Estratégias para interpretação de espectros de massas

• Composição elementar dos íons a partir de medidas exatas de massas.

• Resolução em espectrometria de massas.

• Padrões isotópicos.

• Etapas na identificação de espectros de massas: a) íon molecular ou íon pseudo-molecular; b) fragmentos e mecanismos de fragmentação.

Na presença de um campo

magnético homogêneo, íons

descrevem uma trajetória circular

v

Br

ze

m

r

mvvBze

2

)(

Usando a energia cinética, T =

(½)mv2 = zeV, ou

zeB

mTr

V

rB

ze

m

mVze

rB

v

rB

ze

m

2

2

)/(2)(

22

22

2

22

2

2

Setor magnético como

analisador de massas:

resolução ditada pela

fenda de saída dos íons

15.01500 15.01820 15.02140 15.02460 15.02780 15.03100

Mass (m/z )

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

te

ns

ity

ISO:CH3

15.0229M

FWHM = DM

R = M/DM

Parâmetros para definir

resolução em

espectrometria de

massas

Determinação de massas moleculares e conceito de resolução

em espectrometria de massa

• Resolução capaz de distinguir íons com massas nominais iguais, m/z = 60

• Resolução necessária para distinguir estas espécies: considerar os íons com a menor diferença de massas, Dm = 60,03242 – 60,02112 = 0,0113

m

mR

D

C3H8O C2H8N2 C2H4O2 CH4N2O

60,05754 60,06884 60,02112 60,03242

53100113,0

60R

Mass measurement accuracy depends on resolution

0

2000

4000

6000

8000

Co

un

ts

2840 2845 2850 2855

Mass (m/z)

Resolution = 14200

Resolution = 4500

Resolution =18100 15 ppm error

24 ppm error

55 ppm error

High resolution means better mass accuracy

Para íons contendo C, H, O, N (C0-100, H3-74, O0-4 e N0-4), atribuição da composição sem ambiguidade em m/z =118 requer apenas um erro menor do que 34 ppm, enquanto que para m/z =750 atribuição da composição sem ambiguidade requer uma precisão melhor de que 0.018 ppm.

Exemplo de medidas exatas de

massa para determinar

composição química e resolução

necessária para distinguir entre

as diversas possibilidades

Type

Resolving Power (FWHM)

FT-ICR-MS

1,000,000

FT-Orbitrap

100,000

High-Res-TOF 60,000

TOF

10,000

Quadrupole / IonTrap in UltraZoom mode

10,000

Quadrupole / Iontrap

1,000

Poder de resolução típico de diversos tipos de espectrômetros de massas

Massa exata e

abundancia natural de isotopos

dos elementos

mais comuns

Defeito de massa: uso para identificação de composição química,

D = mverdadeira - mnominal

Massa nominal e defeito de massa

• Por exemplo, para o íon hipotético 12C50H100+.,

massa nominal = 5012 + 1001 = 700

massa real = 5012,0000 + 1001,0078 = 700,7800

• Perfluorbutilamina (usado para calibrar a escala de massa)

massa nominal = 671

massa real = 670,9599 Da

Abundancia natural de

isotopos dos elementos

mais comuns e influencia

nos espectros de massas

Padrões isotópicos

para substancias

contendo um ou mais

átomos de Cl e Br

Abundância Natural

35Cl - 75,77% 37Cl - 24,23%

79Br - 50,5% 81Br - 49,5%

1981.84

1982.84

1983.84

Mass spectrum of peptide with 94 C-atoms

(19 amino acid residues)

No 13C atoms (all 12C)

One 13C atom

Two 13C atoms

“Monoisotopic mass”

Massa exata e

abundancia natural de isotopos

dos elementos

mais comuns

m/z

4360.45

4361.45

Isotope pattern for a larger peptide (207 C-atoms)

Mass spectrum of insulin

12C : 5730.61

13C

2 x 13C

Insulin has 257 C-atoms. Above this mass, the monoisotopic

peak is too small to be very useful, and the average mass is

usually used.

Monoisotopic mass

Monoisotopic mass

corresponds tolowest mass peak

When the isotopes are clearly resolved the monoisotopic mass

is used as it is the most accurate measurement.

Average mass

Average mass corresponds

to the centroid of the

unresolved peak cluster

When the isotopes are not resolved, the centroid of the envelope

corresponds to the weighted average of all the the isotope peaks in

the cluster, which is the same as the average or chemical mass.

6130 6140 6150 6160 6170

Poorer

resolution

Better

resolution

What if the resolution is not so good?

At lower resolution, the mass measured is the average mass.

Mass

Interpretação de espectros de massas: considerações iniciais

• Espectros de massa de substancias orgânicas obtidas por ionização por elétrons podem apresentar o íon molecular, M+,

(não necessariamente), e fragmentos iônicos. • Como reconhecer o íon molecular, M+, que é um cátion radical? a) Íon de maior massa (excluindo isótopos) no espectro; b) Regra do nitrogênio: íon molecular de substancia (CxHyOzNv) com um número impar (1,3, etc) de atomos de nitrogênio possui uma massa nominal de numero impar, e vice-versa; c) Íon molecular deve ser capaz de formar os principais íons fragmentos por perdas de neutros “lógicos”.

Ionização de íons moleculares 1

• Ionização de uma molécula simples e formação do íon molecular,

• Ionização representada como ocorrendo no sítio de menor

energia de ionização,

Interpretação de espectros de massa: considerações iniciais Reconhecimento do íon molecular, M+, cátion radical.

122 M+.

C7H6O2

m/z RI 121 0.51 122 84 123 6.8 124 0.51

C6H7O2

N = 0, 2, 4, ...

Regra do nitrogênio b) Regra do nitrogênio: íon molecular de substancia (CxHyOzNv) contendo um número impar (1,3, etc) de N deve ser impar, e vice-versa;

Identificação simples dos fragmentos iônicos em espectros de massas

• Identificação do neutro eliminado na fragmentação, p.ex. (M-1)+, (M-15)+, (M-18)+, (M-44)+, etc. (Ver tabela 6.6 para formula do neutro e possível precursor).

• Identificação da fórmula do íon através da sua relação m/z. (Ver tabela 6.7 para as possíveis estruturas).

• Identificação de íons característicos, indicativos da estrutura da molécula precursora. (Ver tabela 6.8)

Perda de neutros e íons típicos - Fragmentações

M+. 122

[M-17]+.

-OH ou

-NH3

-C2H5O ou

-COOH

C7H6O2 ins. = C – H/2 + N/2 +1

[M-45]+.