Biossegurança na manipulação de microrganismos patogênicos

ao homem e animais

Erna Geessien KroonLaboratório de Vírus

ICB – UFMG

Como evitar a cadeia ?

Perigo

Acidente

Dano pessoal e materialPlantas, animais, homem,

meio ambiente

Biossegurança

A construção do conceito de biossegurança, teve seu inicio na

década de 70, quando a comunidade científica iniciou a discussão sobre os impactos da engenharia genética na

sociedade.

Riscos – Agentes Infecciosos

Probabilidade de dano ou doençaPatogenicidadeVia de transmissãoEstabilidade do agenteDose infectanteConcentraçãoOrigemProfilaxiaDeterminação dos níveis de Biossegurança para impedir o escape ao meio ambiente

Níveis de Biossegurança

NB-1 normas de biossegurança nível 1 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam baixo risco individual e para a comunidade (microrganismos que normalmente não causam doença em seres humanos ou animais de laboratório sadios).

NB-1 Equipamento de Segurança ( Barreira Primária)

Roupa protetora - avental e luvasPodem ser necessários: proteção facial proteção de ouvidos

Instalações (Barreiras Secundárias)•Pia para lavar as mãos •Superficies de fácil limpeza•Bancadas•Mobiliário robusto•Janelas teladas

NB-1Práticas microbiológicas

•Uso de pipetadores mecânicos (automáticos)•Lavar as mãos•Acesso restrito ou limitado quando estiver trabalhando•Proibição de comer, beber e fumar•Minimizar gotas e aerossóis •Descontaminar áreas de serviço diariamente•Descontaminar resíduos•Manutenção de programa de controle de insetos & roedores

Níveis de BiossegurançaNB-2 = normas de biossegurança nível 2 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam risco individual moderado e risco limitado para a comunidade (microrganismos capazes de causar doenças em seres humanos ou animais de laboratório sem apresentar risco grave ao trabalhador, comunidade ou ambiente. Tratamento efetivo e medidas preventivas disponíveis, risco de disseminação pequeno).

Práticas Microbiológicas•Luvas•Pipetas automáticas•Cuidados com objetos cortantes

NB-2

Instalação (Barreiras Secundárias)•Autoclave •Estação Lava Olho

Equipamento ( Barreira Primária)•Uso de capela classe II para agentes infecciososque formam aerossóis ou gotas•grandes volumes•altas concentrações

Como em NB-1 +

NB-2 Práticas Especiais•Descontaminar área de serviço •Relatar liberações e acidentes•Não ter animais no laboratório•Programas de imunização•Amostras de soro base•Precauções com agulhas e objetos cortantes•Usar plásticos quando possível•Não tocar em vidro cortado com as mãos

Equipamento de Segurança ( Barreiras Primárias)

• Capelas biológicas [NB-2/3] •Roupa protetora pessoal•Luvas •Gorros•Pipetadores automáticos•Proteção para olhos e face•Proteção respiratória [NB-3]

Cabine Segurança Biológica

Classe IIProteção para indíviduo e ambienteSuprimento e exaustão de ar por filtro HEPA IIA entrada de 75 lfpm e recircula 70% do ar IIB entrada de 100 lfpm e exaustão de 70% (B1) ou 100% ( B2)

HEPA - High Efficiency Particulate Air

Fluxo laminar

Níveis de Biossegurança

NB-3 = normas de biossegurança nível 3 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam elevado risco individual e risco limitado para a comunidade (normas para o trabalho com microrganismos que geralmente causam doenças em seres humanos e/ou animais, ou ainda resultam em sérias consequências econômicas, com risco pequeno de disseminação por contatos individuais, existindo tratamento antimicrobiano ou antiparasitário).

NB-3

NB-3

Níveis de Biossegurança

NB-4 = normas de biossegurança nível 4 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam elevado risco individual e elevado risco para a comunidade (normas para o trabalho com microrganismos que causam doenças graves ou são letais para seres humanos e animais, de transmissão fácil por contatos individuais casuais).

Desinfecção e esterilização

Antisséptico- inativa microrganismos ou inibe sua multiplicação. Aplicado em superfície de organismos.Desinfetante - inativa microrganismos ou inibe sua multiplicação. Não inativa os esporos. Aplicado em superfícies inertesEsterilização – destrói todos os microrganismos

Germicidas químicos

Hipoclorito de sódio 1a 5 g/l cloro – 1:50 a 1:10Formaldeído -5% carcinogênicoGlutaraldeído -20 g/l -2% (alcalino) Compostos fenólicosAmônio quaternário – cloreto benzalcônioAlcool – etanol ou 2 -propanolIodoPeróxido de hidrogenio – 3%

Esterilização

Calor Seco 1600C de 2 a 4 hCalor úmido – 15 minutos a 1210C 25 minutos a 1150CDeslocamento por gravidadePré-vacuoIncineração

AUTOCLAVE

Principais falhas humanas

limpeza incorreta ou deficiente dos materiais; utilização de invólucros inadequados para os artigos a serem esterilizados; confecção de pacotes muito grandes, pesados ou apertados; disposição inadequada dos pacotes na câmara; abertura muito rápida da porta ao término da esterilização; tempo de esterilização insuficiente; utilização de pacotes que saíram úmidos da autoclave; mistura de pacotes esterilizados e não esterilizados; não identificação da data de esterilização e data-limite de validade nos pacotes; desconhecimento ou despreparo da equipe para usar o equipamento.

Substituir o bico de Bunsen

Calor infra-vermelho 5-7 segundos a 815.6oC

Ou Bico de Bunsen protegido ou alças descartáveis

Transporte

Embalagem primária e secundária a prova de derramamentoAbsorvente entre primário e secundárioCada embalagem primária é embalada individualmenteIdentificação depois da embalagem secundáriaIdentificação de gelo seco

Transporte

Transporte de agente infeccioso

Recipientes pararecolher lixo

Depósito de vidro e plástico

Recipientes para objetos cortantes e vidro

Circulação de agentes infecciosos no meio ambiente

Doenças Emergentes e re-emergentes em humanos

75% de origem animalFatores predisponentesAlterações demográficasProdução animal intensivaTurismoComércioGuerrasDegradação Ambiental

Tecnologia do DNA recombinante

Métodos usados para construção e caracterização de moléculas de DNA recombinante. DNA Recombinante : DNA quimera de 2 espécies diferentes, usualmente a bacteriana, plasmidial ou viral contendo um gene de outra espécie.Engenharia Genética : Aplicação de técnicas de DNA recombinante

Plasmídeos

Produção de ovelha transgênica

Produção de proteínas de uso farmacêutico

Imunização de animais por meio da expressão transgênica de antígenos virais

Transferência in vivo (seta em laraja) Nesta estratégia os vetores contendo o gene "terapêutico" são colocados diretamente no tecido alvo.Transferência ex vivo (seta em azul) As células do paciente são removidas pelo médico. No laboratório, o gene "terapêutico" é adicionado às células que, em seguida, retornam para o paciente geneticamente corrigidas.

Transferência de genes para seres humanosEx-vivo

Gene terapêutico

In vivo

vetor

Células alteradas

vetores Células humanas

No Brasil - Lei de Biossegurança

11.105, 24 de março de 2005 Art. 1°

Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a

manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a

pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de

organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados ...

Da classificação de risco do OGM

Para a classificação de risco, deve-se também considerar:a) a possibilidade de recombinação de seqüências inseridas no OGM, levando à reconstituição completa e funcional de genomas de agentes infecciosos;b) outros processos que gerem um genoma infecciosos;c) genes que codifiquem substâncias tóxicas aos homens, aos animais, aos vegetais ou que causem efeitos adversos ao meio ambiente;d) genes de resistência a antibióticos de amplo uso clínico.

Resolução Normativa Nº 02

Os OGM serão classificados em quatro classes de risco, adotando-se como critérios o potencial patogênico dos organismos doador e receptor, a(s) seqüência(s) nucleotídica(s) transferida(s), a expressão desta(s) no organismo receptor, o OGM resultante e seus efeitos adversos à saúde humana e animal, aos vegetais e ao meio ambiente. Para genes que codificam produtos nocivos para a saúde humana e animal, aos vegetais e ao meio ambiente, o vetor utilizado deverá ter capacidade limitada para sobreviver fora do ambiente de contenção. Todo organismo geneticamente modificado deverá possuir um marcador capaz de identificá-lo dentre uma população da mesma espécie.

Resolução Normativa Nº 5, de 12 de março de 2008

Dispõe sobre normas para liberação comercial de Organismos Geneticamente Modificados e seus derivados.

SISTEMA DE BIOSSEGURANÇA DE OGM

CTNBio

CIBio

OERF

CNBS

Normas de Biossegurança e avaliação de risco

Manutenção da Biossegurança

Registro e Fiscalização

Sócio-econômica e interesse nacional

Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho De 2006

Art. 3º. A instituição que se dedique ao ensino, à pesquisa científica, ao desenvolvimento tecnológico e à produção industrial que utilize técnicas e métodos de engenharia genética ou realize pesquisas com Organismos Geneticamente Modificados (OGM) e seus derivados deverá criar uma Comissão Interna de Biossegurança (CIBio).§ 1º. A instituição de que trata o caput deste artigo indicará um técnico principal responsável para cada projeto específico.§ 2º. A instituição que pretender importar OGM e seus derivados para uso em atividades de pesquisa deverá instalar sua CIBio.§ 3º. As instituições devem reconhecer o papel legal das CIBios e sua autoridade e assegurar o suporte necessário para o cumprimento de suas obrigações, promover sua capacitação em biossegurança e implementar suas recomendações, garantindo que elas possam supervisionar as atividades com OGM e seus derivados.

Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho De 2006

Art. 12. A instituição de direito público ou privado que pretender realizar pesquisa em laboratório, regime de contenção ou campo, como parte do processo de obtenção de OGM ou de avaliação da biossegurança de OGM, o que engloba, no âmbito experimental, a construção, o cultivo, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a liberação no meio ambiente e o descarte de OGM, deverá requerer, junto à CTNBio, a emissão do

CQB.

Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho De 2006

Art. 13. As organizações públicas e privadas, nacionais e estrangeiras, financiadoras ou patrocinadoras de atividades ou ao ensino com manipulação de organismos vivos, à pesquisa científica e ao desenvolvimento tecnológico e à produção industrial, devem exigir a apresentação de CQB, sob pena de se tornarem co-responsáveis pelos eventuais efeitos decorrentes do descumprimento do Decreto nº 5.591, de 22 de novembro de 2005.

Parágrafo único. A instituição que pretender importar OGM e seus derivados para uso em atividades de pesquisa deverá requerer CQB.

Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006

Art. 14. O CQB será emitido pela CTNBio mediante requerimento da CIBio da instituição interessada, o qual deverá estar acompanhado da documentação que consta do Anexo desta Resolução Normativa.

Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006

V. para a emissão do CQB, a CTNBio considerará a competência e adequação do quadro funcional e a infra-estrutura disponível para os trabalhos com OGM e seus derivados.

Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006

Art. 15. O CQB será emitido para uma unidade operativa dentro de uma instituição, podendo ser esta unidade constituída por um ou mais laboratórios ou outro tipo de infra-estrutura de funcionamento.

Parágrafo único. A instituição, de acordo com suas necessidades, poderá requerer um ou mais CQBs.

Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006

Art. 16. Sempre que uma instituição detentora de CQB pretender alterar qualquer componente que possa modificar as condições aprovadas na emissão do CQB, sua CIBio deverá requerer revisão ou extensão de seu CQB junto à CTNBio.

Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006

Art. 19. A CTNBio poderá, conjuntamente com um ou mais órgãos e entidades de registro e fiscalização, realizar vistorias às instituições detentoras de CQB, devendo, com base nos seus resultados, manter, suspender ou cancelar o CQB da instituição vistoriada.

Parágrafo único. A critério da CTNBio e considerando as classes de risco do OGM e seus derivados, a emissão, revisão extensão, suspensão e cancelamento de CQB poderá depender de vistoria às instalações.

Liberações comerciais – Vacinas animais

Vacina Inativada Contra Circovirose Suína – Ingelvac Circoflex - Processo 01200.002191/2007-35

Vacina Inativada Contra Circovirose Suína – Suvaxyn PCV2 One Dose - Processo 01200.001967/2007-08

Vacina RECOMBITEK - vacina contra cinomose, hepatite, adenovirose, parvovirose, parainfluenza, coronavirose e leptospirose caninas - Processo 01200.000292/98-92.

Vacina VAXXITEK MD/IBD - uma vacina viva recombinante contra a doença de Marek e doença de Gumboro - Processo 01200.005090/2003-92.

Fluxo para OGM

Indicação CIBioCQBAprovação CQBSubmissão Projeto

NB-1 – pode ser CIBioNB-2 – CTNBio

Aprovação Identificação das áreas no LaboratórioTrabalho seguindo as normas

Impacto da tecnologia DNA recombinante

Genética Humana Mapeamento e clonagem de genes de doenças humanas

Diagnóstico de doenças genéticasDeterminação de paternidade

Terapia genética Estudo dos genomas inteiros

Biotecnologia MedicinaIndústria

Agricultura e Pecuária Produção de plantas e animais transgênicos

CRONOLOGIA DAS INOVAÇÕES NO DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS

Fonte: Lehman Brothers Pharmaceutical Research

*

Produção da insulinahumana em E.coli

Promotor bacterianoβ gal

AmpR

Cadeia A da insulina

Transformação em E.coli

Cultura de células

Purificação da proteína de fusão β gal-insulinaPurificação da proteína de fusão β gal-insulina

Região amino-terminal da cadeia B madura

β gal

Cadeia B da insulina

β gal

Cadeia A Cadeia B

Tratamento com BrCN

Peptídeos da β gal

Cadeia A Cadeia BPurificação das cadeias A e B

Re-enovelamento e oxidação das cisteínas

Insulina ativa

Ponte dissulfeto

Primeira proteína recombinante licenciada para uso terapêutico

Biotecnologia Verde

Plantas produzindo antígenos para vacinas: RaivaE. coli enterotoxigênicaVibrio choleraeHepatite BHIVMalaria

Biotecnologia Branca - Industrial

desenvolvimento sustentado

2010 – 20% da indústria químicaaplicará biotecnologia300 bilhões de dólares

Hoje apenas 2%

Exemplo de integração interdisciplinar – biocatálise, nanobiotecnologia,bioprocessamento e bioinformática

Biotecnologia branca -exemplo

Remoção de óleos e graxas das fibras de algodão – solução alcalina quenteUso de enzimas reduz em 60% de emissão de resíduos na água, 20% de redução de energia e 20% de redução de custos .

Biotecnologia branca

Requer desenvolvimento de novas enzimas, processos, produtos e aplicações. Metagenomica promete fornecer novas moléculasMas ........Sistemas de expressão são necessários para que cada nova enzima e molécula bioativa seja um sucesso econômico

O cupim é capaz de gerar 2 litros de hidrogenio da fermentação de uma folha de papel, sendo um dos reatores mais eficientes do mundo.Tem mais de 200 espécies de bactérias em seu intestino ajudando a explorar os potenciais metabolitos da lignocelulose.

Metagenômica

Metagenômica é a estratégia para isolar, sequenciar e caracterizar DNA extraidos de amostras do meio ambiente. Esses dados com as assinaturas de RNA 16S ribosomal é utilizado para determinar o perfil da comunidade microbiana

Biotecnologia Azul

Tecnologias que envolvam aplicação de métodos de biologia molecular a organaismos marinhos e de água doce

Antibióticos gerados de diatomáceas marinhas

Oceanos

Oceanos ocupam 70 % da superfície da terraProduz metade do oxigênio da terraMicrorganismos constituem 90 % da biomassa viva dos oceanosVírus matam 20% dessa biomassa por diaReservatórios inexplorados de diversidade genética da Terra

Oceanos

1 ml de água contem milhões de partículas viraisA abundancia é 15 vezes maior que de bactérias e archaebactérias55% da biomassa procariota

Biotecnologia Vermelha

Envolve uso de biotecnologia para processos biomédicos

Produção de ovelha transgênica

Produção de proteínas de uso farmacêutico

Imunização de animais por meio da expressão transgênica de antígenos virais

Biotecnologia Vermelha

Finalidades Médicas

Fonte: 2008 Survey, Biotechnology, New Medicines in Development, PhRMA

Fonte: 2008 Survey, Biotechnology, New Medicines in Development, PhRMA

Obrigada!