eletroforese capilar e cromatografia líquida - ufjf.br · 30/05/2012 2 principio da separação em...
TRANSCRIPT
30/05/2012
1
Eletroforese capilar e
Cromatografia Líquida
Prof. Rafael SousaDepartamento de Química - ICE
Notas de aula: www.ufjf.br/baccan
Analítica V: 1S2012
Eletroforese Capilar (EC)
TÉCNICA ELETROANALÍTICA
HISTÓRICOCriada por Arne Tiselius para estudar proteínasem soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948)
APLICAÇÕESCompostos orgânicos e inorgânicosMacromoléculas (DNA e RNA)
Introduzida como técnica instrumental (1981): ECJorgenson e Lukacs
EC - Técnica instrumental
Capilar preenchido com uma solução tampãoimerso em recipientes contendo o mesmo tampão (potencial)
Amostra é depositada na extremidade do capilar oposta ao detectorVoltagens de 5 – 60 kV
Correntes de 10 – 100 mA (FEO)
Detector espectrofotométrico de UV-Vis
EC: Na Prática
OBS: Esta animação é uma cortesia do Prof Marcone Leal (DQ-UFJF)
30/05/2012
2
Principio da separação em eletroforese
Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando aplicadouma ddp entre as extremidades do capilar
ν = µe E µe ���� mobilidade eletroforéticaE ���� força do campo elétrico (POTENCIAL/DISTÂNCIA)
�Altos potenciais ���� velocidade de migração elevada ���� separação rápida
EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO: NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N)
µe VN = D ���� coeficiente de difusão (cm2 s-1)
2D
N é geralmente superior àqueles conseguidos em CLAE !
Fluxo eletroosmótico (FEO)
Dependente do pH (geralmente acima de 3): ionização dos grupos silanóis
�Velocidade de fluxo uniforme esem pressão (em contrário à CLAE)
�Atua como uma “bomba”
� Não favorece o alargamento de pico
Instrumentação
Eletrodos de Pt
(4 – 5 µL)
Introdução da amostra
Volumes de 10 a 100 nL são introduzidos no capilar
Favorece a injeção de uma quantidademaior dos íons de maior mobilidade
Não
fun
cio
na
qu
and
o s
e en
che
o c
apila
r co
m g
el capilar
Det
ecto
r
pressão vácuo
eletrocinéticosifonamento
capilar
capilar
capilar
Reservatório de eletrólito
Detector
DetectorDetector
amostraamostra
amostra amostra
Reservatório de eletrólito
30/05/2012
3
Capilares
Comprimento de 25 – 100 cm
Diâmetro interno de 10 – 100 µm
� Vidro� Teflon (não usado com as voltagens mais elevadas)
� Sílica fundida
A superfície interna pode ser quimicamente modificada
O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido (repetibilidade)
Detector
���� Responde à passagem das espécies “on-column”(Cada espécie apresenta um tempo de passagem diferente)
���� VÁRIOS TIPOS de detectores PODEM SER USADOS
Mais comum: Espectrofotométrico no UV-Vis� caráter “universal”
Outros exemplos:- Fluorescência induzida por laser
- Amperométricos, condutométricos(precisam ser devidamente isolados, eletricamente, do capilar)
Acoplamento com outras técnicas- Espectrometria de massas (informações estruturais das moléculas)
Sinal analíticoEletroferograma: resposta em função do tempo
- Cátions migram mais rápido
- Compostos neutros (em uma única “zona”) seguem o FEO (cetonas)
- Ânions migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)
� Diferença na mobilidade dos solutos
Fatores que afetam o sinal
� Aquecimento Joule
A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar � CAUSA alargamento dos picos
PARA EVITAR: - Usar voltagem e tampão em conc. adequadas
� Comprimento de “injeção”Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois ajanela de detecção é da ordem de 0,1 mm� CAUSA alargamento dos picos
PARA EVITAR:- Usar um solvente com força iônica menor que a do tampão
(para que a corrente atua mais sobre os analitos, que chegarão mais
rápido na outra extremidade da coluna)
30/05/2012
4
Análise quali e quantitativa
���� Necessidade de calibração
Compara-se a respostade PADRÕES e AMOSTRAS nas mesmas condições
� Respostas (nos tempos de migração correspondentes):
- Áreas dos picos (de espectros UV-Vis, p. ex)
- Construção de curvas de calibração
Análise quali e quantitativa
Exemplo de resultado
Modos de separação por eletroforese
- Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)
- Eletroforese capilar em gel (ECG)
- Isotacoforese capilar (IC)
- Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM)
- Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)
Modos de separação por eletroforese
• Eletroforese capilar em solução livre (ECSL)
� Baseada nas diferenças das velocidades de migração deespécies iônicas em um dado tampão
� Não serve para espécies neutras(a menos que sejam derivatizadas)
• Eletroforese capilar em gel (ECG)
� O capilar é preenchido por um gel com tamanho de poroapropriado
� Macromoléculas como DNA podem ser separadas em funçãodo tamanho
(menores ficam menos retidas, ao contrário da CE)� Também não ocorre separação das espécies neutras
Moléculade DNA
30/05/2012
5
Eletroforese capilar em gel (ECG)
Modos de separação por eletroforese
• Isotacoforese capilar (IC)
� Em um dos tampões: íons com alta mobilidade (dianteiros)- localizado próximo ao detector
� No outro: íons com baixa mobilidade (terminadores)
- componentes da amostra se separam em zonas(de acordo com a sua mobilidade)
- todas essas zonas se movem com a mesma velocidade- Na quantificação se mede os comprimentos das zonas
• Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)
� Substâncias anfóteras (proteínas) ficam focalizadas em umadada região do capilar devido a um gradiente de pH
� Utiliza-se uma mistura de anfólitos* para dissolver a amostra
� O cátodo é mantido em pH alto e o ânodo em pH baixo
* ács. poliméricos sintéticos
Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)
“A”, “B” e “C” ficam“focalizadas” na região de
pH que corresponde aoseu ponto isoelétrico
30/05/2012
6
• Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM) – técnica híbrida
� Utiliza-se eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantesa ponto de formarem micelas (carga neg.)
� Espécies positivas movem-se mais lentamente� Espécies neutras sofrem partição entre as micelas e a fase
aquosa do tampão (migração intermediária)� Espécies negativas são repelidas pelas micelas e migram mais
rapidamente
���� VANTAGEM SOBRE CLL:Maior eficiência de separação
Vantagens e desvantagens
VANTAGENS:
� Elevada frequencia analítica (rapidez)� Versatilidade� Baixo custo
- Baixo consumo de amostras, reagentes e solventes� Desempenho analítico satisfatório
- Excelentes separações e resoluções� Possibilidade detecção on line
DESVANTAGENS:
� Não se aplica a todos os tipos de compostos, como:- Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar
(adequados para CG)- Polímeros iônicos de massa molar alta
Referências
Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.Principles of Instrumental Analysis
5th ed., Saunders College Publishing, 1998
Harris, D. C.Análise Química Quantitativa
7a ed., LTC – Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008
Grossman, P. D.; Colburn. J. C. Capillary Electrophoresis. Theory and Practice
Academic Press Inc., 1992
Queiroz, SCN; Jardim, ICSF; “Eletroforese Capilar”, Chemkeys, 2001
Tavares, MFM; “Eletroforese Capilar: Conceitos Básicos”, Quim. Nova, 19 (1996) 173
Questões
1- Defina eletroforese capilar e explique o que é o fluxoeletroosmótico.
- Técnica separação na qual a separação de substâncias iônicas ocorre emfunção da carga e da mobilidade iônica.
- O fluco eletroosmótico (FEO) é o fluxo de espécies carregadas (íons) dotampão que migram do anodo (+) para o catodo (-), carreando os constituintes
da amostra.
30/05/2012
7
2- Em relação ao sinal analítico, qual é o perfil esperado para umeletroferograma? Justifique.
As espécies com carga positiva saem primeiro (migram mais rápido), as
espécies com carga negativa saem por último (sofrem repulsão pela catodo) eas espécies neutras saem entre as positivas e as negativas, por seremcarreadas pelo FEO.
3- Cite duas fontes de alargamento de banda na eletroforese capilar ecomente como este problema pode ser minimizado.
- Quantidades de amostra elevadas (comprimentos de injeção grandes);
- Aquecimento joule (corrente formada no capilar);
� Quantidades adequadas de amostras, tampões apropriados e usarsistema de refrigeração do capilar.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL)em Inglês
Interação diferenciada dos componentes da amostra com uma
FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL
sólido
oulíquido
líquido
ougás
Crom. líquida (CL)
Crom. gasosa (CG)
Uma das diferenças entre a CG e a CL são as configurações experimentais:
Sólido
líquido sobre um sólido
FASEESTACIONÁRIA
CONFIGURAÇÃOEXPERIMENTAL
PLANAR
COLUNA
30/05/2012
8
Ex de interação analito - FE
Equilíbrio FE – FM (partição na crom. Líquido-líquido)
� Diferente para as substâncias diferentesPolaridade
Tamanho
Cromatografia planar
Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido
FM (capilaridade) � separação
� Fácil realização� Análises quali e quantitativas
� Baixo custo� Baixas
- Resolução e- Repetibilidade- Reprodutibilidade
Cromatografia em coluna
Convencional (Clássica)
Solvente
Fase estacionária
Suporte inerte
Líquida de alta eficiência (CLAE)
- Colunas verticais (FM - gravidade)- Análises quali e quantitativas- Baixo custo- Baixa frequência- Desempenho regular
- Colunas e FM – altas pressões- Análises quali e quantitativas- Desempenho analítico satisfatório- Rapidez analítica, automação- Custo elevado ...
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
- Amplamente utilizada- Dentre as modalidade mais importantes- Vem se desenvolvendo desde a década de 70
NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA
� Necessidade de calibração
RESULTADO : Amostras x Padrões(cromatograma)
30/05/2012
9
Subdivisões da CLAE
� Tipo de FE (MECANISMO de separação)
Cromatografia líquido-sólido: CLS���� FE é um sólido (adsorção)
Cromatografia líquida de fase ligada: CLFL�FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido
(partição)
Cromatografia líquido-líquido: CLL���� FE é um líquido que recobre um sólido (partição)
Cromatografia por exclusão: CE
� FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controladaAplicação importante: análise de polímeros (GPC)
Cromatografia de troca iônica: CTI
� FE sólida contém grupos NR3+ (para troca
aniônica) ou grupos SO3- (para troca catiônica)
Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)
Mesmo princípio da Prática 10 !
Cromatografia por afinidade: CA
� FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivacom proteínas e anticorpos
Cromatografia quiral: CQ
� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirseletivamente com compostos quirais
“Para aprofundar o conhecimento”:
Pesquisar substâncias que são determinadas por CA e por CQ
Separação e Sinal analítico
FM
FM
FM
FM
FM
FM + componente separado
Cromatograma
Tempo de retenção
Sin
al
30/05/2012
10
Entendendo o cromatograma
Diferentes espécies � SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr(tr= tempo de retenção � medida em função do tempo)
saca
rin
a
aspartame
ben
zald
eíd
o
Informaçõesquali equantitativas
Tempo de retenção
Resposta do detector
Muita interaçãoPouca interação
Análise quantitativa
Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picoscromatográficos com áreas diferentes
���� Necessidade de calibração:
�Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações
� Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES
Configuração instrumentalComponentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta
eficiência:
� Cada componente: função no processo analítico
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector
Processador-Registrador
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
frasco de plástico
ouvidro
FMÁgua
+Solvente(s) orgânico(s)
n-hexanoAcetonitrilaMetanolMetil-t-butil-éterClorofórmioDiclorometanoTetrahidrofurano2-propanol
eliminação departículas maiores
que 5 µm
retirada de gasesDissolvidos
Ultrasomou
Borbulhamento gases inertes
USO(preparação diária)
CUIDADOS
30/05/2012
11
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
� Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível
� BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
Composição constante(eluição ISOCRÁTICA)
Composição variável(eluição por GRADIENTE)
Bomba de seringa
Bomba pneumática
Amostras complexasCompostos de polaridade
muito diferente
Bomba recíproca
Proporção doSolvente mais polar
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
Ex: Bomba recíproca (uma das mais usadas)
Desvantagens:
Vazão pulsada � amortecedorCavitação (bolhas) devido à compressão
Vantagem:
Mudança da fase móvel
Para coluna
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna
ALÇA TROCÁVEL ���� Volumes de 2 a 1000 µL
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
Coluna ���� tubo de aço inoxidável ���� separação
Capacidade: dimensões
Фi= 1 – 20 mm
L= 3 – 25 cm
FEPartículas com Ф na faixa de µmUso de partículas pequenas���� melhor separação (aumenta N)
+
FM
DUAS COMBINAÇÕES
Fase reversa
Fase normal
FE apolar (baixa polaridade)FM polar
FE polarFM apolar (baixa polaridade)
30/05/2012
12
EFICIÊNCIA DA COLUNA ���� RESOLUÇÃO
� REPRESENTAÇÃO: N“Número de pratos teóricos”
N = 16 tr
W
2
� Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação
� Não implica em rapidez ! (Altura do prato (H): H= L / N)
Determinada pelo no de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FM
Sin
al d
o d
etec
tor
Tempo de retenção
Detecção dos componentes conforme saem da coluna
�UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA
���� Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE)
- Que respondem à concentração���� sinal proporcional à concentraçãoEx: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência
MAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEIS
- Que respondem à massa ���� sinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de tempoEx: Detectores eletroquímicos e de condutividade elétrica
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADIENTE
Considerações práticas
� Várias configurações instrumentais podem ser empregadas
determinação de vários tipos de substâncias(mesmo em amostras complexas)
sistema à alta pressão: checar vazamentos
As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamno resultado
para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrõesinternos
(substância com características físico-químicas semelhantes às do
analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida)
Questões
1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquidade alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles.
2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes emanalgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveisdiferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% HAc; Y: 60% MeOH/ 40% HAc;Z: 40% MeOH/ 60% HAc). Considerando essas informações, responda qual é ocomposto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essamesma separação.
X Y Z
30/05/2012
13
Referências
Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.Principles of Instrumental Analysis5th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998
Harris, D. C.Análise Química Quantitativa7a ed., LTC – Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008
Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S.Fundamentos de Cromatografia1a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006