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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Erythrina velutina Willd: AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA,

FARMACOLÓGICA E BIOLÓGICA

Clara Raissa de França Rocha e Lopes

São Cristóvão Abril, 2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS



Clara Raissa de França Rocha e Lopes

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa

São Cristóvão Abril, 2010

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

L864e

Lopes, Clara Raissa de França Rocha e Erythrina velutina Willd : avaliação fitoquímica, farmacológica e biológica / Clara Raissa de França Rocha e Lopes. – São Cristóvão, 2010.

104 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Núcleo de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2010.

Orientador: Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa.

1. Farmacologia. 2. Fitoquímica. 3. Erythrina velutina Willd. I. Título.

CDU 615.322

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Folha de aprovação

CLARA RAISSA DE FRANÇA ROCHA E LOPES



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Aprovada em: 30/04/2010

Orientador: Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa, Dr

1º Examinador: Prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti, PhD

2º Examinador: Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam, Dr

PARECER

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu pai José

Nilson, a minha mãe Lucimar, ao meu

marido Rogério e aos meus filhos Júlio

Miguel e João Gabriel

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida, pelas oportunidades, pela força, proteção e presença real na minha vida. Ao meu pai, que desde pequena sempre acreditou em mim, sem medir esforços para que eu tivesse o melhor na minha vida profissional, por saber que seria a base para uma vida pessoal sólida. A minha mãe, que com sua compreensão, amor e carinho sempre esteve ao meu lado me dando apoio e força quando muitas vezes na minha vida quis desistir de tudo. Ao meu marido, que em todos os momentos me apoiou, incentivou, compreendeu e ajudou a concluir este trabalho e a buscar sempre novos desafios. Aos meus filhos, pela paciência nas minhas ausências, compreensão e palavras de carinho, todo o meu amor. Aos meus irmãos, cunhadas e sobrinha pelo carinho e apoio para que eu pudesse ter a tranqüilidade necessária durante o turbilhão de atividades. Agradeço ao meu professor e orientador Dr. Damião, pelas cobranças, confiança, paciência e estímulo à pesquisa. Reconheço o mérito do cuidado que dispensou ao meu trabalho e a generosidade em disponibilizar os seus conhecimentos e experiências. A minha querida amiga Dr. Silmara Pantaleão, com quem pude aprender muito da academia e da vida em intermináveis e deliciosas conversas. Ao amigo Heleno pela presteza e disponibilidade em ir comigo fazer a coleta da planta, deixando de estar no convívio de sua família para auxiliar-me em uma tarefa primordial para a realização desse estudo. Ao biológo Dr. Antônio Celso de Feitas pela identificação botânica da espécie. Aos professores do Departamento de Fisiologia pelo apoio e contribuições cientificas compartilhada durante a realização desse trabalho. Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pelo conhecimento adquirido no decorrer desse curso. Ao professor Dr. Lucindo José Quintans Júnior por ter aberto as portas do seu laboratório para a realização da triagem farmacológica. A professora Dr. Flávia Teixeira Silva e seu aluno Tiago por compartilharem seus conhecimentos e experiências.

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Ao professor Dr. Charles Estevam pelas conversas informais que enriqueceram o meu conhecimento. A professora Dr. Brancilene que sempre me apoio e, com sua experiência, ajudou-me em momentos decisivos. Aos funcionários do Departamento de Fisiologia, colegas de trabalho, pelo incentivo e convivência solidária. A funcionária Edina, da biblioteca central, pela amizade e presteza na solicitação dos artigos pelo Comut. A Genival, Mariana, Renata, Daiane, Ivan, Luciana e em especial a Tamires, amigos de laboratório pela amizade, convivência, demonstração de força e determinação, pelas conversas em tantas atividades realizadas juntos ou visitando a bancada de trabalho. As amigas do curso de mestrado em Ciências Farmacêuticas: Juliana Damasceno, Mônica, Jaqueline, Gabriele, Julyanna, Eline, Patrícia, Iderjane e Edisleide pelo companheirismo e incentivo. As amigas Adriana Gibara e Marilia pela ajuda em diversos momentos da realização da triagem farmacológica comportamental. A Sr. Osvaldo responsável pela manutenção e limpeza do biotério, pelo cuidado com os animais. A banca examinadora da qualificação, Dr. Sócrates Cavalcante e Dr. Rogéria Nunes, pelas preciosas contribuições a esse trabalho. Ao Programa de Pós – Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela oportunidade de realizar esse curso. Ao Instituto de Química da UNESP de Araraquara-SP e ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB) pelas analises espectrais. Ao Departamento de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro nas pessoas da Dr. Celuta S. Alviano e a Dr. Daniela S. Alviano pelo ensaio antimicrobiano.

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“... Porque é melhor a sabedoria do que os rubis; e tudo o que mais se deseja não se pode comparar com ela.”

(Prov. 8:11)

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RESUMO

O gênero Erythrina, família Fabaceae, é muito conhecido pela presença de alcalóides tetracíclicos tipo eritrina e outras classes químicas como flavonóides. A espécie Erythrina velutina Willd, conhecida popularmente como “Mulungu”, é utilizada pela população do nordeste brasileiro por suas propriedades sudoríficas, calmante, emoliente, peitoral e anestésica local. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar os constituintes químicos presentes no extrato metanólico das folhas de Erythrina velutina, bem como investigar a atividade farmacológica e antimicrobiana do extrato bruto e das fases orgânicas, além de contribuir com a quimiotaxonomia do gênero Erythrina. As folhas foram coletadas no município de Simão Dias, Sergipe, Brasil. O extrato metanólico bruto, obtido por maceração, foi submetido a prospecção fitoquímica que indicou a presença dos seguintes metabólitos secundários: alcalóides, taninos e flavonóides. O particionamento deste extrato foi realizado com hexano, acetato de etila e n-butanol. A partir do extrato metanólico bruto foi feita uma marcha para alcalóide obtendo as fases clorofórmica e n-butanólica básica. Da fase n-butanólica básica isolou-se o ácido nicotínico. A identificação estrutural do composto foi realizada a partir dos dados espectrais de RMN de 1H e 13C e em comparação com dados da literatura. Na realização da triagem farmacológica comportamental, foi observado que administrações das fases orgânicas e do extrato bruto promoveram discretas alterações comportamentais ao nível de sistema nervoso central, sugerindo que o extrato de Erythrina velutina contém substâncias psicoativas. O extrato metanólico bruto e a fração hexânica promoveram uma inibição de crescimento fraco ou parcial, sem halo de inibição definido, para o fungo Trichophyton rubrum T544. PALAVRAS-CHAVE: Erythrina velutina Willd; Constituintes químicos; Triagem farmacológica comportamental; Atividade antimicrobiana.

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ABSTRACT

Erythrina plant species, botanical family Fabaceae, are the main source for the tetracyclic erythrina-type alkaloids, and other chemical classes such as flavonoids. The Erythrina velutina Willd specie is popularly known as "Mulungu" and used by the population of the northeastern region of Brazil for its sudorific, soothing, emollient, pectoral, and local anesthetic properties. The objective of this study was to isolate and identify the constituents present in the leaves methanol extract of Erythrina velutina, and to investigate the antimicrobial activity of the crude extract and organic phases as well as contribute to the chemotaxonomy of the genus Erythrina. The leaves were collected in the city of Simão Dias, Sergipe, Brazil. The phytochemical screening performed with the crude methanol extract showed the presence of the following secondary metabolites: alkaloids, tannins, and flavonoids. The crude methanol extract was obtained by maceration and fractionated into hexane, ethyl acetate and n-butanol phase. From the crude methanol extract was extracted alkaloids that resulted on basic chloroform and n-butanol phase. Nicotinic acid was isolated from basic n-butanol phase. The structure identification involved analysis of spectral data of NMR of 1H and 13C and comparison with literature data. The behavior pharmacological screening showed that administration of the organic phases and crude extract promoted discrete behavioral changes at the level of central nervous system, suggesting that the extract of Erythrina velutina contains psychoactive compounds. In addition, antimicrobial screening showed that the crude methanol extract and hexane fraction present a weak inhibition or in part without inhibition zone defined for the fungus Trichophyton rubrum T544. KEYWORDS: Erythrina velutina Willd; Chemical constituents; Pharmacological screening; Antimicrobial activity.

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SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO............................................................................................

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II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................

2.1. Plantas medicinais................................................................................ 2.2. Importância dos marcadores químicos................................................. 2.3. Erythrina velutina Willd.......................................................................... 2.4. Fitoquímica............................................................................................ 2.5. Atividades farmacológicas..................................................................... 2.6. Aspectos toxicológicos do gênero e espécie.........................................2.7. Aspectos da atividade antibacteriana do gênero e espécie..................

24 24 28 31 34 40 43 44

III – OBJETIVOS............................................................................................ 3.1. Geral...................................................................................................... 3.2 Específicos.............................................................................................

50 50 50

IV – EXPERIMENTAL ................................................................................... 4.1. Especificações dos materiais e equipamentos......................................4.2. Estudo fitoquímico.................................................................................

4.2.1. Coleta e identificação do material botânico ................................ 4.2.2. Preparação do extrato metanólico das folhas secas de Erythina

velutina (EMEv).............................................................................................. 4.2.3. Fracionamento do extrato metanólico.......................................... 4.2.4. Características organolépticas e pH............................................ 4.2.5. Prospecção fitoquímica do extrato metanólico bruto da

Erythrina velutina Willd................................................................................... 4.2.6. Marcha para alcalóides................................................................ 4.2.7. Isolamento dos constituintes químicos........................................

4.2.7.1. Fase n-butanólica básica (FNB)...................................... 4.2.7.2. Fase acetato de etila e isolamento de seus

constituintes químicos(FACET)...................................................................... 4.3. Farmacologia.........................................................................................

4.3.1. Animais........................................................................................ 4.3.2. Triagem psicofarmacológica preliminar.......................................

4.4. Procedimento experimental do ensaio antimicrobiano in vitro.............. 4.4.1 Microorganismos utilizados.......................................................... 4.4.2. Preparo do inóculo contendo os microorganismos..................... 4.4.3. Preparação do extrato bruto e fases orgânicas da Erythrina

velutina para os ensaios antimicrobianos in vitro........................................... 4.4.4. Ensaio antimicrobiano in vitro......................................................

51 51 53 53 53 54 55 56 59 60 60 61 63 63 64 64 65 65 66 66

V – RESULTADOS E DICUSSÃO................................................................. 5.1. Fitoquímica............................................................................................

68 68

xi

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5.1.1. Prospecção fitoquímica............................................................... 5.1.2. Marcha para alcalóides...............................................................

5.1.2.1. Fase n-butanólica básica............................................... 5.1.3. Fase acetato de etila...................................................................

68 70 70 78

5.1.4. Observações gerais.................................................................... 5.2 Farmacologia..............................................................................................

5.2.1 Triagem farmacológica comportamental...................................... 5.3. Atividade antimicrobiana.......................................................................

VI. CONCLUSÃO...........................................................................................

79 80 80 85 90

CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................

91

VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................

93

VIII – ANEXO(S)............................................................................................ ANEXO 1 – Declaração do CEPA (Conselho de Ética em pesquisas com Animais)......................................................................................................... ANEXO 2 – Triagem Farmacológica Comportamental (ALMEIDA et al., 1999)..............................................................................................................

103 103 104

ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................... ÍNDICE DE ESQUEMAS................................................................................ ÍNDICE DE TABELAS....................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E DE SIGLAS.................................................. LISTA DE SÍMBOLOS...................................................................................

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Erythrina velutina Willd, Fabaceae................................................... 32

Figura 2 – Estrutura química do esqueleto clássico de alcalóides eritrínicos............................................................................................................

Figura 3 - Estrutura química do esqueleto básico de alcalóides eritrínicos do tipo dienóide (I) e alquenóide (II)........................................................................

35

35

Figura 4 - Estrutura química de alcalóides eritrínicos........................................

36

Figura 5 – Estrutura química do ácido nicotínico (AN)....................................... 71

Figura 6 – Espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6 /300 MHz)....................................................................................................................

73

Figura 7 – Expansão do espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6 / 300 MHz)....................................................................................................................

74

Figura 8 – Espectro de RMN 13C de FNB 10-16 (DMSO-d6 /75 MHz)............... 75

Figura 9 – Estrutura química e sinais de RMN1H do alcalóide (+)-coculidina............................................................................................................

76

Figura 10 – Expansão do espectro de RMN1H de NB-E (DMSO-d6/75 MHz)....................................................................................................................

77

Figura 11 – Espectro de RMN1H de F17-18 da fase acetato de etila (CDCl3 /200 MHz)............................................................................................................

79

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14

ÍNDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1 – Obtenção e particionamento do extrato bruto das folhas Erythrina velutina Willd (EMEv)......................................................................

55

Esquema 2 - Marcha para alcalóides do extrato metanólico bruto de Erythrina velutina Willd...................................................................................

60

Esquema 3 – Isolamento do ácido nicotínico da fase n-butanólica básica das folhas de Erythrina velutina Willd............................................................

61

Esquema 4 – Isolamento dos constituintes químicos da fase acetato de etila das folhas de Erythrina velutina Willd.....................................................

63

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ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 – Estruturas químicas dos compostos isolados de Erythrina velutina Willd....................................................................................................

38

Tabela 2 - Resultados da prospecção fitoquímica com o extrato metanólico bruto.................................................................................................................

68

Tabela 3 – Dados de RMN1H (δ, 300 MHz) e 13C (δ, 75 MHz) de FNB 10-16 obtidos em DMSO-d6, comparados com dados da literatura (BHAT SV, NAGASAMPAGI BA, SIVAKUMAR M, 2005) (AN-1A e AN-1B)......................

Tabela 4 – Resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana...................

72 86

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LISTA DE ABREVIATURAS E DE SIGLAS

AN – Ácido nicotínico

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC - American Type Culture Collection

BHI - Brain Heart Infusion

CC – Cromatografia em coluna

CCD - Cromatografia em Camada Delgada

CCDA - Cromatografia em Camada Delgada Analitica

CCDP - Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CEPA – Conselho de Ética em Pesquisas com Animais

CIM - Concentração Inibitória Mínima

COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

DNA – Ácido desoxirribonucléico

EMEv - Extrato metanólico de Erythrina velutina

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

EtOAc - Acetato de etila

FACET - Fase acetato de etila

FCA - Fase clorofórmica ácida

FCB - Fase clorofórmica básica

FHEX - Fase hexânica

FHMET - Fase hidrometanólica

F-NBU - Fase n-butanólica

FNB - Fase n-butanólica básica

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MIC - Minimal Inhibitory Concentration

MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina

OMS - Organização Mundial de Saúde

ppm - Partes por milhão

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

RMN 13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze

RMN 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RF - Fator de retenção

SNC - Sistema Nervoso Central

SUS - Sistema Único de Saúde

UV - Ultravioleta

UFPB – Universidade Federal da Paraíba

UNESP – Universidade Estadual de São Paulo

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LISTA DE SÍMBOLOS

ºC – Grau Celcius

14C - Carbono 14

CDCl3 - Clorofórmio deuterado

CHCl3 – Clorofórmio

cm - centímetro

d - dupleto

dd - Duplo dupleto

ddd – Triplo dupleto

DMSO - Dimetilsulfóxido

DMSO d6 - Dimetilsulfóxido deuterado

g - grama

H - Hidrogênio

H2O – Água

HCl – Ácido clorídrico

Hz – Hertz

i.p. - intraperitoneal

J – Constante de acoplamento

L – Litro

m - Multipleto

MeOH – Metanol

mm – milímetro

mg - miligrama

mg/kg - miligrama(s) por kilograma(s)

MHz - Mega Hertz

xviii

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mL – mililitro

NH4OH – Hidróxido de amônio

nm – nanômetros

s – simpleto

α – Alfa

β – Beta

γ – Gama

δ – Deslocamento químico

µg/mL - micrograma(s) por mililitro(s)

µL - Microlitro(s)

pH - Potencial hidrogeniônico

v.o. – via oral

v/v – volume/volume

xix

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I. INTRODUÇÃO

Documentos escritos pelas primeiras civilizações comprovam que as

plantas medicinais representaram a única fonte de tratamento para as

enfermidades, sendo seu uso tão antigo quanto à história do homem (CALIXTO,

2000). No início, quando os métodos de extração, purificação e identificação

ainda não haviam sido desenvolvidos, empregava-se diretamente extratos das

plantas. Com o desenvolvimento tecnológico, algumas plantas passaram a ser

utilizadas como fonte para a extração direta dos princípios ativos. Ainda, estes

princípios ativos também serviam como material de partida para a síntese de

derivados químicos ou mesmo como modelo para a síntese total de fármacos.

Além de fornecer princípios ativos para o emprego direto na terapia, as

plantas medicinais também podem ser utilizadas como fitoterápicos, os quais são

definidos como preparações padronizadas, constituídas de misturas complexas

de uma ou mais plantas, usadas para o tratamento de várias doenças (CALIXTO,

2000). Neste caso, tanto a atividade farmacológica como os compostos

responsáveis por esta atividade devem estar bem definidos (HOSTETTMANN;

QUEIROZ; VIEIRA, 2003). Entretanto, em alguns casos os princípios ativos

responsáveis por sua ação farmacológica são desconhecidos e o sinergismo

entre as substâncias parece ser o principal responsável pela ação (KINGHORN,

2001).

Frequentemente, a atividade dos extratos vegetais não é reproduzida

pelas substâncias ativas isoladas. Assim, é possível que a atividade

farmacológica seja resultante da ação de mais de um componente, que podem

eventualmente atuar sobre os mesmos processos bioquímicos e podem também

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contribuir de outras maneiras, modificando a solubilidade, alterando fenômenos

de absorção ou influenciando a estabilidade (SCKENKEL; GOSMANN;

PETROVICK, 2007). De acordo com MAHADY (2001), nota-se nos últimos anos

um interesse crescente por fármacos e medicamentos de origem vegetal,

principalmente porque as plantas medicinais representam uma reserva

praticamente inexplorada de substâncias úteis à humanidade. Aproximadamente

420 mil espécies vegetais são conhecidas (BRAMWELL, 2000) e menos de 5%

destas foram avaliadas para uma ou mais atividades biológicas (VERPOORTE;

VAN DER HEIJDEN; MEMELINK, 2000). Apesar do extenso emprego pelas

populações, relativamente poucas plantas medicinais foram avaliadas

cientificamente e clinicamente para comprovar sua eficácia, benefícios potenciais

e efetividade (CALIXTO, 2000). Diversos fatores podem explicar a razão desta

divergência. Quando comparados com fármacos sintéticos, os medicamentos

vegetais exibem algumas diferenças marcantes, como: princípios ativos são

frequentemente desconhecidos; a padronização, estabilidade e controle de

qualidade, embora realizáveis, são de execução relativamente complicados; a

disponibilidade e a qualidade da matéria-prima vegetal são questões

problemáticas; são raros os estudos clínicos e toxicológicos duplo-cegos bem

definidos para comprovar a eficácia e segurança (CALIXTO, 2000). Estes fatos

evidenciam a complexidade da tarefa de desenvolver, a partir de plantas

medicinais, produtos com constância de composição e propriedades terapêuticas

reprodutíveis, como se exige dos demais medicamentos. O estudo de

determinada espécie vegetal com fins medicinais deve compreender a realização

de pesquisas botânicas, farmacognósticas, químicas, farmacológicas e

toxicológicas, e este trabalho multidisciplinar deve concluir se a espécie em

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questão está bem caracterizada morfológica e quimicamente e se sua ação será

eficaz e segura quando administrada em doses corretas (CALIXTO, 2000).

No Brasil, a utilização de plantas medicinais com fins terapêuticos

provém de diferentes origens e culturas, principalmente de índios, seitas afro-

brasileiras e da tradição européia. Em um primeiro momento, além do fator

cultural e religioso, as plantas medicinais coletadas no campo eram (e muitas

ainda são) mais acessíveis à grande parcela da população desprovida de poder

aquisitivo para adquirir medicamentos industrializados. Além deste fato, nota-se

atualmente uma tendência mundial em buscar terapias ditas “naturais”, cuja

principal vantagem é a ausência ou a redução (muitas vezes equivocada) de

eventos adversos.

Uma série de plantas medicinais vem sendo utilizada como matéria-

prima para produção de fitoterápicos, entre elas as do gênero Erythrina

(Fabacea).

No Brasil, a designação inclui as espécies Erythrina velutina, endêmica

das regiões semi-áridas do nordeste, e Erythrina mulungu, nativa do sul.

Investigações preliminares mostram que um número de alcalóides e flavonóides

têm sido isolados de plantas pertencentes ao gênero Erythrina. Vários estudos

desta classe de compostos apresentam atividades analgésica, antiagressiva,

antiinflamatória, ansiolítica e antibacteriana (RAUPP et al., 2008; RIBEIRO et al.,

2006; MARCHIORO et al., 2005; VIRTUOSO, 2005).

Os estudos fitoquímicos realizados até o momento utilizaram as cascas

do caule de Erythrina velutina e as sementes (VIRTUOSO, 2005; OZAWA et al.,

2008, 2009) o que representa um risco à sobrevivência da espécie (ZSCHOCKE

et al., 2000). Portanto, é de grande interesse científico a avaliação do potencial

23

farmacológico e o estudo fitoquímico de outras partes da planta, como folhas, as

quais são mais disponíveis que flores ou sementes e cuja coleta não tende a

causar a destruição da planta, ao contrário do que ocorre com cascas ou raízes.

Estudos para avaliar a atividade antimicrobiana e toxicológica que comprovem a

segurança do uso da Erythrina velutina são muito importantes, mas ainda muito

escassos.

As pesquisas em produtos naturais tornam-se urgentes, uma vez que a

concretização de programas para promover o levantamento desta riqueza nativa,

busca contribuir efetivamente para o desenvolvimento auto-sustentável da Região

Nordeste, oferecendo ao Estado de Sergipe uma alternativa de elevado potencial

econômico.

Desse modo, avaliou-se a composição química do extrato metanólico

das folhas da espécie Erythrina velutina Willd (Fabaceae). O mérito deste estudo

está na ocorrência da referida espécie no Estado de Sergipe e no pouco

conhecimento sobre a sua quimiotaxonomia e comprovação científica do seu

potencial terapêutico. Os dados levantados em pesquisa bibliográfica e de campo

permitem observar a unanimidade quanto à escassez de informações sobre o

aspecto químico, efeitos farmacológicos e atividade antimicrobiana das folhas da

Erythrina velutina, consumidas oralmente pela população, por meio de diferentes

preparados.

Assim sendo, torna-se relevante investigar o perfil fitoquímico do

extrato das folhas de Erythrina velutina Willd, podendo dessa maneira comprovar

e beneficiar a saúde da população que faz uso das substâncias provindas dessa

planta.

24

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Plantas medicinais

O conhecimento sobre as plantas acompanha a evolução do homem

ao longo dos séculos. As primitivas civilizações cedo se aperceberam da

existência, ao lado das plantas comestíveis, de outras dotadas de maior ou menor

toxicidade que, ao serem experimentadas no combate à doença, revelaram,

embora empiricamente, o seu potencial curativo. Esta interação se traduz na

religiosidade, modo de vida, trabalho e no trato com a saúde, conforme as

compreensões dos grupos culturais, que há milênios, praticam alguns dos

conhecimentos que são repassados através das gerações. Observar a história

das civilizações mesopotâmica, egípcia, chinesa, entre outras, quanto ao uso de

plantas medicinais mostra a importância dos conhecimentos que levaram a

construção da base da medicina tradicional.

Essa tendência alcança o século XIX, onde os recursos terapêuticos

usados na medicina tradicional eram constituídos predominantemente por plantas

e extratos vegetais. Destaca-se nessa época a “Farmacopéia Geral para o Reino

e Domínios de Portugal”, onde se encontram descritas cerca de 400 espécies

vegetais e seus usos pela população (SCHENKEL et al., 2007).

Ainda neste século foi descoberto o primeiro princípio ativo isolado de

planta, a quinina, marcando o início dos estudos para o isolamento e utilização de

substâncias terapêuticas (SCHENKEL et al., 2007, PHILLIPSON, 2001).

Os recursos terapêuticos de origem vegetal começaram a ser

estudados no início do século XX, estabelecendo-se lentamente a tendência de

25

utilização das substâncias ativas isoladas e seus efeitos terapêuticos estudados

(SCHENKEL et al., 2007).

A utilização das substâncias ativas isoladas se impôs pela constância

da composição, maior eficácia, segurança e qualidade dos produtos, facilitando o

estabelecimento de especificações para uma substância única, em relação ao

extrato bruto da planta (SCHENKEL et al., 2007).

MIGUEL e MIGUEL (2004) relatam que "as pesquisas científicas

iniciaram na tentativa de comprovar a identidade botânica, composição química e

ação farmacológica das drogas vegetais, agrupando aquelas de efeitos

semelhantes. Essas pesquisas buscaram determinar as estruturas quimicamente

ativas e a promoção de modificações estruturais. Esses estudos possibilitaram a

proposição de maior atividade terapêutica, junto aos requisitos de qualidade e

ausência de toxicidade".

Com o desenvolvimento de várias tecnologias, aliado ao interesse em

se confirmar o conhecimento em medicina popular, as plantas medicinais têm tido

seu valor terapêutico pesquisado mais intensamente pela ciência.

Como estratégia para investigação de plantas medicinais, a abordagem

etnofarmacológica consiste em combinar informações adquiridas junto a

comunidades locais, que fazem uso da flora medicinal, com estudos

químico/farmacológicos realizados em laboratórios especializados

(ELIZABETSKY & SOUZA, 2007). Desse modo foram descobertos produtos como

a morfina, a codeína, a digoxina, a beladona, a atropina e muitos outros

compostos que modificaram a história médica e tornou o tratamento das doenças

uma realidade, e não apenas uma promessa de cura.

26

Esse grande avanço científico pode garantir as áreas da Botânica, da

Química de Produtos Naturais e da Farmacologia grandes descobertas com

aplicações diretas na medicina tradicional denominada Fitoterapia. Nesta

perspectiva programas de financiamento à pesquisa têm se incorporado junto às

Universidades e Instituições de Pesquisa incentivando a busca de fármacos com

aplicação na prevenção à saúde e cura de diversas patologias (VIRTUOSO,

2005).

Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), pelo

menos 65-80% da população mundial, em países em desenvolvimento, recorre às

plantas medicinais para obter benefícios à saúde. Aproximadamente 25% das

drogas prescritas mundialmente vêm de plantas, sendo 121 desses compostos

ativos de uso corrente. Dos 252 medicamentos consideradas básicos e essenciais

pela Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são exclusivamente de origem

vegetal e um número significativo são compostos sintéticos obtidos a partir de

precursores naturais (RATES, 2001). No entanto, poucas plantas têm sido

cientificamente estudadas para a avaliação da sua qualidade, segurança e

eficácia (CALIXTO, 2005).

Nas últimas décadas, o interesse da população pela medicina

alternativa levou a indústria farmacêutica a investir na pesquisa de novas drogas

a partir dos recursos naturais, levando o mercado de fitoterápicos a atingir a cifra

de 7 bilhões no ano de 1997, somente na Europa (CALIXTO, 2000). Estima-se

que o comércio mundial de produtos fitoterápicos movimente cifras da ordem de

US$ 22 bilhões de dólares (YUNES; PEDROSA; FILHO, 2001).

Os países latino-americanos juntos possuem grande parte da

biodiversidade mundial. Nesta perspectiva, o Brasil possui cerca de 20-22% de

27

todas as plantas e microrganismos. Entretanto, estima-se que não mais de 25.000

espécies de plantas têm sido objeto de qualquer tipo de investigação científica

(CALIXTO, 2005).

Avalia-se, no Brasil, que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento da

indústria farmacêutica nacional, em 1996, foram originados de medicamentos

derivados de plantas (URIAS, 2006). O Brasil é o país com maior diversidade

genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 mil espécies

catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA; NODARI,

2007).

A biodiversidade do ecossistema brasileiro, uma das mais ricas do

planeta, coloca o Brasil em posição privilegiada frente a outros países e para

investigá-la, torna-se necessária a dedicação de inúmeros pesquisadores nas

várias áreas de pesquisas científicas.

Em dezembro de 2005 foi aprovada a Política Nacional de Práticas

Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (PNPIC-SUS), que

tem como objetivo ampliar as opções terapêuticas aos usuários do SUS, com

garantia de acesso às plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à

fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade

da atenção à saúde (BRASIL, 2006).

O aumento na produção e no consumo de produtos fitoterápicos

demanda maior rigor relativo à qualidade destes produtos. No Brasil, a Agência

Nacional de Vigilância Sanitária tem sido bastante rigorosa e a legislação vigente

(RDC nº 14/2010 – ANVISA) requer a detecção e a quantificação dos chamados

marcadores. Apesar de muitos deles serem comerciais, seus preços são

28

geralmente bastante elevados, por isso são importantes os estudos de otimização

dos mesmos.

Diante disso, é necessária a realização de estudos para investigar a

atividade de extratos totais de plantas e a relação entre a atividade dos diferentes

compostos para a obtenção do efeito terapêutico desejado, pois são conhecidos

alguns constituintes bioativos de plantas, através de atividade sinergística, que

podem ter sua ação potencializada ou seus efeitos colaterais atenuados por

outros constituintes secundários encontrados nos extratos brutos (ELVIN-LEWIS,

2001).

2.2 Importância dos marcadores químicos

O desenvolvimento de fitoterápicos inclui várias etapas e envolve um

processo interdisciplinar, multidisciplinar e, muitas vezes, interinstitucional. As

áreas de conhecimento envolvidas vão desde a botânica, agronomia, ecologia,

química, fitoquímica, farmacologia, toxicologia, biotecnologia, química orgânica

até a tecnologia farmacêutica.

Neste contexto, os estudos fitoquímicos compreendem as etapas de

isolamento, elucidação estrutural e identificação dos constituintes mais

importantes do vegetal, principalmente de substâncias originárias do metabolismo

primário e secundário, responsáveis, ou não, pela ação biológica. Esses

conhecimentos permitem identificar a espécie vegetal, conjuntamente com

ensaios de atividade biológica, analisar e caracterizar frações ou substâncias

bioativas. Ressalta-se ainda, a importância do estabelecimento de marcadores

químicos para o desenvolvimento de fitoterápicos, onde a legislação vigente (RDC

nº 14/2010 – ANVISA) define marcador como o componente ou classe de

29

compostos químicos (ex: alcalóides, flavonóides, ácidos graxos, etc.) presente na

matéria-prima vegetal, idealmente o próprio princípio ativo e, preferencialmente,

que tenha correlação com o efeito terapêutico que é utilizado como referência no

controle de qualidade da matéria-prima vegetal e dos medicamentos fitoterápicos.

Para isso, o conhecimento da estrutura química tem especial relevância

no caso de substâncias facilmente degradáveis por fatores tais como luz, calor e

solventes, atrelados ao processo tecnológico (TOLEDO et al., 2003)

A diversidade molecular, fator importante para a procura de novas

moléculas em plantas, significa também, diferentes propriedades físico-químicas.

Esse fato representa um desafio para o químico que pretende isolar e determinar

a estrutura de compostos ativos, uma vez que o extrato de determinada planta

pode conter centenas ou milhares de compostos (HAMBURGER;

HOSTETTMANN, 1999).

Metabólitos são substâncias produzidas e/ou necessárias em qualquer

processo químico ou metabolismo inerente a um organismo vivo. O estudo de

metabólitos secundários como marcadores químicos em taxóns de plantas e

microorganismos vêm sendo cada vez mais ampliado e aceito por taxonomistas

de destaque. Estes podem utilizar caracteres químicos (micromoléculas) e

caracteres macromoleculares na identificação de relações existentes entre seres

vivos em qualquer nível hierárquico: populações, espécies, gêneros, tribos,

famílias, etc. bem como em análises evolutivas para avaliar relações filogenéticas

e variação dentro de espécies (ZDERO & BOHLMANN, 1990). Esse processo de

estudo classificatório denomina-se quimiossistemática ou quimiotaxonomia.

As plantas possuem em sua composição substâncias denominadas

metabólitos, e estas podem ser divididas em dois grupos distintos: metabólitos

30

primários e secundários. Os primários (lipídeos, carboidratos, proteínas e ácidos

nucléicos) são essenciais à vida e ao desenvolvimento das plantas, sendo

fornecedores de matéria-prima e de energia para a formação dos metabólitos

secundários, como: taninos, alcalóides, flavonóides, glicosídeos cianogênicos

dentre outros (SANTOS, 2007). A origem de metabólitos primários e secundários

em plantas envolve rotas biossintéticas complexas, onde atuam sistemas de

enzimas poderosas, muitas das quais ainda não foram totalmente elucidadas.

Durante muito tempo os metabólitos secundários foram considerados

como produtos de excreção do vegetal, com estruturas químicas e, algumas

vezes, propriedades biológicas interessantes. Atualmente, sabe-se que muitas

destas substâncias estão diretamente envolvidas nos mecanismos que permitem

a adequação da planta ao seu meio. O aparecimento destes compostos é

determinado por necessidades ecológicas como, limitações nutricionais, defesa

contra herbívoros e microorganismos, proteção contra raios ultravioleta (UV),

atração de polinizadores e possibilidades biossintéticas, tanto em relação ao

número de substâncias produzidas quanto à sua diversidade numa mesma

espécie (SANTOS, 2007).

Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários,

apenas os compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados

e estudados pela fitoquímica clássica. Porém, normalmente, os compostos

presentes em menor proporção na planta são os que apresentam melhores

efeitos terapêuticos (YUNES; PEDROSA; FILHO, 2001).

É importante ressaltar que substâncias em princípio consideradas

terapêuticas também podem causar efeitos indesejados ou tóxicos, sendo

imprescindível à realização de estudos toxicológicos desses compostos. Apesar

31

de várias plantas do gênero Erythrina terem sido muito estudadas, outras

apresentam poucos estudos, como se observa com as folhas da Erythrina velutina

Willd.

2.3 Erythrina velutina Willd

O gênero Erythrina (família Fabaceae) é muito conhecido, ocorrendo

nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Possui cerca de 110 espécies, das

quais 70 são nativas da América (VASCONCELOS et al., 2003). O nome

Erythrina vem do grego "erythros", que significa vermelho, em alusão à cor de

suas flores. O epíteto específico “velutina” vem do latim, devido ao fato da folha

apresentar indumento de delicados e macios pêlos (CARVALHO, 2008).

Encontra-se no Brasil cerca de doze espécies (EPAMIG, 1993), sendo as duas

principais Erythrina velutina, originária do Nordeste e Erythrina mulungu, nativa do

Sudeste (NEILL, 1988).

A espécie Erythrina velutina Willd (Figura 1) é uma árvore de grande

porte, decídua, que mede de 8 a 12 m de altura, com tronco de 40-70 cm de

diâmetro; possui fruto do tipo legume, flores de coloração vermelha e folhas

alternadas compostas e trifolioladas, sustentadas por pecíolo de 6-14 cm; folíolos

cartáceos, com fase ventral apenas pulverulenta e dorsal de cor verde mais clara

revestida por densa pilosidade feltrosa, de 6-12 cm de comprimento por 5-14 cm

de largura (LORENZI, 1998).

Segundo a classificação taxonômica, a espécie pertence ao Reino-

Plantae, Filo-Magnoliophyta, Classe-Magnoliopsida, Ordem-Fabales, Família-

Fabaceae (Leguminosae – Papilionoideae), Subfamília - Faboideae. Tem como

sinonímias científicas Corallodendrum velutinum Willd., Chirocalyx velutinus Walp;

32

floresce de agosto a dezembro e os frutos amadurecem em janeiro a fevereiro,

podendo ser encontrada na região metropolitana de Aracaju (JOLY, 2002).

A planta em estudo é característica de várzeas úmidas e beira de rios

da caatinga da região semi-árida do Nordeste brasileiro. É também encontrada na

orla marítima de Pernambuco e na floresta latifoliada de Minas Gerais e São

Paulo (LORENZI, 1998). O Estado de Sergipe é caracterizado por vegetação

típica de caatinga e por remanescentes de mata atlântica, ambientes propícios

para encontrar esta planta (Figura 1).

Figura 1 - Erythrina velutina Willd., Fabaceae

Fonte: LORENZI (1998)

33

O referido gênero engloba plantas que são popularmente chamadas de

“mulungu”, “canivete”, “suína”, “sananduva”, “pau-imortal” ou “muchocho”

(CORRÊA, 1952).

Segundo LORENZI (1998) a Erythrina velutina é conhecida

popularmente por: “mulungu”, “suína”, “canivete”, “corticeira”. De acordo com

EPAMIG (1993) e o país onde a planta é encontrada vamos ter: “mulungu-da-

catinga”, “mulungu”, “pau-de-coral”, “sanaduí”, “sananduva”, “suína”, “suinan”

(Brasil); “arbe à coral” (Guiana Francesa); “bucare”, “pinon da costa” e “pinon

espinosa” (Cuba); “bucare” e “peonita” (Venezuela); “cay-boung” (Conchinchina);

“chocho” e “coral” (Colômbia); “coral bean tree” (Inglaterra); “imortelle” (Martinica);

“poró blanco” (Costa Rica).

A madeira da Erythrina velutina é leve, macia e pouco resistente aos

agentes decompositores. É empregada na confecção de tamancos, jangadas,

brinquedos e caixotaria. A árvore é extremamente ornamental, principalmente

quando em flor, e isto tem estimulado seu uso no paisagismo, principalmente na

arborização de ruas, jardins e alamedas. A árvore também é utilizada como cerca

viva pela facilidade com que pega de estacas espetadas no próprio local

(LORENZI, 1998).

A casca e os frutos dessa espécie são empregados na medicina

popular em algumas regiões do Nordeste, embora a eficácia e a segurança do

seu uso ainda não tenham sido comprovadas cientificamente. Assim, seu uso

vem sendo feito com base na tradição popular. São atribuídas às preparações de

sua casca propriedades sudoríficas, calmante, emoliente e peitoral. Ao seu fruto

seco, ação anestésica local quando usado na forma de cigarro como odontálgico

(CARVALHO, 2008).

34

2.4 Fitoquímica

Em 1877, teve início o estudo do gênero Erythrina, devido à descoberta

da ação farmacológica do extrato das sementes da E. americana, por Dominguez

e Altamirano (HARGREAVES et al., 1974). Após essa descoberta, os extratos de

diferentes espécies de Erythrina passaram a ter seus perfis fitoquímicos e

farmacológicos pesquisados.

As plantas do gênero Erythrina são a principal fonte dos alcalóides

tetracíclicos do tipo eritrina, que foram originalmente identificados em 1937 por

FOLKERS e MAJOR, através da investigação química das sementes da E.

americana Mill e isolaram a eritroidina, o qual apresentava atividade paralisante

semelhante a d-tubocurarina (NKENGFACK et al., 1994). As plantas do gênero

Cocculus (família Menispermaceae) também produzem alcalóides tetracíclicos

eritrínicos, diferindo somente no padrão de oxigenação (AMER; SHAMMA;

FREYER, 1991).

A nomenclatura dos tipos de alcalóides eritrínicos é interessante. O

prefixo “eryso-” denota a presença de uma função fenólica. O prefixo “erythroi-”

indica que o anel D do esqueleto é lactônico; enquanto o prefixo “erythra-” mostra

que o anel D do esqueleto é o clássico (Figura 2), como por exemplo a (+)-

eritravina (AMER; SHAMMA; FREYER, 1991).

35

Figura 2 – Estrutura química do esqueleto clássico de alcalóides eritrínicos.

Fonte: AMER; SHAMMA; FREYER, 1991

Os alcalóides dienóides apresentam um sistema diênico nos anéis A e

B (Figura 3). Os alcalóides que possuem uma dupla ligação ∆1,6 no anel A são

denominados alquenóides (Figura 3) (AMER; SHAMMA; FREYER, 1991).

(I) (II)

Figura 3 – Estrutura química do esqueleto básico de alcalóides eritrínicos

do tipo dienóide (I) e alquenóide (II)

Fonte: SARRAGIOTTO, 1981.

Um terceiro grupo de alcalóides eritrínicos inclui: erisodienona, 3-

desmetoxi eritratidinona, α-eritroidina e β-eritroidina (Figura 4) (AMER; SHAMMA;

FREYER, 1991).

36

Erisodienona 3-desmetoxi eritratidinona

α-eritroidina β-eritroidina

Figura 4 – Estruturas químicas de alcalóides eritrínicos

Fonte: SARRAGIOTTO, 1981

Também foram isolados de espécies de Erythrina alguns alcalóides

que não apresentam o esqueleto eritrínico: orientalina, N-noorientalina,

protosinomenina, N-norprotosinomenina, isoboldina, eribidina, scourelina,

coreximina, hipaforina, colina (FLAUSINO-JUNIOR, 2006).

Da E. variegata foram isolados alcalóides deste gênero como

erisotrina, erisodina, erisovina, eritralina, erisopina, erisonina, erisopitina,

eritratina, hipaforina (GHOSAL; DUTTA; BHATTACHARYA, 1972), sendo que a

erisodina e erisovina são os mais amplamente distribuídos (GARCIA-MATEOS;

SOTO-HERNANDEZ; KELLY,1998).

A erisotrina, eritrartina, hipaforina, N-óxido de erisotrina, N-óxido de

eritrartina foram isolados do extrato etanólico preparado com as flores secas de E.

37

mulungu, sendo que os três primeiros compostos são de ocorrência comum nesta

espécie de Erythrina. Dos dois últimos compostos não foi excluída a possibilidade

de serem artefatos, mas considerando o processo de extração e o material

vegetal utilizado, foi definido que são produtos naturais do metabolismo da

espécie (SARRAGIOTTO; LEITÃO FILHO; MARSAIOLI, 1981; SARRAGIOTTO,

1981).

Foram isolados dois novos alcalóides glucodienóides: o (+)-16β-D-

lucoerisopina e (+)-15β-D-glucoerisopina das sementes de E. latíssima

(WANJALA; MAJINDA, 2000). Flavonas e isoflavonas preniladas foram isoladas

da E. vogelii, a saber, vogelin A, vogelin B, e vogelin C, vogelin H, vogelin I,

vogelin J (WAFFO et al., 2006; ATINDEHOU et al., 2002). Um novo alcalóide foi

isolado das flores da E.herbacea: o 10-hidroxi-11-oxyerysotrine (TANAKA et al.,

2008). FLAUSINO et al., (2007) a partir do extrato hidroalcoólico das flores de E.

mulungu isolou um novo alcalóide eritrínico, a (+)-11 α – hidroxi-eritravina, e dois

já conhecidos, a (+) – eritravina e (+) – α – hidroxi-erisotrina.

Da Erythrina velutina isolou-se a (+)-eritralina e a (+)-eritratina (Tabela

1) (AMER; SHAMMA; FREYER, 1991). Um novo isoflavonóide, a erivelutinona ((-

)2’, 4’-dihidroxi-6-prenil-7-metoxiisoflavona), foi isolada, pela primeira vez, da

casca da Erythrina velutina como uma goma marrom-amarelada, e a 4’- O -

metilsigmoidina (Tabela 1) (DA-CUNHA, 1996). Um estudo de fracionamento

químico realizado com o extrato etanólico da casca da Erythrina velutina foram

identificados a homoesperitina e faseolidina (Tabela 1) (RABELO et al., 2001).

VIRTUOSO et al. (2005) realizaram um estudo com o extrato etanólico da casca

da Erythrina velutina onde a análise do cromatograma da amostra fração

hexânica obtido no cromatógrafo a gás evidenciou a presença de ácido fênico,

38

ácido cinâmico, α – amirina, estigmasterol, β – amirina, β – sitosterol e lupeol. No

extrato metanólico das sementes da Erythrina velutina, foi isolado hipaforina, um

alcalóide indólico (OZAWA et al., 2008). Em 2009, OZAWA et al. isolaram das

sementes um novo alcalóide: o N- óxido de erisodina (Tabela 1). Também das

cascas do caule de Erythrina velutina foi isolado por CABRAL (2009), um

triterpeno do tipo oleanano (3β-Olean-12-ene-3,28-diol), um alcalóide do tipo

eritrínico (erisovina) e três flavonóides: um pterocarpano (faseolidina), uma

flavona prenilada (4’-O-metil sigmoidina B) e um isoflavonóide glicosilado (7-O-[α-

ramnopiranosil-β-glicopiranoside]-genisteina), sendo esse último composto

relatado pela primeira vez no gênero Erythrina (Tabela 1).

Tabela 1 – Estruturas químicas dos compostos isolados da Erythrina velutina

(+) – eritralina

(+) - eritratina

Erivelutinona

4’-O-metilsigmoidina

39

Continuação da Tabela 1

Homoesperitina

Faseolidina

Hipaforina

N- óxido de erisodina

7-O-[α-ramnopiranosil-β-glicopiranoside]-genisteina

As plantas da Família-Fabaceae (Leguminosae – Papilionoideae)

possuem sementes ricas em lectinas, proteínas de natureza não-imunoglobulina

capazes de reconhecimento específico e ligação reversível a carboidratos. Seu

papel nas plantas não está bem estabelecido. MORAES et al. (1996), extraiu

lectina das sementes de Erythrina velutina e demonstrou indução da migração de

neutrófilos na cavidade peritoneal e bolsa de ar dorsal de ratos.

Em trabalho realizado com o extrato aquoso das folhas de Erythrina

velutina, CARVALHO et al. (2009), constataram a presença de diferentes classes

químicas tais como alcalóides, catequinas, esteróides, flavonóis, flavonas,

flavonóides, fenóis, saponinas, taninos, triterpenóides e xantonas.

O

OOH

OH

O

O

H

H O

H

HO

H

OHH

O

O

H

HO

H

H O

H

OHH

H 3C

78

6

29

105 4

3

4'

3'

6'

5'

1'2'

1'''

6''

3''1''2''

5''

2'''

5'''

3'''

4' ''6 '''

4 ''

40

Muitos estudos fitoquímicos mostram que as espécies do gênero

Erythrina possuem compostos que pertencem a outras classes químicas, tais

como isoflavanonas, isoflavonas e pterocarpanos, dentre os derivados não-

alcaloídicos (NKENGFACK et al., 1994). Isso vem demonstrar que este gênero é

uma fonte de substâncias biologicamente ativas.

2.5 Atividades farmacológicas

De acordo com GARIN-AGUILAR (2000), os efeitos anticonvulsivantes,

hipotensivos, hipnóticos e anestésicos (CRAIG, 1981; HARGREAVES et al., 1974;

GHOSAL et al., 1972) do curare são semelhantes aos efeitos dos alcalóides

extraídos da Erythrina americana, que foram descritos por Altamirano e

Domingues em 1888 (FOLKERS & MAYOR, 1937; LEHMAN, 1936) e confirmados

por RAMÍREZ & RIVERO em 1935.

ROGER et al. (2001) em um estudo com o extrato bruto de Erythrina

vespertilio, mostraram sua atividade sobre o sistema serotonérgico inibindo a

liberação cálcio-dependente de serotonina plaquetária, uma das principais

atividades dos antagonistas de receptores 5-HT3.

Segundo BARROS (1970) o extrato aquoso e etanólico das cascas de

Erythrina velutina utilizados em testes farmacológicos na concentração de 1:1,

apresentaram resultados significativos. No extrato etanólico aplicado em gatos,

sintomas, tais como depressão da respiração e da pressão sanguínea foi

reportada. Para o extrato aquoso observou-se estímulo respiratório. Quando

ambos os extratos foram utilizados em sapos, observou-se depressão da

atividade do músculo cardíaco, inibição das contrações musculares induzidas em

uma preparação de músculo abdominal de sapo. Já em coelhos observou-se,

41

inibição da motilidade e tônus de uma preparação de duodeno para ambos os

extratos e, forte atividade inibidora de contrações uterinas induzidas por ocitocina.

Estudos farmacológicos com Erythrina velutina em animais de

laboratório constataram uma atividade espasmolítica significativa do extrato bruto

hidroalcoólico, como também atividade curarizante, antimuscarínica e depressora

do sistema nervoso central, compatíveis com as propriedades preconizadas pela

medicina popular para esta planta (LORENZI & MATOS, 2002).

Estudos realizados por VASCONCELOS et al. (2003) com o extrato

hidroalcoólico da casca de Erythrina velutina e E. mulungu apresentaram efeitos

antinoceptivos significantes em diferentes modelos experimentais e, que os

efeitos analgésicos destas plantas são independentes do sistema opióide. Em

contra partida, em 2004, esses pesquisadores avaliaram os efeitos no

comportamento de ratos em estudo com os mesmos extratos demonstrando

redução da atividade locomotora após tratamento intraperitoneal (i.p.), no teste de

cruz elevado, campo aberto e de coordenação motora (rota rod).

Em 2004, DANTAS et al. testaram o extrato aquoso das folhas de

Erythrina velutina em roedores e apresentou aumento do sono induzido por

pentobarbital de maneira dose-dependente indicando efeito sedativo, hipnótico e

diminuição da atividade motora. Um dos dados mais significativos refere-se à

interferência com os processos mnemônicos em baixas doses. De acordo com o

trabalho de MARCHIORO et al. (2005) o extrato aquoso das folhas de Erythrina

velutina no teste do edema de pata não inibiu o processo inflamatório. Na placa

quente não houve diferença estatística na latência quando comparado ao

controle. Porém, tanto no modelo da formalina, quanto do ácido acético, os

42

resultados aproximaram-se dos obtidos por VASCONCELOS et al. (2003). Além

disso, o antagonista opióide naloxona reverteu o efeito do extrato na maior dose.

RIBEIRO et al. (2006) pesquisando os efeitos do extrato hidroalcoólico

da casca da Erythrina velutina e E. mulungu em ratos submetidos a modelos de

animais de ansiedade e depressão demonstraram efeito do tipo ansiolítico no

labirinto em T similar ao diazepam, controle positivo. O estudo mostrou também

que tanto a atividade locomotora no campo aberto, como o tempo de imobilidade

na natação forçada, não foi alterada em nenhuma das doses, após administração

aguda ou crônica.

SANTOS et al. (2007) em trabalho realizado com o extrato aquoso das

folhas da Erythrina velutina sobre ducto deferente de rato, observaram que o

extrato aquoso inibiu as contrações induzidas por estímulo elétrico de campo de

maneira dependente da concentração. VASCONCELOS et al. (2007) pesquisando

os efeitos anticonvulsivantes no extrato hidroalcoólico da casca de Erythrina

velutina (v.o. e i.p.) e E. mulungu (i.p.), utilizaram o teste das convulsões

induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ), estricnina sugerindo ação depressiva do

sistema nervoso central. RAUPP et al. (2008) utilizando modelos experimentais

de ansiedade em camundongos, quando administrado de forma crônica o extrato

hidroalcoólico da casca da Erythrina velutina sugeriu exercer efeito ansiolítico.

OZAWA et al. (2008) avaliaram o tempo de sono em camundongos administrando

hipaforina, um alcalóide indólico, presente em Erythrina velutina. O presente

estudo confirmou a indução do sono.

TEIXEIRA-SILVA et al. (2008) testaram os efeitos semelhantes dos

benzodiazepínicos utilizando o extrato alcoólico das folhas da Erythrina velutina,

em modelos animais que avaliam a ansiedade, memória e epilepsia. Os efeitos

43

observados para o extrato alcoólico no sistema nervoso dos roedores

assemelharam-se ao perfil dos efeitos dos benzodiazepínicos e podem ser

interpretados pela interação do extrato com os sistemas gabaérgicos.

CARVALHO et al. (2009) investigaram as evidências farmacológicas do

mecanismo de ação da Erythrina velutina a partir do extrato aquoso das folhas,

cujos constituintes são importantes para as atividades farmacológicas.

Observa-se que grande parte dos trabalhos realizados utilizam extratos

brutos de diferentes espécies de Erythrina, sem, no entanto, realizar a verificação

dos compostos envolvidos nas atividades observadas.

2.6 Aspectos toxicológicos do gênero e espécie

Os estudos de genotoxicidade com plantas têm crescido juntamente

com o aumento do uso terapêutico e com o interesse de comprovação da eficácia

das mesmas nas mais diversas finalidades farmacológicas. Isso se deve ao fato

de muitas das plantas utilizadas por um grande número de pessoas, apesar de

possuírem propriedades farmacológicas, também podem causar alterações no

DNA (VARANDA, 2006). Apesar da importância, poucos são os estudos

toxicológicos que comprovam a segurança do uso da Erythrina velutina Willd.

Em um trabalho feito com o extrato aquoso das folhas de Erythrina

velutina, BONFIM (2001) demonstrou o caráter possivelmente atóxico, em um

estudo de toxicidade aguda pré-clinica em todos os animais que sobreviveram à

administração de 5 g/Kg do extrato. O referido trabalho não atendeu a todas as

recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para a

realização de estudos de toxicidade pré-clinica de fitoterápicos (ANVISA-

44

Resolução RE No 90,16 de Março de 2004). CRAVEIRO et al. (2008)

demonstraram que não houve toxicidade aguda a partir do extrato aquoso de

folhas de Erythrina velutina em ratos Wister tratados por via oral. Nenhum animal

veio a óbito e nenhum sinal de toxicidade foi detectado nas observações

comportamentais ou nas autópsias, indicando uma razoável atoxicidade do

extrato.

OLIVEIRA et al. (2008) avaliaram em ratos, por meio do teste do

micronúcleo em células hematopoiéticas, o possível efeito genotóxico do extrato

alcoólico das folhas de Erythrina velutina. Os resultados obtidos demonstraram

que a incidência de eritrócitos policromáticos micronucleados observada nos

tratamentos não diferiu da incidência gerada pela formação espontânea do

micronúcleo. Portanto, a ingestão do extrato das folhas da Erythina velutina nas

concentrações testadas não apresentam potencial genotóxico.

Os dados obtidos nesses trabalhos de toxicidade e genotoxicidade com

a Erythrina velutina, mostram a necessidade de estudos, não apenas, com o

extrato bruto, como também com compostos isolados da planta.

2.7 Aspectos da atividade antimicrobiana do gênero e espécie

As primeiras observações acerca da utilização de produtos naturais

com atividade antimicrobiana remontam aos tempos da Babilônia, 3000 anos a.C.,

quando portadores de feridas infeccionadas usavam o alho Allium sativum L.

(Liliaceae), na forma de cataplasma para a cura de suas chagas (CAVALLITO &

BAILEY, 1944). Ao longo da história muitas foram às personalidades que

buscaram identificar propriedades antimicrobianas na natureza.

45

Na atualidade, os fármacos usados no tratamento de doenças

causadas por bactérias e fungos são denominados agentes antimicrobianos. Este

termo, introduzido com a descoberta da penicilina por Fleming em 1928, foi

considerado o primeiro antibiótico a ser produzido em escala industrial (PEREIRA

& PITA, 2005). Os antimicrobianos contribuíram de forma decisiva para a

diminuição das taxas de morbidade e mortalidade, particularmente das doenças

infecciosas de origem bacteriana. A partir da introdução da penicilina e da

sulfonamida, ocorreu um crescente progresso no isolamento e no

desenvolvimento de agentes antimicrobianos utilizados na terapia e na profilaxia

das patologias decorrentes da ação dos microorganismos (SILVA, 2006).

Ao longo das últimas décadas, o avanço da indústria farmacêutica

levou ao surgimento de diversos antimicrobianos, com espectro de ação cada vez

mais amplo. Entretanto, a exposição aos antimicrobianos desencadeou

resistência bacteriana, limitando as opções terapêuticas dos processos

infecciosos.

O uso indiscriminado dos antimicrobianos e a administração de forma

não controlada, juntamente com o aumento da prevalência das doenças

imunossupressoras têm sido as mais importantes causas da resistência aos

antimicrobianos. Os principais mecanismos de resistência são desencadeados

pela inativação enzimática; modificações nos receptores, devido a mudanças

ribossômicas e de DNA girase, alterações de enzimas bacterianas e fúngicas,

mudanças no transporte do antimicrobiano, nas proteínas da membrana externa,

na força protônica reduzida e transporte ativo a partir da célula microbiana

(SILVA, 2006). A busca de novas alternativas que possam substituir ou melhorar

os antimicrobianos disponíveis é urgente, e uma das fontes de pesquisa é

46

representada pelos produtos de origem natural. Grande parte dos antimicrobianos

em uso (penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos, entre outros) são derivados

de metabólitos secundários de fungos e bactérias. É possível que da mesma

forma, existam metabólitos provenientes de espécies vegetais com propriedades

semelhantes e que futuramente possam substituir os medicamentos outrora

eficientes. O antimicrobiano ideal, objeto permanente de pesquisa, é aquele que

apresenta atividade letal ou inibitória contra diferentes espécies de

microorganismos, não provoque efeitos colaterais, seja quimicamente estável e

não induza resistência microbiana (SCHENKEL et al., 2007).

Logo, a busca de propriedades antibacterianas a partir de extratos de

plantas e substâncias mais seletivas tem sido incentivada e intensificada

(MIGUEL & MIGUEL, 2004). Sendo assim, entre inúmeros gêneros vegetais a

serem investigados destaca-se o gênero Erythrina, que apresenta em sua

composição química uma grande diversidade de metabólitos secundários

bioativos.

O extrato da planta africana E. abyssinica demonstrou atividade contra

leveduras e fungos, sendo que a eritroabissin-I e faseolina, isolados desta

espécie, tiveram atividade antilevedura contra Sacharomyces cerevisae e

Candida utilis com concentração inibitória mínima (CIM) entre 25-50 µg/mL e

atividade antifúngica contra Sclerotinia lebertiana, Mucor mucedo, Rhizopus

chinensis com CIM entre 6-25 µg/mL (NAKANISHI, 1982).

O gênero Erythrina tem provado ser uma fonte farta de espécies

contendo agentes antimicrobianos que pertencem a várias classes estruturais de

flavonóides. Raízes de E. variegata demonstraram atividade contra Staphyloccus

aureus e Mycobacterium smegmatis (TELIKEPALLI et al., 1990). Também das

47

raízes da E. variegata L. foi isolado um isoflavonóide, a ericristagallin, que é um

potente agente antibacteriano contra Streptococcus mutans, sendo usado para

prevenção da cárie dental (SATO et al., 2002). TANAKA et al., (2002) mostrou

que os isoflavonóides ericristagallin e orientanol B, isolados da E. variegata

apresentam alta atividade antibacteriana quando testados contra cepas de

Staphyloccus aureus resistentes a meticilina com valores de concentração

inibitória mínima (CIM) entre 3,13-6,25 µg ml-1. Posteriormente, também dessa

mesma espécie foi isolada isoflavanona bidwillon B e foi demonstrada atividade

contra Staphyloccus aureus resistentes a meticilina (SATO et al., 2004).

Os extratos metanólico e diclorometano de E. vogelii mostraram

propriedades antifúngicas contra Cladosporium cucumerinum no ensaio direto de

autobiografia (ATINDEHOU et al., 2002.). Os isoflavonóides cinnamilfenol e

eripostirene, isolados das raízes de E. poeppigiana, possuem atividade

antilevedura contra cepa de Candida albicans e atividade antibacteriana contra

cepa de Staphyloccus aureus resistentes a meticilina (SATO et al. 2003; TANAKA

et al., 2004).

A partir do tronco de madeira da E. latissima, duas isoflavonas e uma

flavanona foram isoladas e caracterizadas como 7,3’-dihidroxi-4’-metóxi-5’-(γ,γ-

dimetillalil) isoflavona (erilatissin A), 7,3’-dihidróxi-6’’,6’’-dimetil-4’’,5’’-

dehidropirano [2’’,3’’:4’,5’] isoflavona (erilatissin B), (-) -7,3’-dihidróxi-4’-metóxi 5’

(γ,γdimetillalil) flavanona (erilatissinC), respectivamente, além dos 10 conhecidos

flavonóides. Estes compostos mostraram atividade antimicrobiana contra

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida mycoderma

(CHACHA; BOJASE-MOLETA; MAJINDA, 2005).

48

Os flavonóides isolados da casca do caule de E. burttii apresentaram

atividade contra fungos e bactérias gram positivas, contudo, a bactéria

Escherichia coli (gram negativa) mostrou-se resistente (YENESEW et al., 2005).

Sete pterocarpanos, eribraedin B, eribraedin A, faseollin, eritrabissin II,

eristagallin A, eritrabissin-1 e ericristagallin, duas flavanonas, 5-hidroxisoforanona

e glabrol, e uma isoflavona, erisubin F, foram isolados do caule de E.

subumbrans. Os compostos eribraedin A e eritrabissin II apresentaram o mais alto

grau de atividade contra cepas de Streptococcus, com a concentração inibitória

mínima (CIM) de 0,78-1,56 µg/ml, enquanto o composto ericristagallin apresentou

o maior grau de atividade contra cepas de Staphylococcus aureus, incluindo

cepas resistentes à meticilina com um CIM de 0,39-1,56 µg/ml. Curiosamente, os

compostos eribraedin A, eritrabissin II, eristagallin A e ericristagallin foram mais

ativos contra as cepas testadas quando comparados aos antibióticos controle

(vancomicina e oxacilina) (RUKACHAISIRIKUL et al., 2007).

A atividade antibacteriana da Erythrina velutina é pouco estudada.

VIRTUOSO et al. (2005) realizaram um estudo preliminar da atividade

antibacteriana das cascas de Erythrina velutina onde foram utilizados os métodos

de difusão em disco e concentração inibitória mínima para o extrato etanólico

bruto e para a fração hexânica, contra oito bactérias patogênicas. Nesse trabalho

demonstrou-se que a presença de atividade antibacteriana dos produtos vegetais

sobre Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. Nenhuma atividade foi

observada sobre as outras bactérias testadas por difusão em ágar. Foi registrada

atividade moderada contra todos os microorganismos no teste de concentração

inibitória mínima para o extrato bruto e fração hexânica das cascas de Erythrina

velutina.

49

De acordo com o levantamento bibliográfico realizado, não foi relatada,

até o presente momento, a investigação da atividade antimicrobiana das folhas da

Erythrina velutina.

50

III. OBJETIVOS

3.1 Geral

Analisar a composição química do extrato metanólico das folhas de

Erythrina velutina Willd e verificar seu efeito farmacológico e antimicrobiano.

3.2 Específicos

- Isolar e identificar os constituintes químicos presentes no extrato

metanólico das folhas de Erythrina velutina Willd;

- Investigar o potencial efeito psicofarmacológico do extrato

metanólico bruto e das fases orgânicas de Erythrina velutina Willd;

- Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato metanólico bruto

e das fases orgânicas de Erythrina velutina Willd;

- Contribuir com a quimiotaxonomia do gênero Erythrina.

51

IV. EXPERIMENTAL

4.1 Especificações dos materiais e equipamentos

Aparelhos utilizados

- Estufa de ar circulante (MARCONI MA-037)

- Moinho (TECNAL TE-650)

- Evaporador rotativo (FISATOM 801)

- Lâmpada de ultravioleta VILBER LOURMAT, modelo CN-6

- Espectrômetro de RMN da marca MERCURY-VARIAN

- Espectrômetro de RMN da marca INOVA – Varian

Reagentes e outros materiais utilizados

- Todos os reagentes utilizados são de grau de pureza analítico e da

marca Synth ou Sigma-Aldrich.

- Sílica gel 60, ART 7734 da MERCK (0,063-0,200 mm).

- Óxido de Alumínio 90 (MERCK – pH 9,0-10,0).

- Tiras com indicadores coloridos para medir pH (Macherey-Nagel).

Métodos cromatográficos

Na cromatografia em coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60, ART 7734

da MERCK, de partículas com dimensões entre 0,063-0,200 mm e Óxido de

Alumínio 90 (MERCK – pH 9,0-10,0), tendo como suporte colunas de vidro

cilíndricas cujas dimensões variaram de acordo com a quantidade de amostra a

ser cromatografada. Para cromatografia em camada delgada (CCD), foi usada

sílica gel 60 PF254 ART 7749 da MERCK, distribuída sobre placas de vidro com

ajuda de um espalhador mecânico tipo quick fit, seguindo técnica descrita por

52

MATOS (1997). As cromatoplacas obtidas foram secas ao ar livre e ativadas em

estufa a 110 ºC durante 1 hora.

As revelações das substâncias na cromatografia em camada delgada

analítica (CCDA) foram executadas pela exposição das placas à lâmpada de

irradiação ultravioleta (UV) com comprimento de onda (254 nm) por meio de

lâmpada de ultravioleta VILBER LOURMAT, modelo CN-6 e/ou pela pulverização

com uma solução de ácido sulfúrico a 5% em etanol seguida de aquecimento. O

grau de pureza das substâncias foi evidenciado por cromatografia em camada

delgada analítica (CCDA), determinando-se a pureza quando observada uma

única mancha após revelação.

Na preparação das placas cromatográficas para a realização da

cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foi usada sílica gel 60

PF254 ART 7749 da MERCK, distribuída sobre placas de vidro com ajuda de um

espalhador mecânico tipo quick fit. A camada de sílica gel na placa foi de 1,0 mm

de espessura (MATOS, 1997). As cromatoplacas obtidas foram secas ao ar livre e

ativadas em estufa a 110 ºC durante 1 hora.

Como fases móveis foram usados os solventes hexano, clorofórmio,

acetato de etila e metanol, isoladamente ou em misturas binárias em gradiente

crescente de polaridade.

Métodos espectrométricos

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN

1H) e

Ressonância Magnética Nuclear de 13C (RMN13C) foram obtidos em

espectrômetro da marca MERCURY-VARIAN (LTF/UFPB) operando a 200 MHz

(1H) e 50 MHz (13C) e INOVA – Varian (Instituto de Química da UNESP de

Araraquara-SP) operando a 300 MHz (1H) e 75 MHz (13C).

53

As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se uma

pequena quantidade em solvente deuterado da Cambridge Isotope Laboratories

(CDCl3 e DMSO-d6). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes

por milhão (ppm) e foram referenciados para RMN1H pelos picos característicos

dos hidrogênios pertencentes às frações não deuteradas destes solventes:

clorofórmio (δH 7,24) e DMSO-d6 (δH 2,50 ppm). Para os espectros de RMN13C,

estes mesmos parâmetros foram utilizados: clorofórmio (δC 77,0) e DMSO-d6 (δC

39,50 ppm). Os dados foram obtidos em DMSO-d6 quando o aparelho utilizado foi

INOVA – Varian.

As multiplicidades das bandas de RMN1H foram indicadas segundo as

convenções: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), ddd (triplo dupleto), m

(multipleto).

4.2 Estudo fitoquímico

4.2.1 Coleta e identificação do material botânico

Foram coletadas as folhas de Erythrina velutina Willd no município de

Simão Dias (10º 47’ 8,12832” S, 37º 46’ 6,2346” O), Estado de Sergipe, Brasil,

durante o mês de Janeiro de 2009. A identidade botânica da planta foi confirmada

pelo biólogo, Dr. Antônio Celso de Freitas, através da comparação com uma

exsicata que se encontrava depositada no Herbário da Universidade Federal de

Sergipe sob o registro ASE 4126.

4.2.2 Preparação do extrato metanólico de folhas secas de Erythrina

velutina (EMEv)

54

As folhas de Erythrina velutina foram completamente desidratadas em

estufa de ar circulante a uma temperatura de 40ºC e depois trituradas em moinho

até sua transformação em pó fino (5 Kg). O pó fino (4054 g) foi submetido à

extração, até exaustão do material vegetal, por processo de maceração (72

horas) sucessivas com metanol contendo 2% de hidróxido de amônio PA. Em

seguida, o extrato foi filtrado e concentrado com auxilio de um evaporador

rotativo, resultando em 567,19 g de extrato metanólico bruto (Esquema 1).

4.2.3 Fracionamento do extrato metanólico

O processo foi realizado em funil de separação usando solventes de

ordem de polaridade crescente. Suspendeu-se o extrato metanólico bruto (EMEv

65 g) em uma solução metanol/água (7:3). O extrato suspendido (solução

hidrometanólica) foi submetido a uma partição líquido/líquido, sob agitação

manual de forma exaustiva e sucessiva, utilizando hexano (4 L), acetato de etila

(3 L) e n–butanol (1,5 L), respectivamente. Após a evaporação dos solventes em

evaporador rotativo obteve-se a fase hexânica (FHEX) (20 g), fase acetato de etila

(FACET) (13,0 g) e fase n-butanólica (F-NBU) (7,35 g). O resíduo final foi

denominado fase hidrometanólica remanescente (FHMET) (Esquema 1).

55

Esquema 1: Obtenção e particionamento do extrato bruto das folhas de Erythrina

velutina (EMEv)

Fase hexânica (20 g)

Folhas secas e pulverizadas(4054 g)

MeOH + 2% de NH4OHConcentração a vácuo

Extrato metanólico bruto(567,19 g)

Acetato de etila

Solução hidrometanólica

Fase hidrometanólica I

EMEv (65 g)MeOH / H2O (7:3)

Hexano

Fase hidrometanólica II Fase acetato de etila (13 g)

n -Butanol

Fase hidrometanólica III Fase n -butanólica (7,35 g)

4.2.4 Características organolépticas e pH

Foram observadas as seguintes características organolépticas do

extrato metanólico bruto: cor e odor. O pH foi verificado através do uso de tiras

com indicadores coloridos (Macherey-Nagel).

56

4.2.5 Prospecção fitoquímica do extrato metanólico bruto da Erythrina

velutina Willd

A pesquisa dos metabólitos secundários foi realizada através de testes

de prospecção fitoquímica de acordo com metodologias adaptadas de MOREIRA

(1979), MATOS (1997), COSTA (2000) e MIGUEL & MIGUEL (2004),

empregando reações de grupos funcionais da molécula. Esta triagem tem como

objetivo sistematizar ou rastrear os principais grupos de constituintes químicos

que compõem o extrato vegetal, através de um exame qualitativo rápido, no qual

se utiliza reagentes de coloração ou precipitação.

Os constituintes do metabolismo secundário pesquisados foram:

alcalóides, quinonas, taninos, flavonóides, glicosídeos saponínicos,

leucoantocianidinas, esteróides e triterpenos.

O extrato metanólico bruto (1,0 g) foi suspenso em uma solução de

metanol/água (7:3) sob agitação mecânica, obtendo-se uma solução

hidrometanólica (150 mL). A partir dessa solução foram realizados os seguintes

testes fitoquímicos:

a) Identificação de alcalóides

Em quatro tubos de ensaio adicionou-se 1 mL da solução

hidrometanólica de Erythrina velutina, acrescentou-se 3 gotas de ácido clorídrico

a 1% em cada tubo. Agitou-se. Adicionou-se 2 gotas dos reativos de precipitação:

Dragendorff (iodo bismutato de potássio), Bertrand (ácido sílico túngstico),

Bouchardat (solução aquosa de iodo em iodeto de potássio) e Mayer (iodo -

mercurato de potássio), respectivamente. Os tubos foram agitados. Observa-se o

aparecimento de precipitado e/ou a mudança da coloração da solução.

57

b) Identificação de quinonas (Reação de Bornträger Direta)

Em tubo de ensaio foi colocado a solução hidrometanólica de Erythrina

velutina (1,0 mL), adicionando-se 5 mL de amônia diluída 10%. Após agitação,

verificou-se a coloração da solução.

c) Identificação de glicosídeos saponínicos

Definiu-se o índice de espuma em 10 tubos de ensaio contendo

diluições sucessivas do extrato metanólico em análise. O ensaio baseou-se, após

agitação vigorosa no sentido longitudinal durante 15 segundos, no aparecimento

de espuma persistente de pelo menos 1 cm de altura, após 15 minutos de

descanso.

d) Identificação de taninos

Da solução hidrometanólica, foram retiradas alíquotas de 5 mL para a

realização de cada uma das reações abaixo relacionadas, onde observou-se a

intensidade e tonalidade da coloração adquirida pela solução ou precipitado

quando foi adicionado o reativo.

Reação com sais de ferro: À solução hidrometanólica juntou-se cerca

de 5 mL de água e algumas gotas de solução de cloreto férrico a 1% em água,

observando-se a formação e coloração do precipitado.

Reação com acetato de chumbo: Foram adicionadas a solução

hidrometanólica 5 gotas de solução aquosa a 10% de acetato neutro de chumbo,

anotando-se a cor do precipitado formado.

Reação com alcalóides: À solução com taninos foi adicionada uma gota

de solução de ácido clorídrico a 10% e algumas gotas de solução de sulfato de

atropina a 0,1%. Verificou-se a formação ou não de precipitado.

58

Reação com dicromato de potássio: Em um tubo de ensaio, contendo a

solução hidrometanólica do extrato, gotejou-se 5 gotas de solução de dicromato

de potássio.

e) Identificação de flavonóides

Para a identificação de flavonóides procederam-se as seguintes

reações de identificação:

Reação de Shinoda: Adicionou-se a 2 mL da solução hidrometanólica

uma pequena alíquota de magnésio metálico e 1 mL de ácido clorídrico

concentrado. Observou-se a mudança de cor.

Reação com hidróxidos alcalinos: Adicionou-se 0,5 mL de solução de

hidróxido de sódio 1 M em alguns mililitros da solução hidrometanólica em tubo de

ensaio de Erythrina velutina.

Reação com sais de ferro: A solução hidrometanólica (5 mL) foram

acrescentadas algumas gotas de solução de cloreto férrico a 1% em água. Em

seguida, observou-se mudança na coloração (azul, verde, marrom ou vermelho).

f) Pesquisa de leucoantocianidinas

Levou-se 10 mL da solução hidrometanólica de Erythrina velutina a

secura em banho-maria e adicionou-se 5 mL de álcool etílico e cinco gotas de HCl

concentrado. Em seguida, o material foi aquecido à ebulição. A reação é positiva

se houver a reação de redução da leucoantocianidina (de coloração amarela) em

antocianidina em presença de ácido clorídrico, confirmada pela formação de

coloração vermelha.

g) Pesquisa de esteróides e triterpenos - reação de Liberman Bouchard

59

Levou-se a secura 30 mL da solução hidrometanólica de Erythrina

velutina em banho-maria e com auxílio de bastão de vidro dissolve-se 5 mL de

clorofórmio, filtrando em seguida. O extrato clorofórmico foi pipetado para três

tubos de ensaio nos volumes de 0,1 mL; 0,5 mL e 1,0 mL, e completou-se para 2

mL com clorofórmio. Em capela efetuou-se a reação de Liberman Bouchard

adicionando lentamente 1,0 mL de anidrido acético e 2,0 mL de ácido sulfúrico.

Observa-se a formação de coloração que passa por azul, verde, vermelho e

alaranjado que se modificam com o tempo em várias tonalidades (esteróides),

enquanto que a coloração é estável para os triterpenos.

4.2.6 Marcha para alcalóides

Uma parte do extrato metanólico bruto (452,18 g) foi dissolvido em

solução aquosa de ácido clorídrico (10%) e filtrado em funil de placa porosa. A

fase aquosa ácida foi submetida à extração líquido/líquido com clorofórmio

(CHCl3). A fase orgânica, fase clorofórmica ácida (FCA), foi separada da fase

aquosa. Em seguida, a fase aquosa ácida foi basificada com hidróxido de amônio

(NH4OH) a 10% em volume suficiente para atingir pH entre 8-9 e submetida

novamente à extração com CHCl3. A fase orgânica foi separada e evaporada,

resultando na fase clorofórmica básica (FCB) (1,0522g). A fase aquosa foi ainda

submetida a uma extração com n-butanol. A fase orgânica foi separada,

evaporada, resultando na fase n-butanólica básica (FNB) (33,58g). (Esquema 2)

60

Esquema 2: Marcha para alcalóides do extrato metanólico bruto de Erythrina

velutina Willd.

Extrato metanólico seco452,18 g

Resíduo Extrato aquoso ácido I

Fase clorofórmica ácida Extrato aquoso ácido II

Extrato aquoso básico

Fase n -butanólica básica33,580 g

Fase clorofórmica básica1,052 g

HCl a 10%Filtração a vácuo

Extração com CHCl3

NH4OH a 10%pH = 8 - 9

n -butanolCHCl3

I II

4.2.7 Isolamento dos constituintes químicos

4.2.7.1 Fase n-butanólica básica (FNB)

A fase n-butanólica básica (2 g) foi submetida à cromatografia em

coluna (CC), utilizando alumina básica como fase estacionária, clorofórmio e

metanol em misturas binárias, como fase móvel. A eluição da coluna foi realizada

empregando clorofórmio/metanol (95:5 – 1:1), a qual forneceu 30 frações de

aproximadamente 20 mL. Na proporção (9:1) coletou-se as frações 1 a 11. Na

proporção (8:2) coletou-se as frações 12 a 16. Na proporção 1:1 coletou-se as

frações 17 a 30.

61

Para o monitoramento das frações coletadas na coluna, foi utilizada a

CCDA, sendo utilizadas e reunidas de acordo com os seus fatores de retenção

(RF), após a visulização na luz ultravioleta e borrifamento de uma solução de

ácido sulfúrico a 5% em etanol.

Após revelação das placas, as amostras que possuíram mesmo RF,

foram reunidas. A amostra FNB 10-16 (23,5 mg) apresentou pureza satisfatória e

foi submetida à análise de RMN1H e 13C, (Esquema 3).

Esquema 3: Isolamento do ácido nicotínico da fase n-butanólica básica das

folhas de Erythrina velutina Willd

FNB 2-4 FNB 5-8 FNB10-1623,5 mg

FNB 17-19 FNB 21-30

Fase n -butanólica básica (2 g)

4.2.7.2 Fase acetato de etila e isolamento de seus constituintes químicos

(FACET)

A fase acetato de etila (1,400 g) foi submetida a cromatografia em

coluna (CC), utilizando-se sílica gel como fase estacionária e hexano, acetato de

etila e metanol, puros ou em misturas binárias, como fase móvel. Foram coletadas

120 frações. A eluição inicial da coluna foi realizada empregando hexano/acetato

de etila na proporção 8:2, a qual forneceu as frações F1 e F2. Em seguida,

empregou-se o sistema hexano/acetato de etila na proporção 1:1, o qual forneceu

as frações F3, F4, F5, F6, F7. Para a eluição hexano/acetato de etila 2:8,

obtiveram-se as frações F8 a F41. Aumentando a polaridade utilizando acetato de

62

etila puro obteve-se as frações F42 a 48. Empregando-se acetato de etila/metanol

95:5, 9:1 e 1:1 obteve-se as seguintes frações, respectivamente: F49 e F50; F51

a F75; F76 a F120. Para o monitoramento das frações coletadas na coluna, foi

utilizada a CCDA.

A visualização dos compostos foi feita por irradiação ultravioleta,

seguida por borrifamento de uma solução de ácido sulfúrico 5% em etanol. Após a

revelação das placas, as amostras que possuíram mesmo RF, foram reunidas.

Obteve-se sete frações reunidas: F1-3 (20 mg); F4-9 (11,6 mg); F10-16 (12 mg);

F17-18 (19,4 mg); F19-26 (23,4 mg); F42-60 (35,5 mg); F72-80 (8,5 mg)

(Esquema 4).

Após resultados de RMN1H a fração F17-18 (19,4 mg) foi submetida à

CCDP a fim de purificá-la. Utilizou-se hexano e acetato de etila (6:4) como

eluentes, obtendo-se duas subfrações: F17-18.1 e F17-18.2. A subfração F17-

18.1 (10 mg), apresentou-se como sólido marrom, que após análise por CCDA,

mostrou-se como única mancha e foi encaminhada para análise de RMN. A

subfração F17-18.2 (6,6 mg) apresentou-se como sólido marrom claro, que após

análise por CCDA mostrou-se como mancha esverdeada, que foi encaminhada

para análise de RMN (Esquema 4).

63

Esquema 4: Isolamento dos constituintes químicos da fase acetato de etila das

folhas de Erythrina velutina Willd.

F1-3 F4-9 F10-16 F42-60 F72-80

Fase Acetato de Etila(1,4 g)

F19-26F17-1819,4 mg

F17-18.1 F17-18.2

CCDP

4.3 Farmacologia

4.3.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss (machos e adultos), com 2-3

meses, pesando em média 25 g, provenientes do Biotério-UFS. Os animais foram

mantidos em caixas coletivas com alimentação e água ad libitum. No dia do

experimento os animais ficaram em jejum de seis horas. O presente protocolo (Nº

72/2009) de uso de animais está de acordo com os princípios éticos na

experimentação animal do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da

Universidade Federal de Sergipe, vide em anexo 1. Todos os experimentos foram

realizados conforme as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA).

64

4.3.2 Triagem psicofarmacológica preliminar

A triagem farmacológica comportamental representa uma avaliação

estimativa e preliminar das propriedades em nível do sistema nervoso central

(SNC) de uma substância em estudo, possibilitando o direcionamento da

pesquisa (ALMEIDA et al., 1999).

Grupos de 6 camundongos foram tratados (por via oral – v.o.) com a

fase n-butanólica básica (200 mg/kg), fase clorofórmica básica (200 mg/kg), fase

hexânica (200 mg/Kg), fase acetato de etila (200 mg/Kg), fase n-butanólica (200

mg/Kg), extrato metanólico bruto (400 mg/Kg) e comparados ao grupo controle

que recebeu tratamento do veículo utilizado para solubilizar o extrato e as fases

(uma mistura de solução salina/propilenoglicol a 0,1% - v/v) (v.o.). Após as

administrações todos os grupos de animais foram observados por um período de

4 horas quanto ao aparecimento ou mesmo alteração de uma série de

comportamentos que sugerem uma provável atividade no sistema nervoso

central, conforme protocolo experimental descrito por ALMEIDA et al. (1999)

(Anexo 2), onde foram comparados parâmetros como: ambulação, atividade geral,

irritabilidade, tremores, convulsão, agressividade, ptose palpebral, analgesia,

anestesia, piloereção, bocejo, contorções abdominais, sedação, ataxia, dentre

outros.

4.4 Procedimento experimental do ensaio antimicrobiano in vitro

A metodologia escolhida para o ensaio antimicrobiano in vitro foi o teste

de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, um método físico,

no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente

65

ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de

crescimento do microrganismo desafiado com a concentração da substância

ensaiada (PINTO, KANEKO, OHARA, 2003).

O ensaio antimicrobiano foi realizado em colaboração com a Dr. Celuta

S. Alviano e a Dr. Daniela S. Alviano, do Departamento de Microbiologia

Professor Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do

Rio de Janeiro, Brasil.

4.4.1 Microorganismos utilizados

Foram utilizadas culturas puras de fungos Candida albicans Serotype B

ATCC 36802 (ATCC-American Type Culture Collection), Cryptococcus

neoformans T1-444 Sorotipo A (Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP-

SP), Trichophyton rubrum T544 e Aspergillus niger (Hospital Clementino Fraga

Filho, UFRJ); e as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus MRSA

(BMB 9393) (Hospital Clementino Fraga Filho, UFRJ).

4.4.2 Preparo do inóculo contendo os microorganismos

Em um tubo de ensaio contendo cultivo recente (máximo 24 h)

preparou-se o inóculo a partir de uma suspensão de cada microorganismo em

caldo BHI (Brain Heart Infusion) estéril. A concentração do inóculo foi ajustada de

modo a se obter 2x105 células/mL. O inóculo foi distribuído em placas de Petri

previamente preparados com meio BHI (Brain Heart Infusion) sólido com auxílio

de um swab estéril. Para retirar o excesso de material, o swab foi pressionado

acima do nível do líquido contra a parede interna do tubo contendo o inóculo. As

66

superfícies de cada placa de Petri contendo o meio BHI foram inoculadas

esfregando-se o swab em toda superfície do ágar.

4.4.3 Preparação do extrato bruto e fases orgânicas da Erythrina velutina

para os ensaios antimicrobianos in vitro

O extrato metanólico bruto, as fases hexânica, acetato de etila, n-

butanólica, clorofórmica básica e n-butanólica básica foram diluídas em DMSO

(Dimetilsulfóxido) atingindo a concentração de 50 mg/mL. Para o ensaio, cada

fase sofreu uma diluição de 1:3 em água destilada estéril gerando uma

concentração final de 16,6 mg/mL. O controle positivo foi feito com anfotericina B

(1 mg/mL) para os fungos e vancomicina (1 mg/mL) para as bactérias. O controle

negativo foi DMSO diluído 1:3 em água destilada estéril.

4.4.4 Ensaio antimicrobiano in vitro

Foi utilizada a metodologia de difusão em ágar “Drop test” onde aplica-

se o extrato a ser testado diretamente no meio previamente inoculado com o

microorganismo, sem a utilização de discos estéreis (HILI; EVANS; VENESS,

1997). Os microrganismos (2 x 105 células/mL) foram espalhados em placas de

Petri contendo meio BHI (Brain Heart Infusion) sólido e, depois de 10 minutos, 10

µL da substância (extrato e as fases orgânicas ) foi colocado no centro de cada

placa. Todas as placas foram incubadas a 37°C, com tempo de incubação

variando de 01 a 07 dias, dependendo do microrganismo testado e, com leitura

dos resultados através da medição dos halos de inibição em centímetros. O

controle positivo foi feito com anfotericina B para os fungos e vancomicina para as

bactérias. A formação do halo de inibição no local onde foi aplicada a amostra

67

indica a sensibilidade do microrganismo ao mesmo, sendo passível de ocorrer

resultados atípicos principalmente em testes com microrganismos mutantes ou

resistentes. Neste caso, é observado um halo de inibição, mas com a presença de

algumas colônias na região; a isto se dá o nome de pseudo-halo (FALCÃO,

2003). Os testes foram feitos em triplicata.

68

V. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Fitoquímica

5.1.1 Prospecção fitoquímica

De acordo com as características organolépticas, o extrato metanólico

bruto de Erythrina velutina possui coloração verde escuro, odor semelhante e

característico levemente adocicado e pH 6,0. Os resultados da prospecção

fitoquímica realizada estão dispostos na tabela 2.

Tabela 2 – Resultados da prospecção fitoquímica com o extrato metanólico bruto

ENSAIOS COM EXTRATO METANÓLICO BRUTO

Alcalóides

Dragendorff +

Bertrand +

Bouchardat +

Mayer +

Quinonas

Reação Borntrager direta -

Taninos

Reação com sais de ferro +

Reação com acetato de chumbo +

Reação com alcalóides +

Reação com dicromato de potássio +

Flavonóides

Reação de Shinoda +

Reação com hidróxidos alcalinos +

Reação com sais de ferro +

Glicosídeos saponínicos -

Leucoantocianidinas -

Esteróides e triterpenos -

Legenda: Resultados = positivo (+), negativo (-).

69

Segundo FALKENBERG et al. (2007), a caracterização dos principais

grupos de substâncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realização

de reações químicas que resultem no desenvolvimento de coloração e/ou

precipitado característico.

As plantas produzem diferentes substâncias químicas e o fazem em

diferentes proporções, dependendo do habitat, do regime de chuvas, da

insolação, do solo, enfim, das características climato-edáficas. Entretanto,

algumas substâncias químicas são bastantes características para um

determinado vegetal, e desta forma podem servir como parâmetro para sua

caracterização e identificação.

Os testes fitoquímicos realizados visaram evidenciar as principais

classes de substâncias químicas presentes na espécie, por reações qualitativas, a

partir do extrato metanólico bruto de Erythrina velutina Willd com reagentes

específicos para cada classe química de produtos naturais.

Os dados das análises químicas realizadas com o extrato das folhas de

Erythrina velutina demonstraram a presença de alcalóides, taninos e flavonóides.

Para a detecção de alcalóides, verificou-se a presença de precipitados

bastante característicos, variando do marrom ao marrom-alaranjado.

HENRIQUES et al. (2007) afirma que a formação de precipitados pode ser

considerada apenas como provável presença de alcalóides, enquanto resultados

negativos com estes reagentes são indicativos da ausência de alcalóides.

Na identificação de taninos os ensaios com sais de ferro, acetato de

chumbo e dicromato de potássio mostraram-se positivos, pois houve formação de

precipitado e mudança de coloração. Ocorreu mudança na tonalidade esverdeada

da solução do extrato para verde escuro, verde amarelado, verde amarronzado,

70

respectivamente. Já a reação com alcalóides apresentou resultado positivo para

esta classe química, notando-se a presença de precipitado branco (COSTA,

2000).

No teste para identificação de flavonóides os ensaios com sais de ferro

mostraram-se positivos, com a formação de precipitado, o que sugere a presença

da referida classe química. O ensaio com hidróxidos alcalinos apresentou

coloração verde claro amarelado, sugerindo resultado positivo para a presença de

isoflavonas (COSTA, 2000). Já a reação de Shinoda apresentou a formação de

um precipitado indicando a presença da classe química, entretanto não houve

mudança de cor. Segundo ZUANAZZI (2007), essa reação baseia-se no fato de

que os derivados flavônicos de cor amarela reduzem-se adquirindo coloração

avermelhada ou, no caso dos antociânicos, azulada. Este ensaio produz reação

negativa para chalconas e isoflavonas. O autor afirma que isoflavonóides são,

salvo raríssimas exceções, de ocorrência exclusiva em Fabaceae.

5.1.2 Marcha para alcalóides

Sabe-se que o gênero Erythrina é muito rico em vários tipos de

alcalóides. Sendo assim, devido aos resultados da prospecção fitoquímica serem

positivos para a presença de alcalóides no extrato metanólico bruto da planta em

estudo, optou-se por realizar uma extração ácido-base, método normalmente

usado para a extração de alcalóides. A partir da marcha para alcalóides obteve-se

a fase clorofórmica básica e a fase n-butanólica básica.

5.1.2.1 Fase n-butanólica básica

Por meio da cromatografia em coluna e CCDA foi selecionada a

amostra FNB 10 - 16 que apresentou satisfatório grau de pureza. Foi realizada

71

análise espectroscópica desta amostra através de RMN de 1H e 13C em DMSO-d6.

O espectro de RMN1H (Figura 6 e 7) apresentou sinais característicos de

hidrogênio aromático (δH = 6-9 ppm), conforme mostra os dados da tabela 3 para

os hidrogênios ligados aos carbonos 2, 4, 5 e 6. O composto heterocíclico é

monosubstituído na posição, C-3 (δc = 129) (Figura 8).

Conforme dados publicados por BHAT SV, NAGASAMPAGI BA,

SIVAKUMAR M, (2005) há semelhança entre os sinais da amostra FNB 10 – 16 e

(AN 1a e AN 1b) (Tabela 3) com o ácido nicotínico (Figura 5), sugerindo por meio

dessa análise que a amostra citada seja o ácido nicotínico.

O ácido nicotínico, nos vegetais, é proveniente do ácido aspártico e do

gliceraldeído, sendo um precursor de muitos alcalóides. Dentre as rotas

bissintéticas para formação dos alcalóides piridínicos e piperidínicos encontra-se

a possibilidade do núcleo piperidínico ser biossíntetizado, partindo do glicerol e do

ácido aspártico, tendo o ácido nicotínico como intermediário (SANTOS, 2007).

N

OH

O

H

H

H

H1

35

4

Figura 5 - Estrutura química do ácido nicotínico (AN)

72

Tabela 3 - Dados de RMN1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) de FNB 10-16 obtidos em

DMSO-d6, comparados com dados da literatura (BHAT SV, NAGASAMPAGI BA,

SIVAKUMAR M, 2005) (AN-1A e AN-1B)(δ em ppm e J em Hz).

FNB 10-16 (δC) FNB 10-16 (δH) AN-1A (δC) AN-1B (δH)

C

2

3

4

5

6

CO2H

148

129

135

123

151

166

9,02 dd (0,9; 2,1 Hz)

8,29 ddd (1,8; 2,1; 7,7 Hz)

7,49 ddd (0,9; 4,8; 7,7 Hz)

8,70 dd (1,8; 4,8 Hz)

150,3

133,5

138,6

124,8

151,5

170,8

9,14 s

8,25 m

7,60 m

8,72 m

Legenda: AN-1A e 1B (dados da literatura); FNB 10-16 (dados da amostra).

Muitos estudos têm concentrado seus experimentos nas sementes, que

tipicamente contém 0,1% de alcalóides, embora os alcalóides tenham sido

previamente isolados de folhas, caule, haste, casca, raiz, vagem e flores das

espécies de Erythrina. O perfil alcaloidal das espécies Erythrina é característico,

contudo, tem sido observado uma variação quantitativa em diferentes partes da

espécie. Ao passo que algumas variações podem ser resultados da localização

da planta, da idade e até da época da coleta, pois existe evidência na variação

química dentro das espécies (GARCIA-MATEOS et al., 1998).

Apesar dos resultados obtidos com as folhas no presente estudo,

OZAWA et al. (2008) pesquisou as sementes da Erythrina velutina Willd e isolou

da fase clorofórmica básica o alcalóide indólico hipaforina. Em 2009, OZAWA e

seus colaboradores, também das sementes isolaram da fase n-butanólica o N-

73

óxido de erisodina; da fase clorofórmica básica eritralina, 8-oxo-eritralina,

erisotrina, erisodina, erisovina, glicoerisodina e hipaforina.

Figura 6 - Espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6/300 MHz)

74

Figura 7 - Expansão do espectro de RMN1H de FNB 10-16 (DMSO-d6 / 300 MHz)

75

Figura 8 – Espectro de RMN13C de FNB 10-16 (DMSO-d6/75 MHz)

Apesar de não ter sido isolado alcalóides típicos do gênero Erythrina na

espécie velutina, o espectro expandido de RMN1H da fase n-butanólica básica

(NB-E) desta planta apresentou sinais com valores característicos, em ppm, desta

76

classe química. A indicação da presença destes alcalóides na fase baseia-se na

comparação dos sinais de RMN1H na região de hidrogênios ligados a carbono sp2

do alcalóide (+)-coculidina (Figura 9), isolado de Cocculus laurifolia (AMER,

SHAMMA, FREYER, 1991), com os sinais presentes no espectro expandido de

RMN1H da fase n-butanólica básica de Erythrina velutina Willd (Figura 10). A

intensidade destes sinais demonstra que os alcalóides estão presentes em

pequena proporção no extrato, o que justifica as diversas tentativas de seu

isolamento sem êxito. A baixa produção destes alcalóides pela espécie pode

envolver diferentes fatores, tais como época de coleta, tipo de solo e parte da

planta utilizada para armazenamento dos alcalóides. Esta última possibilidade é a

mais provável, considerando que já foram isolados alcalóides das sementes e

cascas desta espécie (OZAWA et al., 2008, 2009; CABRAL, 2009; VIRTUOSO,

2005).

N

MeO

H H

H

MeO

6,90 d

6,65 dd

6,93 d

5,41 m3,22 s

Figura 9: Estrutura química e sinais de RMN1H do alcalóide (+)-coculidina

77

Figura 10 – Expansão do espectro de RMN1H de NB-E (DMSO-d6/75 MHz)

78

5.1.3 Fase acetato de etila

Na literatura há diversos estudos fitoquímicos com o gênero Erythrina

realizados com a fase acetato de etila, da qual foram isolados flavonóides e

terpenos (DA-CUNHA et al.,1996; WANJALA & MAJINDA, 2000; OZAWA et al.,

2009). De forma semelhante, a fase acetato de etila foi submetida à cromatografia

em coluna utilizando sílica gel como adsorvente e as frações obtidas foram

monitoradas através de CCDA e CCDP. Selecionou-se uma fração para análise

de RMN1H. As demais tratavam-se de graxa ou mistura complexas.

O espectro de RMN1H da fração F17-18 apresentou dupletos na região

de hidrogênios aromáticos (6-9 ppm) e alguns simpletos na região de grupos

metoxílicos ligados a anel aromático (Figura 11). No espectro de RMN1H da

fração F17-18, observou-se a presença de picos referente à graxa, na faixa de

campo alto, dificultando a visualização dos demais picos do metabólito a ser

identificado (Figura 11). Entretanto, os sinais na região 3,5-4,0 ppm e 6,2-8,0 ppm

são sugestivos de substância aromática metoxilada (Figura 11), possivelmente da

classe química dos flavonóides, comumente encontrada no gênero Erythrina e

demonstrada sua presença no extrato metanólico das folhas de Erythrina velutina

através da prospecção fitoquímica realizada no presente estudo. Para uma maior

purificação desta substância realizou-se a CCDP objetivando uma melhor

purificação do composto investigado. Após o processo cromatográfico obteve-se

duas subfrações a F17-18.1 e a F17-18.2, as quais foram analisadas empregando

RMN1H e 13C. Contudo, não foi possível a identificação do metabólito secundário

investigado devido à pequena quantidade de amostra isolada e ao seu baixo grau

de pureza.

79

Figura 11 – Espectro de RMN1H de F17-18 da fase acetato de etila (CDCl3 /200

MHz)

5.1.4 Observações gerais

A fase hexânica, n-butanólica e a fase clorofórmica básica foram

exaustivamente cromatografadas em coluna de sílica gel e as frações obtidas não

foram purificadas por se apresentarem como misturas complexas.

80

Como descrito, o estudo das folhas de Erythrina velutina não levou ao

isolamento de metabólitos secundários e este fato pode ser atribuído à época da

coleta, ineficiência do método utilizado, pequena quantidade destes compostos

presentes nas folhas, bem como local de armazenamento destes alcalóides nesta

espécie, corroborando com o trabalho de SARRAGIOTO (1981) realizado com as

folhas e flores de Erythrina mulungu. O estudo supra citado objetivava o

isolamento de alcalóides, entretanto, essa classe de compostos não foi

encontrada nas folhas, o que motivou a autora a optar por outra parte da planta,

as flores. Com o extrato hexânico das folhas isolou-se um composto do tipo

poliisoprenóide, Fitol. Dos extratos clorofórmico e metanólico das flores isolaram-

se os alcalóides erisotrina, eritrartina, hipaforina, N-óxido de erisotrina e N-óxido

de eritrartina. Portanto, estes resultados mostram que em algumas espécies de

Erythrina, as folhas são pouco promissoras do ponto de vista fitoquímico, apesar

da presença das propriedades terapêuticas.

5.2 Farmacologia

5.2.1 Triagem farmacológica comportamental

A Erythrina velutina é uma planta largamente utilizada pela população

nordestina, principalmente como calmante. A partir de dados da literatura

verificou-se que o extrato alcoólico das folhas de Erythrina velutina, coletadas no

período de junho, apresentou resultados semelhantes ao perfil dos efeitos dos

benzodiazepínicos quando submetidos aos modelos animais que avaliam a

ansiedade, memória e epilepsia (TEXEIRA-SILVA et al., 2008). Considerando a

época de coleta (janeiro/2009) e a localização geográfica diferente da planta

81

avaliada em relação ao artigo citado, optamos por realizar uma triagem

farmacológica comportamental. Primeiramente, foi feita a triagem das fases

orgânicas e depois do extrato metanólico bruto, pois estudos mostram que

variáveis como época de coleta e condições ambientais interferem nos processos

bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos dos vegetais. A dose de 200

mg/Kg para as fases orgânicas e de 400 mg/Kg para o extrato metanólico bruto foi

baseada no estudo acima citado. A via de administração escolhida foi a via oral

devido ao uso popular.

Na triagem farmacológica foi realizado o monitoramento de

comportamentos, que na maioria das vezes são exibidos normalmente pelos

animais, de forma que qualquer alteração no padrão normal de comportamento

pode ser sugestiva de atividade no sistema nervoso central (ALMEIDA et al.,

1999).

Os animais que foram tratados com a fase n-butanólica básica, pela via

oral, apresentaram após uma hora de administração as seguintes alterações

comportamentais: leve diminuição da ambulação, leve aumento da auto-limpeza e

o levantar levemente aumentado. Também foi observada diminuição da

defecação dos animais.

Os animais tratados com a fase clorofórmica básica apresentaram após

trinta minutos de administração as seguintes alterações comportamentais:

discreta analgesia e resposta ao toque diminuído. Após uma hora: ptose palpebral

discreta, leve sedação. Após duas horas: leve sedação. Após três horas: leve

sedação, resposta ao toque diminuído. Após quatro horas: leve sedação. Durante

a 1ª, 2ª e 3ª hora a defecação foi diminuída.

82

Os animais tratados com a fase hexânica apresentaram após trinta

minutos de administração as seguintes alterações comportamentais: discreta

ambulação e o levantar e escalar levemente aumentado. Durante a 1ª, 2ª e 3ª hora

nada foi observado. Após quatro horas: o levantar levemente aumentado.

Os animais tratados com a fase acetato de etila apresentaram após

trinta minutos de administração as seguintes alterações comportamentais: leve

analgesia, discreta alteração da resposta ao toque diminuído e o levantar

levemente aumentado. Durante a 1ª, 2ª e 3ª hora: leve sedação, analgesia leve,

discreta alteração da resposta ao toque diminuído e a defecação foi diminuída.

Após quatro horas: analgesia leve, discreta alteração da resposta ao toque

diminuído e defecação diminuída.

Os animais tratados com a fase n-butanólica apresentaram após trinta

minutos de administração as seguintes alterações comportamentais: discreta

ambulação, o levantar e o escalar levemente aumentado. Durante a 1ª, 2ª e 4ª

hora nada foi observado. Após três horas: discreta ptose palpebral.

Como os resultados com as fases orgânicas não foram contundentes

optamos por avaliar também o extrato metanólico bruto. Os animais tratados com

400 mg/Kg do extrato metanólico bruto apresentaram após trinta minutos de

administração a seguinte alteração comportamental: discreta catatonia. Durante a

1ª e 2ª hora: ptose palpebral discreta, leve sedação, defecação e micção

diminuída. Após 3ª e 4ª horas: defecação e micção diminuída.

Após os experimentos, todos os camundongos ficaram em observação

por 48 h e durante esse período, não houve óbitos para nenhuma das fases

orgânicas e extrato bruto testado.

83

Comparando-se as cinco fases orgânicas avaliadas, observou-se que

as mesmas apresentam uma discreta atividade depressora do sistema nervoso

central, a qual pode estar relacionada com o efeito calmante relatado pela

população. Entretanto, foi constatado efeito depressor mais acentuado ao utilizar

a fase acetato de etila. Esta fase promoveu maior número de alterações

comportamentais nos animais, quando comparado com as demais fases

orgânicas e extrato metanólico bruto. Esta diferença ocorre, possivelmente,

devido à presença de metabólitos secundários bioativos em maior quantidade na

fase acetato de etila. Enquanto isso, no extrato bruto, além dos metabólitos

secundários, estão presentes substâncias interferentes que podem agir de forma

antagônica ou sinérgica em relação aos efeitos observados, por tratar-se de uma

mistura complexa (MAUDERLY, 1993).

Sendo assim, as alterações comportamentais apresentadas em função

do efeito discreto exercido pelas referidas fases orgânicas e o extrato metanólico

bruto no sistema nervoso central podem estar relacionadas com o efeito calmante

relatado pela população, porém, não ocorreram em conformidade com os

resultados prévios relatados na literatura (DANTAS et al., 2004; MARCHIORO et

al., 2005), em particular com o estudo de TEXEIRA-SILVA et al., (2008). Diante

do exposto ressalta-se que vários fatores podem ter influenciado a quantidade de

metabólitos secundários bioativos presentes no extrato avaliado, tais como: a

época em que a planta foi coletada, visto que a quantidade e, às vezes, até

mesmo a natureza dos constituintes ativos não é constante durante o ano; a

variação da composição de metabólitos pode variar durante o ciclo dia/noite; a

idade e o desenvolvimento da planta, bem como dos diferentes órgãos vegetais

também são de considerável importância e podem influenciar não só a quantidade

84

total de metabólitos produzidos, mas também as proporções relativas dos

componentes da mistura; a faixa em que ocorrem as variações anuais, mensais e

diárias na temperatura é um dos fatores que exerce maior influência em seu

desenvolvimento, afetando, portanto, a produção de metabólitos secundários;

fatores fisiológicos críticos, tais como fotossíntese, comportamento estomatal,

mobilização de reservas, expansão foliar e crescimento, podem ser alterados por

estresse hídrico e, conseqüentemente, levar a alterações no metabolismo

secundário; o efeito da seca na concentração de metabólitos e, às vezes,

dependente do grau de estresse e do período em que ocorre, sendo que efeitos a

curto prazo parecem levar a uma produção aumentada, enquanto a longo prazo é

observado um efeito oposto. Os nutrientes afetam não somente o metabolismo

primário, mas também influenciam a produção de diferentes metabólitos

secundários; fatores mecânicos aos quais as plantas estão susceptíveis, tais

como ferimentos, ou mesmo meros estímulos, causados por chuva, vento, areia,

invasão por patógenos e pastagem de herbívoros, também podem influenciar a

expressão do metabolismo secundário. Sabendo-se dos inúmeros fatores que

podem levar as variações no conteúdo de metabólitos secundários, fica clara a

necessidade de estudos visando detectar as condições e épocas para a coleta

que conduza a uma amostra vegetal com concentrações desejáveis de princípios

ativos (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

Neste sentido, os resultados da triagem farmacológica preliminar com o

extrato metanólico bruto e as fases orgânicas não demonstraram atividade

satisfatória a nível de sistema nervoso central, o que nos levou a não dar

continuidade aos estudos psicofarmacológicos empregando modelos animais

para avaliação de atividades farmacológicas comportamentais específicas.

85

5.3 Atividade antimicrobiana

Espécies do gênero Erythrina vêm sendo estudadas e algumas

atividades são atribuídas às mesmas como: antimicrobiana (CHACHA; BOJASE-

MOLETA; MAJINDA, 2005; YENESEW ET AL., 2005), anti-HIV (MCKEE et al.,

1997), antibacterial (TANAKA et al., 2002, 2004; SATO et al., 2002) e

antiplasmodial (ANDAYI et al., 2006).

Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade

antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Em um “screening” extensivo

de plantas utilizadas na medicina tradicional, destaca-se os extratos vegetais com

ação antimicrobiana, devido a sua importância no desenvolvimento e produção de

produtos farmacêuticos e cosméticos. Dentre os métodos mais conhecidos

incluem método de difusão em ágar, que foi escolhido para esse trabalho, pela

simplicidade de execução e baixo custo (OSTROSKY et al, 2008).

Os microrganismos a serem utilizados foram selecionados para esse

ensaio devido à capacidade de causarem diversas patologias que podem atingir

gravidade considerável, alguns representam riscos de infecção nosocomial de

difícil controle e, as culturas purificadas são acessíveis.

Os resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana pelo método de

difusão em ágar mostraram que o extrato metanólico bruto e a fase hexânica

apresentaram uma inibição fraca ou parcial, sem halo de inibição definido, para o

Trichophyton rubrum T544. Entretanto, para as demais fases orgânicas de

Erythrina velutina não houve inibição do crescimento de nenhuma das cepas de

bactérias e fungos testadas (Tabela 4).

86

Neste trabalho, os controles positivos utilizados foram anfotericina B e

vancomicina. Os resultados obtidos com o extrato bruto e as fases orgânicas não

foram comparados com os mesmos controles, pois não podemos comparar

substâncias puras com extrato bruto e fases orgânicas que são misturas

complexas (MAUDERLY, 1993).

Tabela 4 – Resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana

Extrato e fases orgânicas (Drop teste com spots de 10 µl)

Trichophyton rubrum

Aspergillus niger

Cryptococcus neoformans

Candida albicans

Escherichia coli

Staphylococcus aureus MRSA

Controle negativo (DMSO)

- - - - - -

Extrato metanólico bruto +/- - - - - - Fase hexânica +/- - - - - - Fase acetato de etila - - - - - - Fase n-butanólica - - - - - - Fase clorofórmica básica - - - - - - Fase n-butanólica básica - - - - - - Anfotericina B 2,0±0,1 1,8±0,2 2,0±0,1 2,0±0,1 - - Vancomicina - - - - 1,0±0,1 1,8±0,1

Legenda: (-) Não houve inibição; (+/-) inibição fraca ou parcial sem halo de inibição definido; média ± desvio padrão.

Estudos similares foram realizados com outras espécies de Erythrina a

partir de substâncias puras isoladas ou extratos, onde comprovou-se o potencial

antifúngico deste gênero. Pterocarpanos isolados da Erythrina abyssinica e os

extratos metanólicos e diclorometano da Erythrina vogelli demostraram atividade

contra fungos e leveduras (NAKANISHI, 1982; ATINDEHOU et al., 2002). Da

Erythrina burttii foram isolados flavonóides que mostraram atividade antifúngica

(YENESEW et al., 2005). Os isoflavonóides isolados das raízes de Erythrina

poeppigiana possuem atividade antilevedura contra cepa de Candida albicans

(SATO et al., 2003; TANAKA et al., 2004). Estudos biológicos preliminares

revelaram que o N-óxido de erisotrina e N-óxido de eritrartina isolados das flores

da E. mulungu atuam como fungicida (SARRAGIOTTO, 1981).

87

Estudos realizados com a Erythrina latíssima mostraram resultados

diferentes quando avaliados para a atividade antimicrobiana. Segundo MAJINDA

et al. (2001) os alcalóides isolados da semente, madeira da raiz, casca do caule e

vagem da E. latissima não demonstraram atividade antibacteriana contra os

microrganismos testados (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida mycoderma e Sacharomyces

cerevisiae). Entretanto, a partir do tronco de madeira E. latissima, duas

isoflavonas e uma flavanona foram isoladas, além de 10 conhecidos flavonóides.

Estes compostos mostraram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida mycoderma (CHACHA;

BOJASE-MOLETA; MAJINDA, 2005). A diferença entre esses dois trabalhos pode

ser justificada porque quando se enumera as atividades de alguns flavonóides,

comprova-se que os mesmos podem ser responsáveis por ações antivirais,

antimicrobianas, antitumoral, anti-hemorrágicos, hormonais, antinflamatórios, e

antioxidantes (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007), enquanto que para os alcalóides

eritrinícos estudos mostram um maior número de atividades farmacológicas ao

nível de sistema nervoso central (MAJINDA et al., 2001).

VIRTUOSO et al., (2005), em avaliação preliminar a partir da casca de

Erythrina velutina, demonstrou que ocorreu atividade antibacteriana dos produtos

vegetais sobre Streptococcus pyogenes e Staplylococcus aureus. Nenhuma

atividade foi observada sobre outras bactérias testadas por difusão em ágar e foi

registrada atividade moderada contra todos os microrganismos no teste de

concentração inibitória mínima para o extrato etanólico bruto e fração hexano.

Segundo LENETTE et al. (1987) considera-se que o tamanho da zona

de inibição de crescimento no teste de difusão é bastante influenciada pela

88

velocidade de difusão das substâncias no ágar, sendo assim, é possível que a

baixa polaridade dos compostos da fase hexânica diminua a velocidade de

difusão destes no ágar, gerando um halo de inibição proporcionalmente menor em

relação aos antibióticos controle que são polares e ao extrato bruto. Os resultados

obtidos, apesar de modestos, comprovam o possível potencial antifúngico desse

gênero frente à cepa de Trichophyton rubrum T544 demonstrando dessa forma,

que extratos de plantas apresentam perspectivas para a obtenção de antifúngicos

naturais.

As dermatofitoses são infecções superficiais capazes de produzir

lesões em tecidos queratinizados, como pele, pelo e unhas, causadas por fungos

queratinofílicos denominados dermatófitos, que compreendem os gêneros

Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton, semelhantes em sua

morfofisiologia, imunologia e taxonomia. As dermatofitoses apresentam-se como

as infecções fúngicas mais comuns em países tropicais, constituindo um

problema de saúde pública e refletindo baixo nível de educação sanitária. A

distribuição e freqüência das dermatofitoses e seus agentes etiológicos variam

segundo a região geográfica e o nível sócio econômico da população

(BONCOMPTE; ALGUERÓ; VIDELA, 1997). Trichophyton rubrum é o fungo mais

comum observado em todo o mundo e especialmente é o dermatófito dominante

na onicomicose com uma prevalência de cerca de 80% (CHAN, 2002).

Logo, o possível potencial antifúngico exibido pelo extrato metanólico

bruto e fase hexânica de Erythrina velutina frente ao Trichophyton rubrum deve

ser investigado com mais detalhes, a fim de contribuir para a descoberta e

desenvolvimento de novos agentes antifúngicos naturais, os quais, se viáveis,

89

representarão alternativas terapêuticas aplicáveis no tratamento de várias

micoses.

90

VI. CONCLUSÃO

Conforme os resultados obtidos nesse trabalho, conclui-se que:

- O estudo fitoquímico da espécie Erythrina velutina, revelou-a como

bioprodutora de diferentes metabólitos, tais como alcalóides, flavonóides e

taninos;

- Através de métodos cromatográficos usuais e técnicas

espectroscópicas RMN de 1H e 13C foi possível isolar e identificar um marcador

químico para a espécie avaliada, o qual trata-se do ácido nicotínico.

- Da fase acetato de etila foi isolada uma substância, entretanto, não

foi determinada a sua estrutura química devido a pequena quantidade isolada do

metabólito, bem como a presença de impurezas, o que dificultou as análises

espectrais. Contudo, os sinais presentes no espectro de RNM1H são sugestivos

de substância aromática metoxilada, possivelmente da classe química dos

flavonóides, comumente presente no gênero Erythrina.

- Na realização da triagem comportamental, foi observado que

administrações da fase clorofórmica e n-butanólica básica, fase hexânica, fase

acetato de etila, fase n-butanólica e extrato metanólico bruto da planta Erythrina

velutina Willd promoveram alterações comportamentais discretas ao nível de

sistema nervoso central, do tipo depressor, que podem estar relacionadas com o

efeito calmante relatado pela população.

- O extrato metanólico bruto e a fase hexânica mostraram uma

inibição fraca ou parcial sem halo de inibição definido para o Trichophyton rubrum

T544.

91

- Para as demais fases orgânicas de Erythrina velutina não houve

inibição do crescimento de nenhuma das cepas de bactérias e fungos testadas.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nas folhas há uma menor concentração de compostos químicos

quando comparado com outras partes da planta já estudadas por vários grupos

de pesquisa. Sendo assim, a importância deste trabalho advém da sua

contribuição no estudo de uma espécie etnofarmacologicamente bastante

utilizada, visando descrever sua constituição química e, a partir desses dados

comprovarem sua utilização pela população.

O isolamento dos demais constituintes químicos e possíveis

marcadores químicos presentes nas folhas de Erythrina velutina é um desafio

para os trabalhos futuros, uma vez que diversos métodos cromatográficos foram

empregados e demonstraram a dificuldade da separação em função da

proximidade dos seus coeficientes de retenção em cromatografia em camada

delgada e em cromatografia de coluna.

Durante a execução desse trabalho alguns conhecimentos foram

adquiridos, mas, cada um atrelado a novas perguntas que remetem à pesquisa

mais aprofundada de alguns pontos, tais como a sazonalidade da época de

coleta, a parte da planta a ser estuda, a idade da planta, o horário da coleta, o

método de extração, localização geográfica da planta, entre outros. O rigor

dessas informações e observações é necessário considerando-se a importância

da rigorosa legislação aplicada ao registro de fitoterápicos e a possibilidade de

ocorrência de fraudes. Por isso, esse estudo deve servir como estímulo e não

entrave à busca de informações, visando encontrar marcadores químicos da

92

espécie e proporcionar à indústria farmacêutica a garantia e segurança na

aquisição da matéria-prima.

Como sabemos, torna-se urgente a necessidade do conhecimento e

padronização rigorosa das condições experimentais para avaliação

antimicrobiana (in vitro) de plantas. Vários fatores afetam a suscetibilidade e a

execução dos métodos de difusão e de diluição, portanto, há alguns aspectos

importantes a serem considerados, tais como os meios de cultura, pH do meio,

disponibilidade de oxigênio, a suscetibilidade dos agentes antimicrobianos e

condições de incubação.

O uso de extratos e substâncias provenientes da planta Erythrina

velutina é de reconhecida aplicabilidade em muitas áreas da farmacologia

voltadas a saúde. Apesar do uso freqüente da casca e das folhas na forma de

chás, principalmente pela população nordestina, para várias finalidades, ainda

não existem informações de caráter científico suficiente para que este ou seus

constituintes sejam aplicados como fitoterápico, fato lastimável quando se

considera as potencialidades já descritas na literatura, o que traria diversos

benefícios a população.

93

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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103

VIII. ANEXOS

ANEXO 1 – Declaração do CEPA (Conselho de Ética em Pesquisa com Animais)

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ANEXO 2 - Triagem Farmacológica Comportamental (ALMEIDA et al., 1999) PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_________ DATA:____/_____/_____ VIA DE ADMINISTRAÇÃO:____________ ANIMAIS:______________________________ RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________________ GRUPOS:________________________

ATIVIDADE FARMACOLÓGICA

Quantificação dos efeitos (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso

até 30` 1h 2h 3h 4h 1 – SNC a - Estimulante Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção Movimento intenso das vibrissas Outras_____________________ b - Depressora Hipnose Ptose Sedação Anestesia Ataxia Reflexo do endireitamento Catatonia Analgesia Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular c - Outros comportamentos Ambulação Bocejo excessivo Groming Rearing Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais Abdução das patas do trem posterior Pedalar Estereotipia 2 - SN AUTÔNOMO Diarréia Constirpação Defecação aumentada Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar 3 – MORTE

obs.:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

erythrina velutina willd: avaliaÇÃo fitoquÍmica ... · extrato metanólico bruto foi feita uma...

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