modificó los parámetros. El número de

repeticiones fue de 5 (cada unidad muestral correspondió a una planta individualmente

cultivada en una maceta).

Cuando se detectaron diferencias significativas en los ANVAs, se aplicó una prueba de

Duncan como método de análisis de comparación múltiple de medias.

43

Para las variables de la eficiencia del fotosistema II, por cada accesión se realizó una

prueba de “t” de cada tratamiento en comparación con su respectivo control.

Para todos los casos en que se realizaron análisis y pruebas estadísticas, se empleó un

nivel de significancia del 5%.

El análisis estadístico de la expresión relativa de genes se realizó mediante la aplicación

de análisis desarrollada para analizar expresiones relativas de genes obtenidas por qRT-

PCR, denominada “micromatrices de ADN” del programa InfoStat (Di Rienzo et al.,

2011) con 5000 ciclos de remuestreo y comparación de a pares (p<0,05).

3.4. Resultados


biomasa y sus componentes

En los tratamientos en los cuales la salinidad estuvo presente (salino y mixto

inundación-salinidad) pudo observarse que si bien en general todas las accesiones

redujeron la biomasa del vástago con respecto a los tratamientos que no se sometieron a

salinidad (inundado y control), las mismas tuvieron respuestas diferentes (interacción

significativa entre los factores inundación y accesión dentro del nivel 150 mM de NaCl)

(Figura 3.1.B). La mejor respuesta, tomando como criterio una mayor acumulación de

biomasa de vástagos, se observó para el híbrido interespecífico (LtxLc) en el estrés

mixto, con respecto al estrés únicamente salino (1,25 y 0,87 g MS por planta

respectivamente). En las demás accesiones, la acumulación de biomasa de vástagos se

afectó por el estrés mixto de forma similar al estrés provocado por salinidad

únicamente, aunque con una tendencia clara a reducirla aún más en el cv. de Lotus

corniculatus tetraploide (LcT) (0,62 y 0,95 g MS por planta en promedio en el estrés

mixto y salino respectivamente). Una tendencia similar a lo observado para LtxLc en el

estrés mixto se encontró en el parental L. corniculatus diploide (LcD) (0,62 y 0,35 g MS

por planta para el estrés mixto y salino respectivamente) (Figura 3.1.B).

Para los tratamientos que no incluyeron salinidad (control e inundado), la biomasa de

vástagos no presentó interacción entre los factores inundación y accesión (p>0,05). Al

analizar los efectos principales de los mismos se observó que LcT fue la accesión que

más biomasa en vástago acumuló, sin diferenciarse de LtxLc, pero sí de L. tenuis (Lt) y

de LcD (Figura 3.1.A). Si bien la biomasa de raíces de la accesión LcT se redujo en

inundación sin salinidad, no se encontró reducción de la biomasa de los vástagos para

ninguna accesión (Figura 3.1.A).

La biomasa de raíces en general para las diferentes situaciones fue mayor en LcT, pero

fue la única accesión que presentó una reducción provocada por la inundación, tanto en

los tratamientos sin salinidad (Figura 3.1.C), como también en los tratamientos en

presencia de concentraciones elevadas de sales (Figura 3.1.D). Las demás accesiones no

presentaron alteraciones detacables frente al estrés por inundación bajo nuestras

condiciones experimentales.

44

Figura 3.1. Biomasa seca (en g de MS) de plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a

21 días de tratamientos de sumersión parcial (Inund), salinidad (NaCl), mixto salinidad-

inundación (NaCl-Inund) y condición control (Cont). A y B: Vástagos. C y D: Raíces. Dentro

de cada gráfico, las barras que no tienen ninguna letra en común, son significativamente

diferentes (Prueba de Duncan, p<0,05, n=5, ±DE). En el gráfico A, la interacción del ANVA

(entre accesión e inundación) no fue significativa (p>0,05), los efectos principales mostraron

que el factor accesión fue significativo (p<0,05) mientras que el factor inundación no (p>0,05),

y las diferencias son indicadas en letras mayúsculas. Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido

interespecífico entre L. tenuis y L. corniculatus; LcD: L. corniculatus diploide y LcT: L.

corniculatus tetraploide.

A los 20 días de comenzados los tratamientos de estrés por aclimatación salina

(principalmente cuando se trató del salino y el mixto), el efecto deletéreo de los

tratamientos sobre el estado general de la parte aérea de la planta ya resultaba evidente

(Figura 3.2). En ese momento, como puede observarse en la Figura 3.2 ya se insinuaba

una respuesta diferencial entre algunas accesiones cuando eran sometidas al estrés

mixto, siendo muy contrastante el estado de las plantas de LtxLc con respecto a las de

LcT. Asimismo, era posible observar una mejor respuesta del híbrido LtxLc frente al

estrés mixto que frente al estrés provocado únicamente por la salinidad.

Lt LtxLc LcD LcT

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0NaCl

NaCl-Inund

aabab bb

bcbccV

ásta

go

s M

S (

g)

Lt LtxLc LcD LcT

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0Cont

InundA

C

AB

BV

ásta

go

s M

S (

g)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

a

bbc

c c cd

de e

Raíz

MS

(g

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

a

bbcbcdbcd bcdcd d

Raíz

MS

(g

)

A

D C

B

45

Figura 3.2. Estado fenotípico de las plantas de 4 accesiones del género Lotus en el día 8 desde

que se completaron los tratamientos de aclimatación salina. Tratamientos: sumersión parcial

(Inund), salinidad (NaCl), mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) y condición control (Cont).

Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido interespecífico entre L. tenuis y L. corniculatus; LcD: L.

corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus tetraploide.

Lt

LcD

LtxLc

Cont Inund NaCl NaCl-Inund

LcT

46


iones en las diferentes fracciones de la biomasa

Los tratamientos que incluyeron salinidad aumentaron considerablemente la

concentración de iones Na+ y Cl– en las hojas (apicales y basales) en todas las

accesiones con respecto a las situaciones que no la incluyeron (Figura 3.3 y Figura S.3.1

del anexo). En las hojas apicales de las plantas que se sometieron a estrés mixto de

inundación y salinidad, y también las sometidas a únicamente salinidad, se observó que

las accesiones respondieron diferencialmente en la concentración de ambos iones (se

detectó interacción accesión x inundación). Las concentraciones de iones Na+ y Cl– del

tratamiento mixto de inundación y salinidad comparadas con aquellas observadas en

plantas bajo tratamiento de estrés por salinidad solamente, casi se duplicaron en la

accesión LcT, mientras que en las demás accesiones, se observaron concentraciones

similares entre ambas condiciones experimentales (Figura 3.3.A y C). La accesión Lt en

los tratamientos con salinidad presentó los menores niveles de Cl– en sus hojas apicales,

seguido por el material híbrido LtxLc, el cual a su vez, no se diferenció de su parental

LcD. También dentro de los tratamientos con salinidad, se observó que la concentración

de Na+ en las hojas apicales de Lt sometidas a salinidad solamente, fue la más baja.

Dicha concentración de Na+ no se diferenció de las obtenidas para la misma accesión de

Lt cuando se sometió a la condición mixta, y tampoco de la concentración determinada

para LcD en presencia de salinidad solamente (Figura 3.3.C). Las demás condiciones y

accesiones tuvieron niveles similares de Na+ en sus hojas apicales, excepto LcT en la

condición mixta de inundación y salinidad que al igual que para el Cl–, casi duplicó su

concentración con respecto a los niveles obtenidos para el tratamiento de salinidad

solamente.

En las condiciones sin aplicación de salinidad (únicamente inundación y control), los

niveles de Na+ y Cl– en las hojas apicales y basales, fueron muy bajos en comparación

con los tratamientos con 150 mM de NaCl y no se modificaron por la inundación

(Figura S.3.1 del anexo).

En las hojas basales, en los tratamientos que incluyeron 150 mM de NaCl, la inundación

incrementó la concentración de los iones Na+ y Cl– en todas las accesiones (se detectó

efecto del factor inundación), en forma independiente a ellas (interacción accesión x

inundación no significativa). Las accesiones se diferenciaron entre ellas, siendo Lt

nuevamente, al igual que para las hojas apicales, la que menos iones tóxicos acumuló,

seguida en orden ascendente por el material híbrido LtxLc y su parental LcD, que no se

diferenciaron entre sí. La mayor acumulación de estos iones se determinó en la accesión

LcT (Figura 3.3.B y D).

47

Figura 3.3. Concentración de iones Cl– y Na+ en hojas apicales y basales (en μmol por g de MS)

de las plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de tratamientos de salinidad

(NaCl) y mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund). A y B: concentración del ion Cl– en hojas

apicales y basales respectivamente. C y D: concentración del ion Na+ en hojas apicales y basales

respectivamente. Dentro de cada gráfico, las barras que no tienen ninguna letra en común, son

significativamente diferentes (Prueba de Duncan, p<0,05, n=5, ±DE). En el gráfico B y D, la

interacción del ANVA (entre Accesión e Inundación) no fue significativa y se detectó diferencia

entre accesiones, las cuales se indican con letras mayúsculas y además el factor inundación

aumentó la concentración de los iones. Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido interespecífico entre L.

tenuis y L. corniculatus; LcD: L. corniculatus diploide y LcT: L. corniculatus tetraploide.

Con respecto a la concentración del ion K+ en las hojas apicales, los efectos de los tres

factores fueron significativos e independientes entre ellos (no se detectó interacción

triple ni ninguna doble entre los factores accesión, inundación y salinidad). En este

sentido, la salinidad y la inundación disminuyeron la concentración de K+ en las hojas

apicales. En la accesión LtxLc se observó menor concentración de dicho ion,

independientemente de la salinidad y de la inundación (Figura 3.4.A).

La concentración de K+ en las hojas basales de las plantas que recibieron 150 mM de

NaCl, difirió entre las accesiones y respondió dependiendo de la inundación (pudo

observarse interacción accesión x inundación). Todas las accesiones disminuyeron la

concentración de K+ de sus hojas basales en el tratamiento mixto en comparación con el

tratamiento de únicamente salinidad. LcT en esta última situación de estrés, fue la que

mayor concentración de K+ mantuvo en sus hojas basales. Sin embargo fue también la

que proporcionalmente más redujo la concentración de dicho ion al ser sometida a

inundación durante el estrés mixto. Los valores obtenidos para el material híbrido en el

estrés mixto, no se distinguieron significativamente de los valores observados en su

parental LcD bajo la misma condición. (Figura 3.4.B).

La concentración de K+ en las hojas basales de las plantas que no recibieron 150 mM de

NaCl, disminuyó por la inundación, independientemente de las accesiones (se detectó

A B

D C

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

5000

A

B B

C

Cl-

ho

jas

ba

sa

les

(

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

5000

NaCl

NaCl-Inund

cb

d

c

d

a

bcbc

Cl-

ho

jas

ap

ica

les

(

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

5000

bc bc

bcdbc

d

a

b

cd

Na

+ h

oja

s a

pic

ale

s (

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

5000

A

B B

C

Na

+ h

oja

s b

as

ale

s

(m

ol

g-1

MS

)

48

efecto del factor inundación y no hubo interacción entre accesión x inundación) (Figura

S.3.2.A del anexo).

Teniendo en cuenta la relación en base molar entre los iones K+ y Na+ (K+/Na+) en las

hojas apicales y basales, se observó una fuerte caída general en dicha relación en todas

las accesiones cuando las plantas se sometieron a 150 mM de NaCl con respecto a

aquellas que no se sometieron a esa condición de estrés (Figura 3.4.C y D; Figura

S.3.2.B del anexo). Analizando la misma relación en ápices de plantas sometidas al

tratamiento de salinidad y estrés mixto de inundación y salinidad (Figura 3.4.C), se

observó que la inundación disminuyó la relación K+/Na+ independientemente de las

accesiones (no se detectó interacción accesión x inundación; se detectó efecto del factor

inundación). También se observaron diferencias entre las accesiones, siendo el material

híbrido LtxLc el que menor relación K+/Na+ presentó pero sin diferenciarse

significativamente de los valores observados para LcT (Figura 3.4.C).

En los tratamientos sin salinidad, la relación K+/Na+ de las hojas apicales de las plantas

inundadas con respecto a las controles se mantuvo en valores similares a excepción de

LcT en la cual se observó una reducción con respecto a su control (Figura S.3.2.B del

anexo).

La relación K+/Na+ en las hojas basales se redujo por el efecto de los factores

inundación y salinidad, independientemente entre sí y del factor accesión (no se observó

ninguna interacción doble ni triple; se detectó efecto del factor inundación y del factor

salinidad; no existió efecto del factor accesión) (Figura 3.4.D).

49

Figura 3.4. Concentración de K+ (en μmol por g de MS) y relación molar K+/Na+ en hojas de

plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de tratamientos de sumersión

parcial (Inund), salinidad (NaCl), mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) y condición control

(Cont). A: concentración de K+ en hojas apicales, no se detectó la presencia de ninguna

interacción entre los factores (ni dobles ni la triple), los efectos principales de los factores

fueron los tres significativos y se muestran con letras mayúsculas las diferencias entre

accesiones. B: concentración de K+ en hojas basales. C: relación K+/Na+ en hojas apicales, no se

detectó interacción entre accesión e inundación y se muestran las diferencias entre accesiones

con letras mayúsculas. D: relación K+/Na+ en hojas basales, no se detectó la presencia de

ninguna interacción entre los factores (ni dobles ni la triple) y los efectos principales de los

factores inundación y salinidad fueron significativos y los dos disminyeron la relación. Dentro

de cada gráfico, las barras que no tienen ninguna letra en común, son significativamente

diferentes (Prueba de Duncan, p<0,05, n=5, ±DE). Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido



Con respecto al estado fenotípico de los ápices y otras hojas de las plantas de LcT

durante el estrés mixto de inundación y salinidad al momento de la cosecha, estas

mostraron a simple vista un claro deterioro. Se observó pérdida de turgencia, varias

hojas secas en cada vástago, características todas estas que no se evidenciaron en las

otras accesiones (Figura 3.5) y tampoco en las plantas del propio LcT en situación de

estrés provocado únicamente por la salinidad.

A

C

B

Lt LtxLc LcD LcT

0

500

1000

1500

2000 NaCl

NaCl-Inund

c

a

d

ccd

bb

c

K+

en

ho

jas

ba

sa

les

(

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

500

1000

1500

2000

Cont

Inund

B

NaClNaCl-Inund

A A A

K+ h

oja

s a

pic

ale

s (

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

5

10

15

20 Cont

Inund

NaClNaCl-Inund

K+/N

a+

en

ho

jas

ba

sa

les

Lt LtxLc LcD LcT

0

1

2

3

NaCl

NaCl-Inund

ABA

B

A

K+/N

a+

en

ho

jas

ap

ica

les

D

50

Figura 3.5. Efecto de 21 días de tratamiento mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) sobre 3

accesiones del género Lotus. A: Imagen del estado de LcD y LcT al momento de la cosecha de

biomasa, donde se pueden observar daños por fitotoxicidad iónica en LcT. B: Imagen del estado

de LcT y de LtxLc al momento de la cosecha. LcD: Lotus corniculatus diploide. LcT: L.

corniculatus tetraploide; LtxLc: híbrido interespecífico entre L. tenuis y L. corniculatus.

3.4.3. Efecto del estrés mixto de inundación y salinidad sobre la expresión relativa

de genes vinculados a la compartimentalización subcelular de iones Na+ y Cl–

La expresión relativa de genes que codifican transportadores involucrados en la

compartimentalización subcelular de los iones Na+ y Cl–, se evaluó en ápices de

vástagos de plantas cultivadas en situación control y en estrés mixto de inundación y

salinidad, condición de estrés que más se diferenció entre las accesiones en cuanto a su

respuesta general. Se observó que en la expresión relativa del gen CLC-f, el cual

codifica para un canal de Cl– en membranas subcelulares, se indujo en el material

híbrido LtxLc y en su parental LcD con respecto a sus controles. En las restantes dos

accesiones, Lt y LcT no se observó una modificación en el nivel de transcripción de

dicho gen con respecto a los controles (Figura 3.6.A).

Por otro lado, el gen LtNHX1, que codifica para un antitransportador Na+/H+ del

tonoplasto, se indujo en el híbrido interespecífico LtxLc en la condición de estrés mixto

en comparación a su control. Asimismo. En la accesión Lt se encontró reprimida la

expresión relativa de este gen en la situación de estrés mixto con respecto a la situación

control (Figura 3.6.B).

Figura 3.6. Expresión relativa de los genes CLC-f (A) y LtNHX1 (B) en plantas de 4 accesiones

del género Lotus sometidas a 21 días de tratamiento mixto salinidad-inundación (NaCl-Inund) y

condición control (Cont). Valores son expresados como 2–∆∆Ct referidos a Lt Cont (n=3 ±DE).

Los asteriscos indican diferencia significativa respecto a la situación control (p<0,05). Lt: Lotus

tenuis; LtxLc: híbrido interespecífico entre L. tenuis y L. corniculatus; LcD: L. corniculatus

diploide y LcT: L. corniculatus tetraploide.

A B

LcD LcT

NaCl-Inund

NaCl-Inund

LcT LtxLc

A B

Lt LtxLc LcD LcT

0

2

4

6

8Cont

NaCl-Inund*

*

CL

C E

xp

resió

n r

ela

tiva (

2-d

dC

T)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1

2

3

4Cont

NaCl-Inund

*

*

NH

X1 E

xp

resió

n r

ela

tiva (

2-dd

CT)

51

3.4.4. Efecto del estrés mixto de inundación y salinidad sobre la fotosíntesis neta y

parámetros del fotosistema II

La tasa de fotosíntesis neta determinada como el intercambio neto de CO2 a luz

saturante, en general se redujo fuertemente en todas las accesiones cuando estuvo

presente la salinidad en los tratamientos (estrés únicamente por salinidad y estrés mixto

de inundación y salinidad). En esta situación, las accesiones tuvieron respuestas

diferenciales frente a la inundación (existió interacción accesión x salinidad). Se

encontró que el híbrido LtxLc y su parental LcD incrementaron fuertemente las tasas de

intercambio neto de CO2 en la situación de estrés mixto con respecto al estrés por

salinidad solamente. Por otro lado, las accesiones Lt y LcT tuvieron tasas similares

entre las plantas sometidas a estrés mixto y las sometidas a salinidad solamente (Figura

3.7.B). En la situación de los tratamientos sin salinidad (inundación y control), LcT fue

la única accesión que debido a la inundación redujo su tasa fotosintética con respecto a

su control. Simultáneamente en LcD se observó una tendencia a incrementar dicha tasa

debido a la inundación (Figura 3.7.A).

Con respecto a los parámetros relacionados a la eficiencia y funcionamiento del

fotosistema II, determinados mediante mediciones basadas en la fluorescencia

transitoria de la clorofila, se observó que LcT fue la única accesión que presentó una

reducción del rendimiento cuántico máximo (Fv/Fm; Figura 3.7.C) y del índice de

performance (PIabs; Figura 3.7.D) en el tratamiento de salinidad, y en mayor magnitud

en el tratamiento mixto, siempre con respecto a la situación control.

52

Figura 3.7. Respuestas fisiológicas de plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21

días de tratamientos de sumersión parcial (Inund), salinidad (NaCl), mixto salinidad-inundación

(NaCl-Inund) y condición control (Cont). A y B: tasa de intercambio neto de CO2 a luz

saturante (PN). Dentro de cada gráfico, las barras que no tienen ninguna letra en común, son

significativamente diferentes (Prueba de Duncan, p<0,05, n=5, ±DE). C: rendimiento cuántico

máximo de la fotoquímica primaria (Fv/Fm) y D: índice de performance (PI abs). En C y D

cada tratamiento se comparó frente a la situación control mediante una prueba de t bilateral, y

las diferencias se indicaron con asteriscos (p<0,05). Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido



3.5. Discusión


biomasa y fotosíntesis neta

Como respuesta general de las plantas de todas las accesiones, la acumulación de

biomasa en los vástagos se redujo cuando los tratamientos incluyeron salinidad

(tratamiento de salinidad solamente y el mixto entre inundación y salinidad). Al

respecto, se ha considerado que este resultado pudo deberse en mayor medida, al efecto

osmótico provocado por la salinidad, según el modelo de dos fases propuesto por otros

autores (Munns, 2002; Zhu, 2003). En el tratamiento de únicamente salinidad, para el

período y el nivel aquí aplicado (150 mM de NaCl durante 21 días, con previa

aclimatación salina), más allá de la reducción en el crecimiento, no se observaron ni

síntomas, ni otros indicios de toxicidad en ninguna de las accesiones. Por lo tanto, todas

las accesiones presentaron un destacable grado de tolerancia al estrés por salinidad, si se

considera la supervivencia y el estado general de las plantas como criterios para

establecerlo. Esto concuerda con las observaciones realizadas previamente para dos de

Lt LtxLc LcD LcT

0

5

10

15

cdcd

bb

bccd

a

d

NaCl

NaCl-Inund

PN (

mo

l C

O2 m

-2 s

-1)

Lt LtxLc LcD LcT

0.75

0.80

0.85

0.90

Cont

InundNaClNaCl-Inund

**

Fv

/Fm

A B

D C

Lt LtxLc LcD LcT

0

5

10

15 a

ab ab abab ab

bb

Cont

Inund

PN (

mo

l C

O2 m

-2 s

-1)

Lt LtxLc LcD LcT

0

2

4

6

8

10 Cont

InundNaClNaCl-Inund

*

*

PI ab

s

53

las especies de este género analizadas en este trabajo de tesis, evaluadas en situaciones

experimentales de salinidad similares (L. tenuis y L. corniculatus tetraploide) (Teakle et

al., 2006, 2010).

Cuando las plantas se sometieron únicamente al estrés por sumersión parcial

(inundación), y tal como era de esperarse por tratarse de especies descriptas

previamente como tolerantes a este estrés (revisado por Striker y Colmer, 2016), las

accesiones presentaron pocos efectos deletéreos, tales como la reducción de la biomasa

en el cultivar tetraploide comercial de L. corniculatus (LcT) y el aumento de la relación

vástago-raíz provocada por la inundación en todas las accesiones. Las proporciones de

biomasa de vástagos y de raíces se pueden observar en la Figura 3.1, (los cálculos y

análisis de la relación no son presentados).

La situación más interesante y contrastante entre las accesiones, surgió frente a la

combinación de los estreses, es decir, en la condición de estrés mixto de inundación y

salinidad. Ha sido ampliamente reportado para la mayoría de las plantas cultivadas, que

el efecto de la salinidad es exacerbado por la inundación cuando ambos estreses ocurren

en simultáneo, tornándose una situación más perjudicial que aquella que se presumiría

como solo la suma de ambos estreses por separado (Barrett-Lennard, 2003; Bennett et

al., 2009). Esta observación fue muy evidente en LcT para la mayoría de los parámetros

evaluados y también por el estado general de las plantas de esta accesión, tomando

como ejemplo la aparición de los típicos síntomas de toxicidad iónica provocada por la

salinidad (aparición de hojas secas desde los márgenes y la muerte de algunos ápices de

las plantas) (Figura 3.5). También en esta misma accesión se observó una tendencia a la

reducción mayor de la biomasa durante el estrés mixto que cuando se sometieron las

plantas al estrés por salinidad solamente. Bajo nuestras condiciones experimentales, la

diferencia en la menor acumulación de biomasa en los vástagos en plantas de la

accesión LcT sometidas al estrés mixto, no llegó a ser significativa con respecto a lo

determinado bajo la situación de estrés por salinidad solamente. Sin embargo debe

tenerse en cuenta que al momento de la cosecha, las hojas secas (presentes en LcT en

situación de estrés mixto) no se separaron de las que aún no presentaban efectos

deletéreos evidentes a simple vista, y todas se incluyeron en la determinación de la

biomasa seca total, pudiendo esto probablemente enmascarar las diferencias.

El material híbrido interespecífico LtxLc bajo las condiciones de estrés mixto de

inundación y salinidad, presentó una mayor acumulación de biomasa aérea que frente al

estrés provocado únicamente por la salinidad (Figura 3.1), lo que deja en evidencia que

la sumersión parcial (inundación) podría tener un efecto atenuante sobre el estrés salino

en este material vegetal. Este interesante hallazgo para una especie leguminosa, también

fue reflejado en el estado general de las plantas (Figuras 3.2 y 3.5.B) y por los otros

parámetros medidos, como por ejemplo, la mayor tasa de fotosíntesis neta que se

observa en el estrés mixto (Figura 3.7). En este sentido, también su parental L.

corniculatus diploide (LcD) presentó una mayor tasa de fotosíntesis en el estrés mixto

que en el provocado por la salinidad únicamente. Además, para la misma accesión fue

posible observar una tendencia a una mayor acumulación de biomasa en los vástagos en

el estrés mixto, que lo observado en simultáneo frente al estrés provocado por agregado

de iguales concentraciones de sal pero en condiciones de libre drenaje (Figura 3.7).

Estas respuestas encontradas en LcD, podrían estar indicando que estos rasgos de

tolerancia, son transferidos desde este parental de procedencia española, hacia el

material híbrido. Una respuesta más favorable en el estrés mixto de inundación y

salinidad que en el estrés por salinidad sola, ha sido poco reportada en la literatura. Solo

recientemente se ha observado que en la planta Mentha aquatica, la inundación ayudó a

54

morigerar el efecto de la salinidad, probablemente debido a un incremento en la

actividad antioxidante y de la estabilidad de membranas (Haddadi et al., 2016).


iones en la biomasa de las plantas

Con respecto a la concentración de iones Na+ y Cl– en las hojas, es sabido que para la

mayoría de las plantas cultivadas, el estrés mixto de inundación y salinidad produce un

incremento mayor de la concentración de estos iones hacia el vástago, que cuando las

plantas están sometidas a estrés únicamente por salinidad (Galloway y Davidson, 1993;

Barrett-Lennard, 2003). En los resultados de esta tesis, esto fue muy evidente en la

accesión menos tolerante (LcT), ya que el estrés mixto, efectivamente provocó un

mayor incremento de los iones Na+ y Cl– tanto para las hojas apicales como en las

basales (Figura 3.3). Dicha observación fue consistente con los síntomas de las plantas

resultando evidente el comienzo de la muerte de las hojas desde sus márgenes y de los

tejidos apicales en general (Figura 3.5). Además LcT fue la única accesión que presentó

parámetros del fotosistema II afectados por las condiciones salinas (Figura 3.7.C y D),

sugiriendo daños en el mismo.

En la accesión Lt se observó una respuesta muy contrastante con respecto a LcT en dos

sentidos: por un lado, en Lt el estrés mixto no aumentó la concentración de los iones

nocivos con respecto al estrés provocado únicamente por la salinidad, y por otro lado,

los valores de esas concentraciones, fueron muy inferiores a los valores que presentó la

accesión menos tolerante (LcT) (Figura 3.3). Estas respuestas, sumadas a observaciones

previas similares realizadas por Teakle et al. (2006 y 2007) para estas dos especies,

sugieren que Lt posee mecanismos eficientes de exclusión de los iones nocivos, que no

permiten que las concentraciones de estos lleguen a ser severamente perjudiciales a

nivel de vástagos, y que, además, esos mecanismos pueden ser eficazmente mantenidos

en condiciones del estrés mixto de inundación y salinidad.

Particularmente para el caso del Cl–, la concentración de este anión en vástagos se ha

encontrado fuertemente correlacionada (en forma negativa) con el nivel de tolerancia, e

incluso con una correlación negativa mayor que la observada con la concentración de

Na+ en vástagos de géneros de leguminosas tales como Trifolium (Winter, 1982; Rogers

et al., 1997), Medicago (Sibole et al., 2003), Glycine (Luo et al., 2005) y Lotus (Teakle

et al., 2006; Teakle et al., 2007). De todas maneras, es importante tener presente que el

Cl– es considerado un micronutriente esencial que regula actividades de enzimas en el

citoplasma, y también es un cofactor esencial en la fotosíntesis. Además está

involucrado en regulaciones de pH y de turgencia (Xu et al., 2000; White y Broadley,

2001). Sin embargo, el Cl– puede ser tóxico para las plantas en altas concentraciones, y

se han reportado valores críticos que resultan ser tóxicos a partir de 115-200 μmoles por

g de MS para las plantas consideradas “sensibles” y de 425-1410 μmoles por g de MS

para las consideradas “tolerantes” (Xu et al., 2000). Teniendo en cuenta los valores

estimados por esos autores para plantas tolerantes a salinidad, pudimos determinar que

Lt fue capaz de mantener al Cl– por debajo de una concentración de 1000 μmoles por g

de MS en plántulas sometidas al estrés salino y también frente al estrés mixto, lo que

afianza aún más la hipótesis de que se activarían mecanismos de exclusión (o de “no

entrada”) para este anión en esta especie. Por el contrario, las plantas de LcT y sobre

todo las sometidas al estrés mixto, superaron alrededor de 4 veces estos valores (Figuras

3.3.A y B), y consistentemente se evidenciaron síntomas de toxicidad y otros fenotipos

que sugieren daños concurrentes en el fotosistema II.

55

En las accesiones experimentales LcD y el híbrido LtxLc, las plantas sometidas a estrés

mixto de inundación y salinidad con respecto a las sometidas únicamente a salinidad, no

aumentaron sus concentraciones de Cl– en las hojas apicales, y el material LtxLc

tampoco incrementó la concentración de Na+ (Figura 3.3). Tanto el híbrido

interespecífico como la accesión diploide de L. corniculatus presentaron valores

intermedios entre las dos accesiones más contrastantes (Lt y LcT). Esto podría estar

indicando que en parte, activaron mecanismos de exclusión. Pero si se toman en cuenta

los valores críticos estimados para toxicidad por Cl– previamente detallados, los niveles

de concentración en LcD y LtxLc superaron los mismos y debieron haber presentado

síntomas evidentes de toxicidad en las hojas. Sin embargo, ninguna evidencia de

toxicidad iónica se puso de manifiesto en estas dos accesiones experimentales. Este

puede resultar un indicio de importancia que sugiere la activación de los mecanismos de

compartimentalización subcelular o “secuestro” de iones nocivos en compartimentos

intracelulares a nivel de las hojas. Posiblemente este mecanismo evitaría que los iones

nocivos dañen las enzimas citoplasmáticas de sitios metabólicamente muy activos,

como el mesófilo de las hojas en crecimiento. Para hacer una aproximación hacia esa

hipótesis, se midieron las expresiones relativas de dos genes involucrados en el proceso

de compartimentalización del Na+ y del Cl–. Esta posibilidad se analizó y se discutió en

el próximo apartado de este capítulo (3.5.3).

Por otro lado, es frecuentemente reportado en la bibliografía, que el estrés por salinidad

en plantas de cultivos, además de provocar un incremento de los iones Na+ y Cl–,

también induce una caída en la concentración celular de K+ (Greenway y Munns, 1980;

Maathuis y Amtmann, 1999). En nuestros resultados se observó que, efectivamente, la

salinidad redujo la concentración de K+ en las hojas de todas las accesiones. Por su

parte, el estrés por inundación también redujo la concentración de K+, y los efectos

adversos de los dos estreses observados en el estrés mixto, fueron aditivos y condujeron

a las menores concentraciones determinadas para este catión (Figura 3.4).

Resulta conocido el hecho de que la similitud en las características fisicoquímicas entre

el Na+ y el K+ determina que estos iones compitan entre sí, poniendo en riesgo un

amplio rango de procesos citoplasmáticos claves como reacciones enzimáticas, síntesis

de proteínas y funciones de los ribosomas, por lo que ha sido propuesto que resulta

esencial la determinación de la relación de concentraciones que mantienen entre ellos

(Shabala y Cuin, 2008). En este sentido, habitualmente se asocia como rasgo de

identidad de las especies vegetales con mayor grado de tolerancia a la salinidad, el de

mantener lo más invariable posible la relación K+/Na+ en sus tejidos (Munns y Tester,

2008). Con respecto a esto, los resultados en este capítulo de la tesis no mostraron

correspondencia con dicha afirmación ya que se observó en todas las accesiones una

fuerte reducción de dicha relación cuando se sometieron a los tratamientos bajo

condiciones de salinidad (Figura 3.4), y no se encontró correspondencia con los

diferentes grados de tolerancia que sí pudieron observarse en la mayoría de los demás

parámetros evaluados. Es oportuno mencionar que ya ha sido reportado previamente

que en diversas plantas halófitas y en algunas glicófitas con mayor grado de tolerancia a

la salinidad, la relación K+/Na+ no siempre es invariable frente a niveles crecientes de

salinidad, y que frecuentemente no es posible establecer una correlación clara con

respecto a la tolerancia, definida ésta en base a otros parámetros (Colmer et al., 2009;

Flowers et al., 2014). Esto podría deberse a que una proporción significante del K+ de

las hojas, se localiza en las vacuolas, cumpliendo principalmente la función física de

generación de turgencia. La clave estaría, en que en ciertas especies de plantas, este rol

del ion K+ en las vacuolas puede ser reemplazado por el Na+ (Leigh y Wyn Jones, 1986;

Kronzucker et al., 2013). Por lo tanto, si bien el estrés por salinidad disminuye la

56

concentración de K+ en los tejidos de las plantas, no necesariamente ello implicaría que

disminuya su concentración en el citoplasma (Flowers et al., 2014). Esto sugiere que

para aquellas plantas que tienen una fuerte capacidad de compartimentalizar

subcelularmente al Na+, la relación K+/Na+ a nivel de tejido no estaría asociada con su

tolerancia a la salinidad, como sí ocurriría en otras especies vegetales que carecen de

dicha capacidad. Esto es otro indicio de importancia que pone de manifiesto la

relevancia de las proteínas transportadoras de membranas con función de regular la

concentración iónica en los diferentes compartimentos intracelulares. Una mayor

discusión al respecto se realizó en el siguiente apartado de esta tesis.

3.5.3. Regulación de genes vinculados a la compartimentalización subcelular de

iones Na+ y Cl–

La expresión relativa de genes involucrados en la compartimentalización subcelular de

los iones Na+ y Cl– se evaluó en la situación de estrés que más diferenció a las

accesiones en cuanto a su respuesta general, es decir, el estrés mixto entre inundación y

salinidad. Por ello, se estudiaron las expresiones relativas de dos genes que codifican

para proteínas de membranas intracelulares con función de transportadoras de Na+ y

Cl–: el gen LtNHX1 que codifica para un intercambiador Na+/H+ y el gen CLC-f que lo

hace para un canal de Cl– en membranas del aparato de Golgi. De esta manera, pudo

observarse la existencia de una inducción significativa en la expresión tanto de LtNHX1

como de CLC-f en el material híbrido LtxLc en la condición del estrés mixto con

respecto a su control (Figura 3.6). Esta capacidad, se la habría otorgado el parental LcD,

ya que en las mismas condiciones de estrés, en dicha accesión también se indujo

significativamente la expresión de CLC-f, y una tendencia similar pudo observarse para

la expesión del gen LtNHX1. En contraste con estas respuestas, en el cultivar tetraploide

LcT, no se observó un incremento en la expresión de estos transportadores de

membrana con respecto a su control. Estos resultados sugieren que para aquellos

materiales que acumulan cantidades elevadas de los iones nocivos en sus tejidos,

existiría una fuerte asociación entre la inducción de estos genes y la tolerancia al estrés

por salinidad. Por otro lado, en la accesión Lt no se indujo la expresión relativa de

ninguno de los dos genes evaluados, lo que sugiere que su mayor tolerancia (con

respecto a LcT) se debería a una menor acumulación de los iones en los tejidos, sin que

se alcancen niveles tóxicos de los mismos. Esto último también indicaría que los

mecanismos de “exclusión” de los iones en Lt resultan más eficientes que en las demás

accesiones, aspecto que ya se discutió en el apartado anterior (3.5.2).

Por otra parte, y tal como se explicó en el apartado 3.3.7 de este capítulo, mediante

análisis in silico se determinó que el canal de Cl– (CLC-f) se localizaría en las

membranas de vesículas del aparato de Golgi, lo que estaría vinculado a la

compartimentalización de los iones Cl–, excluyéndolos del citoplasma. Además podría

estar conduciendo a su vez, a la incorporación de esos iones al sistema de secreción de

desechos celulares (que el aparato de Golgi lleva a cabo) mediante la formación de

vesículas de exportación de productos. Para comprobar estas hipótesis, se deberían

realizar estudios de localización in situ de este canal transportador, y determinar que

esté cumpliendo la función que sugieren nuestros datos, aspecto que tendríamos

previsto como trabajo futuro. Con respecto a esto, los CLCs en general, ya han sido

vinculados en la tolerancia a la salinidad para diferentes especies vegetales (Nakamura

et al., 2006; Jossier et al., 2010), y particularmente para el gen ortólogo CLC-f en vid,

especie en la cual se reportó una expresión constitutiva en las variedades tolerantes a la

57

salinidad, lo que se diferenció de lo observado en simultáneo en las accesiones

clasificadas como sensibles (Henderson et al., 2014).

Por otra parte, en trabajos recientes, se ha logrado mejorar significativamente la

tolerancia a la salinidad en L. corniculatus (Bao et al., 2014) y alfalfa (Bao et al., 2016)

mediante transgénesis de plantas que co-expresaron dos genes de tonoplasto clonados a

partir de la planta xerófita suculenta Zygophyllum xanthoxylum. Se ha sugerido que

dicha especie utiliza de manera muy efectiva la acumulación de Na+ en las vacuolas de

todos los tejidos, para disminuir su potencial osmótico y lograr extraer agua ajustando

su potencial osmótico a partir de suelos salinos y secos. Uno de estos genes codifica

para una proteína que facilitaría la acumulación de Na+ en vacuolas, mientras que el

otro gen, codificaría para una H+-pirofosfatasa. En las plantas transgénicas, además de

la mayor tolerancia a la salinidad, se encontró mayor tolerancia a la sequía, y los autores

asociaron estas respuestas a una mayor concentración de Na+ y K+ en las hojas, sin

haber presentado efectos de toxicidad como los que sí se observaron en las plantas no

transgénicas. En base a estos resultados, los autores sugirieron que las plantas debieron

haber compartimentalizado los iones en vacuolas, evitando así la toxicidad del Na+ en el

citosol y aumentando la capacidad osmorregulatoria vacuolar. Esto justificaría la

hipótesis de que la capacidad diferencial de poder compartimentalizar los iones

subcelularmente que se sugerió para las accesiones evaluadas en este trabajo de tesis,

también estaría asociada a los diferentes grados de tolerancia a la salinidad que pudieron

determinarse.

Por otra parte, también es importante destacar que en los trabajos de muy diversos

autores (Greenway y Munns, 1980; Morard y Silvestre, 1996; Barrett-Lennard, 2003;

Munns, 2005; Teakle et al., 2007), se pone de manifiesto la importancia de una

adecuada regulación en la energía necesaria para el transporte activo de los iones para

poder tolerar condiciones de estrés por salinidad. Es evidente que una exitosa

compartimentalización de Na+ y Cl– en vacuolas, requiere intercambiadores de iones y

bombas de H+ ubicadas en el tonoplasto que generen una diferencia electroquímica de

H+ a través del mismo, que a su vez, influye sobre la actividad de transporte de los

canales de iones (Colmer y Flowers, 2008; Munns y Tester, 2008; Shabala, 2013). La

deficiencia energética en las raíces, entre otros efectos altera significativamente a dichos

procesos de transporte activo de iones. Por lo tanto, la compartimentalización de los

iones y también los mecanismos de exclusión de Na+ y Cl– podrían verse

comprometidos dependiendo de la respuesta de las plantas frente al estrés por

inundación y en la consecuente tolerancia relativa al estrés mixto de salinidad e

inundación entre las accesiones. Esto a menudo conduce a severas reducciones del

crecimiento e incluso a la muerte de la planta (Barrett-Lennard, 2003; Teakle et al.,

2007), excepto en el caso de las plantas halófitas de humedales, en las cuales se ha

reportado un menor incremento de Na+ y Cl– en los vástagos, presumiblemente debido a

una mejor oxigenación, lo cual evitaría las deficiencias energéticas severas, facilitando

en consecuencia, la adecuada regulación de la concentración de los iones (Colmer y

Flowers, 2008). En este sentido, para especies del género Lotus frente a estrés mixto de

inundación y salinidad a nivel de las raíces, se ha propuesto que la mayor aireación

lograda a través de una mayor formación de aerénquima en L. tenuis con respecto a L.

corniculatus, permitiría mantener una adecuada generación de ATP. De esta manera se

aseguraría el normal funcionamiento de los intercambiadores de Na+/H+ (demandantes

de energía) como el LtNHX1, sin permitir que esos iones se trasladen al vástago, como

sí sucedería en L. corniculatus tetraploides (Teakle et al., 2010). Esto concuerda con los

resultados encontrados en esta tesis, ya que hemos observado que aquellas accesiones

que presentaron mayor capacidad de generar aerénquima en sumersión parcial, y por

58

ende mayor potencial de aireación de sus tejidos sumergidos (datos presentados en el

capítulo 2, Figura 2.6), fueron las que mayor tolerancia presentaron al estrés mixto de

inundación y salinidad. En contraste a esto, para la leguminosa Melilotus siculus, otros

autores (Striker et al., 2015) trabajando con 15 accesiones de esta especie, no

encontraron correlación entre los diferentes grados de porosidad de los tejidos

aerenquimáticos y la tolerancia al estrés mixto de hipoxia y salinidad. No obstante ello,

esta especie constituye una especie anual altamente tolerante a este estrés mixto, por lo

que las variaciones intra-específicas, quizás no sean suficientes para dejar en evidencia

una correlación entre los distintos grados de tolerancia de las accesiones.

3.6. Conclusiones

En conclusión, las evidencias encontradas en este capítulo sugieren que Lotus tenuis fue

capaz de activar principalmente los mecanismos de exclusión de los iones para hacer

frente al estrés por salinidad, y que esos mecanismos persistieron en la situación de

estrés mixto de inundación y salinidad. Si bien se afectó el crecimiento, en

correspondencia con ello, no se observaron daños aparentes por fitotoxicidad. Por otro

lado, la población diploide de L. corniculatus presentó evidencias que, sumado a lo

descrito para L. tenuis, además activaría mecanismos de compartimentalización

subcelular de los iones a nivel de hojas. Por su parte, los resultados obtenidos sugieren

que el híbrido interespecífico podría “heredar” a partir de su parental L. corniculatus

diploide, la capacidad de activar los mecanismos de compartimentalización de los iones

frente a un estrés salino, pero presentando al mismo tiempo un mayor potencial de

crecimiento que el observado para ese parental. Este mayor potencial de crecimiento

posiblemente lo adquiera a partir de su parental L. tenuis, siendo interesante también

que, frente al estrés mixto, incluso presentó una clara tendencia a superar en crecimiento

a este último parental, lo que podría derivar del carácter híbrido del material generado.

Por otra parte, el cultivar comercial tetraploide de L. corniculatus, entre las accesiones

evaluadas, fue el más afectado por el estrés mixto, sugiriendo que los mecanismos de

exclusión activados frente al estrés provocado únicamente por la salinidad, no pudieron

ser mantenidos frente al estrés mixto (inundación más salinidad), por lo que se

duplicaron los niveles de iones nocivos en las hojas. Sumado a esto, tampoco demostró

ser capaz de activar los mecanismos de compartimentalización subcelular de esos iones

nocivos, dando como resultado final, efectos claramente visibles de toxicidad y muerte

de tejidos, lo que conllevó a un fenotipo de la planta muy afectado por el estrés mixto

de salinidad e inundación.

Finalmente es importante destacar que la sumersión parcial morigeró los efectos del

estrés provocado por la salinidad en el material híbrido LtxLc y en la población diploide

de L. corniculatus, cuando estos estreses se aplicaron simultáneamente.

59

4. CAPÍTULO 4. EFECTOS DE LA INUNDACIÓN SOBRE LA FIJACIÓN

BIOLÓGICA DE NITRÓGENO ATMOSFÉRICO DE LA SIMBIOSIS

MUTUALISTA ENTRE Lotus spp. - Mesorhizobium loti

60

4.1. Introducción

El nitrógeno (N) es el cuarto elemento más abundante (detrás de C, O y H) en la

biomasa vegetal (Larcher, 1995). En los ecosistemas terrestres es paradójico que

mientras la biomasa aérea de la planta está expuesta a una atmósfera la cual contiene

alrededor del 78% de gas dinitrógeno (N2), las raíces están constantemente explorando

el suelo en busca de N asimilable y frecuentemente la falta de disponibilidad adecuada

de este nutriente limita severamente el crecimiento. Más del 99,9% del N global existe

como N2 mientras que solo el 0,00001% del N es localizado en la biósfera (Hartwig,

1998).

El N en una escala global está sujeto a un rápido y constante reciclado, y es

eventualmente liberado a la atmósfera como gas N2 y otros gases a partir de

microorganismos desnitrificantes, o de aquel depositado en sedimentos marinos. Los

productores primarios (las plantas) no pueden utilizar directamente al N2 atmosférico

para incorporarlo a sus biomoléculas, por lo que se requiere una continua reducción-

oxidación del mismo a moléculas aprovechables para las plantas, como el nitrato (NO3–)

o el amonio (NH4+). La reducción del N2, constituye una reacción altamente

demandante de energía y en la naturaleza se produce por dos vías: i) descargas eléctricas

(tormentas) y luego depositados en el suelo por las precipitaciones; y ii) biológicamente

catalizada por la enzima nitrogenasa que poseen ciertos microorganismos procariotas

(fijadores).

Entre los microorganismos fijadores de N2, los más eficientes son los que establecen

una simbiosis con plantas superiores, en el cual la energía para la fijación del N2 y el

sistema de protección a oxígeno son provistos por la planta hospedadora (Mylona et al.,

1995). En este tipo de simbiosis, la protección por parte de la planta es brindada por la

formación de estructuras denominadas “nódulos”, generado a partir de una relación de

reconocimiento específica entre la planta y la bacteria. En el interior del nódulo, la

bacteria reduce N2 atmosférico a NH4+ el cual la planta puede asimilar vía la enzima

glutamina sintetasa para formar glutamina. Para romper el triple enlace del N2 son

necesarias grandes cantidades de energía, por lo que la nitrogenasa necesita 16

moléculas de ATP por cada molécula de N2 reducida a NH4+. Por su lado, la bacteria

obtiene de la planta carbohidratos y principalmente malato como fuente de energía y

carbono. Entre las plantas que son capaces de formar nódulos en simbiosis con

procariotas fijadores de N2, sin duda la simbiosis mutualista entre las leguminosas y las

bacterias denominadas comúnmente como rizobios, es la de mayor importancia del

planeta. La fijación biológica del N2 (FBN) producida por este tipo de asociación

significa la fuente natural de N más importante tanto para sistemas ecológicos como

para los agroecosistemas (Smil, 1999). Se ha estimado que mediante tal proceso son

fijados anualmente 200 millones de toneladas de nitrógeno (Graham y Vance, 2003;

Peoples et al., 2009). Por otro lado, los eventos de inundación, provocan una gran

disminución de la FBN en la mayoría de las leguminosas. Una causa de dicha

disminución, puede radicar en la falta de energía que se generaría a partir de a una

alteración en la biosíntesis del ATP en los tejidos sumergidos. Sin embargo, las plantas

tolerantes poseen procesos de adaptación, como la inducción de procesos metabólicos

de fermentación. En este sentido, la fermentación metabólica constituye un proceso que

permite la continuidad de los mecanismos fisiológicos esenciales, entre ellos la

generación de ATP, y la obtención de energía, pero de forma mucho menos eficiente

(Gibbs y Greenway, 2003). Esto se debe a que en condiciones de hipoxia, en la vía

glicolítica, por cada unidad de hexosa, solo dos moléculas de ATP son originadas junto

con dos moléculas de piruvato mientras que de forma simultánea se reduce el NAD+ a

61

NADH. Con el fin de mantenerse la vía glucolítica en actividad, se debe regenerar

continuamente el NAD+ desde NADH y eso es logrado a través del metabolismo

fermentativo. En este sentido, el piruvato puede originar lactato mediante la enzima

lactato deshidrogenasa o generar etanol a través de dos reacciones posteriores

catalizadas por la piruvato descarboxilasa y la enzima alcohol deshidrogenada (Tadege

et al., 1999).

Rocha et al., (2010), trabajando con L. japonicus, observaron que los genes nifH y GS,

se reprimieron fuertemente después de 5 días de anegamiento. Estos genes codifican

enzimas con roles esenciales en la FBN (nifH: codifica para una subunidad de la

nitrogenasa y GS: codifica para la glutamina sintetasa). Sin embargo, James y Crawford

(1998) evaluaron la FBN de L. corniculatus y L. uliginosus en condiciones de anoxia,

encontrando que L. uliginosus formó nódulos eficientes bajo dicha condición, sobre

raíces y tallos. Además observaron que el oxígeno necesario para el bacteroide, es

suministrado hacia los nódulos vía la red de aerénquima y lenticelas a lo largo de tallos,

raíces y los propios nódulos. Simultáneamente dichos autores observaron que en L.

corniculatus tetraploide, se desarrollaba una senescencia temprana de los nódulos. En

otros trabajos, se ha reportado que L. tenuis mantiene los nódulos en condiciones de

anegamiento pero disminuye su eficiencia de fijación de N2 (Mendoza et al., 2005; Real

et al., 2008). En ello radica la importancia de realizar un mayor número de estudios de

los procesos involucrados en la simbiosis, con el fin último de mejorar la FBN en

plantas cultivadas en zonas anegables.

Por lo descrito, surge como objetivo particular para este capítulo de la tesis: evaluar el

efecto de la inundación sobre la FBN y el crecimiento, en dos especies del género Lotus

contrastantes en cuanto a su tolerancia a la inundación.

4.2. Hipótesis

a) La fisiología de la FBN llevada a cabo por la simbiosis mutualista entre bacterias

fijadoras de N2 y Lotus spp. bajo estrés por sumersión parcial, es más afectada en L.

japonicus que en L. tenuis, en correspondencia con la tolerancia relativa reportada para

ambas especies frente a dicho estrés.

b) Los genes de enzimas claves en la FBN se reprimen bajo estrés por sumersión parcial

en la especie más sensible L. japonicus, contribuyendo a la reducción de la eficiencia en

la FBN en esta especie.


4.3.1. Material vegetal

Se utilizaron semillas de L. japonicus ecotipo MG-20 (Lj, menor tolerancia relativa al

anegamiento, y es la especie modelo de estudio de leguminosas de nodulación

determinada) y de una población de L. tenuis naturalizada en un bajo inundable de la

Pampa Deprimida (Lt, mayor tolerancia relativa). Se utilizaron estas dos accesiones

debido a que en estudios previos de este trabajo de tesis ha quedado comprobado que

presentan tolerancias contrastantes frente a la sumersión parcial.

4.3.2. Sistema de cultivo y tratamientos

Las semillas de las dos especies se escarificaron químicamente de la misma manera que

lo explicado en la sección 2.3.1.2 de este trabajo de tesis. Además se desinfectaron

62

utilizando hipoclorito de sodio al 10 % durante 6 minutos y posteriormente se

sembraron en placa de Petri que contenían agar-agua al 0,8 % (p/v) y puestas a germinar

en cámara de cultivo. Seis días después se transplantaron en macetas 300 cm3

conteniendo sustrato lavado constituido por arena y arena de cuarzo (1:1) y esterilizado

mediante doble autoclavado. Inmediatamente transplantadas, las plántulas se inocularon

con Mesorhizobium loti cepa NZP2213, la cual se seleccionó debido a que desarrolla

nódulos efectivos con las dos especies de Lotus evaluadas (Pankhurst et al., 1979,

Pankhurst y Jones, 1979). Se utilizaron plantas “blanco”, sin inocular, y que se

incluyeron solamente con el fin de asegurarse de no encontrar nódulos de rizobios

“contaminantes” en el sistema de cultivo. Todas las plantas se cultivaron durante 21

días en cámara de cultivo en las mismas condiciones que lo explicado en el apartado

3.3.2 pero en este caso siendo regadas con solución nutritiva Evans 1 X sin agregado de

N. De esta manera se asumió que las plantas obtuvieron el N necesario para su

crecimiento, mediante la FBN.

Luego de los 21 días de crecimiento inicial, las plantas se separaron en 2 grupos y se

sometieron durante 28 días a los siguientes tratamientos: -inundación (Inund), las

plantas se sumergieron parcialmente (nivel de agua a 3 cm sobre el sustrato) con

solución nutritiva Evans hipóxica sin nitrógeno; y tratamiento -control (Cont), en el cual

las plantas se regaron también con solución nutritiva Evans sin nitrógeno pero con libre

drenaje.

La solución nutritiva Evans 1 X hipóxica, se trató de la misma manera que lo explicado

en la sección 3.3.2 de esta tesis.

4.3.3. Evaluación de biomasa

Luego de 28 días de tratamientos, se realizó la cosecha del total de la planta, lavándola

cuidadosamente con agua destilada y separándola en 3 fracciones: vástagos, raíces y

nódulos. Las fracciones así separadas se colocaron en sobres de papel y se secaron en

estufa a 70 °C durante 3 días hasta peso constante. Luego de secadas las muestras, se

pesaron con ayuda de una balanza analítica.

En el momento de la cosecha, parte de las muestras frescas de raíces y nódulos, se

congelaron en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 ºC hasta su utilización para

extracción de ARN.

4.3.4. Determinación de nitrógeno

La concentración de N total para las distintas fracciones de biomasa, se determinó

mediante la técnica de Kjeldahl, propuesta por Nelson y Sommers (1973) que

principalmente consta de tres etapas: digestión, destilación y titulación. Se utilizaron 50

mg de material seco y molido, se colocó en tubos de vidrio Pirex® y se les agregó 4 ml

de H2SO4 y una alícuota del catalizador (K2SO4/CuSO4 1/15). Los tubos con la mezcla

se calentaron a 460 °C durante 5 minutos. Posteriormente se agregó un volumen de 10

ml de H2O2 y se digirió 1 minuto más a 460 °C. Luego de la digestión completa de las

muestras, se llevó a un volumen de 50 ml finales con agua miliQ. De ese volumen se

tomó una alícuota de 10 ml para la destilación, a la cual, se le agregó 3 ml de NaOH

para neutralizar la muestra. La destilación se realizó durante 5 minutos y el destilado

obtenido se recogió dentro de un erlenmeyer conteniendo 10 ml de ácido bórico y un

indicador para titulación (verde de bromocresol y rojo de metilo). Posteriormente, la

63

etapa de la titulación se realizó con H2SO4 0,004 N y los valores se estimaron mediante

una curva de calibración construida con glicina digerida y destilada de la misma manera

que las muestras.

Con los datos obtenidos de N total y el peso seco de los nódulos, se estimó la

“capacidad de fijación” o “eficiencia de fijación” de los nódulos de la siguiente manera:

contenido de N fijado (mg) por planta por unidad de MS de nódulo (g).

4.3.5. Determinación de parámetros de la eficiencia del fotosistema II

El día previo a la cosecha de la biomasa, es decir a los 20 días de comenzado los

tratamientos, se determinaron los parámetros Fv/Fm y PIabs en la cuarta hoja expandida

contando a partir del ápice. El procedimiento se realizó de la misma manera que lo

detallado en la sección 2.3.1.5 de la tesis.

4.3.6. Expresión relativa de genes

Para poder evaluar la expresión relativa de genes mediante PCR en tiempo real (qRT-

PCR), se obtuvo el ADN copia (ADNc) de muestras de raíces noduladas, tomando

aproximadamente 100 mg de peso fresco. El procedimiento para obtener ADN copia se

llevó a cabo siguiendo el protocolo explicado en la sección 3.3.7 de esta tesis. Los genes

que se evaluaron mediante su expresión relativa fueron: i) nifH, que codifica para una

unidad del complejo enzimático de la nitrogenasa del bacteroide; ii) GS, que codifica

para la enzima glutamina sintetasa de la planta; iii) PDC, que codifica para la enzima

piruvato descarboxilasa de la planta; iv) ADH, que codifica para la enzima alcohol

deshidrogenasa de la planta. Las dos primeras son claves en la FBN y las dos últimas

son enzimas que se inducen en aquellas plantas capaces de activar el metabolismo

fermentativo.

Los niveles de transcriptos se normalizaron contra el gen EF-1α, excepto el gen de la

bacteria nifH el cual se normalizó contra el gen de expresión constitutiva sigA. Los

cebadores utilizados son detallados en la Tabla 4.1.

Tabla 4.1. Lista de cebadores utilizados

Nombre del gen Dirección Secuencia del cebador (5’→3’) Referencia

Subunidad H de la

nitrogenasa (nifH)

Sentido TCCAAGCTCATCCACTTCGTG Ott et al., 2005

Antisentido AGTCCGGCGCATACTGGATTA Ott et al., 2005

Glutamina sintetasa

1 (GS)

Sentido GGGAATTCCAAGTTGGCCCTTCAG Rocha et al., 2010

Antisentido AACGAGCAACCCACACCTCATC Rocha et al., 2010

Piruvato

descarboxilasa

(PDC)

Sentido GCCTGCGAATTGTGGTTATGA Andreadeli et al.,

2009 Antisentido TAGCGCCTACTGACCAACCAA

Alcohol

deshidrogenada

(ADH)

Sentido TCTTTGGACTTGGAGCTGTTGGC Rocha et al., 2010

Antisentido TGATGCACCAGAAACCCTTGCC Rocha et al., 2010

sigA Sentido GCCCTCTGCTCGACCTTTCC Ott et al., 2005

Antisentido AGCATCGCCATCGTGTCCTC Ott et al., 2005

Factor de elongación

1-alfa (EF-1α)

Sentido TGACAAGCGTGTGATCGAGAGG Escaray et al., 2014

Antisentido GATACCTCTTTCACGCTCAGCCTT Escaray et al., 2014

64

4.3.7. Diseño experimental y análisis de datos

Se utilizó un diseño completamente al azar con arreglo factorial de los tratamientos en

dos factores fijos. Los factores fueron: i) accesión, con dos niveles (Lj y Lt); ii)

inundación, con dos niveles (sumersión parcial y libre drenaje o control).

El análisis estadístico constó de un ANVA a 2 vías y cuando se detectó interacción

significativa (p<0,05) entre los factores, se realizó la prueba de comparación múltiple de

medias de Duncan (p<0,05). Previamente se verificaron los supuestos de normalidad y

homogeneidad de varianzas.

Los análisis de los parámetros del fotosistema II y de la expresión relativa de genes se

realizaron como lo explicado en el apartado 3.3.8 de esta tesis.

4.4. Resultados

4.4.1. Parámetros de crecimiento y formación de nódulos

Mediante la determinación de la biomasa total de cada planta, se observó que las

accesiones respondieron de manera diferencial frente a la sumersión parcial en nuestras

condiciones experimentales (se detectó interacción significativa entre los factores

inundación y accesión). Las plantas de la especie modelo Lotus japonicus (Lj),

sometidas al tratamiento de inundación, disminuyeron su biomasa un 48 % en

promedio, con respecto a las plantas cultivadas en situación control. Esto contrasta con

lo observado en simultáneo en la respuesta de la accesión de L. tenuis (Lt) evaluada

(Figura 4.1.A). Además, se observó clorosis en las hojas de más edad (basales) y

absición de alguna de ellas, únicamente en las plantas de la accesión Lj que se

sometieron a inundación (Figura 4.1.B).

65

Figura 4.1. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre la biomasa de plantas

de Lotus japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con Mesorhizobium loti. A: Biomasa total

por planta (n=6 ±DE) en g de materia seca (MS). Barras sin ninguna letra en común difieren

significativamente (Prueba de Duncan, p<0,05). El porcentaje muestra la reducción de biomasa

de las plantas inundadas con respeto a las controles. B: Fotografías de plantas representativas al

momento de la cosecha. Las líneas punteadas blancas sobre las fotografías de las plantas

tratadas representan el nivel de agua al cual se sometieron durante la sumersión parcial, y

también representan 5 cm. Cont: tratamiento control; Inund: tratamiento de sumersión parcial.

Por otra parte, se determinó que la formación de nódulos en la accesión Lj, se afectó por

el tratamiento de inundación aplicado. En este sentido, el número de nódulos y el peso

de cada nódulo en promedio, se redujeron significativamente en Lj, mientras que esto

Cont Cont Inund Inund

Lj Lt

B

A

Lj Lt

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8 Cont

Inund

b

aa

a48%

Bio

ma

sa

to

tal (g

MS

pla

nta

-1)

66

no ocurrió en Lt (Figura 4.2.B y C). Asimismo, la biomasa total de nódulos por planta,

en Lj, se redujo en un 70 % con respecto a las plantas cultivadas en condición control

(Figura 4.2.A).

Figura 4.2. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre los nódulos de plantas

de Lotus japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con Mesorhizobium loti. A: biomasa de

nódulos en g de MS por planta; B: número de nódulos por planta; C: biomasa media en mg de

MS por nódulo. Barras sin ninguna letra en común difieren significativamente (Prueba de

Duncan, p<0,05; n=6 ±DE). Los porcentajes muestran la reducción de cada variable de las

plantas inundadas con respeto a las controles. D: Fotografías de plantas representativas

mostrando en detalle del estado de los nódulos al momento de la cosecha. Cont: tratamiento

control; Inund: tratamiento de sumersión parcial.

4.4.2. Concentración de nitrógeno en la planta

En cuanto a la concentración de N total en planta entera, se observó que el tratamiento

de inundación aplicado, redujo su concentración en ambas accesiones evaluadas, pero

en diferentes magnitudes (se detectó interacción entre los factores inundación y

accesión). En este sentido, se determinó que las plantas de Lj sometidas al tratamiento

de inundación, en promedio redujeron un 41 % su concentración de N con respecto a las

plantas cultivadas en situación control. Para el caso de Lt, bajo las mismas condiciones

de estrés, la concentración de N, sólo se redujo el 20 % (Figura 4.3.A).

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05 Cont

Inund

b

a

a

a

70%

Nó

du

los (

g M

S p

lan

ta-1

)

0

20

40

60

80

100

c

a

ab

b

51%

Nó

du

los (

# p

lan

ta-1

)

Lj Lt

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8a

bab

b

34%

Nó

du

lo (

mg

nó

du

lo-1

)

A

B

C

D

Cont Inund

Lj

Lt

67

La capacidad o eficiencia de fijar N por unidad de peso seco de los nódulos, también se

redujo en Lj en un 52 % en promedio en aquellas plantas sometidas al tratamiento por

inundación. En Lt bajo idénticas condiciones de estrés, no se observó una reducción

significativa de dicho parámetro (Figura 4.3.B).

Figura 4.3. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre la FBN en plantas de L.

japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con M. loti. A: concentración porcentual de N total

por planta. B: eficiencia de FBN de los nódulos (contenido en mg de N fijado por g de MS de

nódulo). Los porcentajes muestran la reducción de la concentración de N de las plantas

inundadas con respeto a las controles. Barras sin ninguna letra en común difieren

significativamente (Prueba de Duncan, p<0,05; n=6 ±DE). Cont: tratamiento control; Inund:

tratamiento de sumersión parcial.

4.4.3. Expresión relativa de genes vinculados a la FBN y a la hipoxia en raíces

La expresión relativa de los genes nifH y GS (que codifican enzimas fundamentales para

la FBN), se reprimió fuertemente en las raíces noduladas de plantas de Lj sometidas a la

condición de inundación con respecto a las plantas cultivadas en situación control. En

contraste, en la accesión Lt bajo la situación de inundación, no se reprimió la expresión

relativa del gen GS y sí se observó una disminución en la expresión del gen nifH, pero

en mucho menor grado que lo observado simultáneamente para Lj (Figura 4.4.A y B).

Por otro lado, las expresiones relativas de los genes PDC y ADH, (que codifican

enzimas del metabolismo fermentativo), se indujeron en ambas accesiones sometidas a

las condiciones de inundación (Figura 4.4.C y D).

Lj Lt

0

1

2

3

4

c

aa

b

41%20% Cont

Inund

N t

ota

l p

lan

ta (

% d

e la M

S)

A B

Lj Lt

0

10

20

30

40

50

b

a

c

ab52%

Efi

cie

ncia

de

lo

s n

ód

ulo

s

(mg

N e

n p

lan

ta/g

de

MS

de

nó

du

lo)

68

Figura 4.4. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre la expresión relativa de

genes vinculados a enzimas de la FBN y del metabolismo fermentativo en plantas de L.

japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con M. loti. A: expresión relativa del gen (nifH) de

una subunidad de la nitrogenasa. B: expresión relativa del gen GS de la glutamina sintetasa. C:

expresión relativa del gen (PDC) de la piruvato descarboxilasa. D: expresión relativa del gen

(ADH) de la alcohol deshidrogenasa. La presencia de los asteriscos sobre las barras

correspondiente al tratamiento de inundación, representan diferencias significativas con respecto

a su control (* p<0,05; ** p<0,01; n=6 ±DE). Cont: tratamiento control; Inund: tratamiento de

sumersión parcial.

4.4.4. Parámetros de la eficiencia del fotosistema II

Los parámetros Fv/Fm y PIabs, que estiman la eficiencia del fotosistema II, obtenidos

mediante la fluorescencia transitoria de la clorofila, disminuyeron en las plantas de Lj

bajo condiciones de sumersión parcial con respecto a la situación control. Sin embargo,

los mismos parámetros no se afectaron significativamente en la accesión Lt (Figura 4.5).

Lj Lt

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

*GS

(2

-dd

Ct )

Lj Lt

0

2

4

6

*

*

PD

C (

2-d

dC

t )

Lj Lt

0

5

10

15

20 **

*

AD

H (

2-d

dC

t )

A B

C D

Lj Lt

0.0

0.5

1.0

1.5

**

*

Cont

Inund

nif

H(2

-dd

Ct )

69

Figura 4.5. Efecto de 28 días de inundación en sumersión parcial sobre dos parámetros de la

eficiencia del fotosistema II en plantas de L. japonicus (Lj) y L. tenuis (Lt) en simbiosis con M.

loti. A: Eficiencia cuántica máxima del fotosistema II (Fv/Fm). B: índice de performance (PI

abs). Los asteriscos sobre las barras correspondientes a las plantas inundadas representan

diferencias significativas con respecto a su control, de acuerdo a una prueba de t (p<0,05; n=6

±DE).

4.5. Discusión

Los resultados obtenidos en este capítulo de tesis, junto con aquellos obtenidos en el

capítulo 2 demostraron que las plantas de L. tenuis (Lt) y de L. japonicus (Lj), fueron

diferencialmente afectadas por el estrés de sumersión parcial. Además, en este capítulo

se observó que la FBN fue más afectada en la especie más sensible al estrés por

inundación, es decir en L. japonicus. Esto se determinó mediante el análisis de la

reducción de la biomasa, la disminución de la eficiencia del fotosistema II y por la

aparición de clorosis con abscisión de hojas basales, rasgos típicos de la deficiencia por

N (Figura 4.1 y Figura 4.5). Estos resultados también sugieren que la mayor tolerancia

frente al estrés por sumersión parcial que se encuentra en L. tenuis, podría estar

vinculada al hecho de que en tales condiciones estresantes continuaría fijando N2

atmosférico, mientras que en la accesión menos tolerante no se podría mantener la FBN

eficientemente. Una mayor discusión de este tipo de respuestas diferenciales

encontradas frente a la sumersión parcial entre estas dos accesiones se realizó en el

capítulo 2 de este trabajo de tesis.

Por otro lado, los resultados de la inducción de la expresión relativa de los genes que

codifican para las enzimas del metabolismo fermentativo, indicaron que tanto Lj como

Lt respondieron a la hipoxia producida por la sumersión parcial (Figura 4.4.C y D),

siendo ampliamente reconocido que la inducción de estos genes son indicativos de tal

condición metabólica (Bologa et al., 2003; Ismond et al., 2003; Rocha et al., 2010). En

este mismo sentido, nuestros datos además sugieren que las dos accesiones activarían el

metabolismo fermentativo para obtener energía bajo estas condiciones de estrés, lo cual

constituye una respuesta metabólica característica que poseen las plantas tolerantes

frente a la hipoxia provocada por la inundación (Gibbs y Greenway, 2003). De todas

maneras, teniendo en cuenta que el metabolismo fermentativo es muy ineficiente desde

el punto de vista de producción de ATP, este mecanismo no bastaría para mantener una

adecuada FBN. En ese sentido, si bien las dos accesiones activarían el metabolismo

fermentativo, la FBN disminuyó fuertemente sólo en Lj, lo que pondría en evidencia

que en Lt se involucrarían otros mecanismos de compensación, para mantener una

adecuada oferta de energía y carbono para los bacteroides.

Lj Lt

0

2

4

6

8

*

PI ab

s

Lj Lt

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90 Cont

Inund

*F

v/F

m

A B

70

Nuestros resultados demostraron que la sumersión parcial provocó una fuerte

disminución en la FBN en Lj en comparación a una situación de crecimiento en

solución de riego con libre drenaje y también en comparación a Lt. Los resultados

además sugieren, que la disminución en la cantidad de N fijado durante la simbiosis Lj-

M. loti, estaría provocada por dos motivos: i) la menor biomasa de nódulos alcanzada en

las plantas inundadas; ii) la disminución en la capacidad intrínseca de cada nódulo en

fijar nitrógeno.

i) En el caso de la reducción de la biomasa total de nódulos por planta, se produjo tanto

por la disminución del número total de nódulos como por la disminución del peso de

cada nódulo en sí mismo (Figura 4.2). Considerando las posibles causas en la reducción

del número de nódulos, previamente ha sido observado que en suelos anegados, la etapa

más temprana de la formación del nódulo se dificulta en muchas plantas leguminosas,

ya que la acumulación de etileno inhibe la formación de los pelos radiculares, siendo

éstos muy importantes para realizar la primera fase de la infección mediante la

curvatura del pelo radicular que será posteriormente infectado (Goormachtig et al.,

2004; Sprent, 2007). También ha sido reportado que la aplicación exógena de etileno o

de alguno de sus precursores, inhibe la nodulación en varias leguminosas (Okasaki et

al., 2004) limitando su número (Ma et al., 2004; Nukui et al., 2006). Con respecto a la

importancia que existe en el desarrollo de una determinada biomasa de nódulos, se sabe

que existe una alta correlación positiva entre la biomasa de los mismos y la cantidad de

N fijado por la simbiosis, lo que afecta en definitiva, el normal crecimiento de las

plantas.

ii) La pérdida de funcionalidad de los nódulos, se observó en la reducción de la

eficiencia de fijación de N por unidad de biomasa de los nódulos (Figura 4.3.B). Otro

resultado que sugiere fuertemente la pérdida de la capacidad intrínseca de fijar N por

parte de los nódulos en la condición de inundación de la accesión Lj, fue que se

redujeron los niveles de expresión del gen de la nitrogenasa con respecto a las plantas

cultivadas con libre drenaje (Figura 4.4.A). Esta observación concuerda con lo

encontrado por Rocha et al. (2010), quienes trabajando con la especie modelo L.

japonicus (aunque con el ecotipo Gifu-129) determinaron que el anegamiento redujo los

niveles de expresión del gen nifH, y también, al igual que lo observado en nuestro

trabajo, se redujo la expresión del gen GS. Las enzimas que codifican estos genes son

claves en la FBN, y las expresiones de los mismos indicarían una falla metabólica,

dejando en evidencia que en Lj existiría una incapacidad para mantener las condiciones

necesarias en el nódulo para una FBN adecuada. Simultáneamente pudo también

demostrarse que Lt tuvo una mayor capacidad para mantener el sistema en un

funcionamiento adecuado, ajustando las condiciones fisiológicas para mantener una

adecuada capacidad para la FBN. En este sentido, tendría un rol de relevancia la

propiedad de las plantas tolerantes, para generar tejido aerenquimático de los órganos

sumergidos. Con respecto a esto, los resultados presentados en el capítulo 2 (Figura 2.6)

permitieron observar una respuesta contrastante para esta característica entre estas dos

accesiones. Esta hipótesis estaría de acuerdo con lo encontrado para otras especies del

género Lotus en que se le adjudicó la mejor respuesta de L. uliginosus a la mayor

porosidad de las plantas hipóxicas con respecto a L. corniculatus tetraploide, en la cual

se observó (a diferencia de lo observado para L. uliginosus) una senescencia más

temprana de los nódulos (James y Crawford, 1998). Estas respuestas podrían deberse en

gran medida a una mejor producción de ATP en aquellas plantas que poseen una mayor

capacidad para formar y conectar sus tejidos aéreos y los sumergidos mediante el

incremento de su porosidad (formación de aerénquima), y de esta manera transportar

más eficientemente el O2 a los distintos órganos sumergidos (base de tallos, raíces y

71

nódulos). Sin embargo, eso no explicaría la elevada inducción de los genes utilizados

como indicadores de la situación de hipoxia (PDC y ADH). Una explicación posible es

que la inundación pueda estar afectando la adquisición de algún otro elemento clave

adicional requerido para una adecuada FBN, como podría ser por ejemplo el molibdeno

(cofactor de la nitrogenasa).

4.6. Conclusiones

La concentración de nitrógeno en las plantas de L. tenuis fue mucho menos afectada por

la inundación, que en las plantas de L. japonicus, en las cuales dicha concentración se

redujo a la mitad. Por lo tanto, la FBN fue afectada diferencialmente según el nivel de

tolerancia intrínseco de cada especie leguminosa considerada.

La sumersión parcial indujo la expresión relativa de los genes que codifican para

enzimas del metabolismo fermentativo en ambas accesiones, indicando una situación de

hipoxia en las raíces noduladas de ambas accesiones estudiadas (Lj y Lt).

La expresión relativa de genes, que codifican para enzimas importantes de la FBN,

mostraron una clara vinculación con la concentración de N total de las plantas entre

cada uno de los tratamientos (control vs estrés).

La reducción en la biomasa y de los parámetros que estiman la eficiencia del

fotosistema II, también dejaron en evidencia que Lj fue menos tolerante a la sumersión

parcial que Lt cuando se cultivaron en ausencia de suministro mineral de N, lo que

condiciona su incorporación al obtenido por medio de la FBN.

72

5. CAPÍTULO 5. CONSIDERACIONES FINALES

73

Contraste de hipótesis planteadas

Partiendo del objetivo general propuesto de “ampliar el conocimiento sobre el género

Lotus y su relación simbiótica con rizobios frente a condiciones restrictivas de

crecimiento, con énfasis en la finalidad de incrementar su aprovechamiento en áreas

inundables tales como los de la Pampa Deprimida”, se plantearon inicialmente diversas

hipótesis, que se pusieron a prueba en los tres capítulos experimentales de este trabajo

de tesis. El estudio consistió en evaluar el estrés provocado por sumersión parcial sobre

diferentes accesiones del género Lotus.

En el primer capítulo experimental (capítulo 2 de la tesis), teniendo en cuenta el

origen de las accesiones se plantearon 2 hipótesis: i) “la población diploide de L.

corniculatus de la Albufera de Valencia, por estar adaptada a zonas inundables en su

lugar de origen, tiene características morfológicas y anatómicas más aptas para tolerar

períodos prolongados de sumersión parcial que el cv. comercial tetraploide de L.

corniculatus (San Gabriel)” y ii) “las características morfológicas y fisiológicas (la

capacidad de generar abundante aerénquima y raíces adventicias entre otras) que le

conceden a la especie L. tenuis una elevada tolerancia frente a la sumersión parcial son

transferidas a la descendencia híbrida en el cruzamiento interespecífico con L.

corniculatus de la Albufera de Valencia. De esta manera el híbrido interespecífico

obtenido en procura de realizar una mejora de la calidad forrajera, posee también las

características de tolerancia al estrés por sumersión parcial”. Estas hipótesis se

pusieron a prueba mediante el estudio las respuestas morfológicas, anatómicas,

fisiológicas y de acumulación de biomasa, de plantas adultas de 5 accesiones del género

Lotus frente a un estrés prolongado de sumersión parcial. Además, se evaluó un período

de recuperación post-inundación. También se estudió el poder germinativo de las

semillas de las mismas accesiones bajo sumersión. Teniendo esto en cuenta, y a partir

de los resultados obtenidos a nivel de planta adulta, se pudo establecer que la primera de

las hipótesis planteadas era correcta y por lo tanto concluir que la accesión diploide de

L. corniculatus es más tolerante al estrés por sumersión parcial. Tomando en conjunto

las respuestas de las diferentes accesiones referidas a la acumulación de biomasa, a la

producción de raíces adventicias, a la formación de tejido aerenquimático, a las tasas de

crecimiento relativo y de fotosíntesis neta, a la integridad de membranas, entre otras,

frente al estrés por sumersión parcial en un período prolongado, las accesiones que se

mostraron más tolerantes fueron en primer lugar L. tenuis, seguida por el material

híbrido interespecífico. Luego se ubicaría la población diploide de L. corniculatus. Bajo

idénticos criterios de tolerancia relativa, las accesiones más sensibles fueron el cv.

tetraploide de L. corniculatus y la especie modelo L. japonicus. Además, y brindando

un nuevo objetivo de estudio para lo mediato, también pudo establecerse que la

germinación bajo una inundación de poca profundidad, estaría asociada al nivel de

tolerancia en estado de planta adulta.

En el segundo capítulo experimental (capítulo 3 de la tesis) se plantearon las hipótesis

de que “la mayor tolerancia frente al estrés mixto de inundación y salinidad que poseen

algunas accesiones de Lotus spp. se debe a la capacidad de mantener activos los

mecanismos que tienen para tolerar al estrés por salinidad, aún bajo condiciones de

sumersión parcial: i) mecanismos que evitan la acumulación perjudicial de iones en

vástago; y ii) mecanismos de compartimentalización subcelular de iones nocivos”. Las

hipótesis de este capítulo se pusieron a prueba estudiando parámetros fisiológicos, de

concentración de iones en las hojas, expresión de genes vinculados a la

compartimentalización subcelular de los iones y la acumulación de biomasa. Dichas

evaluaciones se realizaron en plántulas de diferentes accesiones del género Lotus

74

sometidas al estrés mixto de inundación y salinidad. A partir de los resultados obtenidos

se pudo concluir que en las plantas de Lotus spp., que presentan tolerancia diferencial al

estrés mixto de inundación y salinidad, son capaces de “ponerse en juego” mecanismos

de tolerancia diferentes, lo cual brinda una nueva base de estudio para establecer

novedosos criterios y parámetros de selección en los programas de mejoramiento en

leguminosas. En este sentido se encontraron evidencias de que en la especie L. tenuis

frente al estrés por salinidad, se prioriza la activación de los mecanismos de exclusión

de los iones tóxicos, y que los mismos son eficazmente conservados aún frente al estrés

mixto de inundación y salinidad. Por su parte, nuestros resultados sugieren que en la

población diploide de L. corniculatus de colecta propia, además de los mecanismos de

exclusión, se activan mecanismos adicionales de tolerancia mediante la

compartimentalización subcelular de los iones tóxicos. En base a los resultados

obtenidos, también se puede sugerir que el material híbrido interespecífico presentó la

mejor respuesta general frente al estrés mixto entre inundación y salinidad,

probablemente debido a adoptar características de tolerancia relacionadas con los

mecanismos de compartimentalización subcelular de los iones de su parental L.

corniculatus diploide y características de L. tenuis en cuanto a su mayor potencial de

crecimiento. Por último, los resultados obtenidos permitirían hipotetizar que el cultivar

comercial tetraploide de L. corniculatus frente al estrés mixto de inundación y salinidad,

no es capaz de mantener activos los mecanismos de tolerancia, y por lo tanto, resulta

fuertemente afectado por el mismo.

En el tercer capítulo experimental (capítulo 4 de la tesis) se plantearon las hipótesis de

que i) “la fisiología de la FBN llevada a cabo por la simbiosis mutualista entre

bacterias fijadoras de N2 y Lotus spp. bajo estrés por sumersión parcial, es más

afectada en L. japonicus que en L. tenuis, en correspondencia con la tolerancia relativa

reportada para ambas especies frente a dicho estrés” y ii) “los genes de enzimas claves

en la FBN se reprimen bajo estrés por sumersión parcial en la especie más sensible L.

japonicus, contribuyendo a la reducción de la eficiencia en la FBN en esta especie”.

Las mismas se pusieron a prueba mediante la evaluación de características fisiológicas,

de crecimiento y de expresión de genes vinculados a la FBN frente al estrés por

sumersión parcial, sobre dos accesiones del género Lotus contrastantes en cuanto a su

tolerancia a dicho estrés según lo determinado en los estudios previos en este trabajo de

tesis. Las accesiones estuvieron asociadas simbióticamente con una cepa microbiana

efectiva para ambas especies. A partir de los resultados obtenidos, se concluyó que, si

bien la sumersión parcial causa hipoxia en las raíces noduladas, la FBN es afectada

diferencialmente entre las especies, y que la misma presenta una correspondencia con la

tolerancia inherente de las especies vegetales, aceptando la hipótesis planteada.

Discusión general de los principales hallazgos y perspectivas derivadas

La obtención de leguminosas forrajeras de elevada calidad, y aptas para suelos

anegables, es de gran interés debido a que este tipo de ambientes limitan en gran medida

el cultivo de la mayoría de las especies leguminosas forrajeras más utilizadas a nivel

global, como por ejemplo la alfalfa y el trébol blanco. Es sabido que ciertas poblaciones

de especies forrajeras del género Lotus se destacan por su buena adaptabilidad a

ambientes de baja aptitud agrícola (Escaray et al., 2012), lo que favorece su

implantación y su persistencia en este tipo de ecosistemas. El uso de especies del género

Lotus con fines forrajeros a su vez, se vería favorecido si se pudiera contar con

cultivares de mejor calidad forrajera, es decir, que a la producción de materia seca en

75

ambientes marginales, se le sumen otros atributos tales como un adecuado/óptimo nivel

de taninos condensados foliares. Cabe destacar que los taninos condensados foliares en

forrajeras, en niveles de hasta 45 mg por g de MS, han sido vinculados a numerosas

ventajas para la alimentación de los rumiantes, incluyendo aquellos que demuestran que

los mismos previenen el “meteorismo” o “empaste” (Li et al., 1996; Waghorn y Shelton

1997) (dicha problemática es muy importante en otras leguminosas carentes de los

taninos condensados como la alfalfa y el trébol blanco); aumentan la eficiencia en el

aprovechamiento de las proteínas, ya que los taninos condensados forman complejos en

el rumen con ellas evitando su degradación por las bacterias allí alojadas y como

consecuencia, aumentando su aprovechamiento a nivel intestinal (Aerts et al., 1999);

disminuyen la carga de parásitos internos (Niezen et al., 1995; Otero y Hidalgo, 2004) y

reducen de la emisión de metano producido en la fermentación entérica: es menester

recordar la creciente importancia en el ámbito de la investigación de esta última

temática, por ser el metano un potente gas del efecto invernadero, ya que su incidencia

se considera 25 veces más significativa en el cambio climático global, que las

concentraciones equivalentes de CO2 (Tavendale et al., 2005; Patra y Saxena, 2010). En

este sentido, los cultivares de L. corniculatus son considerados de mayor calidad

forrajera que los materiales de L. tenuis, por poseer niveles adecuados de taninos

condensados para la alimentación de rumiantes y por tener un mayor potencial de

producción de biomasa forrajera, pero numerosos reportes (incluyendo nuestro trabajo)

ha dejado en evidencia que dichos materiales no prosperan en suelos anegables, lo que

establece un claro contraste con L. tenuis. En el capítulo 2 del presente trabajo de tesis

se ha evaluado la respuesta frente a la inundación del híbrido interespecífico entre L.

tenuis y L. corniculatus (LtxLc) obtenido en nuestro laboratorio, el cual posee

características mejoradas desde el punto de vista de la calidad forrajera con respecto a

su parental L. tenuis, teniendo en cuenta los niveles de taninos condensados que posee

dicho material. Los resultados de este trabajo de tesis, tomados en conjunto sugieren

que el híbrido LtxLc sería tan apto como L. tenuis en ofrecer forraje para el ganado en

los suelos anegables, pues alcanza el mismo nivel de acumulación de biomasa aérea

luego de 35 días de recuperación post-inundación. Asimismo, se observa que tanto el

material híbrido como L. tenuis poseen mejores aptitudes forrajeras en ambientes

marginales que L. corniculatus tetraploide, el cual, a pesar de sus reconocidas

características forrajeras (buen aporte de MS y concentraciones adecuadas de taninos

condensados foliares), no lograría una implantación efectiva en los ecosistemas donde

predominan las condiciones de estrés evaluadas.

En virtud de explicar las diferencias observadas en cuanto a la tolerancia de los

materiales vegetales evaluados, una de las respuestas que más se asoció a la misma en

nuestros resultados fue la capacidad de generar tejido aerenquimático en los órganos

sumergidos, y la generación y mantenimiento de raíces adventicias. Estas dos

características y su vinculación con la tolerancia en anegamientos prolongados, apoyan

a lo reportado anteriormente por otros autores para distintas especies vegetales

(Armstrong, 1979; Colmer y Voesenek, 2009; Voesenek y Bailey-Serres, 2015).

Las respuestas adaptativas de las accesiones más tolerantes (L. tenuis y el material

híbrido) incluyó que las mismas en estrés por sumersión parcial, mantuvieron una tasa

de fotosíntesis neta similar a sus controles, lo que contrastó con lo observado en las

accesiones menos tolerantes (el cultivar tetraploide de L. corniculatus y la especie

modelo L. japonicus). Nuestros resultados referidos a la tasa fotosintética fueron

consistentes con lo reportado previamente en L. corniculatus por otros autores (Striker

et al., 2005) y fueron coherentes con la biomasa que lograron acumular esas accesiones

durante el período de inundación. Cabe destacar que el aquí presentado, es el primer

76

reporte de un híbrido interespecífico del género Lotus evaluado bajo estas condiciones

de estrés, y entendemos como necesario, realizar una proyección de nuestros estudios

mediante una evaluación equivalente a nivel de parcelas de campo para comprobar los

resultados evaluados en invernáculo. Asimismo, también nos proponemos como

objetivo de estudio inmediato, evaluar los aspectos relativos a la calidad forrajera del

material híbrido vinculados al contenido de taninos condensados en cuanto a su

potencial importancia a nivel de la mitigación de la producción de metano en rumiantes

y en el control de parásitos. Además se evaluarían posibles fluctuaciones del nivel de

taninos en el forraje cuando el material híbrido es afectado por el efecto de las

inundaciones y por su eficiencia frente a ciclos alternantes del “agua útil”.

Con respecto a las respuestas frente al estrés mixto de salinidad e inundación de las

accesiones de Lotus y que se detallaron en el capítulo 3 de este trabajo de tesis, es

menester destacar que las evaluaciones tuvieron en cuenta muy diversos parámetros

entre los que se incluyeron: la acumulación de biomasa; mecanismos fisiológicos tales

como el intercambio neto de CO2 y la eficiencia del fotosistema II; la determinación de

la concentración de iones (Na+, Cl– y K+), y respuestas moleculares a nivel de

transcritos asociados a la compartimentalización subcelular de los iones nocivos. Como

resultado de los mismos, hemos podido demostrar que los mecanismos de respuesta

planteados en las hipótesis de trabajo difirieron entre las accesiones evaluadas. En este

sentido, los resultados obtenidos a partir de la evaluación de la expresión relativa de

genes vinculados a la compartimentalización subcelular de los iones Na+ y Cl–, tuvieron

como antecedente, lo observado para L. tenuis y L. corniculatus tetraploide (Teakle et

al., 2010) frente al estrés mixto de inundación y salinidad, que dejaron en evidencia que

la expresión relativa del gen del intercambiador Na+/H+ (LtNHX1) era inducido en las

raíces de L. tenuis y no las de L. corniculatus tetraploide. Los mismos autores sugirieron

que una mayor compartimentalización de Na+ en las vacuolas de las raíces, evitaría que

el Na+ sea transportado al vástago, y de esta manera ejerza, su reconocido efecto

detrimental, lo que contrasta claramente con lo reportado para el L. corniculatus

tetraploide. Sin embargo, estos mismos autores, no evaluaron la expresión de LtNHX1

en vástago, y a partir de ello, una de nuestras hipótesis de trabajo consistió en que la

mayor tolerancia relativa determinada para alguna de las accesiones evaluadas, podría

estar relacionada con un uso más eficiente del mismo mecanismo de

compartimentalización del Na+ a nivel de vástago, en correspondencia con los

determinados en la raíz. Teniendo en cuenta que en dos de las accesiones que mejor

toleraron el estrés mixto de inundación y salinidad (el material híbrido y su parental

LcD) se acumularon niveles de Na+ que podrían haber sido tóxicos para los vástagos en

crecimiento, y habiéndose determinado que simultáneamente se observó una inducción

de la expresión relativa de LtNHX1 en los ápices, podemos sugerir que existiría una

compartimentalización de Na+ evitando así su efecto tóxico en el citoplasma. Por su

parte, los evidentes fenotipos de toxicidad iónica observados en los vástago del L.

corniculatus tetraploide bajo estrés mixto de inundación y salinidad, también

permitirían sugerir que este mecanismo de tolerancia no se encontraría activo en esta

accesión en tal condición, ni a nivel de raíces (Teakle et al., 2010) ni en vástagos (este

trabajo de tesis). Nuestro trabajo además incluyó el estudio, por primera vez para una

leguminosa, de la expresión relativa del gen CLC-f el cual codifica para un canal de Cl–,

que intervendría en su compartimentalización en las vesículas subcelulares del aparato

de Golgi. El gen que codifica para dicho transportador, se indujo diferencialmente frente

el estrés mixto de inundación y salinidad en las dos mismas accesiones que toleraron

altas concentraciones de los iones tóxicos en vástagos sin mostrar daños por toxicidad

(el material híbrido y su parental L. corniculatus diploide), lo que contrastó con lo

77

observado para las demás accesiones. De estas evidencias, surge la necesidad de más

estudios que evalúen la localización y funcionalidad in situ de este canal de Cl– para una

mejor comprensión de las evidencias reportadas en nuestro trabajo. Es importante tener

en cuenta, que los reportes actualmente disponibles en la literatura especializada,

sugieren fuertemente que la tolerancia de las plantas leguminosas está más asociada a

una adecuada regulación de la concentración citoplasmática del anión Cl– que a la del

catión Na+ (revisado por Teakle y Tyerman, 2010). Por ello, entendemos como de

particular relevancia, considerar como una futura aplicación biotecnológica lo

observado para el gen CLC-f, evaluando su transferencia a leguminosas consideradas

sensibles al estrés salino, en un procedimiento análogo a los trabajos llevados a cabo por

Bao et al. (2014 y 2016) para intercambiadores de Na+/H+ y las bombas de H+

discutidos en el apartado 3.5.3 de este trabajo de tesis.

Por otro lado, también nos interesa profundizar la evaluación de nuestras observaciones

sobre el material híbrido interespecífico LtxLc bajo las condiciones de estrés mixto de

inundación y salinidad, donde hemos podido determinar una mejor respuesta que frente

al estrés inducido únicamente por la presencia de sales neutras (observación la cual es

reportada por primera vez para una leguminosa). Este tipo de respuesta frente al estrés

mixto de inundación y salinidad, ha sido escasamente reportada y a nuestro entender,

resulta muy promisoria, ya que avalaría su posible utilidad como forrajera para

ambientes donde se encuentran ambos estreses en forma simultánea. También

entendemos que constituiría un interesante sistema de estudio para dilucidar

comparativamente, los mecanismos de respuesta del material híbrido con respecto a sus

parentales, ya que éstos parecen priorizar mecanismos diferentes entre ellos para hacer

frente al estrés por salinidad y el estrés mixto provocado por la presencia simultánea de

inundación y de salinidad.

Con respecto a la evaluación de la incidencia del estrés por inundación sobre el proceso

de FBN (tema el cual se abordó en el capítulo 5 de este trabajo de tesis), se encontró que

el mismo se afectó diferencialmente según el nivel de tolerancia de las especies

leguminosas consideradas. Si bien la sumersión parcial indujo una situación de hipoxia

en las raíces noduladas de ambas accesiones estudiadas (Lj y Lt), la FBN es afectada

diferencial y significativamente entre las especies. Las claras diferencias observadas

brindan un modelo experimental muy interesante que permitiría comprender con mayor

profundidad, los mecanismos de respuesta y tolerancia asociados a la FBN en

importantes especies leguminosas forrajeras bajo situaciones de estrés por inundación.

En síntesis, en vinculación con el objetivo general propuesto de profundizar el

conocimiento sobre el género Lotus frente a condiciones restrictivas de crecimiento, con

énfasis en la finalidad de incrementar su aprovechamiento en áreas inundables tales

como los de la Pampa Deprimida, pudo cumplirse el mismo desde dos enfoques: i)

desde un “punto de vista teórico” se logró ampliar el conocimiento en cuanto a las

respuestas que diferencialmente ponen en juego las especies del género Lotus frente al

estrés por inundación del tipo sumersión parcial, a la que se sumó la variante del estrés

mixto por sumersión parcial y salinidad, estableciendo un nuevo modelo experimental

que permite el diseño de nuevos estudios sobre la fisiología y los mecanismos de

respuesta de la FBN frente a este tipo de estrés, lo cual no es frecuentemente evaluado.

Asimismo entendemos que la hibridación interespecífica constituye una herramienta de

elevada potencialidad de estudio en el género Lotus en particular, y eventualmente en

leguminosas en general, teniendo quizás particular interés, en la evaluación de los

mecanismos de las respuestas frente al estrés mixto de inundación y salinidad; y ii)

desde un enfoque más “aplicado”, el uso potencial de la hibridación interespecífica

permitiría obtener materiales con características mejoradas (por ejemplo, con respecto a

78

L. tenuis, con mejores niveles de taninos condensados foliares y la presencia de

rizomas) aptos para ambientes inundables, lo que posibilitaría incrementar el

aprovechamiento ganadero de grandes áreas restrictivas tales como los que

frecuentemente se observan en la Pampa Deprimida, asegurando la persistencia de los

recursos forrajeros necesarios. Esta aplicación tecnológica se suma a las expectativas

que poseemos en cuanto a la obtención de nuevos criterios de mejora en el género Lotus

spp., que se desprenderían de las técnicas de secuenciación masiva y la evaluación de

los perfiles metabólicos que se encuentran en análisis. Entendemos que a partir de los

mismos podríamos sumar novedosos elementos de selección de los materiales vegetales

utilizados, en los actuales programas de mejoramiento de leguminosas forrajeras.

79

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91

7. ANEXO

Figuras y tablas suplementarias correspondientes al capítulo 2 Tabla S.2.1. Efecto de 35 días de recuperación post 55 días de sumersión parcial (Inund) sobre

distintas fracciones de biomasa (g de materia seca/planta) en plantas adultas de 5 accesiones

(Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L.

corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus tetraploide y Lj: L. japonicus).

Tratamientos Hojas Tallos Raíces

(Acc x Inund) media ± DE media ± DE media ± DE

Lt Cont 6,05 ± 1,28 b 13,32 ± 2,19 a 8,40 ± 2,50 b

Inund 4,82 ± 1,67 c 9,13 ± 1,79 c 4,37 ± 1,79 d

LtxLc Cont 7,09 ± 1,86 a 11,07 ± 2,18 b 5,95 ± 1,60 c

Inund 3,32 ± 1,45 d 5,67 ± 1,75 e 2,55 ± 0,83 e

LcD Cont 5,42 ± 1,68 bc 5,29 ± 1,16 ef 2,57 ± 0,81 e

Inund 2,08 ± 1,14 e 2,99 ± 0,82 g 1,02 ± 0,75 f

LcT Cont 7,37 ± 1,37 a 8,95 ± 2,26 cd 12,32 ± 4,08 a

Inund 1,62 ± 0,89 ef 4,37 ± 0,80 f 1,47 ± 0,93 ef

Lj Cont 3,17 ± 0,70 d 7,83 ± 1,71 d 2,61 ± 0,88 e

Inund 0,99 ± 0,37 f 2,73 ± 0,41 g 0,93 ± 0,27 f

Los valores son las medias de 14 plantas ± el desvío estándar. Para cada fracción de biomasa (columnas),

las medias sin ninguna letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan

(p<0,05).

Tabla S.2.2. Efecto de 35 días de recuperación post 55 días de sumersión parcial (Inund) sobre

distintas fracciones de biomasa (g de materia seca/planta) en plantas adultas de 5 accesiones

(Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L.

corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus tetraploide y Lj: L. japonicus).

Tratamientos Hojas Tallos Raíces


Lt Cont 4,94 ± 1,03 b 19,45 ± 2,46 a 9,18 ± 2,54 b

Inund 5,46 ± 0,99 ab 15,19 ± 2,55 b 5,78 ± 1,49 c

LtxLc Cont 5,55 ± 1,23 ab 19,32 ± 2,54 a 6,68 ± 1,84 c

Inund 4,93 ± 0,66 b 13,60 ± 3,11 b 5,08 ± 2,33 c

LcD Cont 4,96 ± 2,68 b 9,29 ± 1,33 cd 5,44 ± 2,15 c

Inund 2,04 ± 0,60 c 6,94 ± 1,95 de 1,48 ± 0,33 d

LcT Cont 6,85 ± 3,05 a 16,09 ± 2,65 b 13,83 ± 4,24 a

Inund 3,90 ± 1,49 b 6,56 ± 2,02 e 2,75 ± 1,41 d

Lj Cont 1,44 ± 0,38 c 10,05 ± 1,25 c 2,10 ± 0,64 d

Inund 0,86 ± 0,27 c 2,81 ± 0,73 f 0,96 ± 0,32 d

Los valores son las medias de 10 plantas ± el desvío estándar. Para cada fracción de biomasa (columnas),

las medias sin ninguna letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan

(p<0,05).

92

Tabla S.2.3. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) sobre las tasas de crecimiento

relativo en peso seco (TCR, g g-1 día-1) de plantas adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp.

(Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide;

LcT: L. corniculatus tetraploide y Lj: L. japonicus).

Tratamientos TCR Hojas TCR Tallos TCR Raíces


Lt Cont 0,022 ± 0,004 bc 0,034 ± 0,003 cd 0,033 ± 0,006 b

Inund 0,018 ± 0,007 c 0,028 ± 0,003 e 0,020 ± 0,007 d

LtxLc Cont 0,040 ± 0,005 a 0,056 ± 0,003 a 0,044 ± 0,005 a

Inund 0,025 ± 0,008 b 0,043 ± 0,007 b 0,028 ± 0,006 bc

LcD Cont 0,022 ± 0,006 bc 0,037 ± 0,004 c 0,025 ± 0,006 cd

Inund 0,003 ± 0,011 e 0,027 ± 0,005 e 0,004 ± 0,014 e

LcT Cont 0,019 ± 0,003 c 0,028 ± 0,004 e 0,032 ± 0,006 b

Inund -0,012 ± 0,013 f 0,016 ± 0,003 f -0,009 ± 0,011 f

Lj Cont 0,010 ± 0,004 d 0,032 ± 0,004 d 0,023 ± 0,007 cd

Inund -0,012 ± 0,008 f 0,013 ± 0,003 f 0,004 ± 0,005 e

Los valores son las medias de 14 plantas ± el desvío estándar. Para cada TCR (columnas), las medias sin

ninguna letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05).


las tasas de crecimiento relativo en peso seco (TCR, g g-1 día-1) de plantas adultas de 5

accesiones (Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus


Tratamientos TCR Hojas TCR Tallos TCR Raíces*


Lt Cont -0,006 ± 0,006 c 0,011 ± 0,003 bc 0,001 ± 0,008

b

Inund 0,003 ± 0,005 bc 0,014 ± 0,005 b 0,007 ± 0,007

LtxLc Cont -0,008 ± 0,006 c 0,016 ± 0,004 b 0,002 ± 0,008

ab

Inund 0,011 ± 0,004 b 0,024 ± 0,007 a 0,017 ± 0,013

LcD Cont -0,005 ± 0,015 c 0,016 ± 0,004 b 0,020 ± 0,013

a

Inund -0,001 ± 0,009 c 0,023 ± 0,008 a 0,010 ± 0,007

LcT Cont -0,004 ± 0,011 c 0,016 ± 0,005 b 0,002 ± 0,009

ab

Inund 0,023 ± 0,013 a 0,010 ± 0,009 bc 0,014 ± 0,017

Lj Cont -0,024 ± 0,010 d 0,007 ± 0,004 c -0,007 ± 0,009

c

Inund -0,005 ± 0,008 c 0,000 ± 0,008 d -0,001 ± 0,009

Los valores son las medias de 10 plantas ± el desvío estándar. Para cada TCR (columnas), las medias sin

ninguna letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05).

* En la TCR de raíces no hubo interacción. La inundación no tuvo efecto y el factor accesión sí lo tuvo

(se muestran las diferencias por accesión).

93

Tabla S.2.5. Efecto de 55 días de sumersión parcial (Inund) sobre diferentes parámetros

morfológicos de plantas adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. (Lt: L. tenuis; LtxLc:

híbrido L. tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide; LcT: L. corniculatus

tetraploide y Lj: L. japonicus).

Tratamientos Tallos 1° Tallos 2° Longitud de tallos


Lt Cont 59,21 ± 15,43 a 37,71 ± 24,07 b 77,54 ± 11,09 b

Inund 30,21 ± 7,90 c 22,07 ± 13,68 c 57,37 ± 9,02 c

LtxLc Cont 34,71 ± 8,57 bc 52,93 ± 21,04 a 88,16 ± 12,68 a

Inund 17,93 ± 6,63 d 22,79 ± 19,39 c 60,40 ± 10,11 c

LcD Cont 22,43 ± 7,61 d 36,36 ± 16,70 b 56,54 ± 8,88 c

Inund 21,79 ± 5,01 d 12,50 ± 6,28 cde 43,81 ± 6,16 de

LcT Cont 37,93 ± 9,97 bc 18,71 ± 11,03 cd 59,51 ± 11,82 c

Inund 20,57 ± 6,32 d 5,57 ± 5,09 e 38,53 ± 5,78 ef

Lj Cont 8,29 ± 1,07 e 19,64 ± 6,81 cd 46,60 ± 2,94 de

Inund 8,14 ± 1,46 e 9,71 ± 1,73 de 35,11 ± 2,31 f

Los valores son las medias de 14 plantas ± el desvío estándar. Para cada parámetro (columnas), las

medias sin ninguna letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05).


diferentes parámetros morfológicos en plantas adultas de 5 accesiones (Acc) de Lotus spp. (Lt:

L. tenuis; LtxLc: híbrido L. tenuis x L. corniculatus diploide; LcD: L. corniculatus diploide;

LcT: L. corniculatus tetraploide y Lj: L. japonicus).

Tratamientos Tallos 1° Tallos 2° Longitud de tallos*


Lt Cont 63,70 ± 17,7 a 79,1 ± 23,45 bc 88,6 ± 16,4

b

Inund 32,50 ± 5,2 bc 127,5 ± 26,23 a 58,8 ± 9,1

LtxLc Cont 48,00 ± 31,4 b 84,7 ± 22,79 b 113,3 ± 16,8

a

Inund 22,30 ± 9,4 cde 87,1 ± 21,64 b 91,7 ± 20,0

LcD Cont 27,33 ± 6,7 cd 61,3 ± 6,66 cd 72,3 ± 4,6

bc

Inund 15,00 ± 4,6 de 40,3 ± 3,21 d 60,0 ± 4,6

LcT Cont 43,20 ± 11,0 b 45,5 ± 15,02 d 71,3 ± 12,8

c

Inund 18,60 ± 5,7 cde 45,3 ± 17,45 d 46,8 ± 5,1

Lj Cont 10,50 ± 1,5 e 15,7 ± 4,32 e 48,7 ± 4,0

d

Inund 7,60 ± 1,5 e 9,8 ± 2,35 e 34,5 ± 3,3

Los valores son las medias de 10 plantas ± el desvío estándar. Para cada parámetro (columnas), las

medias sin ninguna letra en común son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (p<0,05). * En la variable “longitud de los 5 tallos 1° más largos”, no hubo interacción y los dos factores fueron

significativos. La inundación disminuyó la variable y el en factor accesión son mostradas las diferencias

con una letra por accesión.

94

Figuras suplementarias correspondientes al capítulo 3

Figura S.3.1. Concentración de iones Na+ y Cl– en hojas apicales y basales (en μmol por g de

MS) de plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de tratamientos de

sumersión parcial (Inund) y condición control (Cont). A y B: concentración del ion Cl– en hojas

apicales y basales respectivamente. C y D: concentración del ion Na+ en hojas apicales y basales

respectivamente. Dentro de cada gráfico, las barras que no tienen ninguna letra en común, son

significativamente diferentes (Prueba de Duncan, p<0,05, n=5, ±DE). En los gráficos A y C, la

interacción del ANVA (entre accesión e inundación) no fue significativa y los efectos del factor

accesión fueron significativos (las diferencias se muestran en letras mayúsculas). En D no hubo

interacción ni efecto de los factores accesión e inundación. Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido



Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

Inund

Cont

cbc abc bcbc bc b

Cl- e

n h

oja

s b

as

ale

s (

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

Cont

Inund

Na

+ e

n h

oja

s b

as

ale

s (

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

Inund

ABABCC

ContC

l- Ho

jas

ap

ica

les

(

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1000

2000

3000

4000

Inund

CABBC

Cont

Na

+ H

oja

s a

pic

ale

s (

mo

l g

-1 M

S)

A B

D C

95

Figura S.3.2. Concentración de K+ en hojas basales (en μmol por g de MS) y relación molar

K+/Na+ en hojas apicales de plantas de 4 accesiones del género Lotus sometidas a 21 días de

tratamientos de sumersión parcial (Inund) y condición control (Cont). En A: no se detectó

interacción entre accesión e inundación y las diferencias entre accesiones se muestran con letras

mayúsculas. El factor inundación disminuyó la concentración de K+. En B: dentro de cada

gráfico, las barras que no tienen ninguna letra en común, son significativamente diferentes

(Prueba de Duncan, p<0,05, n=5, ±DE). Lt: Lotus tenuis; LtxLc: híbrido interespecífico entre L.

tenuis y L. corniculatus; LcD: L. corniculatus diploide y LcT: L. corniculatus tetraploide.

A B

Lt LtxLc LcD LcT

0

500

1000

1500

2000

ABAB

AB

Cont

Inund

K+ e

n h

oja

s b

as

ale

s (

mo

l g

-1 M

S)

Lt LtxLc LcD LcT

0

1

2

35

10

15

20

25

30

bb

bb bbb

a

K+/N

a+ e

n h

oja

s a

pic

ale

s

estrés por inundación en leguminosas del género lotus · declaro que el material incluido en...

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