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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ROBERTA NUNES
AVALIAÇÃO DO EXTRATO METANÓLICO DAS
FOLHAS DE Garcinia humilis Vahl (CLUSIACEAE) NOS
EFEITOS AGUDOS DA INFLAMAÇÃO
Itajaí (SC)
2019
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ROBERTA NUNES
AVALIAÇÃO DO EXTRATO METANÓLICO DAS
FOLHAS DE Garcinia humilis Vahl (CLUSIACEAE) NOS
EFEITOS AGUDOS DA INFLAMAÇÃO
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Profa. Dra. Nara Lins Meira
Quintão
Co-orientador: Prof. Dr. José Roberto
Santin
Itajaí (SC)
Setembro de 2019
Ficha Catalográfica
Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi CRB 14/493.
N922a Nunes, Roberta, 1995-
Avaliação do extrato metanólico das folhas de garcinia humilis vahl
(clusiaceae) nos efeitos agudos da inflamação [Manuscrito] / Roberta Nunes.
Itajaí, SC. 2019.
112 f. ; il. ; graf. ; fig.
Bibliografias f. 91-109
(Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
“Orientador: Profª. Drª. Nara Lins Meira Quintão.”
“Co-orientador: Prof. Dr. José Roberto Santin.
1. Produtos Naturais. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacologia.
4. Substâncias sintéticas bioativas. I. Universidade do Vale do Itajaí.
II. Título.
CDU: 615.32
Dedico essa conquista a minha família,
que nunca mediu esforços para que meus
sonhos se tornassem realidade.
Obrigada por sempre estarem presentes!
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida, onde permitiu que tudo isso acontecesse.
Deu-me força em todos os momentos difíceis e sabedoria nas horas incertas.
Aos meus pais, Zildo e Zulmira, pelo apoio incondicional em todos os
momentos e escolhas. Agradeço todo o esforço para me proporcionarem uma
educação de qualidade, deixando muitas vezes de lado seus próprios sonhos
para realizar os meus.
Ao meu irmão Ricardo, por sempre estar ao meu lado e por todo
companheirismo durante essa jornada.
Ao Endriw, meu companheiro de todas as horas. Obrigada por toda
ajuda, paciência e por sempre acreditar no meu potencial. Você foi
fundamental para a concretização deste sonho!
A minha orientadora Nara, por me acompanhar nessa trajetória como
professora e amiga. Obrigada por todo conhecimento, confiança, carinho e
respeito. Quem me dera um dia ser metade da profissional excelente que você
é!
Ao meu co-orientador José Roberto, por todo conhecimento e paciência.
Obrigado pela oportunidade de trabalhar e aprender contigo.
Aos membros da banca interna, Prof. Dra. Márcia M. de Souza, Prof.
Dr. Luiz Carlos Klein por todas as correções e sugestões durante a execução
deste trabalho.
Aos meus amigos e companheiros de laboratório, Milena, Renata,
Fernanda, Fellippe e Larissa, muito obrigada! Os experimentos ficaram mais
descontraídos na companhia de vocês!
As minhas companheiras de disciplinas e seminários, Aline, Izabel,
Carla e Talita.
Ao grupo de pesquisa FARMATOX, por todo conhecimento e também
pelos momentos de descontração que passamos juntos.
Ao Prof. Dr. Rivaldo Niero por toda realização da parte fitoquimica e
aos demais professores do programa por todo conhecimento transmitido.
Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Pós Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Prof. Dr. Clóvis Rodrigues, Juliano dos Santos,
Helenise Heyse Moreira e Evandro Gomes.
A minha professora da graduação, Adrielli Tenfen, por me incentivar e
ajudar nesta caminhada desde o início, e pela disposição em sempre me ajudar
na parte química do trabalho.
À CAPES, CNPq e UNIVALI pelo apoio financeiro.
A todos que participaram e acrescentaram para a obtenção desse título,
muito obrigada!
“Suba o primeiro degrau com fé.
Não é necessário que você veja toda a escada.
Apenas dê o primeiro passo.”
(Martin Luther King)
AVALIAÇÃO DO EXTRATO METANÓLICO DAS
FOLHAS DE Garcinia humilis Vahl (CLUSIACEAE) NOS
EFEITOS AGUDOS DA INFLAMAÇÃO
Roberta Nunes
Setembro/2019
Orientadora: Profa. Nara Lins Meira Quintão, Dra.
Co-orientador: Prof. José Roberto Santin, Dr.
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.
Número de páginas: 102
Garcinia humilis, conhecida como “achachairu” é utilizada por suas
propriedades digestivas, laxantes e anti-inflamatórias. Neste contexto, o
presente trabalho investigou os efeitos in vivo e in vitro do extrato metanólico
das folhas de G. humilis sobre a migração de neutrófilos para o tecido
inflamado, na secreção de mediadores químicos derivados de células e na
atividade antinociceptiva. A atividade anti-inflamatória foi investigada por
meio do modelo de bolsa de ar, utilizando como agente flogístico carragenina
administrada no tecido subcutâneo de camundongos Swiss machos tratados
com o extrato de G. humilis (0,1, 1,0, 10 ou 30 mg/kg v.o.). A migração de
leucócitos, a secreção de mediadores químicos (TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1),
e exsudação de proteínas, foram quantificados no exsudato inflamatório. In
vitro, a expressão das moléculas de adesão (CD62L e CD18), mediadores
químicos e quimiotaxia frente ao fMLP foi avaliada em neutrófilos recrutados
de camundongos e em cultura celular de macrófagos RAW 264.7
previamente tratada com extrato (1, 10 ou 100 µg/mL) e estimulada com LPS
(5 µg/mL). A atividade anti-inflamatória dos compostos isolados friedelina,
canofilol, amentoflavona e 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifolina
xantona (10 μM) foi avaliada em macrófagos RAW 264.7 por meio da
mensuração de óxido nítrico (NO) e TNF. O tratamento oral com o extrato
de G. humilis na dose de 30 mg/kg promoveu redução na migração de
neutrófilos, bem como diminuição de TNF, IL-1β e CXCL1, sem alterar a
exsudação de proteínas e níveis de IL-6. In vitro, o extrato de G. humilis
reduziu os níveis de IL-1β e IL-6, porém sem alterar TNF e CXCL1 em
neutrófilos estimulados com LPS. Ainda, o extrato diminuiu a expressão de
L-selectina e β2-intergrina na superfície de neutrófilos e reduziu a
quimiotaxia frente ao fMLP. Os compostos friedelina, amentoflavona e 3-
desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona diminuíram a secreção de
NO e TNF em macrófagos estimulados com LPS. Ressalta-se ainda a
ausência de citotoxicidade para fibroblastos, neutrófilos e macrófagos. Além
do potencial anti-inflamatório o extrato de G. humilis na dose de 30 mg/kg,
via oral, também foi capaz de reduzir a hipersensibilidade mecânica induzida
por carragenina (300 μg/pata). Em conjunto, os resultados obtidos
demonstram que o extrato das folhas de G. humilis apresenta importantes
ações anti-inflamatórias in vivo e in vitro, além de atividade antinociceptiva,
bloqueando as vias de secreção e migração de neutrófilos, sugerindo sua
aplicação terapêutica em reações inflamatórias agudas.
Palavras-chave: Dor. Neutrófilo. Macrófago. Citocina. Achachairu
EVALUATION OF THE METANOL EXTRACT FROM
Garcinia humilis Vahl (CLUSIACEAE) LEAVES ON
ACUTE EFFECTS OF INFLAMMATION
Roberta Nunes
Setembro/2019
Orientador: Nara Lins Meira Quintão, Dr.
Co-orientador: José Roberto Santin, Dr.
Area of concentration: Natural products and synthetic bioactive substances.
Number of pages: 102
Garcinia humilis, known as “achachairu”, is used in popular medicine for its
digestive, laxative and anti-inflammatory properties. We investigated the in
vivo and in vitro effects of the methanol extract of G. humilis leaves on
neutrophil migration to inflamed tissue, the secretion of chemical mediators
derived from cells, and antinociceptive activity. Anti-inflammatory activity
was investigated using carrageenan-induced inflammation in the
subcutaneous tissue of male Swiss mice treated with the extract of G. humilis
(0.1, 1.0, 10 or 30 mg/kg p.o.). Leucocyte migration, secretion of chemical
mediators (TNF, IL-1β, IL-6 and CXCL1) and protein exudation in the
inflammatory exudate were quantified. In vitro, the expression of adhesion
molecules (CD62L and CD18), chemical mediators and chemotactic power
of neutrophils against fMLP were evaluated with neutrophils recruited from
mice and RAW 264.7 macrophage cell culture previously treated with the
extract (1, 10 or 100 µg/mL) and activated with LPS (5 µg/mL). The anti-
inflammatory activity of the isolated compounds friedelin, canophyllol,
amentoflavone and 3-desmethyl-2-geranyl-4-prenylbellidypholine xanthone
(10 μM) were evaluated in RAW 264.7 macrophages by measuring nitric
oxide (NO) and TNF. Oral treatment with the extract of G. humilis at the dose
of 30 mg/kg caused a reduction in neutrophil migration, as well a decrease in
TNF, IL-1β and CXCL1 levels, but did not change the protein exudation and
did not reduce IL-6. In vitro, the treatment with the extract reduced IL-1β
and IL-6 levels, but did not alter TNF and CXCL1. It also decreased CD62L
and CD18 expressions on the surface of the neutrophils, and reduced
neutrophil chemotaxis. The compounds friedelin, amentoflavone and 3-
demethyl-2-geranyl-4-prenylbellidypholine xanthone decreased the secretion
of NO and TNF in the macrophages. The absence of cytotoxicity for
fibroblasts, neutrophils and macrophages is also highlighted. In addition, the
anti-inflammatory extract of G. humilis at the oral dose of 30 mg/kg was also
able to reduce mechanical hypersensitivity by carrageenan (300 μg/paw).
Together, the test results demonstrate that the extract of leaves of G. humilis
presents important anti-inflammatory actions in vivo and in vitro, in addition
to antinociceptive activity, blocking the secretion and migration pathways of
neutrophils, suggesting that it has potential for therapeutic application to treat
acute inflammatory reactions.
Keywords: Pain. Neutrophil. Macrophage. Cytokine. Achachairu
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Migração de leucócitos para o tecido lesado...............................29
Figura 2. Migração do neutrófilo em direção a um gradiente de concentração
quimioatrativo..............................................................................................31
Figura 3. Classificação das fibras nervosas................................................34
Figura 4. Organização das fibras no corno dorsal da medula
espinhal.........................................................................................................35
Figura 5. Sensibilização de nociceptores por lesão tecidual e
inflamação....................................................................................................37
Figura 6. Imagens ilustrativas das folhas de G.
humilis..........................................................................................................41
Figura 7. Estruturas moleculares dos fitoconstituintes presentes no EMB de
G. humilis.....................................................................................................43
Figura 8. Fluxograma da preparação do EMB das folhas de G.
humilis..........................................................................................................50
Figura 9. Delineamento experimental do modelo de bolsa de ar................52
Figura 10. Descrição do método ELISA sanduíche....................................54
Figura 11. Delineamento experimental do modelo de recrutamento de
neutrófilos com glicogênio de ostra.............................................................55
Figura 12. Ilustração do poço para ensaio de quimiotaxia in
vitro..............................................................................................................58
Figura 13. Efeito do EMB de G. humilis no modelo de bolsa de ar induzido
por carragenina.............................................................................................64
Figura 14. Análise histológica do efeito do EMB de G. humilis no tecido de
revestimento da bolsa de ar...........................................................................65
Figura 15. Efeito do EMB de G. humilis sobre a secreção de mediadores
químicos no exsudato da bolsa de ar............................................................66
Figura 16. Avaliação do efeito citotóxico do EMB de G. humilis na
viabilidade de neutrófilos e fibroblastos estimulados com
LPS...............................................................................................................67
Figura 17. Efeito do EMB G. humilis sobre a quimiotaxia de neutrófilos e a
expressão de L-selectina (CD62L) e β2-integrina (CD18)...........................69
Figura 18. Efeito do EMB de G. humilis sobre a secreção de mediadores
químicos secretados por neutrófilos..............................................................71
Figura 19. Efeito do EMB de G. humilis e os compostos C1, C2, C3 e C4 na
produção de NO2- e TNF em macrófagos estimulados por
LPS...............................................................................................................72
Figura 20. Avaliação do efeito citotóxico do EMB de G. humilis e dos
compostos C1, C2, C3 e C4 sobre macrófagos............................................73
Figura 21. Efeito do EMB de G. humilis na hiperalgesia mecânica induzida
por carragenina.............................................................................................75
Figura 22. Efeito do EMB de G. humilis sobre a atividade locomotora dos
animais.........................................................................................................76
Figura 23. Esquema representativo do mecanismo de ação anti-inflamatório
e antinociceptivo do EMB de G. humilis.......................................................89
LISTA DE ABREVIATURAS
AINEs - Anti-inflamatórios não esteroidais
AMPc - Adenosina 3’, 5’ – monofosfato cíclico
APP-1 – Proteína ativadora 1
Arid5a – Domínio interativo rico em AT contendo proteína 5a
ASIC - Canais iônicos sensíveis a ácidos
ATP - Trifosfato de adenosina
C5a - Fração 5a do sistema complemento
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
COXs - Enzimas ciclooxigenases
CXCR2 - Receptor de quimiocina C-X-C tipo 2
DAMP – Padrão molecular associado a danos
DI50 – Dose inibitória de 50%
DMEN - Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxirribonucleico
ELISA – Ensaio de imunoadsorção enzimático
EMB – Extrato metanólico bruto
eNOS - NOS endotelial
E.P. M. - Erro padrão da média
FCS – Soro fetal de bezerro
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
FPR1 - Receptor de peptídeos formilados 1
fMLP - N-formilmetionina-leucil-fenilalanina
GAGs – Glicosaminoglicanos
GM-CSF - Fator estimulante de colônias de macrófagos
GPCRs – Receptores acoplado à proteína G
HBSS - Solução salina equilibrada de Hanks
HE - Hematoxilina e eosina
ICAM – Molécula de adesão intracelular
IFN - Interferon
iNOS - NOS indutiva
i. p. – Intraperitoneal
i. pl. – Intraplantar
ICAM-1- Molécula de adesão intercelular 1
IL – Interleucina
K2P - Canais de potássio de dois poros
KC – Quimiocina derivada de queratinócitos
KV - Kolaviron
LPS - Lipopolissacarídeo de E.coli
LTB4 - Leucotrieno B4
MIP - Proteína macrofágica
MTT - Redução do Sal de Tetrazolium
nNOS - NOS neuronal
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NETs – Armadilhas extracelulares de neutrófilos
NF-κB – Fator nuclear kappa B
NK - Natural killer
NOS - NO Sintase
PAMP – Padrão molecular associado a patógenos
PBS – Salina tampão fosfato
PECAM – Molécula de adesão celular endotelial plaquetária
PGE2 - Prostaglandina E2
PI3K – Fosfoinositídeo-3-quinase
PNs - Produtos naturais
Regnase-1 - RNase reguladora 1
ROS – Espécies reativas de oxigênio
RPMI - Meio do Roswell Park Memorial Institute
RTK - Receptor de tirosina quinase
SNC - Sistema nervoso central
TACE – Enzima conversora de fator de necrose tumoral α
TNF – Fator de necrose tumoral
TRP - Canal potencial receptor transiente
V-CAM-1 – Molécula de adesão celular vascular 1
v. o. – Via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................23
2 OBJETIVOS............................................................................................25
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................25
2.2 Objetivos Específicos............................................................................25
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................27
3.1 Inflamação.............................................................................................27
3.2 Dor............................................................................................. .............33
3.2.1 Dor inflamatória.................................................................................35
3.3 Produtos naturais e medicamentos......................................................38
3.4 Gênero Garcinia....................................................................................39
3.4.1 Garcinia humilis.................................................................................41
3.4.2 Aspectos químicos...............................................................................41
3.4.3 Aspetos biológicos...............................................................................45
4 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................49
4.1 Drogas e equipamentos.........................................................................49
4.2 Obtenção do material botânico e preparação do EMB de G.
humilis.........................................................................................................49
4.2.1 Obtenção dos compostos.....................................................................50
4.3 Animais.............................................................................................. ....50
4.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo – Inflamação no
tecido subcutâneo dorsal (bolsa de ar).....................................................51
4.4.1 Contagem total e diferencial de leucócitos e análise histológica do
tecido da bolsa de ar.....................................................................................52
4.4.2 Quantificação de proteínas totais.......................................................53
4.4.3 Determinação de citocinas..................................................................53
4.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro - Obtenção de
neutrófilos migrados para o peritônio.......................................................54
4.5.1 Viabilidade de neutrófilos...................................................................55
4.5.1.1 Viabilidade celular pelo método de Azul de Tripan.......................55
4.5.1.2 Viabilidade celular pela técnica de redução do Sal de Tetrazolium
(MTT).......................................................................................................... .55
4.5.2 Determinação de citocinas..................................................................56
4.5.3 Determinação do NO2-........................................................................56
4.5.4 Ensaio de quimiotaxia de neutrófilos.................................................57
4.5.5 Quantificação da expressão de moléculas de adesão.........................58
4.5.6 Cultura celular....................................................................................59
4.5.7 Viabilidade celular pela técnica de redução do Sal de Tetrazolium
(MTT)...........................................................................................................59
4.5.8 Determinação do NO2- e TNF............................................................59
4.6 Avaliação da atividade antinociceptiva in vivo...................................59
4.6.1 Hipersensibilidade mecânica induzida por carragenina...................60
4.7 Avaliação dos possíveis efeitos adversos do tratamento com o EMB
de G. humilis................................................................................................60
4.7.1 Atividade locomotora (campo aberto).................................................60
4.8 Análise estatística..................................................................................61
5 RESULTADOS........................................................................................63
5.1 O EMB de G. humilis inibe a migração de neutrófilos para o foco de
inflamação induzida por carragenina.......................................................63
5.2 O EMB de G. humilis reduz a secreção de TNF, IL-1β e CXCL1 no
exsudato inflamatório induzido por carragenina.....................................66
5.3 O EMB de G. humilis não afeta a viabilidade dos neutrófilos
circulantes e de fibroblastos L929........................................................... ..67
5.4 O EMB de G. humilis altera a expressão das moléculas de adesão e
reduz a quimiotaxia em neutrófilos circulantes incubados com LPS in
vitro..............................................................................................................68
5.5 O EMB de G. humilis reduz a produção de citocinas e óxido nítrico
em neutrófilos estimulados com LPS in vitro...........................................70
5.6 O EMB de G. humilis e os compostos friedelina, amentoflavona e 3-
desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona reduzem a secreção de
óxido nítrico e TNF em macrófagos estimulados com LPS.....................71
5.7 O EMB de G. humilis reduz a hiperalgesia mecânica induzida por
carragenina.................................................................................................73
5.8 O EMB de G. humilis não altera a atividade locomotora dos
animais.........................................................................................................75
6 DISCUSSÃO........................................................................................ ....77
7 CONCLUSÃO.........................................................................................89
REFERÊNCIAS.........................................................................................91
ANEXOS...................................................................................................111
ANEXO A – Parecer comitê de ética no uso de animais.......................11
23
1 INTRODUÇÃO
A inflamação é a resposta primária a uma infecção ou lesão no
organismo e possui importante papel de remover o material lesivo (ou o
agente) e promover a reparação tecidual. É caracterizada pela liberação de
uma série de mediadores que regulam o aumento da permeabilidade vascular
e o recrutamento de leucócitos para o local da lesão (RODRIGUEZ-VITA;
LAWRENCE, 2010). Alguns desses mediadores, incluindo citocinas e
quimiocinas, podem ativar diretamente ou modificar a atividade dos
nociceptores, contribuindo para a hiperalgesia e dor espontânea (BASBAUM
et al., 2009).
Apesar dos múltiplos recursos disponíveis atualmente para o tratamento
de processos inflamatórios e dolorosos, como acupuntura, técnicas de
neuroestimulação e bloqueios anestésicos, a terapia farmacológica ainda é o
grande suporte para o tratamento dessas condições clínicas. No entanto,
sempre há preocupações em relação aos efeitos adversos que esses fármacos
podem gerar, como danos gastrointestinais, renais e cardiovasculares
(BENFARI, 2015; RONCHETTI; MIGLIORATI; DELFINO, 2017).
Os produtos naturais (PNs) são uma fonte viável de protótipos e
possíveis fármacos e vêm contribuindo para a prevenção ou tratamento das
mais variadas patologias. A utilização de PNs é relevante, pois permite
avaliar atividades farmacológicas em extratos padronizados, visando validar
o seu uso popular e oferecer maior segurança quanto ao uso terapêutico
(CRAGG, et al., 2014; MOTA et al., 2008).
O gênero Garcinia possui uma ampla gama de propriedades biológicas
e farmacológicas, incluindo atividade anti-inflamatória, analgésica e
antiproliferativa (MARTINS et al., 2008; CAO et al., 2007; SEMWAL, et al.,
2015). A espécie Garcinia humilis é utilizada popularmente para o tratamento
de processos inflamatórios (DAL MOLIN et al., 2012; MARQUES, et al.,
2012). Contudo, ainda não há estudos que comprovem seu efeito anti-
inflamatório, nem mesmo os mecanismos pelos quais esse efeito é regulado.
Neste contexto, estudos que esclareçam o papel do extrato metanólico
bruto (EMB) das folhas da G. humilis sobre os mecanismos envolvidos nos
processos dolorosos e inflamatórios são de grande importância. Assim sendo,
o presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade anti-
inflamatória e antinociceptiva do extrato obtido das folhas de G. humilis
24
utilizando metodologias in vivo e in vitro, visando confirmar o uso
etnofarmacológico no tratamento de processos inflamatórios e dolorosos.
25
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva do extrato
metanólico das folhas de G. humilis utilizando metodologias in vivo e in vitro,
visando confirmar o uso etnofarmacológico no tratamento de processos
inflamatórios e dolorosos.
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar os efeitos do EMB das folhas de G. humilis sobre a migração
de células no modelo de bolsa de ar induzido por carragenina em
camundongos;
• Quantificar no exsudato da bolsa de ar proteínas totais, TNF, IL-1β,
IL-6 e CXCL1;
• Verificar a citotoxicidade do EMB de G. humilis em neutrófilos e
fibroblastos estimulados por LPS;
• Verificar os efeitos do EMB de G. humilis sobre a expressão das
moléculas de adesão celular L-selectina e β2-integrina em
neutrófilos estimulados por LPS;
• Avaliar a atividade do EMB de G. humilis sobre a quimiotaxia de
neutrófilos;
• Quantificar a secreção de TNF, IL-1β, IL-6, CXCL1 e óxido nítrico
em neutrófilos estimulados por LPS;
• Avaliar a atividade do EMB de G. humilis e dos compostos
friedelina, canofilol, amentoflavona e 3-desmetil-2-geranil-4-
prenilbellidifolina xantona sobre macrófagos.
26
• Analisar o limiar mecânico de retirada da pata de animais tratados
com EMB de G. humilis submetidos ao modelo de
hipersensibilidade induzida por carragenina em camundongos;
27
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Inflamação
A inflamação é uma resposta fisiopatológica causada por uma infecção
ou dano tecidual, a qual consiste em eventos celulares e moleculares com
intuito de eliminar o estímulo causador e retornar a homeostasia (ORTEGA-
GÓMEZ, et al., 2013). É caracterizada por cinco sinais típicos: rubor, calor,
edema, dor e perda da função. A inflamação pode ser sistêmica (quando é
causada por um trauma, cirurgia ou infecção grave) ou local (quando é
causada por uma lesão externa) (RONCHETTI; MIGLIORATI; DELFINO,
2017).
Este processo pode ser iniciado por padrões moleculares associados a
patógenos (PAMPs), liberados por micro-organismos invasores, e padrões
moleculares associados a danos (DAMPs) derivados de células danificadas
e/ou mortas, ou em resposta a tecidos e/ou estresse celular. Além disso, o
estímulo inflamatório pode ser desencadeado também por agentes químicos
(ácidos, gases e solventes) (NOURSHARGH, et al., 2014).
As respostas inflamatórias são reguladas por vários fatores
transcricionais, incluindo o fator nuclear κB (NF-κB). A ativação de NF-κB
depende da ubiquitinação induzida pela fosforilação das proteínas IκB. A via
de sinalização do NF-κB é ativada em minutos após a exposição de sinais
pró-inflamatórios, como citocinas e patógenos, que por sua vez designa os
IκBs clássicos (IκBα, IκBβ ou IκBε) para degradação com consequente
liberação de dímeros de NF-κB para translocação nuclear, onde medeiam a
expressão de muitos genes inflamatórios (CHRISTIAN, et al., 2016; GRAY,
et al., 2014).
Em condições fisiológicas, os leucócitos circulam na parte central do
vaso sanguíneo e, na vigência de um estímulo inflamatório, são recrutados
para o foco da lesão. Nesse processo, ocorrem alterações vasculares, como
vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular que, em conjunto
resultam na diminuição do fluxo sanguíneo, no extravasamento de proteínas
plasmáticas e no recrutamento celular (CHEN; NUNES, 2010).
Em resposta à lesão, células inflamatórias locais, secretam diversas
citocinas na corrente sanguínea. O fígado responde produzindo um número
de reagentes de fase aguda, incluindo as proteínas de fase aguda (APPs). As
APPs possuem diversas funções fisiológicas no sistema imune, a grande
28
maioria age destruindo ou inibindo o crescimento de patógenos (CRAY, et
al., 2009).
O recrutamento de células para o local afetado é primeiramente
composto por neutrófilos. Essas células são cruciais para a primeira linha de
defesa do sistema imune inato devido às suas funções fagocíticas e
microbicidas. No local afetado, os neutrófilos liberam mediadores pró-
inflamatórios para atrair outras células inflamatórias e montam funções
efetoras para destruir os patógenos, incluindo degranulação, fagocitose,
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e armadilhas extracelulares
de neutrófilos (NETs). No entanto, os neutrófilos devem ser rigidamente
regulados; o recrutamento excessivo exacerba suas atividades e acentua a
inflamação causando lesão tecidual (SAVILL et al., 2002; PANTARELLI;
WELCH, 2018).
Além de neutrófilos, outras células imunes inatas e residentes produzem
mediadores que modulam o destino da inflamação. Neutrófilos, macrófagos,
mastócitos e células dendríticas produzem citocinas e quimiocinas que
controlam o início da inflamação, sua manutenção e regulam sua amplitude
e duração de resposta. A inflamação também é controlada por uma série de
mediadores e reguladores extracelulares como fatores de crescimento,
eicosanoides (prostaglandinas) e outros peptídeos (FREIRE; VAN DYKE,
2013).
O extravasamento de leucócitos para o tecido lesado requer adesão
dessas células ao endotélio capilar. Esse processo de interação leucócito-
endotélio é altamente complexo, e mediado pela expressão sequencial de
receptores glicoproteicos, denominados de moléculas de adesão, que estão
expressos em leucócitos e em células endoteliais (COTRAN; MAJNO, 1964;
DARVEAU, 2010; FREIRE; VAN DYKE, 2013) (Fig. 1).
A primeira classe de moléculas de adesão envolvida neste processo
pertence à família das selectinas (P, E e L-selectinas), responsáveis pelo
rolamento (rolling) dos leucócitos na superfície do endotélio. As células
endoteliais expressam dois tipos de selectinas, denominadas P-selectina
(CD62P) e E-selectina (CD62E). A P-selectina é encontrada em plaquetas e
estocada nos corpos de Weibel-Palade na célula endotelial e é rapidamente
redistribuída para a superfície da célula, em resposta a produtos microbianos,
citocinas, histamina e trombina gerada durante a coagulação sanguínea. Já a
expressão da E-selectina (CD62E) é dependente de síntese proteica após
estimulação por mediadores específicos como interleucina-1β ou fator de
29
necrose tumoral (TNF). Uma terceira selectina, denominada L-selectina
(CD62L), é expressa na superfície de leucócitos. Essa glicoproteína serve
para a ligação de leucócitos às células endoteliais que são ativadas por
mediadores inflamatórios durante a inflamação (GENG, et al., 1990; SMITH,
2007; LEY, et al., 2007). Após a ativação, a L-selectina é clivada pela ação
de metaloproteinases de membranas, como a ADAM17, também conhecida
como TACE, resultando, portanto, em expressão passageira (UCHIMURA;
ROSEN, 2006).
A parada de leucócitos é mediada pela ativação de receptores acoplados
a proteína G (GPCRs) por quimiocinas inflamatórias, que medeiam a
ativação de integrinas, uma outra classe de moléculas de adesão. A subfamília
de maior importância em neutrófilos é a família β2-integrina. A β2-integrina
é expressa na superfície dos leucócitos e se liga a glicoproteínas expressas na
superfície endotelial, incluindo ICAM-1 ou VCAM-1. Essa ligação permite
a redução da velocidade de rolamento dos leucócitos, firme adesão dos
leucócitos ao endotélio, bem como alteração da conformidade das células,
para posteriormente transmigração para o foco da lesão (GHANDOUR et al.,
2007; WILLIAMS et al., 2011; HERTER; ZARBOCK, 2013).
Figura 1. Migração de leucócitos para o tecido lesado
Os quatro eventos principais para a migração do leucócito incluem: rolamento, que é mediado
por selectinas, ativação que é mediada por quimiocinas e adesão, que é mediada por integrinas.
Após ativação, os leucócitos migram para o tecido lesado afim de combater o agente lesivo.
Fonte: Adaptado de Karenberg et al., 2016.
30
Durante o comportamento de rolling, os neutrófilos podem detectar
gradientes químicos extracelulares e avançar para concentrações mais altas
desse gradiente, esse processo é denominado quimiotaxia. Os neutrófilos
respondem a múltiplos quimiotáticos que são secretados de diferentes fontes,
estes incluem, N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP), leucotrieno B4
(LTB4), fração 5a do sistema complemento (C5a) e/ou quimiocinas (PETRI,
SANZ, 2018).
As quimiocinas são pequenas citocinas quimiotáticas que podem
controlar o tráfego e o comportamento migratório de células imunitárias e/ou
gliais periféricas (BAJETTO, et al., 2001). A CXCL1 é uma citocina
quimiotática produzida durante a inflamação e é importante para atrair células
polimorfonucleares para o local inflamatório. Em camundongos é conhecida
como quimiocinas derivada de queratinócitos (KC). Já em humanos, atua de
forma semelhante a IL-8 (VERRI, et al., 2006; SILVA, et al., 2017).
Dentro da vasculatura, quimioatrativos como quimiocinas são
imobilizados por glicosaminoglicanos (GAGs), em particular na membrana
luminal do endotélio. Extravascularmente, quimioatratores podem ligar-se à
matriz extracelular e orientar a migração de leucócitos para o foco da lesão.
Os quimiotáticos transmitem seus sinais através da interação com receptores
acoplados à proteína G expressos nas superfícies dos neutrófilos (WANG, et
al., 2005).
A quimiotaxia de neutrófilos é caracterizada por três processos
diferentes: Detecção do gradiente, polarização e motilidade celular. Portanto,
uma vez que o quimioatrativo interage com o seu receptor na superfície dos
neutrófilos, eles se submetem ao rearranjo do citoesqueleto, a mudança da
forma da célula e a polarização, mostrando uma borda de ataque/pseudópode
na frente, que empurra a célula para frente e uma extremidade
traseira/urópode na parte traseira, o que lhes permite mover-se intra- e
extravasculamente ao longo de uma gradiente de concentração (PETRI;
SANZ, 2018) (Fig. 2).
31
Figura 2. Migração do neutrófilo em direção a um gradiente de concentração
quimioatrativo
O movimento celular consiste em ciclos de cinco processos: Protusão da membrana na borda de
ataque; Adesão das protusões; Translocação do corpo celular; Desprendimento da cauda e
retração da borda da extremidade traseira. A reorganização do citoesqueleto de actina está
envolvida nestes processos, que é regulada por Rho GTPases. Cdc42, Rac e Rho são reguladores
chaves da montagem de actina e controlam a formação de pseudópodes, urópodes e fibras de
tensão. Rac e Cdc42 ativados induzem a reorganização do citoesqueleto de actina na borda de
ataque; a polimerização de actina localizada na borda dianteira empurra para frente a membrana
em estruturas conhecidas como pseudópodes. Em contrapartida, Rho regula a montagem de
filamentos de actomiosina contráteis, que induzem o descolamento da cauda. Assim, durante o
movimento das células Rac e Cdc42 estimulam a formação de protuberâncias na borda de ataque,
enquanto que Rho induz a retração na extremidade traseira. Essa reorganização coordenada
permite o movimento da célula em direção a um alvo. Fonte: Adaptado de Matsuoka et al., 2014.
O processo de migração transendotelial é um passo fundamental no
recrutamento de leucócitos e envolve a função coordenada de um grande
número de moléculas. Proteínas intracelulares localizadas adjacentes às
bordas das células ou na membrana plasmática funcionam na transdução do
sinal. Estas incluem as GTPases Rho A, Rho G, Rac e Cdc42, as quinases da
32
família Src, PI3K, óxido nítrico sintase (NOS) endotelial e proteínas
adaptadoras do citoesqueleto cortactina, filamina e α-actina (ALCAIDE, et
al., 2009; ENGELHARDT, et al., 2004; VESTWEBER, 2007; WILLIAMS
et al., 2011).
No entanto, é importante ressaltar que a migração de neutrófilos precisa
ser balanceada, pois neutrófilos ativados são os principais produtores de
radicais livres. Durante a inflamação prolongada, esses agentes tóxicos
tornam-se prejudiciais ao infligir danos ao hospedeiro, o óxido nítrico (NO),
por exemplo, pode interagir com elétrons levando a formação do ânion
peroxinitrito (ONOO-), um agente oxidante extremamente potente
(TRIPATHI, et al., 2007).
O NO é sintetizado a partir da L-arginina e oxigênio molecular por um
processo enzimático que utiliza elétrons doados pelo NADPH. A NO sintase
(NOS) converte a L-arginina em NO através do intermediário N-hidroxi-L-
arginina. Existem três tipos de NOS, NOS neuronal (nNOS) expressa
constitutivamente em neurônios, NOS endotelial (eNOS) expressa
constitutivamente em células endoteliais e a NOS induzível (iNOS) que não
é expressa em células em repouso, mas somente na ativação celular
(GELLER, et al., 1993; TRIPATHI, et al., 2007).
A geração de NO é uma característica genuína de células do sistema
imune, incluindo células dendríticas, células natural killer (NK), mastócitos,
monócitos, macrófagos, neutrófilos, bem como células endoteliais,
fibroblastos, hepatócitos e células de Schwann (SAINI; SINGH, 2018). Nos
neutrófilos, o NO modula a quimiotaxia, a adesão celular, a fagocitose, o
burst respiratório e a apoptose (BOGDAN, 1997).
O NO também medeia a liberação de armadilhas extracelulares de
neutrófilos (NETs) no local da inflamação, aumentando a geração de radicais
livres. As NETs são formadas pelos neutrófilos como um mecanismo de
defesa para imobilizar microorganismos invasores. São constituídas de um
suporte de DNA decorado com proteínas granulosas, tais como proteases
enzimaticamente ativas e peptídeos antimicrobianos (BOELTZ, et al., 2019).
À medida que a lesão amadurece, os neutrófilos se acumulam no tecido
local e morrem por apoptose. A acumulação inicial de neutrófilos é seguida
de uma segunda onda de infiltração celular, de fagócitos mononucleares
(monócitos). A diferenciação de monócitos em macrófagos promove a
remoção de neutrófilos e detritos apoptóticos por fagocitose. Os macrófagos
que completaram a eliminação de neutrófilos apoptóticos são removidos do
33
tecido inflamado, seja por egressão ao sistema linfático ou por apoptose,
processo denominado eferocitose. Esta regulação temporal da inflamação
requer que este fenótipo celular conservado seja altamente regulado para
limpar o insulto original, se não reconhecidas e descartadas, as células
apoptóticas sofrem necrose secundária, liberando conteúdos intracelulares
prejudiciais e ampliando a resposta inflamatória aguda para crônica. Portanto,
embora as reações inflamatórias sejam benéficas e necessárias para a defesa
do hospedeiro, essas reações precisam ser controladas para evitar sequelas e
danos nos tecidos (HERTER; ZARBOCK, 2013; MAYER; DEREK, 2015;
SAVILL et al., 2002; VAN DYKE, 2013; WARD et al., 1999).
3.2 Dor
A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor
(IASP) como sendo uma experiência associada com uma lesão tecidual real
ou potencial com componentes emocionais, sensoriais, cognitivos e sociais.
A detecção de estímulos nocivos pelos nociceptores provoca dor nociceptiva,
no entanto, em várias condições patológicas, a dor pode ocorrer na ausência
de um estímulo nocivo, em resposta a estímulos normalmente inócuos
(alodinia), e com resposta exagerada a um estímulo nocivo (hiperalgesia)
(WILLIAMS; CRAIG, 2016).
O componente sensorial da dor é denominado nocicepção que inclui a
detecção pelas fibras nervosas de estímulos mecânicos, térmicos ou
químicos. Em resposta a estes estímulos, receptores celulares, incluindo
receptores acoplados a proteína G (GPCR), canal potencial receptor
transiente (TRP), canais iônicos sensíveis a ácidos (ASIC), canais de potássio
de dois poros (K2P) e receptor de tirosina quinase (RTK), sofrem mudanças
na sua conformação e, portanto, medeiam a despolarização necessária para
desencadear um potencial de ação. A sensibilidade a dor térmica depende de
populações distintas de neurônios sensoriais primários, alguns tonam-se
ativos em temperaturas frias (TRPM8), enquanto outros respondem ao calor
(TRPV1). Já as terminações nervosas excitadas por estímulos mecânicos são
mediadas pelo receptor TRPA1 ou por canais catiônicos, especialmente
canais de sódio. As terminações periféricas sensíveis a estímulos químicos,
geralmente são ativadas por ligantes químicos relacionados a lesão celular ou
inflamação, como prótons, íons potássio, ATP, aminas, citocinas e
bradicinina (BASBAUM et al., 2009; MEYER et al., 2008).
34
Estes estímulos nocivos são inicialmente detectados pelas fibras
nervosas sensoriais aferentes primárias que inervam um alvo periférico e
transmitem essa informação para os neurônios dentro do corno dorsal da
medula espinhal, e daí para os centros cerebrais superiores para interpretação
pelo cérebro (LINLEY, et al., 2010; JULIUS, 2013; RONCHETTI;
MIGLIORATI; DELFINO, 2017).
Os nociceptores que conduzem esse potencial de ação são formados por
duas classes principais de fibras nervosas baseadas no calibre e na velocidade
de condução. A primeira classe inclui aferentes mielinizados de diâmetro
médio (Aδ) que medeiam a dor aguda, rápida e bem localizada. Esta mesma
classe abrange as fibras mielinizadas de diâmetro maior (Aβ) que possui
elevada velocidade de condução, sendo responsáveis pela informação
proprioceptiva (toque e pressão). A segunda classe de nociceptores (C), são
fibras não mielinizadas de pequeno diâmetro, que conduzem o impulso de
forma lenta, produzindo a dor secundária (BASBAUM et al., 2009; MEYER
et al., 2008) (Fig. 3).
Figura 3. Classificação das fibras nervosas
Representação esquemática dos diferentes tipos de fibras nervosas responsáveis pela condução
do sinal nociceptivo da periferia ao SNC.
Fonte: Adaptado de GRUNENTHAL, 2004.
Estes aferentes primários terminam com um padrão específico de
distribuição na medula que é determinado pela sua modalidade sensorial e
pela região do corpo que inervam. Em geral fibras que apresentam baixo
35
limiar de ativação (Aβ) se estendem desde a lâmina III até a lâmina V. Já as
fibras nociceptivas e termoreceptoras Aδ e C inervam a lâmina I e II (TODD,
2010) (Fig. 4).
Figura 4. Organização das fibras no corno dorsal da medula espinhal
Representação esquemática demonstrando as terminações centrais dos principais aferentes
primários.
Fonte: Adaptado de GRUNENTHAL, 2004.
A projeção de neurônios dentro das lâminas I e V constituem a principal
saída do corno dorsal para o cérebro. Esses neurônios estão na origem de
múltiplos caminhos ascendentes, incluindo os traçados espinotalâmicos e
espinoreticulotalâmicos, que levam estímulos dolorosos para o tálamo e
tronco cerebral, respectivamente. A partir do tronco talâmico e encefálico as
informações chegam às estruturas corticais (BASBAUM et al., 2009).
A classificação do processo doloroso é diversificada e depende do
critério adotado. Do ponto vista fisiológico a dor pode ser classificada em
três tipos distintos: Nociceptiva, inflamatória e neuropática (BASBAUM et
al., 2009). O presente trabalho concentra-se somente na dor inflamatória,
visto que ela é um dos cinco sinais típicos da inflamação.
3.2.1 Dor inflamatória
A dor de origem inflamatória resulta basicamente da interação entre o
tecido danificado e os neurônios sensoriais nociceptivos periféricos por meio
36
da participação de mediadores inflamatórios; alguns apenas sensibilizando a
resposta nociceptiva (PATAPOUTIAN; TATE; WOOLF, 2009; GRACE et
al., 2014).
Notavelmente, os nociceptores expressam um ou mais receptores de
superfície celular, capazes de reconhecer e responder a cada um desses
mediadores inflamatórios. Esses mediadores sensibilizam os nociceptores
para que seu limiar de ativação diminua e sua responsividade aumente,
contribuindo para a hipersensibilidade à dor no sítio inflamado. A
estimulação desses receptores ativa sistemas de segundos mensageiros, os
quais resultam na ativação de proteínas quinases que possuem a habilidade
de fosforilar canais iônicos e receptores. Um dos principais segundos
mensageiros implicados na dor inflamatória é a adenosina 3’, 5’ –
monofosfato cíclico (AMPc) (REICHLING; GREEN; LEVINE, 2013).
A via inflamatória é tipicamente desencadeada por um trauma ou lesão
periférica. Isto é acompanhado pela liberação de ácido araquidônico, que é
posteriormente convertido em prostanoides pelas enzimas ciclooxigenases
(COXs). A COX-2 é a isoforma predominante da COX em condições
patológicas, mas não é a fonte exclusiva de prostaglandinas, que pode ser
induzida em tecidos lesados por IL-1β, TNF, IL-6, DAMPs e PAMPs
(BURIAN; GEISSLINGER, 2005). A COX-2 transforma o ácido
araquidônico em PGE2. A PGE2 promove a vasodilatação local e a ativação
e migração de neutrófilos, macrófagos e mastócitos, e pode ativar diretamente
os nociceptores através dos receptores da prostaglandina E (EP) (AOKI;
NARUMIYA, 2012).
A migração de células para o local da inflamação leva a liberação de
mediadores pró-inflamatórios, como citocinas e quimiocinas. Certas
citocinas pró-inflamatórias como TNF, IL-1β e IL-6, desempenham um papel
direto na geração e manutenção da dor, facilitando a sensibilização central e
hiperalgesia. Os neurônios nociceptivos possuem receptores para essas
citocinas em sua superfície, e a neutralização dessas citocinas pode resultar
em redução rápida da dor até mesmo antes da atenuação da inflamação. Essas
citocinas são liberadas por neutrófilos, macrófagos, linfócitos T e mastócitos,
tanto sistemicamente quanto localmente no local da inflamação
(RONCHETTI; MIGLIORATI; DELFINO, 2017). Em relação às
quimiocinas, uma gama diferente dessas moléculas, incluindo CCL5,
CXCL12, CX3CL1 e CCL22 mostraram aumentar o Ca2+ intracelular.
37
Algumas delas também mostraram induzir uma resposta excitatória, por
exemplo CXCL12 (YANG, et al., 2015).
Além dos mediadores acima mencionados, muitos outros
neuropeptídios estão envolvidos no processo doloroso durante a inflamação.
Por exemplo, a substância P é expressa em todo sistema nervoso e
imunológico e pode induzir a liberação de citocinas por vários tipos de
células, desempenhando um papel crítico na modulação de respostas imunes
em locais periféricos (O´CONNOR, et al., 2004) (Fig. 5).
Figura 5. Sensibilização de nociceptores por lesão tecidual e inflamação
Os nociceptores aferentes primários são ativados por estímulos térmicos, mecânicos ou químicos
nocivos. Uma vez ativadas, essas fibras nervosas transmitem sinais nocivos aos neurônios
secundários no corno dorsal da medula espinhal, e daí para o cérebro, provocando uma percepção
de desconforto agudo ou dor. Além desses sinais transmitidos centralmente, os nociceptores são
únicos em sua capacidade de também sinalizar antidromicamente, de tal forma que eles liberam
os transmissores não apenas dos terminais centrais da medula espinhal, mais também dos
terminais periféricos estimulados. Em particular, alguns nociceptores liberam os peptídeos
substância P e CGRP, que provocam vasodilatação, permeabilidade vascular e outras respostas
em células periféricas próximas. Essas ações produzem ou liberam múltiplas moléculas
sinalizadoras locais, um processo chamado de inflamação neurogênica. A sopa inflamatória
assim produzida inclui neutrofinas, prostanóides e outras substâncias bioativas, prótons
extracelulares, e monoaminas, cada uma das quais interage com receptores no terminal do
nociceptor para aumentar sua sensibilidade a estímulos físicos ou químicos.
Fonte: Adaptado de JULIUS, 2013.
38
O tratamento da dor sempre foi um dos principais objetivos da clínica,
pois está relacionado a diversas condições patológicas de origem inflamatória
e procedimentos cirúrgicos. A intervenção farmacológica para reduzir a dor
pode produzir analgesia pela diminuição da excitação ou pelo aumento da
inibição no sistema nervoso (BASBAUM et al., 2009).
Os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) são largamente
utilizados no tratamento da dor e inflamação. Tanto a dor aguda quanto a
crônica podem ser tratadas com eficácia com os AINEs. No entanto, sempre
há preocupações de segurança associado ao uso desses fármacos, como danos
gastrointestinais, renais e cardiovasculares clinicamente relevantes
(BENFARI, 2015; RONCHETTI; MIGLIORATI; DELFINO, 2017).
Outra opção de tratamento de processos dolorosos são os opioides.
Embora sejam muito eficazes no tratamento da dor, são incapazes de bloquear
o componente inflamatório. Portanto, compreender os mecanismos
moleculares subjacentes à associação entre mediadores inflamatórios e
percepção da dor, pode fornecer a base para o desenvolvimento de novos
tratamentos farmacológicos (RONCHETTI; MIGLIORATI; DELFINO,
2017).
3.3 Produtos naturais e medicamentos
Durante a maior parte da história, a natureza, especialmente as plantas,
fornece uma ampla fonte de medicamentos para o tratamento de várias
doenças. A partir dos anos 1800, os avanços nos conhecimentos científicos
levaram à descoberta de compostos bioativos puros, derivados de plantas
medicinais, comumente referidos como PNs (CRAGG, et al., 1997; CRAGG;
NEWMAN, 2013).
Entre os primeiros exemplos relatados encontram-se a estricnina,
atropina, quinina e colchicina. Esses isolamentos foram seguidos pelo que é
considerado o desenvolvimento do primeiro PN comercial puro, a morfina,
fármaco derivado do ópio a qual é obtido da Papaver somniferum. Em
seguida, foi desenvolvido a primeira droga semi-sintética baseada em um
produto natural, a Aspirina®, a qual foi inspirada na salicilina, derivada da
casca de salgueiro (Salix alba). Este foi o início de uma nova era na medicina
ocidental, onde as drogas podem ser isoladas a partir de plantas e
administradas em dosagens precisas (CRAGG; GROTHAUS; NEEWMAN,
2014; LISOWSKA, et al., 2018; RAFFA, et al., 2018).
39
Após a comercialização da Aspirina® e da morfina, muitos produtos
derivados de PNs foram e são comercializados. A descoberta de novos
anticancerígenos de origem vegetal tem incentivado as pesquisas nessa área.
Um dos exemplos é o da Catharanthus roseus, conhecida também como
Vinca. O isolamento dos alcaloides vimblastina e vincristina é de grande
utilidade no tratamento de linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer
de ovário e testículos e leucemia linfoblástica aguda infantil. Neste campo
dos tumores, a descoberta mais importante foi o Taxol®, um agente
quimioterápico com ação antitumoral. Seu ingrediente ativo, o
paclitaxel, foi isolado da Taxus brevifolia. Este medicamento foi
aprovado pela primeira vez em 1994 pela Food and Drug
Administration (FDA) dos Estados Unidos para o câncer de
mama. Desde então, mais de um milhão de pacientes com câncer se
beneficiaram deste fármaco, que agora também é usado em tumores de
ovário e pulmão (BRANDÃO, et al., 2010; OBERLIES, KROLL,
2004).
Além destes, outros medicamentos utilizados pela população são
derivados de PNs, como por exemplo, a Digoxina®, proveniente da
Digitalis lanata, utilizada no tratamento de problemas cardíacos e a
Caspofungina, medicamento utilizado contra infecções fúngicas,
desenvolvida a partir de um fungo que posteriormente, foi
geneticamente modificado para aumentar e retardar sua eliminação no
organismo (VIEGAS JR., et al, 2006). Outro exemplo é a capsaicina, um
composto proveniente do gênero Capsicum, conhecido como pimenta,
utilizado na forma tópica para tratamento de dor neuropática e dor associada
a condições como osteoartrite, artrite reumatoide e psoríase (O’NEILL, et al.,
2012).
Segundo Cragg e Newmann (2016) cerca de 50% dos fármacos
comercializados no mundo entre 1981 e 2014 são derivados, direto ou
indiretamente, de produtos naturais. Além disso, vale ressaltar que das cerca
de 250.000 espécies existentes no mundo, apenas 1-15% já foram estudadas,
e mesmo assim não em sua integralidade. Esse número mostra a infinidade
de PNs e estruturas químicas que poderiam ajudar na descoberta de novos
compostos com poucos efeitos adversos para o tratamento de muitas doenças,
inclusive de doenças inflamatórias (JUTTE, et al., 2017).
3.4 Gênero Garcinia
40
O gênero Garcinia denominado anteriormente de Rheedia, pertence à
família Clusiaceae e possui aproximadamente 1350 espécies. É distribuída
em países tropicais e subtropicais do sudeste Asiático, oeste e leste da África
e América Central e do Sul (ALMEIDA, et al., 2008; LI, et al., 2015).
Algumas espécies deste gênero têm grande relevância para a indústria
farmacêutica por apresentarem importantes atividades biológicas como anti-
inflamatória e antioxidante. Essas atividades são atribuídas a presença de
metabólitos secundários como xantonas e benzofenonas. Dentre os
compostos já descritos destacam-se garcinol e ácido gambórgico, ambos com
potencial aplicação na terapia do câncer, por atuarem inibindo o ciclo celular
(LI, et al., 2015; MARTINS, et al., 2007). A tabela 1 apresenta alguns estudos
já realizados com os extratos brutos, frações e princípios ativos derivados do
gênero Garcinia em relação a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva.
Tabela 1. Algumas das atividades anti-inflamatória e antinociceptiva
descritas para o gênero Garcinia
Espécie Extrato/Substância
G. brasilienses
Óleo extraído das cascas dos frutos
(MARTINS, et al., 2008).
G. cambogia
Extrato etanólico das cascas dos frutos (REIS,
et al., 2009).
G. gardneriana Biflavonóides volkensiflavona, I 3-
naringenina-II8-eriodicito, fukugetina e
fukusideo (CECHINEL FILHO, et al., 2000).
G. hanburyi Extrato da resina extraída das cascas obtido
com acetato de etila (PANTHONG, et al.,
2007).
G. kola Extrato de hexano das sementes secas
(OLALEYE, et al., 2000).
41
G. mangostana Extrato etanólico e de diclorometano dos frutos
(CHEN, et al., 2008).
G. morella
Extrato metanólico dos frutos (CHOUDHURY,
et al., 2018).
3.4.1 Garcinia humilis
A G. humilis, também conhecida como G. achachairu (LIM, 2012),
Mammea humilis (LIM, 2012), Rheedia lateriflora (DUARTE, 2011),
Rheedia sessiliflora e Rheedia siebere (LIM, 2012), é oriunda da região de
Santa Cruz - Bolívia, porém muito bem adaptada na região Sul do Brasil
(TERRAZAS, et al., 2013). É encontrada também no Peru, Guatemala,
Guiana, Panamá e Ilhas do Caribe (LIM, 2012).
Na medicina popular, os frutos são utilizados para saciar a fome e as
folhas são utilizadas como cicatrizantes, digestivas e laxantes e no tratamento
de reumatismo e úlcera gástrica (DAL MOLIN et al., 2012; MARQUES, et
al., 2012) (Fig. 6).
Figura 6. Imagens ilustrativas das folhas da G. humilis
Fonte: LORENZI et al., 2006; DAL MOLIN, 2009; MARIANO, 2016.
3.4.2 Aspectos químicos
42
Dentre os estudos já realizados com a espécie, podemos destacar os
estudos fitoquímicos com o extrato metanólico das sementes de G. humilis
(anteriormente denominada de G. achachairu), do qual foi extraído o
composto fenólico denominado de Gutiferona A. Este composto foi ativo
contra a dor em modelos induzidos por formalina, capsaicina, glutamato e
carragenina (DAL MOLIN, et al., 2012), além de apresentar efeito
gastroprotetor em modelos de úlcera em camundongos (NIERO, et al., 2012).
O extrato obtido da casca e da polpa, levaram a obtenção de
procianidinas e ácido cítrico, os quais em estudos pré-clínicos promoveram a
diminuição da pressão arterial sistólica, a rigidez diastólica e a infiltração de
células inflamatórias no ventrículo esquerdo (JONH, et al., 2018). Além
destes, o extrato obtido da casca e do caule, levou a obtenção de um composto
denominado Gutiferona I, um agonista LXR (receptor do fígado) responsável
pela regulação do gene ABCA1, que medeia o efeito do colesterol
extracelular. Espera-se que esse agonista aumente o efluxo de colesterol,
diminuída LDL e aumente HDL (HERATH, et al., 2005).
Estudos fitoquímicos realizados por pesquisadores do Núcleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí
(UNIVALI) demonstraram a presença de compostos terpênicos e fenólicos
no EMB das folhas de G. humilis, como friedelina (1), canofilol (2),
amentoflavona (3) e 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifolina xantona (4)
astilbina (5), apigenina (6) e Gb-1a (7) (GERBER, 2014) (Fig. 7).
43
Figura 7. Estruturas moleculares dos fitoconstituintes presentes no EMB das
folhas de G. humilis
H
O
[1] [2]
H
O
OH
O
O
OH
OH
OH
[6]
[5]
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH CH3
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
[4]
[3]
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OOH
O
OH
OH
OOH
[7]
A friedelina (1) e o canofilol (2) pertencem a classe dos triterpenos. Os
triterpenos são compostos de baixa polaridade que, são constituídos por 6
unidades estruturais de isopreno. Estudos têm mostrado que os triterpenos
44
pentacíclicos possuem uma ampla gama de efeitos farmacológicos,
especialmente atividade anti-inflamatória, hepatoprotetora, antitumoral, além
de atuar na regulação imunológica. (Para revisão ler XU, et al., 2018).
Estudos farmacológicos demonstraram a friedelina como potente anti-
inflamatório, analgésico e antipirético em modelos in vivo (PAULRAYER,
A. et al., 2011), além de exibir atividades antibacterianas contra S. aureus e
S. albus (ODAK; MANGURO; WONG, 2018). Já o canofilol, presente em
várias espécies do gênero Calophyllum (NOLDIN; ISAIAS; CECHINEL-
FILHO, 2006), possui atividade antibacteriana comprovada contra S. aureus,
S. albus e N. meningitides (ODAK; MANGURO; WONG, 2018).
Além de terpenos, flavonoides também já foram descritos na espécie.
Os flavonoides constituem a maior classe de compostos fenólicos vegetais.
A estrutura química dos flavonoides consiste de 15 carbonos organizados no
núcleo básico 2-fenil-benzopirona. Este núcleo pode variar quanto aos seus
padrões de hidroxilação e além disso, os compostos podem apresentar-se na
forma de O- ou C-heterosídeos, ainda sulfatados ou metilados. Em alguns
casos, podem ser encontrados na natureza na forma de dímeros, que resultam
na ligação de duas unidades de flavona, flavonona, flavonolol, além de
ocorrerem também, com menor frequência os dímeros de chalconas e
isoflavonas (FERREIRA, et al., 2012; GONTIJO; SANTOS; VIEGAS JR,
2017).
Os fenólicos isolados do EMB de G. humilis (apigenina, astilbina,
amentoflavona e Gb-1a) possuem diversas propriedades biológicas
relevantes descritas.
A amentoflavona (3) foi isolada pela primeira vez da Ginkgo biloba,
porém já foi observada também em vários outros gêneros incluindo o gênero
Garcinia. Estudos já comprovaram sua ação anti-inflamatória e
antinociceptiva (KIM, et al., 1998; SILVA, et al., 2001); antioxidante e anti-
inflamatória frente à colite ulcerativa (SAKTHIVEL;
GURUVAYOORAPPAN, 2013); além de induzir a apoptose pela via
intrínseca e extrínseca, reduzindo a sinalização anti-apoptose modulada por
NF-κB em células de glioblastoma in vitro (TSUNG-HSIEN, et al., 2018).
A astilbina (5) possui efeito hepatoprotetor, antibacteriano, além de ser
eficaz na redução da tensão muscular (MOURALARI et al., 2006;
BONIFACE; FERREIRA; KAISER, 2017).
A apigenina (6) possui atividade antioxidante em células de melanoma
(CHUANG, et al., 2018), atividade antiparasitária contra Leishmaniose
45
(EMILIANO; AMARAL, 2018) e atividade anti-hiperglicêmica com efeito
protetor contra a destruição das células β pancreáticas no diabetes
(ESMAEILI; SADEGHI, 2009; RAUTER, et al., 2010).
O Gb1a (7), juntamente com outros dois biflavonoides Gb2 e
kolaflavanona, formam o kolaviron (KV), uma fração do extrato etanólico
encontrado na G. kola. O KV exibe potentes efeitos anti-inflamatórios.
Estudos mostram que o tratamento de macrófagos estimulados por LPS com
o KV inibiu a secreção de IL-6 e bloqueou a fosforilação de Akt, ERK1/2,
IκBα e NF-κB (p65), esse bloqueio interferiu na sinalização da via do LPS,
reduzindo a ativação de vários fatores de transcrição inflamatórios
(OLALEYE et al., 2000; ABARIKWU, 2014).
3.4.3 Aspectos biológicos
Pesquisas realizadas pelo grupo de pesquisa da UNIVALI com
diferentes partes da espécie G. humilis demonstraram amplas atividades
biológicas em diferentes doenças, como demonstrado na tabela 2.
Tabela 2. Atividades biológicas descritas da espécie G. humilis
Extrato e/ou
composto
Atividade comprovada
Extrato metanólico
das sementes e o
composto isolado
Gutiferona A
Ativos contra a dor em modelos induzidos por
formalina, capsaicina, glutamato e carragenina
(DAL MOLIN, et al., 2012). Efeito
gastroprotetor em modelos de úlcera induzida
por etanol/HCl em camundongos, (NIERO, et
al., 2012). Tratamento de Leishmaniose
(CECHINEL, FILHO et al., 2013).
Xantonas PJB;
THX; DGP; TDP
obtidas do extrato
metanólico dos
galhos
Efeito gastroprotetor (MARIANO, et al.,
2016).
46
Xantonas 3-
Demetil-2-geranil-4-
prenilbelidifolina e
1,5,8-trihidroxi-
4’,5’-dimetil-
2Hipirano (2,3:3,2)-
4-(3-metilbut-2-enil)
obtidas do extrato
metanólico dos
galhos
Extrato obtido da
casca e polpa e
procianidinas e
ácido cítrico
Atividade antiproliferativa contra linhagens
celulares de câncer de mama, próstata e rim
(MARIANO, et al., 2016).
Cardioproteção (JOHN, et al., 2008)
Extrato obtido da
casca e caule e o
composto
Gutiferona I
Extrato metanólico
dos galhos
Hepatoproteção (HERATH, et al., 2005).
Eficaz na redução da pressão arterial
(JANUÁRIO, 2015). Atividade contra
microorganismos gram-positivos (MELIM, et
al., 2011).
PJB: 7-preniljacareubin; THX: 1,3,5,6-tetrahidroxi; DGP: dimetil-2-geranil-4-
prenilbelidifolina; TDP: 1,5,8-trihidroxi-4’, 5’dimethil-2H-pirano (2,3;3,2)-4-(3-
metilbut-2-enil).
Em relação a toxicidade, estudo realizado por Marques et al. (2012),
demonstrou que o extrato das sementes de G. humilis, numa única
administração oral nas doses de 500, 1000 e 2000 mg/kg não causou
genotoxicidade e clastogenicidade nas células do fígado, medula óssea e
testículo.
Apesar de extratos de G. humilis e alguns dos seus compostos isolados
terem sido submetidos a alguns estudos farmacológicos, não existe nenhum
relato na literatura dos efeitos do extrato metanólico (EMB) das folhas de G.
47
humilis sobre a inflamação aguda e a dor inflamatória. Neste contexto, o
presente trabalho visou elucidar o efeito anti-inflamatório e o mecanismo de
ação do EMB de G. humilis, bem como seu efeito antinociceptivo.
48
49
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Drogas e reagentes
Para a realização do estudo foram utilizados: Microplaca de 96 poços
(Costar ®), Indometacina, Morfina (Dimorf ®), Lipopolissacarídeo de E.coli
(LPS 026:B6 Sigma), Carragenina-λ (Sigma), Filtro (TPP Spritzen-Syringe-
Filter 0,22 μm), Salina tamponada com fosfato (PBS), Quetamina e Xilazina
(Vitrocell, Campinas, SP), Cloreto de sódio (NaCl), Corante May-Grünwald
(New Prov, Brasil), Corante Giemsa (New Prov), Formaldeído (Quemis),
DMEN (Dulbecco's Modified Eagle Medium), Glicogênio de ostra (Sigma
Aldrich), Bradford (Amresco ®), Albumina de soro bovino (AppliChem),
Brometo de tiazolil de tetrazólio (Sigma-Aldrich), Agarose (Invitrogen ™),
Anticorpos monoclonais anti-CD62L e anti-CD18 (BD Pharmingen ™), anti-
CD62L ficoeritrina (PE) e anti-CD18 fluoresceína isotiocianato (FITC),
Fibroblastos L929 murinho linhagem NCTC, anticorpo mouse TNF, IL-1β,
IL-6 e CXCL1/KC (R & D Systems – DuoSet ®).
4.2 Obtenção do material botânico e preparação do EMB de G. humilis
As folhas da G. humilis foram coletadas em Camboriú, Santa Catarina
e identificadas pelo Dr. Oscar B. Iza (Departamento de Botânica da
Universidade do Vale do Itajaí). Uma exsicata da amostra foi depositada no
Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí, Santa Catarina, sob número de
exsicata HBR 52637. As folhas foram secas a temperatura ambiente,
pulverizadas e extraídas por meio de maceração em metanol por sete dias.
Após filtração, o solvente foi removido por evaporação sob pressão reduzida
em rota evaporador com controle de temperatura em aproximadamente 50oC,
e posteriormente seco em estufa de ar circulante a 40ºC e acondicionado em
dessecador, sob sílica ativada. Um fluxograma das operações realizadas
encontra-se na figura 8.
O extrato foi produzido e cedido gentilmente pelo Professor Dr. Rivaldo
Niero (UNVALI).
50
Figura 8. Fluxograma da preparação do EMB das folhas de G. humilis.
Fonte: A autora, 2019.
4.2.1 Obtenção dos compostos
A partir de 3 kg de folhas secas, moídas e maceradas por sete dias, o
rendimento obtido foi de 330 gramas de extrato metanólico bruto (EMB). 230
gramas deste extrato foi submetido a extração líquido-líquido com solventes
de polaridades crescentes, rendendo as seguintes frações: Fração de hexano
5,29 gramas (2,3%), clorofórmio 43,54 gramas (18,93%) e acetato de etila
24,19 gramas (10,5%). O processo de purificação das frações e obtenção dos
compostos foi realizado através de procedimentos cromatográficos
(GERBER, 2014).
Os compostos friedelina, canofilol, amentoflavona e 3-desmetil-2-
geranil-4-prenilbellidifolina xantona foram submetidos aos testes
farmacológicos. A apigenina, astilbina e o Gb-1a não foram testados por não
haver quantidades suficientes. Os compostos foram isolados e cedidos
gentilmente pelo Professor Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI).
4.3 Animais
Para realização dos experimentos camundongos Swiss, machos, com 2
a 3 meses de idade e peso entre 25 e 35 g foram fornecidos pelo Biotério da
UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em salas
51
com controle de temperatura (22-25ºC), umidade (40-60%) e ciclos
controlados (claro/escuro, 12 horas cada), tendo ração e água ad libitum. Os
animais foram ambientados por um período de 5 dias antes da realização dos
experimentos. O comitê de ética de pesquisa em animais da UNIVALI
aprovou todos os procedimentos experimentais (Protocolo CEUA – 061/17)
(ANEXO A).
4.4 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo - Inflamação no
tecido subcutâneo dorsal (bolsa de ar)
Um compartimento estéril denominado bolsa de ar, foi desenvolvido
pela administração de 3 mL de ar estéril utilizando filtro (TPP Spritzen-
Syringe-Filter 0,22 μm) acoplado a uma seringa no tecido subcutâneo da
região dorsal de camundongos Swiss, os quais foram anestesiados
previamente a este procedimento. Três dias após a primeira injeção de ar, um
reforço foi realizado pela injeção de mais 3 mL de ar estéril, segundo o
procedimento descrito por Sedgwick (1986) e por Jain e Parmar (2011). Seis
dias após a primeira injeção, os animais foram tratados por via oral com EMB
de G. humilis (0,1, 1,0, 10 ou 30 mg/kg), indometacina (30 mg/kg, controle
positivo) ou com veículo solução tamponada de fosfato (controle negativo).
Uma hora após os tratamentos, uma solução de carragenina (1%) foi injetada
diretamente na bolsa de ar. Quatro horas mais tarde, após a injeção de
carragenina, uma pequena incisão foi realizada na bolsa de ar para obtenção
do exsudato do infiltrado inflamatório e do tecido de revestimento da bolsa
de ar. Após estas coletas os animais foram eutanasiados conforme normas do
CEUA (Fig. 9).
52
Figura 9. Delineamento experimental do modelo de bolsa de ar
Fonte: A autora, 2019.
4.4.1 Contagem total e diferencial de leucócitos e análise histológica do
tecido da bolsa de ar
Com o conteúdo coletado da bolsa de ar, foram confeccionados os
esfregaços celulares para a contagem diferencial dos leucócitos. Após o
preparo dos esfregaços, estes foram corados pelo método de May-Grünwald
Giemsa. A contagem celular diferencial (polimorfonucleares e
mononucleares) foi realizada em microscópio óptico comum, com auxílio de
objetiva de imersão (aumento de 1000 vezes), contando-se 100 células por
lâmina. A contagem de leucócitos totais foi determinada em câmara de
Neubauer. Os resultados foram expressos em número total de células por mL.
O revestimento da bolsa de ar foi conservado em solução formaldeído e
encaminhada a empresa Histocell (São Paulo/Brasil) para confecção das
lâminas. A confecção das lâminas consistiu em inserção do fragmento do
tecido em um cassete. Em seguida, a amostra passou por um processo de
desidratação por 1 hora primeiramente em álcool 70%, seguido por álcool
96% e por fim álcool absoluto.
Posteriormente, a amostra foi colocada em xilol por duas horas e em
seguida em banho de parafina por no mínimo três horas. Concluído este
processo, foi feita a inclusão da amostra no próprio cassete de forma que o
fragmento estivesse na posição ideal para o corte histológico. O cassete com
a amostra foi colocado no equipamento denominado micrótomo onde foram
feitos cortes seriados entre 3 ou 4 micras e a fita produzida nesse processo foi
53
colocada em banho-maria com temperatura aproximada de 56ºC. Após
esticar a fita no banho, foi retirado o número de fragmentos necessários e
estes foram colocados sobre a lâmina.
Em seguida, a lâmina foi para uma estufa com temperatura variável
entre 60ºC e 70ºC por aproximadamente 30 minutos. Na sequência, foi
realizada a coloração das lâminas. Estas passaram por um processo com três
xilóis por cinco minutos em cada cuba, depois foram imersas em 5 cubas de
álcool, lavadas em água corrente por cinco minutos e colocadas no corante
hematoxilina e “contra coradas” com eosina. Para finalizar o processo de
coloração foi realizado algumas imersões em álcool absoluto e em seguida
em xilol.
As amostras coradas receberam a cobertura de uma lamínula e a
avaliação microscópica foi realizada em microscópio óptico nas objetivas de
40, 100 e 400 x.
4.4.2 Quantificação de proteínas totais
No exsudato proveniente da bolsa de ar foi realizado a mensuração de
proteínas totais pelo método de Bradford (1976), utilizando albumina de soro
bovino como padrão e realizada de acordo com as instruções do fabricante
(Amresco ®).
4.4.3 Determinação de citocinas
No exsudato proveniente da bolsa de ar foi mensurada a concentração
de TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1 pelo método de ELISA sanduíche de acordo
com as instruções do fabricante (R & D Systems – DuoSet ®) e conforme as
descrições apresentadas na figura 10.
54
Figura 10. Descrição do método ELISA sanduíche
No ELISA sanduíche, o anticorpo para um antígeno específico, chamado de anticorpo de captura,
foi adsorvido no poço. Em seguida, a amostra com o antígeno (exsudato inflamatório) foi
adicionada, se ligando a esse anticorpo. Logo após, foi adicionado outro anticorpo específico
para o antígeno, chamado de anticorpo de detecção. Finalmente, um terceiro anticorpo ligado a
uma enzima, chamado de estreptavidina foi adicionado. Essa enzima, reage com o substrato
adicionado (TMB), gerando cor. A intensidade da reação é proporcional à quantidade de antígeno
presente. Fonte: Adaptado de AFTER et al., 2000.
4.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro - Obtenção de
neutrófilos migrados para o peritônio
Camundongos Swiss receberam 3 mL de solução de glicogênio de ostra
(1%, i.p.) para estimular o recrutamento de leucócitos para cavidade
peritoneal. Após 4 horas, os animais foram anestesiados e exsanguinados por
secção da artéria carótida. Em seguida, 3 mL de PBS foram injetados na
cavidade peritoneal e após suave massagem, as células foram removidas com
auxílio de pipeta Pasteur. As células obtidas foram submetidas à
centrifugação (600 g, 15 min, 4ºC) e o pellet formado foi ressuspendido em
1 mL de meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado
com 10% de Soro Fetal Bovino. A quantificação total de neutrófilos foi feita
em câmara de Neubauer. Um total de 1x106 neutrófilos foram adicionados
por poço em placas de cultura de 96 poços, com volume final completado
para 300 µL com meio DMEM, para obtenção da cultura celular empregada
nos ensaios descritos abaixo (Fig. 11).
55
Figura 11. Delineamento experimental do modelo de recrutamento de
neutrófilos com glicogênio de ostra
Fonte: A autora, 2019.
4.5.1 Viabilidade celular de neutrófilos
Para excluir possíveis efeitos citotóxicos do EMB das folhas de G.
humilis sobre neutrófilos, ensaios de viabilidade celular foram realizados.
Para tanto, neutrófilos foram mantidos em cultura por 18 horas com
incubação simultânea de EMB de G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) e LPS
(5 µg/mL), em estufa de CO2 atmosfera úmida, a 37ºC com 5% de CO2.
4.5.1.1 Viabilidade celular pelo método de Azul de Tripan
Após o período de incubação, 10 µl de suspensão de neutrófilos foram
acrescidos a 10 µl de azul de tripan e a quantificação das células não viáveis
(não coradas) foi realizada em câmara de Neubauer.
4.5.1.2 Viabilidade celular pela técnica de redução do Sal de Tetrazolium
(MTT)
Utilizou-se fibroblastos murinos linhagem NCTC clono 929 [L Cell,
L929] de origem de tecido conectivo adiposo. As células foram adquiridas do
banco de células do Rio de Janeiro.
56
As culturas celulares de L929 mantidas em estufa a 37 °C com 5% de
CO2, foram plaqueadas (50.000 células/poço) em microplacas de 96 poços
(TTP) e mantidas a 37 °C com 5% de CO2. Após 2 horas, 10 µL de EMB das
folhas de G. humilis (0,1, 1,0, 10 e 100 μg/mL) foram adicionados. Como
controle positivo e negativo de citotoxicidade foram empregados DMSO a
10% e meio DMEM, respectivamente. O crescimento celular foi revelado
pelo ensaio de redução do MTT. Neste ensaio, o MTT sofre redução pela
atividade da succinato desidrogenase mitocondrial das células vivas e é
convertido em sal formazan, formando cristais de coloração azulada que,
após dissolução com DMSO, permite a quantificação da coloração formada
em espectrofotômetro (MOSMANN, 1983). Após 21 horas de incubação a
37 °C com 5% CO2, foi adicionado 10 μL de MTT (5 mg/mL) e a placa
mantida mais 3 horas em estufa a 37 °C e com 5% CO2. Ao término desse
período, o sobrenadante foi retirado, e para a dissolução dos cristais formados
pela redução do MTT foi adicionado 100 μL de DMSO. A densidade óptica
(DO) de cada poço foi determinada em espectrofotômetro de microplacas em
570 nm.
A intensidade de cor formada é proporcional à atividade enzimática
mitocondrial e indica a viabilidade celular. Assim, a percentagem de
crescimento obtida corresponde ao número de células presentes no cultivo
celular e indica o efeito induzido pelo EMB de G. humilis adicionado ao
cultivo celular (MANOSROI; SARAPHANCHOTIWITTHAYA;
MANOSROI, 2005).
4.5.2 Determinação de citocinas
No sobrenadante da cultura de neutrófilos foi mensurado as
concentrações de TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1 pelo método de ELISA de
acordo com as instruções do fabricante (R & D Systems – DuoSet ®). Para
descrição do método consultar item 4.4.3.
4.5.3 Determinação do NO2-
O NO foi indiretamente quantificado pela formação de seus metabólitos
nitrato (NO3-) e nitrito (NO2
-), utilizando a reação de Griess (GREEN et al.,
1982). A concentração de NO2- foi determinada no sobrenadante da cultura
de neutrófilos utilizando a reação de Griess (1% de sulfanilamida com 0,1%
57
de α-naftil etilenodiamida, preparado no momento do uso) em placa de 96
poços.
A reação de NO2- com esse reagente produz uma coloração rósea, que
foi quantificada por meio da leitura das densidades óticas. Após 10 minutos
de incubação em temperatura ambiente, a absorbância de cada amostra foi
determinada em espectrofotômetro com comprimento de onda de 550nm.
Curvas-padrão com concentrações previamente conhecidas de NO2- (0 – 150
μM) também tiveram as densidades óticas determinadas, permitindo a
quantificação dos valores de nitrito/nitrato, em μM, com auxílio da equação
da reta.
4.5.4 Ensaio de quimiotaxia de neutrófilos
A quimiotaxia foi avaliada pela técnica adapta de Nelson et al. (1975).
Utilizou-se placa de 6 poços, onde foram colocadas 3 mL de uma mistura de
agarose 1,2 % + 50% HBSS (solução salina equilibrada de Hanks) + 50%
RPMI + 20% FCS. As placas foram colocadas a 37ºC com 5% de CO2 por 1
hora para adquirir consistência. Em seguida, foram realizadas três
perfurações, medindo 3.5 mm de diâmetro, distantes 2.5 mm entre si, sobre a
placa de agarose. Os neutrófilos isolados de camundongos Swiss (1x107
células/mL) tratados com EMB de G. humilis (1, 10 ou 100 µg/mL) foram
colocados nas perfurações periféricas, 10 µL em cada perfuração. Na
perfuração central foram colocados 10 µL de fator quimiotático (fMLP/0,1
µM). As placas foram incubadas a 37ºC em estufa de 5% de CO2 durante 4
horas. Após a incubação, os neutrófilos foram contados em microscópio. A
quantificação foi feita a partir da margem das perfurações periféricas em
direção ao agente quimiotático (perfuração central). O experimento foi
realizado em duplicata e os resultados expressos em número de
neutrófilos/campo. Como controle positivo para a migração celular foram
utilizados neutrófilos não tratados com EMB de G. humilis nas perfurações
periféricas e o fator quimiotático (fMLP/0,1 µM) na perfuração central (Fig.
12).
58
Figura 12. Ilustração do poço para ensaio de quimiotaxia in vitro
Fonte: A autora, 2019.
4.5.5 Quantificação da expressão de moléculas de adesão
Para a quantificação da expressão das moléculas de adesão L-selectina
(CD62L) e β2 – integrina (CD18), os neutrófilos (1x106) foram incubados na
ausência e na presença de EMB de G. humilis (1, 10 ou 30 µg/mL) e
subsequentemente estimuladas ou não com LPS (5 µg/mL) durante 60
minutos a 37ºC. Em seguida, as amostras foram ressuspendidas em 1 mL de
PBS a 4ºC e centrifugadas (5 min, 600g). O sobrenadante foi descartado e os
leucócitos foram incubados com os anticorpos monoclonais anti-CD62L (L-
selectina, 0,5 mg/mL) e anti-CD18 (β2-integrina, 0,5 mg/mL), conjugados
respectivamente ao fluoróforo ficoeritrina (PE, diluição 1:100) e
isotiocianato de fluoresceína (FITC, diluição 1:100), durante 20 minutos em
temperatura ambiente (18-25ºC). Imediatamente após as incubações, as
amostras foram centrifugadas (5 min.; 600g) e ressuspendidas em PBS para
leitura em citometria de fluxo. A população de neutrófilos foi caracterizada
pelas diferenças dos parâmetros de granulosidade e complexidade dos
diferentes tipos celulares detectados pelo citômetro de fluxo Accuri
(Immunocytometry System, BD Bioscience). Os sinais ópticos emitidos
foram convertidos em sinais eletrônicos, o que permitiu uma leitura
59
computadorizada pelo software. Os dados de 10.000 neutrófilos foram
obtidos e os resultados foram expressos como intensidade de fluorescência
após análise pelo software FlowJo.
4.5.6 Cultura celular
A linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7 foi adquirida do Banco
de Células do Rio de Janeiro (BCRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e mantida
em meio DMEM suplementado 10% de SFB (Soro fetal bovino), 100 µg/L
de estreptomicina e 100 IU/mL de penicilina a 37ºC em atmosfera com 5%
de CO2.
4.5.7 Viabilidade celular pela técnica de redução do Sal de Tetrazolium
(MTT)
O método foi realizado conforme descrito no item 4.5.1.2. Contudo,
utilizou-se macrófagos RAW 264.7 para avaliação da viabilidade celular.
Após 24 horas de incubação, os macrófagos foram tratados com o EMB
de G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) e os compostos friedelina, canofilol,
amentoflavona e 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona (10 µM)
juntamente com LPS (1 μg/mL) por 24 horas. Após esse período, o
sobrenadante da cultura de macrófagos foi coletado.
4.5.8 Determinação do NO2- e TNF
A determinação dos níveis de NO2- e TNF no sobrenadante da cultura
de macrófagos tratados com o EMB de G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL)
e os compostos friedelina, canofilol, amentoflavona e 3-desmetil-2-geranil-
4-prenilbellidifoline xantona (10 µM) foi mensurado por meio do método de
Griess e ELISA, conforme descritos nos itens 4.5.3 e 4.4.3, respectivamente.
4.6 Avaliação da atividade antinociceptiva in vivo
Os animais foram colocados individualmente em compartimentos de
acrílico transparente individuais (9 X 7 X 11cm) localizados em uma
plataforma de arame elevada. Inicialmente, a frequência de resposta de
retirada da pata posterior direita foi obtida a partir de 10 aplicações
60
sequenciais do filamento de von Frey 0,6 g (VFH, Stoelting, Chicago, USA).
Anotadas as frequências, os animais que obtiveram frequência de resposta
menor que 50% foram estimulados com filamentos com gramaturas maiores,
em escala logarítmica (1, 1,4, 2 e 4g), de forma crescente até obter-se 50%
ou mais de resposta de retirada. Caso a frequência de retirada com o filamento
de 0,6g tenha sido maior que 50%, o mesmo passou a ser estimulado com
filamentos de menor gramatura (0,07, 0,16 e 0,4g) até obter 50% de resposta.
O filamento com o qual o animal respondeu no mínimo 50%, seguindo o
método descrito acima, representou o limiar mecânico (Ex.: 50% resposta
com filamento 0,6g = limiar 0,6g) (COBOS et al., 2012).
4.6.1 Hipersensibilidade mecânica induzida por carragenina
Para a indução da dor inflamatória, os camundongos receberam uma
injeção i. pl. de 50 μL carragenina (300 µg/pata) na superfície plantar da pata
posterior direita. Inicialmente, os animais foram tratados com o EMB de G.
humilis (0,1, 1, 10, 30 ou 100 mg/kg, i.p.), indometacina (30 mg/kg, controle
positivo) ou veículo (PBS + tween 80 0,5%, 10 mL/kg), 30 minutos antes da
indução da hipersensibilidade. Em seguida, os animais receberam uma
injeção i. pl. de carragenina e então foram avaliados quanto à
hipersensibilidade mecânica por meio do monofilamento de von Frey, nos
intervalos de 1, 2, 4 e 6 horas após a injeção de carragenina (QUINTÃO, et
al., 2005; SANTODOMINGO, et al., 2006).
4.7 Avaliação dos possíveis efeitos adversos do tratamento com o EMB
de G. humilis
4.7.1 Atividade locomotora (campo aberto)
O teste de campo aberto permite uma avaliação da atividade estimulante
ou depressora de um determinado composto do SNC, conforme descrito por
Sielgel (1946). O equipamento do campo aberto consiste em uma arena
circular de acrílico transparente com 60 cm de diâmetro e 50 cm de altura,
com um piso dividido em 12 quadrantes. O número de cruzamentos realizado
com as quatro patas foi quantificado durante uma sessão de 6 minutos. Os
animais foram tratados por via oral com o EMB de G. humilis (30 mg/kg) e,
61
por via subcutânea, receberam o controle morfina (5 mg/kg). Após 60
minutos do tratamento, a atividade locomotora dos animais foi avaliada.
4.8 Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos como média ±
erro padrão da média (E.P.M.), exceto os valores de DI50 (doses da droga
que produziram a resposta em 50% em relação ao grupo controle), que são
apresentadas como a média geométrica acompanhada de seus respectivos
limites de confiança, em nível de 95%. As porcentagens de inibição foram
citadas como a média ± o erro padrão da média da diferença (em
porcentagem) entre as áreas sob as curvas obtidas para cada experimento
individual em relação ao grupo controle correspondente.
A análise dos dados foi realizada por meio da variância com
comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário, foram utilizados
como pós-teste o Teste de Tukey-Kramer ou Dunett. Os dados foram
analisados no programa GraphPad Prism 6®, admitindo como
significativamente estatístico o p <0,05. Os resultados obtidos neste estudo
foram correlacionados com dados de estudos prévios reportados pela
literatura.
62
63
5 RESULTADOS
5.1 O EMB de G. humilis inibe a migração de neutrófilos para o foco de
inflamação induzida por carragenina
O efeito de diferentes doses do EMB de G. humilis sobre a migração de
leucócitos in vivo foi avaliado no tecido subcutâneo dorsal de camundongos
Swiss na vigência de ação da carragenina. Os dados apresentados na figura
13A demonstram que o EMB de G. humilis nas doses de 1, 10 e 30 mg/kg foi
capaz de reduzir a migração de leucócitos para a bolsa de ar quando
comparado ao controle, com uma porcentagem de inibição de 93,10 ± 1,78%
na maior dose usada (30 mg/kg). O valor de DI50 foi de 9,07 (6,19 - 13,29)
mg/kg. A indometacina, fármaco utilizado como controle positivo, também
reduziu a migração celular, com inibição de 89,8 ± 5,02%.
A análise diferencial das células migradas para a bolsa de ar demonstrou
que o tratamento com o EMB G. humilis nas doses de 10 e 30 mg/kg, bem
como a indometacina, reduziram a migração de leucócitos, especificamente
polimorfonucleares (Fig. 13B) para o foco da lesão.
A fim de verificar a concentração de proteínas no espaço extravascular,
foi mensurada a concentração de proteínas totais no lavado do infiltrado
inflamatório pelo método de Bradford. Conforme demonstrado na figura
13C, o EMB G. humilis não alterou a concentração de proteínas totais
presentes no exsudato da bolsa de ar.
64
Figura 13. Efeito do EMB de G. humilis no modelo de bolsa de ar induzido
por carragenina.
Le
uc
óc
ito
s T
ota
is (
10
4)
N a iv e C o n tro le 0 .1 1 1 0 3 0 In d o
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0#
* * *
* * *
* * ** * *
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cle
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ota
is (
10
4)
N a iv e C o n tro le 0 .1 1 1 0 3 0 In d o
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
# # # #
* * *
* * ** * *
Pro
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(
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L)
N a iv e C o n tro le 3 0 In d o
0 .0
0 .2
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0 .6
0 .8
#
*
N a iv e
C a rra g e n in a 1 %
+ G . h u m il is (m g /k g v .o .)
+ In d o m e ta c in a (3 0 m g /k g v .o .)
(A ) (B )
(C )
Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Swiss. Os animais
receberam tratamentos por via oral uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina, o lavado
do infiltrado inflamatório foi coletado 4 horas após a injeção de carragenina na bolsa de ar. (A)
A determinação do número total de células do exsudato foi realizada em câmera de Neubauer e
o (B) valor diferencial foi realizado em esfregaços corados pelo método May-Grunwald Giemsa.
(C) A concentração de proteínas foi mensurada em espectrofotômetro a 590 nm utilizando o
reagente de Bradford e albumina bovina foi utilizada como padrão. Os valores expressam a
média ± e.p.m. de ensaios realizados com o exsudato inflamatório obtido de 6 animais em cada
grupo. * p < 0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001 vs grupo controle significativamente diferente do
grupo naive # p <0,001. (One-way ANOVA seguido pelo teste post hoc de Tukey).
As análises histológicas do tecido de revestimento da bolsa de ar dos
animais tratados com EMB de G. humilis demonstraram redução de
leucócitos no tecido inflamado, bem como redução do edema no tecido
conjuntivo quando comparado ao grupo controle (Fig. 14).
65
Figura 14. Análise histológica do efeito do EMB de G. humilis no tecido de
revestimento da bolsa de ar.
Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Swiss. Os animais
receberam tratamentos por via oral uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina, o lavado
do infiltrado inflamatório e o tecido de revestimento da bolsa de ar foi coletado 4 horas após a
injeção de carragenina na bolsa de ar. O revestimento da bolsa de ar foi fixado em formaldeído
10% para avaliação histológica. As amostras foram incorporadas em parafina e secções em série
de 5 μm de espessura foram montadas em lâminas de vidro, desparafinado, reidratado com água
destilada e corados com HE. A avaliação microscópica foi realizada em microscópio óptico nas
objetivas de 4, 10 e 40 x. Setas pretas pontilhadas indicam a espessura do tecido conjuntivo.
Setas vermelhas indicam a presença de infiltrado inflamatório. Chaves indicam edema no tecido
conjuntivo.
66
5.2 O EMB de G. humilis reduz a secreção de TNF, IL-1β e CXCL1 no
exsudato inflamatório induzido por carragenina
Durante o processo inflamatório, citocinas e quimiocinas inflamatórias
como TNF, IL-1β, IL-6 e CXCL1 contribuem para a extensão do processo.
Com o intuito de verificar a secreção desses mediadores inflamatórios,
realizou-se a dosagem de citocinas pelo método imuno-enzimático ELISA. A
figura 15 demonstra que o tratamento dos animais com o EMB G. humilis (30
mg/kg) foi capaz de diminuir as concentrações de TNF, IL-1β e CXCL1 (Fig.
15 A, B e D) em relação ao grupo controle, mas não foi capaz de reduzir IL-
6 (Fig. 15 C).
Figura 15. Efeito do EMB de G. humilis sobre a secreção de mediadores
químicos no exsudato da bolsa de ar.
TN
F (
pg
/mL
)
N a iv e C o n tro le G . h . In d o
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
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* *
# # #
*
IL-1
(
pg
/mL
)
N a iv e C o n tro le G . h . In d o
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
* * * *
# # # #
* * * *
IL-6
(p
g/m
L)
N a iv e C o n tro le G . h . In d o
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
# # # #
N a iv e C a rra g e n in a 1 % + G . h u m il is (3 0 m g /k g v .o .) + In d o m e ta c in a (3 0 m g /k g v .o .)
CX
CL
1 (
pg
/mL
)
N a iv e C o n tro le G . h . In d o
0
5 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
*
# # # #
(A ) (B )
(C ) (D )
Bolsas de ar foram induzidas no tecido subcutâneo dorsal de camundongos Swiss. Os animais
receberam tratamentos por via oral uma hora antes da injeção de 2 mL de carragenina, o lavado
do infiltrado inflamatório foi coletado 4 horas após a injeção de carragenina na bolsa de ar. A
concentração dos níveis de (A) TNF, (B) IL-1β, (C) IL-6 e (D) CXCL1 foram determinados pelo
método de ELISA de acordo com as normas do fabricante. Os valores expressam a média ±
e.p.m. de ensaios realizados com o exsudato inflamatório obtido de 6 animais em cada grupo. *
p <0,05, ** p <0,01 e **** p <0,0001, vs grupo controle significativamente diferente do grupo
naive # p <0,001 (One-way ANOVA seguido pelo teste post hoc de Tukey).
67
5.3 O EMB de G. humilis não afeta a viabilidade dos neutrófilos
circulantes e de fibroblastos L929
Para excluir possíveis efeitos citotóxicos do EMB das folhas de G.
humilis sobre neutrófilos e fibroblastos, ensaios de viabilidade celular pela
técnica de azul de Tripan e redução do MTT foram realizados (Fig. 16).
A citotoxicidade do EMB de G. humilis foi avaliada primeiramente pela
metodologia de exclusão por azul de Tripan (Fig. 16A) utilizando neutrófilos
coletados do peritônio de camundongos Swiss na presença ou ausência de
LPS e EMB de G. humilis. O grupo basal (neutrófilos + meio DMEM)
apresentou 86,8% de viabilidade. O grupo LPS (neutrófilos + meio DMEM
+ 5 µg/mL LPS) apresentou 86,3% de viabilidade. Os grupos tratados com o
EMB de G. humilis nas concentrações de 0,1, 1,0, 10 e 100 µg/mL
apresentaram viabilidade de 81,6%, 81,8%, 89,2% e 87,4%, respectivamente.
Para avaliar um possível efeito citotóxico do EMB de G. humilis sobre
fibroblastos, foi o realizado o ensaio de MTT. Os resultados obtidos
corroboraram com a técnica de exclusão com azul de Tripan, demonstrando
que todas as concentrações testadas (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) do EMB de G.
humilis não apresentam citotoxicidade. A viabilidade média das
concentrações do extrato foi de 98,65%. Já as células tratadas com DMSO,
utilizado como controle positivo, apresentou uma viabilidade baixa de
18,02% (Fig. 16B).
Figura 16. Avaliação do efeito citotóxico do EMB de G. humilis na
viabilidade de neutrófilos e fibroblastos estimulados com LPS.
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r (
%)
B a s a l L P S 0 ,1 1 ,0 1 0 1 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
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+ G . h u m il is (g /m L )
L P S (5 g /m L )
Via
bil
ida
de
Ce
lula
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%)
B a s a l D M S O 0 .1 1 1 0 1 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
# # # #
D M S O 1 0 %B a sa l G . h u m il is (g /m L )
(A ) (B )
Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Swiss (glicogênio de ostra
1%). Neutrófilos (1x106) foram incubados na presença ou na ausência de LPS (5µg/mL)
68
juntamente com EMB G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL). A quantificação da viabilidade
celular foi realizada pela técnica de exclusão com (A) azul de Tripan e avaliada
microscopicamente por câmara de Neubauer. (B) Fibroblastos foram incubados na presença ou
ausência de EMB G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) por um período de 21 horas. Após esse
período as células foram incubadas por 3 horas com MTT. Os valores expressam a média ±
e.p.m. de ensaios realizados com 50.000 células/poço. # Diferença entre basal vs DMSO (One-
way ANOVA seguido pelo teste post hoc de Tukey).
5.4 O EMB de G. humilis altera a expressão das moléculas de adesão e
reduz a quimiotaxia em neutrófilos incubados com LPS in vitro
Os ensaios para avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo
evidenciaram uma diminuição na migração de células inflamatórias. Sabendo
que o processo de migração de neutrófilos do vaso sanguíneo para o tecido
lesado requer a presença de um agente quimiotático para atrair o
deslocamento do neutrófilo, avaliamos a ação direta do EMB de G. humilis
nas propriedades de locomoção do neutrófilo por meio do ensaio de
quimiotaxia in vitro induzida por fMLP.
Na figura 17A é possível observar a atuação do EMB de G. humilis
sobre neutrófilos. Os neutrófilos não tratados com o EMB de G. humilis
respondem de forma significativa ao agente quimiotático, movimentando-se
em direção ao fMLP. Já os neutrófilos tratados com o EMB de G. humilis
apresentam redução significativa na quimiotaxia frente ao fMLP, diminuindo
a migração celular.
Além da presença de um agente quimiotático para a migração celular in
vivo é necessário a atuação de moléculas de adesão, para isso, avaliamos a
expressão das moléculas de adesão L-selectina (CD62L) e β2-integrina
(CD18) na superfície de neutrófilos. Os neutrófilos foram recrutados do
peritônio de camundongos Swiss, pela metodologia do glicogênio de ostra e
posteriormente incubados, durante 1 hora com LPS (5 µg/mL) ou PBS e
tratados com 1, 10 ou 100 µg/mL de EMB de G. humilis.
Os resultados obtidos mostraram que os tratamentos com o EMB de G.
humilis aumentaram a porcentagem de neutrófilos positivos para L-selectina
(CD62L) (Fig. 17 B). Contudo, reduziram a expressão de β2-integrina
(CD18) em neutrófilos (Fig. 17 C), demonstrando que o tratamento com
EMB de G. humilis é capaz de alterar a expressão das moléculas de adesão,
especialmente da β2-integrina nos neutrófilos.
69
Figura 17. Efeito do EMB G. humilis sobre a quimiotaxia de neutrófilos e a
expressão de L-selectina (CD62L) e β2-integrina (CD18).
N ú m e ro d e c é lu la s q u e m ig ra ra m
0 1 0 0 2 0 0 3 0 0
Ba
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l 1
10
10
0
* * *
* * *
* * *
MF
I
B a s a l L P S 1 1 0 3 0
0
2 0 0 0 0
4 0 0 0 0
6 0 0 0 0
8 0 0 0 0
* * * *
* * * *
L P S (5 g /m L ) + G . h u m il is (g /m L )
MF
I
B a s a l L P S 1 1 0 3 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0# #
* * *
C D 6 2 L C D 1 8
(B ) (C )
(A )
Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Swiss (glicogênio de ostra
1%). Para o (A) ensaio de quimiotaxia in vitro uma suspensão celular de neutrófilos (1x107) foi
incubada com diferentes concentrações de G. humilis (1, 10 ou 100 µg/mL) durante 15 minutos
e colocados frente ao estímulo fMLP (1µM) sobre uma placa de agarose. As células foram
contadas utilizando microscópio invertido no aumento de 20x. A quantificação foi feita a partir
da margem das perfurações periféricas em direção ao agente quimiotático (perfuração central).
O experimento foi realizado em duplicata e os resultados expressos em número de
neutrófilos/campo. Para avaliação da expressão das moléculas de adesão, neutrófilos (1x106)
foram incubados na presença ou na ausência de LPS (5µg/mL) juntamente com EMB G. humilis
(0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL). A quantificação da expressão das moléculas de adesão foi avaliada
através da marcação com anticorpos de detecção (B) CD62L e (C) CD18 pelo método de
citometria de fluxo. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células
obtidas de 8 animais em cada grupo. *** p <0,001 e **** p <0,0001, vs grupo LPS
significativamente diferente do grupo basal # p <0,001 (One-way ANOVA seguido pelo teste
post hoc de Tukey).
70
5.5 O EMB de G. humilis reduz a produção de citocinas e óxido nítrico
em neutrófilos estimulados com LPS in vitro
A interação de neutrófilos com células residentes, mediadores
inflamatórios locais, e/ou matriz extracelular pode levar à produção de vários
outros mediadores, incluindo citocinas, enzimas degradadoras e espécies
reativas de oxigênio, que podem amplificar a resposta inflamatória e lesar o
tecido circundante. Para avaliar esses efeitos, neutrófilos foram tratados ou
não com EMB G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL) e mantidos em cultura
por 18 horas, na presença ou ausência de LPS (5 µg/mL). Após 18 horas, o
sobrenadante da cultura foi coletado e mensurado os mediadores
inflamatórios TNF, IL-1β, IL-6, CXCL1 e NO2- .
Na figura 19 é possível observar que o tratamento dos neutrófilos com
o EMB G. humilis foi capaz de diminuir as concentrações de IL-1β (Fig. 18B)
e IL-6 (Fig. 18C), mas não foi capaz de reduzir os níveis de TNF (Fig. 18A)
e CXCL1 (Fig. 18D). Em relação ao NO2- (Fig. 18E), todas as concentrações
utilizadas (0,1, 1,0, 10 e 100 µg/mL) no tratamento, reduziram a produção
deste mediador inflamatório em neutrófilos estimulados com LPS.
71
Figura 18. Efeito do EMB de G. humilis sobre a secreção de mediadores
químicos secretados por neutrófilos.
TN
F (
pg
/mL
)
B a s a l L P S 0 .1 1 1 0 1 0 0
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
#
IL-1
(
pg
/mL
)
B a s a l L P S 0 .1 1 1 0 1 0 0
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0#
* ** * * * *
IL-6
(p
g/m
L)
B a s a l L P S 0 .1 1 1 0 1 0 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
# #
* *
CX
CL
1 (
pg
/mL
)
B a s a l L P S 0 .1 1 1 0 1 0 0
0
5 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
* **
NO
m
ol/
mL
B a s a l L P S 0 .1 1 1 0 1 0 0
0
5
1 0
1 5
#
* ** *
* *
B a sa l L P S (5 g /m L ) + G . h u m il is (g /m L )
(A )
(D )(C )
(B )
(E )
Neutrófilos foram obtidos da cavidade peritoneal de camundongos Swiss (glicogênio de ostra
1%). Neutrófilos (1x106) foram incubados na presença ou na ausência de LPS (5µg/mL)
juntamente com EMB G. humilis (0,1, 1, 10 ou 100 µg/mL). A concentração dos níveis de (A)
TNF, (B) IL-1β, (C) IL-6 e (D) CXCL1 foram determinados pelo método de ELISA de acordo
com as normas do fabricante. (E) A quantificação de nitrito foi realizada pela reação de Griess.
Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com células obtidas de 8 animais
em cada grupo. * p <0,05 ** p <0,01, *** p <0,001 e **** p <0,0001, vs grupo LPS
significativamente diferente do grupo basal # p <0,001. (One-way ANOVA seguido pelo teste
post hoc de Tukey).
5.6 O EMB de G. humilis e os compostos friedelina, amentoflavona e 3-
desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona reduzem a secreção de
óxido nítrico e TNF em macrófagos estimulados com LPS
72
Adicionalmente, o efeito anti-inflamatório do EMB de G. humilis e dos
compostos isolados friedelina (C1), canofilol (C2), amentoflavona (C3) e 3-
desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona (C4) foi avaliado em
macrófagos. Macrófagos murinos RAW 264.7 foram tratados com extrato
(10 µg/mL) e com os compostos (10 µM/mL) na presença de LPS (1 µg/mL).
No sobrenadante da cultura de células, foi mensurada a secreção dos
mediadores inflamatórios NO2- e TNF.
Os resultados obtidos demonstram que macrófagos tratados com o EMB
de G. humilis e os compostos C1, C3 e C4 diminuem a secreção de NO2- em
relação ao grupo controle (Fig. 19 A e B). Em relação ao TNF, somente o
composto C4 foi capaz de inibir a secreção dessa citocina (Fig. 19 D)
Figura 19. Efeito do EMB de G. humilis e os compostos C1, C2, C3 e C4 na
produção de NO2- e TNF em macrófagos estimulados por LPS
NO
m
ol/
mL
B a s a l L P S 1 0
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
* *
# # # #
NO
m
ol/
mL
B a s a l L P S C 1 C 2 C 3 C 4
0
2
4
6
8
1 0
1 0 M /m L
# # # #
** *
* * * *
TN
F (
pg
/mL
)
B a s a l L P S 1 0
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0 # # #
L P S (5 g /m L ) + G . h u m il is (g /m L )
TN
F (
pg
/mL
)
B a s a l L P S C 1 C 2 C 3 C 4
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
*
1 0 M /m L
# # #
(A )
(C )
(B )
(D )
A linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7 foi adquirida do Banco de Células do Rio de
Janeiro (BCRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e foram incubados na presença ou na ausência de LPS
(1 µg/mL) juntamente com EMB de G. humilis (1, 10 ou 100 µg/mL) e os compostos friedelina
(C1), canofilol (C2), amentoflavona (C3) e 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona
(C4) (10 µM/mL). (A e B) A quantificação de nitrito foi realizada pela reação de Griess. (C e D)
A quantificação de TNF foi determinada pelo método de ELISA de acordo com as normas do
73
fabricante. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com 50.000
células/poço * p <0,1 e ** p <0,01, **** p <0,0001, vs grupo LPS significativamente diferente
do grupo basal # p <0,001 (One-way ANOVA seguido pelo teste post hoc de Tukey).
Para avaliar um possível efeito citotóxico do EMB de G. humilis e os
compostos C1, C2, C3 e C4 sobre macrófagos, foi o realizado o ensaio de
MTT. Os resultados obtidos demonstram que todas as concentrações testadas
do EMB de G. humilis (Fig. 20 A) e dos compostos (Fig. 20 B) não
apresentam citotoxicidade significativa. A viabilidade média das
concentrações do extrato foi de 67,36% e a dos compostos 69,79%. Já as
células tratadas com DMSO, utilizado como controle positivo, apresentaram
5,1% de viabilidade.
Figura 20. Avaliação do efeito citotóxico do EMB de G. humilis e dos
compostos C1, C2, C3 e C4 sobre macrófagos.
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r (
%)
B a s a l D M S O 1 1 0 1 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
# # # #
B a sa l D M S O 1 0 % G . h u m il is (g /m L )
**** ********
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r (
%)
B a s a l D M S O C 1 C 2 C 3 C 4
0
5 0
1 0 0
1 5 0
1 0 M /m L
# # # #
F r ie d e lin a C a n o filo l
A m e n to fla vo na
3 -d e s m e til-2 -g e ra n il-4 -p re n ilb e llid ifo lin e
xan tona
B a sa l D M S O 1 0 %
****
******** ****
(A ) (B )
A linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7 foi adquirida do Banco de Células do Rio de
Janeiro (BCRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e foram incubados na presença ou ausência de (A)
EMB G. humilis (1, 10 ou 100 µg/mL) e (B) os compostos friedelina (C1), canofilol (C2),
amentoflavona (C3) e 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifoline xantona (C4) (10 µM/mL) por
um período de 21 horas. Após esse período as células foram incubadas por 3 horas com MTT.
Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios realizados com 50.000 células/poço. #
Diferença entre basal vs DMSO (One-way ANOVA seguido pelo teste post hoc de Tukey).
5.7 O EMB de G. humilis reduz a hiperalgesia mecânica induzida por
carragenina
74
Durante o processo inflamatório, as respostas a estímulos nocivos são
aumentadas, provocando dor inflamatória. Para estabelecer a dose mais
efetiva do EMB de G. humilis e o seu tempo de ação, foi realizado o modelo
de hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina. Para tanto,
camundongos Swiss foram tratados com EMB de G. humilis (1, 10 ou 30
mg/kg) 30 minutos antes da injeção i. pl. de carragenina (300 µg/pata) e
posteriormente avaliados através do monofilamento de von Frey nos
intervalos de 1, 2, 4, e 6 horas.
Os dados obtidos demonstram que o EMB de G. humilis reduziu a
hiperalgesia mecânica quando comparado ao grupo controle. O resultado foi
expressivo em todas as doses, com inibições na frequência de resposta de
57,6 ± 6,82%, 66,6 ± 11,25% e 54,62 ± 5,5% para as doses de 1, 10 e 30
mg/kg respectivamente (Fig. 21 A e B). No limiar mecânico houve uma
inibição de 40,05 ± 8,77%, 49,85 ± 10,25% e 35,10 ± 3, 87% para as doses
de 1, 10 e 30 mg/kg respectivamente (Fig. 21 C e D). A indometacina,
fármaco utilizado como controle positivo, também reduziu a hiperalgesia,
com inibição de 74,78 ± 5,95% na frequência de resposta e 56,3 ± 8,23% no
limiar mecânico.
75
Figura 21. Efeito do EMB de G. humilis na hiperalgesia mecânica induzida
por carragenina
T e m p o (h )
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qu
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0
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B 1 3 4 6
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+ In d o m e ta c in a (5 m g /k g v .o .)
+ G . h u m il is (1 m g /k g v .o .)
+ G . h u m il is (1 0 m g /k g v .o .)
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****
C a rra g e n in a (3 0 0 g /p a ta )
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+ In d o m e ta c in a (5 m g /k g v .o .)
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B 1 3 4 6
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B a s a l C o n tro le 1 1 0 3 0 5
0
2
4
6
8
1 0 #
*** ******
****
(A )
(C )
(B )
(D )
Hipersensibilidade mecânica de camundongos previamente tratados com G. humilis (1, 10 ou 30
mg/kg, v.o.), indometacina (5 mg/kg, v.o.), em diferentes intervalos de tempos, após a injeção i.
pl. de carragenina (300 µg/pata). Os resultados são apresentados qualitativamente pela
frequência de resposta (A e B) obtida com o filamento de von Frey de 0,6 g e quantitativamente
pelo limiar de retirada mecânica (C e D) (g). B e D representam a área sob a curva (AUC) do
respectivo gráfico de linhas. Os valores expressam a média ± S.E.M. de testes realizados com 6
animais em cada grupo. Significativamente diferente do grupo Controle, onde ** p <0,01, *** p
<0,001 e **** p <0,0001, # difere significativamente do limiar basal.
5.8 O EMB de G. humilis não altera a atividade locomotora dos animais
O possível efeito sedativo ou relaxante muscular do EMB de G. humilis,
foi verificado empregando o teste de campo aberto. Os resultados
apresentados na figura 22 demonstraram que a maior dose do EMB de G.
humilis (30 mg/kg), não foi capaz de afetar a atividade locomotora dos
animais (14,84 ± 10,27 número de cruzamentos), quando comparado com o
grupo controle positivo morfina.
76
Figura 22. Efeito do EMB de G. humilis sobre a atividade locomotora dos
animais
Nú
me
ro
de
cru
za
me
nto
s
N a iv e 5 3 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
M o rf in a (m g /k g s . c .) G . h u m il is (m g /k g v . o .)N a ive
*
Camundongos Swiss foram tratados com EMB de G. humilis (30 mg/kg), após 60 minutos os
animais foram colocados no campo aberto durante 6 minutos e avaliados quanto número de
cruzamentos realizado com as quatro patas. Os valores expressam a média ± e.p.m. de ensaios
realizados com 6 animais em cada grupo, onde * p <0,1 (One-way ANOVA seguido pelo teste
post hoc de Tukey).
77
6. DISCUSSÃO
Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que o
tratamento in vivo e in vitro com o EMB de G. humilis exerce efeitos sobre
as funções dos neutrófilos, diminuindo a migração de células para o foco
inflamatório.
A escolha pela utilização do EMB de G. humilis baseou-se em seu uso
popular para o tratamento de processos inflamatórios. Para os ensaios in vivo
foi utilizada a menor dose com maior efeito significativo. As doses utilizadas
in vitro foram escolhidas com base em estudos publicados utilizando técnicas
similares as desse trabalho (SILVA, et al., 2015).
O presente trabalho avaliou os efeitos do EMB de G. humilis sobre a
migração de leucócitos, utilizando primeiramente o modelo de inflamação
denominado bolsa de ar. Esse modelo é útil para avaliar produtos com
possível atividade anti-inflamatória, visto que, a fase inicial (4 horas após a
injeção de carragenina) ocorre uma importante migração de células,
principalmente de leucócitos. Esse parâmetro, permite avaliar a capacidade
do EMB de G. humilis de interferir com a mobilização de leucócitos para o
tecido lesado, além de permitir a quantificação e diferenciação das células
inflamatórias presentes no exsudato da cavidade subcutânea.
Neste modelo, a indução do processo inflamatório foi realizada por
meio da aplicação de carragenina na cavidade subcutânea de camundongos.
A carragenina é um agente flogístico derivado de algas marinhas, utilizado
para induzir inflamação não específica, a partir da ativação da resposta imune
inata. É bastante conhecida por induzir exsudação inflamatória aguda,
levando ao acúmulo de células e a liberação de mediadores inflamatórios
(ROMANO, et al., 1997).
Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com o EMB de G.
humilis reduz de maneira dose dependente o número de leucócitos migrados
para a bolsa de ar. Estes resultados corroboram com estudos já realizados com
demais espécies do gênero Garcinia. As sementes de G. kola (OLALEYE, et
al., 2000), a casca de G. hambury (PATHONG, et al., 2007), os frutos da G.
mangostana (CHEN, et al., 2008), G. brasiliensis (MARTINS, et al., 2008)
e G. morella (CHOUDHURY, et al., 2018) demonstraram pronunciado efeito
anti-inflamatório no modelo de edema de pata induzido por carragenina.
Além disso, a literatura tem mostrado que os triterpenos e flavonoides
possuem atividade anti-inflamatória relevante (FERREIRA, et al., 2012).
78
Dados obtidos, em colaboração, com o grupo coordenado pelo Professor Dr.
Rivaldo Niero da UNIVALI, demonstraram que o EMB das folhas de G.
humilis possui vários compostos, incluindo o triterpeno friedelina e os
flavonoides amentoflavona e Gb-1a (GERBER, 2014).
Paulrayer et al. (2011) demonstraram que a friedelina possui potente
efeito anti-inflamatório no modelo de edema de pata induzido por
carragenina. Estudos realizados por Kim e colaboradores (1998) descrevem
a atividade anti-inflamatória da amentoflavona nos modelos de edema de pata
induzido por carragenina e no edema de orelha induzido pelo ácido
araquidônico. O flavonoide Gb-1a também possui atividade anti-inflamatória
descrita, indicando sua atuação nas vias de sinalização do NF-κB e AP-1
(OLALEYE et al., 2000; ABARIKWU, 2014).
Com base na análise total de leucócitos e na análise diferencial das
células migradas para a bolsa de ar, foi evidenciado que a redução de
leucócitos é caracterizada principalmente pela diminuição de
polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos e basófilos). Durante o processo
inflamatório, o número de neutrófilos na circulação aumenta
significativamente e este é um parâmetro indicativo de resposta inflamatória
(KRUGER, et al., 2015).
A partir do tecido de revestimento da bolsa de ar, foram realizadas
análises histológicas que comprovaram a redução da migração celular, bem
como a diminuição do edema no tecido conjuntivo quando comparado ao
grupo controle. Sabe-se que a formação de edema é mediada principalmente
pelo aumento da permeabilidade vascular, migração de leucócitos e
produção/exsudação de proteínas (GORDON, et al., 2005). Apesar do EMB
de G. humilis diminuir a migração celular, o extrato não foi capaz de bloquear
a exsudação de proteínas, pois o processo de vasodilatação ainda acontece,
permitindo o extravasamento de proteínas (CHEN; NUNES, 2010).
O processo inflamatório é caracterizado pela alta produção e liberação
de citocinas e quimiocinas inflamatórias, entre as quais TNF, IL-1β, IL-6 e
CXCL1 desempenham um papel proeminente. Os resultados obtidos
mostraram que os animais tratados com EMB de G. humilis tiveram uma
diminuição significativa de TNF, IL-1β e CXCL1, mas não de IL-6.
O TNF e a IL-1β induzem a produção/secreção de outras citocinas e
quimiocinas, expressão de moléculas de adesão, angiogênese e mediação de
efeitos inflamatórios sistêmicos, como a febre, a hipotensão, além de
promoverem neutrofilia (TINCANI, et al., 2007).
79
Durante a inflamação do tecido periférico, a produção local de CXCL1
é mediada por células locais, incluindo macrófagos residentes. Essa
quimiocina é importante para atrair células polimorfonucleares para o foco
inflamatório (SILVA, et al., 2017). A diminuição conjunta de TNF, IL-1β e
CXCL1 implica diretamente na regressão do processo inflamatório,
resultando na diminuição da migração de células e produção/secreção de
citocinas inflamatórias, colaborando para a recuperação da homeostasia.
A IL-6 é liberada, além dos neutrófilos, por queratinócitos, fibroblastos
e células endoteliais. Essa ampla liberação por diversas células, justifica seus
níveis aumentados no modelo in vivo, já que além de células inflamatórias,
outras células residentes também liberam essa citocina (SPROSTON;
ASHWORTH, 2018). Apesar da IL-6 ser considerada uma citocina pró-
inflamatória, evidências também indicam que em certas condições, a IL-6
tem propriedades anti-inflamatórias. A IL-6 é capaz de inibir citocinas
inflamatórias como fator estimulante de colônias de macrófagos (GM-CSF),
interferon (IFN) e proteína macrofágica (MIP). A partir disso, há também
evidências experimentais indicando que a IL-6 regula negativamente a
síntese de IL-1β e TNF (BARTON, 1997; XING, et al., 1998).
Estudo realizado por Frode et al. (2002) no modelo inflamatório de
pleurisia induzido por carragenina, mostra que a injeção de IL-6 5 min antes
da injeção de carragenina resulta em uma diminuição significativa na
migração total de células, sendo que a diminuição no número de células
totais, foi à custa da diminuição de neutrófilos. Essa redução celular ocorre
tanto na fase aguda (4 horas após a injeção de carragenina), quanto na fase
tardia (48 horas após). Neste mesmo estudo, a IL-6 também se mostrou eficaz
no bloqueio do extravasamento de fluídos. Sabe-se que os fluídos que
extravasam do vaso para o tecido são compostos de, além de células
inflamatórias, também por proteínas de fase aguda. No presente trabalho, o
fato do EMB de G. humilis não ter reduzido a secreção de IL-6, justifica a
ocorrência de também não haver bloqueio da exsudação de proteínas, visto
que a IL-6 é a principal mediadora da secreção hepática da maioria das
proteínas de fase aguda (CRAY, et al., 2009).
Para complementar os ensaios in vivo, ensaios in vitro foram realizados
para a avaliação da atividade anti-inflamatória do EMB das folhas de G.
humilis diretamente sobre leucócitos. Nesse sentido, foram realizados ensaios
utilizando neutrófilos recrutados de camundongos. Os neutrófilos são células
fundamentais para a resposta inflamatória, pois, apresentam a característica
80
de responder rapidamente a agente lesivos, exercendo atividades fagocíticas
e microbicidas. Desta forma, os neutrófilos são células alvo importantes para
a ação de agentes terapêuticos (PANTARELLI; WELCH, 2018).
Para os ensaios in vitro, utilizou-se o LPS como agente indutor do
processo inflamatório. O LPS é um lipopolisacarídeo encontrado na parede
celular de bactérias gram-negativas, sendo capaz de desencadear uma
importante resposta inflamatória a partir da ativação de TRLs que são
expressos na membrana celular de neutrófilos. Após ativação específica do
receptor TRL4 pelo LPS, ocorre a ativação de vias inflamatórias,
especialmente a do NF-κB. O NF- κB ativado induz a fosforilação do IκB no
citosol, causando sua rápida degradação a partir da via ubiquitina-
proteassoma. Como resultado, o NF-κB ativado entra no núcleo e a
subunidade p65 fosforilada desencadeia a expressão gênica de iNOS, TNF,
IL-1β, IL-6, além de outros mediadores inflamatórios (TUCUREANU, et al.,
2017; NAEGELEN, et al., 2015).
Para certificarmos que o EMB das folhas de G. humilis não é citotóxico
para neutrófilos e fibroblastos, ensaios de viabilidade celular foram
realizados. Os resultados obtidos pela técnica de exclusão com azul de Tripan
demonstraram que o EMB das folhas de G. humilis não afeta a viabilidade
das células. O mesmo foi observado na técnica de redução do sal de
tetrazolium, onde as células permaneceram viáveis em relação ao grupo
controle (DMSO). Esses resultados foram importantes para a continuidade
dos ensaios in vitro.
Como já enfatizado no presente trabalho, a interação dos leucócitos
circulantes com o endotélio vascular é mediada por moléculas de adesão.
Deste modo, com o propósito de verificar o possível mecanismo envolvido
com a diminuição da migração celular observado no modelo de bolsa de ar,
foi realizada a análise da expressão das moléculas de adesão envolvidas na
migração de células, L-selectina e β2-integrina.
A partir dos dados obtidos por meio de citometria de fluxo é possível
verificar que o tratamento com o EMB de G. humilis altera a expressão de
CD62L. A CD62L é exclusivamente expressa na membrana de leucócitos e
medeia o comportamento de rolamento dos neutrófilos na parede do vaso.
Esta molécula de adesão se torna altamente expressa na membrana celular
quando ocorre alterações hemodinâmicas ou ativação de mediadores
inflamatórios. Após o processo de ativação, a CD62L é clivada pela ação de
metaloproteinases de membrana, permitindo a ativação da CD18 (β2-
81
integrina) (UCHIMURA; ROSEN, 2006). Os dados obtidos demonstraram
que neutrófilos tratados com o EMB de G. humilis possuem alterações na
expressão dos níveis de CD62L, essa alteração impediu que a CD62L fosse
clivada e posteriormente expressasse a CD18. Além disso, o tratamento de
neutrófilos com EMB de G. humilis reduziu a porcentagem de neutrófilos
positivos para CD18. A CD18 liga-se a diferentes componentes da membrana
celular e as moléculas de adesão da superfamília de imunoglobulinas
(ICAM1 e 2, VCAM-1 e PECAM-1) presentes no endotélio. A expressão
dessa molécula no endotélio quiescente é baixa, no entanto, durante um
processo inflamatório sua expressão torna-se aumentada, provendo a firme
adesão dos leucócitos no endotélio vascular para sua posterior migração para
o local afetado (HERTER; ZARBOCK, 2013).
Desta forma, é possível inferir que a diminuição da migração celular
pode, em parte, estar relacionado com as alterações observadas na expressão
das moléculas de adesão. Neste contexto, é possível que o EMB de G. humilis
permita que os leucócitos permaneçam em comportamento de “rolling” na
parede do vaso, mas impeça que haja a firme adesão desses leucócitos no
endotélio vascular para posterior transmigração e combate do agente lesivo
no tecido inflamado. Esse fato é bastante relevante, pois sabe-se que um
processo inflamatório exacerbado pode levar a danos teciduais (SAVILL et
al., 2002; PANTARELLI; WELCH, 2018).
Os leucócitos polimorfonucleares são dotados de mobilidade ativa,
característica que assume importância nas respostas do organismo a
infecções. Essa mobilidade ativa, quando induzida por um gradiente de
substância química, é chamada quimiotaxia (PETRI, et al., 2018). Visto que
durante o processo de transmigração, os leucócitos tornam-se hábeis à
responder a substâncias quimiotáxicas, como por exemplo o fMLP. Foi
proposto a análise da resposta quimiotática dos leucócitos frente a esse
agente.
O fMLP pode funcionar como padrões moleculares associados a danos
a partir da interação com o receptor FPR1 em neutrófilos, promovendo a
quimiotaxia dessas células em ambientes in vitro e in vivo (MCDONALD, et
al. 2010; ZHANG, et al. 2010). O ensaio de quimiotaxia foi feito pela técnica
de migração sob agarose, onde observou-se que as células tratadas com EMB
das folhas de G. humilis diminuíram a migração celular em direção ao fMLP.
O receptor de fMLP é membro da família de GPCRs, os quais
direcionam a polimerização de actina e contração da miosina, regulam
82
mudanças na morfologia celular e consequentemente o tráfego de leucócitos.
A diminuição de resposta frente a esse agente, dificulta a migração celular e
impede que células inflamatórias acumulem no local da lesão (MCDONALD,
et al. 2010).
Com o intuito de verificar se a redução dos níveis de citocinas e
quimiocinas observadas nos testes in vivo foi resultado de uma menor
migração ou se o extrato também foi capaz de interferir com a liberação das
mesmas pelos neutrófilos, foi avaliada a secreção de citocinas inflamatórias
em neutrófilos recrutados de camundongos. Os resultados obtidos in vitro
evidenciam que o EMB de G. humilis diminui IL-1β e IL-6, contudo não
reduz a secreção de TNF e CXCL1.
A diminuição dos níveis de IL-1β in vitro corrobora com os dados
obtidos in vivo. Entretanto, cabe ressaltar que a redução da mesma no
exsudato ocorreu de forma mais pronunciada, possivelmente potencializada
por uma menor migração celular. Como já mencionado, a IL-1β é um dos
mais importantes marcadores de indução da resposta inflamatória, associada
à infecção aguda. A diminuição dos níveis dessa citocina é importante para a
diminuição da migração celular e de produção de mais citocinas inflamatórias
(BARTEKOVA, et al., 2018).
A IL-6 é secretada por várias células, dentre elas os neutrófilos. Os
resultados obtidos no presente estudo evidenciaram que o EMB de G. humilis
atuou na redução da migração de neutrófilos, o que poderia resultar em uma
menor concentração de IL-6 no exsudato, entretanto, observou-se ao
contrário. Quando submetido ao teste in vitro, o extrato foi capaz de interferir
de modo expressivo na liberação de IL-6. Diante desses resultados
divergentes, acredita-se que a IL-6 presente no exsudato seja presente de
outros tipos celulares, como por exemplo macrófagos e até mesmo tecido
hepático (KURYSZKO, et al., 2016).
Apesar da concentração de IL-6 não ter diminuído in vivo, o EMB de G.
humilis foi capaz de reduzir de modo expressivo a produção de IL-6 pelos
neutrófilos. Uma hipótese para essa redução significativa seria a ação do
EMB de G. humilis em modificações pós-transcricional do mRNA de IL-6,
atuando nas enzimas Regnase-1 e Arid5a. A síntese de mRNA da IL-6 é
mediada pela ativação da via de sinalização do NF-κB. A regnase-1 promove
a degradação do mRNA da IL-6, enquanto a Arid5a inibe os efeitos da
regnase-1. O equilíbrio entre Arid5a e regnase-1 é importante para a
regulação do mRNA da IL-6, o desequilíbrio de ambas pode levar ao
83
desenvolvimento de processos inflamatórios. Sugere-se que o EMB de G.
humilis esteja inibindo a ação da Arid5a em neutrófilos e por isso os níveis
de IL-6 estão diminuídos in vitro (TANAKA, et al., 2017).
Em contrapartida, não foi evidenciada redução significativa nos níveis
de TNF e CXCL1 nos testes in vitro, dado este divergente dos experimentos
in vivo. O TNF é uma proteína de sinalização celular ubíqua produzida
principalmente por macrófagos, mas também por outras células, incluindo
leucócitos, células dendríticas, células musculares lisas, fibroblastos, células
endoteliais e epiteliais (BARTEKOVA, et al., 2018). A CXCL1 é uma
citocina quimiotática produzida durante a inflamação e é importante para
atrair células polimorfonucleares para o local inflamatório (SILVA, et al.,
2017). Sabendo que a secreção de TNF e CXCL1 pelos neutrófilos não foi
inibida pelo tratamento com EMB de G. humilis, é provável que esta inibição
observada in vivo seja decorrente da redução da migração celular, resultando
em uma menor concentração de TNF e CXCL1 no exsudato, sem interferir
com a produção dos mesmos pelos neutrófilos.
Durante o processo inflamatório, há uma estimulação excessiva da
atividade da NADPH oxidase por citocinas e outros agentes, que leva a
expressão da iNOS. A iNOS sintetiza o NO que tem um papel multifaceado
nas reações inflamatórias, desde o aumento da vasodilatação e a formação de
edema, por meio da regulação da atividade dos leucócitos, até a modulação
das terminações nervosas sensoriais e citotoxicidade tecidual (TRIPATHI, et
al., 2007).
O tratamento de neutrófilos com EMB de G. humilis foi capaz de reduzir
os níveis de NO. Esse dado corrobora com resultados obtidos no estudo
realizado por Chen et al. (2008) que demonstraram a atuação da G.
mangostana na diminuição dos níveis de NO por meio da redução da
expressão da iNOS. Pelo fato de o extrato poder estar interferindo com a
atividade do NF-κB, acredita-se que isso se reflita numa menor expressão de
iNOS (GELLER, et al., 1993; TRIPATHI, et al., 2007).
Para verificar a atividade da G. humilis sobre macrófagos e analisar
quais compostos específicos estão relacionados com a atividade anti-
inflamatória, foram avaliados os compostos friedelina, canofilol,
amentoflavona e 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifolina xantona em
macrófagos estimulados com LPS. Os macrófagos são células residentes que
após ativados, produzem uma ampla gama de citocinas, quimiocinas e
mediadores químicos que promovem a inflamação. O NO secretado pelos
84
macrófagos é um agente citotóxico pró-inflamatório importante que protege
o hospedeiro de vários patógenos, inativando e destruindo agentes
infecciosos. Contudo, a produção exacerbada pode lesar células saudáveis
vizinhas, sendo este mecanismo responsável pela maioria dos processos
inflamatórios e autoimunes (XUE, et al., 2018). Todos os compostos, exceto
o canofilol, foram capazes de diminuir a secreção de NO.
Estudo realizado por Li, et al. (2018) utilizando macrófagos RAW 264.7
estimulados com LPS e tratados com amentoflavona (50 µM) demonstrou
que, a amentoflavona é capaz de diminuir a secreção de NO e a fração EtOAc
contendo amentoflavona, foi capaz de reduzir a secreção de IL-6 e PGE2,
contudo não diminuiu os níveis de TNF. Colaborando com esses dados, Oh,
et al. (2013) também descreve a amentoflavona (100 e 200 µM) como
importante inibidor da secreção de NO e PGE2, além de diminuir a expressão
gênica de genes pró-inflamatórios como iNOS, TNF, COX-2 e IL-1β. Ambos
estudos corroboram, em parte, com os resultados obtidos no presente estudo,
sugerindo a amentoflavona como um importante composto para o potencial
anti-inflamatório da G. humilis. Em relação ao composto friedelina, embora
tenha diminuído os níveis de óxido nítrico, a literatura demonstra apenas seu
potencial anti-inflamatório, analgésico e antipirético em modelos in vivo
(PAULRAYER, A. et al., 2011).
O composto que apresentou melhores resultados de perfil anti-
inflamatório in vitro foi o 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbelidifolina xantona,
pois além de diminuir a secreção de óxido nítrico, foi capaz de reduzir os
níveis de TNF. As xantonas possuem diversas atividades comprovadas,
dentre elas destaca-se o caráter anti-inflamatório, principalmente a ação
inibitória sobre COX-2 e NF-κB (TIAN-YONG, et al., 2019; REN, et al.,
2019).
Dos sinais cardinais presentes no processo inflamatório, a dor é o
sintoma que mais causa desconforto e incapacidade aos indivíduos. A dor é
um problema de saúde pública que necessita da atenção dos pesquisadores
para a busca de fármacos mais eficazes e com efeitos adversos reduzidos, que
possam prover uma melhor qualidade de vida aos pacientes (WILLIAMS;
CRAIG, 2016).
Com base nos resultados previamente obtidos, também foi objetivo
deste estudo avaliar o efeito do EMB de G. humilis sobre o limiar mecânico
de retirada da pata no modelo de hipersensibilidade induzida por carragenina
em camundongos. O tratamento com o EMB de G. humilis, diminuiu a
85
frequência de resposta e aumentou o limiar mecânico dos animais
estimulados com carragenina.
Estudos realizados com o EMB das sementes da G. humilis e o
composto isolado Gutiferona A demonstraram ser ativos contra a dor em
modelos induzidos por formalina, capsaicina, glutamato e carragenina (DAL
MOLIN et al., 2012). Além disso, o gênero Garcinia, além de possuir
atividade anti-inflamatória, também possui importante atividade
antinociceptiva, incluindo as espécies G. gardneriana (CECHINEL FILHO,
et al., 2000), G. hanburyi (PANTHONG et al., 2007), G. kola (OLALEYE et
al., 2000) e G. mangostana (CHEN et al., 2008).
A composição química do EMB das folhas de G. humilis também pode
ser responsável pela atividade antinociceptiva. O flavonoide Gb-1a exerce
um pronunciado efeito antinociceptivo na nocicepção causada pela injeção
i.p. de ácido acético (BITTAR, et al., 2000), além disso este composto é capaz
de aumentar o limiar de dor em camundongos submetidos ao modelo de
artrite reumatoide (BADER et al., 2014; BUBA et al., 2016). O flavonoide
amentoflavona, possui atividade antinociceptiva já descrita no modelo de
contorção induzida pelo ácido acético (KIM, et al., 1998).
A ação pronociceptiva dos neutrófilos foi sugerida pela primeira vez há
quase 30 anos. Neste primeiro estudo, observou-se que os neutrófilos
presentes nas articulações de cães aumentaram a nocicepção articular
promovida pela administração de LPS (CASTRO; FERREIRA, 1979). Em
estudos subsequentes, Levine et al. (1984) mostraram que a
hipersensibilidade induzida pelo LTB4, C5a e o fMLP dependeram da
migração de neutrófilos.
Cunha e colaboradores (2008) também demonstraram que os neutrófilos
estão envolvidos na gênese da hipersensibilidade inflamatória, especialmente
na induzida por carragenina. Além disso, demonstraram que as ações dos
neutrófilos sobre a sensibilidade dolorosa não estão associadas à produção de
citocinas por células residentes, mas sim à produção de PGE2 pelos
neutrófilos. O que nos leva a concluir que o efeito do extrato sobre a migração
celular reflete numa menor sensibilização das terminações sensoriais.
Contudo, não se pode deixar de mencionar que em nosso estudo, a redução
da migração de neutrófilos impactou na redução dos níveis de citocinas,
diferente do observado por Cunha et al. (2008).
Considerando que os neutrófilos ativados produzem e liberam citocinas
inflamatórias como TNF, IL-1β e IL-6, e estas podem agir em receptores
86
presentes nos nociceptores periféricos e levar ao desencadeamento do
processo doloroso, a redução de TNF, IL-1β e CXCL1 mostrado no modelo
de bolsa de ar, exibido pelo tratamento in vivo com EMB de G. humilis, pode
contribuir para a redução da sensibilidade nociceptiva desencadeada por
estímulos mecânicos.
Ribeiro et al. (2000) sugerem que a cascata liberada pela carragenina
pode ser considerada bifásica, sendo que a primeira fase estaria sendo
desencadeada principalmente por citocinas (TNF, IL-1β e IL-8) e a segunda
fase pelo aumento de prostanóides e radicais livres. Sugere-se então, que o
EMB de G. humilis possa estar influenciando na fase aguda inflamação
gerada pela carragenina.
As quimiocinas não se restringem apenas à atividade quimiotática de
leucócitos; células gliais e neuronais também podem ser ativadas por
quimiocinas. A CXCL1 é uma das quimiocinas com papel significativo na
modulação da dor, que pode ser produzida tanto periférica quanto
centralmente. Os efeitos descritos da CXCL1 no desenvolvimento da dor
inflamatória ocorrem por meio da ativação de seu principal receptor cognato,
o receptor de quimiocina C-X-C tipo 2 (CXCR2), que é expresso pelos
neurônios do SNP e do SNC. A inflamação periférica induz a expressão de
CXCL1 e CXCR2 por esses tecidos, o que contribui para a neuroplasticidade
e sensibilização de nociceptores na dor patológica (CAO, et al., 2016;
SILVA, et al., 2017). A diminuição nos níveis de CXCL1 em camundongos
tratados com EMB de G. humilis contribui para a diminuição da
hipersensibilidade a dor no local inflamatório periférico.
Embora haja clareza na importância do neutrófilo na hipersensibilidade
inflamatória, ter somente a presença dessas células no foco inflamatório não
é suficiente para o seu surgimento. Estas células necessitam de ativação para
produzirem e liberarem mediadores químicos. Por exemplo, neutrófilos
recrutados pela metodologia do glicogênio de ostra não causaram
hipersensibilidade, mas quando os neutrófilos foram ativados com LPS e
C5a, o limiar foi reduzido (LEVINE, et al., 1985). Esses resultados reforçam
o papel do neutrófilo na dor inflamatória sugerindo que a modulação da sua
atividade possa constituir importante ferramenta para o tratamento de
doenças que envolvem processo inflamatório doloroso.
Com relação aos possíveis efeitos adversos investigados, os animais
tratados com o EMB de G. humilis não demonstraram alterações na atividade
locomotora, quando avaliados no teste do campo aberto. Esse resultado
87
permite sugerir que o extrato não afetou vias funcionais importantes no SNC,
o que possibilita uma resposta fidedigna no teste de von Frey.
Embora o EMB de G. humilis tenha demonstrado pronunciado efeito
sobre a inflamação aguda, bloqueando vias importantes para a migração
celular, estudos toxicológicos subsequentes fazem-se necessários para
confirmar a segurança terapêutica deste extrato.
88
89
7. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que o EMB de
G. humilis possui atividades anti-inflamatórias e antinociceptiva decorrente
da redução expressiva da migração de neutrófilos. Esse efeito envolve a
diminuição da expressão da molécula de adesão β2-integrina. A redução das
citocinas parece ser consequência da menor migração celular (Fig. 23). Em
conjunto, os dados obtidos permitem validar o uso popular da G. humilis para
o tratamento da inflamação, sugerindo sua aplicação terapêutica em reações
inflamatórias agudas.
Figura 23. Esquema representativo do mecanismo de ação anti-inflamatório
e antinociceptivo do EMB de G. humilis
Durante a resposta inflamatória células - especialmente neutrófilos - são recrutados para o tecido
lesado. Para atravessar o epitélio vascular é necessário a interação entre neutrófilos e moléculas
de adesão (CD62L e CD18). O EMB de G. humilis reduziu a migração de neutrófilos no exsudato
inflamatório induzido por carragenina, mas não alterou a exsudação de proteínas. Reduziu as
citocinas pró-inflamatórias TNF, IL-1β e CXCL1 in vivo. Reduziu as citocinas IL-1β, IL-6 e NO
in vitro, além de reduzir a expressão de CD18 que impede a firme adesão dos neutrófilos no
endotélio vascular para sua posterior migração para o tecido lesado. Em macrófagos, o EMB de
G. humilis e os compostos friedelina, canofilol, amentoflavona e 3-desmetil-2-geranil-4-
prenilbellidifolina xantona foram capazes de diminuir a secreção de NO, contudo somente o
composto 3-desmetil-2-geranil-4-prenilbellidifolina xantona foi capaz de diminuir a secreção de
TNF. Ainda o EMB de G. humilis mostrou reduzir a ação quimiotática. O extrato não apresentou
citotoxicidade e manteve os valores de viabilidade celular normais, tanto para fibroblastos
quanto para neutrófilos e macrófagos. Além disso, o EMB de G. humilis atua diminuindo a dor
90
inflamatória, reduzindo a frequência de resposta e aumentando o limiar mecânico de
camundongos quando estimulados por carragenina. Fonte: A autora, 2019.
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ANEXOS
ANEXO A – Parecer comitê de ética no uso de animais
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