UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE UFFFaculdade de FarmciaDepartamento de Tecnologia Farmacutica

Relatrio de Tecnologia Enzimtica e das FermentaesCurva Padro e Curva de Crescimento de Saccaromyces cerevisiae

Professoras: Yanina M. A. Calvette Sorele B. Fiaux

Alunos: Gabriel Duarte (Turma KC) Fernanda Krajewski( Turma KC) Letcia F. de Castro (Turma KC) Mayara Nogueira Lara (Turma KC)

Niteri, 20 Maio de 2015.

1. Introduo

1.1 Saccharomicces cerevisiaeA Saccharomicces cerevisiae bastante empregada pelo homem, pode ser utilizada em indstrias de fermentao, alimentcia e de bebidas. As principais caractersticas que as tomam microrganismos interessante para processos industriais so: Desenvolvimento atravs de substrato barato e de fcil disponibilidade Facilidade de obteno e reproduo Utilizao de nutrientes em suas formas mais simples Possibilidade de cultivo independente do ambiente Pouca exigncia de gua e de espao (rea) Formao de produtos com valor nutritivoOutra vantagem do emprego de clulas da S. Cerevesiae sua fcil utilizao em procedimentos moleculares e seu completo sequenciamento gentico.1

1.1 Condies Ambientais Vrios fatores influenciam o cultivo da S. cerevisiae. O crescimento celular depende de fatores como pH, temperatura, componentes do meio de cultura e a disponibilidade de oxignio para a clula.2 As temperaturas timas para sua utilizao em processos industriais esto entre 25 e 35C e o pH timo entre 4,5 e 5,5. Fontes de carbono e nitrognio so muito importantes no crescimento desses microrganismos, o modo de aplicao e a seleo de fontes de carbono um dos fatores crticos dos processos fermentativos, pois muitos compostos, especialmente aucares, podem causar intensa represso catablica de sntese de vrias enzimas, alm da reduo na velocidade de crescimento. O estudo da agitao e da aerao em processos fermentativos tambm essencial, acredita-se que os objetivos principais so a disperso de bolhas de ar, com consequente suprimento de oxignio aos microrganismos, a manuteno das clulas em suspenso e o aumento da transferncia de calor e massa no meio. 2

1.2 Importncia para a industriaSaccharomyces cerevisiae se desenvolve tanto em condies aerbias como anaerbias. Em presena de oxignio, a levedura transforma a glicose em gs carbnico e gua, liberando uma quantidade de energia que ser utilizada no prprio metabolismo celular. Em ausncia de oxignio, a levedura fermenta transformando acar em gs carbnico e lcool e liberando uma quantidade menor de energia. Denominados respectivamente respirao e fermentao, estes processos so a base da produo de vrios alimentos e bebidas.3A levedura S. cerevisiae obtida nas destilarias, depois de usada como fermento para a obteno do lcool a partir da cana de aucar. Ela pode ser considerada como um residuo na produo do lcool. Na produo de bolos e pes, a S. cerevisiae transforma os acares disponveis na massa em lcool e gs carbnico, sendo este ltimo o responsvel pelo crescimento da massa. O termo "fermento biolgico" se aplica s culturas puras de Saccharomyces cerevisiae vendidas no comrcio, para conferir um sabor prprio e aumentar o volume e a porosidade de pes e outros produtos de confeitaria. No deve ser confundido com o fermento qumico (geralmente bicarbonato de sdio).3

1.2 Processos fermentativosEm termos gerais, o processo fermentativo se implica na utilizao de microrganismos para a obteno de um produto desejado atravs de matria orgnica (substrato) catalisada por enzimas.2Hoje em dia temos diversos produtos utilizados nas indstrias qumicas, farmacuticas e de alimentos que so obtidos por processos fermentativos. Estes produtos podem ser produzidos pelo metabolismo primrio (ex: etanol) ou secundrio (ex: antibiticos) do microrganismo cultivado e ao lado da produo de biomassa, enzimas e protenas em geral, eles so os responsveis pela evoluo tecnolgica e desenvolvimento das pesquisas na rea.Em termos industriais, portanto, aceita-se a denominao fermentao ou processo fermentativo para caracterizar qualquer transformao intermediada por um microrganismo atravs de uma sequncia de reaes bioqumicas. Assim, tambm so considerados processos fermentativos as transformaes envolvendo respirao microbiana, biossntese, fotossntese e respirao com substratos orgnicos.4

2. Objetivo: Elaborar as curvas padro e de crescimento utilizando a levedura Saccharomyces cerevisae por meio da tcnica de Densidade tica associada ao Peso Seco.

3. Material e Mtodos (Procedimentos)

3.1 Materiais para a curva padro

Bales volumtricos (10,0ml; 25,0ml; 50,0ml; 100,0ml); Pipetas volumtricas (1,0ml; 2,0ml; 5,0ml; 10,0ml); Pipetas Pasteur Erlenmeyers (100,0ml e 250,0ml); Cubetas de espectrofotmetro Espectrofotmetro Tubos de centrfuga Centrfuga Cpsulas de porcelana Estufa Balana

Composio do meio de cultura para curva padroO meio de cultivo foi preparado segundo as quantidades descritas abaixo:Acar cristal 10 g/LSulfato de amnio 5,0 g/LFosfato dicido de potssio 1,5 g/LExtrato de lvedo 5.0 g/LSulfato de magnsio 7.H2O 0,5 g/Lgua destilada q.s.p 1000 mL pH 6,03.2 Materiais para curva de crescimento

Balo de fundo chato de 2000 mL Filtro Tubo de exausto Tubo de coleta Compressor de ar Bico de Bunsen Pipeta Pasteur

Nota: O Balo de fundo chato de 2000 mL contm 1000 mL de meio de cultivo estril, adaptado a um filtro e um compressor de ar e um tubo de exausto que permite a sada de ar e tubo de coleta para retirada da amostra.

Composio do meio de cultura para curva de crescimento Acar cristal 10 g/L Sulfato de amnio 5,0 g/L Fosfato dicido de potssio 1,5 g/L Extrato de lvedo 5,0 g/L Sulfato de magnsio 7.H2O 0,5 g/L gua destilada q.s.p 1000 mL pH 6,0

3.3 Mtodos

3.3.1 Curva padroPara a obteno da suspenso de clulas do Saccharomyces cerevisae, realizou-se o cultivo de fermento biolgico, que foi crescido por cerca de 24h em 100 mL do meio de cultivo sob agitao a 30C.O preparo da suspenso me foi realizado dividindo-se em 2 tubos de centrfuga os 100 mL da suspenso de clulas obtida anteriormente (50 mL para cada tubo). Os tubos foram conduzidos centrfuga e submetidos centrifugao por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi retirado com o auxlio de Pipeta de Pasteur e em seguida as clulas foram ressuspendidas com gua destilada, repetindo o procedimento de centrifugao e remoo do sobrenadante por duas vezes. Aps este procedimento os resduos do tubo foram transferidos para um balo volumtrico de 100 mL e ele foi avolumado.Para a obteno da concentrao celular da suspenso me (Peso Seco) pesaram-se 2 cpsulas de porcelana vazias, e em seguida retirou-se 5 mL da suspenso me (em duplicata) e transferiu-se para as cpsulas previamente secas e taradas em uma estufa a 80C por 24h. Estas foram ento novamente secas nas mesmas condies, resfriadas e ento pesadas.Obteve-se o peso seco de massa celular pela diferena de peso entre as cpsulas cheia e vazias, dividida pela alquota de soluo me adicionada s cpsulas. O valor do peso seco foi expresso em grama por litro.Em seguida foram feitas 4 diluies, selecionadas arbitrariamente, de 1:25 1:35 1:50 1:100 1:200. Estas diluies foram feitas transferindo alquotas da suspenso me para bales volumtricos que foram avolumados com gua destilada.Leu-se a densidade tica atravs do espectrofotmetro, no comprimento de onda a 540nm. Como branco para calibrar o aparelho, utilizou-se gua destilada.

3.3.2 Curva de crescimentoO inculo foi preparado a partir do crescimento do Saccaromyces Cerevisiae em um erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultivo de mesma composio e meio de preparo da curva padro. O meio de cultivo estava sob condies asspticas. O inculo foi crescido por 16h a 30C e 180 rpm. Adicionou-se 100 mL do inculo em um balo de fundo chato de 2000 ml contendo 1000 ml do meio estril, com um filtro, compressor de ar e um tubo de exausto adaptados.Em intervalos de tempo regulares, foram retirados aproximadamente 5 mL em duplicata da suspenso pelo tubo de coleta.Aps a coleta, o volume foi marcado e centrifugou-se a amostra durante 10 inutos a 3500 rpm. Em seguida, lavou-se duas vezes o resduo de clulas com gua destilada, centrifugando a novamente.Ressuspendeu-se a amostra para o mesmo volume e em seguida, fez-se a leitura da densidade ptica pelo espectrofotmetro em 540 nm, utilizando gua destilada como branco.

4. Resultados4.1 Curva PadroGrupoCpsulaPeso da cpsula vazia (g)Peso da cpsula com S. cerevisiae (g)Massa de clulas secas (g)Mdia (g)

G2643,594543,60560,11100,1160

G2744,899044,91110,1210

Fez-se a mdia aritmtica dos pesos secos encontrados para as duas alquotas da suspenso-me e calculou-se a concentrao em g/L.

Tabela 1. Mdia aritmtica dos pesos secos

Peso clulas = 0,1160 g 0,1160g ------- 10 mL Xg ---------------1000mL X = 11,6 g/L de clulas

Para a construo da curva padro, realizaram-se diluies seriadas da soluo me e a densidade ptica de cada diluio foi medida pelo espectrofotmetro. Os valores de densidade tica das amostras diludas bem como os valores de peso seco para as respectivas diluies podem ser observados na tabela 2:

DiluioDensidade pticaFator de DiluioPeso Seco (g/L)

ABMdia

1:250,4020,4050,40350,040,464

1:350,3250,3230,3240,02860,331

1:500,1890,1880,18850,020,232

1:1000,0910,1000,09550,010,116

1:2000,0740,0720,0730,0050,058

Tabela 2. Tratamento de dados Curva padro

A partir dos dados da tabela 2, plota-se a curva padro que relaciona a densidade tica com o peso seco das clulas. Grfico 1: Curva padro DO x PS

Para esta curva temos: y= 0,8938 . x; Logo, DO = 0,8938 . PS

4.2 Curva de CrescimentoPara o clculo das concentraes da massa celular utilizaram-se as mdias dos valores de absorvncia obtidos experimentalmente para cada tempo de cultivo (em horas) e relacionaram-se estas s concentraes atravs da equao obtida a partir da curva padro: PS = DO / 0,8938, onde DO representa a densidade tica obtida experimentalmente e PS a concentrao da massa celular. Algumas amostras coletadas a partir do meio de cultivo tiveram sua massa celular diluda pois aps um determinado tempo de cultivo, o crescimento j havia sido grande o suficiente para prejudicar a leitura de densidade tica das amostras no espectrofotmetro.

Tabela 3. Dados para contruo da curva de crescimentoN pontoAluno ResponsvelHorrioTempo (h)DiluioDO 1DO 2Mdia DOPeso Seco (g/L)Peso Seco corrigido (g/L)ln PS

1Tatiane12:30000,4310,4560,44350,49620,4962-0,701

2Letcia13:090,651:50,1050,1040,10450,11690,5845-0,537

3Vitor14:051,581:50,1320,1560,1440,16110,8055-0,216

4Mayara15:052,581:50,1710,1690,1700,19020,951-0,050

5Fernanda16:153,741:50,2530,2480,25050,28031,40150,337

6Gabriel17:004,51:100,2380,2650,25150,28142,8141,035

7Carla18:005,51:12,50,3230,3270,3250,36364,5451,514

8Talita19:006,51:250,1730,1760,17450,19524,881,585

Com base nos dados da tabela 3, plota-se a curva de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae:

Grfico 2. Curva de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae. Plota-se ento a curva de crescimento linearizada a fim de identificar a fase exponencial do crescimento.

Grfico 3. Curva de crescimento linearizada da levedura Saccharomyces cerevisiae.

A partir do quarto ponto , observado que a curva adquire um carter exponencial, sendo estes pontos os que representam a fase exponencial de crescimento e os quais sero utilizados para obtermos os valores da taxa de crescimento espontneo () e o tempo de gerao (tg), tempo necessrio para duplicao da massa celular dessa levedura, para tanto plota-se a curva da fase exponencial de crescimento.

Grfico 3. Curva da fase exponencial de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae.Como, o R no satisfatrio, o segundo ponto desta curva est fora do padro, provavelmente por um erro na mensurao e com base em dados da literatura, onde possvel observar que em cerca de 3 horas de cultivo a levedura Saccharoymes cerevisiae se encontra na fase exponencial de crescimento, plota-se um grfico com a excluso do segundo ponto a fim de obter a taxa especfica de crescimento.

Grfico 4. Curva da fase exponencial de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae. Plota-se ento uma curva da fase exponencial de crescimento linearizada a fim de se obter a taxa especfica de crescimento () e o tempo de gerao (tg).

Grfico 5. Curva exponencial de crescimento linearizada da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Portanto, para esta curva, temos:y = 0,5583x 1,5989 ; onde y = ln PS e x = tempologo: Sendo o coeficiente angular da reta = 0,5583.

Conhecendo o valor de , podemos calcular o tempo de gerao (tg): h

Bibliografia: 1) RIO, D. T. Biossoro de Cdmio por leveduras Saccharomyces cerevisae. Piracicaba, 2004. 54p. Tese (Mestrado em Agronomia) Departamento de Microbiologia agrcola Universidade de So Paulo.2) NEVES, L. C. M. Reviso bibliogrfica. Disponvel em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08102006-175534/publico/RevisaoBibliografica.pdf Acesso em: 18 de maio de 2015.

3) MALAJOVICH M. A. Biotecnologia. Rio de Janeiro, Axcel Books do Brasil, 20044) BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L.; SERAFINI, L. A. Biotecnologia: avanos na agricultura e na agroindstria. Caxias do Sul RS: Editora EDUCS, 2002.

QUESTES 1 Calcule a concentrao celular do inoculo empregado no experimento executado objetivando a coleta de dados usados para construir a curva de crescimento.

2- Explique a importncia do inoculo ser constitudo de clulas em fase de crescimento exponencial.A fase Lag (latente) a fase de adaptao do microorganismo ao meio. Nesta fase no h crescimento microbiano e portanto uma fase sem interesse para as industrias. Sendo assim, procura-se um modo de eliminar ou reduzir o tempo desta fase. Logo, o inoculo sendo constitudo de clulas na fase exponencial, a fase Lag consegue ser reduzida.

3- A curva de crescimento resultante do trabalho corresponde uma curva de crescimento tpica, com todas as suas fases?Uma curva de crescimento tpica constituda de sete fases. So elas a fase lag (ou latente), fase de acelerao do crescimento, fase exponencial do crescimento, fase de desacelerao do crescimento, fase estacionria, fase da acelerao de morte e fase de morte. Observando o grfico correspondente curva de crescimento conseguimos observar a ausncia da fase lag, da fase estacionria, da fase da acelerao de morte e de morte. A fase lag (latente) a fase de adaptao do microorganismo ao meio e (taxa especfica de crescimento) igual zero. Notamos que essa fase no est presente em nosso grfico pois no primeiro intervalo de tempo j se nota o crescimento de microorganismos.A fase estacionria, onde =0, no apresenta crescimento microbiano e as fases de acelerao de morte ( 0;- Fase exponencial de crescimento - >> 0, constante e mximo;- Fase de desacelerao do crescimento - > 0.

4- Explique porque necessrio construir uma curva padro para cada microorganismo e justifique a necessidade de construir diferentes curvas padro para o mesmo microorganismo. necessrio construir uma curva padro para cada microorganismo pois cada um se desenvolve de uma diferente maneira, em condies diferentes, tornando a curva padro mais restrita. Assim, uma mudana de microorganismo ou parmetro de anlise, deve ocasionar uma mudana na curva padro, uma nova construo da mesma.

5- Variaes, como mudana de microorganismo, alterao de equipamentos (por exemplo, espectrofotmetro) e alteraes drsticas no meio de cultivo exigem a construes de novas curvas padres. Por qu? Quando alteramos qualquer parmetro devemos construir novas curvas padro. Isto acontece pois, a anlise estaria sendo baseada em dados que no correspondem aos que vo ser utilizados na anlise da amostra. A mudana de condies do meio e do prprio microorganismo altera o comportamento e o crescimento do microorganismo, a mudana nos equipamentos tem efeito na sensibilidade, alterando resultados e assim sendo necessrio construir uma nova curva padro com as novas condies.

6- O uso de curva peso seco versus densidade tica no indicada para a determinao de clulas viveis. Como poderamos construir uma curva padro que relacionasse a densidade tica concentrao de clulas viveis de um microorganismo?Um mtodo utilizado para clulas viveis o de contagem por plaqueamento. Nesta tcnica o inoculo espalhado por toda a extenso do meio solidificado com auxlio da ala Drigalski e pode ser usada para isolamento, contagem e identificao dda morfologia das colnias. Para a construo da curva padro seria necessrio inicialmente plaquear e incubar o inoculo e ento fazer a contagem das unidades formadoras de colnia de clulas viveis e ento, a partir deste dado seria possvel relacionar a densidade tica com a concentrao de clulas viveis.

7- Avalie e justifique os mtodos para confeco da curva padro e da curva de crescimento so viveis em escala industrial.Em escala industrial, o crescimento microbiano feito por processo batelada. A confeco de curva de crescimento e curva padro necessita que o processo seja interrompido, o que torna invivel. Durante o processo batelada, as condies devem ser mantidas para garantir a obteno do produto desejado.