efeitos da quitosana no controle de doenças pós colheita

EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE

DOENÇAS PÓS COLHEITA E

RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE

TOMATE

Ernane Nogueira Nunes

Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB

Areia – PB

2012

EFFECTS OF CHITOSAN ON CONTROL OF

POSTHARVEST DISEASES AND

PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF TOMATO FRUIT

AUTORES: Jia Liu, Shiping Tian, Xianghong Meng, Yong Xu;

PERIÓDICO: Postharvest Biology and Technology 44 (2007)300–306

Laboratory of Photosynthesis and Environmental MolecularPhysiology, Institute of Botany, Chinese Academy ofSciences, Nanxingcun 20, Xiangshan, Haidian, Beijing100093, China.

Areia – PB2012

INTRODUÇÃO

• Pós colheita: responsável por grandes perdas de frutase hortaliças (chegando até 40%);

• Fungicidas sintéticos:

▫ Ainda são as melhores alternativas;

▫ Preocupação internacional;

▫ Patógenos resistentes;

▫ Novas alternativas.

INTRODUÇÃO

• QUITOSANA (N-acetil-d-glucosamina):Polissacarídeo derivado da carapaça (quitina) decrustáceos;

• É natural, possui efeitos antifúngicos e estimulante derespostas de defesa nos vegetais (Terry e Joyce, 2004);

• Puccinia arachidis Speg. (Sathiyabama eBalasubramanian, 1998), Alternaria alternata (Fr.)Keissler (Reddy et al., 1998) e Aspergillus niger V.Tiegh. (Plascencia-Jatomea et al., 2003).

INTRODUÇÃO• Através de pesquisas anteriores sabe-se que a quitosana

aumentou a atividade da fenilalanina amônia liase (PAL) embagas de uva (Romanazzi et al, 2002); (BIOSSÍNTESE DEFLAVONOIDES E LIGNINA)

• Quitinase e 1,3-glucanase em laranjas, morangos eframboesas (Fajardo et al, 1998;. Zhang e Quantick, 1998);(ESTÍMULOS A DEFESA VEGETAL)

• Quitosana apresentou efeitos em B. cinerea e P. expansumem frutos de cereja doce e morango (Romanazzi et al., 2003) em cítros (Reddy et al., 2000);

• Estudos recentes indicam resistência dos fungos.

OBJETIVOInvestigar os efeitos da quitosana no controle do mofocinzento e mofo azul, causada por B. cinerea e P.expansum, em frutos de tomate armazenados adiferentes temperaturas e o desencadeamento demarcadores de defesa, incluindo polifenoloxidase(PPO), peroxidase (POD) e compostos fenólicos.

B. cinerea P. expansum

MATERIAL E MÉTODOS

• Os frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill)foram colhidas no estádio vermelho maduro;

• Classificados com base no tamanho e na ausência delesões físicas ou doença de infecção;

• Antes dos tratamentos, os frutos foram desinfetadoscom hipoclorito de sódio a 2% durante 3min, e emseguida enxaguados com água corrente e secos aoambiente.

MATERIAL E MÉTODOS

• B. cinerea e P. expansum foram isolados a partir de frutos infectados de tomate e cultivados em BDA a 25◦C;

• Os esporos de ambos os agentes patogênicos foram removidos a partir de 2 semanas de idade e suspensas em 5ml de água destilada estéril contendo 0,05%(v/v) de Tween 80, como solubilizante;

• As suspensões foram filtradas através de quatro camadas de gaze estéril, de modo a aderir os micélios.

MATERIAL E MÉTODOS

• Quitosana com desacetilação de 90% e uma viscosidade de 15cP foi obtido a partir do OceanUniversity of China;

• Dissolvido em 2%(w/v) em HCl a 1% sob constante agitação;

• Depois diluiu-se a: 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5% e 1%, com o valor do pH de cada solução ajustado para 5,4 com NaOH.

MATERIAL E MÉTODOS• Foram preparadas 50 placas de Petri para cada fungo (60

mm de diâmetro) com 10ml BDA e com os conídios a1×106spores/mL-1, que continham diferentesconcentrações (0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5% e 1%) dequitosana, com posterior incubação a 25◦C por 12h;

• Discos de micélio (5mm de diâmetro) a partir de 2semanas de idade, foram colocados no centro de placas dePetri (90 mm de diâmetro) com 20mL de BDA, contendodiferentes concentrações de quitosana emseguida, incubadas a 25 ◦C.

• O crescimento micelial foi determinado medindo odiâmetro das colónias 3 dias após a inoculação.

• Cada tratamento foi repetido três vezes e a experiência foirepetida duas vezes.

MATERIAL E MÉTODOS: Ensaio de

integridade da membrana plasmática dos

esporos▫ As amostras foram inoculadas em meio de cultura PDA

diluídas a 5×105spores/mL-1 e depois centrifugadas a 200rpm durante 10 min a 25◦C e lavadas duas vezes com tampão 5omM de fosfato de sódio (pH 7,0) para remover meio residual.

▫ As suspensões de conídios foram coradas com 10 µgml-1

de iodeto de propídio(PI), durante 5 min a 30 ◦ C.

MATERIAL E MÉTODOS: Efeitos da quitosana

nos frutos• De acordo com dados não mostrados foram escolhidas as concentrações de

0,5% e 1%;

• Os frutos foram feridos com o auxílio de um prego estéril (3mm de profundidade e 3mm de largura);

• TRATAMENTOS: 0,5% de quitosana (15µL), 1% de quitosana (15µL) e água destilalada (15µL) nos ferimentos;

• Depois 4 horas, 5µL de uma suspensão de esporos de B. cinerea e P. expansum a 5×103 spores/mL-1 foram adicionados a cada ferida;

• Os frutos tratados foram colocados em caixas estéreis para manter uma umidade relativa (cerca de 95%) e armazenados a 25◦C e 2◦C;

• Verificação da incidência de podridões: 3 e 21 dias após a inoculação;

• Tratamento: 3 repetições e o Experimento: 2 vezes.

MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do

PPO, POD e compostos fenólicos

• Frutos de tomate foram feridos e 15µL de 1% de quitosanaforam adicionados a cada ferida, com agua destilada adicionada servindo como controle;

• Após o tratamento, os frutos foram divididos aleatoriamente em dois lotes: 25◦C e 2◦C;

• Foram retiradas amostras de polpa em torno das feridas de 10 frutos a 0, 1, 2 e 3 dias a 25◦C e aos 0, 7, 14 e 21 a 2◦ C;

• Cada tratamento continha três repetições e a experiência foi repetida duas vezes.

• As amostras de tecido (2g) de cada tratamento foram homogeneizados com 10ml de 100 mM de solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,4) contendo 0,2g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) e terra a 4◦C;

• O homogeneizado foi centrifugado a 15000 × g durante 30 min a 4◦C e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio;

• Atividade PPO foi determinada através da adição de 0,1ml de enzima preparada em 3,0mL de substrato catecol(500mM, 100mM em tampão fosfato de sódio, (pH6.4) e o aumento da absorvância em 398nm foi verificada.



• A atividade de POD foi determinada utilizando guaiacol como substrato (Ippolito et al., 2000);

• A mistura de reação consistiu em 0,1ml de extrato bruto, 2mL de guaiacol (8mM, de sódio 100mM tampão de fosfato, pH 6,4), incubou-se durante 30 min a 30◦C;

• O aumento da absorvância a 460nm foi medida após a adição de 1mL H2O2 (24mM).



• 1g de polpa de cada 10 frutos foram homogeneizadascom 20mL de gelo á 1% de HCl metanol-solução e emseguida centrifugou-se a 15000 × g durante 15 min a4ºC.

• O sobrenadante foi recolhido e a absorbância foimedida a 280nm.



MATERIAL E MÉTODOS: Análises estatísticas

• Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SPSS11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

• Os dados do ensaio de membrana de plasma integridadeforam comparados independente-amostras teste t.

• Demais análises foram analisadas através da ANOVA.

• Teste de médias realizadas através do teste de Duncan (P<0,05).

RESULTADOS

CONCLUSÕES• Os resultados evidenciaram que quitosana foi eficaz no

controle do mofo cinzento (B. cinerea) e mofo azul (P.expansum) em frutos de tomate armazenados a 25◦C e2◦C, indicando que a temperatura de armazenamento tevepouca influência sobre os efeitos de controle de quitosanaem doenças pós-colheita de frutos de tomate.

• Sendo o efeito da quitosana sobre mofo cinzento melhordo que no azul.

• Verificou-se que as atividades de PPO, POD e nível decompostos fenólicos em frutos tratados com quitosanaaumentaram significativamente a 25◦C e 2◦C, o queconfere propriedades de defesa.

• Quitosana tem potencial para substituir os fungicidassintéticos, mas muitos estudos ainda são necessários.

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EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE

DOENÇAS PÓS COLHEITA E

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2012