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XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba

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EFICÁCIA ANTIMICROBIANA DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA SOBRE

ESPOROS, LEVEDURAS E BACTÉRIAS

Carreira CM1,Pereira CA2, Bombana AC1, Jorge AOC2

1Faculdade de Odontologia (FOUSP-SP)/Departamento de Dentística, [email protected]

2Faculdade de Odontologia (UNESP-SJC)/Departamento de Biociências Bucal

Resumo- O objetivo deste trabalho foi avaliar a solução de nanopartículas de prata (NP-Ag) na descontaminação de limas endodônticas; em diferentes tempos experimentais. Limas endodônticas contaminadas por 24hs com suspensões de S. aureus, S. mutans, E. faecalis, E. coli e C. albicans (106 células/ mL) foram imersas na solução de NP-Ag e permaneceram em contato com a solução de NP-Ag por 5, 10, 15 e 30 min. Suspensão de B. atrophaeus, na forma esporulada, foi adicionada diretamente na solução NP-Ag e, sua ação foi avaliada nos mesmos tempos descritos acima. Meios seletivos para cada microrganismo foram utilizados para a obtenção do número de UFC/mL. Dentre os microrganismos testados, o esporo demonstrou ser o mais resistente. As nanopartículas de prata promoveram redução superior a 90% de UFC/mL sobre as leveduras e demais bactérias testadas. Para todos os grupos houve diferença estatisticamente significante entre o grupo controle com os demais tempos experimentais (teste de Turkey, p<0.05). A solução de nanopartículas de prata foi efetiva na descontaminação de instrumentos, e sua eficácia está diretamente relacionada com o tempo de contato. Palavras-chave: nanopartículas de prata, agentes desinfetantes, bactérias, esporo bacteriano, levedura Área do Conhecimento: Ciências da Saúde – Odontologia Introdução

Novos modelos de biomateriais estão surgindo contendo a incorporação de nanopartículas em suas matrizes. Dentre as nanopartículas com propriedades antimicrobiana destacam-se as nanopartículas de prata, por apresentarem amplo espectro (LOK et al., 2007; LEE et al., 2007; ZANG et al., 2008), incluindo ação em Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (XU et al., 2004; GOGOI et al., 2006) e certos vírus (ELICHIGUERRA et al., 2005).

No início do século 20 modificou-se a forma de preparar solução de prata. Produziram-se moléculas muito pequenas (KLASEN, 2000; CHOPRA, 2007), e assim, foram enquadradas em uma nova classe de materiais, os biomateriais, preparados por nanotecnologia. A nanociência ou nanotecnologia representa o início de um novo ciclo da capacidade humana de tentar desvendar o desconhecido. É a arte de entender os materiais em escala nanométrica, que variam de 0,1 a 100 nm, região em que os materiais apresentam novas propriedades e comportamentos diferentes daquelas que geralmente apresentam em escala macroscópica.

A indústria química dispõe de algumas alternativas de desinfetantes, como glutaraldeído, formaldeído, alcoóis, iodo, fenol sintético, clorexidina, hipoclorito de sódio e detergentes enzimáticos, entretanto, todos apresentam indicações precisas e desvantagens. Assim, torna-

se importante avaliar outros agentes desinfetantes, como a solução de nanopartículas de prata, pelo seu conhecido poder antibacteriano, facilidade de obtenção e baixo custo (LOK et al., 2007; LEE et al., 2007; ZANG et al., 2008) .

Com o crescente uso de soluções de nanopartículas de prata e de seus produtos, tornou-se interessante avaliar sua eficácia na descontaminação de limas endodônticas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação antimicrobiana de soluções de nanopartículas de prata e também sua ação em esporos de B. atrophaeus; em diferentes tempos experimentais.

Metodologia

Solução de nanopartículas de prata foi preparada na concentração de 47 ppm e aferida sua concentração pela diferença de potencial condutivo entre o veículo base e o produto final obtido pela eletrólise (Khemia, SP, Brasil).

Foram utilizadas culturas de cepas padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Streptococcus mutans (ATCC 35688), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Bacillus atrophaeus (ATCC 65961), Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 18804). Para cada cepa, com exceção de B. atrophaeus, a suspensão microbiana foi preparada a partir de culturas de 24h em ágar Sabouraud Dextrose (Difco, Detroit, EUA) para C. albicans e ágar de infusão de cérebro e coração (BHI; Difco, Detroit,


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USA) para S. aureus, S. mutans, E. faecalis e E. coli. Todos os ensaios com cepas de S. mutans foram incubados em estufa bacteriológica (37ºC) sob condições de microaerofilia (5% de CO2).

Após incubação, colônias dos microrganismos foram suspensas em solução fisiológica esterilizada (NaCl 0,9%), e ajustada em espectrofotômetro (B 582, Micronal, São Paulo, Brasil), até obtenção de suspensão padronizada contendo 106 células/mL.

Para obtenção da suspensão esporulada de B. atrophaeus foi utilizada a metodologia proposta por Penna et al. (2001) e Kuroiwa et al. (2003). A suspensão foi padronizada com 106

células/mL com solução de NaCl 0,9% esterilizada.

Para os ensaios de descontaminação foram utilizados 300 limas endodônticas tipo Kerr (Maillefer, Dentsply, Weybridge, UK), calibre #30 e com 21 mm de comprimento. Os instrumentos foram divididos em 5 grupos (n=12), de acordo com o tempo de imersão do instrumento na solução de nanopartículas de prata: G1: 5 min; G2: 10 min; G3: 15min; G4: 30min; e G5: controle (sem contato com as nanopartículas de prata).

Uma alíquota de 100 µL da suspensão de cada cepa foi transferida para os tubos contendo os instrumentos imersos em 3mL de caldo BHI (Difco, Detroit, USA) e, em seguida, foram incubados a 37oC, por 24h. Após a contaminação as limas foram transferidas para tubos contendo 3 mL de solução de nanopartículas de prata e permaneceram em contato com esta solução por 5, 10, 15 e 30 min. Decorrido os períodos experimentais, as limas foram lavadas em solução estéril de NaCl a 0,9%, e transferidas para tubos contendo caldo BHI. Os tubos foram agitados em vortex (Fanem, São Paulo, Brasil) por 1 min, e alíquotas de 10 µL da solução foram transferidas para placas de Petri contendo: ágar MacConkey (Himedia, Mumbai, India) para E. coli, ágar M-Enterococcus (Difco, Detroit, USA) para E. faecalis, ágar Sabouraud dextrose com 50 mg/L-1 de cloranfenicol (União Química, São Paulo, Brasil) para C. albicans, ágar Manitol (Difco, Detroit, USA) para S. aureus, e ágar BHI para S. mutans. Todo o experimento foi realizado em duplicata.

Para o grupo de esporos de B. atrophaeus, 100 µL da suspensão foi colocada em tubos de ensaio contendo 3 mL de solução de nanopartículas de prata. Assim, os tubos foram agitados em vortex por 1 min, e submetidos aos diferentes tempos experimentais. Em seguida, alíquotas de 100 µL foram transferidas para tubos contendo solução de NaCl a 0,9% esterilizada. Os tubos foram novamente agitados em vortex por 1 min e 10 µL desta solução foi transferido para placas com ágar Nutriente.

No grupo controle, os instrumentos contaminados ou 100 µL da suspensão de esporos, foram transferidos para tubos com soro fisiológico, agitados por 1 min e alíquotas de 10 µL foram semeadas em placas com ágar seletivos, descritos anteriormente. As placas foram incubadas em estufa à 37 ºC por 48 h. Após o período de incubação, os números de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) foram contados.

Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente pela análise de variância ANOVA, teste TUKEY, considerando-se diferença estatística quando p<0,05, utilizando-se o software Minitab 14 (Inc. PA, USA).

Resultados

Os valores das médias de UFC/mL assim

como a análise estatística nos grupos homogêneos estão apresentados na Tabela 1. Na Figura 1 visualiza-se a redução (%) e o desvio-padrão de UFC/mL dos microrganismos após a atuação da prata nos diferentes tempos experimentais.

Tabela 1: Média de UFC/mL (potência 103) e significância entre grupos homogêneos (GH) dos microrganismos avaliados nos diferentes tempos experimentais.

UFC/mL GH Sol.

salina 5

min 10

min 15

min 30

min B. atrophaeus

87A 31B 28B 27B 24B

E. coli 17 A 3,9 AB 2,3 B 1,5 B 0,92 B E. faecalis 43 A 27 AB 10 BC 4,2 C 2,4 C

S. mutans 100 A 69 AB 29 B 2,2 C 0,2 C

S. aureus 130 A 72 B 55 B 2,9 C 0,2 C

C. albicans 2,1 A 0 B 0 B 0 B 0 B GH: Grupo homogêneo - letras diferentes representam diferença estatisticamente significante entre os grupos (Teste de Tukey, p≤0,05).

No tempo de 30 minutos notou-se redução

(%) significativa de todos os microrganismos testados. Foi constatada redução em 100% das cepas de C. albicans, 99,9% de S. aureus, 99,7% de S. mutans, 93,7% de E. faecalis e 77,6% de E. coli. O microrganismo B. atrophaeus, em sua forma esporulada, demonstrou-se mais resistente (70,5%).


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* p estatisticamente significante (<0,05) em relação ao grupo controle – Análise de variância ANOVA, teste de Turkey. Figura 1: Redução dos microrganismos viáveis (%) após a ação das nanopartículas de prata nos diferentes tempos experimentais. Discussão

Após o tratamento odontológico, todos os instrumentos dispostos na bandeja ficam contaminados, inclusive os que não foram manuseados (MILLER et al., 1971; COTTONE et al., 1991). O mesmo acontece com o ambiente do consultório odontológico. Assim, o dentista e sua equipe auxiliar devem, rigorosamente, empregar métodos de controle de infecção cruzada e estar sempre atentos as recomendações impostas por órgãos competentes. O Ministério da Saúde do Brasil, em 1994, apresentou “NORMA” um manual que descreve como processar artigos e superfícies contaminadas (BRASIL, 1994) e, em 2003 o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) divulgou novas normas para a desinfecção e esterilização pré-operatória. Ambos os regulamentos demonstraram preocupação com a prevenção de acidentes com instrumentos perfuro-cortantes contaminados e indicam como passo inicial para o processamento desses instrumentos, a descontaminação ou desinfecção do material com substâncias químicas. Neste contexto, este estudo propôs avaliar se a solução de nanopartículas de prata seria capaz de descontaminar as limas endodônticas contaminadas por diferentes tipos de microrganismos e também sua ação antimicrobiana sobre esporos de B. atrophaeus.

Limas endodônticas foram selecionadas como corpo-de-prova por serem considerados instrumentos clínicos de difícil limpeza, já que apresentam inúmeras reentrâncias. Além disso, pôde-se avaliar a ação das nanopartículas de prata em diferentes tipos de materiais, pois a lima é composta por metal, na porção ativa, e plástico, no cabo do instrumento. Não observamos nenhum tipo de corrosão da porção metálica nem

deformação no cabo após contato de 30 minutos com substância avaliada.

Os resultados da ação antimicrobiana demonstraram-se satisfatórios, visto que houve redução significativa das bactérias avaliadas na forma vegetativa (entre 77,6 - 99,9%) e eliminação total de C. albicans (100%). O decréscimo dos valores da média de UFC/mL (Tabela 1) no decorrer do tempo de ação da substância demonstrou que a redução microbiana foi influenciada diretamente pelo tempo de contato do microrganismo com as nanopartículas de prata. Estes dados corroboram com Kong e Jang (2008) e Thibodeau et al. (1978), que também confirmaram a influência do tempo na efetividade da prata.

Apesar do mecanismo de ação das nanopartículas de prata não estar completamente elucidado, acredita-se que nanopartículas interagem com elementos da membrana celular das bactérias, causando danos estruturais, forçando a dissipação de prótons, e finalmente a morte celular (SONDI, SALOPEK-SONDI, 2004; LOK et al., 2006). Também tem sido proposto que íons de prata liberados das nanopartículas podem atuar no fosfato das moléculas do DNA, resultando na inativação da sua replicação. Outro mecanismo seria a reação com proteínas contendo enxofre, induzindo a inibição de funções enzimáticas respiratórias (GUPTA et al., 1998; MATSUMURA et al., 2003).

Em 1972 Spaulding classificou os agentes desinfetantes em nível baixo, intermediário ou alto, de acordo com a diversidade de microrganismos que o fármaco é capaz de eliminar (MOLINARI, RUNNELLS, 1991). A escolha dos microrganismos da atual pesquisa buscou abranger espécies usualmente encontradas nos resíduos dos espirais de instrumentos endodônticos, as quais são associadas a diversas patologias que acometem a cavidade bucal. A utilização de esporos de B. atrophaeus serviu como parâmetro para avaliar a eficácia da solução de nanopartículas de prata, uma vez que essa apresenta grande resistência aos desinfetantes convencionais e é utilizada em avaliações da eficácia de procedimentos de esterilização (BLOCK, 2001; RUSSELL, 1982; 1990; MCDONNELL, RUSSELL, 1999).

O microrganismo na forma de esporo é sempre mais resistente que na forma vegetativa, por sofrer modificações na sua estrutura frente às condições de adversidade. No presente estudo, observou-se que B. atrophaeus foi o microrganismo mais resistente, com a menor taxa de redução microbiana (70,5%, p<0,00 em relação ao grupo controle). Nenhum trabalho foi encontrado na literatura avaliando a ação da prata sobre microrganismos esporulados. No entanto, na forma vegetativa, a Concentração Inibitória


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Mínima (CIM) da prata para B atrophaeus foi de 70 µg/ mL (YOON et al, 2007).

Uma possível explicação da menor sensibilidade à prata demonstrada por E.coli (77,6% em 30 min) pode estar relacionada com a constituição de sua membrana Gram-negativa, composta por moléculas de lipopolissacarídeos (LPS), que promovem efetiva barreira contra nanopartículas (BRAYNER et al., 2006; FAN et al., 2002). Resultados semelhantes foram demonstrados por Yoon et al. (2007), que também relacionaram a constituição da membrana celular como a causa da maior CIM sobre microrganismos Gram-negativos.

Na literatura, não há um consenso dos valores de CIM das nanopartículas de prata. Chopra (2007) questiona essas divergências e constata que mesmo os trabalhos que seguiram os parâmetros estabelecidos pela National Commitee for clinical Laboratory Standads (NCCLS, Pennsylvania, USA) e pelo Comitê Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobianos (EUCAST) demonstraram resultados diferentes. Para o autor, a alta dosagem utilizada do produto (70-100 ppm) se justifica pelo receio de administrar subdoses e estimular o aparecimento de microrganismos resistentes.

Baseados no mesmo número inicial de microrganismos (aproximadamente 100 UFC) Ug, et al. (2003), O`Neill e Chopra (2004) e Hamilton-Miller, et al. (1993), obtiveram valores de CIM entre 8 a 80 mg/L para S. aureus. Da mesma forma, porém com outro parâmetro de medida, Berger et al (1976) e Thibodeau et al. (1978) obtiveram os valores entre 0,68 ppm e 20 ppm. Sondi e Salopek-Sondi (2004) sugeriram que os diferentes resultados estão relacionados com as diferentes metodologias empregadas, já que os constituintes do meio de cultura podem influenciar nos efeitos dos íons de prata sobre os microrganismos.

A concentração avaliada no presente estudo foi de 47 ppm, sendo um valor intermediário entre as concentrações relatadas na literatura e com base em estudo piloto realizado previamente. A solução teste foi produzida a partir de uma corrente elétrica de 5 µA, que demonstrou gerar nanopartículas de prata com maior capacidade antimicrobiana (THIBODEAU et al., 1978).

O grupo do esporo não seguiu o mesmo modelo metodológico dos demais microrganismos testados, pois, se a suspensão de B. atrophaeus entrasse em contato com o meio de cultura BHI, para promover contaminação das limas endodônticas, seriam restabelecidas as condições para o retorno do microrganismo a sua forma

vegetativa. Assim, a suspensão foi adicionada diretamente na solução teste.

No que tange essa nova área do conhecimento, verifica-se que a ciência e inovações tecnológicas caminham juntas e que fortes laços de reciprocidade refletem-se no crescimento da produção acadêmica e em novas utilizações práticas. Assim, novos modelos de biomateriais estão surgindo com a incorporação de nanopartículas em suas matrizes. Nesse arsenal podem-se encontrar desde roupas, lavadoras de roupa, colchões higiênicos e potes para armazenar mantimentos. Na área da saúde destacam-se a confecção de cateteres vasculares e urinários (SILVER et al., 2006); e os sistemas de purificação de água, que já são empregados no cotidiano. No campo da pesquisa, encontram-se o desenvolvimento de máscaras cirúrgicas (LI et al., 2006), gazes (LEE et al., 2007) e ataduras para queimaduras, dentre outros.

Os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que a solução de nanopartículas de prata atua como um desinfetante eficaz e pode ser considerado como uma alternativa aos desinfetantes encontrados no mercado atualmente, por apresentar amplo potencial antimicrobiano, facilidade de obtenção e baixo custo.

Conclusão

A análise dos resultados obtidos pela aplicação do modelo experimental permitiu as seguintes conclusões: - A solução de nanopartículas de prata apresentou ação antimicrobiana sobre S. aureus, S. mutans, E. faecalis e E.coli, aderidos em limas endodônticas; - A solução de nanopartículas de prata apresentou efetiva ação sobre Candida albicans, promovendo eliminação total após 5 min; - Esporos de B. atrophaeus foi o microrganismo mais resistente às nanopartículas de prata; - A efetividade da solução de nanopartículas de prata está relacionada com o tempo em que a solução permanece em contato com o microrganismo. Referências

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