efeitos fisiolÓgicos e metabÓlicos em tomateiro … · companheirismo e imensurável ajuda nesta...

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE, UNICENTRO – PR

EFEITOS FISIOLÓGICOS E METABÓLICOS EM

TOMATEIRO POR ESTROBILURINAS E CARBOXAMIDAS

TESE DE DOUTORADO

JANAINA MAREK

GUARAPUAVA-PR

2018

JANAINA MAREK

EFEITOS FISIOLÓGICOS E METABÓLICOS EM TOMATEIRO POR

ESTROBILURINAS E CARBOXAMIDAS

Tese apresentada à Universidade Estadual do

Centro-Oeste, como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área

de concentração em Produção Vegetal, para

obtenção do título de Doutora em Agronomia.

Professora Drª Elizabeth Orika Ono

Orientadora

Professor Dr. João Domingos Rodrigues

Co-Orientador

Professora Drª Cacilda Márcia Duarte Rios Faria

Co-Orientadora

GUARAPUAVA-PR

2018

Catalogação na Publicação

Biblioteca Central da Unicentro, Campus Santa Cruz

Marek, Janaina

M323e Efeitos fisiológicos e metabólicos em tomateiro por estrobilurinas e carboxamidas / Janaina Marek. – – Guarapuava, 2018.

xxii, 149 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual do Centro-Oeste, Programa de

Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Produção Vegetal, 2018

Orientadora: Elizabeth Orika Ono Coorientador: João Domingos Rodrigues Coorientadora: Cacilda Márcia Duarte Rios Faria Banca examinadora: Elizabeth Orika Ono, Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada, João Domingos Rodrigues, Patricia Carla Giloni de Lima, Cacilda Márcia Duarte Rios Faria

Bibliografia

1. Agronomia. 2. Produção vegetal. 3. Solanum lucopersicum L.. 4.

Alternaria solani. 5. Estresse oxidativo. 6. Proteínas relacionadas à patogênese. 7. Enzimas. I. Título. II. Programa de Pós-Graduação em Agronomia.

CDD 630

“A agricultura é a arte de colher o sol.”

(Provérbio Chinês)

Jamais me envergonharei das minhas raízes...

Sou filha de agricultores humildes,

que com o suor de cada dia e mãos calejadas,

proveram o sustento da família e o estudo de seus filhos.

Pai e Mãe,

Com muito orgulho eu lhes dedico esta tese!

Quero agradecer...

Primeiramente a Deus pelo dom da vida e imensa proteção.

Aos meus pais, José e Juraci, por serem meus exemplos de vida, por todo o amor,

carinho e cumplicidade.

Ao Dione de Azevedo, meu ‘braço direito’, por toda a dedicação, compreensão,

companheirismo e imensurável ajuda nesta caminhada.

A minha irmã Jienefer por toda a ajuda intelectual, física, emocional e espiritual,

minha querida companheira nos momentos de sorrisos e lágrimas.

Ao meu irmão Diogo e minha cunhada Débora, pelo carinho, apoio e pelas palavras

de conforto.

A minha orientadora Drª Elizabeth Orika Ono por todo o ensinamento e exemplo

de profissionalismo, pela paciência e dedicação em me orientar, mesmo com a dificuldade

da distância e, principalmente, pela confiança depositada em mim.

Aos meus co-orientadores Drª Cacilda Márcia Duarte Rios Faria e Dr. João

Domingos Rodrigues pelo apoio incondicional e por toda a atenção e ajuda quando

precisei.

As professoras Drª Kátia Regina Freitas Sckwan-Estrada e Drª Patricia Carla

Giloni de Lima pelas importantes considerações e contribuições para a lapidação deste

trabalho.

A minha querida ‘aprendiz’ Jessica Caroline Miri por ter se dedicado a este trabalho

como se fosse dela, por ter me ajudado do começo ao fim, além da grande amizade em

todas as horas e pelas palavras amigas nos momentos difíceis.

A minha amiga Elaine Pittner, companheira de laboratório, por toda a ajuda e

parceria nas análises enzimáticas e, principalmente, pela amizade construída.

As meninas do “pam”, Regina Lopes, Mariane Dal Comune e Suélen Hellmann,

por toda a ajuda com as análises. A Elisa Adriano e Aline José Maia pela ajuda

com as análises de trocas gasosas.

Aos colegas de laboratório, Laís Gasperotto, Juliane Wolbert, Douglas Bortuli,

Carla Daiane Leite, Leandro Alvarenga Santos, Fábio Telaxca, Letícia Lopes

Dias, Rafael Calixto e Paola Zimmermann por toda a ajuda concedida.

As meninas de Botucatu, Ana Claudia Macedo e Amanda Cristina Esteves Amaro

pelo auxílio com o aporte técnico e científico nas metodologias.

Aos professores Renato e Marcão pela disponibilidade do espaço físico para as

análises de pós-colheita.

A nossa querida secretária Lucilia pela paciência e prontidão em me atender.

Ao pessoal da manutenção pelo empréstimo de ferramentas e aos seguranças pelo

monitoramento prestado em muitas noites e finais de semanas.

A todos os Professores do Programa por auxiliar na construção deste conhecimento.

Aos meus colegas de Pós-Graduação pelas amizades construídas, por estarem comigo

nesse trajeto e por todo o conhecimento que construímos juntos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia e à Universidade Estadual do

Centro-Oeste, Campus Cedeteg pela oportunidade e apoio concedido para a realização

deste trabalho.

A todos os meus familiares e amigos, em especial minha Avó ‘Dona Nena’, Tia

Nega, Andreia, Davina, ‘Dona Zene’, madrinha Ilze, Iara, Ana Paula, Rubia,

Laís, Mayara, Thayna, Jessica (...) obrigada pelas orações, conversas, abraços e

apoio nos momentos de dificuldade.

E aqueles que criticaram, pois só assim pude ver que ainda havia muito para

melhorar.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho...

Muito obrigada!

SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................. i

ÍNDICE DE TABELAS ......................................................................................................... vii

RESUMO .................................................................................................................................. ix

ABSTRACT ............................................................................................................................. xi

1.INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

2.OBJETIVOS .......................................................................................................................... 3

2.1Objetivo Geral ....................................................................................................................... 3

2.2Objetivos específicos ............................................................................................................. 3

3. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................... 4

3.1 Aspectos gerais do cultivo de tomateiro ............................................................................... 4

3.1.1 Origem ...............................................................................................................................4

3.1.2 Características botânicas e agronômicas ........................................................................... 4

3.1.3 Qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro .................................................................. 5

3.2 A importância econômica da cultura do tomateiro ............................................................... 6

3.3 Ocorrência de doenças .......................................................................................................... 7

3.3.1 Pinta preta do tomateiro: aspectos gerais da doença ......................................................... 7

3.3.2 Controle de pinta preta em tomateiro ................................................................................ 9

3.4 Efeitos fisiológicos das estrobilurinas e carboxamidas ...................................................... 11

3.5 Desenvolvimento de plantas ............................................................................................... 12

3.6 Eficiência fotossintética ...................................................................................................... 12

3.6.1 Trocas gasosas ................................................................................................................. 12

3.6.2 Pigmentos fotossintéticos e fluorescência da clorofila a ................................................. 13

3.6.3 Nitrato redutase................................................................................................................ 14

3.7 Estresse oxidativo ............................................................................................................... 15

3.7.1 Enzimas envolvidas na defesa antioxidativa ................................................................... 16

3.7.2 Peroxidação lipídica ........................................................................................................ 18

3.8 Indução de resistência e a defesa vegetal contra patógenos ............................................... 19

3.8.1 Proteínas envolvidas na indução de resistência ............................................................... 23

3.8.2 Metabolismo secundário e defesa vegetal ....................................................................... 24

4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 27

4.1 Caracterização da área de estudo ........................................................................................ 27

4.2 Material vegetal: semeadura e transplante.......................................................................... 27

4.3 Material vegetal: tratos culturais ........................................................................................ 28

4.4 Delineamento experimental e tratamentos ......................................................................... 29

4.5 Caracterização dos fungicidas ............................................................................................ 30

4.5.1 Boscalida ......................................................................................................................... 30

4.5.2 Boscalida + Cresoxim-metílico ....................................................................................... 30

4.5.3 Piraclostrobina ................................................................................................................. 31

4.5.4 Fluxapiroxade + Piraclostrobina ...................................................................................... 31

4.5.5 Metiram + Piraclostrobina ............................................................................................... 31

4.6 Isolamento e inoculação do patógeno: Alternaria solani ................................................... 32

4.7 Propriedades avaliadas ....................................................................................................... 33

4.7.1 Análise de desenvolvimento ............................................................................................ 33

4.7.2 Trocas gasosas ................................................................................................................. 33

4.7.3 Fluorescência da clorofila a ............................................................................................. 34

4.7.4 Nitrato Redutase .............................................................................................................. 35

4.7.5 Pigmentos fotossintéticos ................................................................................................ 36

4.7.6 Análise de carboidratos ................................................................................................... 37

4.7.7 Avaliação da severidade de Alternaria solani ................................................................. 38

4.7.8 Análises bioquímicas ....................................................................................................... 39

4.7.8.1 Coleta e obtenção dos extratos enzimáticos ................................................................. 39

4.7.8.2 Proteínas totais e atividades enzimáticas ...................................................................... 41

4.7.8.3 Ânion superóxido e peróxido de hidrogênio ................................................................ 43

4.7.8.4 Peroxidação lipídica ..................................................................................................... 45

4.7.8.5 Compostos fenólicos..................................................................................................... 45

4.7.8.6 Deposição de lignina .................................................................................................... 45

4.7.9 Avaliação de produção e pós-colheita de frutos de tomateiro ......................................... 46

4.7.9.1 Produção..... .................................................................................................................. 46

4.7.9.2 Qualidade pós-colheita de frutos .................................................................................. 47

4.7.9.3 Avaliação da perda de massa ........................................................................................ 48

4.8 Análise estatística ............................................................................................................... 49

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 50

5.1 Desenvolvimento do tomateiro ........................................................................................... 50

5.2 Eficiência fotossintética ...................................................................................................... 55

5.3 Pigmentos fotossintéticos e atividade da enzima nitrato redutase ...................................... 64

5.4 Síntese e translocação de carboidratos ............................................................................... 69

5.5 Controle de Alternaria solani ............................................................................................. 74

5.6 Estresse oxidativo e enzimas antioxidantes ........................................................................ 78

5.7 Proteínas relacionadas à patogênese e respostas de defesa ................................................ 99

5.7 Produção e Qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro .............................................. 115

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 125

7. CONCLUSÃO ................................................................................................................... 125

8. Referências Bibliográficas ............................................................................................... 130

i

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Casa de vegetação: vista externa (A) e vista interna (B). Unicentro, Guarapuava/PR.

.................................................................................................................................................. 27

Figura 2. Plantas de tomateiro em casa de vegetação tutoradas verticalmente com fitilho

(Experimento I – 2015) e bambu (Experimento II – 2016). Unicentro, Guarapuava/PR......... 29

Figura 3. Cultura de Alternaria solani antes (A) e após (B) injúria mecânica dos micélios.

Unicentro, Guarapuava/PR. ...................................................................................................... 32

Figura 4. Análise de trocas gasosas em plantas de tomateiro (A e B). Unicentro,

Guarapuava/PR. ........................................................................................................................ 34

Figura 5. Clip para adaptação ao escuro: indicado pela seta (A); Análise de fluorescência da

clorofila a em plantas de tomateiro. Unicentro, Guarapuava/PR. ............................................ 35

Figura 6. Escala diagramática para avaliação de Alternaria solani em tomateiro expressa em

proporção de área foliar lesionada (A). Avaliação da severidade de pinta preta em tomateiro

(B). Unicentro, Guarapuava/PR. .............................................................................................. 38

Figura 7. Ponto de colheita dos frutos de tomateiro: vermelho-claro (A) e pesagem dos frutos

em balança analítica (B). Unicentro, Guarapuava/PR. ............................................................. 46

Figura 8. Colheita de frutos no estádio de maturação verde-salada (A), pesagem dos frutos (B),

frutos no início: 1°dia (C) e final: 21° dia (D) do experimento de avaliação de perda de massa.

Unicentro, Guarapuava/PR. ...................................................................................................... 49

Figura 9. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol m-2 s-1), condutância estomática (gs, mol m-2 s-

1) e concentração interna de CO2 na folha (Ci, μmol mol-1) em plantas de tomateiro híbrido

Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos

fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 34 e 94 dias após o transplantio (DAT),

nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação,

diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio

padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ............................................................... 56

Figura 10. Taxa de transpiração (E, mmol m-2 s-1), eficiência do uso da água (EUA, A/E, μmol

CO2 (mmol H2O)-1) e eficiência de carboxilação (A/Ci) em plantas de tomateiro híbrido

ii


fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 34 e 94 dias após o transplantio (DAT),

nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação,

diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio

padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ............................................................... 58

Figura 11. Fluorescência variável da clorofila a (Fv), eficiência máxima do PSII (Fv/Fm),

rendimento quântico fotoquímico do PSII, Y(II) e taxa relativa de transferência de elétrons

(ETR) em plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas

com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 34 e

94 dias após o transplantio (DAT), nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras

distintas, na mesma avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade

(p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ........... 60

Figura 12. Teor de clorofila a (µg g massa fresca-1), clorofila b (µg g massa fresca-1) e

carotenoides (µg g massa fresca-1) em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em

casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com

Alternaria solani, aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 dias após o transplantio (DAT), nos anos

de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação, diferem pelo

teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média.

Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ............................................................................................ 65

Figura 13. Atividade da enzima nitrato redutase (NR, μg nitrito min-1 g de massa fresca-1) em

plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com

diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 15, 20, 35,

50, 65, 80, 95 e 110 dias após o transplantio (DAT), nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5)

seguidas de letras distintas, na mesma avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de

probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR,

2018. ......................................................................................................................................... 68

Figura 14. Efeito dos diferentes tratamentos com fungicidas, na área abaixo da curva de

progresso da doença (AACPD), testados no controle de Alternaria solani em plantas de

tomateiro híbrido Conquistador, cultivado em casa de vegetação, nos anos de 2015 e 2016.

Tratamentos: testemunha inoculada (Test+Inoc), testemunha absoluta (Test), boscalida (Bosc),

boscalida mais cresoxim-metílico (Bosc+Cre), piraclostrobina (Pira), fluxapiroxade mais

piraclostrobina (Flux+Pira) e metiram mais piraclostrobina (Me+Pira). Médias (n = 10)

seguidas de letras distintas diferem pelo teste Tukey ao nível de 1% de probabilidade (p<0,05).

Barras indicam e desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ........................ 74

Figura 15. Variação das temperaturas e umidades do ar, máximas e mínimas, no ano de 2015,

avaliadas diariamente durante a condução do experimento, no interior da casa de vegetação

iii

onde foram conduzidas as plantas de tomateiro híbrido Conquistador, tratadas com diferentes

fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani. Unicentro,

Guarapuava/PR, 2018. .............................................................................................................. 75

Figura 16. Variação das temperaturas e umidades do ar, máximas e mínimas, no ano de 2016,

avaliadas diariamente durante a condução do experimento, no interior da casa de vegetação

onde foram conduzidas as plantas de tomateiro híbrido Conquistador, tratadas com diferentes

fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani. Unicentro,

Guarapuava/PR, 2018. .............................................................................................................. 76

Figura 17. Concentração de ânion superóxido (•O2-, mmol g de massa fresca-1) aos 15, 16, 17,

20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após

o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de

vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com

Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10).


Figura 18. Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD, U min-1 mg proteína-1) aos 15,

16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias

após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa

de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com



Figura 19. Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2, µmol g de massa fresca-1) aos 15,

16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias





Figura 20. Atividade da enzima ascorbato peroxidase (APX, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16,

17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias





Figura 21. Atividade da enzima glutationa redutase (GR, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16,

17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias


iv




Figura 22. Atividade da enzima glutationa S-transferase (GST, U min-1 mg proteína-1) aos 15,

16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias





Figura 23. Atividade da enzima glutationa peroxidase (GPX, U min-1 mg proteína-1) aos 15,

16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias





Figura 24. Atividade da enzima catalase (CAT, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29,

30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após o

transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de




Figura 25. Peroxidação lipídica (TBARS, µmol g massa fresca-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30,

31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após o transplantio

(DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas

com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos

de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR,

2018. ......................................................................................................................................... 97

Figura 26. Atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (PAL, U min-1 mg proteína-1) aos 15,

16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias




Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. .......................................................................................... 101

Figura 27. Teor de Compostos Fenólicos (mg g massa fresca-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31,

34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após o transplantio

v

(DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas

com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos

de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR,

2018. ....................................................................................................................................... 103

Figura 28. Atividade da enzima peroxidase (POD, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20,

29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após o





Figura 29. Atividade da enzima polifenoloxidase (PPO, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17,

20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após





Figura 30. Deposição de lignina (µg de lignina-1 mg de massa fresca-1) aos 14, 20, 35, 50, 65,

80, 95 e 110 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador

cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e

inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 10) seguidas de letras

distintas, na mesma avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade

(p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ......... 108

Figura 31. Atividade da enzima lipoxigenase (LOX, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20,

29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após o





Figura 32. Atividade da enzima quitinase (QUI, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29,

30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após o





vi

Figura 33. Atividade da enzima β-1,3-glucanase (GLU, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17,

20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias após





Figura 34. Atividade das enzimas pectinametilesterase (PME, U min-1 g massa fresca-1) (A.) e

poligalacturonase (PG, U min-1 g massa fresca-1) (B.) em frutos de tomateiro híbrido

Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, nos anos de 2015 e 2016. Tratamentos:

testemunha inoculada (Test+Inoc), testemunha absoluta (Test), boscalida (Bosc), boscalida

mais cresoxim-metílico (Bosc+Cre), piraclostrobina (Pira), fluxapiroxade mais piraclostrobina

(Flux+Pira) e metiram mais piraclostrobina (Me+Pira) e inoculadas com Alternaria solani.

Médias (n = 10) seguidas de letras distintas, no mesmo ano, diferem significativamente entre

tratamentos pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam e

desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. .................................................. 122

Figura 35. Perda de massa (%) de frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa


Alternaria solani, durante 21 dias, nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 10) seguidas de letras

diferentes no mesmo dia de avliação diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5%

de probabilidade (p<0,05). Dados transformados em arco seno de √x(%). Barras indicam desvio

padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ............................................................. 123

Figura 36. Modelo esquemático mostrando os efeitos fisiológicos e metabólicos promovidos

pela aplicação de estrobilurinas: cresoxim-metílico e boscalida e carboxamidas: boscalida e

fluxapiroxade em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação

e inoculadas com Alternaria solani. Fonte: MAREK, 2018. ................................................. 127

vii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Análise química de solo dos experimentos I e II nos anos de 2015 e 2016,

respectivamente. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. ................................................................ 28

Tabela 2. Altura (cm) aos 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias após o transplantio (DAT) de plantas

de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes

fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculadas com Alternaria solani, no ano de 2015.






Tabela 4. Variáveis de desenvolvimento aos 120 dias após o transplantio (DAT) de plantas de

tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação e tratadas com diferentes

fungicidas de efeitos fisiológicos, inoculados com Alternaria solani, no ano de 2015.


Tabela 5. Variáveis de desenvolvimento aos 120 dias após o transplantio (DAT) de plantas de

tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes

fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, no ano de 2016.


Tabela 6. Média dos teores de açúcares totais e açúcares redutores (µg g massa fresca-1) em

folha, caule e fruto aos 50 e 120 dias após o transplantio (DAT) de plantas de tomateiro híbrido


fisiológicos e inoculadas com Altenaria solani, no ano de 2015. Unicentro, Guarapuava/PR,

2018. ......................................................................................................................................... 70

Tabela 7. Média dos teores de açúcares totais, açúcares redutores (µg g massa fresca-1) em


Conquistador, cultivadas em casa de vegetação e tratadas com diferentes fungicidas de efeitos

fisiológicos e inoculadas com Alternaria solani, no ano de 2016. Unicentro, Guarapuava/PR,

2018. ......................................................................................................................................... 71

Tabela 8. Valores médios de produção total (PT, kg m-2), número total de frutos (NTF, frutos

m-2), massa fresca de frutos (MFF, g fruto-1) e porcentagem de frutos não comerciais (FNC, %)

de plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas com

viii

diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos de

2015 e 2016. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. .................................................................... 116

Tabela 9. Valores médios de firmeza (gf cm-2), pH, teor de sólidos solúveis (SS, °Brix), acidez

titulável (AT, g de ácido cítrico 100 g de polpa-1), relação SS/AT e teor de ácido ascórbico (AA,

mg 100 g de polpa-1) de frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivados em casa de


Alternaria solani, no ano de 2015. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. .................................. 119

Tabela 10. Valores médios de firmeza (gf cm-2), pH, teor de sólidos solúveis (SS, °Brix), acidez

titulável (AT, g de ácido cítrico 100g de polpa-1), relação SS/AT e teor de ácido ascórbico (AA,

mg 100 g de polpa-1) de frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivados em casa de


Alternaria solani, no ano de 2016. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018. .................................. 120

ix

RESUMO

MAREK, Janaina. Efeitos fisiológicos e metabólicos em tomateiro por estrobilurinas e

carboxamidas. Guarapuava: UNICENTRO, 2018. (Tese – Doutorado em Agronomia/Produção

Vegetal).

O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos fisiológicos e metabólicos em plantas de

tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação e inoculadas, com aplicação

de estrobilurinas e carboxamidas. O estudo foi realizado em dois anos (2015 e 2016), nos quais

foram avaliados os efeitos dos diferentes fungicidas no desenvolvimento de plantas de

tomateiro, na eficiência fotossintética, no sistema antioxidativo, no controle da doença e na

ativação de mecanismos de defesa contra o patógeno, bem como na produção e pós-colheita de

frutos. O delineamento experimental utilizado foi blocos ao acaso, com sete tratamentos e cinco

repetições, sendo cada parcela composta por quatro plantas. Os tratamentos utilizados foram:

T1 – testemunha inoculada (água + inóculo); T2 – testemunha absoluta (água); T3 – boscalida

(0,075 g L-1); T4 – boscalida (0,100 g L-1) + cresoxim-metílico (0,050 g L-1); T5 –

piraclostrobina (0,100 g L-1); T6 – fluxapiroxade (0,058 g L-1) + piraclostrobina (0,116 g L-1) e

T7 – metiram (1,100 g L-1) + piraclostrobina (0,100 g L-1). O efeito dos tratamentos no

desenvolvimento foi avaliado pela altura de plantas, área foliar, massa fresca e seca de folhas,

caule e raiz. Para verificar a eficiência fotossintética foram realizadas avaliações de trocas

gasosas, fluorescência da clorofila a, teor de pigmentos, atividade da enzima nitrato redutase e

teor de carboidratos. Para verificar os efeitos dos tratamentos no sistema antioxidativo, no

controle da doença e ativação de mecanismos de defesa ao patógeno, foram avaliadas a área

abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), concentração de ânion superóxido e

peróxido de hidrogênio, atividade das enzimas superóxido dismutase, ascorbato peroxidase,

glutationa redutase, glutationa S-transferase, glutationa peroxidase, catalase, fenilalanina

amônia-liase, quitinase, β-1,3-glucanase, peroxidase, polifenoloxidase e lipoxigenase, além do

teor de compostos fenólicos, peroxidação lipídica e deposição de lignina. Para avaliar os efeitos

dos tratamentos na produção e pós-colheita de frutos foram realizadas avaliações de firmeza de

fruto, pH, sólidos solúveis, acidez titulável, relação sólidos solúveis/acidez titulável (SS/AT),

teor de ácido ascórbico, atividade das enzimas pectinametilesterase e poligalacturonase e perda

de massa. Pelos resultados obtidos pode-se concluir que os tratamentos fluxapiroxade mais

x

piraclostrobina, seguido de metiram mais piraclostrobina, se destacaram dos demais

tratamentos, pois apresentaram melhor desenvolvimento das plantas e maior produção de

frutos, em razão da maior eficiência fotossintética, maiores atividades das enzimas de defesa

antioxidativa e ativação de respostas de defesa contra o ataque do patógeno.

Palavras-chave: Solanum lycopersicum L., Alternaria solani, estresse oxidativo, proteínas

relacionadas à patogênese, enzimas.

xi

ABSTRACT

MAREK, Janaina. Physiological and metabolic effects on tomatoes by strobilurins and

carboxamides. Guarapuava: UNICENTRO, 2018. (Thesis - PhD in Agronomy / Plant

Production).

The objective of this research was to evaluate the physiological and metabolic effects of

Conquistador hybrid tomato plants, cultivated in greenhouse and inoculated, with the

application of strobilurins and carboxamides. The study was realized in two years (2015 and

2016), in which the effects of the different fungicides on the development of tomato plants, on

the photosynthetic efficiency, on the antioxidative system, on the control of the disease and on

the activation of defense mechanisms were evaluated the pathogen, as well as in the production

and post-harvest of fruits. The experimental design was a randomized block with seven

treatments and five replicates, each plot being composed of four plants. The treatments used

were: T1 – inoculated control (water + inoculum); T2 – absolute control (water); T3 – boscalide

(0.075 g L-1); T4 – boscalide (0.100 g L-1) + kresoxim-methyl (0.050 g L-1); T5 – pyraclostrobin

(0.100 g L-1); T6 – fluxapiroxade (0.058 g L-1) + pyraclostrobin (0.116 g L-1) and T7 –

methyram (1,100 g L-1) + pyraclostrobin (0.100 g L-1). The effect of treatments on development

was evaluated by plant height, leaf area, fresh and dry mass of leaves, stem and root. To verify

the photosynthetic efficiency, gas exchange, chlorophyll a fluorescence, pigment content,

nitrate reductase enzyme activity and carbohydrate content were evaluated. In order to verify

the effects of treatments in the antioxidative system, in the control of the disease and activation

of defense mechanisms to the pathogen, the area under the disease progress curve (AUDPC),

concentration of superoxide anion and hydrogen peroxide, activity of the enzymes superoxide

dismutase, ascorbate peroxidase, glutathione reductase, glutathione S-transferase, glutathione

peroxidase, catalase, phenylalanine ammonia-lyase, chitinase, β-1,3-glucanase, peroxidase,

polyphenoloxidase and lipoxygenase, in addition to the phenolic compounds content, lipid

peroxidation and deposition of lignin. In order to evaluate the effects of the treatments on fruit

production and post harvesting, fruit firmness, pH, soluble solids, titratable acidity, ratio solid

silts/titratable acidity (SS/AT), ascorbic acid content, pectinametilesterase and

polygalacturonase enzyme activity, and mass loss. Based on the results obtained, it can be

concluded that the treatments fluxapiroxade plus pyraclostrobin, followed by metiram plus

xii

pyraclostrobin stood out from the other treatments, as they presented better plant development

and fruit production, due to the higher photosynthetic efficiency, higher enzyme activities of

antioxidative defense and activation of defense responses against the attack of the pathogen.

Key words: Solanum lycopersicum L., Alternaria solani, oxidative stress, proteins related to

pathogenesis, enzymes.

1

1. INTRODUÇÃO

O tomate está entre as hortaliças de maior relevância econômica e social no mundo e

seu cultivo se destaca como um dos principais geradores de empregos (FONTENELLE et al.,

2011; GRIGOLLI et al., 2011). O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é a segunda solanácea

mais cultivada, com produção estimada de 3,79 milhões de toneladas para a safra 2017 (IBGE,

2017). É cultivado nas mais diversas regiões brasileiras, abrangendo locais com diferentes

características climáticas, além de diversos sistemas de produção. É um dos frutos de hortícolas

mais consumidos no mundo, contribuindo para uma dieta saudável e equilibrada, por serem

ricos em minerais, vitaminas, aminoácidos essenciais, açúcares e fibras dietéticas, além de

conter grandes quantidades de vitaminas B e C, ferro e fósforo (NAIKA et al., 2006).

Em função da crescente expansão do cultivo surgiram vários problemas fitossanitários,

entre eles, muitas doenças fúngicas, incluindo a pinta preta, causada pelo patógeno Alternaria

solani. Esta é uma doença de ocorrência mundial e altamente agressiva, capaz de provocar

danos severos na cultura do tomateiro (DOMINGUES et al., 2009; FONTENELLE et al., 2011;

SONG et al., 2011).

Entre os métodos de controle utilizados a aplicação de fungicidas é a mais frequente

(FREITAS FILHO et al., 2008). Estes produtos químicos protegem a planta contra o ataque do

patógeno (REIS et al., 2007), podendo apresentar ação protetora ou sistêmica. Entre os

fungicidas sistêmicos registrados para o controle da pinta preta em tomateiro, encontram-se as

estrobilurinas e carboxamidas. Entretanto, estas substâncias, além da ação fungitóxica, também

proporcionam efeitos fisiológicos positivos nas plantas.

O efeito fisiológico destas moléculas tem sido estudado em diferentes culturas como

soja, feijão, milho, banana, tomate, pepino, alface, melão e videira (CARRIJO, 2014;

DEMANT; MARINGONI, 2012; LIMA et al., 2009; LIMA et al., 2012; JACOBELIS

JUNIOR, 2015; AMARO et al., 2018; MANSANO, 2014; MACEDO, 2015; MAREK, 2016),

respectivamente. De acordo com os mesmos autores, entre os principais resultados observados,

destacam-se maiores acúmulos de biomassa e produtividade, incremento fotossintético,

aumento da atividade da enzima nitrato redutase, maiores teores de pigmentos fotossintéticos e

redução do estresse oxidativo. Além de melhorar a qualidade pós-colheita de frutos de tomate

e melão (RAMOS et al., 2013; MACEDO et al., 2017).

2

Estes estudos evidenciam os efeitos fisiológicos no crescimento, desenvolvimento e

metabolismo fotossintético da planta, culminando em maior produtividade. No entanto, também

são observados efeitos no sistema antioxidativo da planta e, desta forma, podendo inferir

possíveis ações nas respostas de defesa da planta. Pois, a produção de espécies reativas de

oxigênio (EROs), como o peróxido de hidrogênio (H2O2), tem papel essencial nos mecanismos

de defesa do vegetal, além de atuar como sinalizador no processo de indução de resistência

(LEHMANN et al., 2015).

O fenômeno da indução de resistência em plantas se caracteriza pela ativação do arsenal

de defesa, que inclui barreiras físicas e bioquímicas, que a priori estariam latentes e após

expostas ao agente eliciador ou patógeno são induzidas desencadeando uma sequência de

eventos, ocorrendo maior síntese de compostos de defesa (SONG et al., 2015). Devido a isso,

a planta aumenta sua capacidade de atrasar ou evitar a entrada e, a subsequente, atividade de

um agente agressor em seus tecidos.

Assim, a aplicação de fungicidas formulados a base de estrobilurinas e carboxamidas,

além de controlarem doenças e proporcionarem os efeitos fisiológicos já descritos, também

podem ativar respostas de defesa em plantas de tomateiro. Isto possibilitaria maior controle do

patógeno e de outros possíveis agentes estressores, pois a resistência apresenta sistematicidade,

que conforme Hammerschmidt et al. (2001), a proteção não se limita apenas às partes da planta

que receberam o tratamento, mas se estende para aquelas não tratadas, além de agir de forma

não específica, podendo atuar sobre um ou vários patógenos. Portanto, o uso destes produtos se

torna uma ferramenta importante para o produtor no manejo de controle de pinta preta em

tomateiro, pois auxiliam na melhora do metabolismo das plantas incrementando a

produtividade, além de ativar o arsenal de defesa da planta.

3

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar os efeitos fisiológicos e metabólicos em plantas de tomateiro híbrido

Conquistador, cultivadas em casa de vegetação e inoculadas com Alternaria solani, pela

aplicação de boscalida, boscalida mais cresoxim-metílico, piraclostrobina, fluxapiroxade mais

piraclostrobina e metiram mais piraclostrobina.

2.2 Objetivos específicos

Por meio da aplicação dos diferentes fungicidas já citados, em plantas de tomateiro

inoculadas com A. solani, ao longo do ciclo da cultura objetivou-se:

1 - Avaliar os efeitos no desenvolvimento de plantas de tomateiro, bem como no

acúmulo de biomassa;

2 - Analisar os efeitos na taxa de assimilação de CO2, taxa de transpiração, eficiência

do uso da água, eficiência de carboxilação, fluorescência da clorofila a, teor de pigmentos

fotossintéticos, atividade da enzima nitrato redutase, concentração e translocação de

carboidratos em plantas de tomateiro;

3 - Verificar os efeitos na atividade das enzimas antioxidativas e as respostas na

peroxidação lipídica em plantas de tomateiro;

4 – Avaliar o controle da doença pinta preta em plantas de tomateiro;

5 - Mensurar os efeitos na atividade das proteínas relacionadas à patogênese e a ativação

das respostas de defesa em plantas de tomateiro e

6 - Investigar os efeitos na produção e qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro.

4

3. REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Aspectos gerais do cultivo de tomateiro

3.1.1 Origem

O centro de origem do tomateiro é a região andina, desde o Equador, passando pela

Colômbia, Peru, Bolívia, até o norte do Chile. Sua domesticação ocorreu no México, sendo os

espanhóis e portugueses os responsáveis pela difusão do tomate pelo mundo, através de suas

colônias ultramarinas. Chegou ao Brasil no século XIX, por imigrantes europeus que,

difundiram e incrementaram o consumo do tomate após a Primeira Guerra Mundial (NAIKA et

al., 2006; ALVARENGA, 2013).

3.1.2 Características botânicas e agronômicas

O tomateiro, cujo nome científico é Solanum lycopersicon, nomenclatura proposta por

Linnaeus em 1753, pertencente à família Solanaceae, que inclui outras espécies conhecidas,

como a batata, o tabaco, as pimentas e a berinjela (NAIKA et al., 2006). O tomateiro é uma

planta de porte arbustivo cultivado anualmente, podendo apresentar crescimento determinado

ou indeterminado conforme a variedade. Desenvolvem-se bem em diferentes latitudes, tipos de

solo, temperaturas e métodos de cultivos (ALVARENGA, 2013).

Apresenta sistema radicular constituído de raiz principal, raízes secundárias e

adventícias, podendo chegar a profundidades de 1,5 m, porém cerca de 70% das raízes se

encontram a menos de 20 cm da superfície. A parte aérea da planta é constituída por uma haste

principal, as folhas são alternadas, compostas com um grande folíolo terminal e cerca de 6 a 8

folíolos totais (FILGUEIRA, 2005).

A cada três folhas surge uma haste floral. A floração é influenciada por fatores como a

cultivar, temperatura, luminosidade, nutrição mineral e pela relação entre outros órgãos da

planta, assim como o efeito de reguladores vegetais (NAIKA et al., 2006).

O fruto é uma baga carnosa e suculenta, bi, tri ou plurilocular, que irá determinar o

tamanho final do fruto. As sementes são reniformes, pequenas, apresentando pequenos pelos e

de coloração marrom-clara. Um grama contém cerca de 300 sementes, sendo que um fruto pode

ter de 50 a 200 sementes. O desenvolvimento adequado da planta depende de fatores como a

cultivar, luminosidade, temperatura, nutrição, disponibilidade de água e concentração de CO2

(FILGUEIRA, 2005).

5

De acordo com Alvarenga (2013) para o cultivo de tomate encontram-se disponíveis

cultivares ou híbridos com características de hábito de crescimento indeterminado ou

determinado, caracterizados pelos segmentos de mesa e de indústria. As cultivares de hábito de

crescimento indeterminado, se destacam para a produção de frutos de mesa (consumo in natura)

e seu manejo incluem o tutoramento e podas, podendo também ser realizado o raleio de frutos

(NAIKA et al., 2006).

Quanto aos fatores climáticos, o tomateiro apresenta faixas de temperaturas ótimas

conforme o estádio de crescimento e desenvolvimento. Segundo Alvarenga (2013), para a

germinação está entre 18 a 24ºC, para a formação de mudas de 20 a 25ºC, florescimento de 18

a 24ºC, fixação de frutos de 14 a 17ºC durante a noite e de 19 a 24ºC durante o dia, e na fase de

maturação de 20 a 24ºC.

A cultura é muito exigente em água nas fases de desenvolvimento e produção. Quanto

ao fotoperíodo as plantas se desenvolvem bem entre nove e 15 horas de luminosidade diária. A

umidade relativa do ar tem efeitos indiretos, principalmente no que diz respeito à multiplicação

de fungos e bactérias fitopatogênicas (NAIKA et al., 2006).

3.1.3 Qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro

A produtividade e a qualidade pós-colheita são reflexos do manejo adotado durante

todo o ciclo da cultura. Frutos com melhor aparência visual influenciam a escolha do

consumidor, quanto ao tamanho, formato e defeitos externos do fruto. De tal forma, que no

supermercado somente os frutos que correspondem às expectativas do consumidor, tais como

cor, brilho e principalmente o tamanho têm especial relevância (HEINE et al., 2015).

A manutenção das características e a qualidade pós-colheita do tomate de mesa, durante

o armazenamento até a comercialização, são fundamentais para preservar a aparência,

principalmente a cor (atributo atrativo) e a qualidade quanto ao teor de açúcares, acidez, pH,

textura, sabor e suculência (FERREIRA et al., 2010).

O tomate caracteriza-se por ser um fruto climatérico. O fruto maduro é o resultado de

inúmeras alterações bioquímicas e fisiológicas que ocorrem nos estádios finais do

desenvolvimento do fruto, resultando em um tomate palatável e atrativo. Entre estas alterações

ocorrem modificações no metabolismo de ácidos orgânicos, açúcares, cor, atividade de enzimas

pectinolíticas e firmeza (TAIZ; ZEIGER, 2013).

6

O fruto do tomateiro é considerado saboroso, quando apresenta a proporção de sólidos

solúveis/acidez titulável (SS/AT) superior a 10 (KADER et al., 1978). Dentre as características

relacionadas à qualidade dos frutos de tomate, os teores de sólidos solúveis, pH e acidez

titulável, são características químicas que conferem o sabor ao fruto e, que também são

perceptíveis pelo consumidor (HEINE et al., 2015).

Em frutos de tomate, os açúcares são os maiores constituintes dos sólidos solúveis e são

medidos em °Brix (medida indireta da quantidade de açúcar no fruto). Desta forma, frutos com

maior conteúdo de °Brix estão relacionados à maior síntese e acúmulo de açúcares durante seu

desenvolvimento, sendo reflexo do manejo adotado na cultura (HEINE et al., 2015). A acidez

em frutos é atribuída à presença dos ácidos orgânicos. Em tomate o ácido orgânico

predominante é o ácido cítrico, correspondendo 90% da acidez titulável (SIMANDLE et al.,

1966).

As modificações na firmeza do fruto são processos desencadeados pela atividade das

enzimas pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG), que resultam no amaciamento

do fruto (menor firmeza). A ação da enzima PME é catalisar substâncias pécticas, hidrolizando

grupos metil-éster, produzindo pectinas de menor grau de metilação que servirão de substrato

para a PG. A atuação destas causam mudanças na textura do fruto, pela degradação das pectinas

(SAINZ; VENDRUSCOLO, 2015). No entanto, menor atividade destas enzimas, para frutos de

tomate, permite maior firmeza após o amadurecimento, conferindo ao fruto maior resistência a

impactos físicos sofridos durante o transporte destes até o consumidor final (HEINE et al.,

2015).

3.2 A importância econômica da cultura do tomateiro

O tomateiro é uma das principais hortaliças, sendo a segunda solanácea mais cultivada

no mundo, superada apenas pela produção de batata. Devido a sua flexibilidade na utilização

como alimento, por suas qualidades organolépticas e ao alto teor de vitamina C, tem aceitação

por grande parte dos consumidores (ALVARENGA, 2013).

O aumento do consumo é o principal fator para a expansão da produção de tomate.

Conforme os dados do IBGE (2017), a produção brasileira de tomate possui uma estimativa de

3,79 milhões de toneladas na safra de 2017. A produção está distribuída ao longo de todo país,

sendo a região Sudeste responsável por 45% do total produzido no país, seguida pelas regiões

7

Centro-Oeste, Nordeste e Sul 20,9%, 20,3% e 13,0%, respectivamente, sendo que o Paraná tem

uma participação na produção de 4,5%.

Dentro do agronegócio brasileiro, segundo Rodrigues (2012) o setor da horticultura tem

se destacado como um forte gerador de renda e trabalho para muitas famílias. Estima-se um

total de 700 mil hectares cultivados com geração de cerca de 300 mil empregos em toda a cadeia

produtiva.

Entretanto, a cultura do tomate possui inúmeras doenças fitossanitárias, que podem

acometer a planta ao longo do ciclo, o que a torna uma hortaliça de elevado nível de risco

econômico (ALVARENGA, 2013).

3.3 Ocorrência de doenças

A cultura do tomateiro está sujeita a muitas doenças que causam prejuízos significativos.

Grande parte das doenças é controlada eficientemente a partir de um adequado programa de

manejo, integrando o uso de variedades resistentes e a adoção de medidas de exclusão,

erradicação e proteção da planta contra agentes fitopatogênicos (KUROZAWA; PAVAN,

2005).

Conforme Alvarenga (2013) as doenças que dizimam os tomateiros podem ser causadas

por agentes fúngicos, viróticos, bacterianos, nematoides ou até mesmo doenças fisiológicas.

Entre essas doenças, uma das principais é a pinta preta, causada pelo fungo Alternaria solani,

com ocorrência em todas as regiões onde o tomateiro é cultivado.

3.3.1 Pinta preta do tomateiro: aspectos gerais da doença

O agente causal da pinta preta, Alternaria solani (Ellis; Martin) L.R. Jones; Grout, foi

descrito pela primeira vez em folhas de beterraba em New Jersey em 1882 e a sua

patogenicidade foi estabelecida por volta de 1896. Este agente patológico pertence ao grupo

dos fungos da classe Deuteromycetes, ordem Moniliales e Família Dematiaceae (VALE et al.,

2000).

O fungo se caracteriza por possuir micélio septado e ramificado. Os conidióforos

possuem 12-20 x 120-296 μm, são simples, septados, longos, sub-hialinos a escuros com

conídios terminais. Estes são multicelulares, com septos transversais e longitudinais, clavados

com uma das extremidades pontiagudas, com ou sem apêndice (VALE et al., 2000;

KUROZAWA; PAVAN, 2005).

8

A infecção por A. solani ocorre, principalmente, em condições de temperatura e

umidade elevadas (FILGUEIRA, 2005). As temperaturas mínimas, ótimas e máximas

necessárias para a germinação dos conídios de A. solani são 5, 27 e 32º C, respectivamente

(SALUSTIANO et al., 2006). Desta forma, havendo umidade e calor suficiente, o fungo penetra

diretamente através da cutícula ou via estômatos após a formação de apressório. As lesões

tornam-se visíveis sob condições favoráveis entre 48 a 120 horas após a inoculação. A

ocorrência de epidemias severas desse patógeno está associada a temperaturas diárias de 25 a

32ºC (KUROZAWA; PAVAN, 2005).

O fungo é disseminado facilmente pelo vento e pode sobreviver entre um cultivo e outro,

em restos de culturas infectadas, podendo ainda sobreviver em equipamentos agrícolas, estacas

e caixas usadas para o transporte de frutos. Além do tomateiro, o fungo A. solani infecta outras

solanáceas como batata, berinjela, pimentão e jiló (VALE et al., 2000; KUROZAWA; PAVAN,

2005; ALVARENGA, 2013).

Muitas espécies patogênicas do gênero Alternaria são produtoras de toxinas prolíficas,

que facilitam a sua vida necrotrófica. Estes patógenos necessitam matar as células hospedeiras

antes da colonização e, portanto, são as toxinas secretadas que facilitam a morte da célula

causando danos ao tecido, resultando em necrose da área lesionada (LAWRENCE et al., 2008).

Os fungos fitopatogênicos são capazes de produzir grande número de enzimas

hidrolíticas extracelulares, as quais vêm sendo estudadas em A. solani, sendo que alguns autores

já detectaram atividades aminolíticas, pectinolíiticas e celulolíticas. Resultados obtidos a partir

das atividades aminolítica e pectinolítica de 45 isolados de A. solani, provenientes de diferentes

hospedeiros, revelaram possível envolvimento na patogênese. As diferenças nestas atividades

enzimáticas extracelulares contribuíram para diagnosticar a especificidade de hospedeiro

(MARCHI et al., 2006).

Este perfil enzimático é inter ou intra especificamente variável (MAHMOUD; OMAR,

1994), colaborando para a diferenciação de espécies ou de isolados dentro de uma mesma

espécie. Durante a infecção, segundo Agrios (2004), as enzimas extracelulares parecem

favorecer a penetração, colonização, bem como a obtenção de nutrientes e/ou contribuir nas

reações de defesa da planta.

Devido à forte agressividade com que se desenvolve, a pinta preta provoca perdas diretas

por infectar os frutos e indiretas pela redução do vigor da planta, reduzindo o crescimento

9

devido ao decréscimo da fotossíntese, pelos danos a área fotossinteticamente ativa, além da

ocorrência da desfolha em estágios mais avançados da doença (ALVARENGA, 2013).

A doença apresenta alto potencial destrutivo, incidindo sobre folhas, hastes, pecíolos e

frutos do tomateiro, causando danos em qualquer estádio de desenvolvimento da planta. Toda

parte aérea da planta pode apresentar sintomas da doença, independentemente da idade, mas há

maior tendência de lesões aparecerem, com maior frequência, nas folhas mais velhas

(KUROZAWA; PAVAN, 2005).

Nestas folhas a doença caracteriza-se pela presença de manchas pequenas de cor

marrom-escura, circundadas ou não de um halo amarelado. À medida que a lesão cresce,

formam-se anéis concêntricos, bastante característicos desta doença (FREITAS FILHO et al.,

2008). Quando não é controlada adequadamente há severa destruição da área foliar e, nos

frutos, verifica-se podridão deprimida, circular, próxima ao pedúnculo, coberta por mofo preto

(ALVARENGA, 2013).

Conforme avaliações realizadas por Paula e Oliveira (2003), notou-se que a partir da

quarta semana após o transplante ocorreu a maior incidência de pinta preta, tanto em tomateiros

em sistema rasteiro como no tutorado, acentuando-se gradativamente em algumas cultivares.

Segundo Töfoli e Domingues (2005) o aumento de suscetibilidade à pinta preta está associado

aos tecidos maduros, sendo mais frequente durante a fase de frutificação.

Condições ideais para a ocorrência de epidemias severas também foram observadas por

Salustiano et al. (2006) na região de Viçosa, onde observaram que nas épocas de plantio, em

que predomina temperaturas entre 20 e 30ºC, com presença de molhamento foliar e/ou chuva,

favorece consideravelmente a ocorrência da pinta preta. Entretanto, em épocas de temperaturas

amenas (≤ 20ºC), os mesmos autores relataram que, mesmo na presença de molhamento foliar

e/ou chuvas, a curva de progresso da doença se desenvolveu lentamente, com severidades de

20 a 30% ocorrendo somente ao final do ciclo da cultura, quando a produção já havia atingido

seu máximo.

3.3.2 Controle de pinta preta em tomateiro

Diversos métodos de controle têm sido utilizados no combate das principais doenças

fúngicas do tomateiro. Para o controle de pinta preta são recomendados métodos culturais,

como sementes de boa procedência, rotação de cultura, eliminação de restos culturais,

espaçamento adequado à boa aeração e adubação equilibrada (KUROZAWA; PAVAN, 2005;

10

FREITAS FILHO et al., 2008). Outra opção viável e econômica é a utilização de variedades

resistentes, podendo reduzir a dependência de fungicidas (RAO et al., 2007).

Porém, o controle químico ainda é o método mais utilizado, o qual pode ser feito com

fungicidas protetores e/ou curativos indicados para a cultura (FREITAS FILHO et al., 2008).

De acordo com Reis et al. (2007) fungicidas são produtos químicos aplicados em plantas para

promover a proteção contra a penetração e/ou posterior desenvolvimento dos patógenos,

podendo ser classificados, de maneira geral, como fungicidas de contato ou sistêmico.

Fungicidas sistêmicos, como as estrobilurinas e carboxamidas que são alguns dos

fungicidas registrados para o controle da pinta preta na cultura do tomateiro, são absorvidos

pelas folhas e translocados pelo sistema condutor da planta, proporcionando uma ação protetora

prolongada (REIS et al., 2010). Fungicidas do grupo das estrobilurinas, como a piraclostrobina

e o cresoxim-metílico, atuam na inibição da respiração mitocondrial, que bloqueia a

transferência de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c1, interferindo na produção de ATP

e na síntese de energia do patógeno (KANUNGO; JOSHI, 2014; MATOS et al., 2016).

Pertencente ao grupo químico das carboxamidas, o fungicida boscalida vem sendo uma

nova alternativa para o manejo da pinta preta na cultura do tomateiro. Este princípio ativo tem

ação preventiva e curativa, atuando na germinação de esporos, alongamento do tubo

germinativo, crescimento micelial e esporulação de uma ampla variedade de fungos (EFSA,

2015). Sendo classificado como inibidor da respiração na célula fúngica atuando sobre o

complexo II (TÖFOLI, 2004), semelhante ao fluxapiroxade, outra carboxamida. Ambos atuam

na respiração mitocondrial, bloqueando a transferência de elétrons no complexo II, inibindo a

enzima succinato dehidrogenase (SDHI), reduzindo o processo respiratório e bloqueando o

fornecimento de energia das células do fungo (FRAC, 2017).

No entanto, pesquisas têm evidenciado que além da ação fungitóxica destes produtos

formulados a base de estrobilurinas e carboxamidas têm sido relatados efeitos simultâneos na

fisiologia de plantas (DIAZ-ESPEJO et al., 2012; LIMA et al., 2012; DEMANT;

MARINGONI, 2012; RAMOS et al., 2013; COLOMBARI et al., 2015; JADOSKI et al., 2015;

MAREK, 2016; MACEDO et al., 2017; AMARO et al., 2018). A ação extra destes produtos é

importante, pois as práticas agrícolas buscam por manejo que aumentem a eficiência

fotossintética das culturas, e consequentemente, seus rendimentos (BRANDÃO FILHO et al.,

2003).

11

3.4 Efeitos fisiológicos das estrobilurinas e carboxamidas

O uso de fungicidas apenas como agente de controle de fitopatógenos tem mudado.

Segundo Venancio et al. (2003) o lançamento das estrobilurinas mudou o conceito de controle

de doenças, sobretudo pelas vantagens obtidas com a ação destes produtos no metabolismo

vegetal promovendo efeitos fisiológicos positivos nas plantas.

A aplicação de estrobilurinas ativam diferentes rotas metabólicas nos vegetais. Estudos

têm demonstrado que ocorre a ativação da enzima NADH-nitrato redutase, aumento da

assimilação de nitrato e sua posterior incorporação nas moléculas vitais da planta, como a

clorofila. Além disso, ocorre o aumento da eficiência de assimilação de CO2, elevação da taxa

fotossintética e redução da taxa respiratória. Outro efeito promissor é a redução na produção de

etileno, que retarda a senescência das folhas, aumentando o período que a planta permanece

com a fotossíntese ativa, também chamado de ‘efeito verde’ (VENANCIO et al., 2003;

TÖFOLI; DOMINGUES, 2007; FAGAN et al., 2010), repercutindo consequentemente em

aumentos significantes no rendimento das culturas.

A partir dos efeitos fisiológicos observados com o uso das estrobilurinas, estudos com

outras moléculas como boscalida e fluxapiroxade, também têm sido realizados para avaliar seu

potencial no metabolismo e desenvolvimento das plantas. O efeito fisiológico destas moléculas

já foi relatado em diferentes culturas como soja (TSUMANUMA et al., 2010; FAGAN et al.,

2010; SOARES et al., 2011; CARRIJO, 2014), feijão (KOZLOWSKI et al., 2009; DEMANT;

MARINGONI, 2012; JADOSKI et al., 2015), milho (LIMA et al., 2009), banana (LIMA et al.,

2012), tomate (RAMOS et al., 2013; JACOBELIS JUNIOR, 2015), pepino (SIRTOLI et al.,

2011; AMARO, 2011; AMARO et al., 2018), alface (MANSANO, 2014), melão (MACEDO,

2012; 2015; MACEDO et al., 2017), cenoura (COLOMBARI et al., 2015) e videira (MAREK,

2016).

Entre os principais resultados observados se destacam maiores acúmulos de matéria seca

e produtividade (LIMA et al., 2009; KOZLOWSKI et al., 2009; TSUMANUMA et al., 2010;

AMARO, 2011; DEMANT; MARINGONI, 2012; COLOMBARI et al., 2015; JADOSKI et al.,

2015; MAREK, 2016), incremento na taxa fotossintética (FAGAN et al., 2010; CARRIJO,

2014; MANSANO, 2014; AMARO et al., 2018), aumento da atividade da enzima nitrato

redutase e efeito verde (SOARES et al., 2011; MACEDO, 2012; 2015; RAMOS, 2013),

alterações hormonais e atraso na senescência (FAGAN et al., 2010), maior qualidade na pós-

colheita em frutos (RAMOS et al., 2013, MACEDO et al., 2017), formação de óxido nítrico e

12

ativação de respostas de defesa (VENANCIO et al., 2003) e menor estresse oxidativo nas

plantas (AMARO, 2011; MACEDO, 2012; 2015, JACOBELIS JUNIOR, 2015; JADOSKI et

al., 2015; AMARO et al., 2018).

3.5 Desenvolvimento de plantas

As plantas crescem, se desenvolvem e produzem frutos graças ao processo

fotossintético, pelo qual produzem fotoassimilados, a partir do sol, que emite radiação em

diferentes comprimentos de onda (KLUGE et al., 2014). Avaliar o crescimento e

desenvolvimento de plantas é inferir sobre a sua capacidade assimilatória em sintetizar e alocar

os fotoassimilados nos diferentes órgãos. Desta forma, plantas que apresentam maior área

foliar, possuem maior capacidade de aproveitar a energia em prol da fotossíntese, apresentando

melhor desenvolvimento e ganhos de produtividade (REIS et al., 2013).

Unindo maior área fotossintética ativa com alto teor de pigmentos fotossintéticos têm-

se o maior aproveitamento da energia solar para a síntese de compostos orgânicos

(RODRIGUES et al., 2016). Aproximadamente 90% da massa seca de uma planta é formada a

partir dos produtos oriundos da fotossíntese (fotoassimilados), portanto, a planta utiliza uma

parte do que produz para crescer, convertendo em biomassa, e outra parte oxida na respiração

como fonte de energia para seu metabolismo. Sendo assim, a fotossíntese líquida (fotossíntese

bruta menos a respiração) é um indicador da eficiência fotossintética das plantas em assimilar

o CO2 e converter em compostos orgânicos (POPOV et al., 2003).

As plantas realizam fotossíntese durante algumas horas por dia (± 4 horas dia-1) e

respiram durante 24 horas, consumindo considerável parte dos compostos que produziram

durante o período de fotossíntese (informação verbal)1. Desta forma, para se obter maior

produção de frutos em uma planta, é necessário aumentar a fotossíntese líquida através do

aumento da fotossíntese bruta e redução da respiração (KLUGE et al., 2014).

3.6 Eficiência fotossintética

3.6.1 Trocas gasosas

Estudar a fisiologia da planta, no que diz respeito à eficiência fotossintética, visando

ganhos de produtividade tornou-se uma importante estratégia no manejo da cultura. De acordo

1 Rodrigues, J. D. (Professor Titular, Depto. Botânica – IB – UNESP – Botucatu. Comunicação pessoal, 2017.

e-mail: [email protected]

13

com Macedo (2015) as avaliações de trocas gasosas são importantes ferramentas para se avaliar

a capacidade fotossintética das plantas, além da vantagem de ser um método não destrutivo que

permite a análise qualitativa e quantitativa da fotossíntese na planta.

A produção de biomassa depende da eficiência fotossintética dos órgãos fontes, com

forte influência sobre o desenvolvimento do vegetal (FOYER; GALTIER, 1996). A fotossíntese

líquida, de acordo com Popov et al. (2003) indica a eficiência da taxa de assimilação de CO2.

Desta forma, mensurar estes parâmetros fisiológicos em plantas de tomateiro, visando

ganhos de produtividade, é uma ferramenta importante para se avaliar as taxas de assimilação

de CO2, de transpiração, condutância estomática e concentração interna de CO2 nas folhas, além

de determinar as relações entre estas, obtendo a eficiência do uso da água e eficiência de

carboxilação (BRANDÃO FILHO et al., 2003).

3.6.2 Pigmentos fotossintéticos e fluorescência da clorofila a

A eficiência fotossintética de uma planta está fortemente associada à quantidade de

clorofilas presentes no tecido foliar. De acordo com Rodrigues et al. (2016) o aumento nos

teores de clorofilas resulta em maior absorção da luz solar e como resultado, ocorre maior

transporte de elétrons nos fotossistemas durante a fase fotoquímica da fotossíntese. A absorção

da luz ocorre nos fotossistemas I e II (PSI e PSII), sendo estes constituídos de pigmentos

fotossintéticos como as clorofilas a e b que estão presentes nas membranas dos tilacóides

(CASIERRA-POSADA; PEÑA-OLMOS, 2015).

Os pigmentos fotossintéticos são compostos orgânicos que absorvem a energia

proveniente da radiação solar no espectro de luz visível (400 a 700 nm). No entanto, a luz possui

duas importantes características físicas, além de onda eletromagnética ela também transporta

uma quantidade de energia (fóton) (TAIZ; ZEIGER, 2013). A absorção desta energia causa uma

instabilidade na molécula de clorofila, tornando-a excitada. Uma vez na forma instável, a

clorofila precisa retornar ao seu estado basal de energia e para isto precisa dissipar esta energia

na forma de calor e/ou como fluorescência e/ou utilizando nas reações fotoquímicas

(CAMPBELL; FARRELL, 2006).

Pensando em maior eficiência fotossintética na produção vegetal, a via fotoquímica é a

mais importante, pois é nesta que ocorre a fixação do CO2 em uma molécula orgânica pela

enzima Ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) que atua no ciclo de Calvin

(TAIZ; ZEIGER, 2013). Para que ocorra a síntese dos compostos orgânicos é necessário

14

primeiramente a produção de ATP e NAPH2, formados durante o transporte de elétrons entre o

PSII e o PSI. Sendo justamente neste processo, que os pigmentos fotossintéticos atuam

eficientemente convertendo a energia solar em energia química nos centros de reação (YEOM

et al., 2014).

No entanto, plantas quando submetidas a condições de estresse abiótico ou biótico,

sofrem alterações no equilíbrio das reações fotossintéticas que acabam causando danos ao

aparato fotossintético. A planta reflete este dano por meio da concentração de pigmentos ou

pela maior emissão de fluorescência da clorofila a (BRESTIC; ZIVCAK, 2013).

A avaliação da fluorescência da clorofila a também é uma técnica não destrutiva que

permite a análise qualitativa e quantitativa da absorção e aproveitamento da energia luminosa

pelo aparato fotossintético, revelando em especial a ‘saúde’ e eficiência dos fotossistemas I e

II (KRAUSE; WEIS, 1991), além de permitir avaliar a taxa de transporte de elétrons (ETR)

entre os centros de reação. Desta forma, evidenciando a qualidade de organização e a eficiência

fotossintética, refletindo no status da planta naquele momento, identificados pelos parâmetros

avaliados (BAKER, 2008; BRESTIC; ZIVCAK, 2013).

3.6.3 Nitrato redutase

Altas atividades da enzima nitrato redutase estão relacionadas a altas produtividades nas

culturas, uma vez que esta é a enzima chave na regulação do metabolismo do nitrogênio

(VIANA; KIEHL, 2010). O nitrogênio participa diretamente do metabolismo da planta, sendo

importante constituinte da molécula de clorofila, ácidos nucleicos, aminoácidos e proteínas

(TAIZ; ZEIGER, 2013).

O nitrogênio, dentre os elementos minerais essenciais para a planta, se destaca como um

dos principais componentes da biomassa. Assim, para suprir suas necessidades, as plantas

absorvem o nitrogênio da solução do solo nas formas de nitrato e amônio, sendo que o nitrato

é a principal forma inorgânica do elemento e sua disponibilidade está ligada diretamente ao pH

do solo e a relação C/N (ERNANI, 2016).

O nitrato (NO3) disponível na solução do solo, após absorvido pelas raízes precisa passar

pelo processo de redução, que ocorre no citoplasma por intermédio da enzima nitrato redutase,

reduzindo nitrato à nitrito (NO2), usando o NADH como doador de elétrons. Na sequência, o

nitrito é transportado até os cloroplastos onde é reduzido à amônia pela enzima nitrito redutase,

15

recebendo elétrons da ferredoxina. Posteriormente a amônia é incorporada em moléculas

orgânicas, entre estas as clorofilas a e b (TAIZ; ZEIGER, 2013).

Entre os efeitos fisiológicos proporcionados pelas estrobilurinas e, recentemente

observados para as carboxamidas, se destaca o aumento da atividade da enzima nitrato redutase.

De acordo com Glaab e Kaiser (1999) estes fungicidas atuam no metabolismo da planta

promovendo a queda nos níveis celulares de ATP, pois eles agem no transporte de elétrons

(como já descrito), desta forma a menor síntese de ATP aumenta a concentração de prótons

(H+) no citosol, este desequilíbrio é a chave propulsora para a ativação da enzima nitrato

redutase. Assim, quanto mais nitrogênio é absorvido e incorporado pela planta, maior é a

produção de compostos nitrogenados como os aminoácidos, que são as bases da biossíntese de

proteínas e, consequentemente, ocorre o aumento na biomassa das plantas.

3.7 Estresse oxidativo

As condições de estresse biótico e abiótico impostas às plantas (alta luminosidade,

extremos de temperatura, seca, salinidade, radiação UV, poluição do ar, herbicidas,

estresses físicos e mecânicos, ou bióticos como o ataque de patógenos) induzem a

superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROs ou ROS, do inglês reactive oxygen

species), formadas durante funções metabólicas normais e causam danos oxidativos em

proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, caracterizando o estresse oxidativo (SCANDALIOS et

al., 2000; FOYER; NOCTOR, 2003; D´AUTRÉAUX; TOLEDANO, 2007; BARBOSA et al.,

2014).

De acordo com Stangarlin et al. (2011) entre as principais EROs presentes no

metabolismo celular de plantas se destacam o ânion superóxido (•O2-), dotado de baixa

capacidade oxidativa; o peróxido de hidrogênio (H2O2) capaz de romper a membrana do núcleo

e causar danos ao DNA; o radical hidroxila (OH•), com baixa capacidade de difusão, porém alta

reatividade provocando lesões em uma série de moléculas em meio celular; e o oxigênio

singleto (1O2), formado a partir da transferência da energia de ativação para o O2, também

produzindo efeitos deletérios.

As EROs são formadas inevitavelmente nos organismos aeróbicos, em eventos

metabólicos que ocorrem em especial nas mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos. Quando

as plantas estão sob condições de estresse abiótico ou biótico ocorre o aumento na produção

destas espécies (BHATTACHARJEE, 2010; KARUPPANAPANDIAN et al., 2011).

16

A geração das EROs também pode ocorrer a partir de danos no sistema fotossintético

(SOARES; MACHADO, 2007), com a formação de oxigênio singleto (1O2). Quando a energia

armazenada na clorofila não é dissipada para a síntese de carboidratos, é então transferida para

o O2, promovendo o transporte pseudocíclico de elétrons (BHATTACHARJEE, 2010). Isto

ocorre devido à baixa fixação de CO2 e menor poder redutor (NADP+), a ferredoxina acaba

transferindo o elétron para o O2 formando •O2- (AHMAD et al., 2008).

As EROs também atuam na via de sinalização em resposta a situações de estresse nas

plantas, influenciando na expressão de vários genes envolvidos no metabolismo de defesa,

agindo como “moléculas sinalizadoras” ou “mensageiros secundários” (BARBOSA et al.,

2014; RECZEK; CHANDEL, 2015).

3.7.1 Enzimas envolvidas na defesa antioxidativa

De acordo com Moller et al. (2007) para combater os danos oxidativos das EROs, as

plantas dispõem de um sistema de defesa composto por mecanismos antioxidantes

enzimáticos e não enzimáticos, que trabalham em conjunto e em sincronia para

desintoxicar as células.

As defesas não enzimáticas incluem as vitaminas C e E, glutationa, β-caroteno,

compostos fenólicos, tocoferóis e poliaminas, ácido ascórbico, α-tocoferol e os carotenoides. O

sistema defensivo enzimático envolve as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalases

(CAT), peroxidases (POD), glutationa peroxidase (GPX), ascorbato peroxidase (APX),

glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST). Todos eles ocorrem em cloroplastos,

mitocôndrias e peroxissomos (SCANDALIOS, 2005; KIM; KWAK, 2010; DINAKAR et al.,

2012; NOCTOR et al., 2015; LEHMANN et al., 2015).

A SOD, uma metalo-enzima, é considerada a primeira linha de defesa contra os danos

causados pelas EROs, pois catalisa a dismutação do radical livre superóxido •O2-, gerando O2 e

H2O2 (GIANNOPOLITIS; RIES, 1977; ALSCHER et al., 2002; MITTLER, 2002;

BHATTACHARJEE, 2010).

A enzima SOD é classificada de acordo com seus cofatores metálicos: cobre e zinco

(Cu/Zn-SOD), manganês (Mn-SOD) e ferro (Fe-SOD) (GILL; TUTEJA, 2010). Geralmente as

plantas contêm uma Mn-SOD localizada na matriz mitocondrial e uma Cu/ZnSOD citosólica,

com Fe-SOD e/ou Cu/Zn-SOD presentes no estroma do cloroplasto. O

17

número de isoenzimas de cada tipo de SOD varia muito de planta para planta, assim

como a quantidade relativa de cada enzima (RESENDE et al., 2003; GILL et al., 2015).

A função principal CAT é prevenir os efeitos potencialmente danosos causados por

mudanças na homeostase de H2O2 (VAN BREUSEGEM et al., 2001; IGAMBERDIEV; LEA,

2002). As CATs são as principais enzimas na eliminação do H2O2 gerado durante a

fotorrespiração e a β-oxidação dos ácidos graxos. Ela converte duas moléculas de H2O2 em

água (H2O) e oxigênio molecular (O2) (DUBEY, 2010).

As plantas possuem várias isoformas de CAT, as quais podem dismutar

diretamente o H2O2 ou oxidar substratos, tais como metanol, etanol, formaldeído e ácido

fórmico (VAN BREUSEGEM et al., 2001; IGAMBERDIEV; LEA, 2002). A atividade da CAT

é efetiva, principalmente em concentrações relativamente altas de H2O2 (mM), por isso são

consideradas indispensáveis para a eliminação das EROs, especialmente em condições de

estresse severo, onde se tem níveis de H2O2 elevados (DUBEY, 2010).

Nas plantas também existem muitas isoformas de PODs, algumas são expressas

enquanto outras são induzidas em resposta ao estresse ambiental. As PODs localizam-se

principalmente na parede celular e no vacúolo, agem utilizando o H2O2 como oxidantes e

compostos de natureza fenólica como doadores de elétrons. São consideradas uma das mais

importantes na eliminação de H2O2 no citosol e nos cloroplastos. Inclusive o H2O2 formado

pela ação da SOD também pode ser eliminado pelas PODs, além da CAT e da APX (LOCATO

et al., 2010).

A enzima APX também é considerada importante na eliminação do H2O2 no citosol e

nos cloroplastos. A degradação do H2O2 ocorre pela utilização do ascorbato como substrato. O

ascorbato é o doador de elétrons específicos para reduzir o H2O2 à água, constituindo parte do

ciclo conhecido como ciclo da ascorbato-glutationa (INZÉ; MONTAGU, 1995; RESENDE et

al., 2003). Esta enzima é importante na defesa de tecidos fotossintéticos contra o estresse

fotoxidativo. A APX também é encontrada no citosol das células não fotossintetizantes atuando

na redução dos níveis de EROs (ASADA, 1999; RESENDE et al., 2003).

Concomitantemente, a enzima GPX catalisa a eliminação de H2O2 e atua na

desintoxicação dos produtos formados na peroxidação lipídica, em decorrência dos danos

oxidativos pela atividade das EROs (DIXON et al., 2010). Nas plantas são encontradas três

isoformas de GPXs, as dependentes de selênio, as hidroperoxidase de fosfolipídios não

18

dependente de selênio (PHGPXs) e glutationa S-transferases com atividade de glutationa

peroxidase (BELA et al., 2015).

Já a GR é uma enzima responsável por catalisar a redução da GSSG (glutationa oxidada)

para GSH (glutationa reduzida). A GR pode ser encontrada tanto em cloroplasto quanto em

mitocôndria, mas sua síntese ocorre no citoplasma da célula de onde é direcionada para as

organelas (HAYES; MCLELLAN, 1999). Esta enzima é encontrada em procariotos e

eucariotos, desde bactérias heterotróficas e fotossintetizantes até plantas e animais superiores

(FOYER et al., 1997).

A GR desempenha papel importante na defesa contra o estresse oxidativo, pois mantém

o equilíbrio entre os níveis de GSSG e GSH na célula. A GSH é uma molécula importante

dentro do sistema celular, participando inclusive do ciclo ascorbato-glutationa (NOCTOR et

al., 2002) ou ainda, da síntese de fitoquelatinas (GRATÃO et al., 2005).

Em parceria com as GRs, as GSTs são enzimas que catalisam a conjugação de GSH à

substratos hidrofóbicos eletrofílicos, como xenobióticos (DIXON et al., 2002). São proteínas

encontradas preferencialmente no citoplasma (MARRS, 1996). Várias classes de GST foram

identificadas em plantas respondendo aos mais diversos tipos de estressores bióticos ou

abióticos (DIXON et al., 2002). De acordo com Ahmad et al. (2010) enquanto a GPX elimina

o H2O2 formando H2O, competindo com a catalase pelo substrato e oxidando GSH, a GST

catalisa a adição de GSH, por isso são diferentes nas suas subunidades e mecanismo catalítico,

no entanto, apresentam funções complementares.

3.7.2 Peroxidação lipídica

As EROs têm funções biológicas definidas quando estão em concentrações fisiológicas

adequadas, atuando como mensageiros e/ou sinalizadores (BARBOSA et al., 2014). Entretanto,

em altas concentrações devem ser evitadas pela planta, considerando que sua reatividade

causará danos oxidativos em proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, caracterizando o estresse

oxidativo (SCANDALIOS et al., 2000; FOYER; NOCTOR, 2003; RIBEIRO et al., 2005;

D´AUTRÉAUX; TOLEDANO, 2007; BARBOSA et al., 2014).

Como são moléculas altamente reativas, as EROs irão reagir com os lipídios

formadores de membranas ocorrendo assim, a peroxidação lipídica. A consequência

direta do dano da peroxidação de lipídios sobre as membranas celulares é o

extravasamento do conteúdo celular para o meio, por danificarem irreversivelmente as

19

membranas, além de formar novos radicais lipídicos (DAN HESS, 2000; KRUSE et al.,

2006).

Este efeito deletério das EROs sobre os ácidos graxos poli-insaturados dos

fosfolipídios das membranas celulares, resulta na desintegração destas, permitindo o

livre transporte de substâncias (tanto a entrada quanto a saída) do interior celular. As

EROs ativam as fosfolipases, desintegrando os fosfolipídios, liberando os ácidos

graxos não saturados, resultando em ruptura das membranas celulares (bombas de Na/K e

Ca/Mg), ocasionado danos ao DNA, oxidando lipídios insaturados, formando resíduos

químicos (ex.: malondialdeído) e comprometendo os componentes da matriz extracelular

(RIBEIRO et al., 2005). Além de afetar diretamente diversas moléculas essenciais como

pigmentos fotossintéticos, proteínas e ácidos nucléicos (FOYER et al., 1997), podendo ocorrer

a paralização do metabolismo celular (LIN et al., 2005).

Os lipídios insaturados da mitocôndria, membrana plasmática e de outras organelas são

os principais locais de deterioração oxidativa. Pois, os ácidos graxos insaturados

destas membranas possuem ligações fracas e de fácil rompimento, e tornam-se alvo da presença

excessiva de EROs, ocorrendo à remoção do hidrogênio destes lipídios (MISHRA et al., 2006).

O radical •O2- é um dos principais oxidantes responsáveis pela peroxidação de

lipídios, sua formação causa o aumento na permeabilidade das membranas no ambiente

celular (BREUSEGEM et al., 2001; APEL; HIRT, 2004). O uso de elicitores bióticos

ou abióticos, ou a presença de um patógeno também pode causar estresse oxidativo à

planta, levando a formação de altas concentrações de EROs e a ocorrência de peroxidação de

lipídios (ADAM et al., 1989; KEPPLER; BAKER, 1989).

A peroxidação de lipídios também atua como precursora para a síntese de ácido

jasmônico, por intermédio das enzimas lipoxigenases. O ácido jasmônico ativa a expressão de

vários genes relacionados à defesa durante as reações de hipersensibilidade na planta

(FARMER; RYAN, 1992).

3.8 Indução de resistência e a defesa vegetal contra patógenos

No ambiente de cultivo as plantas estão vulneráveis ao ataque de uma vasta gama de

patógenos. Entretanto, os vegetais dispõem de um sistema de defesa, que inclui barreiras físicas

e bioquímicas pré e pós-formadas, que atuam na proteção contra o ataque de fitopatógenos

(THAKUR; SOHAL, 2013).

20

Quando se refere à indução de resistência, se estuda principalmente as barreiras pós-

formadas, que a priori estariam latentes, e após expostas ao agente eliciador ou patógeno, são

induzidas e desencadeiam uma cascata de eventos que culminam em maior síntese dos

compostos de defesa (SONG et al., 2015).

O fenômeno da indução de resistência em plantas tem sido descrito como resistência

sistêmica adquirida (RSA) e resistência sistêmica induzida (RSI). Conforme Hammerschmidt

et al. (2001) este termo ‘sistêmico’ revela que a proteção não se limita apenas às partes da planta

tratada, mas se estende para as não tratadas e, muitas vezes, até naquelas em desenvolvimento.

Portanto, a resistência do hospedeiro a um patógeno é definida como a capacidade da planta em

atrasar ou evitar a entrada e a subsequente atividade deste em seus tecidos.

A indução de resistência ocorre tanto em nível de plasmalema quanto no interior da

célula da planta hospedeira, podendo ser desencadeada por diferentes agentes elicitores biótico

e abiótico (orgânicos ou sintéticos) (OLIVEIRA et al., 2016). De tal forma, a resistência pode

ocorrer tanto após a infecção (pós-infeccional) ou induzida por um agente ou substância

elicitora (SHAH et al., 2014). No entanto, as substâncias envolvidas nesta defesa serão

sintetizadas somente após a ativação, evitando gasto energético desnecessário (STANGARLIN

et al., 2008).

De acordo com Edreva (2004) quando uma planta é inoculada com um agente

patogênico ("inoculação primária"), e após um intervalo de tempo é submetido a uma

inoculação secundária ("desafio"), observa-se redução no desenvolvimento dos sintomas da

doença. As defesas da planta são pré-condicionadas pela infecção anterior ou tratamento, que

resulta em resistência (ou tolerância) contra o subsequente desafio por um patógeno (RAGAB

et al., 2009).

Como já dito, a indução é a ativação de mecanismos latentes que passam a se expressar

após a exposição da planta ao eliciador. O reconhecimento precoce do patógeno pela planta é

muito importante, uma vez que ela pode mobilizar a tempo as defesas bioquímicas e estruturais

disponíveis para se proteger do patógeno. Quando uma planta é levada ao estado de indução,

seja por eliciadores bióticos ou abióticos, não se trata de um caso de imunidade, pois a doença

pode acontecer, porém em menor intensidade (AGRIOS, 2004).

Durante a interação-planta patógeno ocorre a produção de EROs, que inicia com uma

explosão oxidativa primária, seguida de micro explosões secundárias, culminando no

acionamento dos mecanismos de defesa antioxidante (BHATTACHARJEE, 2010) e atuando

21

na sinalização intracelular de respostas fisiológicas e biológicas (RECZEK; CHANDEL, 2015).

Além disto, o contato entre um eliciador e os tecidos da planta também desencadeia a síntese

destas substâncias, que agem como sinais bioquímicos (BECKERS; SPOEL, 2006).

Entre as EROs, o H2O2 tem papel essencial nos mecanismos de defesa da planta, pois

este agente oxidante tem efeito tóxico agindo diretamente sobre as estruturas do patógeno, além

de se acumular no sítio de infecção restringindo o desenvolvimento da lesão (resposta de

hipersensibilidade – HR). O H2O2 também atua como sinalizador, aumentando a atividade da

enzima benzoico 2-hidrolase, precursora na síntese do ácido salicílico (hormônio crucial na

sinalização da RSA) (LEHMANN et al., 2015).

O H2O2 tem características importantes para o processo de indução de resistência. Esta

molécula apesar de alguns autores não a classificar como um radical livre, por não ter elétrons

desemparelhados na última camada (BARTOSZ, 1997; COTINGUIBA et al., 2015), apresenta

moderada reatividade, meia-vida relativamente longa (1 ms) e tamanho pequeno, características

que permitem ao H2O2 maior facilidade em atravessar membranas celulares e migrar para

diferentes locais, tendo atuação em regiões distantes do local em que foi produzido

(BHATTACHARJEE, 2010; BARBOSA et al., 2014), por isso é tão importante nos processos

de sinalização em condições de estresse.

Na sinalização desencadeada pelo processo de indução de resistência, de acordo com

Shah et al. (2014), podem ser ativadas diferentes rotas metabólicas dependentes do estímulo

inicial. Geralmente ocorre a ativação da rota via ácido salicílico em resposta à infecção por

patógenos biotróficos ou hemibiotróficos, enquanto que para patógenos necrotróficos são

ativadas rotas dependentes de etileno ou ácido jasmônico (THAKUR; SOHAL, 2013). Segundo

Walkvria (1992) a indução de resistência ocorre na planta hospedeira, tendo como efeito

secundário a inibição, bloqueio ou mesmo a morte do patógeno.

Além dos hormônios vegetais, o óxido nítrico (NO) também apresenta importante papel

na difusão da sinalização de respostas de defesa nos vegetais (GAO et al., 2015). Esses sinais

se difundem por toda a planta sistemicamente ou induzindo sua síntese em cadeia. Estudos

demonstram que os diferentes mecanismos de proteção na planta, se iniciam com as HRs, pelo

aumento das EROs e de NO. Os mecanismos regulatórios das EROs funcionam de forma

independente ou em cooperação com o NO, em resposta ao ataque de patógenos (BELLIN et

al., 2013).

22

Quando plantas são previamente expostas a um eliciador, seus tecidos reagem mais

rapidamente e com mais eficiência às tentativas de colonização por um patógeno virulento

(ROMEIRO; GARCIA, 2009). Para ser considerado um eliciador o produto deve conter uma

ou mais moléculas que ativem as respostas de defesa na planta onde foi aplicado (BONALDO

et al., 2005) e seguir os critérios propostos pelos pesquisadores Steiner e Schönbeck (1995).

Estes autores propõem que um agente abiótico ou biótico para ser considerado indutor de

resistência deve obedecer aos seguintes requisitos:

1. Ausência de efeito tóxico sobre o patógeno;

2. Necessidade de intervalo de tempo entre a aplicação do agente indutor e as respostas de

defesa (indução de resistência);

3. Inespecificidade da proteção, ou seja, a indução de resistência deve conferir proteção a uma

ampla gama de patógenos;

4. Ausência de relação entre efeito e doses do indutor.

São exemplos de eliciadores bióticos ou abióticos compostos químicos dos mais

variados grupos, extratos de células ou filtrados de culturas de microrganismos, agentes físicos

ou químicos, moléculas orgânicas, reguladores vegetais e antibióticos (HAMMERSCHMIDT

et al., 2001; OOSTENDORP et al., 2001; AGRIOS, 2004; EDREVA, 2004; FAIZE et al.,

2004; RESENDE et al., 2007; ROMEIRO; GARCIA, 2009).

A utilização de produtos que induzem mecanismos de resistência nas plantas constitui

uma alternativa para o manejo integrado das doenças na cultura do tomateiro. Itako et al. (2012)

avaliaram em casa de vegetação a ação de produtos químicos no controle da mancha bacteriana

(Xanthomonas perforans) do tomateiro e na ativação de proteínas relacionadas à patogênese e,

observaram que os produtos à base de piraclostrobina juntamente com acibenzolar-S-metil

induziram as atividades das enzimas peroxidase, polifenoloxidase e β-1,3-glucanase,

evidenciando que estes produtos podem estar relacionados à indução de resistência a mancha

bacteriana em plantas de tomateiro.

Ao avaliarem a aplicação de ácido abscísico exógeno em plantas de tomateiro, Song et

al. (2011) obtiveram resultados que demonstram a ativação da resistência em plantas de

tomateiro contra A. solani, resultando em redução de áreas de lesão e gravidade da doença.

Ainda, relataram que esse efeito protetor promovido parece estar correlacionado com a

expressão de genes de defesa e com a ativação de enzimas de defesa como a fenilalanina

amônia-liase, polifenoloxidase e peroxidase em plantas de tomateiro.

23

3.8.1 Proteínas envolvidas na indução de resistência

Após o início do processo de indução de resistência ocorre uma cascata de fenômenos

bioquímicos, incluindo as respostas de hipersensibilidade, desencadeadas pelo acúmulo de

H2O2 no tecido vegetal, culminando na ativação da expressão gênica e, subsequente, síntese de

proteínas relacionadas à patogênese (PRPs) (SHAH et al., 2014).

Como já visto, as PRPs são induzidas no hospedeiro em resposta à infecção por um

patógeno ou por estímulos abióticos, e podem estar correlacionadas com a resistência não

específica do hospedeiro ao patógeno (STANGARLIN et al., 2011). Atualmente são conhecidas

17 famílias de PRPs em vegetais com as mais diferenciadas funções, variando de PR-1 até PR-

17 (GORJANOVIĆ, 2009; FILIPENKO et al., 2013). Nos vegetais, segundo Van loon et al.

(2006) as PRPs podem ser encontradas em estômatos, tricomas glandulares, vasos condutores,

epiderme foliar etc., e possuem a capacidade de se acumular em locais distantes do sítio de

infecção (EBRAHIM et al., 2011).

As principais PRPs estudadas no processo de indução de resistência são as peroxidases,

quitinases e β-1,3-glucanases (GAO et al., 2015). As enzimas β-1,3-glucanases, classificadas

como PR-2, são proteínas que hidrolisam ligações glicosídicas do tipo β-1,3 presentes em β-D-

glucanas, liberando glucose como produto principal. Estas enzimas estão presentes em plantas,

algas, fungos, bactérias, cianobactérias, actinomicetos e oomicetos (TAMOI et al., 2007; LIN

et al., 2009).

Em interações planta-patógeno ocorrem a indução da atividade de β-1,3-glucanases

(SELS et al., 2008) as quais degradam as β-glucanas, enzimas multifuncionais que hidrolisam

polissacarídeos como a celulose e outras glucanas, combatendo a invasão do patógeno no tecido

vegetal, uma vez que as β-1,3-1,6- glucanas constituem grande parte da parede celular destes

microrganismos (KUMAR; DEOBAGKAR, 1996; FLEURI; SATO, 2008).

Estas enzimas também depositam β-1,3-glucano após a ocorrência de ferimentos no

tecido vegetal dificultando a penetração do patógeno. Além disto, atuam em processos

fisiológicos como divisão celular, mobilização de moléculas de reserva entre outros

(BUCHNER et al., 2002; EL GHAOUTH et al., 2004).

As quitinases são enzimas amplamente encontradas na natureza, de acordo com a

especificidade do substrato que hidrolisam estão classificadas como PR-8 (atividade sobre a

lisozima) e PR-11 (atividade sobre quitosana) (MARTINS, 2008). As quitinases produzidas por

plantas estão envolvidas na defesa contra microrganismos e contra estresses abióticos. Elas são

24

induzidas durante o processo de infecção por patógenos ou outro tipo de estresse do meio

ambiente (PERRAKIS et al., 1994).

Esta enzima catalisa a hidrólise de ligações glicosídicas da quitina. A quitina é o

segundo biopolímero mais abundante na natureza, perdendo apenas para a celulose, e

encontrado principalmente nas carapaças de crustáceos, cutículas de insetos e parede celular de

fungos (THARANATHAN; KITTER, 2003).

Uma vez induzidas pelo ataque de patógenos as quitinases atuam através de uma série

de eventos degenerativos na célula do patógeno, incluindo a desorganização das células do

fungo fitopatogênico e da sua cutícula. Com isso o fungo sofre desequilíbrio osmótico,

agregação e recolhimento do citoplasma e da membrana plasmática (CASTORIA et al., 2001).

De acordo com Martins (2008) as quitinases e β-1,3-glucanases, por atuarem na hidrólise da

parede celular de fungos, possuem atuação sinérgica potencializando a ação antifúngica.

Além de serem importantes como enzimas antioxidantes, as enzimas peroxidases

(POD), também participam na lignificação, suberização e no metabolismo da parede celular,

por isso são classificadas como PRPs, pertencentes à família PR-9 (VAN LOON; VAN

STREIN, 1999; EBRAHIM et al., 2011).

Estas enzimas catalisam reações envolvendo o H2O2 e compostos fenólicos para reforçar

a parede celular da planta. As macromoléculas polimerizadas pelas PODs são depositadas na

superfície extracelular, fortalecendo a parede celular, restringindo a invasão por patógenos e a

expansão celular, contribuindo para o enrijecimento da estrutura da planta (HIRAGA et al.,

2001).

3.8.2 Metabolismo secundário e defesa vegetal

Os metabólitos secundários são compostos de baixo peso molecular produzidos em

menores concentrações pelas plantas, no entanto, ocorre o aumento da produção destes em

virtude da interação planta-patógeno (THAKUR; SOHAL, 2013). A formação desses

compostos tóxicos é essencial no processo de defesa contra o agente agressor no local de

infecção (SHAH et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2016).

A ativação das respostas de defesa ocorre como uma cascata de fenômenos, e

simultaneamente com o aumento da expressão de PRPs, se observa aumento na atividade de

outras enzimas, como a fenilalanina amônia-liase (PAL). O aumento da expressão da enzima

PAL está relacionada a maior síntese e acúmulo de compostos fenólicos, seguido também de

25

maior deposição de lignina no tecido vegetal, aumentando a defesa da planta (OLIVEIRA et

al., 2016).

Entre os produtos oriundos do metabolismo secundário, os compostos fenólicos,

sintetizados no metabolismo dos fenilpropanóides, são importantes substâncias de defesa contra

patógenos (SCHWAN-ESTRADA et al., 2008). O metabolismo dos fenilpropanóides inclui

uma série complexa de caminhos bioquímicos que proporcionam às plantas milhares de

combinações. Com isso, muitos deles são intermediários na síntese de substâncias estruturais

das células, como a lignina. A biossíntese de lignina envolve uma série de enzimas, dentre elas

a enzima PAL (BOATRIGHT et al., 2004).

A PAL está relacionada com a resistência de plantas a patógenos, notadamente, por estar

envolvida no primeiro passo da síntese dos fenilpropanóides, convertendo fenilalanina em

ácido-transcinâmico e síntese de compostos como fitoalexinas, e principalmente, de substâncias

envolvidas na biossíntese de lignina, que confere maior resistência à parede celular das plantas

aos patógenos (NAKAZAWA et al., 2001; ZHAO et al., 2005).

O aumento da atividade da PAL está fortemente relacionado aos diferentes tipos de

estresses, entre eles à invasão por patógenos, no entanto, também pode ser ativada pela presença

de compostos eliciadores. Por ação da maior atividade da PAL, ocorre aumento na síntese dos

compostos fenólicos, que são produzidos rapidamente e se acumulam após a infecção, sendo

tóxicos aos patógenos. Os ácidos clorogênico, caféico e ferúlico são exemplos de alguns desses

compostos (CAMPOS et al., 2004) com forte atuação na defesa contra microrganismos, além

de proteção contra danos por radiação ultravioleta (CAMPOS et al., 2003).

Outras vias do metabolismo secundário também estão envolvidas com a defesa vegetal,

como é o caso da via dos octadecanóides. Danos no tecido foliar desencadeiam vias de

sinalização envolvidas com a ativação das lipases, que liberam ácido linolênico e linoleico da

membrana plasmática. Tais ácidos graxos ativam a cascata de sinalização via ácido jasmônico,

culminado na rota do octadecanóide. Entre as enzimas envolvidas nesta rota, se destacam as

lipoxigenase (LOX) e polifenoloxidase (PPO) (TAIZ; ZEIGER, 2013).

As enzimas LOXs são isoenzimas que estão amplamente distribuídas em plantas

superiores e catalisam a formação de hidroperóxidos a partir dos ácidos linolênico e linoleico

(STENZEL et al., 2003), atuando como enzima chave na biossíntese do ácido jasmônico, sendo

a LOX a primeira enzima desta cascata de sinalização de resposta de defesa vegetal. Os

produtos da via da LOX já foram associados à defesa contra patógenos (RANCÉ et al., 1998;

26

STANGARLIN et al., 2011) e sua atividade é regulada, ente outros fatores, pelo ataque de

patógenos e insetos herbívoros (PORTA et al., 2008).

A PPO é uma enzima encontrada em muitas plantas, bactérias, fungos e algas

(THIPYAPONG et al., 2004). Em plantas superiores se localiza nos tilacóides dos cloroplastos

ou em outros plastídeos. Em sua forma ativa, a PPO catalisa a hidroxilação de monofenóis a o-

dofenóis (cresolase) e a oxidação de o-difenóis a o-diquinonas (catecolase) (SHIN et al., 1997;

BITTNER, 2006).

Pequenas quantidades de PPO podem ser encontradas na parede celular, no entanto, a

maior concentração destas enzimas está localizada nos tilacóides (THIPYAPONG et al., 2004),

são abundantes em tecidos lesionados pela invasão de patógenos ou insetos, sendo importantes

nos mecanismos de defesa (CAMPOS et al., 2003; THIPYAPONG et al., 2004).

A função das PPOs no processo de indução de resistência está relacionada ao aumento

da resistência da parede celular dos tecidos vegetais. Estas enzimas, juntamente com as PODs,

oxidam compostos fenólicos, colaborando com a biossíntese de lignina, aumentando as

barreiras físicas contra o ataque de patógenos (YUAN et al., 2002).

A maior atividade das enzimas PAL, POD e PPO promovem maior síntese e deposição

de lignina nos tecidos vegetais. Em folhas de algodão, Guerra et al. (2013) observaram que altas

concentrações de compostos fenólicos e o aumento da atividade da PPO e POD, aumentaram o

fortalecimento da parede celular, devido a maior deposição de lignina.

O aumento da síntese de compostos fenólicos ocorre por ação da maior atividade da

PAL simultaneamente e, conforme aumenta a lignificação das células, ocorre a redução do

conteúdo de compostos fenólicos nas mesmas, uma vez que estas substâncias são substrato para

a síntese de lignina, por ação da POD e PPO (KUHN; PASCHOLATI, 2010).

A lignina é um composto essencial para as plantas e confere a rigidez das células e

tecidos, sendo fundamental em situações de estresse, conferindo maior resistência, estando

presente na parede celular de folhas, caules e raízes (TAIZ; ZEIGER, 2013). Na indução de

resistência, a maior deposição de lignina constitui importante barreira física e química,

dificultando a penetração pelos patógenos. Por isso, é considerada uma das substâncias mais

importantes presentes na parede celular do hospedeiro (CASTRO et al., 2010).

27

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Caracterização da área de estudo

Foram conduzidos dois experimentos: experimento I no ano de 2015 e experimento II

no ano de 2016, em casa de vegetação e laboratório de fitopatologia, pertencentes ao

Departamento de Agronomia, da Universidade Estadual do Centro-Oeste (UNICENTRO),

Campus Cedeteg, no município de Guarapuava/PR, localizada na latitude 25°23’36” S e

longitude 51°27’1’’ W, e 1.025 metros de altitude. O clima da região é classificado como Cfb

subtropical mesotérmico úmido (KÖPPEN, 1948).

Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação (Figura 1), com cobertura de

filme de polietileno, no período de janeiro a maio de 2015 e de 2016 (os dois experimentos

foram conduzidos na mesma época).

Figura 1. Casa de vegetação: vista externa (A) e vista interna (B). Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

4.2 Material vegetal: semeadura e transplante

Foi utilizado o híbrido de tomateiro ‘Conquistador’ (Sakata Seeds Sudamérica Ltda.),

tipo salada, de crescimento indeterminado. As mudas foram preparadas em bandejas de

polipropileno com 128 células preenchidas com substrato comercial Carolina Soil® II,

composto de turfa de esfágno, vermiculita expandida, resíduo orgânico agroindustrial classe A,

calcário dolomítico, gesso agrícola e traços de fertilizantes NPK, pH 5,5 ± 0,5, CE 0,7 ± 0,3

mScm-1 e densidade 145 kg m-3, colocando-se uma semente por célula. A semeadura foi

realizada no dia 2 de dezembro de 2015 (experimento I) e de 2016 (experimento II).

28

As mudas foram transplantadas para os vasos de 10 dm3, no dia 6 de janeiro de 2015

(experimento I) e de 2016 (experimento II) e, após, foi realizada a primeira irrigação para

aclimatação das mudas. Os vasos foram preenchidos com solo coletado no campo experimental

na mesma Universidade, classificado como Latossolo Bruno distroférrico típico (EMBRAPA,

2013), para a execução do experimento I (2015) e reutilizado para a execução do experimento

II (2016) e, em ambos, foram realizadas a análise química, conforme Tabela 1.

A distribuição dos vasos foi realizada com espaçamento de 1,0 x 0,5 m, estimando uma

densidade de 20.000 plantas ha-1.

4.3 Material vegetal: tratos culturais

A correção e adubação de base foram realizadas de acordo com a análise química

(Tabela 1) para ambos os experimentos. Ao longo do ciclo, a irrigação foi realizada por

gotejamento. A adubação de cobertura foi realizada conforme a necessidade da cultura, de

acordo com Alvarenga (2013).

Tabela 1. Análise química de solo dos experimentos I e II nos anos de 2015 e 2016,

respectivamente. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

pH M.O. PMehlich Al H+Al K Ca Mg SB CTC V%

Amostra CaCl2 g dm-3 g dm-3 --------------------------------- mmolc dm-3 -----------------------

2015 5,3 47,1 2,5 0,0 3,6 0,12 2,9 1,5 4,52 8,12 55,7

2016 5,1 46,0 2,3 0,0 3,7 0,15 2,8 1,1 4,05 7,75 52,3

Micronutrientes Enxofre (S) Boro (B) Ferro (Fe) Cobre (Cu) Manganês (Mn) Zinco (Zn)

Amostra -------------------------------------------------------- mg dm-3 ---------------------------------------------------

2015 5,0 0,45 31,3 0,5 28,2 1,9

2016 6,0 0,42 30,2 0,4 26,4 1,4

O controle de plantas daninhas foi efetuado manualmente e o controle de pragas foi

realizado conforme recomendações para a cultura do tomateiro:

• Foi aplicado 15 mL planta-1 via ‘drench’ (esguicho) no transplantio das mudas de 0,6g

L-1 do inseticida formulado com o princípio ativo midacloprido, do grupo químico

neonicotinóide (Evidence®700WG) para o controle de tripes (Thrips palmi), pulgão-verde

(Myzus persicae) e mosca-branca (Bemisia tabaci e B. tabaci raça B);

• Aos 30, 45, 60 e 75 dias após o transplantio foi aplicado via foliar 0,8 mL L-1 do

inseticida formulado com o princípio ativo lufenurom, do grupo químico benzoiluréia (Match

29

EC) para o controle da traça do tomateiro (Tuta absoluta), broca pequena do fruto

(Neoleucinodes elegantalis) e ácaro bronzeado (Aculops lycopersici);

• Aos 25, 35, 45, 55 e 65 dias após o transplantio foi aplicado via foliar 1 mL L-1 do

inseticida formulado com os princípios ativos tiametoxam e lambda-cialotrina, dos grupos

químicos neonicotinóide e piretróide, respectivamente (Engeo Pleno) para o controle de mosca-

branca (Bemisia tabaci).

As plantas foram conduzidas com uma haste ao longo do ciclo, com duas plantas por

vaso e tutoradas na vertical, individualmente, com a utilização de fitilho (experimento I) e de

bambu (experimento 2) (Figura 2). A retirada de brotos foi efetuada quando estes apresentavam

3 a 5 cm de comprimento. As plantas foram conduzidas até o quinto cacho de frutos, quando

foi realizada a poda apical.

Figura 2. Plantas de tomateiro em casa de vegetação tutoradas verticalmente com fitilho (Experimento I – 2015)

e bambu (Experimento II – 2016). Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

Durante o período do experimento (janeiro a maio de cada ano), por meio de termo-

higrômetro digital (Incoterm) instalado dentro da casa de vegetação, foram coletados

diariamente dados de temperatura e da umidade relativa do ar (máxima e mínima).

4.4 Delineamento experimental e tratamentos

O delineamento experimental utilizado foi blocos ao acaso, com sete tratamentos e cinco

repetições, sendo cada parcela composta por quatro plantas.

A primeira aplicação dos tratamentos foi realizada 15 dias após o transplantio (DAT) e

as demais em intervalos de quinze dias, totalizando seis aplicações. As aplicações foram

30

realizadas via foliar, na planta toda, com o uso de pulverizador manual de CO2 pressurizado,

com 0,3 kgf/cm2, bico cônico aberto, utilizando-se cortina plástica entre os tratamentos para

evitar deriva.

Os tratamentos utilizados foram:

T1 – testemunha inoculada (água + inóculo);

T2 – testemunha absoluta (água);

T3 – boscalida (0,075 g L-1);

T4 – boscalida (0,100 g L-1) + cresoxim-metílico (0,050 g L-1);

T5 – piraclostrobina (0,100 g L-1);

T6 – fluxapiroxade (0,058 g L-1) + piraclostrobina (0,116 g L-1) e

T7 – metiram (1,100 g L-1) + piraclostrobina (0,100 g L-1).

4.5 Caracterização dos fungicidas

4.5.1 Boscalida

Como fonte de boscalida utilizou-se o fungicida Cantus® contendo 500g kg-1 de

princípio ativo, fabricado pela BASF S.A.

• Nome químico: 2-chloro-N-(4'-chlorobiphenyl-2-yl) nicotinamide;

• Fórmula molecular: C18H12Cl2N2O;

• Classe: Fungicida sistêmico do grupo químico carboxamida (anilida);

• Tipo de formulação: Granulado Dispersível (WG).

4.5.2 Boscalida + Cresoxim-metílico

Como fonte de boscalida + cresoxim-metílico utilizou-se o fungicida Collis® contendo

200g L-1 de princípio ativo boscalida e 100g L-1 de princípio ativo cresoxim-metílico, fabricado

pela BASF S.A.

• Nome químico: 2-chloro-N-(4'-chlorobiphenyl-2-yl) nicotinamide (Boscalida) e methyl(E)-

2-methoxyimino[2-(o-tolyloxymethyl) phenyl]acetate (Cresoxim-metílico);

• Fórmula molecular: C18H12Cl2N2O (Boscalida) e C18H19NO4 (Cresoxim-metílico);

• Classe: Fungicida sistêmico do grupo químico carboxamida (anilida) (Boscalida) e

estrobilurina (Cresoxim-metlico);

• Tipo de formulação: Suspensão Concentrada (SC).

31

4.5.3 Piraclostrobina

Como fonte de piraclostrobina utilizou-se o fungicida Comet® contendo 250g L-1 de

princípio ativo, fabricado pela BASF S.A.

• Nome químico: Methyl N-{2-[1-(4-chlorophenyl) -1H-pyrazol-3-yloxymethyl]phenyl}

(Nmethoxy)carbamate;

• Fórmula molecular: C19H18ClN3O4;

• Classe: Fungicida sistêmico do grupo químico das estrobilurinas;

• Tipo de formulação: Concentrado Emulsionável – EC.

4.5.4 Fluxapiroxade + Piraclostrobina

Como fonte de fluxapiroxade + piraclostrobina utilizou-se o fungicida Orkestra®SC

contendo 167g L-1 do princípio ativo fluxapiroxade e 333g L-1 do princípio ativo

piraclostrobina, fabricado pela BASF S.A.

• Nome químico: 3-(difluoromethyl)-1-methyl-N-(3′,4′,5′-trifluorobiphenyl-2-yl)pyrazole-4-

carboxamide (fluxapiroxade) e MethylN-{2-[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-yloxymethyl]phenyl}

(Nmethoxy)carbamate (piraclostrobina);

• Fórmula molecular: C18H12F5N3O (fluxapiroxade) e C19H18ClN3O4 (piraclostrobina);

• Classe: Fungicida de ação protetora e sistêmica, dos grupos químicos estrobilurina

(Piraclostrobina) e carboxamida (Fluxapiroxade);

• Tipo de formulação: Suspensão Concentrada (SC).

4.5.5 Metiram + Piraclostrobina

Como fonte de metiram + piraclostrobina utilizou-se o fungicida Cabrio®Top contendo

550g kg-1 do princípio ativo metiram e 50g kg-1 do princípio ativo piraclostrobina, fabricado

pela BASF S.A.

• Nome químico: Zinc ammoniate ethylenebis(dithiocarbamate)-poly(ethylenethiuram

disulfide) (metiram) e MethylN-{2-[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-yloxymethyl]phenyl}

(Nmethoxy) carbamate (piraclostrobina);

• Fórmula molecular: (C16H33N11S16Zn3)x (metiram) e C19H18ClN3O4 (piraclostrobina);

• Classe: Fungicida sistêmico do grupo químico alquilenobis (ditiocarbamato)(Metiram)

e estrobilurina (Piraclostrobina);

• Tipo de formulação: Granulado Dispersível (WG).

32

4.6 Isolamento e inoculação do patógeno: Alternaria solani

O isolado de A. solani inoculado no experimento I (2015) foi obtido a partir de lesões

de folhas de plantas de tomateiro na região de Guarapuava/PR. No experimento II (2016) foi

inoculado o isolado obtido de lesões das plantas testemunhas do experimento I (2015).

Para a manutenção destes isolados, os fungos foram cultivados em meio BDA (batata

ágar dextrose) e incubados em BOD a 25ºC (± 2°C) em fotoperíodo de 12 horas de luz e 12

horas de escuro, por 10 dias. Após, foram guardados discos destas culturas em microtubos

Eppendorf (2 mL) contendo água destilada esterilizada e preservados em BOD, nas mesmas

condições de cultivo.

Para a recuperação destes isolados foram realizados repiques em placas de Petri

contendo meio BDA e incubadas em BOD, nas mesmas condições já citadas, para prover a

suspensão de inóculo inicial para os experimentos. Após o crescimento micelial preencher toda

a placa de Petri (Figura 3A), que ocorreu em média de 8 a 10 dias após a repicagem, foi realizada

a indução da esporulação a partir de injúrias do micélio (estresse físico), utilizando cortes com

bisturi, em toda a extensão da colônia, nos sentidos longitudinal e transversal (Figura 3B).

Realizadas as injúrias, as culturas retornaram às condições de incubação e, após seis

dias, verificou-se a esporulação das culturas. Então foram removidos os esporos com 15 mL de

água destilada esterilizada (com 0,1% de Tween 80), por raspagem com alça de vidro e posterior

filtragem em gaze. A determinação da concentração de esporos na suspensão foi realizada em

câmara de Neubauer ao microscópio de luz, determinando o número de conídios mL-1.

Figura 3. Cultura de Alternaria solani antes (A) e após (B) injúria mecânica dos micélios. Unicentro,

Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

33

A concentração da suspensão para a inoculação foi ajustada para 1x104 conídios mL-1.

As plantas, com exceção do tratamento testemunha absoluta (T2) foram inoculadas 24 horas

após a primeira aplicação dos tratamentos (16 DAT). A inoculação foi realizada com

pulverização da suspensão de conídios na face abaxial e adaxial dos folíolos de todas as folhas

da planta, com pulverizador manual spray, até que gotas fossem formadas e começassem a

escorrer e pingar pelas extremidades dos folíolos. Após inoculação das plantas foram

monitoradas a umidade e temperatura da casa de vegetação, para que as condições ideais ao

desenvolvimento do patógeno fossem mantidas.

4.7 Propriedades avaliadas

4.7.1 Análise de desenvolvimento

Foram realizadas avaliações da altura de planta aos 14 (antes da primeira aplicação dos

tratamentos) e aos 21, 28, 35, 42, 49, 56 e 65 DAT (dias após o transplantio). A última avaliação

ocorreu aos 65 DAT, momento no qual foi realizada a poda apical. Para as medições utilizou-

se régua graduada e os resultados foram expressos em cm planta-1.

Aos 120 DAT (término da colheita) foram coletadas cinco plantas de cada tratamento e

divididas em folha, caule e raiz, após foram mensuradas as seguintes características: área foliar,

massa fresca e seca de folhas, caule e raiz.

A área foliar foi mensurada utilizando-se integralizador de área, Area Meter da LiCor®

modelo LI-3100 e seus resultados expressos em centímetros quadrados (cm2). As folhas, caules

e raízes foram secos em estufa de circulação forçada de ar, à temperatura constante de 60°C,

até atingir massa constante (em média 72 horas). Após as amostras foram pesadas em balança

analítica (0,001 g) e os resultados expressos em gramas (g).

4.7.2 Trocas gasosas

As avaliações de trocas gasosas foram realizadas aos 34 e 94 DAT (5º dia após a segunda

e sexta aplicação dos tratamentos, respectivamente), em folhas completamente expandidas,

localizadas no terço médio da planta (Figura 4). Foram realizadas leituras em duplicata, no

período das 9:00 às 11:00 h da manhã.

Estas medidas foram realizadas utilizando-se equipamento com sistema aberto de

fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água por radiação infravermelha (“Infra Red Gas

Analyser – IRGA”, modelo LI-6400XT, LI-COR) e foram calculadas a partir da diferença entre

34

a concentração de CO2 e o vapor d’água do ar de referência (valor presente na câmara sem a

folha) e da amostra (valor presente na câmara com a folha), obtendo-se as concentrações de

vapor d’água e CO2 que foram liberados (transpiração – vapor d’água) e assimilados

(assimilação de CO2) através dos estômatos foliares.

Figura 4. Análise de trocas gasosas em plantas de tomateiro (A e B). Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

As características de trocas gasosas analisadas foram: taxa de assimilação de CO2 (A,

μmol CO2 m-2 s-1), taxa de transpiração (E, mmol vapor d’água m-2 s-1), condutância estomática

(gs, mol m-2 s-1) e concentração interna de CO2 na folha (Ci, μmol CO2 mol-1 ar). Essas

características foram calculadas pelo programa de análise de dados do equipamento medidor de

trocas gasosas, que utiliza a equação geral de trocas gasosas de Von Caemmerer e Farquhar

(1981).

A eficiência do uso da água (EUA, μmol CO2 (mmol H2O)-1) foi determinada através da

relação entre a taxa de assimilação de CO2 e a taxa de transpiração (A/E). A eficiência de

carboxilação da enzima ribulose 1, 5-difosfato carboxilase (Rubisco) foi determinada através

da relação entre taxa de assimilação de CO2 e a concentração interna de CO2 na folha (A/Ci).

4.7.3 Fluorescência da clorofila a

A fluorescência da clorofila a foi avaliada utilizando fluorômetro portátil

(Portable Chlorophyll Fluorometer - PAM-2500). As leituras foram realizadas aos 34 e 94

DAT (5º dia após a segunda e sexta aplicação dos tratamentos, respectivamente), em folhas

completamente expandidas, localizadas no terço médio da planta (Figura 5A). Foram realizadas

35

medições de cinética lenta, com adaptação das folhas ao escuro por 20 minutos (para que todos

os centros de reação estivessem abertos, com capacidade de receber elétrons) (Figura 5B), e as

leituras foram realizadas em duplicata, no período das 9:00 às 11:00 h da manhã,

simultaneamente com as de trocas gasosas.

Figura 5. Clip para adaptação ao escuro: indicado pela seta (A); Análise de fluorescência da clorofila a em plantas

de tomateiro. Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

Os parâmetros de fluorescência da clorofila a foram obtidos automaticamente e

armazenados na memória do PAM e, posteriormente, foram descarregados em computador por

meio do programa computacional Wincontrol.

Foram obtidos os parâmetros de fluorescência basal (F0) e fluorescência máxima (Fm),

a partir dos quais foram calculados: a fluorescência variável (Fv) e rendimento quântico máximo

do PSII (Fv/Fm). Também foram obtidas as respostas de rendimento quântico fotoquímico

efetivo do PSII, Y(II) e taxa de transferência relativa de elétrons (ETR).

4.7.4 Nitrato Redutase

Para avaliar a atividade da enzima nitrato redutase (NR, EC 1.6.6.1) foram realizadas

oito coletas de folíolos aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 DAT, que correspondem aos

momentos:

• Tempo 0 hora, antes da aplicação dos tratamentos (15 DAT);

• 5° dia após a primeira aplicação dos tratamentos (20 DAT);

• 5° dia após a segunda aplicação dos tratamentos (35 DAT);

• 5° dia após a terceira aplicação dos tratamentos (50 DAT);

36

• 5° dia após a quarta aplicação dos tratamentos (65 DAT);

• 5° dia após a quinta aplicação dos tratamentos (80 DAT);

• 5° dia após a sexta e última aplicação dos tratamentos (95 DAT);

• 15 dias após a última aplicação dos tratamentos (105 DAT).

Foram coletados folíolos entre as 10 e 11 horas da manhã, período em que as plantas

receberam pelo menos três horas de sol e a enzima nitrato redutase já tinha atingido sua máxima

atividade (HAGEMAN; REED, 1980).

Após coletadas, as folhas foram colocadas em pacotes confeccionado com papel

alumínio e armazenadas em caixa de isopor com gelo (mantendo o material fresco, sem

congelar). Na sequência, o material coletado foi levado para o laboratório e a atividade da

enzima nitrato redutase foi determinada de acordo com metodologia proposta por Streeter e

Bosler (1972), onde foram pesadas 1g da amostra fresca em tubos protegidos da luz (revestidos

de papel alumínio).

Em seguida foram adicionados 8 mL de tampão composto por fosfato (KPi) 0.1M pH

7,5 + KNO3 0,2M, a reação foi conduzida à 37ºC por 1 hora. Depois desse período, foram

adicionados 1 mL de sulfanilamida 1% em HCl 1,5% + 1 mL de α–Naftil 0,2%. Após 5 minutos,

a amostra foi filtrada em algodão e a leitura realizada em espectrofotômetro a 540 nm. As

amostras foram coletadas e analisadas no mesmo dia da coleta. A atividade da enzima nitrato

redutase foi expressa em μg nitrito min-1 g de massa fresca-1.

4.7.5 Pigmentos fotossintéticos

Para a determinação do teor de pigmentos foram realizadas oito coletas de discos de

folhas (2 discos de 200 mm² de diâmetro), realizadasno período entre 9 e 10 horas da manhã,

aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 DAT, que correspondem aos momentos:









37

Imediatamente após a coleta, os discos de folhas foram colocados em pacotes

confeccionado com papel alumínio e, em seguida, congelados em nitrogênio líquido para

paralização imediata de todas as reações. Na sequência, o material coletado foi levado para o

laboratório e a determinação do teor de pigmentos foi realizada pelo método

espectrofotométrico proposto por Lichtenthaler e Wellburn (1983).

Para as análises foram pesadas 0,030 g de material vegetal congelado, após foi triturado

em nitrogênio líquido em almofariz de porcelana. Para a obtenção do extrato, o material vegetal

foi macerado em sala escura, com adição de 8 mL de acetona a 80% e 0,01 g de carbonato de

cálcio (Ca(CO3)2). Esta solução foi centrifugada por 20 minutos a 13500 g.

Para as leituras de absorbância no espectrofotômetro foi utilizado o sobrenadante,

utilizando-se os comprimentos de onda de 470, 646,8 e 663,2nm.

Para os cálculos do teor de pigmentos clorofilianos (chl a, b e total) foram utilizadas as

fórmulas abaixo:

Clorofila a (µg/ml) = 12,21 A663 – 2,81 A646

Clorofila b (µg/ml) = 20,13 A646 – 5,03 A663

Chls a + b = 17,76 A646,6 + 7,34 . A663,6

Para o cálculo do teor de xantofilas e carotenoides (x + c) utilizou-se a fórmula:

Carotenoides (µg/mL) = (1000A470 – 3,27[Chl a] - 104[Chl b])

229

Os teores de pigmentos clorofilianos e carotenoides foram expressos em µg g de massa

fresca-1.

4.7.6 Análise de carboidratos

Para determinar o conteúdo de carboidratos (açúcares redutores e açúcares solúveis)

foram realizadas duas avaliações destrutivas ao longo do desenvolvimento, sendo a primeira

realizada aos 50 DAT e a segunda aos 120 DAT (último dia de colheita). Foram coletadas cinco

plantas por tratamento, as quais foram separadas em folha, caule e frutos. Para cada repetição,

as amostras foram homogeneizadas e alíquotas de 2,0 g foram armazenadas em pacotes

confeccionado com papel alumínio a -20°C até o momento da extração.

O conteúdo de carboidratos foi determinado nos diferentes órgãos vegetais: folhas, caule

e frutos. A extração dos açúcares foi realizada de acordo com metodologia proposta por Garcia

et al. (2006), utilizando 0,1 g de material vegetal fresco e homogeneizado. O extrato obtido foi

38

armazenado, separado em microtubos e armazenado a -20°C até a determinação dos

carboidratos.

Para a quantificação dos açúcares solúveis totais foram utilizadas as metodologias de

Morris (1948) e Yemm e Willis (1954). A leitura foi realizada em espectrofotômetro a

620 nm, utilizando solução de glicose para a confecção da curva padrão. Os açúcares

solúveis totais foram expressos em µg g de massa fresca-1.

A quantificação de açúcares redutores foi realizada, segundo metodologia de Miller

(1959). A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 540 nm, utilizando solução de glicose

para a confecção da curva padrão. Os açúcares redutores foram expressos em µg g de massa

fresca-1.

4.7.7 Avaliação da severidade de Alternaria solani

A severidade da doença foi avaliada ao surgimento dos primeiros sintomas, que ocorreu

cinco dias após a inoculação (20 DAT). As avaliações foram realizadas em cinco folíolos

previamente identificados, em 10 plantas por tratamento, por três avaliadores, em intervalos de

7 dias (Figura 6B). Foram realizadas 8 avaliações de severidade no período de 28 de janeiro a

17 de março, em ambos os experimentos. Para a avaliação da severidade foi utilizada a escala

diagramática de Azevedo (1997) (Figura 6A).

Figura 6. Escala diagramática para avaliação de Alternaria solani em tomateiro expressa em proporção de área

foliar lesionada (A). Avaliação da severidade de pinta preta em tomateiro (B). Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

Com os dados obtidos das avaliações da severidade da doença foi calculada a área

abaixo da curva de progresso de doença (AACPD) utilizando-se a Eq. 1:

39

𝐴𝐴𝐶𝑃𝐷 = ∑ (𝑌𝑖 + 𝑌𝑖+1

2) (𝑡𝑖+1 − 𝑡𝑖) 𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 (1)

Na qual, Y representa a intensidade (severidade) da doença, t o tempo e i o número de

avaliações no tempo (CAMPBELL; MADDEN, 1990).

4.7.8 Análises bioquímicas

4.7.8.1 Coleta e obtenção dos extratos enzimáticos

Foram realizadas 25 coletas de discos de folíolos (200 mm² de diâmetro) para análises

enzimáticas, nos tempos 0, 24, 48 e 120 horas após cada aplicação dos tratamentos e uma coleta

final no 15º dia após a última aplicação, sendo:

• Aos 15 DAT = tempo 0 hora, antes da aplicação dos tratamentos;

• Aos 16 DAT = 24 horas após a primeira aplicação dos tratamentos e antes da

inoculação do patógeno;

• Aos 17 DAT = 48 horas após a primeira aplicação dos tratamentos e 24 horas após a




• Aos 29, 44, 59, 74 e 89 DAT = 0 hora antes da segunda, terceira, quarta, quinta e sexta

aplicação dos tratamentos, respectivamente;

• Aos 30, 45, 60, 75 e 90 DAT = 24 horas após a segunda, terceira, quarta, quinta e sexta




• Aos 34, 49, 64, 79 e 94 DAT = 120 horas após a segunda, terceira, quarta, quinta e

sexta aplicação dos tratamentos, respectivamente;

• Aos 105 DAT = 15° dia após a última aplicação dos tratamentos.

Após coletados, os discos de folíolos foram colocados em pacotes confeccionados com

papel alumínio e, em seguida, congeladas em nitrogênio líquido para paralisar todas as reações

imediatamente e armazenado a -20°C para posterior extração enzimática. As coletas foram

realizadas em triplicata, pois foram realizados diferentes tipos de extração.

A primeira extração enzimática foi realizada para determinar o conteúdo proteico e a

atividade das enzimas: superóxido dismutase, ascorbato peroxidase, catalase, peroxidase e

40

polifenoloxidase utilizando 0,3 g de folhas frescas congeladas e trituradas em nitrogênio líquido

com auxílio de almofariz. Em seguida, foi homogeneizada mecanicamente em 4 mL de tampão

fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) contendo 0,1 mM EDTA e 1% (p/p) de PVP (poli-vinil-

pirrolidona), em almofariz. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g durante 30 min a 4°C.

Após centrifugação, o sobrenadante obtido foi transferido para microtubos e estes armazenados

a -20°C para posterior determinação (BALBI-PEÑA et al., 2014).

A extração enzimática para a determinação da atividade da enzima glutationa S-

transferase foi realizada segundo Cataneo et al. (2003). Foram macerados 0,3 g de folhas frescas

congeladas e trituradas em nitrogênio líquido com auxílio de almofariz, adicionando-se 10% de

PVPP, tampão de extração gelado na proporção 1:3 (peso/volume), constituído de 50 mM de

Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 1 mM de GSH, 0,1 mM de Fluoreto de

Fenilmetil-Sulfonil (PMSF) e 10 % (v/v) de glicerol. Os extratos foram centrifugados a 12.000

g por 30 min a 4 ºC, e os sobrenadantes foram armazenados a -20 ºC para posterior utilização

na determinação.

A extração enzimática para a determinação da atividade da enzima glutationa

peroxidase foi realizada pela maceração de 0,5 g de folhas frescas em 2 mL de solução tampão

Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) contendo ditiotreitol (1,5 mM), EDTA (1 mM), Triton X-100 (0,1

%), cisteína (5 mM), fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMS, 0,1 mM) e PVPP insolúvel (2%).

Os extratos foram centrifugados a 12.000 g durante 20 min a 4 ºC (ARAVIND; PRASAD,

2005).

Os extratos enzimáticos para determinação da enzima glutationa redutase foram obtidos

por maceração de 0,5 g de folhas frescas em 2 mL de solução tampão Tris-HCl (100 mM, pH

7,5), contendo ditiotreitol (1,5 mM), EDTA (1 mM), Triton X-100 (0,1 %) e PVPP insolúvel

(2%). Os extratos foram centrifugados a 12000 g, durante 20 min a 4 °C (SHANKER et al.,

2004).

Na extração enzimática, para determinar a atividade da enzima fenilalanina amônia-

liase, foram utilizada 0,3 g de folhas frescas em 3,0 mL do tampão TRIS – HCl pH 8,0. O

extrato foi centrifugado a 3200 g, por 10 minutos a 4 ºC, conforme descrito por Umesha (2006).

A extração enzimática para determinar a atividade das enzimas quitinase e β-1,3-

glucanase e o conteúdo total de proteínas para estes ensaios, foi realizada de acordo com

metodologia descrita por Moerschbacher (1988) e citada por Guzzo e Martins (1996). Foram

utilizadas 0,3 g de material vegetal congelado e triturado em nitrogênio líquido com auxílio de

41

almofariz. Em seguida, foram trituradas em almofariz mantido em gelo, contendo 0,3 g de areia

do mar puríssima, 0,1 g de resina Dowex 1-X8 e 0,5 g de PVPP, após foi adicionado 4 mL de

tampão borato de sódio 0,1 M (pH 8,8) contendo EDTA a 1 mM, DTT a 1 mM e ácido ascórbico

a 50 mM, manteve-se em repouso por 5 minutos, centrifugou-se os extratos a 20.000 g, a 4ºC

por 30 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante obtido foi transferido para microtubos e

estes armazenados a -20°C para posterior determinação enzimática.

A extração da enzima lipoxigenase foi realizada conforme metodologia proposta por

Axelrod et al. (1981). Foram macerados 0,3 g da amostra em 2 mL de tampão Tris-HCl 50 mM,

CaCl2 20 mM, pH 8,0. Após as amostras forma centrifugadas a 5500 rpm por 10 minutos à 4°C,

e o extrato enzimático obtido foi armazenado a -20°C para posterior determinação.

4.7.8.2 Proteínas totais e atividades enzimáticas

A quantificação do conteúdo total de proteínas nas amostras, em todos os extratos, foi

determinada de acordo com metodologia proposta por Bradford (1976). A concentração de

proteínas foi determinada utilizando-se curva padrão de caseína. A leitura de absorbância foi

realizada em espectrofotômetro a 595 nm, sendo o teor proteico da amostra expresso em mg

proteína g massa fresca-1.

A determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) foi

determinada de acordo com metodologia proposta por Giannopolitis e Ries (1997). O ensaio

considerou a capacidade da enzima em inibir a fotorredução do NBT (azul de cloreto de

nitrotetrazólio). A inibição na redução fotoquímica do NBT foi avaliada em espectrofotômetro

a 560 nm. Uma unidade da enzima (U) foi definida como a atividade da SOD necessária para a

iniciação de 50% da fotorredução do NBT. Para o cálculo da atividade específica da enzima

considerou-se a porcentagem de inibição obtida, o volume da amostra e a concentração de

proteína da amostra. A atividade da enzima SOD na amostra foi expressa em U min-1 mg

proteína-1.

A atividade da ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.11) foi determinada conforme

metodologia proposta por Nakano e Asada (1981). A atividade enzimática foi calculada

utilizando-se o coeficiente de extinção molar de 2,8 mM cm-1. As leituras foram realizadas em

espectrofotômetro a 290 nm, de 15 em 15 segundos durante 2 minutos. Os valores foram

expressos em U min-1 mg proteína-1.

42

A atividade da glutationa redutase (GR, EC 1.6.4.2) foi determinada de acordo com

metodologia proposta por Shanker et al. (2004). A atividade da GR foi determinada por meio

do aumento da absorvância obtido pela redução de 5,5-ditiobis-2-ácido nitrobenzóico (DTNB)

pela GSH, com a formação de 5-tio-2- ácido nitrobenzóico (TNB). A atividade enzimática foi

determinada pela leitura contínua da absorvância a 412 nm durante 2 min, determinando a

variação na absorção usando o coeficiente de extinção molar de 14,15 mM-1 cm-1. Os valores

da atividade enzimática da GR foram expressos em U min-1 mg proteína-1.

A atividade da glutationa S-transferase (GST, EC 2.5.1.18) foi determinada usando o

método descrito por Wu et al. (1996). A reação foi conduzida a 30ºC por 10 min, com leitura

em espectrofotômetro a 340 nm, determinando a variação na absorção usando o coeficiente de

extinção molar de 9,6 mM cm-1 para GSH-CDNB (GSH = glutationa reduzida e CDNB = 1-

cloro-2,4-dinitrobenzeno). Os valores da atividade enzimática da GST foram expressos em U

min-1 mg proteína-1.

A atividade da glutationa peroxidase (GPX, EC 1.11.1.9) foi determinada conforme

metodologia de Aravind e Prasad (2005). As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a

340 nm, durante 2 minutos, a partir da taxa de diminuição da absorbância devido ao consumo

de NADPH. A atividade enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar

de 6,22 mM cm-1. O resultado foi expresso em U min-1 mg proteína-1.

Atividade da catalase (CAT, EC 1.11.1.6) foi determinada de acordo com metodologia

proposta por Peixoto et al. (1999). As leituras de absorbância foram realizadas em

espectrofotômetro a 240 nm aos 0 e 80 segundos, a fim de verificar o decréscimo na

absorbância, monitorado o consumo do H2O2. Para calcular a atividade específica da enzima foi

utilizado o coeficiente de extinção molar do H2O2 (39,4 mmol L-1 cm-1) e a atividade foi

expressa em U min-1 mg proteína-1.

A atividade da peroxidase de pirogalol (POD, EC 1.11.1.7) foi determinada de acordo

com metodologia proposta por Teisseire e Guy (2000). A formação de purpurogalina foi medida

em espectrofotômetro a 430 nm. Para calcular a atividade específica da enzima foi utilizado o

seu coeficiente de extinção molar (2,5 mmol L-1 cm-1) e a atividade foi expressa em U min-1

mg

proteína-1.

A atividade da polifenoloxidase (PPO, EC 1.10.3.1) foi determinada conforme método

descrito por Fujita et al. (1995) e adaptado por Zanatta et al. (2006). O meio de reação foi

incubado por 30 minutos a 30°C em banho-maria, decorrido este período a reação foi paralisada

43

com ácido perclórico (HClO4) 2M. A atividade foi medida em espectrofotômetro a 395 nm,

mensurando a conversão de catecol em quinona. A atividade da PPO foi expressa U min-1 mg

proteína-1.

A atividade da lipoxigenase (LOX, EC 1.13.11.12) sobre o ácido linoléico foi

determinada segundo o método descrito por Axelrod et al. (1981). As leituras foram realizadas

em espectrofotômetro a 234 nm, de 20 em 20 segundos por um período de 60 segundos. A

atividade enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar dos

hidroperóxidos do ácido linoléico a 234 nm (25000 mM cm-1). Os resultados foram expressos

em U min-1 mg proteína-1.

A determinação da atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL, EC 4.3.1.5) foi

realizada por quantificação colorimétrica do ácido trans-cinâmico liberado do substrato

fenilalanina, conforme metodologia descrita por Umesha (2006). As leituras foram realizadas

em espectrofotômetro a 290 nm, sendo a atividade determinada em μg de ácido trans-cinâmico

min-1 mg proteína-1, conforme curva padrão de ácido trans-cinâmico. Os resultados foram

expressos em U min-1 mg proteína-1.

A atividade da enzima quitinase (QUI, EC 3.2.1.14) foi determinada segundo Busso e

Mazaro (2015). O meio de reação foi composto por 100 mg de substrato para quitinase, 600 µL

de tampão fosfato de sódio 0,2 M, 300 µL do extrato vegetal, incubado a 50 ºC por 1 hora, após

incubado novamente a 100 ºC por 5 minutos. Após foi centrifugado a 4300 g por 10 minutos, e

o sobrenadante foi retirado para posterior leitura em espectrofotômetro a 595 nm. Os valores

foram expressos em U min-1 mg proteína-1.

A atividade da enzima β-1,3-glucanase (GLU, EC 3.2.1.39) foi determinada segundo

metodologia descrita por Stangarlin et al. (2000), pela quantificação colorimétrica de glicose

liberada de laminarina, por meio do uso da hidrazida do ácido β-hidroxibenzóico (PAHBAH)

a 2,5% conforme metodologia proposta por Lever (1972). As leituras foram realizadas em

espectrofotômetro a 410 nm e a atividade da enzima mensurada de acordo com curva padrão

de glicose. Os valores foram expressos em U min-1 mg proteína-1.

4.7.8.3 Ânion superóxido e peróxido de hidrogênio

Para determinar a concentração do ânion superóxido (•O2-) e de peróxido de hidrogênio

(H2O2), foram realizadas 25 coletas de discos de folíolos (200 mm² de diâmetro), nos tempos

44

0, 24, 48 e 120 horas após cada aplicação dos tratamentos e uma coleta final no 15º dia após a

última aplicação, sendo:

• Aos 15 DAT = tempo 0 hora, antes da aplicação dos tratamentos;

• Aos 16 DAT = 24 horas após a primeira aplicação dos tratamentos e antes da






• Aos 29, 44, 59, 74 e 89 DAT = 0 hora antes da segunda, terceira, quarta, quinta e sexta






• Aos 34, 49, 64, 79 e 94 DAT = 120 horas após a segunda, terceira, quarta, quinta e

sexta aplicação dos tratamentos, respectivamente;

• Aos 105 DAT = 15° dia após a última aplicação dos tratamentos.

O material vegetal coletado foi colocado em pacotes confeccionados com papel

alumínio e, em seguida, congeladas em nitrogênio líquido, a fim de paralisar todas as reações

imediatamente.

A determinação da concentração de •O2- foi realizada em amostras de 0,1 g de material

vegetal. A produção de •O2 - foi avaliada pela determinação do adenocromo acumulado em

leituras de absorbância a 480 nm (MISRA; FRIDOVICH, 1971). O resultado foi expresso em

mmol g de massa fresca-1.

Para a determinação da concentração de H2O2 foram utilizadas amostras de 0,1 g de

tecido foliar e preparadas conforme metodologia de Kuo e Kao (2003). A concentração de

H2O2, foi estimada com base em curva padrão de H2O2, conforme metodologia de Gay e

Gerbicki (2000). O resultado foi expresso em µmol g de massa fresca-1.

45

4.7.8.4 Peroxidação lipídica

Para a determinação da peroxidação lipídica (TBAR) foram coletados discos de folíolos

(200 mm² de diâmetro) nos mesmos horários descritos para determinação da concentração de

•O2- e H2O2 (subitem 4.6.8.3). A lipoperoxidação foi determinada de acordo com técnica

descrita por Heath e Packer (1968) apud Rama Devi e Prasad (1998). Para a reação, foram

utilizadas 0,3 g de folhas frescas congeladas e trituradas em nitrogênio líquido e

homogeneizadas em 5 mL de solução contendo ácido tiobarbitúrico (TBA) a 0,25% e ácido

tricloroacético (TCA) a 10%.

Após a extração a solução foi incubada em banho-maria a 90°C por 60 minutos.

Decorrido este tempo e após resfriamento, a solução foi centrifugada a 10000 g por 15 minutos,

à temperatura ambiente (25°C). O sobrenadante foi coletado e as leituras foram realizadas em

espectrofotômetro a 560 e 600 nm. Para os cálculos utilizou-se o coeficiente de extinção molar

do malondialdeído (155 mmol L-1 cm-1). Os resultados foram expressos em μmol g de massa

fresca-1.

4.7.8.5 Compostos fenólicos

Da mesma forma, para a determinação do teor de compostos fenólicos foram coletados

discos de folíolos (200 mm² de diâmetro) nos mesmos horários descritos para a determinação

da concentração de •O2- e H2O2 (subitem 4.6.8.3). A reação foi realizada a partir da obtenção

do extrato metanólico de acordo com Moore et al. (2006) e o teor de fenólicos totais foram

determinados como descrito por Yu et al. (2003) e expresso em mg de fenólicos totais em

equivalente de ácido gálico (EAG) por grama de massa fresca das folhas de tomateiro. Os

valores foram expressos em mg g massa fresca-1.

4.7.8.6 Deposição de lignina

Para a determinação da deposição de lignina na parede celular foram coletados folíolos

aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 DAT, que corresponde aos momentos:






46




Após a coleta, os folíolos foram colocados em pacotes confeccionados com papel

alumínio e, em seguida, congeladas em nitrogênio líquido, a fim de paralisar todas as reações

imediatamente. Após a coleta as amostras foram levadas ao laboratório e a deposição de lignina

foi realizada conforme metodologia descrita por Mandal et al. (2011). Foram utilizadas 1,0 g

de folhas frescas congeladas para a reação. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro

a 280 nm. Os resultados foram obtidos a partir do aumento de A280nm g de massa fresca-1 de

resíduo seco insolúvel em álcool (RIA) e expressos em µg de lignina-1 mg de massa fresca-1.

4.7.9 Avaliação de produção e pós-colheita de frutos de tomateiro

4.7.9.1 Produção

A colheita dos frutos teve início no dia 27 de março e terminou em 5 de maio de 2015

no experimento I. No experimento II, iniciou em 30 de março e terminou em 7 de maio de 2016.

O período de colheita compreendeu em média 37 dias e foi realizada semanalmente, conforme

os frutos atingiam o estádio de maturação vermelho-claro, conforme descrito por Alvarenga

(2013) (Figura 7A). Todos os frutos foram pesados em balança analítica (Figura 7B), sendo os

resultados expressos em gramas (g), o diâmetro aferido com paquímetro e os valores expressos

em milímetros (mm) (Figura 8B).

Figura 7. Ponto de colheita dos frutos de tomateiro: vermelho-claro (A) e pesagem dos frutos em balança analítica

(B). Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

47

Foram avaliadas a produção total e comercial de frutos de tomate (kg m-2), número de

frutos m-2, massa média de frutos (g), diâmetro e comprimento de frutos. Para a avaliação de

produção, os frutos foram selecionados em não comercial e comercial, sendo considerados

frutos com diâmetro menor que 40 mm não comercial e maior que 40 mm e sem defeitos

(sintomas de doenças, pragas, distúrbios fisiológicos e/ou danos físicos) como comercial.

4.7.9.2 Qualidade pós-colheita de frutos

As análises químicas foram realizadas no Laboratório de Fruticultura e Pós-colheita do

Departamento de Agronomia (UNICENTRO) no mesmo dia em que os frutos foram colhidos.

A colheita dos frutos para estas análises foi realizada no dia 9 de abril de 2015 (92 DAT) para

o experimento I e no dia 7 de abril de 2016 (90 DAT) para o experimento II. Os frutos foram

colhidos no estádio de maturação vermelho-claro (ALVARENGA, 2013) (Figura 8A) e retirou-

se o pedúnculo e os cálices para que não houvesse lesões por atrito. No laboratório os frutos

foram lavados em água corrente e secos com papel toalha.

As variáveis analisadas foram: firmeza de polpa, acidez titulável (AT), pH, sólidos

solúveis (SS, oBrix), relação SS/AT, teor de ácido ascórbico, atividade das enzimas

poligalacturonase e pectinametilesterase e perda de massa.

As metodologias são descritas a seguir:

Firmeza de polpa: foi determinada com auxílio de penetrômetro digital (FR-5120

Lutron) empregando-se ponteira de 8 mm. As leituras foram realizadas em dois frutos inteiros

com casca, em dois pontos opostos na região equatorial de cada fruto e os resultados foram

expressos em grama-força (gf cm-2).

Acidez titulável (AT) e pH: foram utilizadas polpa de três tomates, por repetição,

homogeneizadas em triturador doméstico tipo ‘mixer’. Para análise do pH da polpa e da acidez

titulável foram preparadas amostras de 5 g de polpa diluída em 100 mL de água destilada, deste

extrato, uma alíquota de 50 mL foi utilizada para determinação do pH da polpa em peagâmetro

(Marconi, MA 522). Na mesma alíquota foi realizada a titulação com NaOH 0,1 N até pH 8,2

para determinação da acidez titulável. Os dados foram expressos em gramas de ácido cítrico

100 g de polpa-1.

Sólidos solúveis (SS): foi determinado com refratômetro digital automático de

compensação de temperatura (Atago - Pocket refractoneter Pal1). Os resultados foram

expressos em ºBrix.

48

Relação SS/AT: é a relação entre os teores de sólidos solúveis (SS) e a acidez titulável

(AT).

Teor de ácido ascórbico: foi realizado pelo método titulométrico que consiste na redução

de 2,6-diclorofenolindofenol-sódio (DCFI) pelo ácido ascórbico. Foram utilizadas 10 g de

polpa, tituladas em ácido oxálico a 0,5% com DCFI a 0,01 N. O DCFI em meio básico ou neutro

apresenta coloração azul, em meio ácido é rosado e na forma reduzida incolor. O ponto final da

titulação é detectado pela alteração da coloração da solução incolor para rosada, quando a

primeira gota de solução do DCFI é introduzida no sistema e todo ácido ascórbico já foi

consumido (AOAC, 1997). Os dados foram expressos em mg de ácido ascórbico 100 mL de

polpa do fruto-1.

Atividade da enzima poligalacturonase (PG, EC 3.2.1.15): foi determinada de acordo

com metodologia descrita por D’innocenzo e Lajolo (2001) a partir do extrato enzimático

obtido conforme Pressey (1986). Nas condições do ensaio, uma unidade da PG foi considerada

como a quantidade de enzima capaz de catalisar a formação de 1 nmol de grupos redutores min-

1 g de massa fresca-1. Os resultados foram expressos em U g massa fresca-1.

Atividade da enzima pectinametilesterase (PME, EC 3.1.1.11): foi determinada

conforme metodologia descrita por D’innocenzo e Lajolo (2001) a partir do extrato enzimático

obtido conforme Lima (2002). Nas condições do ensaio, uma unidade de PME foi definida

como a quantidade de enzima capaz de catalisar a desmetilação de pectina correspondente ao

consumo de 1 nmol de NaOH min-1 g de massa fresca-1. Os resultados foram expressos em U g

massa fresca-1.

4.7.9.3 Avaliação da perda de massa

Foram selecionados 10 frutos de cada tratamento para a avaliação de perda de massa.

Os frutos foram colhidos no estádio de maturação verde-rosado de acordo com Alvarenga

(2013) (Figura 8A) e mantidos sobre a bancada do laboratório, revestida com papel kraft

(Figuras 8C e 8D). Inicialmente os frutos foram pesados em balança analítica, sendo os

resultados expressos em gramas (g). Para a avaliação da perda de massa ao longo do

experimento, os frutos foram pesados a cada dois dias até o 21º dia.

Neste período, foram monitorados por meio de termo-higrômetro digital (Incoterm), os

dados de temperatura e umidade relativa do ar (máxima e mínima). Para o cálculo da perda de

massa foi utilizado a diferença entre as pesagens de cada intervalo de tempo e os resultados

49

foram expressos em porcentagem (%) (CHITARRA; CHITARRA, 2005), e a partir destes,

foram plotadas curvas de perda de massa ao longo do período avaliado para cada tratamento.

Figura 8. Colheita de frutos no estádio de maturação verde-salada (A), pesagem dos frutos (B), frutos no início:

1°dia (C) e final: 21° dia (D) do experimento de avaliação de perda de massa. Unicentro, Guarapuava/PR.

Fonte: MAREK, 2018.

4.8 Análise estatística

Neste conjunto de dados foram realizados os testes de normalidade por Shapiro-Wilk e

homogeneidade de variância por Cochran C antes de cada teste estatístico paramétrico. A

análise de variância (ANOVA) e as médias também foram compradas pelo teste Tukey, ambos,

ao nível de 1 e 5% de significância.

Os dados de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a, não apresentaram normalidade

e foram transformados pelo método Box-Cox. Já os dados de porcentagem de frutos não

comerciais e de perda de massa foram transformados por arco seno de √x (%). Todos os testes

estatísticos foram realizados utilizando o software Ambiente R (R Development Core Team,

2016).

50

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Desenvolvimento do tomateiro

Avaliar o desenvolvimento das plantas é inferir sobre a sua capacidade fotossintética,

no que diz respeito ao potencial assimilatório, síntese e alocação de fotoassimilados nos

diferentes órgãos. Pois, a fotossíntese é o processo que move o desenvolvimento e reprodução

das plantas (KLUGE et al., 2014). Analisando o desenvolvimento inicial das plantas de

tomateiro submetidas aos diferentes tratamentos: testemunha inoculada (Test-Inoc), testemunha

absoluta (Test-Absoluta), boscalida (Bosc), boscalida mais cresoxim-metílico (Bosc+Cre),

piraclostrobina (Pira), fluxapiroxade mais piraclostrobina (Flux+Pira) e metiram mais

piraclostrobina (Me+Pira), foram observadas diferenças significativas (p<0,05) entre os

tratamentos, nos dois anos avaliados, apresentando comportamento semelhante (Tabelas 2 e 3).




Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

Altura de planta (cm)

Tratamentos Dias após o transplantio (DAT)

14 21 28 35 42 49 56

Testemunha inoculada

(inóculo + água) 26,3a 35,5c 42,3c 65,9c 85,6c 120,8c 167,5b

Testemunha absoluta (água) 27,6a 33,7c 45,8c 62,8c 86,4c 124,2c 166,2b

Boscalida (0,075 g L-1) 26,3a 39,2b 49,6b 69,9b 92,3b 139,6b 174,2a

Boscalida (0,100 g L-1)

+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 27,2a 38,6b 50,3b 68,3b 93,2b 140,2b 174,6a

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 27,0a 39,4b 52,4b 69,9b 95,6b 141,2b 175,2a

Fluxapiroxade (0,058 g L-1)

+ Piraclostrobina (0,116 g L-1) 26,9a 41,2a 57,6a 72,9a 106,5a 152,3a 175,6a

Metiram (1,100 g L-1)

+ Piraclostrobina (0,100 g L-1) 27,4a 40,6a 55,2a 70,1ab 104,9a 149,7a 175,3a

CV (%) 12,4 14,5 16,4 18,7 18,1 19,2 12,5

Médias (n = 5) seguidas de letras diferentes na coluna diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5%

de probabilidade (p<0,05).

51

Aos 14 DAT (avaliação realizada antes da primeira aplicação dos tratamentos, que

ocorreu aos 15 DAT), não houve diferença significativa entre os tratamentos (p<0,05),

demonstrando que as plantas neste momento apresentavam o mesmo padrão de

desenvolvimento.

Decorrido o início da aplicação dos tratamentos observou-se, de maneira geral, que as

plantas tratadas com os diferentes fungicidas apresentaram maior desenvolvimento inicial

quando comparadas às testemunhas. No entanto, os maiores valores de altura de plantas foram

observados nos tratamentos Flux+Pira e Me+Pira, a partir dos 21 DAT e se estendendo até aos

49 DAT. A altura das plantas aos 56 DAT não diferiu significativamente entre os fungicidas

testados, entretanto, foram maiores que as testemunhas. Os menores valores médios de altura

foram observados para os tratamentos Test-Inoc, seguido de Test-Absoluta.





Altura de planta (cm)

Tratamentos Dias após o transplantio (DAT)

14 21 28 35 42 49 56


(inóculo + água) 26,8a 35,3c 43,6c 65,7c 90,7c 124,1c 168,1b

Testemunha absoluta (água) 27,9a 33,4c 44,8c 63,3c 88,2c 122,5c 167,7b

Boscalida (0,075 g L-1) 26,5a 37,1b 49,9b 70,4b 95,4b 140,2b 175,0a


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 26,8a 37,1b 50,4b 69,9b 96,2b 140,8b 174,9a

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 27,3a 36,8b 50,1b 70,9b 96,9b 141,4b 174,2a




+ Piraclostrobina (0,100 g L-1) 27,0a 39,1a 53,9a 71,6ab 105,8a 151,0a 176,1a

CV (%) 10,3 12,2 9,9 15,2 13,5 12,9 14,2



52

Dentre as características de desenvolvimento mensuradas em plantas de tomateiro,

também foram observadas diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos para as

variáveis: área foliar (cm2), massas fresca e seca de folhas, caule e raízes (Tabelas 4 e 5).

Respostas semelhantes foram observadas nos dois anos avaliados, nos quais os maiores

valores médios de área foliar foram verificados no tratamento Flux+Pira (10452,1 e 10311,5

cm² de área foliar planta-1, nos anos de 2015 e 2016, respectivamente) seguido do tratamento

Me+Pira (9914,3 e 9889,8 cm² de área foliar planta-1, nos anos de 2015 e 2016,

respectivamente). Tais plantas, por apresentarem maior área foliar, tiveram maior capacidade

de aproveitar a energia em prol da fotossíntese e, assim, apresentaram melhor desenvolvimento

e ganhos de produtividade (REIS et al., 2013).

Ao contrário, os menores valores médios de área foliar foram identificados no

tratamento Test-Inoc (3298,3 e 3098,1 cm² de área foliar planta-1, nos anos de 2015 e 2016,

respectivamente) e Test-absoluta (6247,8 e 6384,2 cm² de área foliar planta-1, nos anos de 2015

e 2016, respectivamente). Como estas avaliações foram realizadas aos 120 DAT (após a última

colheita dos frutos), final do ciclo da cultura, as plantas testemunhas (Test-Inoc) estavam com

maior severidade da doença (A. solani inoculada aos 16 DAT). Devido a sua alta agressividade,

a incidência de A. solani em cultivos de tomateiro, provoca perdas diretas por infectar os frutos

e indiretas pela redução do vigor da planta, reduzindo seu desenvolvimento, devido ao

decréscimo da fotossíntese, pelos danos a área fotossinteticamente ativa, além da ocorrência da

desfolha em estádios mais avançados da doença (TÖFOLI et al., 2014).

Por isso, muitas folhas apresentavam lesões ocasionadas pela colonização do patógeno

e grande parte das folhas do terço inferior destas plantas tinham entrado em senescência e

sofrido abscisão, justificando, parcialmente, a menor área foliar. Parcialmente, porque as

plantas testemunhas (Test-Absoluta) não foram inoculadas no início do experimento e

receberam como tratamento somente a aplicação de água, mesmo assim, apresentaram menor

área foliar (6247,8 e 6384,2 cm² de área foliar planta-1, nos anos de 2015 e 2016,

respectivamente), sendo inferiores aquelas observadas para os tratamentos com os diferentes

fungicidas, diferindo significativamente (p<0,05) destes.

Além do efeito positivo na expansão foliar proporcionada por estas substâncias de

efeitos fisiológicos, também foram observados maiores acúmulos de massa fresca e seca de

folhas, caule e raiz nas plantas tratadas com os diferentes fungicidas. Assim como para área

foliar, os tratamentos Flux+Pira seguido de Me+Pira apresentaram maiores valores médios de

53

Tabela 4. Variáveis de desenvolvimento aos 120 dias após o transplantio (DAT) de plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas

em casa de vegetação e tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos, inoculados com Alternaria solani, no ano de 2015.


Variáveis de desenvolvimento

Tratamentos Área foliar

(cm²)

Massa fresca

de folhas (g)

Massa seca de

folhas (g)

Massa fresca

de caule (g)

Massa seca de

caule (g)

Massa fresca

de raiz (g)

Massa seca

de raiz (g)


(inóculo + água) 3298,32e 111,65e 17,26e 418,99c 42,32c 60,18b 9,24b

Testemunha absoluta (água) 6247,84d 211,84d 21,03d 423,56c 44,51c 63,93b 10,41b

Boscalida (0,075 g L-1) 8141,22c 275,37c 26,41c 443,25b 51,47b 81,03a 12,87a


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 8037,21c 270,12c 26,97c 440,24b 48,94b 78,91a 12,04a

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 8119,04c 273,98c 26,24c 442,08b 49,12b 79,31a 12,55a




+ Piraclostrobina (0,100 g L-1) 9914,29b 309,71b 30,42b 495,36a 55,09a 80,96a 12,94a

CV (%) 12,65 13,45 14,72 12,35 10,84 12,72 11,33

Médias (n = 5) seguidas de letras diferentes na coluna diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade (p<0,05).

54

Tabela 5. Variáveis de desenvolvimento aos 120 dias após o transplantio (DAT) de plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas

em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, no ano de 2016.


Variáveis de desenvolvimento

Tratamentos Área foliar

(cm²)

Massa fresca

de folhas (g)

Massa seca de

folhas (g)

Massa fresca

de caule (g)

Massa seca de

caule (g)

Massa fresca

de raiz (g)

Massa seca

de raiz (g)


(inóculo + água) 3098,12e 108,69e 15,86d 401,32e 41,28c 61,39b 9,45b

Testemunha absoluta (água) 6384,17d 208,49d 19,91c 418,74d 43,38c 62,91b 9,98b

Boscalida (0,075 g L-1) 8172,24c 276,57c 28,96b 442,58c 50,79b 80,59a 12,81a


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 8019,45c 271,21c 27,40b 438,16c 47,26b 78,27a 11,89a

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 8121,25c 274,23c 28,19b 441,92c 49,98b 79,48a 12,29a




+ Piraclostrobina (0,100 g L-1) 9889,77b 314,18b 32,97a 488,67b 54,73a 79,99a 12,34a

CV (%) 9,56 12,32 11,25 10,59 12,56 8,78 9,56


55

massas fresca e seca de folhas e, também, proporcionaram maior acúmulo de massa fresca e

seca de caule, diferindo estatisticamente (p<0,05) dos demais tratamentos. No entanto, não

houve diferença significativa entre os fungicidas para o acúmulo de massa fresca e seca de

raízes, apenas diferindo das testemunhas.

Outros pesquisadores avaliando os efeitos fisiológicos proporcionados por

estrobilurinas e carboxamidas também observaram efeitos positivos no acúmulo de matéria seca

e na produtividade de milho (LIMA et al., 2009), feijão (KOZLOWSKI et al., 2009; DEMANT;

MARINGONI, 2012; JADOSKI et al., 2015), soja (TSUMANUMA et al., 2010), pepino

(AMARO, 2011), cenoura (COLOMBARI et al., 2015) e videira (MAREK, 2016).

Como observado, as plantas tratadas com Flux+Pira, seguidas daquelas que receberam

a aplicação de Me+Pira, se destacaram pelo maior desenvolvimento, apresentando maior área

foliar, configurando desta forma, um maior dossel foliar, consequentemente, tiveram maior

capacidade de absorver a luz incidente e isto influenciou diretamente nas taxas fotossintéticas

e no desenvolvimento das mesmas, como pode ser observado nos resultados obtidos por meio

das análises de trocas gasosas realizadas com o IRGA (“Infra Red Gas Analyser”, Modelo LI-

6400, Li-Cor) (Figuras 9 e 10).

5.2 Eficiência fotossintética

Nas avaliações de trocas gasosas realizadas aos 34 e 94 DAT (Figuras 9 e 10), foram

observadas diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos, nos dois anos avaliados,

apresentando comportamento semelhante.

Pode ser observado efeito positivo de todos os fungicidas aplicados nos dois momentos

de avaliação (34 e 94 DAT), com aumento da eficiência fotossintética, em relação às

testemunhas. No entanto, plantas tratadas com Flux+Pira obtiveram os maiores valores para

taxa de assimilação de CO2 (A, μmol m-2 s-1) condutância estomática (gs, mol m-2 s-1) e

concentração interna de CO2 na folha (Ci, μmol mol-1) (Figura 9), diferindo estatisticamente

dos demais tratamentos (p<0,05). Em plantas de soja a aplicação de fluxapiroxade (CARRIJO,

2014) e de piraclostrobina (FAGAN et al., 2010) também promoveram aumento da taxa de

assimilação de CO2 e elevação da taxa fotossintética líquida.

A maior eficiência fotossintética observada nas plantas tratadas com Flux+Pira está

relacionada com a maior abertura estomática, através da qual houve maior difusão de CO2 para

a câmara subestomática, que posteriormente, foi utilizado na assimilação líquida de CO2. Uma

56

vez assimilando e incorporando maiores concentrações de CO2, há o aumento da quantidade de

fotoassimilados produzidos, possibilitando maior desenvolvimento destas plantas, como foi

observado nos dados das Tabelas 2 e 3. Por isso, quanto maior a capacidade fotossintética da

planta (valor de A), maior é o seu ganho fotossintético. Isto indica que o aumento na fotossíntese

líquida em função do aumento da fotossíntese bruta e redução da respiração, reflete em maior

ganho de produção de frutos (KLUGE et al., 2014) em plantas de tomateiro.

Figura 9. Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol m-2 s-1), condutância estomática (gs, mol m-2 s-1) e concentração

interna de CO2 na folha (Ci, μmol mol-1) em plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de

vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 34 e

94 dias após o transplantio (DAT), nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma

avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio padrão da

média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

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57

As alterações na abertura estomática estão relacionadas ao controle da perda de água

pela planta, que refletem na assimilação de CO2 e manutenção da taxa fotossintética (TAIZ;

ZEIGER, 2013). Desta forma, como observado nos tratamentos Test-Inoc e Test-Absoluta a

redução da abertura estomática restringiu a taxa de fixação de CO2 com consequente redução

de sua concentração nas cavidades subestomáticas e nos espaços intercelulares (concentração

interna de CO2), culminado em menor assimilação de CO2 e menor desenvolvimento destas

plantas (Tabelas 4 e 5). Uma vez que o crescimento e desenvolvimento das plantas dependem

dos processos de divisão e expansão celular, os quais são sensíveis a concentração de CO2

assimilado (TSUTSUMI et al., 2014), o aumento da assimilação de CO2 reflete diretamente na

fotossíntese líquida da planta, potencializando seu crescimento e desenvolvimento e,

consequentemente, o ganho de biomassa (XU et al., 2015).

Ao analisar a taxa de transpiração (E, mmol m-2 s-1) das plantas aos 34 e 94 DAT,

observa-se que não houve diferença estatística entre os fungicidas testados para esta

característica (Figura 10). No entanto, a transpiração das plantas nestes tratamentos é menor

quando comparada às testemunhas, diferindo significativamente destas (p<0,05). Nas plantas,

as variações na transpiração são ocasionadas por alterações na temperatura e no potencial

hídrico foliar, uma vez que os estômatos são sensíveis às mudanças ambientais, por isso quando

há aumento no déficit de pressão de vapor ocorrem limitações no processo fotossintético,

devido ao fechamento estomático e à diminuição de CO2 interno (TAIZ; ZEIGER, 2013).

Avaliando a eficiência do uso da água (EUA, A/E, μmol CO2 mmol H2O-1) e a eficiência

de carboxilação (A/Ci) (Figura 10), novamente o tratamento Flux+Pira se destaca e difere

estatisticamente (p<0,05) dos demais tratamentos, aos 34 e 94 DAT. A alta eficiência de

carboxilação observada neste tratamento reflete o eficiente funcionamento da enzima ribulose

1,5-difosfato carboxilase (Rubisco), enzima chave na fixação do CO2 no processo

fotossintético, em decorrência da maior abertura estomática e dos altos valores de assimilação

de CO2.

As plantas tratadas com Flux+Pira apresentaram maior EUA aos 34 DAT (3,99 e 4,13

μmol CO2 mmol H2O-1 em 2015 e 2016, respectivamente) e aos 94 DAT (4,10 e 4,22 μmol CO2

mmol H2O-1 em 2015 e 2016, respectivamente), devido às altas taxas de assimilação de CO2

observadas. Ao contrário, as plantas Test-Inoc apresentaram as menores EUA, com valores entre

0,70 e 1,14 μmol CO2 mmol H2O-1, nas avaliações realizadas nos dois anos de experimento.

58

Figura 10. Taxa de transpiração (E, mmol m-2 s-1), eficiência do uso da água (EUA, A/E, μmol CO2 (mmol H2O)-

1) e eficiência de carboxilação (A/Ci) em plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de

vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 34 e

94 dias após o transplantio (DAT), nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma

avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio padrão da

média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

As plantas Test-Absoluta também apresentaram menores valores paras as características

avaliadas de trocas gasosas, quando comparadas aos diferentes fungicidas testados, mas

superiores a Test-Inoc. Mesmo na ausência de doença, as plantas do tratamento Test-Absoluta

apresentaram menor desenvolvimento, em função da menor eficiência fotossintética e,

consequentemente, menor produção de fotoassimilados. Evidenciando assim, o efeito positivo

da aplicação dos diferentes fungicidas no metabolismo fotossintético em plantas de tomateiro.

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59

O incremento na taxa fotossintética também foi relatado após a aplicação de fungicidas

de efeitos fisiológicos nas culturas de soja (FAGAN et al., 2010; CARRIJO, 2014), alface

(MANSANO, 2014), melão (MACEDO, 2012; 2015) e tomate (RAMOS, 2013; JACOBELIS

JUNIOR, 2015).

As plantas sob estresse biótico ou abiótico, apresentam baixa eficiência fotossintética.

Como observado nas análises de desenvolvimento e de trocas gasosas, nas plantas do tratamento

Test-Inoc, o progresso da doença, fator estressante, afetou negativamente o metabolismo

fotossintético. Por terem sido realizadas junto com as análises de trocas gasosas, as análises da

fluorescência da clorofila a, ajudam a entender a proporção da severidade do dano sofrido por

estas plantas sob estresse biótico, neste caso a presença do patógeno A. solani (Figura 11). Pois

os parâmetros obtidos pelas medidas da fluorescência da clorofila a são variáveis importantes

para descrever o estado fisiológico da planta, pois quando há maior dissipação de energia

através do transporte de elétrons, em decorrência de algum fator de estresse, ocorre declínio na

eficiência quântica potencial do fotossistema II (PSII, menor Fv/Fm) e menor taxa de transporte

de elétrons (ETR).

A luz solar ao incidir sobre as plantas é absorvida pelas clorofilas que se tornam

instáveis, isto é, excitadas, pois saem de seu estado basal para um estado de estímulo. No

entanto, para manter a homeostase do metabolismo fotossintético as clorofilas precisam

retornar ao estado basal, mas para isso, é necessário que a energia absorvida seja dissipada

(TAIZ; ZEIGER, 2013). Em plantas há três processos de dissipação da energia luminosa pelas

moléculas de clorofilas: fotoquímico e/ou fluorescência e/ou calor, que são complementares e

ao mesmo tempo competitivos.

As plantas saudáveis e em condições ambientais ótimas, direcionam a maior parte da

energia para a fotossíntese (síntese de moléculas orgânicas). Ao contrário, plantas sob estresse

abiótico ou biótico, apresentam uma maior proporção de energia dissipada de outras formas, ou

seja, a energia se torna não fotoquímica e é perdida (não é convertida em produtos

fotossintéticos). Desta forma, qualquer alteração na taxa fotossintética ou na dissipação de calor

refletirá em maior emissão de fluorescência (CAMPBELL; FARRELL, 2006; TAIZ; ZEIGER,

2013) permitindo assim, identificar a sanidade do aparato fotossintético da planta no momento

da avaliação da fluorescência da clorofila a.

60

Figura 11. Fluorescência variável da clorofila a (Fv), eficiência máxima do PSII (Fv/Fm), rendimento quântico

fotoquímico do PSII, Y(II) e taxa relativa de transferência de elétrons (ETR) em plantas de tomateiro híbrido

Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e

inoculados com Alternaria solani, aos 34 e 94 dias após o transplantio (DAT), nos anos de 2015 e 2016. Médias

(n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade

(p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

Sendo assim, ao mensurar mudanças na cinética de emissão da fluorescência da clorofila

a pode-se detectar e inferir sobre a presença de danos no aparato fotossintético em decorrência

de danos por agentes estressantes (YUSUF et al., 2010). Como observados nas plantas Test-

Inoc (Figura 10 e 11) a menor eficiência quântica potencial do PSII é consequência da queda

na atividade fotossintética devido a presença do agente estressor que levou à menor eficiência

fotoquímica, em virtude da baixa atividade da enzima ribulose 1,5-difosfato carboxilase e

menor eficiência de carboxilação constatadas. Por isso, manejos que maximizem o processo

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-1) + Cresoxim-metílico (0,050 g L

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Piraclostrobina (0,100 g L-1) Fluxapiroxade (0,058 g L

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61

fotossintético e dissipem maior quantidade de energia para síntese de carboidratos são

vantajosos.

O rendimento quântico máximo do PSII foi estimado pela razão Fv/Fm e indica a

eficiência da planta na captura da energia de excitação pelos centros de reação abertos do PSII

e sua dissipação no transporte de elétrons do PSII para o fotossistema I (PSI), impulsionando a

síntese de ATP e NADPH2, fontes essenciais de energia para a fixação de CO2. Como pode ser

observado na Figura 11, a aplicação dos diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos teve efeito

significativo sobre os parâmetros de fluorescência da clorofila a avaliados aos 34 e 94 DAT. A

fluorescência variável (Fv), eficiência máxima do PSII (Fv/Fm), rendimento quântico

fotoquímico do PSII, Y(II) e a taxa relativa de transferência de elétrons (ETR) apresentaram

comportamento semelhante nos dois anos avaliados (Figura 11).

Estudos realizados com diferentes espécies que apresentam ciclo C3 (como o

tomateiro) demonstram que valores típicos do parâmetro Fv/Fm em folhas saudáveis e, em

condições de iluminação adequadas, variam em torno de 0,83 e valores abaixo deste padrão

indicam que a planta apresenta algum tipo de estresse causando danos ao aparato fotossintético

(BJÖRKMAN; DEMMING, 1987). Neste caso, ocorre a redução na eficiência quântica da

evolução do O2 ou na fixação do CO2, comprometendo o desenvolvimento e produtividade da

planta.

De acordo com os dados apresentados na Figura 11, os valores de Fv/Fm foram

significativamente diferentes (p<0,05) entre os tratamentos, porém não houve diferença

estatística entre as plantas tratadas com os diferentes fungicidas, os quais apresentaram maiores

valores de rendimento quântico potencial do PSII aos 34 e 94 DAT. Os valores variaram entre

0,79 e 0,86, revelando que estas plantas não estavam sob estresse no momento em que as

avaliações foram realizadas. Assim, maiores valores de Fv/Fm indicam maior eficiência de

captura de energia de excitação pelos centros de reação do PSII, reafirmando os resultados

observados nas avaliações de trocas gasosas (Figuras 9 e 10), nas quais a aplicação dos

diferentes fungicidas aumentou, em intensidades diferentes, a eficiência de assimilação e

carboxilação de CO2 pelas plantas.

Ao contrário, o tratamento Test-Inoc, que apresentou menor Fv/Fm teve redução na

eficiência de assimilação e carboxilação de CO2 e, possivelmente, a ocorrência de alterações no

PSII, refletindo em menor capacidade fotossintética e eficiência fotoquímica (CASIERRA-

POSADA et al., 2011). Pois, a presença de condições estressantes leva ao decréscimo na

62

eficiência quântica potencial do PSII, podendo ser detectada pela queda na relação Fv/Fm

(KRAUSE; WEIS, 1991; BAKER; ROSENQVIST, 2004; BAKER, 2008), conforme já

mencionado. Por isso o parâmetro Fv/Fm tem sido amplamente utilizado para identificar e

comparar tecidos saudáveis e danificados por estresses bióticos (ROUSSEAU et al., 2013).

Nas plantas Test-Inoc, foi observado menor Fv/Fm aos 34 e 94 DAT, com queda de

0,64 para 0,43, apresentando declínio acentuado de uma avaliação para outra, indicando

possivelmente a presença de danos no aparato fotossintético. Já no tratamento Test-Absoluta,

os valores de Fv/Fm aos 34 e 94 DAT foram de 0,73 e 0,62, respectivamente.

Uma vez que os valores de Fv/Fm em folhas saudáveis se encontram próximos de 0,83

(BJÖRKMAN; DEMMING, 1987) e como observado, as plantas dos tratamentos Test-Inoc

apresentaram os menores valores deste parâmetro (0,43 e 0,64), pode-se inferir que estas se

encontravam em severas condições de estresse em decorrência do progresso da doença, que

refletiu em perdas da eficiência do PSII. As espécies do gênero Alternaria são produtoras de

toxinas prolíficas, que facilitam a sua vida necrotrófica, provocando a morte da célula, causando

danos ao tecido vegetal (LAWRENCE et al., 2008), resultando em perda de eficiência

fotossintética.

A síntese dos compostos orgânicos é dependente da produção de ATP e NAPH2,

formados durante o transporte de elétrons entre o PSII e o PSI. Assim, a presença do patógeno

A. solani, devido a sua agressividade, afetou a capacidade fotossintética das plantas Test-Inoc

e provocou o desbalanço entre os fotossistemas PSII e PSI, como pode ser observado pela

menor transferência de elétrons (ETR). Em consequência disto, possivelmente, ocorreu o

transporte pseudocíclico de elétrons, também conhecido como Reação de Mehler, onde há

formação de ânion superóxido (•O2-), a partir do oxigênio molecular que recebe o elétron que

seria transferido da ferredoxina para o NADP+ (BHATTACHARJEE, 2010).

Com relação aos parâmetros de fluorescência variável (Fv) e rendimento quântico

efetivo do PSII, Y(II) observou-se diferença significativa entre os tratamentos (Figura 11), com

destaque para o tratamento Flux+Pira que apresentou os maiores valores para Fv aos 94 DAT,

no entanto, sem diferir dos demais fungicidas aos 34 DAT. Tais plantas ao apresentarem

maiores valores de Fv evidenciam maior capacidade de assimilar CO2, uma vez que este

parâmetro é indicativo da capacidade de adaptabilidade do PSII (BAKER; ROSENQVIST,

2004).

63

Plantas que apresentam maiores valores de Fv indicam maior capacidade de

transferência de elétrons entre PSII e PSI para a geração de NADPH2 e ATP, culminando em

maior eficiência fotossintética (BAKER, 2008). Tal fato confirma os resultados verificados para

trocas gasosas, nos quais as plantas submetidas ao tratamento Flux+Pira apresentaram maior

assimilação de CO2, também evidenciado aqui pelos maiores valores de rendimento quântico

efetivo do PSII, sendo aquelas onde se observou os maiores valores de Fv e ETR (Figura 11).

Maiores valores de rendimento quântico efetivo do PSII, Y(II) observados no

tratamento Flux+Pira, revelam maior eficiência fotoquímica do PSII, pois este parâmetro

permite avaliar a capacidade de absorção da luz pelas clorofilas e sua potencial utilização

fotoquimicamente (MAXWELL; JOHNSON, 2000).

Os resultados referentes ao ETR (Figura 11), foram significativamente diferentes entre

os tratamentos (p<0,05), sendo maiores nos tratamentos com aplicação dos diferentes

fungicidas (Flux+Pira > Me+Pira > Pira > Bosc+Cre > Bosc). O transporte de elétrons entre o

PSII e PSI tem como destino final a fixação de CO2, sintetizando carboidratos. Desta forma,

qualquer fator que cause alterações no processo fotossintético refletirá em mudanças na ETR.

De fato, o tratamento Flux+Pira, que apresentou maior rendimento quântico efetivo do PSII

também apresentou maior ETR. Pois, quanto maior o valor de ETR maior é a soma dos destinos

finais dos elétrons no cloroplasto, que serão utilizados principalmente para a fixação de carbono

(MISRA et al., 2011).

Isto comprova a maior eficiência de carboxilação observada no tratamento Flux+Pira,

indicando que estas plantas, tanto aos 34 DAT (que compreendia a fase vegetativa), quanto aos

94 DAT (plena fase reprodutiva), encontravam-se com potencial capacidade fotossintética.

Diante disto, pode-se afirmar que tais plantas produziram maior quantidade de NADPH2 e ATP

(devido ao maior ETR) e utilizaram eficientemente estes produtos no ciclo de Calvin para a

síntese de carboidratos, suprindo as demandas de crescimento, desenvolvimento e produção

que, por consequência, foram maiores neste tratamento.

Ao contrário, as plantas Test-Inoc apresentaram menores valores de Fv, com isto a

eficiência quântica efetiva do PSII da folha diminuiu com o aumento da doença, como já

discutido, em virtude da redução de Fv/Fm em decorrência dos danos causados pelo patógeno

nos tecidos fotossintéticos. Com isso, houve mudanças negativas no processo fotossintético,

prejudicando a síntese e transporte de carboidratos, acarretando em menor utilização de

NADPH2 e ATP e, consequentemente, a eficiência quântica efetiva de PSII diminuiu. Não

64

havendo o consumo de NADPH2 e ATP, há a redução do fluxo de elétrons, como demonstrado

pela baixa ETR nas plantas Test-Inoc, seguidas de Test-Absoluta.

5.3 Pigmentos fotossintéticos e atividade da enzima nitrato redutase

A absorção da luz ocorre nos PSI e PSII, os quais são constituídos de pigmentos

fotossintéticos (clorofila a, clorofila b e carotenoides) (CASIERRA-POSADA; PEÑA-

OLMOS, 2015), por isso a quantidade de clorofilas presentes no tecido foliar reflete

significativamente a eficiência fotossintética de uma planta. Sendo assim o acréscimo nos

teores de clorofilas a e b resulta em maior absorção da luz e consequentemente maior ETR entre

o PSII e PSI (RODRIGUES et al., 2016).

O aumento da eficiência fotossintética, observado nos tratamentos com os diferentes

fungicidas, tem grande relação com o teor de pigmentos fotossintéticos das folhas, analisadas

aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 DAT (Figura 12), que de maneira geral, apresentaram

diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos nos dois anos avaliados.

Na primeira avaliação aos 15 DAT, realizada antes da aplicação dos fungicidas, não se

verificou diferença estatística significativa (p<0,05) entre os tratamentos, no entanto, a partir

dos 20 DAT as plantas tratadas com Flux+Pira apresentaram os maiores teores de clorofila a e

b (µg g massa fresca-1), tendo aumento expressivo com o avanço das avaliações. Este

comportamento está relacionado com o efeito somatório das aplicações, uma vez que as

avalições compreendidas entre 20 e 95 DAT foram realizadas sempre no 5º dia após a aplicação,

portanto, aos 20, 35, 50, 65, 80 e 95 DAT temos: 5º dia após a 1º, 2º, 3º, 4º, 5º e 6º aplicação

dos tratamentos, respectivamente.

Nota-se também que o tratamento Me+Pira com o avançar das avaliações apresentou

efeito semelhante ao Flux+Pira, não diferindo estatisticamente nos teores de clorofila a e b, em

algumas avalições. Estes resultados estão de acordo com os dados observados nas avaliações

de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a, onde se constatou maior incremento

fotossintético nas plantas tratadas com Flux+Pira, seguidas de Me+Pira. De acordo com Baker

e Rosenqvist (2004) quanto maior a quantidade de clorofila a, mais elevados estarão os

processos fotoquímicos da fotossíntese, como de fato pode ser observado nos tratamentos

Flux+Pira e Me+Pira, que apresentaram maior concentração de clorofila a a partir dos 20 DAT.

Este start inicial promovido por estes tratamentos refletiu diretamente na fotossíntese líquida e

65

nos demais parâmetros fotossintéticos avaliados, demonstrando ser um dos importantes efeitos

destas moléculas em plantas de tomateiro.

Figura 12. Teor de clorofila a (µg g massa fresca-1), clorofila b (µg g massa fresca-1) e carotenoides (µg g massa

fresca-1) em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes

fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 dias após

o transplantio (DAT), nos anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação,

diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média.


Pelos resultados observados a aplicação destes fungicidas exerce efeitos fisiológicos e

influenciam significativamente a síntese de pigmentos fotossintéticos, em especial de clorofilas

a e b. Incrementos nos teores de clorofilas também foram relatados em meloeiro (MACEDO,

2015) e tomateiro (RAMOS, 2013; JACOBELIS JUNIOR, 2015), após aplicação de fungicidas

a base de estrobilurinas e carboxamidas. Este efeito reflete em maior eficiência fotossintética

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450

15 DAT 20 DAT 35 DAT 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT 110 DAT

200

250

300

350

400

450

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550





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2016

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2015

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2015

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2015

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aa

a

a

66

das plantas, porque a clorofila, em especial a clorofila a, é o elemento essencial no processo

fotossintético e, quanto maior a concentração destes pigmentos, maior é a absorção e transporte

da energia solar pelos fotossistemas, convertendo-a em energia química (YEOM et al., 2014).

Ao contrário, os menores teores de pigmentos fotossintéticos foram observados nos

tratamentos Test-Inoc, seguido de Test-absoluta, em todas as avalições realizadas após os 15

DAT. Ao analisar estes teores de pigmentos e comparar com os parâmetros de emissão de

fluorescência da clorofila a, nota-se que há um avançado grau de estresse nestas plantas

(fotoinibição crônica), pois como já discutido, as plantas Test-Inoc apresentaram níveis mais

reduzidos de Fv/Fm aos 94 DAT, em decorrência do progresso da doença. Sugere-se, portanto,

que a redução dos valores de Fv/Fm pode ter ocorrido devido aos danos causados pelo patógeno

no tecido foliar, pela degradação do conteúdo celular, que acarretou em menores teores de

clorofilas a e b.

Além disto, a presença do patógeno também desencadeou o processo de estresse

oxidativo, todas estas reações em conjunto promoveram, consequentemente, à menor

capacidade de aproveitamento da luz pelas plantas deste tratamento. Pois, quando a energia

armazenada na clorofila não é dissipada para a síntese de carboidratos, é então transferida para

o O2, promovendo o transporte pseudocíclico de elétrons (BHATTACHARJEE, 2010). Isto

ocorre devido à baixa fixação de CO2 e menor poder redutor (NADP+) e, a ferredoxina acaba

transferindo o elétron ao O2 formando •O2- (AHMAD et al., 2008).

As plantas quando submetidas a condições de estresse abiótico ou biótico aumentam a

produção de EROs (BHATTACHARJEE, 2010; KARUPPANAPANDIAN et al., 2011) e,

consequentemente, sofrem alterações no equilíbrio das reações fotoquímicas pelos danos

causados no aparato fotossintético, percebida na cinética de emissão da fluorescência nas

plantas (BAKER; ROSENQVIST, 2004).

Quanto aos teores de carotenoides foram observados maiores valores nas plantas

tratadas com Flux+Pira, seguidas de Me+Pira, diferindo significativamente entre si e dos outros

tratamentos nas avaliações dos 20 aos 110 DAT, nos dois anos avaliados. Ao contrário, os

menores teores de pigmentos foram observados nas plantas Test-Inoc, seguido do tratamento

Test-Absoluta. Supõe-se, portanto, que os menores teores de pigmentos nestes tratamentos,

principalmente nas plantas Test-Inoc, se devam aos danos causados pela presença de A. solani.

Pois, como se trata de um patógeno necrotrófico, a destruição do tecido vegetal reflete em lesões

celulares e causa danos no metabolismo de síntese de pigmentos fotossintéticos. Uma vez que

67

as plantas refletem os danos sofridos no metabolismo fotossintético por meio da concentração

de pigmentos e pela emissão de fluorescência da clorofila a (BRESTIC; ZIVCAK, 2013), como

já observados.

Somado ao efeito fungitóxico, pode-se dizer que os fungicidas de efeitos fisiológicos

como Flux+Pira e Me+Pira também apresentam efeito positivo na proteção do aparato

fotossintético, pois os carotenoides possuem função antioxidativa e protegem a maquinaria

fotoquímica de danos por estresse oxidativo (danos fotoxidativos). Pois, inevitavelmente há

formação de EROs e de seus subprodutos durante o processo da fotossíntese, os quais causam

severos danos oxidativos no aparato fotossintético e diminuem sua eficiência, assim a síntese

de compostos antioxidativos como os carotenoides são importantes fotoprotetores e

antioxidantes (NISAR et al., 2015).

Os teores de pigmentos fotossintéticos nos vegetais são influenciados pela

disponibilidade, absorção e assimilação de nitrogênio em seu metabolismo. O nitrogênio é um

dos principais constituintes da molécula de clorofila (TAIZ; ZEIGER, 2013), por isso a

concentração de clorofilas a e b têm forte relação com a quantidade de nitrogênio que a planta

assimila. A nitrato redutase é a enzima chave na regulação do metabolismo do nitrogênio

(VIANA; KIEHL, 2010) assim, a atividade desta enzima está intrinsicamente ligada ao maior

aporte de pigmentos para o processo fotossintético da planta.

De acordo com a Figura 13 foram avaliados os efeitos fisiológicos na atividade da

enzima nitrato redutase aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 DAT (mesmos dias em que foram

avaliados os teores de pigmentos). De modo geral, plantas tratadas com os diferentes fungicidas

apresentaram maior atividade da enzima nitrato redutase ao longo das avaliações, verificando-

se diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos, em ambos os anos avaliados.

Dentre os tratamentos, as plantas que receberam a aplicação de Flux+Pira e Me+Pira

foram aquelas que apresentaram maior atividade da enzima nitrato redutase, nas coletas

realizadas após os 15 DAT, o que contribuiu para o maior teor de pigmentos fotossintéticos

evidenciados nestes mesmos tratamentos. Justificando a maior eficiência fotossintética e

desenvolvimento destas plantas que, possivelmente, interferiu na produção de frutos.

Aumento da atividade da enzima nitrato redutase e efeito verde também foram relatados

por Soares et al. (2011), Macedo (2015) e Ramos (2013) em plantas de soja, melão e tomate,

respectivamente, tratadas com fungicidas a base de estrobilurinas e carboxamidas.

68

Figura 13. Atividade da enzima nitrato redutase (NR, μg nitrito min-1 g de massa fresca-1) em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação,

tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 dias após o transplantio (DAT), nos

anos de 2015 e 2016. Médias (n = 5) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam

desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10



-1) Piraclostrobina (0,100 g L

-1)

Fluxapiroxade (0,058 g L-1) + Piraclostrobina (0,116 g L



-1)

a a aa

b b bb bc

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b b b c cc b b

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a

b

a

aa

2016

69

Pode-se observar na que os maiores picos de atividade da enzima nitrato redutase nos

tratamentos Flux+Pira e Me+Pira (Figura 13) ocorreram nas avaliações realizadas aos 50, 65 e

80 DAT, período no qual as plantas de tomateiro se encontravam em transição entre a fase

vegetativa e início da fase reprodutiva, momento de maior necessidade de nitrogênio para suprir

a demanda de fotoassimilados para o desenvolvimento dos frutos. Aos 95 e 110 DAT, fase em

que foi observado maior crescimento e maturação de frutos, as plantas tratadas com Flux+Pira

novamente apresentaram maior atividade da enzima nitrato redutase, seguidas do tratamento

Me+Pira, evidenciando assim os efeitos positivos destas substâncias na fisiologia de plantas de

tomateiro.

A aplicação de fungicidas que promovem efeitos fisiológicos, como as estrobilurinas e

mais recentemente as carboxamidas, aumentam a biomassa e a produção, mesmo em plantas

que não são afetadas por fungos, por isso são práticas agrícolas interessantes no cenário

agrícola. Tais fungicidas, em especial a piraclostrobina, aumentam a assimilação de nitrogênio

por elevarem a atividade de NADH-nitrato, por isso a aplicação de piraclostrobina pode ser

considerada uma alternativa importante para o manejo da adubação nitrogenada (KANUNGO;

JOSHI, 2014).

Plantas que assimilam maior quantidade de nitrogênio também sintetizam maiores

concentrações de compostos nitrogenados essenciais para o seu crescimento (VIANA; KIEHL,

2010). De fato, as plantas Test-Inoc e Test-Absoluta apresentaram a menor atividade da enzima

nitrato redutase, a qual culminou em menor teor de pigmentos, baixa atividade fotossintética,

acarretando menor altura de planta e menor acúmulo de massa fresca e seca de plantas, como

observado nas análises de desenvolvimento.

5.4 Síntese e translocação de carboidratos

A maior obra da fotossíntese é permitir o crescimento e desenvolvimento do vegetal, a

partir de um complexo processo de reações de oxi-redução, fixando o CO2 em compostos

orgânicos. Uma vez que a produção de carboidratos é o produto final da fotossíntese, relações

entre órgãos fonte-dreno também são influenciados pela eficiência fotossintética. Desta forma,

foi avaliada a translocação de fotoassimilados nas plantas de tomateiro aos 50 e 120 DAT

(Tabelas 6 e 7).

70

Tabela 6. Média dos teores de açúcares totais e açúcares redutores (µg g massa fresca-1) em



fisiológicos e inoculadas com Altenaria solani, no ano de 2015. Unicentro, Guarapuava/PR,

2018.

Concentração de carboidratos – 50 DAT

Açúcares totais

(µg g massa fresca-1)

Açúcares redutores


Tratamentos Folha Caule Fruto Folha Caule Fruto


(inóculo + água) 85,2cC 110,6cB 298,3cA 48,6aC 78,9aB 65,9cA

Testemunha absoluta (água) 82,1cC 113,2cB 299,3cA 50,2aC 81,8aB 67,2cA

Boscalida (0,075 g L-1) 92,4bC 136,7bB 336,5bA 39,3bC 61,9bB 105,6bA


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 94,9bC 134,6bB 325,8bA 40,2bC 63,5bB 102,8bA

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 95,6bC 138,5bB 330,5bA 39,8bC 60,5bB 99,3bA


+ Piraclostrobina (0,116 g L-1) 126,4aC 154,6aB 385,9aA 28,1cC 49,6cB 123,5aA



CV (%) 8,6 9,2 7,8 5,9 8,7 8,5


Açúcares totais






(inóculo + água) 63,2cC 102,3cB 302,4cA 28,4aC 50,2cB 72,6cA

Testemunha absoluta (água) 60,7cC 99,8cB 307,2cA 29,6aC 52,6cB 74,9cA






+ Piraclostrobina (0,116 g L-1) 99,6aC 152,3aB 435,6aA 13,3cC 22,3aB 166,0aA



CV (%) 10,7 9,3 9,2 8,7 9,1 7,6

Médias (n = 5) seguidas de letras minúsculas diferentes na coluna e maiúscula para cada característica na linha,

diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade (p<0,05).

50 DAT = início da frutificação; 120 DAT = final da colheita.

Analisando os teores de açúcares totais nas folhas, caule e frutos, tanto aos 50 DAT

quanto aos 120 DAT a concentração destes açúcares, em todos os tratamentos, foi na ordem de

frutos>caule>folhas, demonstrando de maneira geral, que todas as plantas apresentavam

translocação efetiva de carboidratos para os frutos, devido ao incremento positivo destes nos

mesmos. Assim, em todos os tratamentos houve diferença significativa (p<0,05) na

71

concentração de açúcares totais entre os diferentes órgãos avaliados, sendo o mesmo observado

para os teores de açúcares redutores.

Tabela 7. Média dos teores de açúcares totais, açúcares redutores (µg g massa fresca-1) em


Conquistador, cultivadas em casa de vegetação e tratadas com diferentes fungicidas de efeitos

fisiológicos e inoculadas com Alternaria solani, no ano de 2016. Unicentro, Guarapuava/PR,

2018.


Açúcares totais






(inóculo + água) 89,5cC 121,9cB 299,9cA 45,5aC 84,6aB 60,3cA

Testemunha absoluta (água) 86,3cC 124,2cB 303,1cA 48,2aC 85,7aB 62,4cA









CV (%) 9,6 8,7 7,2 6,4 7,4 8,4


Açúcares totais






(inóculo + água) 68,0cC 99,3cB 322,9cA 31,9aC 56,2cB 78,1cA

Testemunha absoluta (água) 66,8cC 103,6cB 318,9cA 32,6aC 55,0cB 79,4cA









CV (%) 9,4 8,7 10,4 9,7 8,4 6,8

Médias (n = 5) seguidas de letras minúsculas diferentes na coluna e maiúscula para cada característica na linha,

diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade (p<0,05).

50 DAT = início da frutificação; 120 DAT = final da colheita.

No entanto, os tratamentos Flux+Pira e Me+Pira foram aqueles que apresentaram as

maiores concentrações destes carboidratos nas folhas, caules e frutos, nas duas avaliações

72

realizadas (50 e 120 DAT), diferindo significativamente (p<0,05) dos demais tratamentos, com

comportamento semelhante nos dois anos avaliados.

Isto indica que estas substâncias promoveram maior síntese e acúmulo de carboidratos

em plantas de tomateiro, estando de acordo com os dados obtidos para as análises de eficiência

fotossintética. Verificando os teores destes carboidratos nos tratamentos Bosc, Bosc+Cre e Pira

aos 50 e 120 DAT observou-se que não houve diferença estatística entre eles para os teores de

açúcares totais e redutores nos órgãos avaliados. Porém, estes três tratamentos diferem

significativamente (p<0,05) dos demais, apresentando valores médios destas características

superiores aos das testemunhas (Test-Inoc e Test-Absoluta) e inferiores aos observados para

Flux+Pira e Me+Pira.

Nos dois anos avaliados (Tabelas 6 e 7), tanto aos 50 DAT quanto aos 120 DAT, as

menores concentrações de açúcares totais e redutores foram observados nas plantas Test-Inoc

e Test-Absoluta, evidenciando que os diferentes fungicidas avaliados influenciaram na

concentração e partição de carboidratos em plantas de tomateiro.

Avaliando a aplicação de piraclostrobina e boscalida, isolados e combinados com

outros produtos químicos em plantas de tomateiro, Ramos et al. (2015) também observaram

que em todos os tratamentos as concentrações de açúcares totais e redutores foram superiores

à testemunha, além de verificarem que nos frutos foi estatisticamente superior às folhas e caule,

evidenciando que estes tratamentos são efetivos na maior translocação destes açúcares, por

promoverem maior desenvolvimento do tecido, aumentando a capacidade de dreno do órgão

em crescimento, neste caso o fruto.

Quanto à concentração de açúcares redutores os menores valores foram encontrados nas

folhas das plantas tratadas com Flux+Pira e Me+Pira, diferindo significativamente dos demais

tratamentos. Isto condiz com o observado nos dados obtidos para as trocas gasosas,

apresentando feedback positivo, uma vez que estas plantas ao possuírem menor concentração

destes açúcares na fonte, não apresentaram limitações no processo fotossintético (devido ao

acúmulo de fotoassimilados) e com isso, as taxas de assimilação de CO2 se mantiveram altas.

Os açúcares são os produtos primários da fotossíntese, por isso quando estão acima da

concentração normal nas folhas (fonte) estimulam rotas de sinalização que bloqueiam a

expressão de genes associados à fotossíntese, caracterizando um feedback negativo do produto

final e os processos fotossintéticos descontinuam até que esta fase se reverta (QUIRINO et al.,

2000; TAIZ; ZEIGER, 2013).

73

Por serem menos reativos, os carboidratos translocados a longas distâncias no floema

são os açúcares não redutores (DINANT; LEMOINE, 2010), assim, a sacarose é o açúcar

predominantemente translocado via floema, mas outros açúcares móveis também estão

presentes como a rafinose e estaquiose, além dos açúcares-álcoois, como o sorbitol e manitol

(VAN BEL; HESS, 2008).

Altas taxas fotossintéticas promovem abundante síntese de açúcares que reflete em

maior crescimento e armazenamento de carboidratos nos drenos (TAIZ; ZEIGER, 2013). O

principal dreno em plantas de tomateiro a partir da floração são os frutos, como observado os

tratamentos Flux+Pira e Me+Pira apresentaram as maiores concentrações de açúcares totais e

redutores aos 120 DAT nos frutos, diferindo significativamente (p<0,05) dos demais

tratamentos.

A maior síntese e acúmulo destes carboidratos nos frutos pode ser explicada pela maior

eficiência fotossintética já relatada, entretanto, também se observou eficiente translocação

destes açúcares no sentido fonte-dreno. Estudos têm demonstrado que as estrobilurinas, como

a piraclostrobina alteram o balanço hormonal da planta, promovendo a síntese de auxinas e

ácido abscísico (ABA) e diminuindo a produção de etileno (KANUNGO; JOSHI, 2014). As

citocininas, por promoverem maior crescimento do dreno e expansão foliar, aumentam a taxa

fotossintética e a capacidade do dreno no tecido. Já o etileno inibe o crescimento dos drenos e

diminui a atividade das invertases (ALBACETE et al., 2013). Diante disto, é possível inferir

que tenha ocorrido um melhor balanço hormonal influenciando a regulação das relações fonte-

dreno com a aplicação destas substâncias, promovendo maior crescimento do tecido dreno e

aumentando a translocação de fotoassimilados para estes órgãos.

Aos 120 DAT os tratamentos Flux+Pira e Me+Pira apresentaram as maiores

concentrações de açúcares totais em todos os órgãos avaliados, evidenciando eficiente acúmulo

de reservas no decorrer do tempo. Isto condiz com o observado nas análises de desenvolvimento

para estas mesmas plantas, uma vez que 90% da massa seca da planta é formada por

fotoassimilados que foram convertidos em biomassa ao longo do desenvolviemnto da planta

(POPOV et al., 2003). Portanto, de acordo com os efeitos observados, os tratamentos Flux+Pira

e Me+Pira promoveram alterações nas relações entre fonte-dreno e, consequentemente, na

produtividade das plantas de tomateiro.

74

5.5 Controle de Alternaria solani

Eficientes níveis de controle de doenças foliares é o principal objetivo de aplicações de

fungicidas, pois infecções por A. solani reduzem a eficiência fotossintética das plantas de

tomateiro comprometendo a síntese de fotoassimilados e, consequentemente, a produção e a

qualidade dos frutos. Por isso para verificar o efeito no controle de A. solani foram avaliadas a

área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) (Figura 14), nos dois anos analisados e

observou-se que houve redução da AACPD para os diferentes fungicidas avaliados em relação

à testemunha inoculada (Test-Inoc).

Test+Inoc

Test Bosc

Bosc+Cre Pira

Flux+Pira

Me+Pira0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

Experimento II ( 2016)

100e68e

333c304cd

417b

248d

Áre

a A

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o d

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956a

Experimento I (2015)

Test+Inoc

Test Bosc

Bosc+Cre Pira

Flux+Pira

Me+Pira

329d381cd

423c

529b

101e148e

1034a

Figura 14. Efeito dos diferentes tratamentos com fungicidas, na área abaixo da curva de progresso da doença

(AACPD), testados no controle de Alternaria solani em plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivado em

casa de vegetação, nos anos de 2015 e 2016. Tratamentos: testemunha inoculada (Test+Inoc), testemunha absoluta

(Test), boscalida (Bosc), boscalida mais cresoxim-metílico (Bosc+Cre), piraclostrobina (Pira), fluxapiroxade mais

piraclostrobina (Flux+Pira) e metiram mais piraclostrobina (Me+Pira). Médias (n = 10) seguidas de letras distintas

diferem pelo teste Tukey ao nível de 1% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam e desvio padrão da média.


No experimento de 2015, as temperaturas médias variaram de 19,5 a 29,5°C (Figura 15)

no interior da casa de vegetação, com extremos de 14,2 a 36,8°C. A umidade relativa média

variou de 72,5 a 81,5%, tendo os extremos de 55 a 95%. Enquanto que no experimento de

2016, as temperaturas médias, mínima e máxima, foram de 19,5 a 30,5°C, respectivamente

(Figura 16), com extremos de 12,1 a 39,3°C. A umidade relativa média variou de 72 a 81,5%,

tendo os extremos de 55 a 95%.

75

0

5

10

15

20

25

30

35

40

31/12/2014

05/01/2015

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30/01/2015

04/02/2015

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14/02/2015

19/02/2015

24/02/2015

01/03/2015

06/03/2015

11/03/2015

16/03/2015

21/03/2015

26/03/2015

31/03/2015

05/04/2015

10/04/2015

15/04/2015

20/04/2015

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30/04/2015

05/05/2015

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Tem

peratu

ra (

°C

)

Máxima Mínima

Um

idad

e R

ela

tiv

a d

o a

r

(U

R%

)

Figura 15. Variação das temperaturas e umidades do ar, máximas e mínimas, no ano de 2015, avaliadas diariamente durante a condução do experimento, no interior da

casa de vegetação onde foram conduzidas as plantas de tomateiro híbrido Conquistador, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com

Alternaria solani. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

76

0

5

10

15

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31/12/2015

05/01/2016

10/01/2016

15/01/2016

20/01/2016

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30/01/2016

04/02/2016

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14/02/2016

19/02/2016

24/02/2016

29/02/2016

05/03/2016

10/03/2016

15/03/2016

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30/03/2016

04/04/2016

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0

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Tem

peratu

ra (

°C

) Máxima Mínima

Um

idad

e R

ela

tiv

a d

o a

r

(U

R%

)

Figura 16. Variação das temperaturas e umidades do ar, máximas e mínimas, no ano de 2016, avaliadas diariamente durante a condução do experimento, no interior da

casa de vegetação onde foram conduzidas as plantas de tomateiro híbrido Conquistador, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com

Alternaria solani. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

77

O aumento da severidade da pinta preta é proporcional ao aumento da umidade relativa

e de temperaturas na faixa de 25 a 32ºC, onde ocorre intensa redução da área foliar, queda do

vigor das plantas, danos em caules e depreciação de frutos (TÖFOLI; DOMINGUES, 2005).

De fato, a ausência de controle e as condições ambientais ideais (Figuras 15 e 16) para o

desenvolvimento da doença acarretou em maior intensidade desta na testemunha inoculada

(Test-Inoc), verificado pelas maiores AACPDs, nos dois anos avaliados.

Devido às condições ideais observadas para o desenvolvimento da doença, altas

temperaturas e umidade relativa do ar, somadas a presença de inóculo (plantas doentes: Test-

Inoc) as plantas Test-Absoluta, que não foram inoculadas no início do experimento, também

manifestaram certo percentual de severidade de doença nas últimas avaliações, por isso

apresentaram índices de AACPD de 248 e 329 nos anos de 2015 e 2016, respectivamente.

As lesões de A. solani são desenvolvidas a partir de penetrações que ocorrem após a

formação do apressório e, no caso deste patógeno, esta estrutura é essencial para o processo de

infecção. Por isso, quando se tem menor número de apressórios formados se observa menor

frequência de lesões no hospedeiro (BALBI-PEÑA et al., 2014). Pode-se observar que os

fungicidas Flux+Pira, Me+Pira, Bosc, Pira e Bosc+Cre reduziram os valores em 92,88, 89,54,

56,38, 65,16 e 68,20% para AACPD no ano de 2015, e em 90,23, 85,68, 48,84, 59,09 e 63,15%

no ano de 2016, respectivamente, em relação à testemunha inoculada.

As menores AACPDs nas plantas tratadas com os fungicidas avaliados em contraste

com a testemunha Test-Inoc indicam que estas moléculas apresentam eficiente controle durante

a germinação dos conídios de A. solani devido ao seu efeito sobre a cadeia de transporte de

elétrons na mitocôndria, afetando a respiração do fungo. As estrobilurinas atuam no complexo

III da respiração mitocondrial, sendo que os princípios ativos piraclostrobina (Pira) e cresoxim-

metílico (Cre) bloqueiam a transferência de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c1,

interferindo no transporte de elétrons e, consequentemente, na formação de ATP para as células

do fungo (KANUNGO; JOSHI, 2014; MATOS et al., 2016).

Já as carboxamidas, fluxapiroxade (Flux) e boscalida (Bosc), atuam na respiração

mitocondrial bloqueando a transferência de elétrons no complexo II, inibindo a enzima

succinato dehidrogenase (SDHI), reduzindo o processo respiratório e bloqueando o

fornecimento de energia das células do fungo (FRAC, 2017). São fungicidas de ação preventiva

e curativa, atuando na germinação de esporos, alongamento do tubo germinativo, crescimento

micelial e esporulação de uma ampla variedade de fungos (EFSA, 2015).

78

No entanto, os tratamentos Flux+Pira e Me+Pira apresentaram as menores AACPDs,

diferindo significativamente (p<0,01) dos demais tratamentos, com resultados semelhantes nos

dois anos avaliados. Os fungicidas Bosc, Bosc+Cre e Pira também foram eficientes em reduzir

a severidade da doença, quando comparados à testemunha Test-Inoc (Figura 14). Assim, o uso

destas estrobilurinas e carboxamidas são eficientes tanto para o controle de A. solani, além de

promoverem maior rendimento fotossintético de plantas de tomateiro. Honorato Júnior et al.

(2015) também verificaram eficiente controle de Hemileia vastatrix em Coffea arabica e

melhor desempenho fotossintético das plantas após a aplicação foliar de piraclostrobina,

comprovando a ação ‘extra’ destes produtos.

5.6 Estresse oxidativo e enzimas antioxidantes

Por consequência da presença da doença nas plantas, decorrentes da inoculação

realizada aos 16 DAT, houve exposição destas a um fator estressante (estresse biótico). Como

observados nos dados de eficiência fotossintética (trocas gasosas e fluorescência da clorofila

a), síntese e translocação de carboidratos, desenvolvimento e acúmulo de biomassa nas plantas

de tomateiro, nota-se que a presença deste fator estressante também teve influência no

metabolismo fotossintético, no desenvolvimento e, possivelmente, na produtividade destas

plantas.

O estresse dispara várias respostas bioquímicas no metabolismo da planta, entre elas a

biossíntese de componentes oxidativos e, consequentemente, a atividade de enzimas

antioxidativas, configurando uma cascata de eventos. Em plantas sob condições de crescimento

normais a produção de EROs é baixa. No entanto, quando submetidas à algum tipo de estresse

biótico ou abiótico, a primeira resposta observada na planta é o aumento drástico da produção

de espécies reativas de oxigênio (EROs ou ROS, do inglês reactive oxygen species) que causam

danos oxidativos em proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, caracterizando o estresse oxidativo

(BARBOSA et al., 2014).

Quando se trata de estresse por agente fitopatogênico, uma das primeiras respostas

celulares após o reconhecimento planta-patógeno é a explosão oxidativa, caracterizada por uma

superprodução de ânion superóxido (•O2-) e do produto de sua dismutação, o peróxido de

hidrogênio (H2O2), principalmente no apoplasto, mas também podendo ser produzidos em

outros compartimentos celulares, como nas mitocôndrias e cloroplastos (SHARMA et al.,

2012). No entanto, Resende et al. (2003) relatam que primeiro ocorre uma pequena e rápida

79

explosão oxidativa, e após ocorre uma segunda explosão, mais forte e prolongada que

caracteriza o processo de resistência, culminando em respostas de defesa como a HR.

O ânion •O2- (radical moderadamente reativo e instável) é gerado por meio de diferentes

vias metabólicas na planta a partir da redução do O2 por um único elétron (RIBEIRO et al.,

2005). Por ser a primeira espécie reativa formada, o •O2- dá origem às outras espécies reativas.

O superóxido •O2-, por intermédio da enzima SOD é dismutado a H2O2 (BHATTACHARJEE,

2010). Uma vez protonado, o •O2- dá origem ao radical peroxila (HO2

•), altamente reativo,

porém presente em pequenas concentrações em pH fisiológico (BARBOSA et al., 2014).

Desta maneira, também foi avaliada a influência dos tratamentos no sistema

antioxidativo enzimático ao longo do ciclo de crescimento e desenvolvimento das plantas de

tomateiro. Nas avaliações da concentração do ânion •O2- em folhas de tomateiro (Figura 17),

aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e

105 DAT, observou-se comportamento similar nos dois anos avaliados. Pode-se notar que

houve aumento da produção desta espécie reativa de oxigênio aos 17 DAT (coleta realizada 24

horas após a inoculação do patógeno) nas plantas Test-Inoc. Isto ocorreu porque durante o

contato inicial entre o patógeno e a célula vegetal, dá-se início a uma cascata de eventos, tendo

como uma das primeiras respostas a explosão oxidativa formando as EROs, e como já relatado,

o •O2- é a primeira molécula reativa a ser formada.

As EROs, iniciando com o •O2-, são formadas pelo vazamento inevitável de elétrons que

acabam sendo ‘aceitos’ pelo O2. Tais elétrons são oriundos dos processos de transporte de

elétrons nos cloroplastos, mitocôndrias e membranas plasmáticas, ou até mesmo, como um

subproduto de várias vias metabólicas localizadas em diferentes compartimentos celulares. Por

isso, as EROs são produzidas em diferentes locais na célula, tais como: cloroplastos,

mitocôndrias, plasmalema, peroxissomas, apoplasto, retículo endoplasmático e paredes

celulares (SHARMA et al., 2012). A transferência de elétrons na mitocôndria ou no cloroplasto

são importantes vias de formação de •O2-, pois ativam as NADPH-oxidases/sintases ligadas à

membrana, além de peroxidases da parede celular e lipoxigenases (RESENDE et al., 2003;

RIBEIRO et al., 2005).

Estudos têm demonstrados que as EROs também agem como “moléculas sinalizadoras”

ou “mensageiros secundários”, atuando na via de sinalização em resposta a situações de

estresses nas plantas, influenciando na expressão de vários genes envolvidos no metabolismo

80

Figura 17. Concentração de ânion superóxido (•O2

-, mmol g de massa fresca-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91,

94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos

fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

15 DAT16 DAT

17 DAT20 DAT

29 DAT30 DAT

31 DAT34 DAT

44 DAT45 DAT

46 DAT49 DAT

59 DAT60 DAT

61 DAT64 DAT

74 DAT75 DAT

76 DAT79 DAT

89 DAT90 DAT

91 DAT94 DAT

105 DAT

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7




-1)




-1)

2016

Co

ncen

tração

do

ân

ion

su

peró

xid

o (

mm

ol

g d

e m

ass

a f

resc

a-1

)

Inoculação

6ª Aplicação4ª Aplicação 5ª Aplicação3ª Aplicação2ª Aplicação1ª Aplicação

2015

81

de defesa da planta (BARBOSA et al., 2014; RECZEK; CHANDEL, 2015). Por isso, as EROs

também são produzidas nos estádios posteriores da patogênese, como de fato ocorreu.

Pode-se observar que a concentração de •O2- permaneceu alta ao longo de todo o

crescimento e desenvolvimento das plantas Test-Inoc, em função do progresso da doença.

Porém, nas plantas Test-Absoluta o aumento da concentração de •O2- só ocorreu aos 64 e 74

DAT, nos anos de 2015 e 2016, respectivamente (Figura 17). Como a concentração de •O2-

manteve-se baixa, quando comparada aos demais tratamentos até estas datas, pode-se aferir que

o aumento significativo da produção de •O2- aos 64 e 74 DAT, ocorreu em função do início do

desenvolvimento da doença nestas plantas, que se confirma pela presença dos primeiros

sintomas observados nesta fase do experimento.

Apesar de todas as plantas, exceto as Test-Aboluta, terem sido inoculadas aos 16 DAT,

ou seja, 24 horas após a aplicação dos fungicidas, o comportamento observado nas plantas

tratadas com os diferentes fungicidas foi totalmente diferente do que se observou nas plantas

Test-Inoc, porém apresentaram comportamento similar entre eles.

Nota-se que a concentração de •O2- nas plantas tratadas com Flux+Pira, Me+Pira, Bosc,

Bosc+Cre e Pira (Figura 17) apresentou picos de produção sempre 24 horas após cada

aplicação, permanecendo alta, porém com pequenas oscilações pelas próximas 48 e 120 horas,

voltando a uma concentração baixa após 15 dias, que compreende o tempo de ‘zero hora’ antes

da próxima aplicação. Como já discutido, tanto as estrobilurinas, quanto as carboxamidas,

atuam na respiração mitocondrial do fungo. As estrobilurinas se ligam ao centro da oxidação

ubi-hidroquinona do complexo bc 1 mitocondrial (complexo III), já as carboxamidas inibem a

enzima succinato dehidrogenase (SDHI) no complexo II da respiração mitocondrial (FRAC,

2017). O efeito destas moléculas, portanto, é no transporte de elétrons que reduz a síntese de

NADH e ATP, bloqueando a produção de energia para a sobrevivência do fungo (KANUNGO;

JOSHI, 2014).

Isto indica que, possivelmente, a geração de •O2- nestes tratamentos, tenha relação com

o modo de ação destas moléculas, uma vez que estes fungicidas testados (estrobilurinas e

carboxamidas), atuam na cadeia de transporte de elétrons do patógeno irreversivelmente, mas

reversivelmente na planta. De fato, Diaz-Espejo et al. (2012) sugerem que há uma possível

evidência de que a inibição do transporte de elétrons, que somente ocorreria a nível

mitocondrial, também possa ocorrer em cloroplastos, após a aplicação de estrobilurinas em

plantas. Desta forma, a geração de •O2- possivelmente esteja ocorrendo durante a fase deste

82

‘bloqueio transitório’ no transporte de elétrons nos cloroplastos e mitocôndrias, pela ação dos

fungicidas, gerando elétrons ‘perdidos’ que acabam sendo capturados pelo O2 formando o •O2.

As EROs, dependendo da sua concentração nas plantas, podem gerar efeitos benéficos

ou deletérios. Em baixas ou moderadas concentrações, as EROs atuam como mensageiros

secundários em cascatas de sinalização intracelular que medeiam várias respostas em plantas.

No entanto, em altas concentrações elas causam danos em diversas biomoléculas (SHARMA

et al., 2012). Para evitar os danos deletérios das EROs as plantas possuem um sistema de defesa

composto por mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, que trabalham em

conjunto e em sincronia para desintoxicar as células (MOLLER et al., 2007) em nível de

cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos (SCANDALIOS, 2005; KIM; KWAK, 2010;

DINAKAR et al., 2012; NOCTOR et al., 2015; LEHMANN et al., 2015).

Entre o arsenal de defesa enzimático, a enzima superóxido dismutase (SOD), uma

metalo-enzima, é a primeira enzima na linha de defesa contra os danos causados pelos ânions

•O2- (BHATTACHARJEE, 2010). Ao analisar a atividade da enzima SOD em folhas de

tomateiro (Figura 18), aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75,

76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT, observa-se que houve um padrão de resposta similar nos dois

anos avaliados. Os resultados revelam que a atividade da enzima SOD encontrava-se alta nas

plantas tratadas com os diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos, nas avalições que

compreendiam 24, 48 e 120 horas após cada aplicação, tendo forte relação com o observado

nas respostas obtidas para a concentração de •O2- (Figuras 17). De maneira geral, todos os

tratamentos com fungicidas de efeitos fisiológicos apresentaram alta atividade da SOD.

No entanto, as maiores atividades da enzima SOD foram observadas nos tratamentos

Flux+Pira, seguido de Me+Pira, demonstrando que houve maior defesa antioxidativa nestas

plantas, a fim de desintoxicar as células pela eliminação do •O2-, minimizando os danos ao

metabolismo. Isto fica evidente quando se observa os dados de eficiência fotossintética nestes

tratamentos, os quais apresentaram maior eficiência de carboxilação e rendimento quântico

efetivo do PSII, além de maior teor de pigmentos fotossintéticos.

Pois a SOD, por ser a primeira enzima na linha de defesa contra as EROs a nível celular,

atua dismutando o •O2- em H2O2 (BHATTACHARJEE, 2010), apresentando uma conversão

altamente eficiente numa velocidade de 1010 vezes maior que na reação espontânea (RESENDE

et al., 2003). Estudos demonstram que o •O2- também pode atuar na redução de metais como o

83

Figura 18. Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89,

90, 91, 94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de

efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

15 DAT16 DAT

17 DAT20 DAT

29 DAT30 DAT

31 DAT34 DAT

44 DAT45 DAT

46 DAT49 DAT

59 DAT60 DAT

61 DAT64 DAT

74 DAT75 DAT

76 DAT79 DAT

89 DAT90 DAT

91 DAT94 DAT

105 DAT

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000




-1)




-1)

Su

peró

xid

o d

ism

uta

se (

U m

in-1

mg

pro

teín

a-1

)

2016

Inoculação


2015

84

Fe3+, nas reações de Haber-Weiss ou Fenton, sendo a principal via de geração do radical

hidroxila (OH•) (GILL; TUTEJA, 2010), o radical mais reativo da família das EROs

(KARUPPANAPANDIAN et al., 2011).

Assim, a enzima SOD por estar presente na maioria dos compartimentos subcelulares

que geram •O2- (SHARMA et al., 2012) e, devido a sua velocidade de ação em dismutar o •O2

-,

acabam indiretamente contribuindo também para a redução de OH• gerado a partir de reações

com o ânion •O2- (DINAKAR et al., 2012).

Nas plantas Test-Inoc houve aumento da atividade da enzima SOD após os 20 DAT,

enquanto que nas plantas Test-Absoluta ocorreu apenas aos 74 DAT, tendo relação com o

observado para a concentração de •O2-. Porém, nas duas testemunhas a atividade da SOD foi

inferior aos tratamentos com fungicidas indicando menor desintoxicação oxidativa nestas

plantas.

A menor atividade da enzima SOD nestas plantas tem relação com a alta agressividade

do patógeno, visto que o processo de infecção de A. solani é muito rápido, pois estudos

demonstram que entre 6 a 12 horas após a inoculação, cerca de 98,9% e 97,1% dos conídios

haviam germinado em folhas de plantas suscetível e resistente de tomateiro, respectivamente,

iniciando o processo de infecção sobre o hospedeiro (ARAÚJO; MATSUOKA, 2004). De fato,

o maior acúmulo de •O2- foi detectado logo após a inoculação (aos 17 DAT, que compreende

24 horas após inoculação) nas plantas Test-Inoc (Figura 17) em resposta ao estresse decorrente.

No entanto, estudos realizados por Balbi-Peña et al. (2014) verificaram que o aumento

de EROs e as respostas de hipersensibilidade (HR) não contribuem para a resistência de plantas

de tomateiro contra A. solani. Os autores descrevem que esta ineficiência das respostas de HR

está relacionado ao fato de A. solani ser um patógeno necrotrófico e, por isso, na interação A.

solani-tomateiro tais respostas de defesa não se fazem eficientes para conter as lesões, pelo

contrário, provavelmente facilitam a colonização dos tecidos do hospedeiro, uma vez que a

morte da célula hospedeira não limita o crescimento do patógeno. Portanto, a alta agressividade

do patógeno somada a baixa eficiência das EROs em combater o seu progresso, resultou em

maior percentual de tecido foliar danificado, isto interferiu na eficiência do arsenal de defesa.

Por isso se observou menor atividade da SOD e, consequentemente, das outras enzimas

antioxidantes, o que comprometeu sanidade dos fotossistemas e, consequentemente, a

eficiência fotossintética destas plantas.

85

Como visto, a maior concentração de H2O2 celular surge da dismutação do •O2-

catalisada pela SOD, onde dois radicais •O2- formam um H2O2 (BHATTACHARJEE, 2010).

Apesar de ser ausente de carga, o H2O2, é um oxidante relativamente estável e de pequeno

tamanho, o que facilita a passagem através da bicamada lipídica da membrana celular e sua

migração em compartimentos diferentes e distante do local de formação, difundindo os danos,

mas também atuando como importante mensageiro secundário em condições de estresse

(RESENDE et al., 2003; RIBEIRO et al., 2005; BARBOSA et al., 2014). Desta forma,

subsequentemente, as vias geradoras de •O2- formam o H2O2, no entanto, é em condições de

estresse severo que se nota as maiores gerações de H2O2 (SHARMA et al., 2012).

Ao analisarmos as concentrações de H2O2 em folhas de tomateiro (Figura 19) aos 15,

16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105

DAT, observou-se que houve novamente um padrão de resposta similar nos dois anos avaliados,

complementando o que foi observado para concentração de •O2- e na atividade da enzima SOD.

Nos tratamentos em que a atividade da SOD estava alta, se observa maiores concentrações de

H2O2, ou seja, maiores quantidades de ânions superóxidos foram dismutados à peróxido de

hidrogênio, desintoxicando o metabolismo celular.

As menores concentrações de H2O2 foram observadas nas plantas Test-Absoluta, no

entanto, estas também apresentaram baixas concentrações de •O2- e da atividade da SOD. Já as

plantas Test-Inoc apresentaram baixas concentrações de H2O2, quando comparadas às plantas

tratadas com os diferentes fungicidas. Entretanto, como já discutido, foram observadas para

estas mesmas plantas altas concentrações de •O2- e baixa atividade da SOD ao longo do seu

ciclo, fato que acarretou danos oxidativos no metabolismo celular, indicado pela baixa

eficiência fotossintética observada neste tratamento.

Na célula vegetal a regulação dos níveis intracelulares de H2O2 também se faz

necessário. Pois o peróxido de hidrogênio também é prejudicial à célula, por ter elevada ação

deletéria, pois é capaz de inativar enzimas, além de participar nas reações de Haber-Weiss ou

Fenton, gerando OH•, o oxidante mais reativo da família das EROs (KARUPPANAPANDIAN

et al., 2011). Sendo assim, o H2O2, quando em concentrações deletérias, também precisa ser

eliminado do metabolismo celular. Por isso, as enzimas antioxidantes trabalham em conjunto,

buscando diminuir a concentração destas EROs originadas por condições de estresses sofridos

pelo vegetal ao longo do ciclo de desenvolvimento.

86

Figura 19. Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2, µmol g de massa fresca-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89,



0

40

80

120

160

200

240

15 DAT16 DAT

17 DAT20 DAT

29 DAT30 DAT

31 DAT34 DAT

44 DAT45 DAT

46 DAT49 DAT

59 DAT60 DAT

61 DAT64 DAT

74 DAT75 DAT

76 DAT79 DAT

89 DAT90 DAT

91 DAT94 DAT

105 DAT

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-1)




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)

2016

Inoculação


2015

87

A regulação dos níveis de H2O2 ocorre por meio de uma grande variedade de enzimas,

tais como ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT), peroxidase (POX), glutationa S-

transferase (GST), glutationa redutase (GR) e a glutationa peroxidase (GPX) (SCANDALIOS,

2005; KIM; KWAK, 2010; DINAKAR et al., 2012; NOCTOR et al., 2015; LEHMANN et al.,

2015), que estão comumente envolvidas na defesa vegetal contra o estresse oxidativo.

Estas enzimas são proteínas que catalisam diferentes reações, controlando os níveis de

EROs, atuando em diferentes organelas para manter a homeostase celular (BARBOSA et al.,

2014). Diante disto, a atividade da enzima APX foi avaliada em folhas de tomateiro (Figura

20), aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91,

94 e 105 DAT, submetidas aos diferentes tratamentos, nos dois experimentos avaliados,

apresentando efeitos similares. Para os diferentes fungicidas testados observou-se maior

atividade da enzima APX em relação às testemunhas, apresentando picos de atividade sempre

às 48 horas após cada aplicação (Figura 20).

A enzima APX é responsável por degradar o H2O2 utilizando o ascorbato como

substrato, tendo alta afinidade com o H2O2, permitindo eliminá-lo em pequenas concentrações,

pois esta enzima apresenta constante de Michaelis-Menten (Km) na ordem µM para seu

substrato (SHARMA et al., 2012). Sua atuação principal é na remoção de H2O2, nos

cloroplastos (RESENDE et al., 2003), defendendo os tecidos fotossintéticos contra o estresse

fotoxidativo. De fato, a alta atividade das APXs colaborou para a manutenção da integridade

do aparato fotossintético, resultando em maior eficiência fotossintética, conforme foi observado

nos tratamentos com os diferentes fungicidas (Figuras 9, 10 e 11).

As menores atividades da APX foram observadas nas plantas Test-Inoc e Test-Absoluta

com pequenas oscilações ao longo do ciclo da cultura. Ao contrário do que foi observado para

as plantas tratadas com fungicidas de efeitos fisiológicos, as testemunhas por apresentarem

baixa atividade da APX, ficaram mais vulneráveis aos danos oxidativos causados pela presença

de H2O2.

Juntamente com a APX, as enzimas GR, GPX e GST compõem o arsenal de defesa ao

estresse oxidativo, atuando na eliminação do H2O2. Semelhante ao observado para as enzimas

SOD e APX, houve diferença na atividade das enzimas GR (Figura 21), GPX (Figura 22) e

GST (Figura 23) em folhas de tomateiro aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59,

60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT, submetidas aos diferentes tratamentos, nos

dois experimentos avaliados, apresentando efeitos semelhantes.

88

Figura 20. Atividade da enzima ascorbato peroxidase (APX, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89,



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Figura 21. Atividade da enzima glutationa redutase (GR, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90,

91, 94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de


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Figura 22. Atividade da enzima glutationa S-transferase (GST, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89,



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91

Figura 23. Atividade da enzima glutationa peroxidase (GPX, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89,



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92

Nota-se que as maiores atividades da enzima GR (Figura 21) foram proporcionadas pela

aplicação de Flux+Pira, seguido de Me+Pira. Os outros fungicidas promoveram aumento na

atividade da enzima, porém em menor intensidade. De maneira geral, é possível observar um

pico de atividade da enzima GR 24 horas após cada aplicação dos fungicidas, com acentuado

declínio após 48 e 120 horas.

A enzima GR também atua na defesa contra o estresse oxidativo, pois mantém o

equilíbrio entre os níveis de GSSG (glutationa oxidada) e GSH (glutationa reduzida) na célula,

em nível de cloroplasto, mitocôndrias, citosol e peroxissomos, no entanto, cerca de 80% da

atividade da GR ocorre em tecidos fotossintéticos (SHARMA et al., 2012). Por isso, juntamente

com a APX, a GR protege o aparato fotossintético dos efeitos nocivos das EROs, confirmando

mais uma vez o efeito positivo destes fungicidas na sanidade do sistema fotossintético.

Como visto, o mecanismo de ação da glutationa ocorre por meio da redução do H2O2 e

de hidropeptídeos orgânicos e envolve simultaneamente a oxidação da GSH para GSSG, por

intermédio da GR, que oxida o NADPH e regenera a GPX. Já a GST, por sua vez, auxilia na

detoxificação do organismo, catalisando a conjugação da GSH a compostos endógenos ou

exógenos como xenobióticos (COGO et al., 2009). De fato, a atividade da enzima GST (Figura

22), apresentou comportamento similar ao da GR em todos os tratamentos, observando-se

maiores atividades para as plantas tratadas com Flux+Pira, seguidas de Me+Pira. No entanto,

as plantas tratadas com Bosc, Bosc+Cre e Pira quando comparadas as testemunhas, também

apresentaram maiores atividades da enzima GST, porém em menor intensidade do que o

observado para aquelas tratadas com Flux+Pira e Me+Pira. O oposto foi observado nas

testemunhas, Test-Absoluta e Test-Inoc, as quais apresentaram as menores atividades das

enzimas GR e GST, elucidando novamente a baixa ativação do sistema de defesa antioxidativo

nestas plantas.

Para a atividade da enzima GPX (Figura 23) constatou-se maior atividade nos

tratamentos Flux+Pira, seguidos de Me+Pira, Bosc, Bosc+Cre e Pira, com aumento expressivo

nas avaliações às 24 horas e mantendo-se alta às 48 e 120 horas após cada aplicação. De maneira

geral, estes tratamentos também foram eficientes em ativar a atividade da enzima GPX

auxiliando na eliminação de H2O2 do metabolismo celular. Como já mencionado, as enzimas

GPXs também atuam na desintoxicação dos produtos formados na peroxidação lipídica, em

decorrência dos danos oxidativos pela atividade das EROs (DIXON et al., 2010). A atividade

da enzima GPX é muito eficiente, pois assim como relatado para a APX, possui KM na ordem

93

de 1µM para o H2O2 (RIBEIRO et al., 2005) e, por isso, quando atuam em conjunto, agem

eficientemente em níveis baixíssimos de H2O2, realizando o ajuste ‘fino’ na remoração destas

EROs do sistema celular.

Além das enzimas já descritas, a enzima catalase (CAT) também compõe o arsenal de

defesa contra o estresse oxidativo, cooperando na eliminação das EROs dos tecidos vegetais, a

partir da conversão de duas moléculas de H2O2 em H2O e O2 (DUBEY, 2010; SHARMA et al.,

2012). A atividade da enzima CAT, avaliada aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49,

59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT em folhas de tomateiro (Figura 24), foi

maior nos tratamentos Flux+Pira e Me+Pira, apresentando pico de atividade às 24 horas,

seguido de declínio da atividade ás 48 e 120 horas, após cada aplicação.

As plantas tratadas com os demais fungicidas apresentaram baixa atividade da enzima

CAT, porém nota-se pequenos picos de atividade 24 horas após cada aplicação, assim como

observado para os tratamentos Flux+Pira e Me+Pira. Diferentemente, o tratamento Test-Inoc

apresentou pico de atividade da enzima CAT somente aos 20 DAT, período que corresponde

às 96 horas após a inoculação do patógeno, depois ocorreu queda na atividade permanecendo

baixa nas demais avaliações. Nas plantas Test-Absoluta observou-se baixa atividade em todas

as avaliações realizadas.

A enzima CAT também previne os efeitos potencialmente danosos causados por

mudanças na homeostase de H2O2, atuando em conjunto com as enzimas do ciclo ascorbato-

glutationa (APX, GR, GST e GPX), apesar de suas características serem diferentes podem

funcionar efetivamente em paralelo e são importantes na eliminação do H2O2 nas diferentes

organelas celulares. Pois a CAT não necessita de agente redutor, sendo energeticamente

eficiente para remoção do H2O2 (SHARMA et al., 2012) e, principalmente, é efetiva em

concentrações relativamente altas de H2O2 (mM), sendo consideradas indispensáveis para a

desintoxicação de EROs, especialmente, em condições de estresse severo, quando os níveis de

H2O2 estão elevados (DUBEY, 2010).

O aumento da atividade das enzimas SOD, APX, GR, GST, GPX e CAT após a

aplicação dos diferentes fungicidas evidenciou que estas substâncias promovem a ativação do

sistema de defesa antioxidativo, preparando a planta para resistir a um possível agente

estressante. No entanto, nota-se que o efeito não perdura por muitos dias, em alguns casos,

como no observado para a enzima APX, o pico de atividade ocorre 48 horas após cada

aplicação, depois a atividade diminui, enquanto que para a enzima GST o efeito é mais

94

Figura 24. Atividade da enzima catalase (CAT, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e

105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos


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prolongado, apresentando maior atividade da enzima até o quinto dia após a aplicação (120

horas). A diferença percebida na expressão das enzimas antioxidativas ocorre porque elas atuam

em momentos e locais diferentes para conter o acúmulo de EROs e, evitando assim, os danos

oxidativos e distúrbios metabólicos, interrompendo e reparando os danos desta cascata de

oxidação (SHARMA et al., 2012), que consequentemente levam à morte celular.

Outro fator interessante observado, é que o efeito da aplicação dos diferentes fungicidas

se repete a cada aplicação, isto comprova o potencial destas substâncias como promotoras de

defesa ao estresse oxidativo em plantas de tomateiro. No entanto, verificou-se que os fungicidas

que afetaram em maior intensidade a atividade das enzimas SOD, APX, GR, GST, GPX e CAT

em plantas de tomateiro foram Flux+Pira e Me+Pira. O aumento da atividade destas enzimas

foi importante para manter a integridade celular, garantindo sua homeostase, pois como

relatado, elas atuam em organelas diferentes, assim potencializando a defesa antioxidativa da

célula. A ação das enzimas antioxidantes mantém a concentração de EROs no organismo dentro

dos limites fisiológicos (RIBEIRO et al., 2005) e de acordo com Sharma et al. (2012) a

expressão simultânea de várias enzimas antioxidantes tem demonstrado ser mais eficiente do

que ações isoladas em plantas.

Todos esses resultados estão de acordo com os dados observados nos parâmetros

fotossintéticos, uma vez que as plantas tratadas com estes fungicidas apresentaram as maiores

eficiências fotossintéticas, indicando que essas plantas estavam mais saudáveis que as

testemunhas. Alterações positivas nos mecanismos antioxidativos proporcionado pela aplicação

de fungicidas de efeitos fisiológicos também já foram relatados em plantas de pepineiro

(AMARO, 2011), meloeiro (MACEDO, 2012; 2015), tomateiro (JACOBELIS JUNIOR, 2015),

feijoeiro (JADOSKI et al., 2015), cafeeiro (HONORATO JÚNIOR et al., 2015), pepineiro

japonês (AMARO et al., 2018).

Contrariamente, as plantas Test-Inoc, as quais apresentaram elevado grau de estresse

oxidativo observado pela alta concentração de EROs (•O2- e H2O2) e baixa atividade das

enzimas antioxidativas avaliadas, acabaram sofrendo com a menor supressão dos níveis tóxicos

de EROs na célula, que acarretou danos irreversíveis. Uma vez que as EROs em altas

concentrações são extremamente prejudiciais para o metabolismo celular, e quando o nível de

EROs excede os mecanismos de defesa, tem-se o fenômeno celular caracterizado como estado

de ‘estresse oxidativo’ (SHARMA et al., 2012), causando consequentemente a peroxidação de

lipídios. Tais danos afetam negativamente a eficiência quântica potencial do PSII, detectada

96

pela menor relação Fv/Fm, conforme já mencionado. Concomitantemente, à queda da eficiência

fotoquímica, ocorreu redução no desenvolvimento destas plantas, bem como o menor acúmulo

de carboidratos e biomassa.

Nota-se, portanto, que a capacidade fotossintética das plantas, nos diferentes

tratamentos diminuiu em proporção a severidade da doença e a intensidade das respostas de

defesa ao estresse oxidativo, decorrentes da interação planta-patógeno. Além dos danos

ocasionados pelo processo de infecção, penetração e colonização pelo patógeno no tecido foliar

do hospedeiro (síntese de enzimas hidrolíticas extracelulares), somam-se a eles, os danos

ocasionados pela alta concentração de EROs, em níveis tóxicos à célula vegetal, causando a

degradação do tecido vegetal devido a peroxidação lipídica.

O processo de peroxidação lipídica, determinada a partir do acúmulo de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) é um dos parâmetros utilizados para avaliar a

intensidade do estresse oxidativo em plantas. Pois, durante o processo de lipoperoxidação, a

reação desencadeada pelas EROs ocasiona a degradação de ácidos graxos poli-insaturados das

membranas celulares, como os ácidos linolênico e linolênico, que têm como subprodutos

principais os íons peróxido e o malondialdeíodo (MDA), os quais são mensurados por meio da

reação com os ácidos tiobarbitúrico e tricloroacético.

Diante disto, a peroxidação lipídica avaliada aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45,

46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT em folhas de tomateiro (Figura

25), demonstrou que os danos oxidativos às membranas celulares foram superiores no

tratamento Test-Inoc, apresentando aumento da intensidade com o decorrer do tempo, seguido

do tratamento Test-Absoluta, quando comparados aos demais tratamentos. As plantas Test-

Absoluta também apresentaram significativa peroxidação lipídica, porém em menor

intensidade que as plantas Test-Inoc.

A alta lipoperoxidação observada nas plantas testemunhas foi reflexo do nível de

estresse elevado nestas plantas, em decorrência do progresso da doença e, concomitantemente,

pela alta produção de EROs que não foram eliminadas devido a ineficiência do sistema

antioxidativo, ou seja, pela baixa atividade das enzimas SOD, APX, GR, GST, GPX e CAT.

Pois, para conter os efeitos deletérios da alta reatividade das EROs as plantas dependem de um

sistema antioxidativo eficaz, quando isto não ocorre, as EROs em altas concentrações

fisiológicas reagem com os lipídios das membranas, ocorrendo assim, a peroxidação lipídica.

A consequência direta do dano da peroxidação de lipídios sobre as membranas celulares é o

97

Figura 25. Peroxidação lipídica (TBARS, µmol g massa fresca-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105

dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos

e inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

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98

extravasamento do conteúdo celular para o meio, por danificarem irreversivelmente as

membranas, além de formar novos radicais lipídicos e intensificando os danos (DAN HESS,

2000; KRUSE et al., 2006).

Além das membranas, outras moléculas essenciais como pigmentos fotossintéticos,

proteínas e ácidos nucléicos também são alvos das EROs (FOYER et al., 1997; SHARMA et

al., 2012), por isso quando em altas concentrações as EROs podem desencadear a paralização

do metabolismo celular (LIN et al., 2005). Logo, estes efeitos do estresse oxidativo interferiram

fortemente no processo fotossintético, causando danos aos pigmentos e aos fotossistemas, bem

como na expressão das enzimas envolvidas no processo de fixação de CO2, como pode ser

observado nos tratamentos Test-Inoc e Test-Absoluta, que apresentaram menores teores de

clorofilas a e b, menor assimilação de CO2, eficiência de carboxilação e rendimento quântico

do PSII (Figuras 9, 10, 11 e 12) e com isto o menor desenvolvimento das plantas.

Ao contrário, a alta atividade das enzimas antioxidativas resultou em menores níveis de

peroxidação lipídica nas plantas tratadas com Flux+Pira, Me+Pira, Bosc, Bosc+Cre e Pira, ao

longo do ciclo da cultura e possibilitaram maior sanidade do aparato fotossintético. Somado a

este efeito, o que possivelmente também pode ter contribuído para a menor peroxidação

lipídica, é a maior concentração de carotenoides observada nestes tratamentos (Figura 12), pois

estes pigmentos são importantes na eliminação do •O2- , além de possuírem a capacidade de

suprimir, prevenir e minimizar o estado tripleto da clorofila devido ao excesso de energia de

excitação, assim prevenindo a formação de •O2- e protegendo o aparato fotossintético

(SHARMA et al., 2012).

A eficiente eliminação das EROs, principalmente do •O2- por intermédio da SOD, é

muito importante para a homeostase celular, porque o radical •O2- é um dos principais oxidantes

responsáveis pela peroxidação de lipídios e sua formação causa o aumento na permeabilidade

das membranas no ambiente celular (BREUSEGEM et al., 2001; APEL; HIRT, 2004). Além

disso, a SOD também contribui indiretamente na redução de OH• (DINAKAR et al., 2012), que

segundo Sharma et al. (2012), uma única molécula de OH• pode resultar na peroxidação de

diversos ácidos graxos poli-insaturados, pois as reações envolvidas neste processo são cíclicas.

De modo geral, pode-se dizer que a aplicação destes fungicidas proporcionou adequado

controle do estresse oxidativo, que refletiu em menores danos celulares e, consequentemente,

em menor perda de área fotossinteticamente ativa, que contribuiu para o maior desenvolvimento

e acúmulo de matéria seca e, possivelmente maior produção de frutos.

99

5.7 Proteínas relacionadas à patogênese e respostas de defesa

De acordo com os resultados já apresentados, a aplicação de diferentes fungicidas

também interferiu na concentração das EROs: •O2- e H2O2 (Figuras 17 e 19), por isso tais

resultados inferem a possível atuação destas moléculas como sinalizadoras de respostas de

defesa em plantas de tomateiro.

Os altos níveis de EROs, como descrito anteriormente, causam sérios danos celulares

por aumentarem a lipoperoxidação. No entanto, as EROs desempenham papéis diferentes nas

plantas, dependendo do equilíbrio entre sua produção e eliminação nos tecidos: em baixas

concentrações atuam como sinalizadores bioquímicos na cascata de transdução de sinais para a

ativação de genes de defesa e de proteção celular, enquanto que em altas concentrações causam

exacerbados danos aos componentes celulares (SHARMA et al., 2012). Assim, as EROs têm

funções biológicas definidas quando estão em concentrações fisiológicas adequadas

(BARBOSA et al., 2014).

Desta forma, uma das funções de grande importância destas espécies reativas de

oxigênio na interação planta-patógeno, é atuarem como mediadores de sinalização intracelular

em respostas fisiológicas e biológicas, nos processos de defesa da planta, caracterizada como

indução de resistência. Os radicais livres são moléculas altamente reativas, devido à

instabilidade da molécula (possuem elétrons desemparelhados), no entanto, o H2O2, mesmo não

sendo classificado como um radical livre, por não ter elétrons desemparelhados na última

camada (BARTOSZ, 1997; COTINGUIBA et al., 2015) é a principal EROs envolvida na

sinalização de respostas de defesa ao ataque por patógenos.

O H2O2 aumenta a atividade da enzima benzóico 2-hidrolase, precursora na síntese do

ácido salicílico (hormônio vegetal crucial na sinalização da resistência sistêmica adquirida –

RSA). Além disso, o H2O2, no apoplasto da célula hospedeira, tem papel essencial nos

mecanismos de defesa da planta por apresentar efeito tóxico ao patógeno, agindo diretamente

sobre as estruturas do fungo e se acumulando no sítio de infecção, desta forma, restringindo o

desenvolvimento da lesão pelas reações de respostas de hipersensibilidade – HR (RESENDE

et al., 2003; LEHMANN et al., 2015).

Esta sequência de eventos culmina no aumento da expressão gênica de proteínas de

defesa, conhecidas como proteínas relacionadas à patogênese (PRPs) tais como a peroxidase

(POD), quitinase e β-1,3-glucanase. Somada a estas respostas também ocorre ativação da

expressão de genes que codificam enzimas da via dos fenilpropanóides, como a enzima

100

fenilalanina amônia-liase (PAL) e da via dos octadecanóides, como as enzimas

polifenoloxidase (PPO) e lipoxigenase (LOX). A sinalização desencadeada pelo processo de

indução de resistência, de acordo com Shah et al. (2014), pode ativar diferentes rotas

metabólicas. Na maioria das interações entre plantas e patógenos biotróficos ou

hemibiotróficos ocorre a ativação da rota via ácido salicílico em resposta à infecção, enquanto

que para patógenos necrotróficos são ativadas rotas dependentes de etileno ou ácido jasmônico

(THAKUR; SOHAL, 2013).

No entanto, a própria peroxidação de lipídios, por intermédio das enzimas LOXs pode

ser precursora da síntese de ácido jasmônico, e ativar a expressão de vários genes relacionados

à defesa durante as reações de HR na planta (DEUNER et al., 2015). Segundo Pinto et al.

(2011), a HR resulta na indução da morte celular programada (MCP) no sítio da infecção e por

consequência, na ativação de diferentes sinais, os quais resultam na expressão de uma variedade

de genes de defesa, no aparecimento de lesões necróticas no local da infecção, impedindo o

desenvolvimento da infecção pelo patógeno.

Esta cascata de fenômenos bioquímicos, normalmente observada após a indução,

resultará em aumento da defesa do vegetal ao ataque do patógeno, reforçando também as

barreiras físicas, por aumentar a atividade de outras enzimas, como a PAL. O aumento da

atividade da PAL está fortemente relacionado com a maior síntese e acúmulo de compostos

fenólicos, seguido também de maior deposição de lignina no tecido vegetal, aumentando a

defesa da planta (OLIVEIRA et al., 2016).

A PAL é considerada a enzima chave no metabolismo secundário das plantas e atua

sobre um substrato específico, a fenilalanina. Portanto, a atividade da enzima PAL avaliada aos

15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105

DAT em folhas de tomateiro (Figura 26) demonstrou que houve diferença na atividade desta

enzima entre os tratamentos, ao longo das avaliações. As maiores atividades da enzima PAL

foram observadas para as plantas tratadas com os diferentes fungicidas às 24 e 48 horas após

cada aplicação. No entanto, os tratamentos Flux+Pira, seguido de Me+Pira foram aqueles que

apresentaram os maiores picos de atividade desta enzima.

Para as plantas Test-Inoc nota-se que ocorreu maior pico de atividade da PAL aos 20

DAT, ou seja, 96 horas após a inoculação do patógeno, mantendo-se alta aos 29 DAT e após,

apresentou pequena redução da atividade, com pequenas oscilações no decorrer das demais

avaliações, sem apresentar queda significativa. Este comportamento observado demonstra que

101

Figura 26. Atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (PAL, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79,

89, 90, 91, 94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas

de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

15 DAT

16 DAT

17 DAT

20 DAT

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31 DAT

34 DAT

44 DAT

45 DAT

46 DAT

49 DAT

59 DAT

60 DAT

61 DAT

64 DAT

74 DAT

75 DAT

76 DAT

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89 DAT

90 DAT

91 DAT

94 DAT

105 DAT

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7




-1)




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Fen

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lia

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U m

in-1

mg

pro

teín

a-1

)

2016

Inoculação


2015

102

o aumento da atividade da PAL ocorreu em resposta ao estresse ocasionado pela infecção do

patógeno.

Nas plantas tratadas com os fungicidas ocorreu aumento da atividade da PAL 24 e 48

horas após cada aplicação, e após este pico, houve redução da expressão aos níveis normais

(próximo do observado aos 15 DAT, momento antes da aplicação dos tratamentos). Já na Test-

Absoluta a atividade da enzima PAL permaneceu baixa até os 64 e 74 DAT, nos anos de 2015

e 2017, respectivamente, onde ocorreu pico da atividade da enzima PAL, apresentando queda

gradativa no decorrer das demais avaliações.

Verificou-se, portanto, que os tratamentos com fungicidas de efeitos fisiológicos

influenciaram na atividade da enzima PAL. Esta é a enzima chave na via metabólica da

fenilalanina, atuando no metabolismo dos fenilpropanóides e apresenta relação direta com a

síntese de compostos fenilpropanóides, como compostos fenólicos e lignina, importantes

compostos de defesa contra patógenos (SCHWAN-ESTRADA et al., 2008), pois a presença de

compostos fenólicos inibem metabólitos do patógeno, dificultando seu desenvolvimento

(STANGARLIN et al., 2011) e a maior deposição de lignina dificulta e restringe a penetração

do patógeno nos tecidos do hospedeiro (STANGARLIN et al., 2011).

A formação desses compostos tóxicos é essencial no processo de defesa contra o agente

agressor no local de infecção (SHAH et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2016). Para constatar o

efeito do aumento da atividade da enzima PAL na síntese de compostos fenólicos foram

avaliados os teores destes aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74,

75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT em folhas de tomateiro (Figura 27), demonstrando que

houve diferença na concentração destas substâncias, entre os tratamentos, ao longo das

avaliações.

Observou-se maior concentração de compostos fenólicos 24 horas após cada aplicação

dos tratamentos Flux+Pira, Me+Pira, Bosc+Cre, Bosc e Pira (picos de teores), tendo declínio

acentuado nas avaliações às 48 e 120 horas após cada aplicação. No entanto, o tratamento

Flux+Pira apresentou os maiores picos de concentração tendo relação com as maiores

atividades da enzima PAL, observadas neste mesmo tratamento. Neste caso, pode-se dizer que

as maiores concentrações de compostos fenólicos foram influenciadas pela atividade da enzima

PAL, pois os picos são observados nos mesmos horários para estas plantas.

Comportamento semelhante ocorreu para as plantas Test-Inoc que apresentaram

maiores concentrações dos compostos fenólicos após os 20 DAT, mesmo momento em que

103

Figura 27. Teor de Compostos Fenólicos (mg g massa fresca-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 dias

após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e

inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016. Barras indicam desvio padrão da média (n = 10). Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

0

5

10

15

20

25

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15 DAT

16 DAT

17 DAT

20 DAT

29 DAT

30 DAT

31 DAT

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45 DAT

46 DAT

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60 DAT

61 DAT

64 DAT

74 DAT

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91 DAT

94 DAT

105 DAT

0

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Fen

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a-1

)

2016

Inoculação


2015

104

houve maior atividade da enzima PAL. Isto indica forte relação entre a atividade da PAL e a

síntese de compostos fenólicos observados em plantas de tomateiro, nas condições destes

experimentos.

Os compostos fenólicos são metabólitos secundários das plantas e, geralmente, estão

envolvidos na defesa do vegetal contra organismos patogênicos (substâncias antinutritivas)

(CAMPOS et al., 2004) e na proteção aos raios ultravioletas (CAMPOS et al., 2003). Os

compostos fenólicos são importantes antioxidantes por possuírem propriedade redutora, devido

sua estrutura química, que permite o sequestro ou neutralização dos radicais livres, formando

intermediários instáveis (SILVA et al., 2010). Desta forma, altos níveis de compostos fenólicos

no metabolismo celular contribuem para a eliminação das EROs, além de protegerem o sistema

de defesa antioxidante.

Portanto, pode-se inferir que os tratamentos com os diferentes fungicidas promoveram

maior defesa antioxidante em plantas de tomateiro, constatada pelo maior teor de compostos

fenólicos nos tratamentos Flux+Pira, Me+Pira, Bosc+Cre, Bosc e Pira, nos quais se observou a

menor peroxidação lipídica. Além destas funções, os compostos fenólicos também são

substratos para a síntese de lignina pela ação de PODs e PPOs. Estas enzimas oxidam

compostos fenólicos, colaborando com a biossíntese de lignina, aumentando as barreiras físicas

contra o ataque de patógenos (YUAN et al., 2002).

De fato, ao analisarmos a atividade das enzimas POD e PPO aos 15, 16, 17, 20, 29, 30,

31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT em folhas de

tomateiro (Figura 28 e 29, respectivamente) pode-se observar a sequência dos picos de atividade

nos mesmos horários em que houve maior concentração de compostos fenólicos (24 horas após

cada aplicação dos fungicidas). Portanto, tanto o teor de compostos fenólicos, quanto a

atividade das enzimas POD e PPO foram afetados pela aplicação de Flux+Pira, Me+Pira,

Bosc+Cre, Bosc e Pira em plantas de tomateiro ao longo do ciclo da cultura.

No entanto, nas plantas Test-Inoc notou-se que ocorreu aumento na atividade das

enzimas POD e PPO aos 20 DAT, que corresponde às 96 horas após a inoculação do patógeno.

Observou-se que a atividade destas enzimas se manteve constante durante as demais avaliações.

Nas plantas Test-Absoluta pode-se verificar que a atividade das enzimas POD e PPO manteve-

se baixa até os 64 DAT, onde ocorreu pequeno aumento da atividade da POD e aos 74 DAT

para a enzima PPO. Comportamento semelhante foi observado para a atividade da PAL e dos

teores de compostos fenólicos nestes mesmos tratamentos.

105

Figura 28. Atividade da enzima peroxidase (POD, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94

e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos


0

50

100

150

200

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15 DAT

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-1)

2016

Inoculação


2015

106

Figura 29. Atividade da enzima polifenoloxidase (PPO, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90,

91, 94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos


0,0

0,2

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15 DAT16 DAT

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105 DAT

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2016

Inoculação


2015

107

Isto indica que a atividade da POD foi influenciada pela presença do patógeno, pois a

POD é uma das enzimas correlacionadas às respostas de resistência em vegetais nas interações

planta-patógeno, por isso, classificada como PRP. As enzimas PODs estão localizadas

principalmente na parede celular e no vacúolo (LOCATO et al., 2010) e atuam em reações de

polimerização, participando da lignificação, suberização e metabolismo da parede celular, a

partir da oxidação de compostos fenólicos, além de estarem relacionadas ao aumento de H2O2

(ação antimicrobiana).

Portanto, uma das funções e, neste caso a mais importante, é sua atuação nas respostas

de defesa da planta ao ataque de patógenos, por participarem de diversos processos fisiológicos

que reforçam a estrutura da parede celular restringindo a entrada do patógeno (BALBI-PEÑA

et al., 2014). As PODs também são importantes enzimas antioxidantes por catalisarem reações

envolvendo o H2O2 (EBRAHIM et al., 2011) e o aumento de sua expressão pode ser indicativo

bioquímico de estresse resultante de fatores bióticos e abióticos (KIM; KWAN, 2010).

Assim como as PODs, as PPOs também estão relacionadas com respostas de defesa.

Estas enzimas aumentam sua atividade após a ocorrência de danos na célula (CAMPOS et al.,

2003; THIPYAPONG et al., 2004) por estarem presentes nos tilacóides, por isso sua ação contra

fitopatógenos ocorre, principalmente após a ruptura da célula pelo processo de penetração do

patógeno. Quando a enzima é liberada destas organelas, simultaneamente inicia o processo de

oxidação de compostos fenólicos que foram simultaneamente liberados do vacúolo, produzindo

quinonas que são substâncias antimicrobianas (THIPYAPONG et al., 2004).

Além disto, as PPOs também atuam no processo de lignificação, juntamente com a POD

e a PAL, aumentando as barreiras de defesa à invasão pelo patógeno. A lignificação proporciona

maior resistência às paredes celulares, exigindo do patógeno, no momento da penetração no

tecido hospedeiro, maior atividade e gasto metabólico para degradar a lignina e avançar com a

colonização (STANGARLIN et al., 2011).

Conforme os resultados observados, a expressão das enzimas POD e PPO está

fortemente correlacionada com a ocorrência de infecção por patógenos e, também, pela

presença de um agente elicitor, neste caso os fungicidas de efeitos fisiológicos. Como a PPO é

uma enzima que se encontra latente e torna-se ativa quando liberada da membrana dos tilacóides

(devido ao rompimento destas) pode-se relacionar os picos de atividade da PPO com os picos

de produção das EROs, •O2- e H2O2 (Figuras 17 e 19), observados após cada aplicação dos

diferentes fungicidas. De fato, uma vez que aumentava a concentração de EROs na célula

108

ocorria a oxidação das membranas, com isso a liberação da enzima PPO. Porém, estes danos

não afetaram fortemente a integridade das membranas, como pode ser observado pela baixa

peroxidação lipídica nestes mesmos tratamentos (Figura 25), em decorrência da alta atividade

das enzimas antioxidativas que eliminavam o excesso de EROs nestas plantas.

Altas concentrações de compostos fenólicos e maiores atividade das enzimas PPO e

POD aumentam o fortalecimento da parede celular, devido a maior deposição de lignina

(GUERRA et al., 2013). Por isso, na indução de resistência em plantas o aumento da atividade

das enzimas PAL, POD e PPO, geralmente, está relacionado à redução da severidade da doença

(KUHN; PASCHOLATI, 2010).

Portanto, como já discutido, o papel destas enzimas no processo de defesa das plantas é

reforçar a parede celular a partir da deposição de lignina, como de fato ocorreu. A deposição de

lignina avaliada aos 15, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 DAT (Figura 30), em folhas de tomateiro,

apresentou diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos nos tempos avaliados. Exceto

para os 15 DAT, período antecedente à aplicação dos tratamentos, demonstrando que neste

momento, todas as plantas apresentavam teores semelhantes de lignina.

Figura 30. Deposição de lignina (µg de lignina-1 mg de massa fresca-1) aos 14, 20, 35, 50, 65, 80, 95 e 110 dias

após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas

com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos de 2015 e 2016.

Médias (n = 10) seguidas de letras distintas, na mesma avaliação, diferem pelo teste Tukey ao nível de 5% de

probabilidade (p<0,05). Barras indicam desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.


0

1

2

3

4

5

6

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9

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12

13

14


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20162015

a

109

As plantas tratadas com os diferentes fungicidas, de maneira geral, apresentaram maior

síntese e deposição de lignina em folhas de tomateiro ao longo do ciclo da cultura, em

comparação com as testemunhas Test-Inoc e Test-Absoluta. No entanto, os maiores teores de

lignina foram observados para o tratamento Flux+Pira, seguido de Me+Pira.

A lignina é um polímero que, juntamente com a celulose e outros polissacarídeos que

constituem a parede celular das plantas, funciona como uma barreira física à penetração do

patógeno e por isso, é considerada uma das substâncias mais importantes presentes na parede

celular do hospedeiro (CASTRO et al., 2010). Assim, plantas que apresentam maiores teores

de lignina são mais resistentes ao ataque por micro-organismo. Isto indica, portanto, que a

aplicação de fungicidas de efeitos fisiológicos como estrobilurinas e carboxamidas, também

atuam como eliciadores e induzem respostas de defesa da planta como observado nos resultados

até aqui demonstrados.

Além das enzimas PAL, POD e PPO podem-se adicionar à lista das enzimas

sinalizadoras de respostas de indução de resistência, a enzima LOX e as PRPs, quitinase e β-

1,3-glucanase. A enzima LOX, assim como a PPO, faz parte das enzimas da via sinalizadora

dos octadecanóides na qual ocorre a biossíntese de ácido jasmônico, importante hormônio

vegetal relacionado ao estresse vegetal que ativa várias respostas de defesa. As LOXs estão

entre as enzimas chave nesse metabolismo. De acordo com Pinto et al. (2011) diversas vias de

sinalização estão interligadas e interagem com a formação de ácido jasmônico.

Cerca de 90% da membrana plasmática é composta de ácidos graxos insaturados,

principalmente, ácido linolênico e ácido linoleico, os quais são precursores para a atividade da

LOX (TAIZ; ZEIGER, 2013). Desta forma, sua atividade está associada com o metabolismo

dos lipídios, principalmente, no que diz respeito à lipoperoxidação. Observou-se que a atividade

da enzima LOX avaliada aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74,

75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT em folhas de tomateiro (Figura 31) apresentou diferença

entre os tratamentos no decorrer do tempo, com expressão semelhante nos dois anos avaliados.

Para a aplicação dos diferentes fungicidas pode-se observar que houve comportamento

semelhante ao observado nas demais enzimas avaliadas, com picos de atividades após cada

aplicação. No entanto, é possível verificar que os picos de atividade vão reduzindo no decorrer

das aplicações. Ao contrário, as plantas Test-Inoc apresentaram aumento da atividade da LOX

aos 16 DAT, compreendendo 24 horas após a inoculação do patógeno, permanecendo nas

demais avaliações.

110

Figura 31. Atividade da enzima lipoxigenase (LOX, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91,

94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos


0,0

0,2

0,4

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105 DAT

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-1)




-1)

Lip

oxig

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(U

min

-1 m

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rote

ína

-1)

2016

Inoculação


2015

111

Possivelmente, o padrão de resposta observado tem relação com os níveis de

peroxidação lipídica, uma vez que, essas enzimas catalisam os ácidos graxos poli-insaturados

para hidroxiperóxidos, originando moléculas reativas (como H2O2), resultando na síntese de

ácido jasmônico e, por conseguinte, na sinalização de respostas de defesa contra patógenos,

como relatado por Stangarlin et al. (2011). De fato, nas plantas tratadas com Flux+Pira,

Me+Pira, Bosc+Cre, Bosc e Pira houve menor peroxidação lipídica ao longo das avaliações,

devido à ativação do aparato de defesa antioxidante. Como a via das LOXs dá origem a radicais

reativos, a presença simultânea das enzimas antioxidativas, auxiliou na proteção da célula

contra possíveis danos causados pelos radicais formados.

A ativação da expressão das enzimas PPO e LOX em resposta à aplicação dos diferentes

fungicidas demonstrou que ocorreu a ativação da rota dos octadecanóides, gerando moléculas

sinalizadoras e ativadoras de genes envolvidos com a defesa vegetal. Portanto, além da ativação

da rota metabólica dos fenilpropanóides e via do ácido salicílico, a aplicação destas moléculas

também induziu a ativação da via do ácido jasmônico, evidenciando o potencial destes

fungicidas como indutores de resistência em plantas de tomateiro.

O efeito aqui observado é muito importante pois, como já discutido, na interação A.

solani-tomateiro, por se tratar de patógeno necrotrófico, a morte celular não dificulta e, sim,

facilita a colonização do tecido pelo fungo, por isso a resistência gene-a-gene via sinalização

dependente de ácido salicílico não se faz tão eficiente. Portanto, nesse tipo de interação, as

respostas de defesa dependem da via de sinalização por intermédio do ácido jasmônico e/ou

etileno (GLAZEBROOK, 2005).

Como já visto, as PRPs são induzidas no hospedeiro em resposta à infecção por um

patógeno ou por estímulos abióticos (STANGARLIN et al., 2011). Entre as principais PRPs

estudadas no processo de indução de resistência estão as PODs (já discutidas), as quitinases e

β-1,3-glucanases (GAO et al., 2015). As enzimas quitinases e β-1,3-glucanases, por atuarem na

hidrólise da parede celular de fungos, possuem atuação sinérgica, potencializando a ação

antifúngica (MARTINS, 2008), por isso, o aumento na expressão destas enzimas são

importantes na defesa contra micro-organismos.

Quanto à atividade das enzimas quitinase e β-1,3-glucanase avaliadas aos 15, 16, 17,

20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e 105 DAT em

folhas de tomateiro (Figura 32 e 33, respectivamente) pode-se observar que os tratamentos

também interferiram na expressão destas enzimas. De maneira geral, é possível observar picos

112

Figura 32. Atividade da enzima quitinase (QUI, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90, 91, 94 e

105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos


0,0

0,2

0,4

0,6

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1,4

15 DAT

16 DAT

17 DAT

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44 DAT

45 DAT

46 DAT

49 DAT

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61 DAT

64 DAT

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75 DAT

76 DAT

79 DAT

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91 DAT

94 DAT

105 DAT

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0,2

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-1)




-1)

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(U

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.-1 m

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)

2016

Inoculação


2015

113

Figura 33. Atividade da enzima β-1,3-glucanase (GLU, U min-1 mg proteína-1) aos 15, 16, 17, 20, 29, 30, 31, 34, 44, 45, 46, 49, 59, 60, 61, 64, 74, 75, 76, 79, 89, 90,

91, 94 e 105 dias após o transplantio (DAT), em plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

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15 DAT16 DAT

17 DAT20 DAT

29 DAT30 DAT

31 DAT34 DAT

44 DAT45 DAT

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59 DAT60 DAT

61 DAT64 DAT

74 DAT75 DAT

76 DAT79 DAT

89 DAT90 DAT

91 DAT94 DAT

105 DAT

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4




-1)




-1)

1,3

-Glu

can

ase

(U

min

-1 m

g p

rote

ína

-1)

2016

Inoculação


2015

114

de atividade 24 horas após cada aplicação dos fungicidas, ocorrendo declínio após 48 e 120

horas. No entanto, as maiores atividades destas enzimas foram proporcionadas pela aplicação

de Flux+Pira, seguido de Me+Pira. Os outros fungicidas testados promoveram aumento na

atividade da enzima, porém em menor intensidade.

Para as plantas Test-Inoc nota-se que ocorreu aumento da atividade, tanto para quitinase

quanto para β-1,3-glucanase, aos 20 DAT (96 horas após a inoculação do patógeno) e manteve-

se durante as demais avaliações. Nas plantas Test-Absoluta pode-se verificar que a atividade

destas enzimas se manteve baixa até os 64 DAT, após houve um pequeno aumento.

Diferentes pesquisas relatam que a alta atividade de quitinase e de β-1,3-glucanase estão

relacionadas com o aumento da resistência das plantas aos patógenos. Pois a enzima quitinase,

hidrolisa a quitina da parede celular de fungos (THARANATHAN; KITTER, 2003) e, assim,

prejudica o desenvolvimento do patógeno. Já a enzima β-1,3-glucanase hidroliza polímeros de

β-1,3glucanas (LIN et al., 2009), que são componentes abundantes na parede celular de muitos

patógenos, juntamente com a quitina. Desta forma, no processo de indução de resistência, as

enzimas quitinase e β-1,3-glucanase, agem de forma conjunta (MARTINS, 2008).

Na interação planta-patógeno, a atuação conjunta de quitinase e de β-1,3-glucanase,

segundo Mauch e Staehelin (1989), inicia com a síntese de pequena quantidade de

β-1,3-glucanase, que atua em nível de lamela média e, conforme ocorre o crescimento do fungo,

as hifas vão sendo degradadas por ação desta enzima. Então, os subprodutos desta hidrólise

atuam como sinalizadores da invasão e induzem a síntese em maior concentração de quitinases

e β-1,3-glucanases que são armazenadas nos vacúolos. À medida que o patógeno consegue

romper as primeiras barreiras de defesa e adentra à célula, o conteúdo dos vacúolos é liberado

e as enzimas agem sobre as estruturas do patógeno, contendo a invasão.

Deste modo, as plantas tratadas com Flux+Pira, Me+Pira, Bosc+Cre, Bosc e Pira ao

promoverem o aumento nos níveis de quitinase e de β-1,3-glucanase comprovam sua eficiência

na ativação de respostas de defesa, pois desencadearam a síntese e acúmulo destas PRPs,

aumentando a capacidade de defesa aos patógenos em plantas de tomateiro. Na planta a ação

destas PRPs contra os micro-organismos patogênicos pode ser tanto direto como indireto. Pode

atuar, por exemplo, de forma direta inibindo a germinação de esporos ou o crescimento do

patógeno, por apresentarem atividade antimicrobiana. No entanto, a ação indireta é a mais

importante pela ação inibitória na atividade hidrolítica sobre a parede celular do fungo

(STANGARLIN et al., 2011).

115

De modo geral, pode-se dizer que a aplicação destes fungicidas proporcionou a ativação

de respostas de defesa em plantas de tomateiro, pois aumentou a expressão de importantes

enzimas de diferentes vias bioquímicas como PAL, POD, PPO, LOX, quitinase e

β-1,3-glucanase, além de maior acúmulo de compostos fenólicos e deposição de lignina. Este

efeito das estrobilurnas e, mais recentemente das carboxamidas, ainda é pouco conhecido.

Alguns trabalhos têm verificado que a aplicação de estrobilurinas interferem positivamente na

defesa de plantas contra agentes patogênicos virais e bacterianos em feijoeiro

(UDAYASHANKAR et al., 2012) e tomateiro (SKANDALIS et al., 2016). Estes estudos

revelam que a aplicação de piraclostrobina aumenta a expressão de genes envolvidos na

iniciação de respostas ao estresse biótico.

Portanto, com base nos resultados apresentados, todas as enzimas antioxidativas, assim

como as relacionadas com a indução de resistência, expressaram maiores atividades, após cada

aplicação dos diferentes fungicidas testados. Isto indica que, mesmo atuando em organelas

distintas e pertencendo a famílias diferentes, todas as enzimas apresentam em comum o fato de

estarem relacionadas à defesa da planta em condições de estresse biótico.

5.7 Produção e Qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro

Em todos os parâmetros avaliados neste trabalho até o momento constatou-se efeitos

positivos em decorrência da aplicação dos diferentes fungicidas. No entanto, como o objetivo

final do cultivo de tomateiro é a produção de frutos com qualidade, observou-se que o efeito

dos benefícios fisiológicos e metabólicos também foi positivo na produção e qualidade pós-

colheita de frutos de tomateiro.

No experimento conduzido em 2015, a colheita dos frutos iniciou-se no dia 27 de março

de 2015 (79 DAT) e estendeu-se até o dia 5 de maio de 2015 (118 DAT). Enquanto que no

experimento de 2016, a colheita dos frutos iniciou-se no dia 30 de março de 2016 (82 DAT) e

estendeu-se até dia 7 de maio de 2016 (120 DAT).

De acordo com a Tabela 8 pode-se observar que houve diferença significativa (p<0,05)

entre os tratamentos nas características de produção e produtividade de frutos. Os resultados

encontrados foram similares para os dois experimentos (anos 2015 e 2016). De maneira geral,

pode-se observar que a aplicação de fungicidas influenciou positivamente na produção total de

frutos (kg m-2), com incremento de 104,2, 98,5, 63,4, 64,7 e 56,2% em relação à Test-Inoc, para

116

os tratamentos Flux+Pira, Me+Pira, Pira, Bosc+Cre e Bosc, respectivamente, no ano de 2015 e

124,8, 115,4, 75,6, 73,3 e 72,0% no ano de 2016.

Tabela 8. Valores médios de produção total (PT, kg m-2), número total de frutos (NTF, frutos

m-2), massa fresca de frutos (MFF, g fruto-1) e porcentagem de frutos não comerciais (FNC, %)

de plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação, tratadas com

diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, nos anos de

2015 e 2016. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

----------2015----------

Tratamentos PT

(kg m-2)

NTF

(frutos m-2)

MFF

(g fruto-1)

FNC1

(%)*


(inóculo + água) 5,98d 52,00d 115,00d 30,20d

Testemunha absoluta (água) 6,92c 56,00c 123,57c 8,95c

Boscalida (0,075 g L-1) 9,34b 61,00b 153,11b 4,62b


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 9,85b 64,00b 153,91b 5,21b

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 9,77b 63,00b 155,08b 4,99b


+ Piraclostrobina (0,116 g L-1) 12,21a 67,00a 182,24a 2,84a



CV (%) 16,54 14,23 10,78 9,56

----------2016----------

Tratamentos PT

(kg m-2)

NTF

(frutos m-2)

MFF

(g fruto-1)

FNC*

(%)


(inóculo + água) 5,21d 48,00d 108,54d 27,08d

Testemunha absoluta (água) 6,08c 52,00c 116,83c 9,61c

Boscalida (0,075 g L-1) 8,96b 61,00b 146,85b 4,91b


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 9,03b 62,00b 145,56b 6,45b

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 9,15b 60,00b 152,53b 5,00b





CV (%) 14,23 9,56 12,6 10,4

1FNC = descarte de frutos menores de 40 mm de diâmetro e com defeitos, como podridões, rachaduras, manchas,

deformado, amassado, dano profundo, imaturo, queima do sol, cancro, dano por frio, viroses (Fonte: CEAGESP,

2003).

*Dados transformados em arco seno de √𝑥(%).



117

Também se observou incremento de 76,4, 71,5, 41,2, 42,3 e 35,0% em relação à Test-

Absoluta para os tratamentos Flux+Pira, Me+Pira, Pira, Bosc+Cre e Bosc, respectivamente, no

ano de 2015 e de 92,6, 84,5, 50,5, 48,5 e 47,4% no ano de 2016. Os maiores incrementos de

produção observados no ano de 2016, em comparação com 2015, devem-se ao fato das

testemunhas terem apresentado menor produção no ano de 2016, em decorrência da maior

severidade da doença como comprovado pelas maiores AACPDs (Figura 14).

O tratamento que apresentou maior produção de frutos foi o Flux+Pira (12,2 e 11,7 kg

m-2 em 2015 e 2016, respectivamente) seguido do tratamento Me+Pira (11,9 e 11,2 7 kg m-2 em

2015 e 2016, respectivamente), não diferindo significativamente entre si. Estes mesmos

tratamentos também apresentaram o maior número de frutos totais m-2, com maior massa fresca

de frutos (g fruto-1) e, consequentemente, menor porcentagem de frutos não comerciais.

Estes resultados evidenciam que a aplicação destas estrobilurinas e carboxamidas

proporcionaram incrementos de produtividade na cultura do tomateiro e são consistentes com

Giuliani et al. (2010) e Cantore et al. (2016), que relataram que a aplicação de azoxistrobina e

piraclostrobina, respectivamente, em plantas de tomateiro promoveram maior rendimento de

frutos comercializáveis. Pesquisas anteriores também demonstraram incrementos de

produtividade por estes fungicidas em outras culturas como videira (DIAZ-ESPEJO et al.,

2012), soja (JOSHI et al., 2014), feijão (JADOSKI et al., 2015), milho (SHETLEY et al., 2015),

cenoura (COLOMBARI et al., 2015) e pepino japonês (AMARO et al., 2018).

A maior produção de frutos e, concomitantemente, maior número de frutos comerciais,

nos tratamentos Flux+Pira e Me+Pira está associada aos efeitos colaterais sobre a fisiologia da

planta adicionados a melhor eficácia de controle de doenças (DIAZ-ESPEJO et al., 2012). De

fato, a maior eficiência fotossintética foi observada para estes tratamentos, evidenciada pelas

altas taxas de assimilação de CO2 e eficiência de carboxilação, demonstradas pelo maior

rendimento quântico do PSII, aliados a maior atividade da enzima nitrato redutase que

influenciou no teor de pigmentos fotossintéticos e na assimilação e disponibilidade de

nitrogênio durante o ciclo da cultura.

Somados a estes efeitos também se observou maior atividade das enzimas antioxidantes

que minimizaram os danos oxidativos, além do aumento nas respostas de defesa da planta.

Estudos demonstram que a síntese de compostos de defesa no processo de indução de

resistência, como proteínas/enzimas específicas utilizam como substratos, por exemplo,

eritrose-4-fosfato do ciclo das pentoses ou fosfoenolpiruvato da glicólise na rota dos

118

fenilpropanoides. Assim, acabam competindo pela energia necessária ao metabolismo primário,

podendo comprometer o crescimento, desenvolvimento e produção do vegetal (MAZARO et

al., 2009). Isto indica que a ativação de respostas de defesa observadas em plantas de tomateiro,

gerou baixo custo energético, ou seja, o efeito positivo no aumento da síntese de fotoassimilados

compensou a perda metabólica gasta na ativação das diferentes rotas de defesa.

Analisando os parâmetros de qualidade pós-colheita de frutos tratados com diferentes

fungicidas pode-se observar nas Tabelas 9 e 10 que houve diferença significativa (p<0,05) entre

os tratamentos para a as características de firmeza de polpa, teor de sólidos solúveis, relação

SS/AT e teor de ácido ascórbico, nos dois anos avaliados.

Os valores de pH dos frutos de tomate variaram entre 4,38 a 4,44 e entre 4,38 e 4,45 em

2015 e 2016, respectivamente, não sendo influenciados significativamente pelos tratamentos

aplicados nas plantas durante os estádios vegetativo e reprodutivo (Tabelas 9 e 10). Esta

característica também não foi influenciada pela aplicação de estrobilurinas e carboxamidas em

tomateiro (RAMOS et al., 2013) e meloeiro (MACEDO et al., 2017). Comportamento

semelhante foi observado nos valores de acidez titulável, onde os valores variaram entre 0,10 a

0,13 e 0,10 a 0,14 em 2015 e 2016, respectivamente, e não houve diferença significativa entre

os tratamentos.

O teor de sólidos solúveis, determinado em °Brix, apresentou diferença significativa em

função dos tratamentos. Os maiores valores foram observados nos tratamentos Flux+Pira (3,78

e 3,82 em 2015 e 2016, respectivamente) e Me+Pira (3,76 e 3,79 em 2015 e 2016,

respectivamente), diferindo dos demais tratamentos. Em frutos de tomateiro, os açúcares são os

maiores constituintes sólidos, assim, frutos que apresentam maior °Brix refletem maior síntese

e acúmulo de açúcares durante seu desenvolvimento (HEINE et al., 2015), aumentando

conforme a maturação se aproxima (CHITARRA; CHITARRA, 2005).

De fato, as maiores concentrações de açúcares totais e redutores aos 120 DAT foram

observados nos frutos de plantas tratadas com Flux+Pira e Me+Pira (Tabelas 6 e 7),

evidenciando que estes tratamentos aplicados durante o desenvolvimento da planta promovem

maior qualidade dos frutos, influenciando principalmente no sabor. A aplicação de

estrobilurinas e carboxamidas também influenciaram positivamente as características físico-

químicas dos frutos de tomateiro (RAMOS et al., 2013) e meloeiro (MACEDO et al., 2017).

119

Tabela 9. Valores médios de firmeza (gf cm-2), pH, teor de sólidos solúveis (SS, °Brix), acidez titulável (AT, g de ácido cítrico 100 g de

polpa-1), relação SS/AT e teor de ácido ascórbico (AA, mg 100 g de polpa-1) de frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivados em casa

de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, no ano de 2015. Unicentro,

Guarapuava/PR, 2018.

Análises Pós-Colheita - 2015

Tratamentos Firmeza

(gf cm-2) pH

SS

(°Brix)

AT

(g ác. cítrico) SS/AT

AA

(mg 100 g-1)


(inóculo + água) 91,12c 4,42a 3,16c 0,12a 26,33c 43,25c

Testemunha absoluta (água) 94,85c 4,44a 3,34c 0,12a 27,83c 45,75c

Boscalida (0,075 g L-1) 99,47b 4,39a 3,46b 0,13a 26,62c 54,50b


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 98,12b 4,42a 3,58b 0,11a 32,55b 53,25b

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 101,26b 4,38a 3,53b 0,12a 29,42b 54,75b


+ Piraclostrobina (0,116 g L-1) 132,59a 4,41a 3,78a 0,10a 37,80a 59,25a


+ Piraclostrobina (0,100 g L-1) 129,84a 4,38a 3,76a 0,12a 31,33b 57,25a

CV (%) 10,25 9,52 6,89 5,89 9,47 8,95


120

Tabela 10. Valores médios de firmeza (gf cm-2), pH, teor de sólidos solúveis (SS, °Brix), acidez titulável (AT, g de ácido cítrico 100g de

polpa-1), relação SS/AT e teor de ácido ascórbico (AA, mg 100 g de polpa-1) de frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivados em casa

de vegetação, tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, no ano de 2016. Unicentro,

Guarapuava/PR, 2018.

Análises Pós-Colheita – 2016

Tratamentos Firmeza

(gf cm-2) pH

SS

(°Brix)

AT

(% ác. cítrico) SS/AT

AA

(mg 100 g-1)


(inóculo + água) 89,96c 4,39a 3,21c 0,13a 24,69c 39,75c

Testemunha absoluta (água) 92,75c 4,42a 3,34c 0,14a 23,86c 43,25c

Boscalida (0,075 g L-1) 97,32b 4,39a 3,54b 0,11a 32,18b 55,75b


+ Cresoxim-metílico (0,050 g L-1) 99,25b 4,40a 3,59b 0,11a 32,64b 56,50b

Piraclostrobina (0,100 g L-1) 99,78b 4,39a 3,61b 0,12a 30,08b 55,00b





CV (%) 11,28 9,02 7,21 6,74 8,95 9,78


121

As características sensoriais como doçura, acidez, aroma, textura, etc., determinam o

sabor de frutos maduros (ANTUNES et al., 2014) e podem ser avaliadas pela relação SS/AT,

analisando o equilíbrio entre o conteúdo de açúcares e ácidos no fruto (CHITARRA;

CHITARRA, 2005). Pode-se observar que o tratamento que apresentou os maiores valores para

a relação SS/AT foi Flux+Pira (37,8 e 38,8 em 2015 e 2016, respectivamente), seguido de

Me+Pira (31,3 e 37,8 em 2015 e 2016, respectivamente). No entanto, não houve diferença

estatística entre eles no ano de 2016, diferindo dos demais tratamentos.

O tomate é considerado saboroso, quando apresenta a proporção SS/AT superior a 10

(KADER et al., 1978). De maneira geral, todos os frutos apresentaram excelente qualidade,

estando adequados para o consumo in natura. No entanto, quanto maior o valor da relação

SS/AT mais suave é o sabor do fruto, devido a excelente combinação entre açúcar e ácido

(SHIRAHIGE et al., 2010).

Na análise do teor de ácido ascórbico os tratamentos Flux+Pira e Me+Pira apresentaram

os melhores resultados. A aplicação de Flux+Pira em plantas de tomateiro ao longo do ciclo

proporcionou incremento de 36,9 e 55,9% em relação à Test-Inoc (em 2015 e 2016,

respectivamente) e 29,5 e 43,4% (em 2015 e 2016, respectivamente), enquanto que para

Me+Pira foi de 32,4 e 49,1% (em 2015 e 2016, respectivamente) e 25,1 e 36,9% (em 2015 e

2016, respectivamente) de ácido ascórbico nos frutos.

O ácido ascórbico, também conhecido como vitamina C, é um composto antioxidante

essencial para a saúde, por estar envolvido nas respostas fisiológicas ao estresse (ORNELAS-

PAZ et al., 2013) e, por isso, frutos com altos teores de vitamina C são mais atrativos aos olhos

dos consumidores (SHIRAHIGE et al., 2010). Além de ser essencial, a preservação das

características físico-químicas e a qualidade pós-colheita dos frutos de tomate de mesa

(FERREIRA et al., 2010) conferem melhor sabor ao fruto, que são perceptíveis pelo

consumidor e definem sua escolha no momento da aquisição (HEINE et al., 2015).

Quanto à firmeza dos frutos (gf cm-2), os tratamentos Flux+Pira e Me+Pira também

apresentaram valores superiores de firmeza, isto indica que estes tratamentos proporcionaram

o desenvolvimento de frutos mais firmes e com maior conservação pós-colheita. Tais resultados

têm correlação com as respostas observadas para as atividades das enzimas pectinametilesterase

(PME) e poligalacturonase (PG) e com a perda de massa (Figuras 34 e 35) nestes mesmos

tratamentos, pois o amaciamento dos frutos decorre de processos desencadeados pela atividade

das enzimas PME e PG (SAINZ; VENDRUSCOLO, 2015). Tratamentos que interferem na

122

atividade destas enzimas e proporcionam maior firmeza dos frutos após a maturação, conferem

maior resistência destes durante a fase de comercialização até o consumidor final (HEINE et

al., 2015).

Figura 34. Atividade das enzimas pectinametilesterase (PME, U min-1 g massa fresca-1) (A.) e poligalacturonase

(PG, U min-1 g massa fresca-1) (B.) em frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação,

nos anos de 2015 e 2016. Tratamentos: testemunha inoculada (Test+Inoc), testemunha absoluta (Test), boscalida

(Bosc), boscalida mais cresoxim-metílico (Bosc+Cre), piraclostrobina (Pira), fluxapiroxade mais piraclostrobina

(Flux+Pira) e metiram mais piraclostrobina (Me+Pira) e inoculadas com Alternaria solani. Médias (n = 10)

seguidas de letras distintas, no mesmo ano, diferem significativamente entre tratamentos pelo teste Tukey ao nível

de 5% de probabilidade (p<0,05). Barras indicam e desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

Os resultados mostram diferenças na atividade das enzimas PME e PG em função da

aplicação dos tratamentos. As menores atividades da enzima PME (Figura 34A) foram

constatadas nos tratamentos Flux+Pira e Me+Pira, enquanto que a maior atividade ocorreu no

tratamento Test-Inoc, em ambos os anos avaliados. A atuação destas enzimas influenciou na

textura do fruto, por atuarem sob as pectinas, degradando-as. A ação da enzima PME reflete na

atividade da PG, pois a desmetilação de substâncias pécticas pela PME produz os substratos

utilizados pela PG (SAINZ; VENDRUSCOLO, 2015). Assim, a atividade da PME aumenta a

atividade da PG, por atuarem concomitantemente.

De fato, notou-se que o padrão de resposta expresso para a atividade da enzima PME se

repete para a atividade da enzima PG (Figura 34B), de tal forma que as menores atividades da

enzima PG foram observadas nos tratamentos Flux+Pira e Me+Pira e, novamente, a maior

atividade foi observada no tratamento Test-Inoc, seguido de Test-absoluta, com respostas

semelhantes em ambos os experimentos realizados. Entretanto, observou-se que os tratamentos

Test-Inoc Test Bosc Bosc+Cre Pira Flux+Pira Me+Pira0

100

200

300

400

500

600

700

800

e

de

d

ccc

cc

c

bb

a

a

B.

Poli

gala

ctu

ronase

(U

min

-1 g

mass

a f

resc

a-1

)

2015 2016

A.Test-Inoc Test Bosc Bosc+Cre Pira Flux+Pira Me+Pira

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

ddd

d

cc

bccc

bcb

b

a

Pecti

nam

eti

lest

era

se (

U m

in-1

g m

ass

a f

resc

a-1

)

a

123

Bosc, Bosc+Cre e Pira também apresentaram menor atividade das enzimas PME e PG, quando

comparados às testemunhas Tes-Inoc e Test-Absoluta.

Nas avaliações de perda de massa, os frutos permaneceram por 21 dias sobre a bancada,

com temperatura ambiente média de 24,5°C (variando de 22,6 a 26,1°C) e umidade relativa

média de 57,5% (variando de 53 a 68%) no ano de 2015. A temperatura ambiente média no

experimento em 2016 foi de 25,0°C (variando de 23,4 a 26,8°C) e umidade relativa média de

58% (variando de 54 a 67%).

Nestas condições pode ser constatado que ao final do período de avaliação (21° dia), os

tratamentos com os diferentes fungicidas apresentavam a maioria dos frutos aptos para o

consumo. No entanto, os tratamentos que mais se destacaram na manutenção das características

visuais pós-colheita foram Flux+Pira e Me+Pira, pois apresentaram as menores perdas de massa

(Figura 35).

Figura 35. Perda de massa (%) de frutos de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de vegetação,

tratadas com diferentes fungicidas de efeitos fisiológicos e inoculados com Alternaria solani, durante 21 dias, nos

anos de 2015 e 2016. Médias (n = 10) seguidas de letras diferentes no mesmo dia de avliação diferem

significativamente entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade (p<0,05). Dados transformados em arco seno

de √x(%). Barras indicam desvio padrão da média. Unicentro, Guarapuava/PR, 2018.

Porém, o tratamento com Flux+Pira apresentou a menor perda de massa ao longo do

período de avalição, com apenas 5,7% (2015) e 5,4% (2016) de redução na massa dos frutos,

enquanto que o tratamento Me+Pira teve 10,1% (2015) e 8,7% (2016). A menor porcentagem

3º dia 5º dia 7º dia 9º dia 11º dia 13º dia 15º dia 17º dia 19º dia 21º dia

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

3º dia 5º dia 7º dia 9º dia 11º dia 13º dia 15º dia 17º dia 19º dia 21º dia

ddddd

cc

cccc

cc

bb

b

bb

a

a

a

a

a

a

aa

a

2015

Perd

a d

e m

assa (

%)

a



-1)





-1)

2016

ddddd

cc

cccc

cc

b

bb

b

b

a

a

a

aa

a

a

aa

a

124

de perda de massa ao longo do período de avaliação está relacionada à firmeza dos frutos, que

de fato foram maiores para estes dois tratamentos. A perda de massa pode ser atribuída,

principalmente, à perda de umidade e de material de reserva pela transpiração e respiração,

respectivamente, sendo um dos principais fatores limitantes da vida útil pós-colheita de frutos.

O maior período de conservação pós-colheita do fruto, permite ter uma perspectiva de quanto

tempo ele resiste ao transporte e/ou comercialização sem que perca suas características e

qualidades externas e internas dos frutos.

Observou-se que as testemunhas, Tes-Inoc e Test-Absoluta, apresentaram as maiores

perdas de massa, quando comparados aos tratamentos Flux+Pira, Me+Pira, Bosc, Bosc+Cre e

Pira. Melhor qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro também foi observada por Ramos et

al. (2013), relatando que o tratamento com a mistura de piraclostrobina e boscalida

proporcionaram frutos mais firmes com uma melhor conservação pós-colheita, uma vez que

frutos mais firmes poderão ser comercializados por períodos mais longos.

Portanto, indicando que, de maneira geral, estes fungicidas também apresentam efeito

positivo na qualidade pós-colheita de frutos de tomateiro, desacelerando o processo de

degradação do fruto, proporcionando maior vida de prateleira e conservação da qualidade no

armazenamento. Em última análise, pode-se inferir que a produtividade e a qualidade pós-

colheita de frutos de tomateiro são reflexos do manejo adotado durante o ciclo da cultura e que

a aplicação dos fungicidas testados promoveram efeitos positivos em todas as características

avaliadas.

125

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Considerando os resultados obtidos nas condições destes experimentos foi possível

verificar por meio dos efeitos fisiológicos proporcionados pelos diferentes fungicidas, que em

todas as características avaliadas as plantas testemunhas, Test-Inoc e Test-Absoluta, foram

aquelas que apresentaram os menores resultados, nos dois anos avaliados, comprovando o efeito

fisiológico dos fungicidas nas plantas de tomateiro híbrido Conquistador cultivadas em casa de

vegetação.

É importante destacar que as temperaturas médias (mínima e máxima) observadas

durante os dois anos de condução do experimento encontravam-se entre 19,5 a 30,5°C e,

sabendo-se que para plantas C3 a temperatura ótima para todas as reações bioquímicas da

fotossíntese é de aproximadamente 25°C, nota-se que as temperaturas foram ótimas para os

processos fotossintéticos durante todo o ciclo de desenvolvimento das plantas de tomateiro.

A partir dos dados observados nas avaliações de trocas gasosas e fluorescência da

clorofila a comprovou-se que plantas de tomateiro sob estresse biótico (Test-Inoc) em

decorrência da presença da doença pinta preta sofreram danos no aparato fotossintético. Este

fato foi verificado pela baixa eficiência fotossintética, que refletiu diretamente no

desenvolvimento e produtividade destas plantas.

Constatou-se também que, os diferentes fungicidas testados, além de serem eficientes

no controle de pinta preta em tomateiro foram capazes de promover a ativação de mecanismos

de defesa, induzindo respostas bioquímicas, observadas pelo aumento da atividade das enzimas

antioxidantes e das enzimas relacionadas à patogênese com baixo custo metabólico. Pois, nestes

mesmos tratamentos observou-se maior acúmulo de biomassa e produção de frutos, quando

comparados às testemunhas. Isto indica que há um importante mecanismo de resistência sendo

induzido por estas moléculas, que até o momento era pouco conhecido.

Para a atividade das enzimas antioxidativas e PRPs, avaliadas ao longo do ciclo da

cultura, notou-se que o efeito se repetiu, apresentando picos de atividades entre 24 e 48 horas

após cada aplicação dos tratamentos, comprovando o potencial destas substâncias como

promotoras de respostas de defesa ao estresse biótico em plantas de tomateiro. Este efeito

protetor ao estresse oxidativo somado a maior eficiência fotossintética resultou nos maiores

índices produtivos e qualidade de frutos observados nas plantas tratadas com estas

estrobilurinas e carboxamidas, pois incrementar a eficiência fotossintética e controlar o estresse

são fatores cruciais para aumentar a produtividade da cultura.

126

Os maiores valores da atividade da enzima nitrato redutase observados nas plantas

tratadas com os diferentes fungicidas, refletiram em maiores teores de pigmentos

fotossintéticos, em especial das clorofilas a e b, pois o teor de clorofila tem estreita relação com

a quantidade de nitrogênio absorvido e assimilado pela planta. Também, o aumento na síntese

de pigmentos incrementou a eficiência fotossintética nestes tratamentos, demonstrando que há

relação entre o aumento da atividade da enzima nitrato redutase e a concentração de clorofilas

interferindo diretamente na fotossíntese líquida e nos demais parâmetros fotossintéticos

avaliados em plantas tratadas com estas estrobilurinas e carboxamidas.

Outra característica importante é que a enzima nitrato redutase pode produzir óxido

nítrico a partir da redução de um elétron do nitrito, utilizando NADPH como doador de elétrons.

Por sua vez, o óxido nítrico, além de outras funções, apresenta importante papel na difusão da

sinalização de respostas de defesa nos vegetais. Assim, há a hipótese de que a maior atividade

da enzima nitrato redutase também esteja relacionada, pela maior biossíntese de óxido nítrico,

com a cascata de eventos, observadas nas respostas de defesas em plantas tratadas com estas

estrobilurinas e carboxamidas. Portanto, diante desta inferência novos estudos com estas

moléculas no patossistema tomateiro-A. solani são necessários para elucidar esta hipótese.

Durante a condução dos experimentos foram realizadas aplicações quinzenais,

totalizando 6 aplicações de fungicidas, que permitiram excelente controle da doença. No

entanto, em condições de campo, onde os fatores climáticos não podem ser controlados, são

necessárias aplicações semanais ou em menor intervalo, dependendo da severidade da doença

e das condições climáticas. Por isso, é comum encontrar sistemas de cultivo que realizam mais

de 12 aplicações de fungicidas durante o ciclo da cultura. Sabendo dos efeitos positivos que os

fungicidas aqui testados proporcionam na fisiologia e no metabolismo das plantas, recomenda-

se que estas moléculas sejam utilizadas em um manejo racional (rotação de modos de ação)

para o controle de A. solani em tomateiro.

Em última análise, tem-se como desafio compreender como todos os efeitos fisiológicos

e metabólicos promovidos pelas estrobilurinas e carboxamidas avaliadas se interligam. A

Figura 36 ilustra, de modo simplificado, a interação entre todos os efeitos fisiológicos e

metabólicos observados em plantas de tomateiro híbrido Conquistador, cultivadas em casa de

vegetação e inoculadas com A. solani, pela aplicação de boscalida, boscalida mais cresoxim-

metílico, piraclostrobina, fluxapiroxade mais piraclostrobina e metiram mais piraclostrobina.

> Firmeza dos frutosAtividade enzimas PME e PG

Perda de massa

Qualidade pós colheita

Sólidos solúveisRelação SS/ATÁcido ascórbico

Melhora o sabor

N frutos m²Massa fresca frutos g% frutos comerciais

> Produtividade

o

> E

ficiê

nci

a foto

ssin

tétic

a

{Taxa de assimilação de COCondutância estomática[ ] interna de COTaxa transpiraçãoEficiência do uso da águaEficiência de carboxilaçãoEficiência máxima de PS IIRendimento quântico fotoquímico do PS IITaxa relativa de transporte de elétrons

[ ] de clorofilas a e b

Crescimento vegetalÁrea foliarBiomassa de folha, caule e raízes[ ] Açúcares totais e açúcaresredutores nas folhas, caule e frutos

> D

ese

nvo

lvim

ento

{2

2

Inibe o transporte de e temporariamente-

[ERO ] = O e H O 2S 2 2-.

Danos oxidativos Defesa antioxidativa

Peroxidação lipídica O 2

2 2

-.

H O

[ ]

[ ]

SODAPXGRGSTGPXCAT

{ {Peroxidaçãolipídica

Tóxico ao patógeno

Respostas dehipersensibilidade

Assimilaçãode nitrogênio

NO NO- -23

Respostasde defesa

Ativação de defesas

NO

?

?

Ativa enzima NR

2 2H O

Via fenilpropanóides Via Octadecanóides

Biossíntese de AS Biossíntese de AJ

PAL

Comp. fenóicos

POD

LOX

PPO

{+

{ Quitinase

B-1, 3-Glucanase

Biossíntesede lignina {?

Eficiente controlede Alternaria solani

Alternaria solani

> PRPs

{

FungicidasEstrobilurinas

e Carboxamidas

BOSBOS + CREPIRAFLUX + PIRAME + PIRA{

{

nível de ATP celular

[H ] no citosol+

Inibe o transporte de e -*

e/ou

{ {

{*

Box 1

Box 2

Box 4

Box 3

Box 5

Box 6

Box 7

Box 8

Box 9

Box 10

Legenda

*Mensageiro celular - metabolismo secundário

Proteção do aparatofotossintético

EROs

MA

RE

K, 2018

128

Figura 36. Modelo esquemático mostrando os efeitos fisiológicos e metabólicos promovidos pela aplicação de

estrobilurinas: cresoxim-metílico e boscalida e carboxamidas: boscalida e fluxapiroxade em plantas de tomateiro

híbrido Conquistador cultivadas em casa de vegetação e inoculadas com Alternaria solani. Fonte: MAREK, 2018.

A eficiência de controle de pinta preta (A. solani) em plantas de tomateiro submetidas à

aplicação de estrobilurinas e carboxamidas está representado no BOX 1: a ação transitória das

moléculas no metabolismo celular vegetal – inibição temporária do transporte de elétrons e

ativação da atividade da enzima nitrato redutase (NR) e o possível envolvimento de moléculas

sinalizadoras como o óxido nítrico (NO). Com a ativação da enzima NR há o aumento da

assimilação de nitrogênio (BOX 2), que culmina na maior síntese de pigmentos fotossintéticos

e, consequentemente, aumenta a eficiência fotossintética da planta (BOX 3), refletindo em

maior desenvolvimento (BOX 4). Em função da ação dos fungicidas no metabolismo celular

(BOX 5) há a superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs quando estão

em altas concentrações podem causar danos celulares, no entanto, quando o arsenal de defesa

enzimático antioxidativo é ativado (BOX 7), ocorre menores danos em função da menor

peroxidação lipídica (BOX 6) e, consequentemente, maior proteção do aparato fotossintético.

Entretanto, a superprodução de EROs (BOX 5) também desencadeia respostas de

defesa, além de serem tóxicas ao patógeno (BOX 8), por isso, em concentrações fisiológicas

adequadas, o H2O2 também atua como mensageiro secundário, ativando importantes vias de

defesa vegetal no metabolismo secundário (BOX 9) e a possível biossíntese de hormônios

vegetais como ácido salicílico e ácido jasmônico (importantes sinalizadores de respostas de

defesa). Unindo todos os efeitos fisiológicos e metabólicos a resposta final é a maior

produtividade e qualidade pós-colheita (BOX 10).

129

7. CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos e nas condições destes experimentos pode-se concluir

que as aplicações de boscalida, boscalida mais cresoxim-metílico, piraclostrobina,

fluxapiroxade mais piraclostrobina e metiram mais piraclostrobina apresentaram eficiente

controle da doença, promoveram efeitos fisiológicos positivos e ativaram os mecanismos de

defesa em plantas de tomateiro.

Os fungicidas fluxapiroxade mais piraclostrobina, seguido de metiram mais

piraclostrobina, foram os tratamentos que proporcionaram os melhores controles de A. solani e

as melhores respostas fisiológicas e metabólicas em plantas de tomateiro híbrido Conquistador,

cultivado em casa de vegetação.

130

8. Referências Bibliográficas

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