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Sequenciamento
Seus resultados de sequenciamento não estão tão bons quanto você gostaria?
Os eletroferogramas da sua corrida podem dar várias pistas do que pode ter ocorrido e de como você pode melhorar seus resultados.
Exemplo de um dado analisado de excelente qualidade
Quando você sequencia produtos de PCR, o primeiro passo é obter um ótimo resultado de PCR, otimizando seu protocolo para que sua amplificação seja específica para fragmento de interesse. Produtos de PCR inespecíficos são um dos principais problemas na obtenção um sequenciamento de qualidade.Além disso, a quantidade de material de partida (DNA molde) para a sua reação de sequenciamento é extremamente crítica para a obtenção de boas sequências. As quantidades variam de acordo com o tamanho dos fragmentos que você pretende sequenciar. A tabela abaixo pode servir como ponto de partida para a otimização da sua reação de sequenciamento.
O sistema Qubit®, da Invitrogen, faz a quantificação do DNA por fluorometria, e é mais indicado que os métodos baseados em absorbância, pois quantifica especificamente o DNA presente na solução.A purificação, tanto do produto de PCR, quanto da reação de sequenciamento, é fundamental para a obtenção de bons resultados de sequenciamento. Existem diversos Kits para a
purificação do produto de PCR, visite o site da Invitrogen e escolha o mais adequado para o seu projeto. A Invitrogen também possui alguns Kits para purificação da reação de sequenciamento (Sequencing Reaction Purification), entretanto o BigDye XTerminator® Purification Kit é um dos protocolos mais rápidos e confiáveis.Mesmo tomando todos os cuidados acima, ainda podem ocorrer problemas no nosso sequenciamento.Eletroferogramas mal resolvidos, com muitos picos sobrepostos, podem ser resultado do uso de algorítimos de análise que são inespecíficos para o Kit (dye set) de sequenciamento utilizado. Verifique sempre se o "basecaller" e o "mobility file" estão de acordo com o seu Kit. Se não estiverem, reanalise seus dados utilizando os algorítimos adequados.No seu programa de análises, verifique sempre a janela EPT para cada eletroferograma. Essa janela mostra o status da corrente, da voltagem, temperatura do forno e potência do laser, que são informações importantes para resolver problemas na sua corrida. Veja abaixo um exemplo de como esses parâmetros devem se corportar durante uma boa corrida.
Oscilações na corrente podem levar a dados incosistentes ou até mesmo falhas na leitura das sequências. Dentre as inúmeras causas para oscilação na corrente, podemos citar: bolhas no bloco ou capilar, erros no preparo do tampão, tampão velho, capilar entupido, decomposição do polímero e a ocorrência de um arco voltáico no equipamento. A figura abaixo mostra um capilar com problemas na corrente (linha verde).
Veja a seguir alguns exemplos de eletroferogramas que podem ajudar a identificar problemas no sequenciamento.
1. Amplificação inespecíficaNo dado bruto do sequenciamento, picos verdes que caracterizam o final dos fragmentos amplificados por PCR (adenilação destes) podem ser observados.
O eletroferograma analisado mostra picos sobrepostos que impedem a determinação exata da sequência.
2. Muito DNA molde na reação de sequenciamentoO excesso de DNA na reação de sequenciamento desequilibra a reação de modo que todos os reagentes são consumidos rapidamente e uma quantidade muito maior de fragmentos curtos é gerada, em relação aos maiores. No dado bruto é possível observar um perfil triangular do sinal.
Obs. Muitas vezes esses perfis podem ser resultado do uso de pouco Mix na reação de sequenciamento, pouco primer ou pouco DNA molde, presença d econtaminantes que inibem a polimerase, ou ainda degradação do produto da reação de sequenciamento.
3. Ausência de sinalUm eletroferograma sem sinal pode ter muitas causas, como a perda do material durante a purificação da reação de sequenciamento, falha na reação de sequenciamento, ausência de corrente durante a corrida, capilar entupido, mau funcionamento do kit de sequenciamento, presença de inibidores na reação de sequenciamento (ex. Fenol) entre outros. Em muitos
desses casos, é muito comum a visualização de um pico alto no inicio do eletroferograma, que correspode aos dideoxinucleotídeos que nao foram incorporados na reação.
4. Sinal muito baixoSinal muito baixo no eletroferograma pode ser reultado da utilização da quantidade insuficiente de DNA molde na reação de sequenciamento ou falha na reação. Pode ainda ser resultado de um tempo muito curto de injeção, da existência de sal na amostra ou de bolhas no tubo da amostra ou de um volume muito baixo de amostra. O sinal baixo se confunde com o background e impede a determinação precisa da sequência.
5. Sinal muito alto
Sinal muito alto pode ser resultado de excesso de DNA molde na reação de sequenciamento ou de um tempo excessivo de injeção. O sinal muito alto prejudica a análise espectral e gera um excesso de ruído (falsos picos).
6. Sinal aparece muito tarde no eletroferogramaIsto pode ocorrer devido ao uso de capilares muito longos, de uma injeção excessiva de material no equipamento ou até mesmo de variações na temperatura da sala de sequenciamento.
Muitas vezes isso pode estar associado a perda de resolução da amostra. Nesses casos, as principais causas são a contaminação durante a eletroforese, a presença de água no polimero, o não preenchimento adequado do capilar, etc.
7. Background elevado
Contaminação na água, polímero, seringas, blocos, etc., resulta em background elevado. Além disso, sujeira nos capilares, nos espelhos, polímero velho, etc, também podem levar a um background elevado. Um background elavado pode prejudicar a eletroforese e diminuir a vida útil dos capilares.
8. Contaminação da reação de sequenciamentoDado bruto mostrando "contaminação verde" aparecendo junto com os fragmentos de DNA, talvezdevido a contaminações resultantes de má qualidade da extração de DNA, talco ou outro produto fluorescente na amostra. Contaminação com primers ou produtos inespecíficos podem gerar perfis semelhantes.
No dado analisado observam-se picos duplos ao longo de toda sequência.
Problemas com o alinhamento da câmera CCD e com a calibração espectral também podem estar entre as causas desses perfis.
9. Queda de uma das fluorescênciasVerifique o software de análise que você está utilizando. Este problema problema geralmente deve-se ao uso de versões anteriores do softaware Sequencing Analyzis v5.2, que possuem erros no "basecaller".
10. Linha de base negativaContaminação em todas as fluorescências, abaixo do nível 0 de intensidade. Procure lavar todos os componentes do sistema, realizando o wizard no software Data Collection.
11. Queda brusca na linha de baseIsso se deve provavelmente a problemas no sistema do equipamento e pode levar a perda de dados no ponto da queda. Entre em contato com um técnico da empresa fabricante.
12. Queda brusca e permanente no sinal
Queda permanente no sinal indica provavelmente o final do fragmento sendo analisado. Isso ocorre principalemnte no sequenciamento de fragmentos curtos de DNA.
Muitas vezes, o sinal cai antes do final do fragmento, provavelmente devido ao uso de quantidade insuficiente de Mix de sequenciamento ou por um problema da polimerase em sintetizar através de um contexto específico de bases.
13. Problemas na purificaçãoCentrifugação ou álcool na concentração errada (dado bruto) causando a perda dos fragmentos menores durante a purificação.
Centrifugação ou excesso de álcool (dado analisado). Artefatos que atrapalham a leitura da sequência, localizados proximos as posições 70, 120 e 180 do eletroferograma são indicativos de uma purificação ruim.
14. Contaminação por etanolMancha fluorescente ocasionada por problemas na remoção total de etanol após a precipitação geraerros na determinação das bases.
15. Picos de PolímeroPicos agudos, de todas as cores, numa mesma posição devido à cristais de uréia no polímero. Paraevitar, retirar da geladeira o polímero ~30 min antes de colocar no equipamento.
Obs. Bolhas e pó (como talco) também podem gerar picos semelhantes quando passarm pela janela de detecção.Picos de uma única cor podem ser resultado elevada temperatura do polímero, pouco volume de amostra no poço ou flutuações na corrente.
Grandes picos no final da corrida também podem aparecer, um artefato associado aos sistemas de eletroforese capilar, mas que nao interfere na qualidade dos dados.
16. Capliar velhoPicos com arraste para a direita e com má resolução (vales pouco profundos entre os picos).
Obs. Injeção em excesso e contaminação do primer de sequenciamento com primers n+1 ou n-1 também podem gerar perfis semelhantes.
17. Sujeira no capilarNo dado bruto os picos são inicialmente agudos, mas ficam gradualmente alargados e arrastadosdevido ao entupimento temporário do capilar. Causas comuns incluem proteínas e outras sujeiras daextração de DNA. A perda gradual da resolução ao longo da sequência também pode ser devido a degradação da amostra, da formamida, do capilar, injeção em excesso ou oscilação na corrente durante a corrida.
18. Degradação da FormamidaFormamida degradada impede, entre outras coisas, a captura da fluorescência e a migração ideal dos fragmentos através do capilar. Formamida de boa qualidade permece congelada qaundo está no freezer. Se sua formamida estiver líquida, troque por uma nova.
19. Dimeros de primersSequências curtas formadas por dimeros de primers são amplificadas preferenciamente. Para resolver esse problema, redesenhe seus primers e utilize enzimas com sistema "hot start".
No dados analisado observa-se:
20. Picos irregulares de C com o BigDye® Terminators v3.1Degradação do Kit de sequenciamento ou da formamida podem levar perfis como os de abaixo. A exposição da reação de sequenciamento à luz, calor, condições ácidas, etc, pode degradar os produtos e levar a esses mesmos perfis. A ressuspenção das amostras em água pode levar a formação de estruturas internas e falhas na migração dos fragmentos.
21. Picos irregulares de G com o BigDye® Terminators v1.1 e v3.1Degradação do Kit de sequenciamento ou da formamida podem levar perfis como os de abaixo. A exposição da reação de sequenciamento à luz, calor, condições ácidas, etc, pode degradar os produtos e levar a esses mesmos perfis. A ressuspenção das amostras em água pode levar a formação de estruturas internas e falhas na migração dos fragmentos.
22. Compressão dos picosGeralmente ocorre em regiões ricas em conteúdo GC devido a não desnaturação do produto.
23. Picos duplos sob bases específicasEsse tipo de problema ocorre principalmente devido à uma calibração espectral incorreta ou pela injeção de muita amostra no capilar.
24. Sequências repetitivasRegiões repetitivas promovem instabilidades durante a amplificação devido a dificuldade da polimerase em sintetizar através dessas regiões. No eletroferograma observam-se picos sobrepostos após a região repetitiva.
25. Polimorfismos de inserção-deleçãoEsses polimorfismos causam a sobreposição dos picos na sequência a partir do ponto em que ocorrem.
26. Perda da resolução no meio da sequênciaOcorre provavelmente devido à presença de contaminantes na amostra ou no sistema, bolhas no capilar, substituição parcial do polímero velho pelo novo, etc.
