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EFEITO DO pH E CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA

CAPACIDADE IN VITRO DE FORMAÇÃO DE BIOFILME

POR Salmonella sp. ISOLADA DE INDÚSTRIA DE

PROCESSAMENTO DE AVES

A. M. Schneider¹, G. R. Fonseca2, S. A. Costa3, M. J. Sereno4, K. Pegoraro5, L. S. Bersot6

1- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, CEP: 85950-000 –

Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (45) 9999-4914 – e-mail: ([email protected]).

2-Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 –


3- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 –








RESUMO – Salmonella sp. é um importante patógeno associado aos produtos de origem animal sendo

o principal agente de enfermidades causadas pela ingestão de carne e ovos. Além disso, possui a

capacidade de formar biofilme, uma fonte de contaminação importante para os alimentos. O objetivo

desse estudo foi verificar como os fatores estressantes: pH (4,5, 7,0 e 9,0), concentração de nutrientes

(30%, 50% e 100%) em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42°C), podem interferir

diretamente na habilidade de formação de biofilme por Salmonella sp. Esta avaliação foi realizada

através de metodologia internacionalmente conhecida. Encontrou-se que a concentração de nutrientes

do meio de cultura e o pH, associados a temperatura, influenciaram diretamente na formação de

biofilme. Contudo, os fatores estressantes não maximizaram a capacidade de formação de biofilme que

se mostrou sempre maior quando as condições ótimas estavam presentes.

ABSTRACT – Salmonella sp. is an important pathogen associated with animal products and is the main

agent of diseases caused by eating meat and eggs. Moreover, it has the ability to form biofilm, a

significant food contamination source. The aim of this study was to determine how stress conditions:

pH (4.5, 7.0 and 9.0), concentration of nutrients (30%, 50% and 100%) depending on incubation

temperature (7°C, 36°C and 42°C), can directly interfere with biofilm formation ability of Salmonella

sp. This evaluation was made using international recognized methodology. It was found that the

concentration of nutrients from the culture medium and the pH associated with the temperature,

influenced directly on the biofilm formation. However, stress conditions not maximized the biofilm

forming ability that proved always larger when the optimal conditions were present.

PALAVRAS-CHAVE: Salmonella sp.; biofilme; pH; nutrientes.

KEY-WORDS: Salmonella sp.; biofilm; pH; nutrients.

mailto:[email protected]




1. INTRODUÇÃO

As enfermidades ocasionadas pelo o consumo de alimentos constituem uma grande

preocupação para a saúde pública mundial, em especial, as causadas por Salmonella sp., sobretudo pelo

consumo de produtos avícolas como carnes e ovos (BELL & KYRIAKIDES, 2002). De acordo com o

relatório anual do CDC, em 2014, Salmonella sp. foi o principal agente causador das toxinfecções

alimentares nos EUA, com 7.439 mil casos reportados e 32 mortes (CDC, 2014). Adicionalmente,

Salmonella sp. tem capacidade de formar biofilmes sendo uma das principais fontes de contaminação

dos alimentos (BELL & KYRIAKIDES, 2002).

Os biofilmes são agregados de micro-organismos, que se anexam e crescem sobre uma

superfície (SREY et al., 2013) como uma maneira de autoproteção bacteriana frente à fatores ambientais

adversos (SHI & ZHU, 2009). A formação do biofilme ocorre quando os micro-organismos se aderem

à uma superfície de contato, se fixam, constituem uma matriz de exopolissacarídeos e iniciam então seu

crescimento (DONLAN, 2002). Na indústria, a formação do biofilme está relacionada a fatores

ambientais como pH, temperatura, composição de nutrientes e as características da população de

bactérias, bem como fatores relacionados a limpeza e desinfecção de equipamentos e utensílios (SHI &

ZHU, 2009).

Os biofilmes de Salmonella sp. possuem grande importância na indústria, pois as superfícies

em que se formam entram em contato com os alimentos diariamente (SCHLISSELBERG & YARON,

2013). Além disso, são resistentes à vários desinfetantes e antibióticos (STEENACKERS et al., 2012) e

permanecem viáveis no ambiente por longos períodos de tempo, se tornando uma fonte de contaminação

crônica para o alimento (VESTBY, et al., 2009). De acordo com o órgão norte-americano National

Institutes of Health, biofilmes estão associados a aproximadamente 80% de todas as infecções humanas

no mundo (NIH, 2002).

De acordo com a Instrução Normativa n° 70 (2003), para garantir a higiene e a segurança dos

alimentos produzidos, as indústrias devem ter um controle minucioso sobre o processo de abate. Além

disso, devem realizar o processo adequado de limpeza para remover todos os resíduos de alimentos e de

outros compostos (SIMÕES et al., 2010). A limpeza adequada é muito importante para prevenção da

formação de biofilmes e a desinfecção é indispensável para eliminação dos biofilmes já formados

(SREY et al., 2013).

O objetivo do trabalho foi verificar como os fatores estressantes pH adverso e redução da

concentração dos nutrientes em meio de cultura, incubados à diferentes temperaturas, podem interferir

na habilidade de formação de biofilme por Salmonella sp.

2. MATERIAL E MÉTODOS

As cepas de Salmonella sp. testadas no presente trabalho foram obtidas de um estudo prévio o

qual avaliou a habilidade de formação de biofilmes através da metodologia descrita por Stepanović et

al. (2000) de cepas de Salmonella sp. isoladas de esteiras condutoras de abatedouros de aves (ZIECH et

al., 2016).

Foram selecionadas três cepas do patógeno com habilidade diferente de formação de biofilmes

(uma fortemente, uma moderadamente e uma fracamente formadora) e foram submetidas frente aos

tratamentos com os fatores estressantes: pH (4.5, 7.0 e 9.0), concentração do meio de cultura (30%, 50%

e 100%) em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42°C), tendo sido realizada a combinação

de um delineamento experimental 3x3x3 com as variáveis testadas para avaliar a formação de biofilmes.

A partir de cada cepa numa concentração celular de 108 UFC/mL (escala 0,5 de MacFarland)

utilizando caldo Luria Bertani (Difco™) preparado de acordo com cada tratamento, foi semeado 200μL

em triplicata, em microplaca de poliestireno de 96 poços com fundo chato (Nest®). Foram utilizados

para o controle negativo, três poços contendo o meio de cultura de acordo com cada tratamento não

inoculado. As placas contendo as cepas de Salmonella sp. e os controles foram incubadas a 7, 35 e

42ºC/96h. Em seguida as placas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada (PBS pH 7,2)

e coradas com violeta cristal 1% por 15 minutos. Após três lavagens com água destilada e secagem em

temperatura ambiente, foi verificada a absorbância em uma leitora de microplacas Polaris (Celer®) a

620nm. O controle negativo foi o branco, utilizado para corrigir o valor da absorbância (resultado da

média aritmética dos quatro orifícios).

Para avaliar os resultados de absorbância o valor da densidade óptica de cada amostra (Doa) foi

comparado com a média da absorbância dos controles negativos (Docn). Para determinar o grau de

formação de biofilme foi utilizada a seguinte classificação: não formadora de biofilme (Doa≤Docn),

fracamente formadora de biofilme (Docn< Doa≤ 2.Docn), moderadamente formadora de biofilme

(2.Docn< Doa≤ 4.Docn) e fortemente formadora de biofilme (4.Docn<Doa).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na verificação do efeito das variáveis, concentração de nutrientes (100%, 50% e 30%) e pH

(9,0, 7,0 e 4,5) de acordo com a temperatura de incubação na formação de biofilme, verificou-se que

para a cultura de Salmonella sp. classificada como fortemente formadora de biofilme (Tabela 1), a

temperatura de refrigeração (7ºC) mostrou diminuir a capacidade de adesão de biofilmes

independentemente das variáveis estudadas (pH e concentração do meio de cultura). Efeito semelhante

foi observado com esta cultura quando incubada a 42ºC.

Tabela 1 - Efeito das variáveis concentração de meio de cultura (100%, 50% e 30%) e pH (4,5; 7,0 e

9,0) na capacidade de formação de biofilme em microplaca de poliestireno de cultura de Salmonella

sp. FORTE formadora de biofilme em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42ºC).

Temperatura de

incubação

Concentração de nutrientes no

meio de cultura (%) pH

100 50 30

7ºC

FR FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

36ºC

MO MO MO 4,5

FO FR FR 7,0

FO FR FR 9,0

42ºC

MO FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR AU FR 9,0

FR = fraca, MO = moderada, FO = forte, AU = ausente

Já a 36ºC (Tabela 1), temperatura considerada ótima para a formação do biofilme, o pH ácido

reduziu a capacidade de adesão, independentemente da concentração do meio de cultura, sendo que no

pH alcalino (9,0) esse efeito foi ainda mais pronunciado, mostrando que a alcalinidade associada a

inanição da cultura (50 e 30%), interferiram na capacidade de formação de biofilme. Em condições

ótimas (36ºC; 100% de meio; pH 7,0) a capacidade considerada “forte” na formação de biofilme foi

mantida, o que ocorreu também em pH 9,0.

Comportamento semelhante também foi observado com a cultura de Salmonella sp.

classificada como moderadamente formadora de biofilme (Tabela 2), cujas temperaturas de 7º e 42ºC

mostraram interferir negativamente na capacidade de formação de biofilme. Mais uma vez, na

temperatura de 36ºC, houve redução da capacidade de formação de biofilme em microplacas de

poliestireno, nas combinações de pH 7,0 x 50% e pH 9,0 x 50%, nas demais combinações de 36°C a

formação de biofilme se manteve moderada. Lianou & Koutsoumanis (2012) obtiveram resultados

similares, onde a maior quantidade de biofilme foi formado a 25°C, quando comparado à temperaturas

mais baixas. Nas outras condições a capacidade de formação de biofilme não sofreu interferência.

Tabela 2: Efeito das variáveis concentração de meio de cultura (100%, 50% e 30%) e pH (4,5; 7,0 e


sp. MODERADA formadora de biofilme em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42ºC).

Temperatura de

incubação



100 50 30

7ºC

FR FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

36ºC

MO MO MO 4,5

MO FR MO 7,0

MO FR MO 9,0

42ºC

MO FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

FR = fraca, MO = moderada, FO = forte

Com relação a cultura de Salmonella sp. fracamente produtora de biofilme (Tabela 3), por se

tratar de uma cultura já avaliada com baixa capacidade de adesão, os efeitos observados foram de

ausência de formação de biofilmes em algumas situações específicas, notadamente quando a cultura foi

incubada a 42ºC. Mas esta cultura não mostrou sofrer com o efeito da temperatura de incubação a 7ºC,

cuja capacidade de formação de biofilme permaneceu inalterada.

Tabela 3: Efeito das variáveis concentração de meio de cultura (100%, 50% e 30%) e pH (4,5; 7,0 e


sp. FRACA formadora de biofilme em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42ºC).

Temperatura de

incubação



100 50 30

7ºC

FR FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

36ºC

FR FR FR 4,5

FR AU AU 7,0

FR FR FR 9,0

42ºC FR AU AU 4,5

AU AU AU 7,0

AU AU AU 9,0

FR = fraca, MO = moderada, FO = forte, AU = ausente

De uma maneira geral, observou-se que a maioria das cepas não conseguiu se desenvolver

bem quando condições estressantes foram cruzadas. Tanto a concentração de nutrientes, o pH e a

temperatura influenciaram positivamente ou negativamente na formação de biofilmes. A temperatura

foi o fator estressante que mais teve influência, pois a 7°C e a 42°C a formação de biofilmes foi

diminuída quando comparada com as cepas incubadas a 36°C. Assim como encontrado por Yang et al.

(2016), onde a contagem de células foram mais elevadas em biofilmes obtidos a 25 °C do que a 4 °C,

indica que a temperatura do ambiente pode ter um efeito significativo sobre a capacidade do micro-

organismo se aderir nas superfícies.

Além do efeito da temperatura, também foi observado o efeito do pH na formação de biofilme,

sendo a associação dos fatores, temperatura mais baixa e pH reduzido, a combinação que teve maior

capacidade de retardo na formação de biofilme. Nguyen & Yuk (2013) comprovaram que a temperatura,

o pH e a idade dos biofilmes estão diretamente ligados com a resistência dos biofilmes à desinfetantes.

A concentração de nutrientes no meio de cultura também mostrou interferir na formação de

biofilme, principalmente quando associado a temperatura. Nguyen et al. (2014) relatou que menores

concentrações de nutrientes foram mais eficazes na promoção da formação de biofilme de Salmonella

sp., e também relatou que os diferentes efeitos da menor concentração de nutrientes sobre a formação

de biofilme podem estar relacionados às diferentes temperaturas de incubação. Contudo, no presente

estudo, as condições estressantes impostas às culturas testadas não maximizaram a capacidade de

formação de biofilme que se mostrou sempre maior quando as condições estressantes não estavam

presentes.

4. CONCLUSÃO

Segundo os resultados obtidos tanto a concentração de nutrientes, o pH e a temperatura

influenciaram positivamente ou negativamente na formação de biofilmes. A temperatura foi o fator

estressante que mais influenciou, pois a 7°C e a 42°C esta formação foi diminuída quando comparada

com as cepas incubadas a 36°C. Diante disso, temperaturas mais baixas e pH reduzidos podem ser

utilizadas como obstáculo tecnológico para retardar a formação de biofilme em superfícies e

equipamentos contaminadas com Salmonella sp. Além disso, é necessário enfatizar que a correta

limpeza e desinfecção através dos programas de Boas Práticas de Fabricação, do Processo Padrão de

Higiene Operacional e da Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle na indústria são importantes

para prevenir a formação e erradicar biofilmes já formados.

5. AGRADECIMENTOS

A. M. Schneider, recebe apoio da Fundação Araucária, PR; S. A. Costa, G. R. Fonseca, L. S.

Bersot, recebem apoio do CNPq; M. J. Sereno, recebe apoio da CAPES e K. Pegoraro, recebe apoio do

MEC.

6. REFERÊNCIAS

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