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Inhibidor: Cualquier sustancia que reduce la velocidad de una reacción enzimática: toxinas, análogos de sustratos, drogas, metales

•  Mecanismos Regulatorios de las células •  Estudio de vias metabólicas •  Diagnóstico •  Estudio de la estructura, especificidad y mecanismo cinético •  Terapeútica

Cinética enzimática Inhibidores Irreversibles Reversibles:

Competitivo, no competitivo puro, mixto y parcial, incompetitivo

¿Qué es un inhibidor?

¿Para qué nos sirven los inhibidores?

Inhibidores Irreversibles •  Tambien se denominan inactivadores (Silverman. Methods in Enzymology 1995; 249: 240-283) •  Se unen fuertemente a la enzima, por lo general formando enlaces covalentes •  La disociación del complejo E-I es muy lenta, por lo que la E tarda en recuperar su actividad, no significa que nunca la recupera •  Diálisis o filtración por exclusión molecular no restaura la actividad enzimática, si el enlace es covalente

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Clasificación de Inhibidores reversibles

Clase de inh Relación entre E e I

Vel Equil E, I y E-I

clásico It>>Et rápido

Unión fuerte Tight-binding

It~=Et rápido

Unión lenta It>>Et lenta

Unión lenta fuerte Slow tight binding

It~=Et lenta

Tomado de Morrison TIBS 1982, 102-105

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Inhibición reversible clásica

Vi=0 Vi≠ 0

Inhibición Completa Inhibición Parcial

Competitivo No competitivo Incompetitivo

I=P

Inhibición por producto

NC mixta NC pura

I=S

Inhibición por sustrato

P Competitivo P No competitivo P Incompetitivo

PNC mixta PNC pura

Inhibidores Reversibles Clásicos

Se unen reversiblemente a la E (pueden ser facilmente removidos), al complejo E-S o a ambos. Cuando el inhibidor es removido, la E recupera su actividad

•  Inhibición Competitiva •  Inhibición No competitiva •  Inhibición Incompetitiva

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[E]t = [E] + [EI] + [ES] (1) Aproximación del estado estacionario para [ES] d[ES]/dt= k1[E][S] – [ES](k2+k3)= 0 (2) [E]= Km [ES]/[S] (3)

Ki= [E][I]/[EI] >>>>> [EI]= [E][I]/Ki= Km[ES][I]/[S]Ki (4) Sustituyendo 4 y 3 en 1 [E]t= Km [ES]/[S] + Km[ES][I]/[S]Ki +[ES]= [ES] (Km/[S](1+[I]/Ki) + 1) (5) [ES]= [E] t[S]/ Km(1+[I]/Ki) + [S] (6) v= k3[ES] = k3 [E] t[S]/ Km(1+[I]/Ki) + [S] v = Vmax [S]/ Km(1+[I]/Ki) + [S] (7) 1/v= Km/Vmax (1+[I]/Ki) 1/[S] + 1/Vmax

Pendiente = Km/ Vmax + (Km/Vmax Ki) [I]

Inhibición Competitiva

Inhibición Competitiva

v= Vmax [S]/ Km (1+ [I]/Ki) + [S]

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Gráficos secundarios de la gráfica de dobles recíprocos

Pendiente= Km/Vmax (1+[I]/Ki)

Km

app/

Vmax

[I]

[I]

Intercepto = Kmapp= Km/Ki [I] + Km

Km/Vmax

-Ki

-Ki

Km

app

Km

Km/Ki

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[E]t = [E] + [EI] + [ES] + [ESI] (8) Aproximación del estado estacionario para [ES] d[ES]/dt= k1[E][S] – [ES](k2+k3)= 0 (2) [E]= Km [ES]/[S] (3)

Ki= [E][I]/[EI]= [ES][I]/[ESI] (9) > [EI]= [E][I]/Ki= Km[ES][I]/[S]Ki (4) Sustituyendo 9 y 3 en 8 [E]t= Km [ES]/[S] + Km[ES][I]/[S]Ki +[ES] + [ES][I]/Ki = [ES] (KmKi + [S]Ki + Km[I] +[I][S])/[S]Ki (10) [ES]= [E] t[S]/ (1+[I]/Ki)(Km + [S]) (11) v= k3[ES] = k3 [E] t[S]/ (1+[I]/Ki) (Km+ [S]) v = (Vmax/ 1+[I]/Ki) [S]/ Km + [S] (12)

1/v= Km/Vmax (1+[I]/Ki) 1/[S] + 1/Vmax (1+[I]/Ki)

Pendiente = Km/ Vmax + (Km/Vmax Ki) [I] Intercepto = 1/ Vmax + [I] /VmaxKi)

Inhibición No Competitiva

Inhibición No Competitiva

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Vmax

Et

Control

No comp

Irreversible

Comparación de inhibición no competitiva reversible e inhibición irreversible

Inhibición No Competitiva Mixta

Se afectan los valores de Vmax y Km Disminuye afinidad del S por el EI

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Inhibición incompetitiva

V= Vmax [S] Km + [S] (1+ [I]/Ki)

Inhibición incompetitiva

S/v

v 0

+I

-I Pendiente= 1/v

Pendiente=!/v (1+[I]/Ki)

Gráfica de Hanes

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Inhibidores de unión fuerte La [EI] no es despreciablemente pequeña comparada con [It] La [I] libre no es igual a la [It] añadida No se asume el estado estacionario [Et]~[I] Importancia como agentes quimioterapéuticos, herbicidas, anticoagulantes

v

Et

I1 I2 I3

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Reglas de Cleland para interpretar gráficos de inhibición

1.  El intercepto en 1/v se afecta por sustancias que se asocian reversiblemente con una forma de la enzima diferente de aquella con la que se asocia el sustrato

2.  La pendiente se afecta por sustancia que se asocian con una forma de la enzima que sea la misma o al menos esté conectada por pasos reversibles, con aquella con la cual se asocia el sustrato

La regla 1 aplica para inhibiciones incompetitivas La regla 2 aplica para inhibiciones competitivas Ambas reglas aplican en inhibiciones no competitivas

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Con los siguientes datos:

1. Haga una gráfica de dobles

recíprocos.

2. Haga una gráfica lineal directa

3. Haga una gráfica [S]/v vs [S]

4. Calcule en cada caso Km y Vmax y

compare

5. Diga que tipo de inhibición se

presenta en A y en B

A

B