CRHISTIANE ANDRESSA DA SILVA

EFEITOS DE VOCALIZAÇÕES DE CO-ESPECÍFICOS

E DO ESCURO SOBRE O RITMO CIRCADIANO DA

ATIVIDADE MOTORA EM SAGÜIS (Callithrix jacchus)

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte para

obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Orientadora: Profª. Drª. Carolina V.

Macedo Azevedo

Co-orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza

Cavalcante

NATAL

2007

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EFEITOS DE VOCALIZAÇÕES DE CO-ESPECÍFICOS

E DO ESCURO SOBRE O RITMO CIRCADIANO DA

ATIVIDADE MOTORA EM SAGÜIS (Callithrix jacchus)

CRHISTIANE ANDRESSA DA SILVA

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte para

obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Orientadora: Profª. Drª. Carolina V.

Macedo Azevedo

Co-orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza

Cavalcante

NATAL

2007

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Título: EFEITOS DE VOCALIZAÇÕES DE CO-ESPECÍFICOS E DO

ESCURO SOBRE O RITMO CIRCADIANO DA ATIVIDADE MOTORA

EM SAGÜIS (Callithrix jacchus)

Autora: Crhistiane Andressa da Silva

Data da Defesa: 06/09/2007

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Luiz Menna-Barreto

Universidade de São Paulo, SP

Prof. Dr. Alexandre A. Lara Menezes

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

Prof. Dra. Carolina V. Macedo Azevedo (orientadora)

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

4

Dedico este trabalho aos meus pais Ademir e Margarete, que sempre me apoiaram,

principalmente nos momentos mais difíceis!

5

“Jamais se desespere em meio às mais sombrias aflições de sua vida, pois das

nuvens mais negras cai água límpida e fecunda”.

(Autor Desconhecido)

6

AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos

Primeiramente, agradeço a Deus por ter me ajudado em mais uma etapa de minha vida!

Um agradecimento especial a Profa. Carolina, cujos ensinamentos, conselhos, sabedoria e

paciência foram fundamentais para o meu retorno ao mestrado e na realização deste trabalho!

Aos Profs. Jefferson, John e Alexandre pelos sábios conselhos e por estarem sempre

disponíveis a ajudar e contribuir!

A André, Aline e Gutemberg pelo grande apoio no cuidado com os animais e na realização

dos experimentos.

Ao pessoal do Núcleo de Primatologia, Flávio, Edinólia, Luiz, Geniberto, Zé Rubens,

Francisco, Tota e Márcio pela ajuda no cuidado com os sagüis.

A Cristiano e Ruthnaldo, cuja ajuda foi primordial na realização dos experimentos!

Aos meus pais e irmãos pelo apoio e ajuda imprescindíveis ao longo do mestrado e durante o

tempo em que fiquei afastada da universidade!

Um muito obrigada ao grande e querido amigo Leland, que torce pelo meu sucesso e me

apóia desde a graduação!

A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal e do Ensino Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de mestrado.

Finalizando, meu muuuuuuito obrigada a Pipoca, Paolo, Borges, Doko, Xando, Xerxes e

Luiz por serem animais encantadores e tão fáceis de lidar!

7

Resumo

Silva, C.A. (2007). Efeitos de vocalizações de co-específicos e do escuro sobre o ritmo circadiano da atividade motora em sagüis (Callithrix jacchus). Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.

O principal zeitgeber para a maioria das espécies é o ciclo claro-escuro (CE), porém outros fatores ambientais como disponibilidade de alimento, temperatura e pistas sociais podem atuar. O ajuste diário do marcapasso circadiano deve resultar da integração de pistas ambientais, fóticas e não-fóticas, com pistas homeostáticas. Como a caracterização do efeito de estímulos não-fóticos sobre o sistema de temporização circadiano em mamíferos diurnos é escassa em relação aos noturnos, principalmente em relação a pistas com significado ecológico, analisamos o efeito de vocalizações de co-específicos e do escuro sobre o ritmo circadiano de atividade motora (RCA) do primata diurno Callithrix jacchus. Com esse objetivo, foram isolados 7 machos adultos em uma sala com iluminação, temperatura (26,8 ± 0,2°C) e umidade (81,6 ± 3,6%) controladas e isolamento acústico parcial. Inicialmente os animais ficaram sob CE 12:12 (∼300:2 lux) e posteriormente sob claro constante (∼2 lux). Foram aplicados dois pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro total, com um intervalo de 22 dias, às 7:30 h (horário local) durante 1 h. Esses pulsos desencadearam atrasos de fase nas horas circadianas (HCs) 1 e 10 e predominantemente avanços de fase nas HCs 9 e 15. Depois foram aplicados dois pulsos de escuro, com um intervalo de 14 dias, às 7:30 h (horário local) durante 1 h. Esses pulsos desencadearam atrasos de fase nas HCs 2, 3 e 18, predominantemente avanços de fase nas HCs 8, 10 e 19, e nenhuma resposta na HC 14. Contudo, o RCA dos sagüis apresentou modulações no período endógeno e na duração da fase ativa por influência de vocalizações emitidas pelos animais de fora da sala, que interferiram nas respostas aos pulsos. Inclusive, foram observados mascaramento social positivo e coordenação relativa com a colônia. Portanto, as respostas de fase obtidas nesse trabalho não podem ser atribuídas apenas aos pulsos. Posteriormente foram aplicados pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro total às 19 h (horário local), durante 1 h por 5 dias consecutivos, e após 21 dias, por 30 dias consecutivos, para sincronizar o RCA. Nenhum animal sincronizou o RCA aos pulsos diários, embora tenham ocorrido modulações no período endógeno de todos. Esse resultado pode ter sido decorrente de habituação ao estímulo. Outra possibilidade é a falta de significado social para os animais devido à reprodução aleatória das vocalizações, visto que cada vocalização tem uma função que pode ter sido perdida com a mistura dos sons. Concluindo, vocalizações de co-específicos induzem mascaramento social e coordenação relativa no RCA de sagüis, atuando como zeitgebers fracos.

8

Abstract

Silva, C.A. (2007). Effects of conspecific vocalizations and darkness on the circadian activity rhythm in marmosets (Callithrix jacchus). Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.

The principal zeitgeber for most of species is the light-dark photocycle (LD), though other environment factors as food availability, temperature and social cues may act. Daily adjustment of the circadian pacemaker may result from integration of environmental photic and non-photic cues with homeostatic cues. Characterization of non-photic effects on circadian timing system in diurnal mammals is scarce in relation to nocturnal, especially for ecologically significant cues. Thus, we analyzed the effect of conspecific vocalizations and darkness on circadian activity rhythm (CAR) in the diurnal primate Callithirx jacchus. With this objective 7 male adults were isolated in a room with controlled illumination, temperature (26,8 ± 0,2°C) and humidity (81,6 ± 3,6%), and partial acoustic isolation. Initially they were under LD 12:12 (∼300:2 lux), and subsequently under constant illumination (∼2 lux). Two pulses of conspecific vocalizations were applied in total darkness, separated by 22 days, at 7:30 h (external time) during 1 h. They induced phase delays at circadian times (CTs) 1 and 10 and predominantly phase advances at CTs 9 and 15. After that, two dark pulses were applied, separated by 14 days, during 1 h at 7:30 h (external time). These pulses induced phase delays at CTs 2, 3 and 18, predominantly phase advances at CTs 8, 10 and 19, and no change at CT 14. However, marmosets CAR showed oscillations in endogenous period and active phase duration influenced by vocalizations from animals outside the experimental room, which interfered on the phase responses to pulses. Furthermore, social masking and relative coordination with colony were observed. Therefore, phase responses obtained in this work cannot be attributed only to pulses. Afterwards, pulses of conspecific vocalizations were applied in total darkness at 19:00 h (external time), during 1 h for 5 consecutive days, and after 21 days, for 30 consecutive days, on attempt to synchronize the CAR. No animal was synchronized by these daily pulses, although oscillations in endogenous period were observed for all. This result may be due to habituation. Other possibility is the absence of social significance of the vocalizations for the animals due to random reproduction, since each vocalization has a function that could be lost by a mixture of sounds. In conclusion, conspecific vocalizations induce social masking and relative coordination in marmosets CAR, acting as weak zeitgeber.

9

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 11

a) Ritmicidade Biológica............................................................................ 11

b) Sincronização ao Ambiente.................................................................... 12

Sistema de Temporização Circadiano.......................................... 14

Sincronização Fótica.................................................................... 16

Sincronização Não-Fótica............................................................ 18

Efeito do Escuro........................................................................... 22

Interação entre Estímulo Fóticos e Não-Fóticos.......................... 24

c) O sagüi como modelo experimental....................................................... 26

2. OBJETIVOS...................................................................................................... 29

3. METODOLOGIA............................................................................................. 31

a) Sujeito experimental............................................................................... 31

b) Condições de manutenção...................................................................... 32

c) Procedimentos........................................................................................ 34

c1) Adaptação.............................................................................. 34

c2) Estímulos não-fóticos e escuro.............................................. 34

d) Método de coleta de dados..................................................................... 36

e) Análise dos dados................................................................................... 37

4. RESULTADOS................................................................................................. 39

Ritmo circadiano da atividade motora ao longo do experimento........... 39

Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro.............................. 48

Pulsos de escuro...................................................................................... 51

Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro durante 5 dias...... 51

Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro durante 30 dias.... 53

10

5. DISCUSSÃO..................................................................................................... 54

6. CONCLUSÕES................................................................................................. 64

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 65

11

1. Introdução

a) Ritmicidade Biológica

Desde tempos mais remotos, os seres vivos convivem com processos rítmicos

no ambiente. As interações da Terra com o Sol e a Lua, aliadas à inclinação natural do

seu eixo, resultam nos ciclos geofísicos, tais como o ciclo claro-escuro, as estações do

ano e a oscilação das marés, entre outros. Relatos antigos já descreviam os ritmos

biológicos, oscilações periódicas na expressão de comportamentos e funções da

matéria viva. Entretanto, acreditava-se que esses ritmos representavam apenas uma

resposta passiva aos ciclos geofísicos (Rotenberg, Marques, Menna-Barreto 2003).

O primeiro estudo sistematizado dos ritmos biológicos foi realizado pelo

astrônomo francês Jean Jacques de Mairan, em 1729. Ele observou que uma planta

sensitiva, uma espécie de Mimosa, mantinha os movimentos rítmicos das folhas com

uma periodicidade diária na ausência do ciclo claro-escuro, sugerindo pela primeira

vez o caráter endógeno da ritmicidade biológica. Posteriormente, essas observações

foram confirmadas em outras plantas e organismos, demonstrando de maneira

irrefutável que a geração da ritmicidade biológica é endógena e não exógena, como se

acreditava inicialmente. O ritmo biológico expresso dessa forma, ou seja, sob

condições ambientais constantes, é denominado ritmo em livre-curso (Rotenberg et al.

2003).

O fato dos ritmos biológicos serem gerados endogenamente não significa que

eles sejam insensíveis aos ciclos ambientais. Pelo contrário, é extremamente

importante para a sobrevivência que eles mantenham uma relação de fase estável com

os ciclos ambientais aos quais a espécie é sensível. Isso permite que os estados dos

ritmos fisiológicos e comportamentais estejam associados às fases mais propícias dos

ciclos ambientais para a sobrevivência da espécie. Essa relação de fase estável dos

ritmos biológicos com os ciclos ambientais é chamada sincronização (Marques,

Golombek, Moreno 2003).

Os ritmos biológicos estão presentes em todos os eucariotos e também são

encontrados em procariotos, como as cianobactérias. Usualmente são classificados de

acordo com Halberg (1959) em circadianos, ultradianos ou infradianos. Os ritmos

12

circadianos apresentam um ciclo recorrendo a cada 24 horas (períodos em torno de 24

± 4 horas) e estão associados ao ciclo claro-escuro, como o ritmo da atividade e

repouso dos animais. Os ritmos ultradianos apresentam mais de um ciclo recorrendo

dentro de um dia (períodos menores que 20 horas), como o ritmo dos batimentos

cardíacos e dos movimentos respiratórios, enquanto os ritmos infradianos recorrem em

intervalos superiores a um dia (períodos maiores que 28 horas), como o ciclo estral dos

animais (Rotenberg et al. 2003). Porém, devido à supervalorização dos ritmos

circadianos e por não haver um significado funcional nessa classificação, Araújo e

Marques (2003) propõem a divisão dos ritmos biológicos em duas categorias: ritmos

com correlatos com ciclos geofísicos, relacionados funcionalmente com a antecipação

de uma mudança no ambiente, e ritmos sem correlatos com ciclos geofísicos,

relacionados com a antecipação de uma mudança no meio interno.

Sendo assim, a ritmicidade biológica é uma característica extremamente

importante por promover uma organização temporal interna na fisiologia e no

comportamento dos seres vivos e possibilitar a sincronização ao ambiente externo,

auxiliando-os a “predizer” e se preparar para as mudanças ambientais periódicas e

regulares (Pittendrigh 1960; Challet & Pévet 2003; Davidson & Menaker 2003). Dessa

forma, garante um funcionamento ótimo do sistema biológico, com maior eficiência,

desempenho e bem-estar (Weinert 2005).

Os ritmos biológicos que possuem um correlato ambiental são os mais

estudados, tanto pela sua obviedade quanto pela facilidade proporcionada pelo fato de

se conhecer as principais freqüências das oscilações. Dentre eles, os mais estudados e,

portanto mais bem descritos e conhecidos, são os ritmos circadianos (Marques et al.

2003).

b) Sincronização ao Ambiente

Para que seja mantida uma relação de fase estável entre os ritmos circadianos e

o zeitgeber*, é necessário que o período endógeno (τ), que sob condições constantes é

* Zeitgeber – denominação dada ao ciclo ambiental que promove a sincronização dos ritmos biológicos

(Marques et al. 2003). Foi proposta por Aschoff (1951, 1954) e tem como sinônimos agente arrastador, proposto

por Pittendrigh (1960), e sincronizador, proposto por Halberg (1960, 1967) (Rotenberg et al. 2003).

13

diferente de 24 horas, ajuste-se ao período do ciclo ambiental (T) e passe a se

expressar com o período exato de 24 horas. Esse processo pode ocorrer através dos

mecanismos de arrastamento ou mascaramento (Daan & Aschoff 2001; Marques et al.

2003).

No mecanismo de arrastamento, o período e a fase do ritmo biológico são

ajustados através de deslocamentos de fase provocados pelos zeitgebers. A nova

sincronização é conseguida gradualmente, após um ou mais ciclos transientes, durante

os quais podem-se observar atrasos ou adiantamentos de fase. São propostos dois

modelos de arrastamento, um através de um mecanismo de arrastamento discreto ou

não-paramétrico e o outro através do arrastamento contínuo ou paramétrico (Aschoff

1999; Daan & Aschoff 2001; Johnson et al. 2003; Pittendrigh 1960).

O modelo de arrastamento não-paramétrico se baseia no efeito fásico ou

discreto que pulsos do zeitgeber provocam sobre o oscilador biológico. Dependendo

da fase do ritmo em livre-curso na qual é aplicado, o pulso vai provocar atraso,

adiantamento ou pode não ter efeito sobre o ritmo. Então, para que ocorra a

sincronização por arrastamento, é necessário que o pulso caia numa fase que provoque

um deslocamento significativo de fase que corrija a diferença entre o período

endógeno e o período do zeitgeber. Uma maneira de se estudar esse mecanismo é

através da aplicação de pulsos idênticos do estímulo nas diferentes horas do dia

circadiano no organismo em livre-curso. A duração e a direção do deslocamento de

fase provocado por esse procedimento, relacionado com a fase de exposição ao pulso

pode ser representada graficamente na denominada curva de resposta dependente da

fase (CRF) (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Johnson et al. 2003; Marques et al.

2003; Pittendrigh 1960).

Por outro lado, o modelo paramétrico propõe que um ritmo circadiano pode ser

sincronizado por um ciclo ambiental completo, através do efeito contínuo deste sobre

o período do oscilador biológico. Esta ação seria alternadamente de aceleração e de

retardo, conforme o ciclo do zeitgeber incidisse nas diferentes fases circadianas.

Contudo, em ambiente natural o arrastamento parece ser resultante da combinação do

mecanismo paramétrico e do não-paramétrico (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001;

Johnson et al. 2003; Marques et al. 2003).

14

No mecanismo de mascaramento, a sincronização é decorrente de efeitos

diretos do zeitgeber sobre a expressão dos ritmos circadianos, sem envolvimento do

oscilador biológico (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Marques et al. 2003). Esse

mecanismo confere plasticidade ao sistema de temporização circadiano, pois

possibilita ao organismo responder instantaneamente a um estímulo ambiental,

proporcionando uma flexibilidade não permitida nos mecanismos rígidos do

arrastamento, além de refinamento e aceleração do ajuste do organismo ao ambiente

(Marques et al. 2003).

O principal zeitgeber para a maioria das espécies é o ciclo claro-escuro (CE),

que é o sinal temporal mais preciso na maioria dos ambientes. Porém, outros fatores

ambientais podem atuar como zeitgeber, principalmente em espécies que não têm

contato com o ciclo CE em seu habitat natural, como os organismos que vivem em

cavernas ou no fundo do mar, embora haja pouca informação sobre a sincronização

nessas condições (Daan & Aschoff 2001). Exemplos de ciclos ambientais importantes

como zeitgebers para várias espécies são os ciclos de disponibilidade de alimento,

temperatura, umidade relativa, pistas sociais, entre outros (Chandrashekaran 1982;

Davidson & Menaker 2003; Marques et al. 2003). Portanto, em ambiente natural o

ajuste diário do relógio circadiano deve resultar da integração de várias pistas

ambientais, fóticas e não-fóticas, com pistas homeostáticas (Challet & Pévet 2003). O

sistema fisiológico responsável por essa integração, pela geração e sincronização da

ritmicidade circadiana é denominado sistema de temporização circadiano.

- Sistema de Temporização Circadiano (STC)

O STC corresponde ao conjunto de estruturas neurais especializadas que

estabelecem uma organização temporal dos processos fisiológicos e comportamentos

dentro de padrões precisos. Dessa forma, é o responsável pela geração e sincronização

dos ritmos circadianos. Consiste em pelo menos três componentes: (1) uma via

aferente (sincronizadora) que transmite informações do meio ambiente; (2) um ou

mais marca-passos, que geram oscilações circadianas; (3) vias eferentes, através das

quais o marca-passo regula a expressão dos diversos ritmos (Goldman 1999; Moore

1999).

15

O núcleo supraquiasmático (NSQ) é considerado o marca-passo principal da

ritmicidade circadiana de mamíferos, nos quais se apresenta como um núcleo par de

neurônios localizados na região anterior do hipotálamo, acima do quiasma óptico,

lateralmente ao terceiro ventrículo (Moore 1999). É anatomicamente dividido em uma

região ventrolateral, responsável pela sincronização aos ciclos ambientais externos, e

uma região dorsomedial, responsável pela geração e estabilidade da ritmicidade

circadiana (Nakamura, Honma, Shirakawa, Honma 2001).

As principais vias sincronizadoras que transmitem informações ambientais para o

NSQ são o trato retino-hipotalâmico (TRH), o trato genículo-hipotalâmico (TGH) e a

via rafe-NSQ (Challet & Pévet 2003; Moore 1999). O TRH origina-se a partir de

células ganglionares da retina que se projetam para o NSQ. É a principal via aferente

que conduz estímulos luminosos ao NSQ, sendo necessário para a sincronização ao

ciclo claro-escuro ambiental. O TGH tem origem no folheto intergeniculado (FIG),

que é parte do complexo geniculado lateral do tálamo e, assim como o NSQ, recebe

projeções diretas da retina. Dessa forma, o TGH é mediador indireto de informações

fóticas do ambiente, além de mediador de informações não-fóticas para o NSQ. A via

rafe-NSQ, originada no núcleo da rafe mesencefálica, é tida como a principal entrada

de informação não-fótica no NSQ. Além disso, está envolvida na modulação da

sincronização fótica (Challet & Pévet 2003; Golombek & Aguilar-Roblero 2003;

Moore 1999).

A principal via efetora do NSQ dirige-se para outros núcleos do hipotálamo, para a

rafe, o tálamo e a área pré-óptica. Essas projeções estão relacionadas com o envio do

sinal circadiano para os sistemas nervoso e endócrino, que o repassam para o restante

dos órgãos e sistemas (Golombek & Aguilar-Roblero 2003).

Outra via efetora do NSQ regula a secreção de melatonina pela glândula pineal.

Esse hormônio é liberado apenas na fase de escuro, pois sua secreção é inibida pelo

claro. Dessa forma a melatonina é um sinal fidedigno dos comprimentos do dia e da

noite para o STC (Goldman 1999; Golombek & Aguilar-Roblero 2003; Moore 1999).

Atualmente prepondera a idéia de que o STC seja um sistema multioscilatório.

Várias evidências indicam que cada célula do NSQ seja um oscilador e que a

sincronização resulte do grau de acoplamento entre as células (Honma, Nakamura,

16

Shirakawa, Honma 2004; Weinert 2005). Também existem evidências da existência de

células geradoras de oscilações circadianas em outras regiões cerebrais como o córtex

cerebral, o hipocampo, e em vários órgãos periféricos, como fígado, coração, pulmão e

músculos. Acredita-se que o STC seja organizado de maneira hierárquica, tendo o

NSQ como oscilador principal que se mantém acoplado aos osciladores periféricos por

meio de conexões nervosas do sistema nervoso autônomo e por sinais humorais

(Brandstaetter 2004; Weinert 2005).

- Sincronização fótica

O sinal de luz diário reajusta os ritmos circadianos a cada ciclo, corrigindo a

diferença entre o período endógeno e as 24 horas ambientais, sincronizando os

organismos ao ambiente externo (Davidson & Menaker 2003). Uma maneira de se

estudar como o ciclo claro-escuro atua sobre o STC é pela construção de uma CRF

fótica, através da aplicação de pulsos de luz em indivíduos mantidos em escuro

constante, se for uma espécie noturna, ou em claro constante com intensidade

luminosa fraca, se for uma espécie diurna (Daan & Aschoff 2001; Marques et al.

2003).

A CRF fótica para roedores noturnos (figura 1) é caracterizada por pequenas

mudanças de fase após pulsos de luz aplicados durante o dia subjetivo e grandes

mudanças de fase após os pulsos durante a noite subjetiva. No início da noite subjetiva

são desencadeados atrasos de fase, enquanto no final da noite subjetiva são

desencadeados avanços de fase (Daan & Aschoff 2001). O mesmo é observado para o

roedor diurno Arvicanthis ansorgei (Slotten, Krekling, Pévet 2005) e para o primata

diurno sagüi (Callithrix jacchus) (Wechselberger & Erkert 1994). Porém, no sagüi

foram observadas grandes mudanças de fase na atividade motora circadiana durante o

dia subjetivo, quando é esperado que o STC não seja muito sensível a mudanças

pontuais na intensidade de luz. Os autores sugerem que essas mudanças de fase

possam ter sido causadas por influência direta da luz sobre o sistema circadiano ou

pelo efeito não-fótico de uma alteração do estado de atividade (arousal) induzida pela

luz.

17

Figura 1: Curva de resposta dependente da fase para pulsos de luz (quadrados) e pulsos de 3h de corrida na roda atividade (losangos). Esses dados foram obtidos de hamsters da linhagem Syrian sob escuro constante. (Figura copiada de Mistlberger & Skene 2004).

Segundo Glass e colaboradores (2001) as manipulações fóticas não devem

induzir respostas comportamentais, pois a luz pode ter um efeito mascarador positivo

que aumenta a atividade desencadeando ativação comportamental, que por si só pode

ter efeito sobre o STC. Com base nisso aplicaram um pulso diário de luz com flashes

estroboscópicos, durante apenas 20 segundos no final do dia subjetivo, por 12 dias,

com o objetivo de sincronizar sagüis (Glass, Tardif, Clements, Mrosovsky 2001). Eles

observaram que a sincronização ocorreu através de avanços de fase de 1,3 a 1,7 h,

quando os pulsos incidiram sobre o fim da noite subjetiva (CT 18-22) dos animais. Por

outro lado, ocorreu através de atrasos de fase de 1,0 a 1,6 h, quando incidiram entre o

fim do dia subjetivo e o início da noite subjetiva (CT 9-12). Arvicanthis ansorgei

também sincronizou a pulsos diários de luz, com duração de 30 minutos, através de

avanços e atrasos de fases (Slotten et al. 2005).

Esses resultados confirmam que a CRF é uma ferramenta realmente eficiente

para se estudar o efeito da luz sobre o STC e como a sincronização fótica está sendo

alcançada. Deve-se considerar que o STC é mais sensível a estímulos fóticos de longa

duração e que o limiar das respostas circadianas à luz é alto. Além disso, os efeitos

dependem da hora circadiana em que a luz é aplicada e das propriedades do pulso de

luz como duração, intensidade e comprimento de onda. Essas propriedades têm

18

significado adaptativo de otimizar a sincronização fótica de oscilações circadianas

(Challet & Pévet 2003; Daan & Aschoff 2001).

- Sincronização não-fótica

Todas as pistas temporais que não são luz são denominadas pistas não-fóticas.

Elas podem mudar a fase do oscilador biológico e modular a sincronização fótica

(Challet & Pévet 2003).

A CRF para pulsos de estímulos não-fóticos em roedores noturnos (figura 1) é

caracterizada por avanços de fase durante o meio e o final do dia subjetivo e atrasos no

início do dia subjetivo ou no final da noite subjetiva (Challet & Pévet 2003;

Mrosovsky, Reebs, Honrado, Salmon 1989). Essas características parecem ser

independentes da natureza do estímulo não-fótico, como foi observado no hamster

Mesocricetus auratus, que apresentou as mesmas mudanças de fase após encontros

agonistas com co-específicos, mudança de gaiola, corrida induzida por uma nova roda

de atividade e administração de triazolam (Mrosovsky et al. 1989). Embora esses

estímulos desencadeiem aumento na atividade locomotora, os autores sugerem que

para se obter uma resposta de fase não-fótica, o importante é o nível de ativação

comportamental desencadeado pelo estímulo, e não a atividade locomotora em si.

Reforçando essa idéia, hamsters da linhagem Syrian apresentaram atrasos de fase em

resposta a pulsos de restrição física no início da noite subjetiva. Os autores sugerem

que a sensibilidade do sistema circadiano à restrição física é dependente da fase e que

poderia estar relacionada à indução de sono em momentos normalmente associados à

vigília para esses animais (Rosenwasser & Dwyer 2002). Por outro lado, os resultados

apresentados por Mistlberger e Antle (2006) são contrários à hipótese de mudanças de

fase desencadeadas por indução de sono durante a restrição física. Aliás, a correlação

entre estado comportamental e magnitude da mudança foi em sentido contrário ao

previsto pela hipótese. Os hamsters que exibiram mais posturas comportamentais

relacionadas ao sono durante a restrição apresentaram as menores mudanças de fase.

Os autores sugerem que os atrasos após a restrição física no início da noite subjetiva

foram causados por um aumento da atividade no final da noite subjetiva, induzido pela

ativação durante a restrição, visto que o aumento na atividade no final da noite

19

subjetiva desencadeia atraso de fase. Apoiando esta hipótese, a repetição do

procedimento de restrição física, promovendo habituação, foi associada à ausência

tanto dos rebotes de atividade como dos atrasos de fase.

Existe uma hipótese de que deve haver pelo menos dois mecanismos diferentes

por trás das mudanças de fase não-fóticas, sendo um claramente dependente de

atividade e outro independente (Bobrzynska & Mrosovsky 1998; Rosenwasser &

Dwyer 2001). Essa parece ser a hipótese mais provável, visto que estudos de restrição

física indicam que as mudanças de fase desencadeadas por triazolam são dependentes

de atividade, enquanto as induzidas por chlordiazepoxide parecem ser mediadas

apenas por ativação (Mrosovsky 1995). É possível que em algumas fases circadianas

os dois mecanismos atuem concomitantemente, pois mudanças de fase associadas com

ativação durante o repouso em hamsters foram dependentes da ocorrência de atividade

(Mistlberger et al. 2003).

Com o objetivo de verificar se a atividade induzida ou a ativação

comportamental, ou ambos, podem induzir mudanças de fase em mamíferos diurnos,

Wechselberger (1994) aplicou pulsos de reprodução de sons de co-epecíficos

associados à apresentação de um espelho em sagüis. Esses pulsos provocaram aumento

na atividade locomotora tanto durante a fase de repouso como na fase ativa. Os pulsos

desencadearam atrasos de fase no início e no meio da noite subjetiva e avanços no fim

da noite subjetiva. Contudo, essas respostas foram semelhantes às desencadeadas por

estímulos fóticos isoladamente. Como os sagüis estavam sob claro constante de 430

lux, é provável que a ativação comportamental tenha aumentado a quantidade de luz

recebida pelos animais e que as mudanças de fase tenham sido primariamente fóticas

ao invés de não-fóticas. Glass et al. (2001) sugeriram que se deve considerar a possível

interferência da luz quando ocorrem eventos não-fóticos, embora o ideal seja que as

manipulações não-fóticas não resultem em mudança na quantidade de luz recebida

pelo sujeito. Portanto, os dados de Wechselberger (1994) provavelmente não refletem

um mecanismo não-fótico.

Avaliando a sincronização não-fótica, Glass e colaboradores (2001) mantiveram

sagüis sob claro constante fraco e aplicaram pulsos comportamentais que consistiam

em atividade estimulada por borrifos d’água e agitação das gaiolas por 1 hora, em

20

escuro total, durante 76 dias. Mesmo com esse tipo de pulso comportamental estando

fora do contexto ecológico dos animais, foi observada sincronização da atividade

motora circadiana. Porém, a sincronização não foi permanente, durando

aproximadamente 3 semanas. Como controle desse experimento, foram aplicados

pulsos de escuro na ausência de atividade induzida durante 42 dias, os quais não

tiveram efeito sincronizador. Uma possibilidade para a sincronização temporária pelos

pulsos comportamentais é que esse estímulo não-fótico seja um sincronizador fraco,

por não ter significado ecológico para essa espécie. Deve-se considerar também que os

tipos de estímulos não-fóticos efetivos na mudança de fase diferem inter-

especificamente. Outra hipótese é que a duração ou a intensidade do estímulo, ou

ambos, tenham sido insuficientes para manter a sincronização. Contudo, quando a

sincronização ocorreu, foi através de atrasos de fase produzidos pelos pulsos de

atividade no final da noite subjetiva ou no início do dia subjetivo, sempre seguidos de

atividade (Glass et al. 2001).

Por outro lado, Slotten et al. (2005) e Hut, Mrosovsky & Daan (1999)

obtiveram sincronização permanente a estímulos não-fóticos em seus experimentos

com mamíferos diurnos. Slotten et al. sincronizaram o roedor Arvicanthis ansorgei por

meio de pulsos diários de 1 hora de melatonina nas fases circadianas de avanços e

atrasos a estímulos não-fóticos. Hut, Mrosovsky & Daan sincronizaram o esquilo

Spermophilus citellus a pulsos de 3 horas de confinamento a uma roda de atividade,

observando avanços de fase no fim do dia subjetivo.

Em relação a estímulos com significado ecológico, os sociais devem ser muito

importantes na expressão dos ritmos circadianos em espécies eusociais, especialmente

na ausência do ciclo claro-escuro. Por exemplo, pássaros são animais sociais que

contam principalmente com a comunicação vocal. Portanto, as pistas auditivas são

potentes zeitgebers para algumas espécies (Davidson & Menaker 2003). O mesmo foi

sugerido para morcegos em experimentos realizados por Marimuthu, Rajan e

Chandrashekaran (1981) com animais dentro de gaiolas em cavernas totalmente

escuras que continuavam sincronizados ao CE ambiental. Segundo os autores a

sincronização foi decorrente de interações sociais entre os morcegos presos e os que

estavam livres nas mesmas cavernas, provavelmente através de pistas auditivas.

21

Pistas sociais também devem ser importantes zeitgebers para Castor

canadensis, já que famílias dessa espécie exibem sincronização mútua dos ritmos

circadianos da atividade durante o inverno, quando estão em tocas cobertas de neve,

ou seja, sob escuro constante (Mistlberger & Skene 2004).

Estudos com primatas sociais não-humanos apontam para a importância de

pistas sociais na expressão de ritmos circadianos. Por exemplo, foram observados

pseudo-bipartição, coordenação relativa, mudanças no período endógeno e na duração

da fase ativa do ritmo circadiano da atividade motora de dois sagüis machos adultos,

um da espécie Callithrix jacchus jacchus e o outro, C. j. penicillata. Essas mudanças

foram induzidas socialmente por uma fêmea presente na mesma sala, provavelmente

por pista acústica (Erkert, Nagel, Stephani 1986). Somando-se a esses resultados, o

contato sonoro entre sagüis promoveu a sincronização do ritmo circadiano da atividade

motora entre pais e filhas, enquanto que entre casais sem relação de parentesco,

induziu apenas mascaramento social positivo (Erkert & Schardt 1991). Esse resultado

indica que o grau de parentesco é um fator importante na sincronização por pistas

sociais. Além disso, um casal que conviveu durante anos não sincronizou mutuamente

nem pelo contato acústico, nem pelo acústico e visual. Só houve sincronização mútua

quando voltaram a coabitar a mesma gaiola, ou seja, foi necessário o contato social

completo para a sincronização mútua. Isso se deu devido à considerável diferença

entre seus períodos endógenos de 23,1 e 23,7 h, pois, para animais cujos períodos

endógenos fossem mais próximos é provável que um zeitgeber social mais fraco

levasse à sincronização mútua. Nesse sentido, quanto maior a proximidade dos

períodos endógenos, maior a probabilidade de sincronização mútua apenas por pistas

sociais. Em suma, estímulos auditivos são zeitgebers fracos e pode ocorrer

sincronização social dos ritmos circadianos em primatas não-humanos dependendo do

grau de parentesco e das diferenças individuais nos períodos endógenos (Erkert &

Schardt 1991).

Davidson & Menaker (2003) sugerem que os sinais sociais em humanos são

incapazes de causar sincronização mútua em condições constantes, mas podem atuar

adicionalmente com a luz mantendo a sincronização já estabelecida. Por exemplo, o

contato social e o esquema de iluminação de claro-escuro 12:12 com intensidade de

22

luz doméstica (200: < 8 lux) não foram suficientes para manter a sincronização entre

indivíduos (Middleton, Stone, Arendt 2002).

Em experimento realizado por Klerman et al. (1998), um sujeito cego foi capaz

de sincronizar a um esquema de atividade-repouso no laboratório (Davidson &

Menaker, 2003). Porém, os pesquisadores escolheram um sujeito que era normalmente

sincronizado em sua vida diária, dentro de uma amostra que incluía sujeitos com

ritmos em livre-curso. Isso sugere que a sensibilidade dos ritmos circadianos às pistas

sociais varia entre seres humanos.

A sensibilidade às pistas sociais varia largamente entre as espécies, o que é

esperado, já que a organização social e os estilos de vida são muito variados. Umas são

altamente dependentes das interações sociais, enquanto outras são praticamente

independentes. Além disso, em condições naturais o ciclo claro-escuro é um zeitgeber

quase sempre disponível. Portanto, parece improvável que as pistas sociais

desempenhem um papel na sincronização básica dos organismos ao ambiente.

Contudo, os sinais sociais devem ser importantes para o refinamento das respostas

circadianas, em particular as respostas temporizadas envolvidas nas interações sociais

adaptativas (Davidson & Menaker 2003).

As diferenças entre os mecanismos de sincronização fóticos e não-fóticos pode

ser uma característica geral dos osciladores circadianos em mamíferos. De um ponto

de vista ecológico, essas diferenças poderiam estar por trás da capacidade do animal

em responder adaptativamente à variedade de pistas sincronizadoras existentes no

ambiente natural (Glass et al. 2001).

- Efeito do Escuro

Como o escuro é a ausência de luz, seria de esperar que as respostas a pulsos de

escuro fossem o oposto do desencadeado por pulsos de luz. Porém, isso é observado

apenas em algumas fases circadianas, enquanto em outras fases as respostas são

semelhantes às desencadeadas por estímulos não-fóticos (Rosenwasser & Dwyer 2001,

2002). Como o impedimento de acesso à roda de atividade atenua as mudanças de fase

a pulsos de escuro, propõe-se que as mudanças de fase por pulsos de escuro são

mediadas por atividade (Mrosovsky 1995).

23

Entretanto, hamsters da linhagem Syrian apresentaram avanços de fase a pulsos

de escuro no meio e no final do dia subjetivo e no início da noite subjetiva e atrasos de

fase entre o final da noite subjetiva e o início do dia subjetivo, independentes do nível

de atividade (Mendoza, Dardente, Escobar, Pevet & Challet 2004; Rosenwasser &

Dwyer 2001, 2002). Além disso, a restrição física bloqueou as mudanças de fase

induzidas pelo escuro no meio do dia subjetivo. No início da noite subjetiva, a

restrição física e o pulso de escuro produziram mudanças de fase independentes que se

somaram. Essas observações dão suporte à hipótese dos autores de que as mudanças de

fase induzidas por escuro dependem de mecanismos diferentes de acordo com as fases

circadianas. Especificamente, mudanças de fase induzidas por escuro podem refletir

um mecanismo não-fótico durante o meio do dia subjetivo, quando os níveis de

atividade são normalmente mínimos, e um mecanismo de imagem especular fótica no

início da noite subjetiva, quando os níveis de atividade são normalmente máximos

(Rosenwasser & Dwyer 2002). Porém, são os animais noturnos que estão em vigília e

com elevados níveis de atividade no início da noite subjetiva. Sendo assim, seria

esperado que os animais diurnos apresentassem respostas opostas a pulsos de escuro

no início da noite subjetiva. Contudo, não é isso que se observa.

A CRF para pulsos de escuro em Octodon degus, um roedor diurno, é

semelhante à CRF para animais noturnos (Labyak e Lee 1997). Além disso, sagüis

(Callithrix jacchus) cegos ou com visão normal apresentaram atrasos de fase na

atividade motora após pulsos no início do dia subjetivo e avanços de fase após pulsos

no final do dia subjetivo (Silva, Albuquerque, Araujo 2005), ou seja, respostas

semelhantes às do degus e de roedores noturnos. Essas mudanças de fase não foram

decorrentes da inibição da atividade, como se poderia imaginar pelo fato do sagüi ser

um animal diurno. Embora os pulsos de escuro tenham inibido a atividade

(mascaramento negativo) nos sagüis com visão normal, o mesmo não aconteceu nos

cegos, a despeito do fato de ambos os grupos mostrarem mudanças de fase com esses

pulsos. Esses resultados dão suporte à hipótese proposta por Rosenwasser & Dwyer

(2001, 2002) de que as mudanças de fase induzidas por pulsos de escuro durante o fim

do dia subjetivo e o início da noite subjetiva são mediadas por um mecanismo de

imagem especular fótica, independente do nível de atividade locomotora.

24

- Interação entre estímulos fóticos e não-fóticos

Nas situações reais, múltiplas interações entre pistas fóticas e não-fóticas devem

ser importantes para o ajuste de fase diário do relógio circadiano e o controle da

organização temporal de todo o organismo. Por exemplo, a exposição à luz durante o

dia pode modificar o processamento de sinais não-fóticos pelo NSQ, assim como

fatores não-fóticos podem modular respostas circadianas a pulsos de luz durante a

noite e a mudanças no ângulo de fase da sincronização ao ciclo claro-escuro (Challet

& Pévet 2003). A resposta do sistema circadiano a diferentes estímulos fóticos e não-

fóticos é de grande importância porque implica que os sistemas circadianos são

capazes de usar muitas fontes de informação (Silva et al. 2005).

Por exemplo, foi demonstrado que Octodon degus, um roedor diurno da

América do Sul, ressincroniza mais rapidamente após mudanças de fase do ciclo de luz

devido a experiências sociais, e que essa aceleração é dependente do olfato. Por outro

lado, não foi observada sincronização mútua nesses animais. Dessa forma, pistas

sociais são consideradas zeitgebers fracos em degus (Goel & Lee 1995ab, 1996; Goel,

Lee, Pieper 1998).

O hamster Mesocricetus auratus também ressincroniza mais rapidamente a

avanços de fase após experiências sociais, como a proximidade do macho a uma fêmea

no estro durante as três primeiras horas no primeiro dia após um avanço de fase de 8

horas no ciclo CE. Contudo, machos que acasalaram com fêmeas não apresentaram

aceleração na ressincronização (Honrado & Mrosovsky 1989).

Em primatas, pistas sociais aceleram a ressincronização fótica em sagüis

durante atrasos de fase, possivelmente associado à maior captação de luz em

decorrência do aumento na atividade dos animais na presença de um co-específico

previamente sincronizado (Mendes 2004).

O ser humano está cada vez mais sujeito a variações bruscas na exposição ao

fotoperíodo, devido à luz artificial, ao horário de verão, às viagens transmeridianas,

que provocam os sintomas de jet lag, ou ao trabalho em turno, em que os trabalhadores

não têm horário fixo para trabalhar, o que gera muitas doenças, inclusive desordens do

sono (Wittmann, Dinich, Merrow, Roenneberg 2006). Além destes, pessoas com

25

cegueira total que não conseguem sincronizar ao ambiente externo sofrem as mesmas

conseqüências (Mistlberger & Skene 2005).

Com o objetivo de encontrar medidas comportamentais que minimizem os

efeitos ocasionados pelas situações citadas acima e que auxiliem na ressincronização

ao ambiente externo, vários estudos avaliaram a interação do exercício físico com a

luz. Em um desses estudos, hamsters apresentaram avanços de fase de 2-3 h após

pulsos de 3 h de corrida na roda de atividade induzida por novidade, do início para o

meio do dia subjetivo. Essa mudança de fase foi quase totalmente anulada por um

pulso de luz aplicado logo após o pulso de exercício, enquanto um pulso de luz

aplicado cerca de 8 h após o pulso de exercício potencializou a mudança de fase.

Comparando esses resultados com aquele desencadeado apenas por pulsos de luz,

observa-se que as mudanças de fase fóticas e não-fóticas não se combinam

aditivamente (Mrosovsky 1991).

Pessoas que praticaram diariamente exercício à noite sob luz fraca (~ 0,65 lux),

após um atraso de fase de 9 horas no ciclo vigília-sono, apresentaram atrasos de fase

significativos no ritmo circadiano da melatonina, sendo a magnitude da resposta

dependente do horário circadiano em que foi efetuado (Barger, Wright, Hughes,

Czeisler 2004). Segundo os autores pode existir um possível efeito sinérgico da luz

com o exercício, já que a magnitude dos atrasos de fase desencadeados pelo exercício

realizados sob luz fraca é menor do que quando o exercício é realizado sob luz forte.

Por isso, o exercício é investigado como uma medida comportamental facilitadora da

adaptação circadiana a atrasos de fase no ciclo sono-vigília (Barger et al. 2004;

Mrosovsky 1991).

A combinação de mudanças de fase fóticas e não-fóticas é complexa, sendo

parcialmente somadas e não lineares. O NSQ parece integrar várias informações do

ambiente para ajustar a sincronização fótica, porém, os mecanismos neuronais

responsáveis por essa integração ainda estão muito distantes de serem compreendidos

(Challet & Pévet 2003). Portanto, faz-se importante investir em estudos que avaliem o

efeito da associação de pistas fóticas e não-fóticas sobre o STC, visto que é dessa

maneira que esse sistema recebe as informações do ambiente natural e promove a

sincronização dos ritmos circadianos. Esses estudos servirão como base para a busca

26

de alternativas que minimizem os efeitos provocados pelas situações que provocam

distúrbios na expressão da ritmicidade circadiana, assim como alternativas para

facilitar a ressincronização. Dessa forma, os prejuízos para o organismo podem ser

minimizados e a qualidade de vida das pessoas que sofrem com esses problemas,

melhorada (Mistlberger & Skene 2005). Contudo, antes é necessário conhecer como

cada pista age isoladamente sobre o STC para entender o efeito associado,

principalmente o efeito das pistas sociais. Visto que, como os humanos vivem

organizados em sociedade, este tipo de pista deve ter um papel muito importante no

ajuste de fase diário dos ritmos circadianos ao ambiente.

c) O sagüi como modelo experimental

O sagüi (Callithrix jacchus) é um pequeno primata neotropical encontrado no

nordeste do Brasil. Por ter boa adaptação às condições de cativeiro e laboratoriais é

muito usado em pesquisas biomédicas (Abbott et al. 2003). Em ambiente natural vive

em grupos sociais compostos de 3 a 15 animais (Stevenson & Rylands 1988).

É um animal estritamente diurno, com os padrões de atividade variando intra e

inter-individualmente. Geralmente, apresenta um perfil bimodal na atividade motora

diária (Erkert 1989; Menezes, Moreira, Azevedo, Costa, Castro 1993; Moreira et al.

1991). Sob condições ambientais constantes exibe ritmos circadianos de atividade

motora estáveis (Erkert 1989; Glass et al. 2001), com o período endógeno em torno de

23,3 ± 0,4 h (Erkert 1989; Glass et al. 2001; Silva et al. 2005). O ritmo circadiano de

atividade ressincroniza mais rapidamente a atrasos de fase do que a avanços de fase no

ciclo CE (Erkert 1989).

Nesta espécie, fatores sociais, como nascimentos de filhotes, estado reprodutivo

da fêmea, status social e tamanho do grupo, influenciam o ritmo circadiano de catação

(Azevedo et al. 2001), comportamento de extrema importância social por favorecer o

estabelecimento, manutenção e fortalecimento dos laços afiliativos entre os animais

(Yamamoto 1991).

A comunicação acústica também deve ser muito importante na interação entre

os animais, já que são arborícolas e normalmente vivem em lugares de vegetação

densa, onde o contato visual entre eles é mais difícil. Portanto, uma das formas mais

27

eficientes de comunicação em seu habitat natural deve ser através das vocalizações

(Epple 1968; Schrader & Todt 1993). Além disso, cada vocalização tem uma função

social. Por exemplo, phee e twitter, considerados “chamadas de contato”, são emitidos

com a função de manutenção de contato entre os animais do grupo, mesmo quando há

uma grande distância entre eles, ou para se comunicarem com outros grupos. Tsee e

tsik têm sons semelhantes, porém estruturas e funções diferentes. O primeiro é

vocalizado em encontros agonistas com co-específicos, enquanto o segundo é

vocalizado para avisar da presença de predadores (Epple 1968). Em suma, o sinal

sonoro é uma pista social muito importante para os sagüis.

Devido a essa importância social, Erkert et al. (1986) e Erkert & Schardt (1991)

avaliaram a eficácia de sinais sonoros como sincronizadores do ritmo circadiano da

atividade motora de sagüis. Eles encontraram que os sinais sonoros emitidos por co-

específicos são um zeitgeber fraco e que a sincronização social é dependente do grau

de parentesco entre os indivíduos e da proximidade de seus períodos endógenos. Em

estudo posterior foi analisado o efeito de pulsos de vocalizações de co-específicos

associados à presença de um espelho. Contudo, as respostas de fase encontradas foram

semelhantes às respostas de fase induzidas por pulsos de luz (Wechselberger 1994).

Como os sagüis estavam sob claro constante de 430 lux, é provável que a ativação

comportamental provocada pelos pulsos tenha aumentado a quantidade de luz recebida

pelos sagüis e que as mudanças de fase tenham sido primariamente fóticas, ao invés de

não-fóticas. Outra possibilidade é que as respostas de fase sejam decorrentes da

interação do estímulo fótico com o não-fótico.

O mecanismo envolvido na ação de vocalizações de co-específicos sobre o

ritmo circadiano da atividade motora de sagüis ainda não é bem compreendido, na

medida em que não foi avaliado de forma sistematizada na ausência de luz. Além

disso, a caracterização do efeito de estímulos não-fóticos sobre o STC em mamíferos

diurnos ainda é escassa quando comparada aos noturnos, particularmente no que diz

respeito à avaliação de pistas não-fóticas com significado ecológico.

O fato de o sagüi ser um primata social diurno, semelhante ao homem, e de fácil

adaptação ao cativeiro, torna-o um excelente sujeito experimental para se testar os

efeitos dos diferentes estímulos não-fóticos, especialmente os sociais, pois os achados

28

para esse animal podem servir de base para estudos em humanos. Portanto, é

extremamente importante caracterizar a ação das pistas não-fóticas na ausência da luz

sobre o ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis, para possibilitar o

entendimento de sua atuação em conjunto com as pistas fóticas sobre esse ritmo.

Como o escuro induz mudanças de fase, faz-se necessário, como controle, avaliar seu

efeito sobre o ritmo circadiano de atividade motora.

29

2. Objetivos

Objetivo Geral

Verificar o efeito de pulsos de vocalizações de co-específicos e de escuro sobre

o ritmo circadiano de atividade motora em sagüis.

Objetivos Específicos

• Comparar as respostas de fase do ritmo circadiano de atividade motora de

sagüis após:

- pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro;

- pulsos de escuro.

• Avaliar o potencial sincronizador da reprodução de vocalizações de co-

específicos em escuro total sobre o ritmo circadiano de atividade motora de

sagüis.

Hipóteses e Predições

H1) O efeito de estímulos não-fóticos sobre o ritmo circadiano da atividade motora é

independente da natureza do estímulo.

P1) As respostas de fase desencadeadas pelos pulsos de vocalizações de co-

específicos em escuro total terão características semelhantes às da curva de

resposta de fase para estímulos não-fóticos descritas em trabalhos anteriores.

30

H2) Mudanças de fase por pulsos de escuro são mediadas por mecanismo não-fótico

durante o dia subjetivo e no final da noite subjetiva, e via mecanismo imagem

especular fótico no fim do dia subjetivo e início da noite subjetiva.

P2.1) As respostas de fase aos pulsos de escuro durante o dia subjetivo e no

final da noite subjetiva terão características semelhantes às desencadeadas pelos

pulsos de vocalizações de co-específicos.

P2.2) As respostas de fase aos pulsos de escuro no fim do dia subjetivo e no

início da noite subjetiva terão características opostas às desencadeadas por

pulsos de luz.

H3) Vocalizações de co-específicos sincronizam o ritmo circadiano da atividade

motora de sagüis.

P3) A reprodução diária de vocalizações de co-específicos sincronizará o ritmo

circadiano da atividade motora dos sagüis.

31

3. Metodologia

a) Sujeito Experimental

Foram estudados 7 sagüis (Callithrix jacchus) machos adultos entre 3 e 6 anos

de idade, sem parentesco, nascidos em cativeiro no Núcleo de Primatologia da UFRN,

à exceção de Pipoca, de origem selvagem. Antes do experimento cada animal estava

sob condições ambientais naturais em uma gaiola que impedia apenas o contato físico

entre os animais. Cada animal foi identificado de acordo com o cadastro do Núcleo

(Quadro 1).

Quadro 1: Animais observados nesse trabalho. Nome Idade no Início do Experimento Peso Médio ± DP (gr)

BorgesC 5 anos 351 ± 21DokoC 5 anos 451 ± 8

PipocaS 3 anos 308 ± 14PaoloC 6 anos 367 ± 15

XerxesC 5 anos 381 ± 24LuizC 3 anos 341 ± 11

XandoC 6 anos 301 ± 16

C nascido em cativeiro no Núcleo de Primatologia da UFRN, S selvagem.

O estado de saúde dos animais foi acompanhado através da observação dos

padrões de atividade motora e comportamento, medidas dos pesos corporais e do

registro da ingestão alimentar. Esse registro foi obtido pela diferença entre as pesagens

dos pratos antes de serem colocados nas gaiolas pela manhã e após serem retirados à

tarde. A maioria dos animais apresentou bom estado de saúde e peso regular durante

todo o experimento (Quadro 1). Dois animais, Xando e Pipoca, apresentaram sintomas

da Síndrome de Emagrecimento Progressivo (SEP) (Schroeder, Osman, Roggenbuck

& Mothes 1999) sendo retirados da sala experimental antes do término do experimento

(figura 2). Xando permaneceu no experimento entre 27 de abril e 24 de agosto de

2006, quando foi retirado da sala experimental, e em sua gaiola foi colocado Doko.

Pipoca permaneceu no experimento entre 27 de abril de 2006 e 02 de janeiro de 2007.

32

Mês Borges Doko Pipoca Paolo Xerxes Luiz Xandoabr-06mai-06jun-06jul-06

ago-06set-06out-06nov-06dez-06jan-07fev-07

mar-07abr-07

Figura 2: As barras cinzas representam o tempo de permanência de cada animal no experimento.

b) Condições de Manutenção

Cada sagüi foi mantido em uma gaiola de tela de arame com 76 cm de altura x

40 cm de largura x 60 cm de profundidade, equipada com comedouro, bebedouro,

poleiro e toca de PVC pintada de preto no interior para evitar a entrada de luz. Foi

utilizado um anteparo branco de madeira entre cada gaiola que evitava o contato visual

e físico entre os animais, porém não impedia o contato auditivo e olfativo entre eles

(Figuras 3 e 4).

Figura 3: Disposição das gaiolas na sala experimental no Núcleo de Primatologia da UFRN. São observados sensores de movimento por infravermelho sobre cada gaiola, anteparos de madeira brancos entre cada gaiola, que impedem o contato físico e visual entre os sagüis, os potes de passas, os comedouros, os poleiros e as tocas de pvc.

33

Os animais tinham água, ração para primatas (Megazoo P-25, fabricante Vale

Verde Destilaria e Parque Ecológico, Minas Gerais, Brasil) e uva-passa ad libitum. A

alimentação era fornecida duas vezes ao dia: pela manhã entre 05:30 e 11:00 h, e à

tarde entre 12:00 e 19:00 h. Pela manhã os sagüis recebiam papa* e frutas da época,

como banana, melancia, mamão, manga, entre outras. À tarde, a alimentação colocada

pela manhã era substituída por frutas da época ou batata-doce cozida. Adicionalmente

eles recebiam leite fermentado com lactobacilos vivos, goma arábica ou ovo em dias e

horários aleatórios, como formas de reforço alimentar e enriquecimento ambiental.

Figura 4: Gaiolas da sala experimental em detalhe. É possível observar os sagüis separados por anteparos brancos de madeira, os comedouros, as garrafas d’água, os poleiros, as tocas de pvc, os potes de passas e um sensor de movimento por infravermelho sobre cada gaiola.

Os sagüis foram mantidos em uma sala com isolamento acústico parcial, que

possibilitava a entrada de silvos longos, denominados phees, emitidos pelos co-

específicos da colônia.

* Papa – composta por leite, água, pão, ovos, cereais, açúcar, banana, reforçada com vitaminas A e D, cálcio,

aminoácidos e ferro.

34

A temperatura média da sala foi 26,7 ± 0,3°C e a média da umidade relativa do

ar foi 78,2 ± 6%. A renovação do ar foi feita por um exaustor ligado em dias e horários

aleatórios.

Inicialmente a condição de iluminação da sala foi de claro-escuro (CE) 12:12 (~

300:2 lux), sendo a fase de claro entre 07:00 e 19:00 h. Posteriormente, a condição de

iluminação passou a ser claro constante (CC) fraco de aproximadamente 2 lux. Na fase

de claro do CE, a iluminação da sala foi realizada por quatro lâmpadas fluorescentes

de luz branca de 32 watts (~ 300 lux). Na fase de escuro do CE e durante o CC fraco, a

iluminação foi realizada por uma pequena lâmpada incandescente de luz amarela de 7

watts (~ 2 lux).

c) Procedimentos (Figura 6)

c1) Adaptação

Para adaptação às condições ambientais e às gaiolas da sala experimental, os

animais ficaram entre 26 de abril e 17 de julho de 2006 (~ 83 dias) sob CE 12:12 (~

300:2 lux), sendo a fase de claro entre 7:00 e 19:00 h. Como no cativeiro em ambiente

natural, onde eles estavam, a fase de claro inicia em torno das 05:00 h e a de escuro em

torno das 17:00 h, eles sofreram um atraso de fase de 2 horas ao serem transferidos

para a sala experimental.

c2) Estímulos Não-Fóticos

- Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro

Após a fase de adaptação, os animais ficaram sob CC fraco de

aproximadamente 2 lux até o ritmo circadiano da atividade motora (RCA) endógeno

da maioria dos animais se expressar de forma estável. Então, foi aplicado um pulso de

vocalizações de co-específicos em escuro total entre 7:30 h e 08:30 h (horário local),

sendo esse procedimento repetido após 22 dias.

Para excluir a influência da presença do pesquisador nas respostas aos pulsos, a

caixa de som foi colocada na Sala 2 alguns dias antes e os fios colocados através da

porta, no dia anterior à aplicação dos pulsos de vocalizações associados ao escuro

(figura 5). O timer (programador de horário eletromecânico) foi ajustado no dia

35

anterior à aplicação dos pulsos. Dessa forma, para a aplicação dos pulsos, o

pesquisador entrava apenas na Sala 1, onde conectava os fios da caixa de som ao

“notebook”, que reproduzia as vocalizações através do programa “Windows Media

Player”, com intensidade de ∼ 92 decibéis.

As vocalizações foram gravadas de animais em cativeiro em ambiente natural

no Núcleo de Primatologia da UFRN, entre 5:20 e 7:00 h da manhã, nos dias 04 de

junho, 01, 07 e 08 de novembro de 2006. As gravações foram feitas através de um

microfone (Electret Condenser Telescopic Microphone V-6502, fabricante Saul

Mineroff Electronics, NY, USA) conectado a um gravador Tascan DA-P1 DAT

(fabricante TEAC Corporation, Tokyo, Japão). A gravação era composta por phee,

twitter, peep de animais adultos e tsik de adultos e filhotes (Epple 1968), que eram

reproduzidos aleatoriamente com o objetivo de evitar habituação à seqüência da

reprodução. Os animais da sala experimental vocalizavam freqüentemente durante a

reprodução das vocalizações, principalmente após a reprodução de phee.

- Pulsos de Escuro

Após a etapa dos pulsos de vocalizações de co-específicos, foram aplicados dois

pulsos de escuro entre 07:30 h e 08:30 h (horário local), com intervalo de 14 dias entre

eles. Para excluir a influência da presença do pesquisador nas respostas aos pulsos, o

timer era ajustado no dia anterior à aplicação dos pulsos.

- Reprodução de vocalizações de co-específicos em escuro diariamente

Com o objetivo de sincronizar o ritmo circadiano da atividade motora dos

sagüis foram aplicados pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro total entre

19:00 h e 20:00 h, por 5 dias consecutivos. Após 21 dias o procedimento foi repetido

durante 30 dias consecutivos. Os pulsos diários foram executados da mesma forma que

os pulsos isolados descritos anteriormente.

36

Fio

Mesa

LuizBorges Doko Pipoca Paolo

Sala Experimental

Sala 2

Sala 1

Xerxes

PC

G7

CS

Figura 5: Diagrama das salas onde foi realizado o experimento. Como o exaustor de ar ficava na Sala 2, a porta entre esta sala e a sala experimental era mantida aberta, enquanto as outras portas eram mantidas fechadas. A gaiola 7 ficou vazia durante todo o experimento. Durante o tempo em que ficou no experimento, Xando permaneceu na gaiola que foi ocupada posteriormente por Doko. (PC – computador; CS – caixa de som; EX – exaustor de ar; G7 – gaiola 7).

d) Método de coleta de dados

A atividade motora dos sagüis foi registrada continuamente através de sensores

de movimento por infravermelho sobre as gaiolas (Figuras 3 e 4), conectados a um

computador através de uma placa de aquisição de dados da National Instruments (NI

PCI – 6025E). Os dados foram totalizados e registrados em intervalos de 5 minutos

pelo software Aschoff (desenvolvido pelo Laboratório de Cronobiologia – UFRN).

EX

37

CE 12:12 (07:00 às 19:00 h) – 83 dias ↓

CC fraco – 137 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 07:30 h (02/12/06) ↓

CC fraco – 22 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 07:30 h (25/12/06) ↓

CC fraco – 19 dias ↓

1h Pulso de escuro às 07:30 h (14/01/07) ↓

CC fraco – 14 dias ↓

1h Pulso de escuro às 07:30 h (29/01/07) ↓

CC fraco – 14 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 19:00 h – 5 dias (13 a 17/02/07) ↓

CC fraco – 21 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 19:00 h – 30 dias (11/03 a 09/04/07) ↓

CC fraco – 17 dias

Figura 6: Esquema das condições a que os sagüis foram expostos com a data e a duração de cada fase. A duração total do experimento foi 366 dias.

e) Análise dos dados

O ritmo circadiano da atividade motora (RCA) de cada sagüi foi analisado

através de inspeção visual dos actogramas, do cálculo do período endógeno (τ) e da

duração da fase ativa (α) por décadas*, nas condições de iluminação de CE e CC fraco

ao longo de todo o experimento. Por meio do programa El Temps (Díez-Noguera,

Barcelona, Espanha) foram construídos os actogramas, calculado o α e calculado o τ�

utilizando o periodograma Lomb-Scargle.

A análise visual dos actogramas apontou modulações no RCA dos animais em

função da coincidência de suas fases ativas com as horas iniciais da atividade dos

animais da parte externa da colônia. Para avaliar a influência desses animais da parte

externa, foram comparados o τ e o α pelo teste t para amostras dependentes, entre os

*Década – 10 dias.

38

dias em que a fase ativa dos animais da sala experimental coincidiam com o horário

entre o nascer do sol e 08:00 h do ambiente externo e os dias em que não coincidiam.

Esta análise abrangeu os dados do primeiro dia de CC até o dia imediatamente anterior

ao início da etapa de aplicação diária de pulsos de vocalização.

Para a análise das respostas de fase após os pulsos foram estimados os horários

do início da atividade no dia seguinte a cada pulso, pela regressão linear com o método

dos quadrados mínimos utilizando o início da atividade dos 7 dias anteriores e do

segundo ao sétimo dia posterior ao pulso. As respostas de fase foram determinadas

pela diferença entre o início da atividade estimado com base nos 7 dias anteriores ao

pulso e o início da atividade calculado com base no segundo ao sétimo dia posterior ao

pulso. Para essa análise, como início da atividade foi considerado o primeiro intervalo

de 15 minutos com valor superior ou igual a 10% da média horária diária, que se

mantinha por um mínimo de 30 minutos dentro de 1 hora (critério adaptado a partir de

Glass et al. 2001).

As horas circadianas (HCs) atingidas pelos pulsos foram definidas com base no

τ definido pelo periodograma Lomb-Scargle a partir dos dez dias imediatamente

anteriores a cada pulso.

Para avaliar o efeito sincronizador dos pulsos aplicados entre 19:00 h e 20:00 h

(horário local) diariamente, foi realizada inspeção visual dos actogramas e análise do τ

nas duas etapas de aplicações de pulsos. Na primeira etapa, durante os 5 dias de

aplicação dos pulsos e nas 2 décadas anteriores e posteriores. Na segunda etapa, nas 3

décadas durante a aplicação dos pulsos e nas 2 décadas anteriores e posteriores. O

Teste t para amostras dependentes foi utilizado para comparar o τ dos sagüis entre as

décadas.

O nível de significância considerado para todos os testes estatísticos foi de 95%

(p ≤ 0,05).

39

4. Resultados

• Ritmo circadiano da atividade motora ao longo do experimento

Sob CE 12:12, todos os animais apresentaram o ritmo circadiano de atividade

motora (RCA) com período de 24 h e duração da fase ativa (α) média de 10,7 ± 0,7 h

(Tabela 1). Durante todo o tempo sob CC fraco os animais exibiram o RCA com

período endógeno (τ) médio de 23,6 ± 0,3 h e α médio de 9,4 ± 1,2 h. Os dados da

atividade motora de Xando não foram analisados por ele ter sido retirado do

experimento antes das manipulações experimentais.

Tabela 1: Média e desvio padrão do período endógeno (τ) e da duração da fase ativa (α) dos sagüis durante as condições de iluminação de claro-escuro 12:12 (∼300:2 lux) e claro constante fraco (∼2 lux).

Animal tau (CE) α (CE) α (CC)Borges 24 9,0 ± 1,0 8,6 ± 1,2Doko 24 9,6 ± 2,0

Pipoca 24Paolo 24 10,1 ± 0,7 9,2 ± 0,9

Xerxes 24 11,2 ± 0,5 10,2 ± 1,0Luiz 24 12,6 ± 0,5 9,3 ± 0,7

Todos 24 10,7 ± 0,7 9,4 ± 1,223,6 ± 0,3

23,4 ± 0,423,6 ± 0,2

23,7 ± 0,323,8 ± 0,423,9 ± 0,523,1 ± 0,2

tau (CC)

Ao longo do CC fraco foram observadas mudanças no τ, no α e na amplitude

(figuras 7 a 14). O τ tendeu a diminuir com o tempo. Contudo, quando a fase ativa dos

sagüis coincidiu com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h no ambiente externo,

ocorreu alongamento do τ e da duração da fase ativa (α), juntamente com aumento na

intensidade da atividade (figuras 7 e 8). O τ alongou em todos os animais (t[20] = 8,29;

p < 0,01), enquanto apenas Paolo (t[8] = 2,9; p < 0,05) e Xerxes (t[5] = 2,9; p <0,05)

alongaram o α. Algumas vezes o τ assumiu o valor de 24 h, persistindo dessa forma

por vários dias (Tabela 1 e figuras 9, 10, 12 e 13). Somente Paolo não exibiu τ de 24 h

em momento algum (figura 11). Essas modulações geralmente eram mais evidentes

quando o fim da atividade coincidia com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h no

ambiente externo (figuras 9 a 14).

40

22,5

22,8

23,1

23,4

23,7

24,0

24,3

CE N C N C N C N C N C N C N C N C N

Relação com a fase ativa da co lônia

Borges

Doko

Paolo

Xerxes

Luiz

Figura 7: Período endógeno (τ) do ritmo circadiano da atividade motora em relação à coincidência (C) e não coincidência (N) da fase ativa dos sagüis em experimento com a fase ativa dos sagüis da colônia entre o nascer do sol e 08:00 h da manhã do ambiente externo durante o experimento (Periodograma Lomb-Scargle). Não foram incluídos nesse gráfico os dados da atividade dos sagüis após o início da aplicação dos pulsos diários de vocalizações de co-específicos em escuro total. CE refere-se à etapa em que os animais estavam sob claro-escuro 12:12.

6

7

8

9

10

11

12

13

CE N C N C N C N C N C N C N C N C N

Relação com a fase ativa da colônia

Borges

Doko

Paolo

Xerxes

Luiz

Figura 8: Média e desvio padrão da duração da fase ativa (α) em relação à coincidência (C) e não coincidência (N) da fase ativa dos sagüis em experimento com a fase ativa dos sagüis da colônia entre o nascer do sol e 08:00 h da manhã do ambiente externo durante o experimento. Não foram incluídos nesse gráfico os dados da atividade dos sagüis após o início da aplicação dos pulsos diários de vocalizações de co-específicos em escuro total. CE refere-se à etapa em que os animais estavam sob claro-escuro 12:12.

41

Para a maioria dos animais, as mudanças observadas no RCA relacionadas à

coincidência ou não da fase ativa dos sagüis com o horário entre o nascer do sol e

08:00 h no ambiente externo, tenderam a diminuir ao longo do CC fraco (figuras 9 a

12). A única exceção foi Luiz, cujas mudanças tenderam a ser mais evidentes com o

decorrer do tempo de manutenção em CC fraco (figura 13).

Pipoca apresentou o RCA diferente de todos durante o CC fraco (figura 14). Do

primeiro dia sob a condição de iluminação constante até 08 de agosto, expressou o

RCA em livre-curso de forma estável com τ médio de 23,1 ± 0,5 h. A partir de 09 de

agosto, o τ alongou assumindo o valor médio de 23,9 ± 0,2 h, ou seja, próximo a 24 h.

Depois de 04 de dezembro o τ alongou mais ainda, passando a ser maior que 24 h

(24,3 ± 0,6 h). Além dessas mudanças no período, ocorreram mudanças na intensidade

da atividade, que reduziu entre 09 de agosto e 20 de outubro. Em seguida, a

intensidade da atividade aumentou juntamente com o α, o que impossibilitou a

determinação dos horários de início e fim de sua atividade, necessários para a análise

de dados. Por esse motivo e pelo fato de Pipoca apresentar sintomas da SEP, seus

dados foram excluídos das análises das respostas aos pulsos de vocalizações

associadas ao escuro e da variação do α e do τ ao longo do experimento.

42

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48Hora do Dia

6/jul

13/jul

20/jul

27/jul

3/ago

10/ago

17/ago

24/ago

31/ago

7/set

14/set

21/set

28/set

5/out

12/out

19/out

26/out

2/nov

9/nov

16/nov

23/nov

30/nov

7/dez

14/dez

21/dez

28/dez

4/jan

11/jan

18/jan

25/jan

1/fev

8/fev

15/fev

22/fev

1/mar

8/mar

15/mar

22/mar

29/mar

5/abr

12/abr

19/abr

26/abr

Dat

a

Figura 9: Actograma da intensidade da atividade motora de Borges ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 9 (Vocalizações)

HC 15 (Vocalizações)

HC 2 (Escuro)

HC 8

5 dias de Vocalizações

30 dias de Vocalizações

43

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48Hora do Dia

6/jul

13/jul

20/jul

27/jul

3/ago

10/ago

17/ago

24/ago

31/ago

7/set

14/set

21/set

28/set

5/out

12/out

19/out

26/out

2/nov

9/nov

16/nov

23/nov

30/nov

7/dez

14/dez

21/dez

28/dez

4/jan

11/jan

18/jan

25/jan

1/fev

8/fev

15/fev

22/fev

1/mar

8/mar

15/mar

22/mar

29/mar

5/abr

12/abr

19/abr

26/abr

Dat

a

Figura 10: Actograma da intensidade da atividade motora de Doko ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia.Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 9 (Vocalizações)

HC 9 (Vocalizações)

HC 11 (Escuro)

HC 10 (Escuro)

5 dias de Vocalizações

30 dias de Vocalizações

44

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48Hora do Dia

6/jul

13/jul

20/jul

27/jul

3/ago

10/ago

17/ago

24/ago

31/ago

7/set

14/set

21/set

28/set

5/out

12/out

19/out

26/out

2/nov

9/nov

16/nov

23/nov

30/nov

7/dez

14/dez

21/dez

28/dez

4/jan

11/jan

18/jan

25/jan

1/fev

8/fev

15/fev

22/fev

1/mar

8/mar

15/mar

22/mar

29/mar

5/abr

12/abr

19/abr

26/abr

Dat

a

Figura 11: Actograma da intensidade da atividade motora de Paolo ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 15 (Vocalizações)

HC 15 (Vocalizações)

HC 14 (Escuro)

HC 8 (Escuro)

5 dias de Vocalizações

30 dias de Vocalizações

45

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48Hora do Dia

6/jul

13/jul

20/jul

27/jul

3/ago

10/ago

17/ago

24/ago

31/ago

7/set

14/set

21/set

28/set

5/out

12/out

19/out

26/out

2/nov

9/nov

16/nov

23/nov

30/nov

7/dez

14/dez

21/dez

28/dez

4/jan

11/jan

18/jan

25/jan

1/fev

8/fev

15/fev

22/fev

1/mar

8/mar

15/mar

22/mar

29/mar

5/abr

12/abr

19/abr

26/abr

Dat

a

Figura 12: Actograma da intensidade da atividade motora de Xerxes ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 1 (Vocalizações)

HC 19 (Escuro)

HC 10 (Vocalizações)

HC 10 (Escuro)

5 dias de Vocalizações

30 dias de Vocalizações

46

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48Hora do Dia

6/jul

13/jul

20/jul

27/jul

3/ago

10/ago

17/ago

24/ago

31/ago

7/set

14/set

21/set

28/set

5/out

12/out

19/out

26/out

2/nov

9/nov

16/nov

23/nov

30/nov

7/dez

14/dez

21/dez

28/dez

4/jan

11/jan

18/jan

25/jan

1/fev

8/fev

15/fev

22/fev

1/mar

8/mar

15/mar

22/mar

29/mar

5/abr

12/abr

19/abr

26/abr

Dat

a

Figura 13: Actograma da intensidade da atividade motora de Luiz ao longo do experimento. As barras cinza representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinza marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 18 (Escuro)

HC 3 (Escuro)

HC 9 (Vocalizações)

HC 23 (Vocalizações)

5 dias de Vocalizações

30 dias de Vocalizações

47

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48Hora do Dia

6/jul

13/jul

20/jul

27/jul

3/ago

10/ago

17/ago

24/ago

31/ago

7/set

14/set

21/set

28/set

5/out

12/out

19/out

26/out

2/nov

9/nov

16/nov

23/nov

30/nov

7/dez

14/dez

21/dez

28/dez

4/jan

11/jan

18/jan

25/jan

1/fev

8/fev

15/fev

22/fev

1/mar

8/mar

15/mar

22/mar

29/mar

5/abr

12/abr

19/abr

26/abr

Dat

a

Figura 14: Actograma da intensidade da atividade motora de Pipoca ao longo do experimento. As barras cinza representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinza marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total. À direita do actograma está apenas a HC atingida pelo pulso aplicado em 02/12, pois não foi possível determinar a HC atingida pelo pulso em 25/12. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 8 (Vocalizações)

48

• Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro

Todas as mudanças de fase com os respectivos níveis de significância estão

descritos na Tabela 2. Apenas as médias e o desvio padrão das mudanças de fase

estatisticamente significativas (p ≤ 0,05) estão representadas na figura 15. Observam-

se atrasos de fase quando os pulsos incidem nas HCs 1 (-53 min) e 10 (-93 min) e a

predominância de avanços de fase quando os pulsos incidem nas HCs 9 (+11 ± 17

min) e 15 (+44 ± 67 min).

Os animais estiveram ativos sempre que os pulsos incidiram no final da noite

subjetiva (HC 23), no início do dia subjetivo (HC 1), e algumas vezes no final do dia

subjetivo (HCs 9 e 10) (figuras 9, 12 e 13). Por outro lado, permaneceram em repouso

sempre que os pulsos incidiram no meio da noite subjetiva (HC 15) (figuras 9 e 11).

Embora a mudança de fase de Luiz após o primeiro pulso tenha sido

estatisticamente significativa, não foi colocada na CRF devido à ocorrência de falta de

energia, por aproximadamente 45 minutos, dois dias após o pulso (Tabela 2 e figura

13). Essa falta de energia aconteceu durante a fase ativa do mesmo, agindo como pulso

de escuro. Como na análise das respostas de fase foram utilizados os 7 dias antes e os

7 dias depois dos pulsos, então a resposta obtida pode ter sofrido a influência do pulso

de vocalizações sob escuro previsto no experimento e do pulso de escuro em

decorrência da falta de energia. Não foram evidenciadas mudanças de fase na

atividade dos outros animais em decorrência do pulso de escuro ocasionado por essa

falta de energia que aconteceu durante a fase de repouso (figuras 9 a 12).

Ocorreu outra falta de energia, por aproximadamente 25 minutos, dois dias após a

aplicação do segundo pulso. Contudo não foram evidenciadas mudanças de fase em

decorrência desse pulso de escuro no RCA de nenhum animal, que aconteceu durante a

fase de repouso (figuras 9 a 13).

Devido ao RCA de Doko não estar em livre-curso quando os pulsos foram

aplicados e suas respostas de fase não terem sido estatisticamente significativas (p ≥

0,05), seus dados não foram colocados na CRF (Tabela 2 e figura 10).

49

Tabela 2: Respostas de fase do início da atividade dos sagüis após os pulsos de vocalizações de co-específicos associadas ao escuro total. Níveis de significância para a estimativa do início da atividade no dia seguinte à aplicação do pulso calculados pela regressão linear com o método dos quadrados mínimos a partir do início da atividade 1-7 dias antes e 2-7 dias depois do pulso. Os níveis de significância estatisticamente significativos (p ≤0,05) estão em vermelho.

Animal HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois) HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois)Borges 9 +23 0,000 0,000 15 +16 0,002 0,014Doko 9 +1 0,661 0,005 9 -1 0,204 0,072

Pipoca 8 -36,25 0,381 0,050Paolo 15 +121 0,011 0,000 15 -4 0,000 0,000

Xerxes 10 -95,31 0,001 0,004 1 -54 0,001 0,000Luiz 23 +20 0,000 0,001 9 -1 0,000 0,000

Respostas de Fase do Início da Atividade após os Pulsos de Som Associados ao Escuro Pulso Aplicado em 02/12/2006 Pulso Aplicado em 25/12/2006

Tabela 3: Respostas de fase do início da atividade dos sagüis após os pulsos de escuro total. Níveis de significância para a estimativa do início da atividade no dia seguinte à aplicação do pulso calculados pela regressão linear com o método dos quadrados mínimos a partir do início da atividade 1-7 dias antes e 2-7 dias depois do pulso. Os níveis de significância estatisticamente significativos (p ≤ 0,05) estão em vermelho.

Animal HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois) HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois)Borges 2 -5 0,000 0,000 8 -3 0,000 0,000Doko 11 +3 0,105 0,151 10 -14 0,765 0,065Paolo 14 -3 0,000 0,001 8 +36 0,000 0,001

Xerxes 19 +38 0,000 0,000 10 +15 0,000 0,000Luiz 18 -74 0,001 0,015 3 -72 0,000 0,027

Pulso Aplicado em 14/01/2007 Pulso Aplicado em 29/01/2007Respostas de Fase do Início da Atividade após os Pulsos de Escuro

50

-120

-90

-60

-30

0

30

60

90

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Hora Circadiana (HC)

Min

uto

s

Figura 15: Curva de resposta dependente da fase do início da atividade de sagüis após pulsos de 1h de vocalizações de co-específicos em escuro total. Hora circadiana 0 h (HC 0) corresponde ao início da atividade e as 24 h circadianas representam o período circadiano. Foram apresentadas apenas as mudanças de fase estatisticamente significativas obtidas através da regressão linear com o método dos quadrados mínimos (p ≤

0,05).

-120

-90

-60

-30

0

30

60

90

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Hora Circadiana (HC)

Min

uto

s

Figura 16: Curva de resposta dependente da fase do início da atividade de sagüis após pulsos de 1h de escuro. Hora circadiana 0 h (HC 0) corresponde ao início da atividade e as 24 h circadianas representam o período circadiano. Foram apresentadas apenas as mudanças de fase estatisticamente significativas obtidas através da regressão linear com o método dos quadrados mínimos (p ≤ 0,05).

51

• Pulsos de Escuro

Todas as mudanças de fase com os respectivos níveis de significância estão

descritos na Tabela 3. Apenas as médias e o desvio padrão das mudanças de fase

estatisticamente significativas (p ≤ 0,05) estão representados na figura 16. Observam-

se atrasos de fase quando os pulsos incidem nas HCs 2 (-5 min), 3 (-72 min) e 18 (-74

min), predominância de avanços de fase nas HCs 8 (+16 ± 28 min), 10 (+15 min) e 19

(+38 min), e ausência de mudança na HC 14.

Ocorreu atividade durante os pulsos no início do dia subjetivo (HCs 2 e 3) (figuras

9 e 13), na maioria dos pulsos no final do dia subjetivo (HCs 8, 10 e 11) e apenas em

uma HC no meio da noite subjetiva (HC 18) (figuras 9 a 13). Por outro lado, os

animais permaneceram em repouso durante os pulsos nas HCs 14 e 19 (figuras 11 e

12).

• Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro durante 5 dias

Nenhum animal apresentou uma relação de fase estável entre o RCA e os pulsos de

vocalizações de co-específicos em escuro aplicados diariamente entre 19:00 h e 20:00

h, durante 5 dias. O τ do RCA dos sagüis variou antes, durante e depois dos 5 dias de

pulsos (Figura 17). Durante os pulsos, dois animais alongaram o τ, dois animais

encurtaram o τ, e um exibiu o mesmo τ da década anterior aos 5 dias dos pulsos. Ou

seja, não houve um padrão nas mudanças do τ devido aos pulsos. Além disso, não

houve diferença no τ entre os 5 dias de pulso e as 2 décadas anteriores (Década 1

anterior: t[5] = 0,19, p > 0,05; Década 2 anterior: t[5] = -0,51, p > 0,05) e posteriores

(Década 1 posterior: t[5] = 0,09, p > 0,05; Década 2 posterior: t[5] = -0,2, p > 0,05).

Através da análise visual dos actogramas observou-se que os pulsos incidiram na

fase de repouso de Paolo, Xerxes e Luiz, que se mantiveram em repouso (figuras 11 a

13). Por outro lado, os pulsos incidiram na fase ativa de Borges e Doko, que

continuaram em atividade durante os pulsos. Contudo, Doko apresentou um aumento

na intensidade da atividade durante o pulso, enquanto Borges, após o pulso.

52

22,5

23

23,5

24

24,5

1A 2A 5 DIAS 1P 2P

Década

Borges

Doko

Paolo

Xerxes

Luiz

Figura 17: Período endógeno do ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis nas 2 décadas anteriores e posteriores, e durante os 5 dias de aplicação dos pulsos de vocalizações sob escuro total entre 19:00 h e 20:00 h (representado pela barra cinza). (A= anterior, P = posterior)

Figura 18: Período endógeno do ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis 2 décadas antes e depois, e nas 3 décadas de aplicação dos pulsos de vocalizações sob escuro total entre 19:00 h e 20:00 h (representado pela barra cinza). Os asteriscos estão marcando as diferenças estatisticamente significativas obtidas através do teste tpara amostras dependentes. (A = anterior, D = durante, P = posterior)

* Entre 2A e D1– t[5] = 4,2; p< 0,05. ** Entre D1 e 1P – t[5] = -3,6; p< 0,05. *** Entre D1 e 2P – t[5] = -5,8; p< 0,05.

22,5

23

23,5

24

24,5

1A 2A D1 D2 D3 1P 2P

Década

Período (h

Borges

Doko

Paolo

Xerxes

Luiz

* ***

**

53

• Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro durante 30 dias

Nenhum animal apresentou uma relação de fase estável entre o RCA e os pulsos de

vocalizações de co-específicos em escuro total aplicados diariamente, durante 30 dias,

de 19:00 h até 20:00 h (figuras 7, 8, 10 a 12). Contudo, pela análise visual dos

actogramas observou-se que, durante 8 dias, Doko apresentou tendência a iniciar a

atividade após o término do pulso (figura 10).

O τ variou antes, durante e depois da aplicação dos pulsos (figura 18). Todos os

animais encurtaram o τ na primeira década dos pulsos em comparação com a década

anterior aos pulsos. Nessa década os pulsos incidiram na fase de repouso da maioria

dos animais.

Os períodos endógenos não diferiram entre as décadas de aplicação dos pulsos

(teste t, p > 0,05). Apesar disso, pela análise visual do gráfico, observou-se que

Borges, Doko e Xerxes alongaram o τ na segunda década, enquanto Paolo e Luiz

alongaram o τ na terceira década dos pulsos. Vale salientar que, na década em que os

animais alongaram o τ, os pulsos incidiram na fase ativa de Borges e Doko e na fase de

repouso de Xerxes, Paolo e Luiz. Contudo, a fase ativa dos três últimos estava

coincidindo com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h do ambiente externo (figuras

9 a 13). Em comparação com a primeira década dos pulsos, todos os animais

alongaram o τ nas décadas posteriores aos pulsos (figura 18).

Os animais apresentaram atividade todas as vezes que os pulsos incidiram em suas

fases ativas. Mas, pela análise visual dos actogramas observou-se que Borges e Doko

apresentaram mais atividade depois dos pulsos, enquanto Paolo, Xerxes e Luiz,

durante os pulsos (Figuras 9 a 13).

54

5. Discussão

O efeito de pistas não-fóticas sobre o RCA de sagüis foi analisado em vários

trabalhos (Erkert et al. 1986; Erkert & Schardt 1991; Glass et al. 2001; Silva et al.

2005; Wechselberger 1994). Contudo, na maioria deles os estímulos não-fóticos foram

aplicados sobre claro constante, ou seja, podiam estar atuando juntamente com a luz,

ou não tinham significado ecológico para os animais. Portanto, com o intuito de

analisarmos respostas a estímulos não-fóticos na ausência de luz e com significado

ecológico, procuramos avaliar o efeito de vocalizações de co-específicos aplicadas em

escuro total sobre o RCA dos sagüis. Como o escuro pode provocar mudanças de fase

no RCA, procuramos avaliar também o efeito de pulsos de escuro.

Em resposta aos pulsos de 1h de vocalizações de co-específicos no escuro,

observaram-se atrasos de fase no início e no fim do dia subjetivo, assim como a

predominância de avanços no fim do dia subjetivo e no meio da noite subjetiva. Essas

respostas são opostas à maioria das mudanças de fase desencadeadas por pulsos de

reprodução de sons de co-específicos associados à apresentação de um espelho

(Wechselberger 1994). Embora o estímulo seja semelhante ao utilizado em nosso

trabalho, no trabalho de Wechselberger (1994) os pulsos não eram aplicados

associados ao escuro, pois os sagüis estavam sob claro constante de 430 lux. Portanto,

é provável que a ativação comportamental durante a aplicação dos pulsos tenha

aumentado a duração da exposição à luz e que as mudanças de fase tenham sido

primariamente fóticas, ao invés de não-fóticas. Dando suporte a essa idéia está o fato

de que as mudanças observadas por Wechselberger (1994) são semelhantes às

observadas após a aplicação de estímulos fóticos em sagüis (Glass et al. 2001;

Wechselberger & Erkert 1994).

Por outro lado, o atraso de fase na HC 1 e os avanços na HC 9 observados no nosso

trabalho são consistentes com a CRF para pulsos de estímulos não-fóticos em roedores

noturnos, caracterizada por atrasos no início do dia subjetivo e durante a noite

subjetiva, e por grandes avanços entre o meio e o final do dia subjetivo (Challet &

Pévet, 2003; Mrosovsky et al., 1989; Rosenwasser & Dwyer 2001). Estas respostas são

semelhantes às encontradas para outros mamíferos diurnos, como o roedor Arvicanthis

55

ansorgei, em resposta a pulsos diários de 1 h de melatonina (Slotten et al. 2005), e o

esquilo Spermophilus citellus, em resposta a pulsos de 3 h de confinamento a uma roda

de atividade (Hut et al. 1999). Além disso, o atraso de fase na HC 1 é semelhante ao

desencadeado por pulsos diários de atividade induzida em sagüis (Glass et al. 2001).

Essas evidências apontam para um efeito semelhante para estímulos não-fóticos

entre mamíferos noturnos e diurnos. Portanto, a resposta a estímulos não-fóticos

dependem da fase do marcapasso circadiano e não da fase do ciclo de atividade-

repouso (Glass et al. 2001; Hut et al. 1999). Somando-se a isso, como as CRF fótica e

não fótica de mamíferos apresentam o mesmo formato e amplitude, mas janelas de

sensibilidade em fases opostas, o marcapasso circadiano deve ser mais sensível a

pistas fóticas durante a noite e a pistas não-fóticas durante o dia (Rosenwasser &

Dwyer 2001).

Em alguns trabalhos é levantada a hipótese de que deve haver pelo menos dois

mecanismos diferentes por trás das mudanças de fase não-fóticas, sendo um

claramente dependente de atividade e outro independente de atividade (Bobrzynska &

Mrosovsky 1998; Rosenwasser & Dwyer 2001). Nossos resultados dão suporte a essa

hipótese, já que foram observadas respostas de fase tanto na presença como na

ausência de atividade durante os pulsos.

Em resposta aos pulsos de 1 h de escuro observam-se avanços de fase no fim do dia

subjetivo e no meio da noite subjetiva, bem como atrasos de fase no início do dia

subjetivo e no meio da noite subjetiva. As mudanças de fase após os pulsos durante o

dia subjetivo são semelhantes ao descrito para sagüis (Silva et al. 2005) e hamsters

(Mendoza, Dardente, Escobar, Pevet & Challet 2004; Rosenwasser & Dwyer 2002).

Além disso, são consistentes com o modelo de CRF para pulsos de escuro proposto

por Rosenwasser & Dwyer (2001), que sugere que o mecanismo por trás das mudanças

de fase induzidas por pulsos de escuro seja a soma de dois mecanismos independentes

atuando em fases circadianas diferentes. Durante o dia subjetivo e o final da noite

subjetiva, os efeitos dos pulsos de escuro refletem um mecanismo mediador de

mudanças de fase não-fóticas, enquanto no fim do dia subjetivo e no início da noite

subjetiva, refletem um mecanismo de imagem especular fótica (Rosenwasser & Dwyer

2001, 2002).

56

Os dados encontrados para sagüis (Silva et al. 2005) e hamsters (Rosenwasser &

Dwyer 2002) dão suporte a essa hipótese, já que as mudanças de fase observadas são o

oposto do desencadeado por estímulos fóticos, além de terem ocorrido

independentemente do nível de atividade durante os pulsos. Inclusive, o escuro para os

sagüis é um estímulo inibidor de atividade, por serem animais cuja fase ativa é restrita

à fase de claro. Portanto, o escuro tem um efeito direto sobre o NSQ.

Corroborando essa idéia, Mendoza et al. (2004) mostraram que hamsters expostos

a pulsos de escuro no final do dia subjetivo apresentaram avanços de fase associados a

uma inibição transitória na expressão de Per1 e Per2 no NSQ, independente de

atividade locomotora. Segundo os autores, esses resultados são semelhantes aos

desencadeados por estímulos não-fóticos, tanto em nível comportamental como

molecular, sugerindo mecanismos neuronais não-fóticos por trás dessas mudanças.

Contudo, os autores não descartam a hipótese de que vias fóticas alteradas durante o

pulso de escuro possam estar diretamente relacionadas à diminuição na expressão dos

genes Per no NSQ.

Infelizmente, o reduzido número de HCs avaliadas para os pulsos de vocalizações

de co-específicos e de escuro torna difícil qualquer comparação dos nossos dados com

os dados de estudos anteriores. Além disso, como a maioria das HCs expostas aos

pulsos de vocalizações de co-específicos foram diferentes das HCs expostas aos pulsos

de escuro, não foi possível compararmos as respostas de fase entre os diferentes tipos

de pulsos. Outro fator que dificultou a análise das respostas aos pulsos foram as faltas

de energia durante o experimento, que agiram como pulsos de escuro sobre o RCA dos

sagüis.

Somando-se a essas limitações, uma decisão metodológica provavelmente afetou as

respostas aos pulsos de escuro durante a noite subjetiva. Como a forma de exposição à

luz em CC influencia a expressão do período endógeno do RCA em sagüis (Gonçalves

2006), optamos por utilizar tocas pintadas de preto para evitar a entrada fótica. Dessa

forma, os animais poderiam escolher o momento de exposição à luz, ou seja, não

ficariam expostos à luz continuamente. Contudo, como eles normalmente ficavam

dentro das tocas quando estavam em repouso, não se expunham aos pulsos de escuro

durante a noite subjetiva. Reforçando essa possibilidade, a única resposta de fase

57

durante a noite subjetiva consistente com a CRF para pulsos de escuro descrita na

literatura foi o atraso de fase na HC 18, única HC em que o animal apresentou

atividade durante o pulso de escuro, ou seja, expôs-se com certeza ao estímulo.

Portanto, existe uma grande probabilidade das mudanças de fase durante a noite

subjetiva, diferentes das geralmente observadas para pulsos de escuro, não terem sido

desencadeadas pelos pulsos de escuro do experimento.

Uma forte possibilidade é que tenham sido causadas por modulações no período

endógeno (τ), na duração da fase ativa (α) e na amplitude do RCA dos sagüis que

ocorreram durante o CC, independentemente das manipulações experimentais.

Inclusive, pela análise visual dos actogramas observa-se interferência dessas

modulações na maioria das respostas de fase tanto aos pulsos de vocalizações como

aos de escuro, independente da fase circadiana. Conseqüentemente, as mudanças de

fase obtidas neste trabalho não podem ser atribuídas apenas aos pulsos, pois, sempre

que a fase ativa dos sagüis coincidia com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h do

ambiente externo, o τ e o α alongavam associados a um aumento na freqüência da

atividade durante esse intervalo de tempo. Além disso, os animais exibiram o RCA em

coordenação relativa algumas vezes. Apenas um animal não apresentou o RCA em

coordenação relativa.

Segundo Araújo et al. (2007), o “phee” é vocalizado mais freqüentemente no início

da manhã, sendo a acrofase entre 06:20 h e 08:00 h. Contudo, no estudo de Araújo et

al. os sagüis estavam em uma sala com as luzes acendendo às 06:00 h. Fazendo uma

relação do horário do acender das luzes com o horário do nascer do sol (em torno das

05:00 h), pode-se inferir que os sagüis em ambiente natural vocalizam mais

freqüentemente o “phee” no início da manhã, entre aproximadamente 05:20 h e 07:00

h, horário que se encaixa no intervalo entre o nascer do sol e 08:00 h da manhã. Nesse

sentido, as modulações observadas no RCA durante o CC devem ter sido decorrentes

da influência dessas vocalizações sobre o sistema de temporização circadiano, pois,

durante todo o CC, a provável pista temporal ambiental que os sagüis em experimento

tiveram acesso foi o “phee” vocalizado pelos sagüis da colônia, que era audível dentro

da sala experimental.

58

Essa idéia é reforçada pelos estudos sobre vocalizações de sagüis, segundo os quais

a comunicação acústica deve ser muito importante na interação entre os animais. Isto

porque os sagüis são arborícolas e normalmente vivem em lugares de vegetação densa,

o que dificulta o contato visual entre os animais. Como são primatas sociais,

normalmente organizados em grupos, a forma mais eficiente de comunicação em seu

habitat natural seria pelas vocalizações (Epple 1968; Schrader & Todt 1993). Além

disso, cada vocalização tem uma função social. O “phee”, silvo longo e alto, é

considerado como “chamada de contato”, pois é emitido com a função de manutenção

de contato entre os animais mesmo quando há uma grande distância entre eles (Epple

1968). Resumindo, o sinal sonoro é uma pista social muito importante para os sagüis.

Dando suporte a essa idéia, estão os resultados descritos por Erkert et al. (1986),

Erkert & Schardt (1991) e Gonçalves (2006). Segundo eles, ocorreram alongamentos

do τ e do α relacionados a mascaramento positivo, coordenação relativa e

sincronização induzidos socialmente por sinais sonoros. Com base nesses resultados,

os autores sugerem que pistas sonoras são zeitgebers fracos para sagüis e que a

eficácia do zeitgeber social é dependente do grau de parentesco e da proximidade dos

períodos endógenos entre os animais.

Corroborando essa hipótese, observamos que o único animal que não entrou em

coordenação relativa com a colônia foi o que exibiu menor período endógeno (23,1 ±

0,2 h) ao longo de todo o CC fraco. Entre os animais que entraram em coordenação

relativa, o que ficou mais tempo nessa condição foi o que exibiu maior período

endógeno (23,8 ± 0,4 h) durante todo o CC fraco. Portanto, as modulações observadas

no RCA devem ter sido induzidas socialmente por sinais sonoros emitidos pelos sagüis

da colônia. É possível que essas vocalizações sinalizassem o início de atividade para

os sagüis em experimento, já que o horário em que são mais freqüentes corresponde ao

início da fase ativa em ambiente natural (Menezes et al. 1993; Moreira et al. 1991).

Essa suposição pode explicar o fato das vocalizações influenciarem apenas quando

coincidiam com a fase ativa do animal, pois é um sinal que pode estar indicando o

início da atividade. Sendo assim, os animais tenderiam a iniciar a atividade no mesmo

horário da colônia, o que ocorreu algumas vezes. Mas aconteceu outras vezes dos

59

animais tenderem a finalizar a atividade quando os sagüis da colônia estavam

iniciando a atividade.

Outra possibilidade é que o sistema auditivo de sagüis tenha uma ritmicidade

circadiana, já que o mesmo é evidenciado em ratos (Frankland & Ralph 1995).

Contudo, o sistema auditivo dos ratos é mais sensível a sinais sonoros durante a noite

subjetiva, enquanto o de sagüis parece ser mais sensível durante o dia subjetivo.

Baseado nisso, parece que a sensibilidade do sistema auditivo está relacionada com a

fase do ciclo de atividade-repouso do animal, sendo mais sensível durante o dia

subjetivo em animais diurnos e na noite subjetiva em noturnos, o que faz sentido com

base na atividade neuronal durante o sono e a vigília em humanos. Durante a vigília,

os neurônios tálamo-corticais operam em “modo de transmissão”, que consiste na

permanente ativação das vias tálamo-corticais. Isso garante a transmissão contínua das

informações sensoriais e outras informações ascendentes ao córtex cerebral. Por outro

lado, durante o sono esses neurônios operam no “modo de disparo em salva”, quando

se tornam menos excitáveis e só conseguem disparar potenciais de ação de tempos em

tempos e não continuamente, de acordo com a chegada de impulsos aferentes (Lent

2004). Nesse sentido, os sinais sensoriais devem ser transmitidos mais facilmente

durante a fase ativa do animal, o que explicaria a maior sensibilidade do sistema

auditivo a pistas sonoras durante essa fase em relação ao repouso.

Curiosamente, as modulações no RCA eram mais evidentes quando o final da

atividade dos sagüis em experimento coincidia com o início da fase ativa da colônia.

Essas diferenças observadas no início e no fim da atividade em relação ao mesmo

zeitgeber social podem ser indicadores da existência de mais de um oscilador

responsável pela expressão do RCA, diferentes na sensibilidade às pistas temporais.

Esse resultado aponta para a existência de pelo menos dois osciladores, um

responsável pelo início da atividade, menos sensível a sinais sonoros, e outro

responsável pelo fim da atividade, mais sensível a sinais sonoros.

A idéia de que o sistema de temporização circadiano seja um sistema

multioscilatório é sustentada por várias evidências. Uma delas é a divisão do RCA em

dois componentes, fenômeno conhecido como bipartição. Por exemplo, sagüis sob

condições de iluminação constante apresentaram bipartição no RCA (Schardt 1989).

60

Camundongos submetidos a um avanço de 8 h exibiram os ritmos circadianos de

atividade e temperatura em dois componentes durante a ressincronização, um

ajustando por avanço de fase e o outro por atraso. Além de darem suporte à idéia de

que o RCA é controlado por pelo menos dois osciladores, esses resultados indicam que

esses osciladores têm propriedades diferentes e estão acoplados ao ciclo CE de

maneiras diferentes (Weinert, Sturm, Waterhouse 2002). Essa idéia foi confirmada em

estudo posterior (Weinert & Weinert 2003) que reforça o modelo de Pittendrigh e

Daan (1976), segundo o qual existem pelo menos dois osciladores, um matutino,

sincronizado ao acender das luzes ou nascer do sol, e um vespertino, sincronizado ao

apagar das luzes ou por do sol. Além disso, o ritmo circadiano da atividade

eletrofisiológica no NSQ apresentou dois picos quando foi cortado em pedaços num

plano horizontal. Um pela manhã, após o nascer do sol simulado, e outro à noite, em

torno do horário do por do sol simulado, que podem estar refletindo a organização dos

osciladores matutino e vespertino no NSQ (Jagota, de la Iglesia, Schwartz 2000).

Outra evidência é a dissociação em dois componentes do ritmo da atividade motora

de ratos, um sincronizado a um ciclo CE diferente de 24 h e o outro em livre-curso,

provavelmente gerados pela atividade de pelo menos dois grupos de osciladores.

Considerando que o STC é formado por uma população de osciladores elementares,

cada um com uma freqüência circadiana, nem todos devem ter a mesma capacidade de

sincronizar a certas condições externas. Aqueles capazes de sincronizar a um ciclo

externo T serão os que oscilam com um período próximo a T, enquanto que os com

períodos mais distantes de T não sincronizarão. Quando o T do ciclo externo é

semelhante ao período endógeno do sistema, a maioria dos osciladores sincronizará e a

atividade se manifestará sob apenas um ritmo, ou seja, o número de osciladores

sincronizados é o que determina o período do sistema (Campuzano, Vilaplana,

Cambras & Díez-Noguera 1997; Honma et al. 2004).

Dando suporte a essa hipótese, ratos expostos a CE de 22 h expressam dois ritmos

circadianos de atividade motora com períodos diferentes. A análise da expressão

gênica no NSQ sob tais condições sugere que esses ritmos refletem atividades

separadas de dois osciladores nas subdivisões dorsomedial e ventrolateral (de la

Iglesia, Cambras, Schwartz, Díez-Noguera 2004), sendo a dorsomedial responsável

61

pela geração e estabilidade da ritmicidade circadiana, enquanto a ventrolateral é

responsável pela sincronização ao ciclo ambiental externo (Nakamura, Honma,

Shirakawa, Honma 2001).

Outro fato interessante no presente trabalho foi que as modulações no RCA ficaram

menos evidentes no decorrer do tempo para a maioria dos animais. Ou seja, estes

parecem diminuir a sensibilidade às vocalizações emitidas pelos sagüis da colônia.

Contudo, no RCA de um animal observou-se o contrário. As modulações ficaram mais

evidentes no decorrer do tempo, indicando um aumento na sensibilidade às

vocalizações emitidas pelos sagüis da colônia. Enquanto a maioria dos animais se

habituou ao estímulo, um animal apresentou indícios de sensibilização, processo que

ocorre devido à repetição ou apresentação de um estímulo por longo tempo. Sendo

que, a habituação ocorre quando o estímulo é fraco, enquanto a sensibilização ocorre

quando e estímulo é forte (Lent 2004). Contudo, alguns trabalhos relatam habituação a

estímulos considerados fortes. Por exemplo, a repetição do procedimento de restrição

física, considerado como estímulo estressor em hamsters, promoveu habituação e

atenuação de respostas de fase (Mistlberger e Antle 2006). Porcos se habituaram à

reprodução tanto de sons artificiais como naturais. Embora fosse esperado que fossem

mais sensíveis ou não habituassem aos sons de abatedouro e de transporte, por serem

estímulos estressores para esses animais, não se observou diferença nas respostas

comportamentais e fisiológicas entre os estímulos sonoros (Talling, Waran, Wathes,

Lines 1996).

Além disso, esse resultado aponta para a variabilidade intra-específica em relação

ao mesmo estímulo. Algo que se deve levar em conta é o histórico de vida do animal,

que pode ter influenciado nessa diferença da resposta ao mesmo estímulo. Outro fator

que poderia ter influenciado é a diferença na sensibilidade do STC entre os animais.

Esses mesmos fatores foram levantados como possíveis causas para a variabilidade

intragrupo em relação a estímulos sonoros, em estudo com sagüis sob condições

ambientais semelhantes às do presente estudo. Os animais foram mantidos em uma

sala com iluminação constante, temperatura e umidade controladas e isolamento

acústico parcial, que possibilitava a entrada de vocalizações emitidas pelos animais de

fora da sala (Gonçalves 2006).

62

Em relação aos pulsos diários de vocalizações de co-específicos durante 1 h era de

se esperar que os animais sincronizassem, com base em estudos anteriores, que

relataram sincronização social por pistas sonoras, e pelo fato dos sagüis terem entrado

em coordenação relativa com a colônia. Contudo, nenhum animal sincronizou o RCA

aos pulsos diários, tanto os aplicados durante 5 dias como os aplicados durante 30 dias.

Uma possível causa é que os animais tenham se habituado ao estímulo diário,

apesar deste ter sido reproduzido aleatoriamente, com o objetivo de evitar a habituação

à seqüência dos sons. Aliás, a reprodução aleatória pode ter contribuído ou ter sido a

causa da ausência de sincronização, pois cada vocalização tem uma função que pode

ter sido perdida com a mistura dos sons. Por exemplo, a reprodução de um phee,

chamada de contato, seguida de um twitter, chamada de contato, seguida de um tsik,

aviso da presença de predadores, poderia ter levado à mistura dos significados, e

conseqüentemente, à ausência de contexto ecológico. Dessa forma, as vocalizações

reproduzidas durante os pulsos podem não ter tido significado social para os animais.

O τ do RCA dos sagüis variou antes, durante e depois dos pulsos. Contudo, para os

pulsos durante 5 dias, não foi encontrado um padrão nessas variações, que devem ter

ocorrido devido à influência das vocalizações dos animais da colônia fora da sala

experimental, descritas anteriormente. Além disso, a ocorrência de faltas de energia

durante os dias de aplicação dos pulsos deve ter fornecido pistas temporais ambientais

conflitantes, interferindo no efeito dos pulsos sobre o STC.

Por outro lado, houve um padrão nas variações do τ em relação aos pulsos durante

30 dias. O τ de todos os animais na primeira década de aplicação dos pulsos foi menor

em relação à década imediatamente anterior e as posteriores à aplicação dos pulsos.

Esses resultados reforçam a idéia de habituação ao estímulo, pois é um indício de que

os animais apresentaram sensibilidade aos pulsos somente nos primeiros dias de

aplicação, já que nas décadas seguintes de aplicação o τ não diferiu estatisticamente

nem visualmente das décadas anteriores e posteriores aos pulsos.

Os pulsos incidiram na fase de repouso dos animais nos primeiros dias de

aplicação. Pela análise visual foram observados avanços de fase pronunciados, como

se estivessem avançando o RCA para alcançar o zeitgeber, o que provavelmente

causou o encurtamento no tau. Depois da primeira década de aplicação dos pulsos

63

observam-se variações no τ de todos os animais, contudo a maioria delas parece ser em

decorrência da influência da colônia. Apenas Borges e Doko alongaram o τ quando os

pulsos coincidiram com sua fase ativa, enquanto os outros alongaram quando suas

fases ativas coincidiram com o início da atividade da colônia. Esses resultados

apontam para diferenças intra-específicas na sensibilidade ao mesmo estímulo.

Apesar de não ter havido sincronização, um animal tendeu a iniciar a atividade

após o término do pulso por alguns dias. Este resultado somado com o aumento na

atividade, quando esta coincidia com o início da fase ativa dos animais de fora da sala,

são evidências de mascaramento social positivo do RCA provocado por estímulos

sonoros. Alguns trabalhos também relataram a ocorrência de mascaramento social

positivo por estímulos sonoros em sagüis (Erkert et al. 1986; Erkert & Schardt 1991;

Gonçalves 2006). Esses dados reforçam a idéia de que estímulos sonoros são

zeitgebers fracos para essa espécie.

Portanto, vocalizações de co-específicos são estímulos importantes na expressão do

RCA em sagüis. Por serem zeitgebers fracos não sincronizam permanentemente,

embora induzam a ocorrência de modulações na freqüência de atividade, no período

endógeno e na duração da fase ativa do RCA típicas de processos de coordenação

relativa e mascaramento social. A avaliação dos mecanismos envolvidos na ação dos

pulsos de vocalizações de co-específicos e de escuro sobre o RCA foi comprometida

devido às limitações descritas. Desta forma, faz-se necessária a continuidade desta

avaliação em condições ambientais que possibilitem a expressão estável do período

endógeno.

64

6. Conclusões

Com base no exposto nesse trabalho, concluímos que:

• os pulsos de vocalizações de co-específicos e de escuro desencadeiam

mudanças de fase no RCA de sagüis. Contudo, a avaliação dessas mudanças foi

comprometida devido às limitações metodológicas descritas;

• vocalizações de co-específicos promovem coordenação relativa e mascaramento

social positivo, portanto atuam como zeitgebers fracos do ritmo circadiano da

atividade motora de sagüis.

65

7. Referências Bibliográficas

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