ENZIMAS

• Substâncias orgânicas de estrutura complexa geradas no interior da célula

• aceleram reações químicas que ocorrem em sistemas biológicos.

• Podem ser encontradas em células animais ou de plantas, bem como em microorganismos.

• Quimicamente, são proteínas globulares constituídas de longas cadeias de aminoácidos unidas por ligações peptídicas

Cadeia com menos de 50 AA peptídeos.

Proteínas cadeias maiores

20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas:

ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL

Podem ter 4 tipos de estrutura

• Estrutura primária:

- mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molécula- é somente a seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial

• Estrutura secundária

- rotação das ligações entre os carbonos dos aminoácidos de seus grupamentos amina e carboxila.

Alfa-hélice:

- forma mais comum; - hélice em espiral - as cadeias laterais dos se distribuem para fora da hélice;- ponte H.

Folha beta ou folha pregueada.

- arranjados em paralelo ou no sentido anti-paralelo.

• Estrutura terciária

- resulta do enrolamento da hélice ou da folha pregueada, - estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes de enxofre,

- têm seqüências de aminoácidos diferentes, refletindo estruturas e funções diferentes,

- Forças fracas, podem ser facilmente quebradas – desnaturação

• Estrutura quaternária

- possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.- a estrutura tridimensional destas é a estrutura quaternária.- Ex: hemoglobina - sua estrutura é formada por quatro cadeias polipeptídicas

Estreita relação entre a estrutura da enzima e sua função:

• são altamente específicas

• somente certos substratos sofrem sua ação e unicamente um tipo de reação ocorre, sem reações colaterais ou produtos derivados,

• se sua estrutura mudar – não catalisa mais aquele substrato

Como isso ocorre?

O substrato liga-se à enzima através do sítio ativo, local onde ocorrerá a reação catalisada pela enzima.

SÍTIO ATIVO

• resíduos de aminoácidos capazes de interagir com o substrato e formação do produto.

• Estes resíduos denominam-se grupos catalíticos

Representação esquemática da estrutura tridimensional da lipase de

Pseudomonas cepacia.

Ser

His

Asp

Teoria da “chave-fechadura” proposta por Emil Fischer

O sítio ativo possui uma conformação cujos grupos ligantes R dos aminoácidos estão corretamente posicionados, e sua conformação é complementar a estrutura do substrato

Modelo do “encaixe induzido”, proposto por Koshland

o sítio ativo é uma região flexível cuja forma pode ser induzida para alojar compostos estruturalmente semelhantes.

Vantagens de utilizá-las como catalisadores:

aumentam de várias ordens de grandeza a velocidade das reações,

as reações ocorrem em condições suaves de temperatura, pressão, e em meio de pH e concentração salina praticamente constantes,

são altamente específicas e capazes de diferenciar estereoisômeros de certos compostos, sem formar subprodutos,

têm capacidade de regular processos,

como aceleram a velocidade da reação sem alterar o equilíbrio termodinâmico, elas podem catalisar um grande número de reações.

União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (UIBBM)

• classificadas em seis grandes grupos, de acordo com o tipo de reação envolvida

• Cada enzima descrita recebe um número de classificação, conhecido por “E.C.”, que é composto por 4 dígitos:

1. Classe 2. Sub-classe dentro da classe 3. grupos químicos específicos que participam da

reação. 4. a enzima, propriamente dita

Classificação das Enzimas - UIBBM

Classe Tipo de Reação Subclasse

Oxidoredutases Transferência de elétrons ou

remoção de hidrogênio

Hidrogenases, oxidases,

peroxidases, etc

Transferases Reações de transferência de

grupos

Transaldolases,

transcetolases, etc

Hidrolases Reações de hidrólise Estearases, lipases ,

peptidases, fosfatases, etc

Liases Reações de adição de grupos

a dupla ligação ou formação

de duplas ligações por

remoção de grupos

Descarboxilases,

cetoácidoliases, hidroliases, pectato liase

Isomerases Transferência de grupos

dentro da molécula para

produzir isômeros

Racemases, epimerases,

oxirredutases, mutase, etc

Ligases Formação e clivagem de

ligações C-O, C-S, C-C e C-

N e ésteres de fosfato

1

2

3

4

5

6

Exemplo:

Pectato Liase EC 4.2.2.2

liase

carbono-oxigênio liase

ativa em polissacarídeos

Pectato liase

EC 4.2.2.2

COFATORES ENZIMÁTICOS E COENZIMAS

Cofatores:

• um ou mais íons inorgânicos que podem ser necessários para a função de uma enzima. 

• não estão ligados permanentemente à molécula da enzima mas, na ausência deles, a enzima é inativa.

Coenzimas:

• compostos orgânicos, quase sempre derivados de vitaminas,

• a fração protéica de uma enzima, na ausência do seu cofator, é chamada de apoenzima.

• enzima + Cofator, chamamos de holoenzima.

IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS

As enzimas quando imobilizadas:

retém sua configuração estrutural devido as ligações de hidrogênio que ocorrem na superfície do material

dificuldade de vibração

Aumento da estabilidade térmica.

O principal interesse em imobilizar

uma enzima é obter um biocatalisador com

atividade e estabilidade que não sejam

afetadas durante o processo.

Vantagens da imobilização:

aumenta a estabilidade das enzimas,

baixo custo,

facilita a separação e recuperação das enzimas,

reutilização, possibilitando operações contínuas.

Tipos de Suporte

• materiais inertes com pouca ou nenhuma interferência no comportamento cinético da enzima.

• O suporte para ser efetivo na imobilização deve:

- deixar a enzima acessível aos substratos, - manter a atividade por um longo período- possibilitar a regeneração do sistema suporte/enzima ao final do processo, sem que ocorra a perda da atividade enzimática.

Exemplos de suportes inertes

Confinamento em matriz

• Polímeros naturais: gel de agar, caseinato de sódio

• Orgonogéis de microemulsão óleo-água, aerogéis de sílica.

Confinamento em microcápsula

• Gelatina, quitosana, alginato carragenana com cloreto de cálcio ou potássio

Ligações cruzadas

• Hexametilenodiamina e glutaraldeído

Ligações em suportes

• Adsorção física: álcool polivinílico (PVA), xantana, quitosana, galactomanana, poli-oxido de etileno (PEO), poli(ácido acrílico) (Carbopol), nylon 6.

• Adsorçção covalente: sílica, alumina, celulose, poli(etilenoglicol) (PEG), metoxi(polietilenoglicol)-p-nitrofenil carbonato.

• Adsorção iônica: resinas de troca iônica: DEAE-sefadex, carboximetilcelulose, Dowex 66, duolite 568N)

Sistema bifásico

Solvente orgânicoÁgua + enzima

Enzima

Métodos de Imobilização de Enzimas

Atividade Enzimática

Atividade biológica capacidade que as enzimas possuem de reagir com determinados constituintes das

células

irá depender da estrutura da proteína

As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas

O que importa não é a massa, mas a atividade

Proteínas desnaturadas

Conserva a massa protéica

Sem atividade catalítica

Dosagem: através da medida de sua atividade

Avaliada pela velocidade da reação que a enzima catalisa ([S] ou [P])

uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)

Pro

duto

µm

ol/m

L

velocidade constante

velocidade decresce

Tempo (min.)

Atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (velocidade constante)

A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades (U).

1 U é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por

minuto em condições ótimas

Métodos para a determinação da atividade de enzimas:

Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo.

Métodos para avaliar as [ ] das espécies:

• Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria...

• Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

Pectinase

1mL/L 0,1 mL

0,1 mL solução enzima +

0,9 mL: solução de pectina +

2mL DNS

Total = 4mL

Após 5 min dosa-se produto: 0,476 µmol/mL

0,476 µmol/mL em 5 min 0,0952 µmol/min

A = 0,0952 х 4mL х 1000 = 380,8 µmol mL-1min-1

A = 380,8 U/mL

Exemplo: Determinar a atividade de pectinase (quebra a pectina):

A velocidade das reações enzimáticas varia com diversos fatores:

• pH

• substrato

• concentração de enzima

• temperatura.

Valor de pH ótimo = atividade máxima;

Velocidade da reação : pH afasta do ótimo;

Influência do pH: dos grupos dissociáveis;

• Influência do pH

Um equilíbrio químico de um ácido fraco pode ser escrito como:

HA A- + H+

As concentrações de HA e de A- dependem do pH

pH HA A-

pH ótimo

concentração hidrogeniônica (H+) que leva a molécula de enzima à conformação ideal para exercer seu papel

catalítico

pH ótimo: determinado a partir de uma curva do efeito do pH na atividade enzimática

muitas enzimas apresentam uma curva indicando que não existe um único valor de pH ótimo, mas uma faixa de pH ótimo (6,0 a 8,5).

6 > pH > 8,5 = inativação irreversível.

RTekk

0

T velocidade de reação = energia cinética;

K é função crescente da T Lei de Arrhenius

• Influência da temperatura

Note que quanto maior a temperatura de, mais rápido é o processo de desnaturação térmica.

Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação;T desnaturação pouco acima da T ótima.

T muito elevadas = desnaturação da enzima

• Efeito da concentração do substrato na velocidade da reação

Cinética Enzimática