enzimas
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EnzimasTRANSCRIPT
08/09/2011
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BIOQUÍMICA
ENZIMAS
Prof. Dra. Ana Carolina S. Siquieroli
Instituto de Genética e Bioquímica
Conteúdo de Enzimas:
Conceito de catalisadores biológicos, substrato, sítio
ativo, co-fatores, coenzimas, vitaminas
Cinética enzimática: Equação de Michaelis-Menten,
conceito de Km, Vm, Kcat, Kcat/Km
Tipos de catálise enzimática
Inibidores enzimáticos
Regulação enzimática
BIOQUÍMICA I - MEDICINA
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Enzimas são um grupo desubstâncias orgânicas denatureza normalmente protéica* com atividade intra ouextracelular e que têm funçõescatalisadoras, catalisandoreações químicas que, sem asua presença, dificilmenteaconteceriam.
* RNAs também podem atuar como enzimas,chamadas ribozimas
Enzimas - Catalisadores Biológicos
Catalisador é toda e qualquer substância que
acelera uma reação, diminuindo a energia de
ativação, diminuindo a energia do complexo ativado,
sem ser consumido, durante o processo.
Um catalisador normalmente promove um caminho
(mecanismo) molecular diferente para a reação.
Enzimas - Catalisadores Biológicos
CO2 + H20
Energia
enzimas
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As enzimas promovem o abaixamento da energia de
ativação necessária para que se dê uma reação
química, resultando no aumento da velocidade da
reação e possibilitando o metabolismo dos seres
vivos.
A capacidade catalítica das enzimas torna-as
adequadas para aplicações industriais, como na
indústria farmacêutica ou na alimentar.
Enzimas - Catalisadores Biológicos
Apresentam uma eficiência catalítica extraordinária:
Tem um alto grau de especificidade por seu substrato
Aceleram as reações químicas de maneira formidável
Funcionam em soluções aquosas, sob condições muito
suaves de temperatura e ph.
ENZIMAS
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São fundamentais para qualquer processo biológico
Agindo em sequências organizadas elas:
catalizam centenas de reações sucessivas
pelas quais as moléculas nutrientes são degradadas,
a energia química é conservada e transformada
as macromoléculas biológicas são sintetizadas a partir
de moléculas precussoras livres.
Não são consumidas durante a reação
ENZIMAS
E E ++ SS EE ++ PP
ENZIMAS
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Importância prática:
Em algumas doenças ocorre uma deficiência ou mesmoausência total de uma ou mais enzimas
Ou até mesmo pode ocorrer excessiva atividade de umaenzima
Quantificação da atividade de algumas enzimas no plasma sanguíneo, eritrócitos ou amostras de tecidosão importantes no diagnóstico de várias doenças.
Muitas drogas exercem seu efeito biológico por meiode interações com as enzimas.
ENZIMAS
Fenilcetonúria: doença causada pela incapacidade
do organismo em produzir a enzima fenilananina-4-
monoxigenase, que converte o aminoácido
fenilalanina em tirosina.
Como resultado da falta da enzima, ocorre o acúmulo da
fenilalanina, que pode causar danos ao sistema nervoso.
Esse é um dos motivos pelos quais os fenilcetonúricos
devem ingerir quantidades mínimas do aminoácido
fenilananina
A doença pode ser detectada ainda cedo com a
realização do teste do pezinho.
ENZIMAS
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As enzimas foram descobertas no século XIX, por Pasteur, que
concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é
catalisada por fermentos. Ele postulou que esses fermentos eram
inseparáveis da estrutura das células vivas do levedo.
Em 1878, Wilhelm Kühne empregou pela primeira vez o termo
"enzima" para descrever este fermento,
Em 1897, Eduard Buchner descobriu que os extratos de levedo
podiam fermentar o açúcar até álcool e provou que as enzimas
envolvidas na fermentação continuavam funcionando mesmo
quando removidas das células vivas. Esta descoberta valeu-lhe o
premio Nobel de Química em 1907.
ENZIMAS - Histórico
Restava determinar qual a natureza das enzimas. Em 1926, James
B. Sumner purificou e cristalizou a urease, mostrando tratar-se de
uma proteína pura, e fez o mesmo, em 1937, para a catalase.
A prova final foi feita por Northrop e Stanley em 1930, com o
estudo de três enzimas digestivas, a pepsina, a tripsina e a
quimotripsina, pelo que receberam o Prémio Nobel da Química em
1946.
ENZIMAS - Histórico
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As enzimas são proteínas, e podem ter tamanhos
variados
A atividade das enzimas são determinadas pela sua
estrutura quaternária.
ENZIMAS - Estrutura
As enzimas exibem uma elevada especificidade
Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das
enzimas originou o modelo Chave-Fechadura, que
considera que a enzima possui sitio ativo
complementar ao substrato.
ENZIMAS – Modelo Chave-fechadura
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Em 1958, Daniel Koshland sugeriu uma modificação
ao modelo de chave-fechadura:
uma vez que as enzimas exibem estruturas flexíveis, elas
podem alterar a sua forma de maneira continuada
através de interações com o substrato, enquanto esse
mesmo substrato vai interagindo com a enzima.
ENZIMAS – Modelo de Encaixe Induzido
A maioria das enzimas são maiores do que o
substrato sobre o qual atuam, e só uma pequena
porção da enzima (cerca de 3-4 aminoácidos) está
envolvida na catálise.
A região que contém estes resíduos catalíticos, que
se liga-se ao substrato e que desempenha a reação,
é denominada de sítio ativo.
ENZIMAS - Estrutura
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sítio ativos, ou sítios catalíticos:
consistem basicamente em “encaixes”, onde se ligarão
sustâncias específicas chamadas substratos que são os
reagentes em uma reação biológica.
Note que o sítio ativo das enzimas geralmente é
específico para somente um tipo de substrato, liga-
se somente a ele, e não a várias outras moléculas
distintas
sítio ativo
Ligação de um substrato ao sítio ativo de uma enzima, devido à complementaridade entre ambos. STRYER, et al., 2002.
ENZIMAS - Estrutura
As enzimas também podem ter sítios onde se ligam co-fatores, que são necessários às reações catalíticas.
Várias enzimas consistem apenas da cadeia polipeptídica, todavia, outras requerem a ligação desses co-fatores para que possam funcionar (tornarem-se ativas) exercendo seu papel de catalisadoras biológicas.
O co-fator é então a porção não protéica da enzima. Nos casos em que há a necessidade de co-fatores, a parte protéica da enzima, inativa, é chamada apoenzima, e ao conjunto apoenzima mais o co-fator, sendo este conjunto ativo, dá-se o nome holoenzima.
ENZIMAS - Estrutura
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Estrutura Estrutura
EnzimáticaEnzimática
Apoenzima ou
Apoproteína
Holoenzima
Co-fatorProteína
Pode ser:
• íon inorgânico
• molécula orgânica
Coenzima
ENZIMAS
De forma geral, os co-fatores mais comum são:
Íons metálicos, como:
o Cu+2, Mg+2, Zn+2, Fe+2, Fe+3
Vitaminas.
Neste caso, quando o co-fator é outra molécula orgânica,
dá-se a ele o nome de coenzima.
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As coenzimas são pequenas moléculas que transportam grupos químicos de uma enzima para outra.
Alguns destes compostos químicos, como a riboflavina, a tiamina e o ácido fólico, são vitaminas, compostos que não são sintetizados no organismo e que têm de ser assimilados através da dieta.
Os grupos químicos transportados incluem o íon hidreto (H-) transportado pelo NAD ou NADP+, o grupo acetil transportado pela coenzima A, os grupos metil transportados pelo ácido fólico
As coenzimas sofrem regeneração e as suas concentrações são mantidas a um nível estável dentro da célula.
Por exemplo, o NADPH é regenerado através da via das pentoses-fosfato
ENZIMAS
Algumas enzimas também podem ter sítios de
ligações para pequenas moléculas, que são
produtos ou substratos, diretos ou indiretos, da
reação catalisada.
Estas ligações servem para aumentar ou diminuir a
atividade da enzima, providenciando um meio de
regulação por feedback.
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A atividade enzimática é influenciada por:
pH;
temperatura;
concentração das enzimas;
concentração dos substratos;
presença de inibidores.
ENZIMAS
Temperatura: o aumento da temperatura pode elevar
a velocidade da reação catalisada até certo ponto,
chamado de temperatura ótima para a ação da
enzima
Isso se deve ao fato de que aumenta o grau de agitação
das moléculas, e com isso, o número de colisões
eficazes entre elas, resultando em reações químicas.
A partir desse ponto, o aumento da temperatura
começa a desnaturar a enzima, sendo que a perda
da estrutura tridimensional faz com que ela perca
sua capacidade catalítica.
ENZIMAS
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ENZIMAS
pH: meios muito ácidos ou muito alcalinos também
podem afetar a atividade enzimática ao desnaturá-la.
De forma geral, as enzimas atuam em faixas de pH, o
chamado pH ótimo, de acordo com a localização celular
ou o órgão.
Fora da faixa de pH ótimo, a atividade da enzima decai
drasticamente.
Por exemplo, enzimas como a pepsina, presente no suco
gástrico, atuam em meios ácidos, ao passo que as enzimas
dos sucos pancreático e entérico atuam em meios alcalinos.
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ENZIMAS
vo
[S]
• Concentração dos substratos:
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Estudo dirigido 1.Diferencie catalisadores químicos e biológicos. Discutir as vantagens da presença
de enzimas nos seres vivos.
2. Defina sítio ativo (ou centro ativo) de uma enzima.
3. Qual é o significado do termo “saturação da enzima” e qual a sua relação com a
velocidade máxima?
4. O que são holoenzimas, apoenzimas, cofatores e coenzimas? Qual a relação entre
as vitaminas e as coenzimas?
5. Definir faixa de pH ótimo para a enzima.
6. Faça uma distinção entre os modelos chave-fechadura e ajuste-induzido para a
ligação do substrato a uma enzima.
A cinética enzimática analiza a velocidade da reação
e suas alterações
A concentração do substrato afeta a velocidade das
reações catalisadas por enzimas?
CINÉTICA ENZIMÁTICA
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
velo
cid
ade inic
ial V
o
[S]
Vmáx
½ Vmáx
Km
Efeito em Vo provocado pela
variação da concentração do
substrato [S] quando a
concentração da enzima é
mantida constante
Em altas concentrações de S,
Vo aumenta cada vez menos
em resposta aos aumentos da
[S].
Finalmente atinge-se um
patamar que é a Velocidade
máxima (Vmáx)
A combinação de uma enzima com o seu substrato
para formar o complexo ES é um passo obrigatório
na catálise enzimática:
Em uma segunda etapa lenta, o complexo ES se
quebra liberando a enzima livre e o produto da
reação:
Como esta etapa é mais lenta, ela limita a velocidade
da reação, ou seja a velocidade é proporcional a [ES]
CINÉTICA ENZIMÁTICA
K1
K2
K-1
K-2
E + S ES
ES E + P
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Em qualquer instante da reação enzimática existe:
Em baixas [S] a maior parte da ezima está na forma E
Desta maneira, a velocidade da reação será proporcional
a [S]
A Vmáx será atingida quando quando praticamente
todas as moléculas da enzima estiverem na forma ES
CINÉTICA ENZIMÁTICA
E livre: E E livre: E E ligada a S: ESE ligada a S: ES
Nestas condições a enzima está SATURADA com
seu substrato e a velocidade da reação não
aumenta mais com novos aumentos da [S].
Em seguida, o complexo ES transforma-se no
produto P e a enzima é liberada para catalisar a
transformação de outra molécula de substrato.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
ES E + PK2
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
velo
cid
ade inic
ial V
o
[S]
Vmáx
½ Vmáx
Km
A curva que expressa a
relação entre [S] e Vo tem a
forma de uma hipérbole
retangular
Que pode ser expressa
matematicamente pela
equação de Michaelis-Menten
Derivaram sua equação
partindo da hipótese básica
de que o passo limitante da
velocidade nas reações
enzimáticas seria a quebra do
complexo ES para formar P +
E livre
CINÉTICA ENZIMÁTICA
A equação de Michaelis-Menten:
Termos importantes:
[S] – concentração do substrato
Vo – velocidade inicial
Vmáx – velocidade máxima
Km – constante de Michaelis
K – constante de velocidade da reação
Vo = Vmáx[S]
Km + [S]
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Uma importante relação numérica emerge da
equação de Michaelis-Menten no caso especial em
que Vo é exatamente a metade de Vmáx:
Dividindo por Vmáx:
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Vmáx = Vmáx[S]
2 Km + [S]
1 = [S]
2 Km + [S] Km + [S] = 2 [S]
Km = [S] quando Vo = ½ Vmáx
CINÉTICA ENZIMÁTICA
velo
cid
ade inic
ial V
o
[S]
Vmáx
½ Vmáx
Km
Isto representa uma definição prática e muito útil para Km –
constante de Michaelis
O Km é equivalente à concentração do substrato onde Vo é igual
à metade de Vmáx
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Kcat também é chamada de número de renovação e
é equivalente ao número de moléculas do substrato
convertidas em produto por uma única molécula da
enzima, em uma dada unidade de tempo, quando a
enzima está saturada pelo substrato.
Os parâmetros Kcat e Km, em conjunto permitem avaliar a eficiência
catalítica das enzimas
Deve-se analisar a relação Kcat/Km para as duas reações , também
denominada constante específica
Relação Kcat/Km fornece uma boa noção quanto à eficiência
catalítica da enzima, uma vez que relaciona a “rapidez da enzima”
com sua afinidade pelo substrato.
Em termos práticos, quanto maior o valor da relação Kcat/Km maior
será a eficiência catalítica.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Vo = Kcat
Km
[Et] [S]
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Catálise ácido-base geral:
Refere-se a transferência de prótons mediadas por outra
classe de moléculas
Catálise covalente:
É formada uma ligação covalente transitória entre a
enzima e o substrato
Catálise por íons metálicos:
Metais firmemente ligados à molécula da enzima
participam na catálise
TIPOS DE CATÁLISE
A atividade enzimática pode ser reduzida por grande
número de substâncias – inibidores
Os inibidores podem ser constituintes normais das
células ou substâncias estranhas ao organismo
Sua presença provoca alterações significativas no
metabolismo – reguladores importantes
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
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Clínica:
A possibilidade de inibir reações enzimáticas é um
campo aberto para aplicações farmacológicas
Muitos medicamentos utilizam-se deste princípio
Ex: sulfonamidas – no combate a infecções bacterianas
Inibição de uma enzima bacteriana
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
Meio ambiente:
Combate a insetos
Inibidores enzimáticos
Acetilcolinesterases – inibidores de acetilcolina (SN)
Detritos industriais
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
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INIBIDORES ENZIMÁTICOS
Inibidores EnzimáticosInibidores Enzimáticos
IrreversíveisIrreversíveis ReversíveisReversíveis
Competitivos Não-competitivos
Reagem quimicamente com as enzimas, levando a
uma inativação praticamente definitiva
Tóxico para os organismos:
Devido à sua irreversibilidade da sua ligação às enzimas
Devido à sua inespecificidade
Ligam-se aos aminoácido serina ou cisteína, frequentes na
estrutura de quase todas as proteínas – portanto capaz de
inativar qualquer enzima
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
IrreversíveisIrreversíveis
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Clínica:
Inibidores irreversíveis com propriedades
terapêuticas:
Aspirina (ácido acetil-salicílico) – antiinflamatório,
antipirético e analgésico
Inibe uma enzima da via de síntese da prostaglandinas e
consequentemente ocorre uma atenuação de reações
inflamatórias
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
Competem com o substrato pelo mesmo centroativo da enzima
Certas moléculas por apresentarem configuraçãoespacial semelhante à do substrato, são capazes de ligarem-se ao centro ativo da enzima
E formarem um complexo enzima-inibidor, semelhante aocomplexo enzima-substrato (ES)
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
ReversíveisReversíveis
Competitivos
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Quando uma molécula de enzima é liberada, irá se associar a novas moléculas de inibidores ou de substrato
com uma probabilidade que dependerá de suasconcentrações relativas
e das afinidades relativas entre a enzima e o substrato e a enzima e o inibidor
Inibidores competitivos: muda o Km, mas não interfere na Vmax.
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
E + Ic EIc
Clínica:
Os inibidores competitivos tem largo emprego
terapêutico:
AZT – inibidor de DNA polimerase (transcriptase reversa)
– necessária para a replicação do vírus HIV
Quimioterapia de tumores
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
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Não possuem qualquer semelhança estrutural com o substrato da reação que inibem
Seu efeito é provocado pela ligação à radicais que nãopertencem ao centro catalítico da enzima
Esta ligação altera a estrutura enzimática a tal ponto queinvibializa a catálise
Se ligam a cadeia lateral de um aminoácido de forma bastante inespecífica
ReversíveisReversíveis
Não-competitivos
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
São exemplos de inibidores não competitivo:
Metais pesados como Hg2+, Pb2+ e Ag+ que reagem
com o grupo SH das proteínas
Como são pouco específicos, a ingestão direta ou
indireta (alimentação) é extremamente tóxica
Inibidores não-competitivos: muda o Vmax, mas não
interfere no Km.
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
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Mecanismos:
1. Controle da disponibilidade de enzimas
Exercido sobre as velocidades de síntese e degradação das enzimas, que determinam sua concentração celular
2. Controle da atividade da enzima
Efetuado por mudanças estruturais da molécula enzimática, provocada pela ligação de compostos ou grupos à cadeiapolipeptídica e que modificam a velocidade de catálise Regulação alostérica – ligação não covalente
Modificação covalente – ligação covalente
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA
O alvo da regulação alostérica e covalente são
certas enzimas-chave
Presentes nas vias metabólicas – enzimas
reguladoras:
Determinam a velocidade de toda a sequência de
reações da qual participa
Pois catalisa a reação mais lenta ou a reação limitante da
velocidade
Em muitos sistemas multienzimáticos, a primeira enzima
da sequência é uma enzima reguladora
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA
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Existem duas classes de enzimas reguladoras:
As enzimas alostéricas:
Funcionam por meio da ligação não-covalente reversíveis de compostos reguladores chamados reguladores alostéricos
Geralmente são pequenos metabólicos ou co-fatores
As enzimas reguladas por uma modificação covalentereversíveis
Ambas as classes apresentam subunidades múltiplas
Sítios catalíticos e sítios reguladores estão emsubunidades separadas
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA
Certas enzimas, cujo local de ação é extracelular(plasma, trato digestivo)
São sintetizadas na forma de precussores inativos –zimogênios
Para se tornar ativo é necessário que ocorra a hidólise de determinadas ligações peptídicas
Adquirem outra conformação - ativos
ZimogênioZimogênio
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA
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Pepsinogênio – origina a pepsina na cavidade
gástrica pela remoçào de 42 aa, sob a ação de íons
H+
Tripsinogênio e quimotripsinogênio, de origem
pancreática são transformados em tripsina e
quimotripsina no intestino delgado
REGULAÇÃO ENZIMÁTICA
Estudo dirigido 1. Numa reação enzimática, todo o sítio ativo está saturado com moléculas de
substrato em concentração 10 mM. O que acontece com a velocidade da reação
quando a concentração de substrato for 30 mM?
2. Escrever a equação de Michaelis-Menten e substituir V0 por ½ Vmax e definir o Km.
3. A hexoquinase é uma enzima que catalisa a reação de fosforilação da glicose e da
frutose no carbono 6, com valores de Km de 0,05 mM e 1,5 mM, respectivamente.
Qual é o substrato que a hexoquinase apresenta maior afinidade?
4. Uma enzima foi testada frente a 3 diferentes substratos (A, B e C). Com base nos
parâmetros cinéticos encontrados (tabela a baixo), qual foi o substrato que a enzima
transformou com maior eficiência?
5. Diferencie inibidores competitivos de inibidores não competitivos. Na prática, como
é possível distingui-los?
6. Explique o mecanismo de controle por ativação de zimogênios. Muitas enzimas
pancreáticas, como a tripsina e quimotripsina, são secretadas na forma de
tripsinogênio e quimotripsinogênio. O que aconteceria com o pâncreas caso esses
enzimas não fossem secretadas na forma de zimogênios?
Substrato Km (mM) Kcat (seg-1
) Kcat/Km (mM-1
seg-1
)
A 15 0,14
B 30 0,06
C 25 2,80