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LIANA MELO LINS DE AZEVEDO

POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DO PETRÓLEO POR FUNGOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE MANGUEZAL IMPACTADO

RECIFE

FEVEREIRO/2010

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS


Liana Melo Lins de Azevedo Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Fungos de Interesse Industrial Orientador: Cristina Maria de Souza Motta Co-orientador: Norma Buarque Gusmão

RECIFE

FEVEREIRO/2010

Azevedo, Liana Melo Lins de Potencial de degradação do petróleo por fungos isolados de sedimentos de manguezal impactado/ Liana Melo Lins de Azevedo. – Recife: O Autor, 2010. 58 folhas : il., fig., tab. Orientador: Cristina Maria de Souza Mota. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Biologia de fungos, 2010. Inclui bibliografia. 1. Fungos filamentosos 2. Biorremediação 3. Degradação do petróleo I. Título. 579.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-205


LIANA MELO LINS DE AZEVEDO

Data da defesa: 10/02/2010

COMISSÃO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES

Drª Cristina Maria de Souza Motta – Orientador Universidade Federal de Pernambuco

Drª. Janete Magali de Araújo Universidade Federal de Pernambuco

“Por mais que lutemos por um mundo melhor, sabemos que não podemos mudá-lo sozinhos. Mas a

esperança é sabermos que o aprendizado torna possível fazê-lo juntos!”

Bruno Ahnert

http://www.pensador.info/autor/Bruno_Ahnert/

Agradecimentos

À Deus que esteve presente em todos os momentos, principalmente nos difíceis, concedendo a oportunidade do aprendizado, revelando seu poder e sua glória a cada instante da minha vida. À Universidade Federal de Pernambuco e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos pelo conhecimento e formação. Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos. Às orientadoras Profª Cristina Maria de Souza Motta e a Profª Norma Buarque Gusmão pela confiança em mim depositada, por estimular o meu crescimento na pesquisa e pela agradável convivência e amizade. Às professoras Maria José Fernandes e Débora Massa Lima da Coleção de Culturas – Micoteca URM, pelo carinho e competência fundamentais na identificação dos fungos filamentosos. Às amigas da Micoteca Marília, Stheffânia, Roberta, Paula, Odacy, Tatiane, Minelli, Polyanna, Juliana e Eliane pelos momentos descontraídos e auxílio quando solicitado. Um agradecimento especial à Cynthia, Rita, Carla, Diana, Breno e Persio por toda ajuda e apoio durante o desenvolvimento da fase prática em laboratório e, principalmente, pela amizade e carinho de todos vocês. À todos os colegas do Departamento de Antibióticos: Adriana, Mariana, Julliana, Erick, Flávia, Aline, Nelânia, Débora e Bárbara. Aos meus pais Davi e Letícia e irmãs Luísa e Gabi, pois sem o carinho, amor e amizade deles, não estaria aqui. Ao meu marido Eduardo pela paciência e incentivo fundamentais para a conclusão deste trabalho. À minha família pelo apoio incondicional.

Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... i

RESUMO

Os manguezais são considerados como um dos ambientes mais susceptíveis a

acidentes envolvendo derramamento de petróleo, o que constitui a principal e mais

danosa causa de contaminação dos solos e águas, demandando o desenvolvimento de

tecnologias que visam solucionar os problemas causados por esse impacto ambiental.

Dentre as novas tecnologias, a biorremediação tem surgido como a mais atrativa e

menos agressiva ao ambiente, pois utiliza o próprio metabolismo dos microrganismos

para eliminar ou reduzir os poluentes presentes na área contaminada. Neste trabalho

objetivou-se isolar fungos filamentosos de sedimentos de mangue impactado e

selecionar os mais promissores quanto à capacidade de degradação do petróleo. O

isolamento foi realizado pela técnica de diluições seriadas utilizando os meios de cultura

Ágar Sabouraud e Ágar Martin. As espécies obtidas no isolamento foram submetidas a

um teste qualitativo de degradação do petróleo utilizando o indicador redox 2,6-

diclorofenol-indofenol (DCPIP). A partir do teste qualitativo foram selecionados 5

isolados: Aspergillus niger, A. terreus, A. oryzae, Penicillium waksmanii e

Tallaromyces flavus, para serem submetidos à aclimatação em concentrações crescentes

de petróleo (2 a 12%), e em seguida foi realizado um planejamento fatorial para

conhecer a influência da agitação, pH, concentração celular e concentração da fonte de

nitrogênio (NH4NO3), tendo como variável resposta a biodegradação do petróleo. Foram

identificadas 14 espécies pertencentes aos gêneros Aspergillus, Cunninghamella,

Curvularia, Penicillium, Tallaromyces e Trichoderma. Todas as espécies testadas

promoveram a descoloração do indicador em tempos variados, destacando-se A. oryzae

e A. terreus, que apresentaram menor tempo de descoloração, 10 e 15h,

respectivamente. De uma maneira geral, observou-se aumento da biomassa e o pH se

manteve próximo a neutralidade. Com relação à fitotoxicidade, os produtos metabólicos

e o material residual presente no meio com A. oryzae e A. terreus demonstraram os

maiores índices de germinação para as sementes de pepino com 65,12% e 55,45%,

respectivamente. Com relação aos parâmetros avaliados, apenas a agitação apresentou

significância estatística. Os resultados obtidos sugerem A. oryzae como espécie

promissora para biorremediação de ambientes impactados por petróleo.

Palavras-chave: fungos filamentosos, biorremediação, sedimentos mangue, petróleo.

Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... ii

ABSTRACT

Mangroves are classified as one of the environments more prone to accidents

involving oil spills, which are the single and most damaging cause of contamination of

soil and waters, requiring the development of technologies to solve the problems caused

by this environmental impact. Among the new technologies, bioremediation has

emerged as the most attractive and less aggressive to the environment because it uses

the own metabolism of microorganisms to eliminate or reduce pollutants in the

contaminated area. This work aimed to isolate filamentous fungi from mangrove

sediments impacted and select the most promising on the ability of degradation of oil.

The isolation was performed by serial dilution technique using the culture media

Sabouraud Agar and Agar Martin. The species obtained in culture were subjected to a

qualitative test of degradation of oil using the redox indicator 2,6-dichlorophenol-

indophenol (DCPIP). From the qualitative test 5 isolates were selected: Aspergillus

niger, A. terreus, A. oryzae, Penicillium waksmanii and Tallaromyces flavus to be

submitted to acclimation to increasing concentrations of oil (2 to 12%), and then was

performed a factorial design to know the influence of agitation, pH, cell concentration

and concentration of nitrogen source (NH4NO3), having as variable response the

biodegradation of oil. There were identified 14 species belonging to the genera

Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, Penicillium, Tallaromyces and Trichoderma.

All species tested promoted the bleaching of the indicator at various times, especially A.

oryzae and A. terreus, which showed lower clearing time, 10 and 15h, respectively. In

general, there was an increase in biomass and the pH remained near neutrality. In

relation to the phytotoxicity, metabolic products and wastes present in the medium with

A. oryzae and A. terreus showed the highest rates of germination for seeds of cucumber

with 65.12% and 55.45% respectively. In relation to the parameters evaluated, only

agitation was statistically significant. The results suggest A. oryzae as promising specie

in the bioremediation of environments impacted by oil.

Keywords: filamentous fungi, bioremediation, mangrove sediments, oil.

Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... iii

Lista de Figuras

Fundamentação Teórica Pág.

Figura 1 – Estrutura de alguns hidrocarbonetos do petróleo...................................................... 3

Capítulo 1

Figura 1. Número de espécies identificadas a partir dos experimentos - O (osmocote); NPK e

C (controle) - nas 6 coletas realizadas.....................................................................................

Figura 2. Tempo (horas) da redução do indicador DCPIP das 14 espécies testadas obtidas do

sedimento de mangue impactado por petróleo...........................................................................

Capítulo 2

27

29

Figura 1. Biomassa (g/L) dos fungos após 7 dias de experimento em concentrações

crescentes de petróleo.................................................................................................................

38

Figura 2. Valores de pH após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de petróleo... 38

Figura 3. Teor de óleos e graxas após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de

petróleo.......................................................................................................................................

39

Figura 4. Diagrama de Pareto para o planejamento fatorial 24, cuja variável dependente é a

redução no teor de óleos e graxas...............................................................................................

42

Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... iv

Lista de Tabelas

Capítulo 1 Pág.

Tabela 1 - Espécies isoladas nas seis coletas realizadas a partir de sedimento do manguezal

de São Francisco do Conde – BA...........................................................................................

26

Capítulo 2

Tabela 1 - Matriz do Planejamento Experimental 24.................................................................. 36

Tabela 2 - Índice de Germinação para sementes de pepino nos ensaios de aclimatação dos

fungos a diferentes concentrações de petróleo...........................................................................

39

Tabela 3 - Análise de variância entre as variáveis pH, agitação, concentração celular e

concentração da fonte de nitrogênio NH4NO3..........................................................................

41

Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... v

SUMÁRIO

Pág.

RESUMO.................................................................................................................................................. i

ABSTRACT............................................................................................................................................. ii

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................................. iii

LISTA DE TABELAS............................................................................................................................. iv

SUMÁRIO................................................................................................................................................ v

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................................... 1

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...................................................................................................... 2

2.1. Petróleo e derivados............................................................................................................................ 2

2.2. Processos utilizados para limpeza de áreas poluídas.......................................................................... 5

2.2.1. Biorremediação................................................................................................................................ 6

2.3. Fatores que influenciam na biodegradação de hidrocarbonetos......................................................... 8

2.4. Microrganismos na biorremediação................................................................................................... 9

2.4.1 Bactérias........................................................................................................................................... 10

2.4.2 Fungos.............................................................................................................................................. 12

2.5. Aspectos bioquímicos da biodegradação de hidrocarbonetos............................................................ 14

2.6. Manguezal.......................................................................................................................................... 15

2.7 Ecotoxicidade...................................................................................................................................... 17

2.8 Planejamento de Experimentos........................................................................................................... 18

CAPÍTULO 1 - Avaliação do potencial de fungos filamentosos isolados de sedimento de mangue impactado na degradação do petróleo...................................................................................................

22

Resumo...................................................................................................................................................... 22

Introdução.................................................................................................................................................. 22

Material e Métodos.................................................................................................................................... 24

Resultados e Discussão.............................................................................................................................. 26

Conclusão.................................................................................................................................................. 31

CAPÍTULO 2 - Potencial de degradação de petróleo por fungos filamentosos................................. 33

Resumo...................................................................................................................................................... 33

Introdução.................................................................................................................................................. 33

Material e Métodos.................................................................................................................................... 34

Resultados e Discussão.............................................................................................................................. 37

Conclusão.................................................................................................................................................. 42

CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................................................ 43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................................. 44

Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 1

1. INTRODUÇÃO

A contaminação do solo com petróleo e derivados tem se tornado um problema

mundial. O óleo cru é física, química e biologicamente prejudicial ao solo devido aos

seus compostos tóxicos, presentes em concentrações elevadas (Franco et al., 2004).

Entre os ecossistemas costeiros, o manguezal está classificado como um dos mais

sensíveis e vulneráveis a vazamentos de óleo, devido ao aumento das atividades

portuárias, mais especificamente, do transporte de petróleo (Cury, 2002; Monteiro,

2003). A necessidade de descontaminar esses ambientes conduz ao desenvolvimento de

técnicas de limpeza como, por exemplo, a biorremediação (Baker e Herson, 1994;

Rosenberg et al., 1996).

A biorremediação pode ser definida como um conjunto de tecnologias, que

utilizam processo(s) biológico(s), aplicados à recuperação ou remediação de áreas

contaminadas. Para isto, em geral, utilizam-se microrganismos, plantas ou produtos

biológicos, como enzimas e componentes celulares, com a finalidade de transformar os

poluentes orgânicos em água e CO2, num processo chamado mineralização (Genow et

al., 1994; Dias, 2000). Esta técnica pode ser considerada uma alternativa promissora e

ecológica na limpeza de ambientes contaminados por petróleo, devido a maioria dos

compostos orgânicos serem biodegradáveis (Atlas, 1995). A biorremediação pode ser

realizada com a adição de nutrientes e a otimização de condições ambientais do solo

(pH, temperatura, umidade, etc.), num processo chamado de bioestimulação, ou pela

adição de microrganismos com a capacidade de degradar rapidamente contaminantes

específicos, conhecida como bioaumento (Seabra, 2001). Também pode ser executada

ex situ, quando há a necessidade de remoção do material contaminado para a realização

do processo de tratamento fora do local poluído, ou in situ, quando o tratamento do

material é realizado no próprio ambiente onde ocorreu a contaminação, não sendo

recomendada a remoção do material contaminado a fim de evitar maior impacto

(Boopathy, 2000).

A biodegradação é um processo lento e sua cinética pode estar condicionada à

concentração de oxigênio, temperatura, nutrientes (especialmente o nitrogênio e o

fósforo), salinidade, receptores de elétrons, pH, composição estrutural dos

hidrocarbonetos e biodegradabilidade dos compostos (Raymond et al., 2001).

Entretanto, a pré-exposição do local a um composto químico poluente ou a um

composto quimicamente semelhante, pode influenciar na velocidade de degradação

deste composto, pela indução de enzimas específicas dos microrganismos presentes, ou


pelo aumento da população degradadora (Racke, 1990). Esse processo tem sido

chamado de adaptação, o qual pode ser resultado de mudanças genéticas, fisiológicas ou

ecológicas da comunidade microbiana (Brito et al., 2004).

Os fungos constituem uma grande parte da biomassa microbiana no solo,

contribuindo para muitos processos de decomposição, sendo relatados como os

microrganismos mais importantes na biodegradação de hidrocarbonetos presentes em

solos (Jones e Eddington, 1968; Rosato, 1998), principalmente por serem capazes de

interagir fisicamente com o poluente e crescer sob condições ambientais de estresse,

como baixos valores de pH, pobres em nutrientes e com baixa atividade de água

(Mollea et al., 2005; Atagana, 2006).

Paralelamente à remediação de locais contaminados por petróleo, existe a

necessidade do desenvolvimento de testes para a avaliação da ecotoxicidade dos

produtos gerados, visando à definição da qualidade aceitável do solo para o

restabelecimento do equilíbrio do ecossistema (Chapman, 1999; Andréa e Pettinelli Jr.,

2000). Dentre esses, os testes utilizando vegetais constituem um recurso prático de

baixo custo e de sensibilidade razoável na indicação qualitativa da presença de

substâncias tóxicas ou inibidores biológicos (Pelegrini et al., 2006). Neste sentido, os

testes de fitotoxicidade baseados na germinação de sementes e no crescimento radicular

têm sido propostos por diversas agências governamentais, como parte da avaliação do

potencial de contaminação de resíduos e/ou rejeitos dispostos no ambiente (OECD,

1984; USEPA, 1996).

Este estudo teve como principal objetivo avaliar a capacidade de fungos isolados

de sedimento de mangue impactado, quanto à degradação de petróleo e avaliar a

influência de diferentes parâmetros no processo de biodegradação.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. PETRÓLEO E DERIVADOS

O termo petróleo refere-se aos derivados de matéria orgânica, originados há

milhões de anos, a partir da decomposição de pequenos animais marinhos, plâncton e

vegetação típica de regiões alagadiças que foram depositados sob camadas sucessivas

de lama e sedimentos, resultando na produção e acumulação de milhares de diferentes

tipos de moléculas orgânicas em sedimentos antigos (UNEP, 1992; Fonseca, 1992). É

encontrado em grandes quantidades sob a superfície terrestre e usado como combustível

e matéria-prima para a indústria química (Wasserman e Plachta, 1994). A fração líquida


total do petróleo, denominada de óleo cru, é encontrada junto ao gás natural (metano),

formando bolsões entre rochas impermeáveis ou impregnando rochas de origem

sedimentar. Na composição química do petróleo encontram-se uma mistura complexa

de diversos compostos orgânicos, os quais podem ser separados em classes distintas em

função da sua estrutura molecular, como olefinas, n-alcanos, parafinas ramificadas,

parafinas cíclicas, compostos aromáticos, compostos oxigenados e compostos

sulfurados. Entretanto, destacam-se os hidrocarbonetos, compostos orgânicos que

contém carbono e hidrogênio, os quais constituem de 50-98% da composição total do

petróleo, sendo formados por alcanos, cicloalcanos e compostos aromáticos, com pelo

menos um anel benzênico em sua estrutura (Fig.1) (Botello, 2005).

Figura 1. Estrutura de alguns hidrocarbonetos do petróleo

Os derivados de petróleo são obtidos a partir da destilação do óleo cru, onde as

frações são submetidas a tratamentos complexos para que sejam convertidas nos

produtos finais desejados, tais como: a) produtos de baixo peso molecular - gasolina,

combustíveis de aviação e óleo Diesel; b) produtos de alto peso molecular - óleos

lubrificantes e outros combustíveis; c) produtos de altíssimo peso molecular - asfaltenos

e piches (Millioli et al., 2008).

A sociedade moderna é dependente do petróleo, porém, este, representa uma

significativa fonte de poluição, por causar efeitos ecológicos de curta e longa duração e

trazer prejuízos às atividades socioeconômicas nos territórios atingidos (La Grega et al.,

1994). Os impactos ambientais ocasionados pelo petróleo ocorrem, principalmente pelas

diversas atividades destinadas à exploração como extração, transporte, refino,


transformação e utilização deste hidrocarboneto e/ou derivados (Aleixo et al., 2007;

Jacques et al., 2007). Todas essas atividades envolvem riscos de derrames acidentais,

que podem ser minimizados, mas não totalmente eliminados. Felizmente, os grandes

derrames que contaminam oceanos e áreas costeiras de forma significativa não ocorrem

com frequência, como os desastres ambientais com 200 mil toneladas de petróleo

despejadas na costa da França pelo acidente com o navio petroleiro Amoco Cadiz

(1978) deixando uma mancha de 110km nas praias da Grã-Bretanha e ainda, as cerca de

40 mil toneladas de petróleo lançadas pelo Exxon Valdez no litoral do Alasca (1989),

onde a riqueza da fauna local fez deste, um dos mais graves acidentes da história; o

incêndio do Haven, na costa da Itália, devido a 140 mil toneladas de óleo a bordo

(1991); o navio Prestige (2002) que transportava 77 mil toneladas de petróleo e se partiu

na costa da Galícia, Espanha, provocando o vazamento de 40 mil toneladas, as quais

atingiram centenas de quilômetros da costa causando grande impacto ambiental e

transtornos econômicos irreparáveis (Drago, 2003; CETESB, 2009; ITOPF, 2009).

O primeiro acidente ocorrido no Brasil foi em 1974, com o navio Takimyia

Maru no estado de São Paulo. O segundo ocorreu em 1975, causado pelo rompimento

do casco do navio-tanque iraquiano Tarik Ibn Ziyad, no canal central de navegação da

Baía de Guanabara atingindo várias praias nas cidades do Rio de Janeiro e de Niterói,

tanto no interior da Baía quanto na costa oceânica. O óleo provocou incêndios em áreas

de manguezal, em torno da baía, e a contaminação afetou seriamente a biota da zona

entremarés (Crapez et al., 2002). Outro grande acidente ambiental envolvendo

vazamento de petróleo ocorreu no Estado de São Paulo em 1978, quando o navio-

tanque Brazilian Marina, derramou cerca de 6000 toneladas de óleo no Canal de São

Sebastião. Em agosto de 1997, um vazamento nas instalações dos Dutos e Terminais do

Sudeste (DTSE) atingiu o manguezal adjacente à Refinaria Duque de Caxias (Reduc),

na baía de Guanabara. Além do manguezal, o óleo se espalhou pelas praias de

Freguesia, Barão, Pitangueiras, Bandeira e Zumbi, localizadas na ilha do Governador.

Em janeiro de 2000, outro vazamento de óleo ocorreu no mesmo local, atingindo

inúmeros manguezais, além da ilha de Paquetá e do norte e leste da ilha do Governador.

Esse vazamento foi considerado um dos maiores acidentes com petróleo já ocorridos na

baía de Guanabara. Neste mesmo ano o duto da Refinaria Getúlio Vargas se rompeu, em

Araucária - Paraná, espalhando mais de 4 milhões de litros de óleo no rio Iguaçu,

provocando um grave impacto ao ambiente, acarretando a morte de peixes e várias

espécies de animais (Santo, 2002). Em 2004, mais um registro de acidente ocorreu no


Paraná com um navio de bandeira chilena que derramou óleo e metanol, atingindo

manguezais e praias (CETESB, 2009). Mais recentemente, em abril de 2009, ocorreu

um vazamento de aproximadamente 2,5 mil litros de óleo da Refinaria Landulfo Alves,

em Mataripe - Bahia, que atingiu praias na Baía de Todos os Santos (IMA, 2009).

Em virtude dessas ocorrências, a recuperação de áreas degradadas vem se

configurando como um desafio e tornando-se objeto de interesse cada vez maior para os

pesquisadores.

2.2. PROCESSOS UTILIZADOS PARA A LIMPEZA DE ÁREAS POLUÍDAS

Após a detecção de um acidente ou mesmo de pequenos vazamentos, medidas

emergenciais são tomadas durante o derramamento de óleo com intuito de minimizar o

efeito do desastre. As técnicas existentes para o tratamento de áreas poluídas podem ser

classificadas segundo a natureza do processo – físico (mecânico), químico ou biológico

- e local onde ocorre o tratamento - in situ ou ex situ. Nos processos in situ, o tratamento

é feito no próprio local de contaminação, sem a extração do meio contaminado. Já nos

processos ex situ, o meio extraído é tratado em instalação de depuração específica

(Seabra, 2001). Essas técnicas devem levar em conta os tipos de microrganismos

existentes no local; condições da área e toxicidade do poluente; volume do material a

ser tratado; tempo e custo para a utilização da tecnologia e, principalmente, a

concentração final do contaminante, no término do tratamento, que deve ser considerada

como aceitável para o tipo de resíduo e uso futuro da área (Walter e Crawford, 1997).

A atenuação natural pode ser descrita como o conjunto de processos físicos,

químicos e biológicos que ocorrem espontaneamente após contaminação em uma

determinada área. Este processo inclui diversos mecanismos tais como: adsorção,

biodegradação, diluição, dispersão, estabilização, evaporação, fotoxidação,

volatilização, entre outros (Fernandes, 1994; Moreno, 2004).

Os processos abióticos de tratamento de áreas poluídas são definidos como

aqueles que envolvem métodos físicos ou químicos de remoção de poluentes (Piña et

al., 2002).

Os métodos físicos mais utilizados, em ambientes marinhos são as barreiras

mecânicas para a contenção da mancha oleosa e barcos dotados de bombas

recuperadoras de óleo. A coleta manual, com auxílio de pás e baldes é utilizada para a

remoção física do óleo nas areias das praias, seguida de lavagens, porém os meios

mecânicos de remoção não são totalmente eficazes e permitem o acúmulo nas áreas


atingidas pelo derramamento (Burns et al., 2000). Dentre os métodos químicos, os mais

comuns são a neutralização, precipitação, oxidação, aplicação de surfactantes e a

extração por solventes (Yerushalmi et al., 2003; Mariano, 2005). A maioria dos

surfactantes é obtida por síntese química a partir de derivados do petróleo, entretanto

sua aplicação e utilização podem causar impacto ambiental, uma vez que aumentam a

dissolução do óleo na água, afetando a biota; são tóxicos e não são biodegradáveis

(Nordvik et al., 1996; Desai e Banat, 1997).

As dificuldades encontradas na remediação abiótica de áreas contaminadas tem

levado ao desenvolvimento de novas tecnologias que enfatizam a detoxificação dos

contaminantes de uma forma não convencional, ou seja, sem a utilização de métodos

somente químicos ou físicos.

2.2.1 BIORREMEDIAÇÃO

Dentre as novas técnicas que visam à remediação de ambientes poluídos e a

recuperação de solos contaminados, a biorremediação surgiu como prática atrativa de

remoção de hidrocarbonetos de petróleo, por causa da simplicidade da manutenção,

aplicação em grandes áreas, baixo custo e da possibilidade de ocasionar a redução do

contaminante no local (Bento et al., 2005), além de ser a forma de tratamento menos

agressiva ao meio ambiente e a mais adequada à manutenção do equilíbrio ecológico, já

que é um sistema que estimula os processos naturais de remediação (Rahman et al.,

2002).

A biorremediação pode ser definida como um conjunto de tecnologias, que

utilizam processo(s) biológico(s) para a estimulação de situações naturais de

biodegradação visando a limpeza de derramamentos de óleos e tratamento de ambientes

terrestres e aquáticos contaminados com compostos xenobióticos (substância sintética

que polui o meio ambiente) (Prince, 1993; Dias, 2000). Os mais eficientes

biodegradadores são as bactérias, os fungos e as leveduras, devido à abundância, grande

diversidade de espécies, versatilidade catabólica e anabólica, bem como a capacidade de

adaptação às condições adversas do meio (Teixeira e Lima, 1991 apud Kataoka, 2001).

Através do metabolismo desses microrganismos, os poluentes orgânicos podem ser

transformados até água e CO2 (processo chamado de mineralização) (Genow et al.,

1994), além de biomassa e materiais húmicos (Grove, 1978; Thomas e Ward, 1989),

metano (CH4) e sais inorgânicos (Dineen et al., 1992). Esse processo pode ocorrer tanto

sob condições anaeróbicas como aeróbicas, sendo a última mais expressiva (Cookson,


1995), pois uma baixa concentração de oxigênio geralmente afeta a mineralização dos

hidrocarbonetos pelos microrganismos (Vasudevam e Rajaram, 2001). O resultado final

de um tratamento de biodegradação depende especialmente da toxicidade e

concentração inicial do contaminante, biodegradabilidade, propriedades do solo

contaminado e do sistema de tratamento escolhido (Dias, 2000).

Em função da importância do tema o Conselho Nacional do Meio Ambiente -

CONAMA publicou a resolução 314 de 29 de outubro de 2002, que dispõe sobre o

registro de produtos destinados à remediação, considerando que os acidentes com

vazamentos de substâncias potencialmente poluidoras, incluindo petróleo e seus

derivados, constituem uma das principais fontes de poluição do meio ambiente e que o

uso de remediadores - definidos como o produto, constituído ou não por

microrganismos, destinado à recuperação de ambientes e ecossistemas contaminados - é

uma opção viável nas ações específicas de recuperação, além de que em função de suas

peculiaridades ou de um uso inadequado, os remediadores podem acarretar

desequilíbrio no ecossistema e danos ao meio ambiente (CONAMA, 2002).

A biorremediação pode ser realizada aumentando-se a atividade microbiana

local, por meio da alteração da área degradada para propiciar as condições ótimas de

degradação biológica dos componentes tóxicos. O bioestímulo pode ser realizado

usando-se a adição de nutrientes e a otimização de condições ambientais do solo, como

ajuste de pH e controle da umidade e da aeração. Já o bioaumento, consiste na adição

de microrganismos exógenos com a capacidade de degradar rapidamente contaminantes

específicos, isolados naturalmente ou manipulados geneticamente, ou apenas seu DNA

purificado (Baker e Herson, 1994; Rosato, 1998; Boopathy, 2000; Seabra, 2001;

Martins, 2003).

Outras técnicas são citadas por Baker e Herson (1994) e Bento et al. (2005)

como a bioventilação, tratamento no qual o crescimento e atividade microbiana são

estimulados pela passagem de oxigênio pelo solo contaminado; o “landfarming” que é,

atualmente, uma das técnicas preferidas para a remediação de solos contaminados por

derramamento de combustíveis. Este método envolve o espalhamento e mistura dos

resíduos à camada fértil do solo, sendo, periodicamente, revolvidos para promover a

homogeneização, aeração e para facilitar o contato de microrganismos nativos como o

poluente. A homogeneização e a aragem do solo, geralmente, são realizadas por meio de

tratores utilizados na agricultura (Jorgensen et al., 2000); a compostagem, tratamento

aeróbico, termofílico que pode ser feito usando pilhas estáticas ou reatores de


alimentação contínua; a fitorremediação que utiliza sistemas vegetais (árvores,

arbustos, plantas rasteiras e aquáticas) e a sua microbiota com o fim de remover,

degradar ou isolar substâncias tóxicas do ambiente; os biorreatores técnica que pode

ser usada para tratar líquidos ou lodo, onde a biodegradação ocorre em um container ou

reator e os biofiltros que consiste no uso de colunas de suspensão microbiana para

tratar emissão de gases.

2.3. FATORES QUE INFLUENCIAM NA BIODEGRADAÇÃO DE

HIDROCARBONETOS

A biodegradação é o mecanismo primário de eliminação de hidrocarbonetos e

substâncias xenobióticas, sendo considerado como o processo mais importante para

determinar o destino final do óleo no ambiente marinho (Atlas, 1981; Ghazaly e Sayed,

2000).

A velocidade da degradação microbiológica dos hidrocarbonetos é influenciada

por diversos fatores físicos, químicos e biológicos, que direta ou indiretamente tem

influência sobre o metabolismo e, por conseguinte, no crescimento das espécies

microbianas, afetando a eficiência do processo (Macedo et al., 2002). Os principais

fatores que afetam a biodegradabilidade são relatados a seguir:

- Temperatura: Influencia no processo de biodegradação devido ao seu efeito no

metabolismo, composição da microbiota presente no sítio contaminado e nas

características físico-químicas dos hidrocarbonetos. Em geral, temperaturas mais altas

aumentam a taxa de metabolismo atingindo valores ideais entre 30°C e 40°C (Atlas,

1991). Nyer (1992) defende que a faixa ótima está entre 20°C e 45°C. Del’Arco e

França (2001) também relatam que a biorremedição em locais impactados por petróleo é

favorecida quando a temperatura está entre 20°C e 40°C.

- pH: A maioria dos microrganismos apresenta uma melhor taxa de desenvolvimento

em pH entre 6 e 8, com valor ótimo em torno de 7, sendo que os fungos são tolerantes a

condições mais ácidas, podendo ocorrer o dobro da taxa de biodegradação com a

correção do pH do solo (Verstraete et al., 1976; Bosset e Bartha, 1984; Rosato, 1998).

Condições extremas de pH, como as que ocorrem em solos ácidos ou desertos alcalinos,

influenciam negativamente na capacidade dos microrganismos degradarem

hidrocarbonetos em solo (Atlas, 1991).

- Nutrientes: Os hidrocarbonetos presentes na composição do petróleo podem servir

como substrato para o desenvolvimento dos microrganismos. Entretanto, outros


nutrientes como nitrogênio e fósforo são necessários, uma vez que em ambientes

contaminados por este poluente, as fontes de N e P estão em quantidades inadequadas

para o crescimento microbiano, tendo em vista a elevada quantidade de carbono

disponível a ser degradado (Miroslav et al., 1996). As fontes de nitrogênio mais

utilizadas em protocolos de biorremediação são uréia, cloreto de amônio e nitrato de

amônio e de fósforo são: fosfato de potássio e fosfato de sódio (Leahy e Colwell, 1990;

Lieberg e Cutright, 1999).

- Disponibilidade de Oxigênio: Geralmente a biorremediação ocorre mais facilmente

sob condições aeróbicas, uma vez que o catabolismo de hidrocarbonetos envolve a

oxidação inicial do substrato por oxigenases, sendo sua principal importância a de

funcionar como aceptor final de elétrons (Atlas, 1984). Amellal (2001) verificou que

regiões próximas à superfície do solo têm demonstrado maior velocidade na taxa de

degradação, enquanto que em regiões mais profundas estas taxas diminuem.

- Umidade: A umidade é um dos fatores que mais afeta a atividade microbiana pois, a

água é um componente indispensável à viabilidade das células vivas, além de auxiliar

nas trocas gasosas e no transporte de nutrientes (Alexander, 1999). Del’Arco e França

(2001), destacaram que o teor de umidade na faixa de 23,3% a 25,5% é o mais

apropriado para solos contaminados com hidrocarbonetos.

- Outros Fatores: Por fim, o uso da técnica da biorremediação depende de muitos outros

fatores, entre os quais: características do solo; tipo, composição, concentração,

biodisponibilidade e toxicidade dos poluentes; o histórico da contaminação; o

conhecimento da densidade da população de microrganismos degradadores de óleo e o

seu potencial de biodegradação, para o alcance das condições ótimas de biodegradação

(Hamdi et al., 2007; Bento et al., 2005).

2.4. MICRORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO

Diversos microrganismos possuem capacidade de degradar hidrocarbonetos do

petróleo, contudo, os principais são as bactérias e os fungos, os quais podem ser

encontrados em ambientes marinhos, de água doce e no solo. Até o momento, vários

gêneros de microrganismos com capacidade para degradar hidrocarbonetos foram

detectados no solo ou água contaminada por petróleo, o que sugere que cada um

desempenhe um papel no processo de transformação de hidrocarbonetos (Atlas, 1991;

Ramsay et al., 2000; Ghazali et al., 2004).


Os fungos são conhecidos pela sua diversidade e habilidade notável para

degradar materiais naturais complexos e persistentes, tais como lignina, quitina e

celulose. Portanto, algumas características dos fungos filamentosos, como a

bioatividade e o crescimento morfológico, os tornam potencialmente melhores

degradadores do que as bactérias. Além disso, os fungos demonstram que são capazes

de crescer sob condições ambientais de estresse, mesmo em baixos pH, baixo teor de

nutrientes e com baixa atividade de água (Mollea et al., 2005; Atagana, 2006). Porém, é

conhecido que os microrganismos podem não degradar o contaminante numa exposição

inicial, mas fazê-lo após uma exposição duradoura (Simom, 1999). Segundo Linkfield

et al. (1989), normalmente existe um período inicial de adaptação ao poluente em que

nenhuma transformação ocorre ou não é detectada, seguida por um período de início e

aceleração da degradação. Essas adaptações metabólicas tem sido objeto de estudo

quanto aos mecanismos que as causam, dentre elas a de adaptação e indução de enzimas

biodegradadoras, mutações genéticas ou adaptação fisiológica a condições de estresse

por carência nutricional (Brito et al., 2004).

2.4.1 Bactérias

Os primeiros estudos da utilização de hidrocarbonetos por microrganismos

foram realizados por Sohnger e Kaserer em 1906 (Bushnell e Haas, 1941). Em 1913,

Sohnger relatou que gasolina, querosene, parafina e óleo de parafina poderiam ser

oxidados a CO2, água e traços de ácidos orgânicos por bactérias pertencentes,

principalmente, aos gêneros Mycobacterium e Pseudomonas. Gray e Thornton (1928)

isolaram vários organismos capazes de decompor compostos aromáticos como

naftaleno, tolueno, cresol e fenol pertencentes aos seguintes gêneros: Micrococcus,

Mycobacterium, Bacterium, Bacillus e Spirillum.

Kobayashi e Rittmann (1982) relataram em seu trabalho, que os organismos

mais comumente isolados em áreas contaminadas por hidrocarbonetos foram bactérias

heterotróficas dos gêneros Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Vibrio,

Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium.

Leahy e Colwell (1990) citam os gêneros Achromobacter, Acinetobacter,

Alcaligenes, Arthobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia e Pseudomonas como os

mais importantes na degradação de hidrocarbonetos no ambiente.

Outros estudos sobre degradação de hidrocarbonetos feitos por Kadri et al.

(1986), Shamshoom et al. (1990), Sorkhoh et al. (1990), Al-Hadhrami et al. (1997),


identificaram como potenciais degradadores os isolados de Acinetobacter, Aeromonas,

Bacillus, Escherichia coli, Flavobacterium, Klebsiella cepacia, Micrococcus luteus,

Moraxella phenylpiruvica, Nocardia, Ochrobactrum anthropi, Pseudomonas

aeruginosa, Pseudomonas sp., Proteus mirabilis, Vibrio, Rhodococcus, Streptomyces,

Vibrio fisheri e Xanthomonas maltophilia.

Robert e Israel (1994) isolaram várias cepas de bactérias oleofílicas incluindo

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas fluorescens e

espécies de Acinetobacter e Flavobacterium, as quais foram capazes de utilizar vários

hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos (Diesel, óleo mineral, hexadecano, fenantreno,

entre outros), como fonte de energia.

Em estudo para avaliar o crescimento sobre o petróleo, Rentería e Miranda

(1998) utilizaram noventa cepas de bactérias, pertencentes a diversos gêneros

provenientes de amostras de água e solo contaminados com petróleo e observaram que

os gêneros que mostraram maior atividade de degradação foram: Micrococcus,

Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter e Flavobacterium. No processo de

biodegradação dos hidrocarbonetos do petróleo pelas bactérias, aproximadamente 50%

do carbono é usado para crescimento da biomassa bacteriana (Sharabí e Bartha, 1993).

Ururahy (1998) estudaram a viabilidade técnica do tratamento biológico de borra

oleosa em escala de bancada. A partir de estímulo de microrganismos nativos presentes

no resíduo oleoso, concluíram que os mesmos foram capazes de crescer em meio

contendo borra de óleo como única fonte de carbono e energia. A identificação desses

microrganismos revelou a presença das bactérias Pseudomonas cepacia, Pseudomonas

aureofaciens, Pseudomonas picketti, Flavobacterium indologenes, Xanthomonas

maltophilia e Ochrobactrum anthropi, além das leveduras Candida tropicalis e

Rhodotorula mucilaginosa e duas espécies de fungos filamentosos.

Bracho et al. (2005) demonstraram a capacidade de algumas bactérias

pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus e Micrococcus,

provenientes de solos contaminados por petróleo na Venezuela, em degradar

hidrocarbonetos, constituindo-se como potenciais recuperadoras de ambientes

impactados.

Pedroti (2007) isolou um total de 19 cepas de bactérias, a partir de solos de horta

e sedimento de manguezal no Espírito Santo, que apresentaram capacidade de

biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo, as quais pertencem aos gêneros:


Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Serratia, Hafnia, Staphylococcus, Enterobacter,

Citrobacter, Listonella e Micrococcus.

2.4.2 Fungos

Os fungos parecem ser os microrganismos mais importantes na biodegradação

de hidrocarbonetos presentes em solos (Rosato, 1998). Neste ambiente, os atributos que

distinguem os fungos filamentosos das outras formas de vida determinam porque eles

são bons biodegradadores. Primeiramente o crescimento micelial proporciona uma

vantagem competitiva sobre as formas unicelulares como as bactérias e leveduras,

especialmente com respeito à colonização do substrato. Os fungos filamentosos podem

rapidamente se ramificar através do substrato, literalmente digerindo seu caminho

através da excreção de enzimas degradadoras. Em segundo lugar, a natureza

extracelular das enzimas de degradação permite que estes fungos tolerem concentrações

de substâncias químicas tóxicas mais altas, do que seria possível se estes compostos

tivessem de ser incorporados à célula. Adicionalmente os compostos insolúveis que não

são capazes de atravessar a membrana celular são suscetíveis ao ataque. E finalmente,

as enzimas produzidas frequentemente não apresentam natureza específica o que

significa que podem agir numa diversa gama de substratos químicos (Cerniglia et al.,

1992; Bennett e Faison 1997; Paszczynski e Crawford, 2000).

Alguns gêneros tais como Beauveria, Acremonium, Cladosporium, Fusarium e

Trichoderma tem sido descritos como degradadores de hidrocarbonetos de petróleo

(Hölker et al., 1995; Peintner e Moser, 1996; Chaîneau et al., 1999). Cunningamella

elegans e Phanerochaete crysosporium têm sido citados na literatura como agentes

capazes de serem utilizados na despoluição de solos e ambientes contaminados por

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (Barbiere, 1998). Ainda entre os fungos

hidrocarbonoclásticos mais citados estão Penicillium, Verticillium, Mortieriella, Phoma,

entre outros (Brito, 2004).

Emtiazi et al. (1997) estudaram algumas espécies de fungos filamentosos

isoladas de solo contaminado por petróleo para degradar derivados deste composto.

Dentre as espécies testadas, Aspergillus niger e Aspergillus puvus foram capazes de

crescer utilizando o fenantreno e antraceno como única fonte de carbono e energia.

Lima et al. (2006), identificaram oito fungos filamentosos isolados de solo

contaminado com óleo Diesel, pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e

Trichoderma e avaliaram o potencial de degradação da fonte de carbono a partir da


velocidade de crescimento radial da colônia em meios contendo resíduos de derivados

de petróleo (Diesel e gasolina) e óleo de soja, como fontes de carbono. Os isolados que

apresentaram maior velocidade de crescimento radial pertenciam aos gêneros

Aspergillus e Trichoderma. Burkert et al. (2008) também utilizaram a taxa de

crescimento radial para avaliar o potencial de degradação de quatro linhagens de

Aspergillus sp. isoladas de solo contaminado no Rio Grande do Sul. As linhagens

demonstraram ser capazes de crescer em meios contendo diferentes hidrocarbonetos

específicos ou derivados de petróleo, como gasolina, óleo Diesel, hexano e

clorobenzeno, como únicas fontes de carbono.

Em estudo com fungos filamentosos isolados de águas residuárias de postos de

gasolina, Silva et al. (2007) selecionaram linhagens resistentes a condições adversas,

capazes de degradar compostos fenólicos. Foram isoladas e purificadas quatro linhagens

de fungos filamentosos pertencentes aos gêneros Aspergillus, Cladosporium, Penicilium

e Phoma.

Silva e Monteiro (2000) identificaram os gêneros Acremonium, Paecilomyces e

Penicillium, isolados de areia contaminada com fenóis, com potencial em degradar

compostos xenobióticos, como o organoclorado PCF (composto derivado do fenol) e os

corantes índigo e Azul Brilhante de Remazol – R (RBBR). Também estudando a

capacidade de descoloração do corante RBBR, Vitalli et al. (2006) testaram cinqüenta e

cinco isolados de fungos filamentosos obtidos de solos da Região da Baixada Santista

contaminados com resíduos industriais contendo uma mistura de organoclorados,

principalmente hexaclorobenzeno (HCB). Dentre as espécies testadas, Eupenicillium

crustaceum foi selecionada devido a sua capacidade de descolorir o corante

promovendo a transformação do HCB em um composto ambientalmente estável,

sugerindo esta como sendo uma espécie interessante para estudos de biorremediação.

Okerentugba e Ezeronye (2003) testaram algumas espécies de fungos

(Penicillium spp., Aspergillus spp. e Rhizopus spp) isoladas de dois rios e de um

efluente de uma refinaria na Nigéria para degradar óleo cru. Foi observado que os

microrganismos foram capazes de utilizar e degradar os constituintes do óleo cru, e

também que os degradadores podem ser isolados de um ambiente que não sofreu

poluição por petróleo, embora aqueles provenientes de ambientes impactados possuam

maior potencial de degradação.

A fim de investigar a possibilidade de utilização de espécies de fungos, isolados

de sementes oleaginosas de Detarium senegalense para degradar hidrocarbonetos do


petróleo e produtos derivados como Diesel, querosene e óleo de motor, Adekunle e

Adebambo (2007) identificaram cinco isolados: Aspergillus flavus, A. niger, Mucor,

Rhizopus e Talaromyces, com capacidade para serem explorados em processos de

biorremediação.

Uzoamaka et al. (2009) estudaram o potencial de degradação de hidrocarbonetos

por fungos filamentosos isolados a partir de solo contaminado por petróleo e concluíram

que dentre os 12 isolados, apenas 8 mostraram potencial para biodegradação. A maior

eficiência de biodegradação (>98%) foi exibida por A. versicolor e A. niger.

A capacidade dos fungos em recuperar ambientes contaminados por diferentes

poluentes aplica-se também a metais pesados (Peintner e Moser, 1996; Barclay et al.,

1998), defensivos agrícolas (Paoletti, 1999), corantes e compostos radioativos

(Haselwandter e Berreck, 1988), plásticos (Beuadette et al., 1998), herbicidas (Colla et

al., 2008), entre outros.

2.5. ASPECTOS BIOQUÍMICOS DA BIODEGRADAÇÃO DE

HIDROCARBONETOS

As vias bioquímicas utilizadas para a degradação de hidrocarbonetos dependem

do substrato a ser utilizado e do tipo de microrganismo envolvido. Embora muitos

mecanismos de biodegradação sejam conhecidos alguns aspectos precisam ainda ser

elucidados. Contudo, segundo Baker e Herson (1994) e Pereira-Jr et al. (2009), algumas

generalizações podem ser feitas:

i. Hidrocarbonetos alifáticos são em geral, mais facilmente biodegradados que os

aromáticos;

ii. Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia normal são mais fáceis de serem

biodegradados do que os de cadeia ramificada. A introdução de uma ramificação

diminuirá sua biodegradabilidade;

iii. Hidrocarbonetos saturados são mais susceptíveis à degradação que os

insaturados. A presença de insaturações dificulta a biodegradação;

iv. Hidrocarbonetos alifáticos com tamanho de cadeia a partir de 8 átomos de

carbono são mais facilmente biodegradados tanto menor seja o tamanho de sua cadeia.

Hidrocarbonetos com menos de 7 átomos de carbono são mais difíceis de serem

biodegradados devido a sua toxicidade para os microrganismos.

O caminho metabólico responsável pela biodegradação aeróbica completa dos

alcanos lineares, normalmente envolve a ação de enzimas hidroxilases, conhecidas


também como monoxigenases, gerando os alcoóis correspondentes, a partir da oxidação

do grupo terminal (oxidação monoterminal). Posteriormente, os alcoóis produzidos são

oxidados a aldeídos e, então, a ácidos graxos, seguindo seu caminho metabólico até

atingir CO2 e H2O como produtos finais (Connan, 1981). Os alcanos ramificados

sobrem β-oxidação, como via degradativa mais comum, com formação de ácidos

dicarboxílicos (Fall et al., 1979).

Os cicloalcanos são particularmente resistentes a biodegradação (Chosson et al.,

1991). Inicialmente são transformados nos alcoóis correspondentes, que então sofrem

uma desidrogenação, formando cetonas. As enzimas envolvidas neste processo são as

ciclo-desidrogenases e monooxigenases, respectivamente. Numa etapa posterior há a

lactonização do anel por monooxigenases e a abertura do mesmo pela lactona-hidrolase

(Ururahy, 1998; Pereira-Jr et al., 2009).

O potencial de biodegradação dos hidrocarbonetos aromáticos está relacionado

ao número de anéis, posições, tipos e natureza das ramificações encontradas nas

moléculas (Peters e Moldowan, 1993). Tipicamente, a biodegradação de um composto

aromático simples pode envolver a oxidação do átomo de hidrogênio do anel aromático,

gerando dihidroxibenzeno (catecol) que, posteriormente, é clivado na posição orto ou

meta, sendo estas reações catalisadas por enzimas oxigenases (Ratledge, 1993; Baker &

Herson, 1994).

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) constituem a classe de

compostos orgânicos perigosos que contem dois ou mais anéis benzênicos condensados,

podendo se apresentar sob forma linear, angular, ou ainda em forma de cacho. Não são

abundantes no petróleo, mas geralmente os principais constituintes dos óleos

combustíveis. Esses compostos exercem, de maneira geral, efeitos carcinogênicos e

mutagênicos, além de tenderem a recalcitrância, devido à elevada hidrofobicidade e

consequente baixa solubilidade em água. O caminho metabólico sugerido para estes

compostos é o mesmo dos compostos aromáticos simples (Cookson, 1995; Pereira-Jr et

al., 2009).

2.6. MANGUEZAL

O manguezal é um ecossistema costeiro complexo, de transição entre os

ambientes terrestre e marinho. Característico de regiões tropicais e subtropicais está

sujeito ao regime das marés, dominado por espécies vegetais típicas, caracterizadas por

colonizarem sedimentos predominantemente lodosos, com baixos teores de oxigênio, às


quais se associam com outros componentes vegetais e animais (Hoff et al., 2002). As

florestas de mangue de todo o litoral brasileiro são compostas de três gêneros:

Avicennia (mangue preto), Laguncularia (mangue branco) e Rhizophora (mangue

vermelho), podendo existir ainda representantes do gênero Conocarpus, que vivem nos

bordos da floresta, sendo comum no litoral Norte (Por, 1994; Schaeffer-Novelli, 1995).

Citrón & Schaeffer-Novelli (1983) citam ainda as bactérias e os fungos como

importantes componentes dos manguezais, onde exercem destacado papel, atuando

como agentes decompositores da matéria orgânica produzida por todo o conjunto de

produtores primários.

A importância ecológica do manguezal é devida as funções que desempenha na

estabilização e proteção da linha costeira e por apresentar condições propícias para

alimentação, proteção e reprodução de muitas espécies animais, sendo considerado

importante transformador de nutrientes em matéria orgânica e gerador de bens e

serviços (Schaeffer-Novelli, 1995). Por outro lado, o manguezal tem um valor

econômico incalculável devido ao seu papel como criatório de espécies para a pesca,

extração de madeira para usos artesanais e comerciais, bem como extração de taninos -

substância a partir da qual se produzem tintas utilizáveis na manufatura de roupas - e

compostos úteis à indústria farmacêutica (Ipieca, 1993; Lewis, 2005).

Em todo o mundo, os manguezais estão sujeitos a impactos naturais e processos

de erosão, além dos impactos antrópicos associados às atividades das civilizações nas

zonas costeiras (NOAA, 1993). Estima-se que mais de 1 milhão de hectares de

manguezais são perdidos anualmente no mundo (Moscatelli, 1999). Entretanto,

derramamentos de petróleo no mar, ocasionados por acidentes marítimos no transporte

ou na exploração, tem causado catástrofes de grandes proporções ao meio ambiente e

aos seres vivos, principalmente quando atingem a região costeira (Cury, 2002; Ferrão,

2005). Áreas costeiras são classificadas como um dos ambientes mais críticos para

acidentes envolvendo derramamento de óleo, isto devido ao longo tempo de residência

do material fóssil nestes ambientes, que pode exceder a 10 anos, com um tempo

estimado de recuperação de 20 anos (Gundlach e Hayes, 1978).

Devido as suas características peculiares, o manguezal é fonte de

microrganismos promissores para serem utilizados em processos de biodegradação. O

trabalho de Zhuang e Peng (1995) demonstrou que os microrganismos isolados de solo

de manguezal possuem uma habilidade excepcional na degradação de óleo Diesel,


destacando o manguezal como importante na “bio-engenharia” das regiões estuarinas e

costeiras para a degradação do óleo Diesel.

Gomez-Roxas e Ayuno (2002) conduziram um estudo em dois manguezais

situados ao sul das Filipinas, para determinar o efeito do petróleo sobre as populações

de bactérias e fungos, bem como isolar microrganismos com potencial para

biodegradação do petróleo. A partir de análise por cromatografia em camada fina,

concluíram que três isolados de bactéria e dois de fungos degradaram parcialmente o

petróleo, e outros dois isolados de fungos foram capazes de degradar totalmente as

moléculas do óleo.

Salvo et al. (2005) encontraram comunidades de fungos com alta capacidade

para degradação in situ de compostos xenobióticos em ambientes impactados. Os

resultados apresentados por Brito et al. (2006) apontam para a rica diversidade

microbiana dos manguezais, cujo potencial para degradação de hidrocarbonetos é

promissor para futuros estudos sobre biorremediação de poluentes.

O impacto ambiental causado por vazamento de óleo na costa brasileira tem sido

uma ameaça permanente à integridade dos ecossistemas costeiro e marinho. Com o

aumento da produção petrolífera, um grande número de ocorrências de vazamentos e

derrames acidentais de petróleo em operações rotineiras (com pequena e média

gravidade) tem sido registrado (Botelho, 2003). Neste contexto faz-se necessário a

ampliação do conhecimento dos microrganismos presentes em manguezais visando

utilizar seu potencial metabólico para o desenvolvimento de tecnologias mais eficientes

na recuperação de ambientes impactados por petróleo e derivados.

2.7. ECOTOXICIDADE

A toxicidade é uma propriedade inerente dos agentes químicos que produzem

efeitos danosos a um organismo quando este é exposto durante certo tempo a

determinadas concentrações. Bioensaios de ecotoxicidade são metodologias analíticas

que buscam compreender a forma como os ecossistemas metabolizam, transformam,

degradam, eliminam, acumulam e sofrem ação da toxicidade das diversas substâncias

químicas neles introduzidas (Mello, 1981; Azevedo e Chasin, 2003). A exposição de

organismos vivos (bioindicadores) a estas substâncias é uma ferramenta valiosa de

análise ambiental. Dentre esses testes, os de fitotoxicidade tem recebido maior atenção

por se mostrarem úteis na previsão dos efeitos de uma complexa mistura de

componentes, como o petróleo (Banks e Schultz, 2005). A fitotoxicidade pode ser


determinada pela germinação das sementes, alongamento da raiz e crescimento da

muda. Os estudos de germinação são conduzidos por exposição direta da semente à

substância teste usando uma solução ou um suporte embebido na solução, como por

exemplo, papel de filtro. Para a avaliação do teste de germinação e crescimento das

raízes pode-se analisar tanto a taxa de germinação quanto o alongamento das raízes (ou

os dois) (Kapanen e Itavaara, 2001). Os testes de ecotoxicidade utilizando vegetais

possuem como vantagens o baixo custo e simplicidade, pois não requerem

equipamentos sofisticados, além da utilização de pouca quantidade de amostra. Por

estes motivos, muitos autores têm optado em utilizar esse teste para avaliar a

ecotoxicidade de metais pesados e compostos fenólicos (Wong, 1995), lodos de estação

de tratamento de efluentes e resíduos sólidos urbanos (Pascual, 1997), herbicidas

(Boutin et al., 2004) e para a obtenção do registro de produtos químicos comerciais

(Reis, 2003), além de serem propostos por diversas agências governamentais, como

parte da avaliação do potencial de contaminação de resíduos e efluentes dispostos no

ambiente (OECD, 1984; USEPA, 1996).

Algumas sementes que podem ser utilizadas nos testes de germinação e

crescimento das raízes são as de repolho, cebola, tomate, trigo e milho, sendo

recomendadas por órgãos internacionais como a OECD (Organization for Economic

Cooperation and Development); USEPA (United States Enviromental Protection

Agency) e FDA (Federal Drug Administration) (Fletcher, 1991). Muitos estudos têm

demonstrado a eficiência de outras espécies também recomendas por estes órgãos como

pepino, agrião (Helfrich et al., 1998), alface e soja (Gundersson et al., 1997) em testes

realizados para verificar a ecotoxicidade do óleo cru.

Barros (2007) utilizou o teste de fitotoxicidade utilizando a espécie Lactuca

sativa (alface) para verificar o efeito da adição de diferentes concentrações do

biossurfactante raminolipídio em solo contaminado com óleo cru e concluíram que à

medida que aumentou a concentração do biossurfatante, ocorreu um efeito inibitório da

germinação, chegando até 70 e 80 % no índice de germinação em relação à germinação

controle (sem o biossurfatante).

2.8. PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS

O planejamento de experimentos representa um conjunto de ensaios

estabelecidos com critérios científicos e estatísticos em que são realizadas alterações nas

variáveis consideradas importantes para o processo, denominadas de variáveis


independentes, de forma que se possa observar e identificar o efeito destas alterações

por meio das variáveis respostas ou dependentes (Montgomery, 2000). Entretanto, nem

sempre todas as variáveis estudadas apresentam influência significativa sobre as

variáveis de resposta, desta forma realiza-se uma triagem de descarte das variáveis não

significativas visando à racionalização do experimento (Barros-Neto et al., 1995).

O planejamento fatorial é de grande utilidade em investigações preliminares,

pois ainda não existe preocupação com uma descrição muito rigorosa da influência

desses fatores sobre a resposta (Barros-Neto et al., 1995).

Para executar um planejamento fatorial precisa-se especificar os níveis em que

cada fator será estudado, ou seja, os valores dos fatores (ou versões, nos casos

qualitativos) empregados nos experimentos. Um planejamento fatorial requer a

execução de experimentos para todas as possíveis combinações dos níveis dos fatores.

Cada um desses experimentos, em que o sistema é submetido, é um ensaio experimental

(Baptista, 2003).

Uma forma de identificar se um fator estudado ou interação entre os fatores

são ou não significativos no processo consiste na análise do teste t de Student. Caso

esse valor calculado seja maior que o tabelado, entende-se que este fator ou interação

é importante. Tal análise é melhor visualizada através do Gráfico de Pareto (Borges,

2001).

Tendo-se os devidos conhecimentos estatísticos, o planejamento experimental

fatorial é importante para a realização de trabalhos, pois permite verificar e selecionar as

variáveis que realmente interferem na obtenção dos resultados.

Baptista (2003) utilizou o planejamento de experimentos para avaliar a

concentração dos nutrientes, (NH4)2 SO4 e KH2PO4, que melhor contribuísse para a

biodegradação em um solo argiloso contaminado com petróleo e água de produção e

verificou que o teor de fósforo foi uma variável fundamental para favorecer a

biodegradação do óleo cru no solo contaminado. Ademais, observou que a eficiência de

remoção de matéria orgânica foi comprometida em função da concentração de (NH4)2

SO4, pois o aumento desta fonte de nitrogênio no solo ocasionou uma redução no

consumo de fósforo que foi prejudicial ao processo.

Pereira e Lemos (2003) realizaram um planejamento fatorial 32, para obter

informações sobre a influência da temperatura e capacidade de retenção de água sobre a

eficiência da biodegradação, usando Aspergillus versicolor como agente degradador,

visando otimizar os níveis apropriados para a biodegradação de hidrocarbonetos de


petróleo. Concluíram que a variável de resposta (eficiência de biodegradação) atingiu

resultados mais expressivos quando foi utilizado 100% da capacidade de retenção de

água e temperatura igual a 40ºC.


CAPÍTULO 1


3. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS

DE SEDIMENTO DE MANGUE IMPACTADO NA DEGRADAÇÃO DO

PETRÓLEO1

RESUMO

O desenvolvimento de atividades industriais, portuárias, pesqueiras, exploração

mineral, turísticas, entre outras, sem planejamento adequado, vem colocando em risco

os atributos básicos dos estuários e ecossistemas associados, como os manguezais. Estas

atividades favorecem o acúmulo de diferentes poluentes no solo, entre eles o petróleo,

gerando impactos consideráveis, inclusive sobre a microbiota, fauna e flora. No presente

trabalho foram isolados fungos filamentosos a partir de amostras de sedimento de

mangue contaminado por petróleo e avaliado o potencial de degradação. Para o

isolamento foi utilizada a técnica de diluição seriada empregando os meios Ágar

Sabouraud e Ágar Martin, em placas de Petri, as quais foram incubadas em temperatura

de 28°C até o crescimento das colônias. Os isolados foram submetidos a teste

qualitativo de degradação de petróleo utilizando como indicador redox 2,6-diclorofenol-

indofenol. Os resultados obtidos indicaram 14 espécies pertencentes aos gêneros

Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, Penicillium, Tallaromyces e Trichoderma,

sendo Aspergillus e Penicillium os gêneros com maior número de isolados. Todas as

espécies promoveram a descoloração do indicador em tempos variados, destacando-se

Aspergillus oryzae (10h), A. terreus (15h), A. niger (20h), P. waksmaii (24h) e T. flavus

(27h) que apresentaram os menores tempos de descoloração do indicador, sugerindo que

esses isolados podem ser utilizados em processos de biorremediação.

Palavras-chave: fungos filamentosos, biorremediação, sedimento de mangue,

petróleo.

INTRODUÇÃO

Os manguezais são uma área de transição entre o ambiente terrestre e aquático

caracterizados por grande variação dos parâmetros físicos e químicos, característicos de

regiões tropicais e subtropicais, os quais favorecem a adaptação de várias espécies,

1Trabalho a ser enviado a revista Soil Biology and Biochemistry Azevedo, L.M.L., Souza, C.S., Fernandes, M.J., Lima, D.M.M., Araújo, J.M., Gusmão, N.B., Souza-Motta, C.M.


inclusive microrganismos como fungos e bactérias (Odum,1988; Schaeffer-

Novelli,1995). Por apresentar-se em regiões costeiras e estuarinas, estão em uma

localização propícia à contaminação de dejetos dos grandes centros urbanos e também

de derramamentos de petróleo causados principalmente pelo transporte, exploração e

estocagem de grandes volumes de óleo, o que tem sido identificado como uma das mais

sérias ameaças aos ecossistemas costeiros (Hansel, 2000; Botelho, 2003).

Microrganismos capazes de oxidar hidrocarbonetos são relativamente

abundantes e frequentemente isolados de ambientes nos quais essas fontes de carbono

estão presentes, tanto de maneira natural (reservas petrolíferas), como introduzidas pelo

homem (casos de contaminação) (Atlas, 1991; Crapez et al., 1997; Greene et al., 2000).

A capacidade microbiana de catabolizar diferentes compostos orgânicos, naturais ou

sintéticos, e inorgânicos, extraindo destes compostos fontes nutricionais e energéticas,

veio possibilitar o emprego dos agentes biológicos, em processos de biorremediação,

como uma forma de mitigar os impactos gerados pelos rejeitos lançados no meio

ambiente (Bouwer e Zehnder, 1993).

A biorremediação é um processo biológico por meio do qual ocorre a

degradação de poluentes por microrganismos e segundo Raymond et al. (2001) está

condicionada a fatores como tipo de microrganismo, condições ambientais

(temperatura, níveis de oxigênio, umidade, salinidade), pH composição estrutural dos

hidrocarbonetos e biodegradabilidade dos compostos. Apesar de ser um processo lento,

a biodegradação é um dos maiores mecanismos naturais de remoção de compostos de

petróleo do ambiente (Braddock et al., 1994).

Os fungos constituem uma grande parte da biomassa microbiana no solo,

contribuindo para muitos processos de decomposição, sendo relatados como os

microrganismos mais importantes na biodegradação de hidrocarbonetos presentes em

solos (Jones e Eddington, 1968; Rosato, 1998), principalmente por serem capazes de

interagir fisicamente com o poluente e crescer sob condições ambientais de estresse,

como meios com baixos valores de pH, pobres em nutrientes e com baixa atividade de

água (Mollea et al., 2005; Atagana, 2006).

Este estudo teve como principal objetivo isolar e identificar espécies de fungos

filamentosos de sedimento de mangue (área de produção de petróleo) proveniente de um

manguezal ao norte da Baía de Todos os Santos, pertencente ao município de São

Francisco do Conde – BA e avaliar a capacidade de degradação de petróleo.


MATERIAL E MÉTODOS

Área de Estudo

O município de São Francisco do Conde está localizado na Baía de Todos os

Santos (BTS), que é uma reentrância costeira inserida na microrregião do recôncavo

baiano, entre as coordenadas 12º37'40" S – 38°40'48" O, onde está localizado um campo

de produção de óleo da Petrobras.

Coleta

As coletas das amostras foram realizadas entre os meses de setembro a

dezembro de 2008 nos aquários do Laboratório de Simulação contendo sedimento de

mangue submetido a 3 condições experimentais :

• Experimento Controle – apenas o sedimento homogeneizado

• Experimento 1 – Sedimento homogeneizado + NPK™.

• Experimento 2 – Sedimento homogeneizado + OSMOCOTE™.

Os fertilizantes NPK™ e o OSMOCOTE™ foram utilizados na concentração de

1% do sedimento úmido.

Amostragens dos Sedimentos

Após a montagem do experimento foi realizada a coleta de três amostras no

tempo inicial do experimento e após 15, 30, 45, 60 e 90 dias. Em cada período foi

coletado 01 proveta de cada aquário o que equivale a 3 amostras dos aquários controles;

3 amostras dos aquários com NPK® e 3 amostras dos aquários com Osmocote®,

perfazendo um total de 09 amostras em cada período.

Após a coleta, as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos

esterilizados, mantido a baixa temperatura e enviadas para o Laboratório de

Microbiologia, do Departamento de Antibióticos da UFPE, para o processamento e

isolamento dos fungos.

Isolamento e Identificação dos Fungos

Para o isolamento, 10g do sedimento foram colocados em frasco de Erlenmyer

(capacidade 250 mL) contendo 90mL (10-1) de tampão fosfato, seguido de agitação em

mesa agitadora a 180rpm, por 30min e 28°C. Posteriormente foram feitas suspensões

até 10-2 e 10-3 e em seguida 1mL de cada uma das suspensões foi transferido para placas

de Petri, em triplicata, contendo os meios Ágar Sabouraund e Ágar Martin, ambos

acrescidos de 100 (mg/L) de cloranfenicol. As placas foram incubadas em estufa a 30°C


por um período de até 5 dias. Posteriormente, fragmentos das colônias que

apresentavam características morfológicas visualmente distintas como cor, forma e

textura, foram transferidos para tubo de ensaio com meio apropriado, sendo em seguida

purificados. As amostras de fungos purificadas foram transferidas para meios de cultura

específicos (Ágar Czapek, Batata Dextrose Ágar ou Ágar Malte) a fim de se fazer a

identificação, onde foram observadas as características macroscópicas (coloração,

aspecto, e diâmetro das colônias) e microscópicas (microestruturas somáticas e

reprodutivas) segundo Ellis (1971, 1976), Raper e Fenell (1977), Sutton (1980),

Domsch et al., (1993), Pitt (1991), e Klich (2002), Kirk (2004), Leslie; Summerell

(2006), dentre outros.

Amostra e Caracterização Química do Petróleo

A amostra de petróleo utilizada em todos os ensaios foi proveniente da Bacia do

Recôncavo Baiano, extraído do Campo de Candeias – Bahia. Esta amostra foi cedida

pelo Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), pertencente ao Núcleo de

Estudos Ambientais do Instituto de Geociências da Universidade Federal da Bahia

(UFBA).

A análise química da amostra do petróleo, referente a determinação das frações

de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e dos compostos nitrogenados, sulfurados e

oxigenados (NSO), foi realizada pelo Laboratório de Processos Fermentativos,

pertencente ao Departamento de Antibióticos do Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). As principais frações do petróleo foram

separadas por cromatografia liquida, realizada, a pressão ambiente, em colunas de vidro

recheadas com sílica gel, como agente adsorvente; e através de método gravimétrico

foram determinadas as porcentagens de cada fração (Souza, 2003).

Avaliação do Potencial de Degradação do Petróleo

A potencialidade dos fungos para degradar o petróleo foi avaliada segundo a

metodologia de Hanson et al. (1993), adaptada para estes microrganismos. O teste

qualitativo foi realizado com todas as espécies identificadas, utilizando placas de

poliestireno com 24 cavidades, onde foram adicionados, em cada cavidade, 475 µL do

meio Bushnell Haas (BH), 50 µL de petróleo, 375 µL do indicador redox 2,6-

diclorofenol-indofenol (DCPIP) e 100 µL de uma suspensão de conídios de cada isolado

utilizado. Foram utilizados dois controles sendo um biótico e outro abiótico, cuja


diferença foi a presença de glicose como fonte de carbono, no controle biótico e

ausência do inóculo no abiótico. O material foi incubado em estufa a 30ºC por até 72h

onde o tempo de redução do indicador DCPIP, de azul (oxidado) para incolor

(reduzido), foi observado diariamente no meio de cultivo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Baía de Todos os Santos - BTS apresenta características similares aos demais

setores costeiros, com atividades portuárias, ocupação urbana, a pesca, coleta de

mariscos e crustáceos para alimentação, além da atividade de produção de petróleo e

manutenção das embarcações utilizadas na pesca (Leão e Domingues, 2000; Queiroz e

Celino, 2009).

Onofre et al. (2009) determinaram que o sedimento na Baía de Todos os Santos

apresentam valores variando de 1 a 7% de areia grossa, 85 a 89% de areia fina, 1 a 2%

de silte e de 4 a 8% de argila, enquanto a matéria orgânica varia de 5,95 a 13%, o

carbono orgânico total de 3,45 a 7,23%, nitrogênio de 0,10 a 0,16% e a relação

carbono/nitrogênio de 36,5 a 57,89%.

Isolamento e Identificação dos Fungos

Após o isolamento dos fungos, foi observado que o meio Ágar Sabouraud

mostrou-se mais recomendável, tanto em relação ao número de colônias (1,6 x 102

UFC/mL), quanto pela variedade de espécies, enquanto que no meio Ágar Martin foram

isoladas 0,7 x 102 UFC/mL. Foram identificadas 14 espécies de fungos filamentosos

pertencentes a seis gêneros: Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, Penicillium,

Talaromyces e Trichoderma. Os gêneros que apresentaram maior número de espécies

foram Aspergillus (6 espécies) e Penicillium (4 espécies) (Tabela 1). Dentre as espécies

isoladas, 85,71% pertencem aos fungos anamorfos (conhecidos anteriormente por

Deuteromycetes), 7,14% aos Zygomycota e 7,14% aos Ascomycota.

Tabela 1. Espécies isoladas nas seis coletas realizadas a partir de sedimento do manguezal de São Francisco do Conde – BA.

Coletas Espécies 1° 2° 3° 4° 5° 6° Sab M Sab M Sab M Sab M Sab M Sab M Aspergillus niger Tiegh x x x x x x x x x x x x A. oryzae (Ahlb.) E. Cohn - - - - x - - - - - - - A. parasiticus Speare x - - - - - - - - - - - A. sydowi Thom e Church x - - - - - - - - - - - A. terreus Thom x x x x x x x x x x x x


A. versicolor Vuill - - - - - - - - - - x - Cunninghamella echinulata Thaxt - - x x - - - - - - - - Curvularia pallescens Boedjin - - - - - - x x - - - - Penicillium aurantiogrieseum Dierckx - - - - - - - - - - x - P. commune Thom - - - - - - x - - - - - P. duclauxi Delacr - - - - - - - - x - - - P. waksmani Zalessky x - - - - - - - - - - - Talaromyces flavus Stolk & Samson - - - - - - - - x - - - Trichoderma longibrachiatum Rifai - - x x - - - - - - - -

x = presença da espécie; - = ausência da espécie; Sab = Ágar Sabouraud; M = Ágar Martin.

A maioria dos isolados foi obtida no experimento controle (Figura 1), resultado

contrário ao de Rosa e Trigüis (2006) ao quantificar bactérias hidrocarbonoclásticas em

experimento de simulação de biorremediação, em unidades com 3 experimentos: (1)

apenas o sedimento homogeneizado; (2) Sedimento + óleo (controle) e (3) sedimento +

óleo + NPK (biorremediação). Esses autores constataram a presença das bactérias em

todas as unidades, sendo encontradas em maiores proporções nas unidades de

biorremediação, concluindo que a presença de nutrientes favoreceu o crescimento da

população microbiana degradadora.

Figura 1. Número de espécies identificadas a partir dos experimentos - O (osmocote); NPK e C (controle) - nas 6 coletas realizadas.

As espécies isoladas no presente estudo fazem parte da micota cosmopolita,

presentes em praticamente todos os ambientes terrestres, e os gêneros são considerados

comuns no solo (Domsch et al., 1980). No ambiente estudado, foi verificado que há

poucas espécies raras ou diferentes de levantamentos realizados para fungos do solo

(Schoenlein-Crusius et al., 2006). Foi encontrado um maior número de colônias das

espécies Aspergillus niger e Aspergillus terreus, que foram isoladas em todas as coletas


realizadas e que dominaram o crescimento nas placas em relação às outras espécies. Rai

et al. (1981) também obtiveram Aspergillus como o gênero dominante em isolamento

feito do sedimento de um manguezal na Índia, em que espécies de Trichoderma,

Pestalotiopsis, Curvularia, Fusarium e Penicillium também foram frequentemente

isoladas. Leahy e Colwell (1990) relatam Aspergillus e Penicillium como os gêneros de

fungos filamentosos mais frequentes tanto em ambientes terrestres como em marinhos,

assim como Moreira e Siqueira (2002) que além destes dois gêneros, destacam Mucor,

Rhizopus, Trichoderma, Fusarium, Pythium, Verticillium e Alternaria como os gêneros

mais comuns encontrados no solo.

No presente estudo, também foram isoladas espécies pertencentes aos gêneros

Cunninghamella, Curvularia, Tallaromyces e Trichoderma, porém estas foram

observadas em apenas uma ou duas das coletas realizadas. Sugere-se que foi encontrada

esta baixa variabilidade em virtude de se tratar de um ambiente alterado, em que as

espécies capazes de sobreviver às condições adversas dominem sobre as outras. Atlas

(1984) afirma que a poluição do solo pode conduzir a um decréscimo na diversidade

microbiana em termos de abundância de espécies, devido à extinção de espécies não

adaptadas ao estresse imposto; mas, pode também ocasionar o enriquecimento de

espécies particulares mais adaptadas a esse estresse, corroborando com o resultado

encontrado no presente trabalho. Santiago e Souza-Motta (2006) também verificaram o

efeito negativo do impacto ambiental na abundância das espécies de fungos, em estudo

com espécies da ordem Mucorales, isoladas a partir de solo de mineração de cobre na

região Jaguarari/Bahia.

Caracterização química da amostra de petróleo

A análise química, referente à determinação das frações dos principais

compostos da amostra de petróleo, evidenciou que o óleo em estudo é constituído por

71,05% de hidrocarbonetos saturados, 20,62% de hidrocarbonetos aromáticos e 8,33%

de compostos NSO. Como demonstrado pelo trabalho de Tissot e Welte (1984), na

composição do petróleo geralmente predomina a fração dos hidrocarbonetos saturados

(57%), seguida de compostos aromáticos (29%) e NSO (14%). A suscetibilidade dos

produtos de petróleo à biodegradação varia com o tipo e estrutura dos componentes

(Englert et al., 1993). Os hidrocarbonetos saturados possuem ligações simples entre os

átomos de carbono e são mais susceptíveis à degradação por microrganismos do que os

insaturados, os quais possuem ligações duplas ou triplas entre seus átomos de carbono,


pois a presença de dupla ou tripla ligação carbono-carbono dificulta a biodegradação

(Tissot e Welte, 1984; Pereira-Jr et al., 2009). A baixa concentração dos compostos

NSO, em relação às demais frações, sugere certa susceptibilidade do petróleo ao ataque

microbiano.

Avaliação do Potencial de Degradação do Petróleo

Todas as 14 espécies submetidas ao teste qualitativo promoveram a oxidação

biológica evidenciada através da descoloração do meio de cultivo contendo o indicador

DCPIP, o que apóia o fato da capacidade de degradação de hidrocarbonetos (Uzoamoka

et al., 2009). A mudança do indicador ocorreu em tempos diferentes para cada espécie,

variando entre 10h e 68h, destacando-se o Aspergillus oryzae com 10 horas, seguido por

A. terreus (15h), A. niger (20h), P. waksmanii (24h) e Talaromyces flavus (27h) (Figura

3). Maciel (2008) observou oxidação biológica de querosene por A. tamarii após 14

horas de ensaio.

Figura 2. Tempo (horas) da redução do indicador DCPIP das 14 espécies testadas obtidas do sedimento de mangue impactado por petróleo.

De acordo com Colla et al. (2008), locais contaminados com poluentes

constituem uma boa fonte de obtenção de microrganismos para estudos de

biorremediação desses mesmos poluentes, uma vez que o local contaminado atua como

um meio de cultivo seletivo para esses microrganismos, sendo que os que permanecem

nestes locais tornam-se adaptados ao poluente, que por sua vez, pode ser utilizado como

fonte de nutrientes para o crescimento. Um dos primeiros estudos de biorremediação


por fungos relatou que os gêneros Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium e

Cunninghamella foram isolados de ambiente estuarino, e, capazes de utilizar o petróleo

como fonte exclusiva de carbono e energia (Cerniglia e Perry, 1973). Segundo Ramsay

et al. (2000) as populações microbianas em solo de mangue possuem potenciais

degradadores de hidrocarbonetos, e isto deve estar relacionado à adaptação destes

microrganismos à grande quantidade de matéria orgânica presente nestes solos. Os

resultados obtidos no presente estudo ainda corroboram com os obtidos por Olguín et

al. (2007) os quais afirmam que a maioria dos solos contaminados por hidrocarbonetos

contem microrganismos capazes de degradá-los.

Segundo Riser-Roberts (1992) a habilidade dos fungos em utilizar

hidrocarbonetos ocorre principalmente em duas ordens: Mucorales (que inclui, por

exemplo, o gênero Cunninghamella) e Moniliales (que inclui os gêneros Aspergillus,

Penicillium, entre outros). Esse mesmo autor enfatiza que Aspergillus e Penicillium

possuem muitas espécies que assimilam hidrocarbonetos, contudo, esta característica é

uma propriedade individual da espécie e não necessariamente uma característica

particular do gênero. Em revisão feita por Leitão (2009), espécies de Penicillium são

apontadas como importantes agentes de remedição em ambientes impactados por

diferentes compostos xenobióticos. Juhasz e Naidu (2000) destacam ainda os gêneros

Aspergillus e Penicillium como os fungos filamentosos mais eficientes na degradação

de hidrocarbonetos.

Araújo e Lemos (2002) identificaram fungos filamentosos isolados a partir de

solo contaminado por petróleo que apresentaram potencialidade para degradação de

hidrocarbonetos, os quais foram agrupados em quatro gêneros (Aspergillus, Penicillium,

Paecilomyces e Fusarium) incluindo as seguintes espécies: A. terreus, A. fumigatus, A.

versicolor, A. niveus, A. niger, P. corylophilum, Paecilomyces variotti e Pae. niveus. A

capacidade de degradação de hidrocarbonetos foi avaliada seguindo a mesma

metodologia utilizada no presente trabalho, porém com outras fontes de carbono.

Os fungos isolados da Baía de Todos os Santos foram capazes de promover a

oxidação biológica em tempos inferiores a 20 horas, como demonstrado por Maciel

(2008) e Souza (2008) que quando utilizaram como fonte de carbono o querosene e o

óleo Diesel observaram que os fungos reduziram o indicador DCPIP em tempos entre

14 e 24 horas e degradaram até 90% da fonte oleosa.

Celino et al. (2009) relataram em estudo realizado na Baía de Todos os Santos

entre os meses de fevereiro e julho de 2007, que os valores de referência dos


hidrocarbonetos, segundo metodologia adotada, não deve ultrapassar de 0,01µg.g-1.

Nesse mesmo estudo os autores encontraram valores superiores a 0,1318µg.g-1 dos

HPAs.

CONCLUSÃO

Na área de manguezal estudada há uma maior riqueza de espécies pertencentes

aos gêneros Aspergillus e Penicillium, sendo A. niger e A. terreus as espécies mais

frequentes. A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que

as espécies isoladas dos experimentos de bioestímulo de sedimento do manguezal, da

Baía de Todos os Santos/BA, contaminado por petróleo apresentam potencialidade para

serem utilizadas em processos de biorremediação, sendo Aspergillus oryzae, A. terreus,

A. niger, Penicillium waksmanii e Talaromyces flavus indicadas para avaliação da

degradação do petróleo.


CAPÍTULO 2


4. POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DE PETRÓLEO POR FUNGOS FILAMENTOSOS2 RESUMO

A poluição ambiental causada por derramamentos e vazamentos de petróleo e de

seus derivados tem sido um grande motivo de preocupação. Fungos filamentosos são

relatados como agentes potenciais de biorremediação de ambientes impactados,

principalmente por serem eficientes decompositores. No presente trabalho foram

testadas cinco espécies de fungos filamentosos quanto à degradação de petróleo.

Inicialmente os isolados foram submetidos à aclimatação em concentrações crescentes

de petróleo (2 a 12%) sendo avaliados o pH, biomassa (g/L), teor de óleos e graxas e a

fitotoxicidade para sementes de Cucumis sativus (pepino). Posteriormente foi realizado

um planejamento fatorial para obter informações sobre a influência da agitação, pH,

concentração celular e concentração de NH4NO3 sobre a variável resposta eficiência de

biodegradação, usando Aspergillus oryzae como agente de degradação. De uma maneira

geral, houve aumento na biomassa e o pH se manteve próximo a neutralidade. Com

relação a fitotoxicidade, os resíduos gerados por A. oryzae e A. terreus causaram menor

impacto as sementes de pepino alcançando, respectivamente, 65,12% e 55,45% para o

índice de germinação. Com relação aos parâmetros avaliados, a agitação foi a única

variável que apresentou significância estatística. Os resultados obtidos destacam A.

oryzae como espécie promissora na biorremediação de ambientes impactados por

petróleo.

Palavras-chave: biodegradação, fungos filamentosos, fitotoxidade, petróleo

INTRODUÇÃO

O petróleo é um recurso natural consumido em todo o mundo, principalmente

pelos países mais desenvolvidos, o que tem garantido avanços tecnológicos na área de

exploração e produção em áreas marinhas cada vez mais profundas. Apesar de suas

indiscutíveis qualidades associadas ao desenvolvimento econômico dos países, inerente

a qualidade de vida de suas populações, este valioso produto está relacionado a grandes

fontes de poluição do meio ambiente (Ferrão, 2005). Acidentes com derrames de

petróleo constituem uma grande preocupação em todos os países do mundo, pois 2Trabalho submetido à revista Brazilian Journal of Microbiology. Azevedo, L.M.L., Souza, C.S., Miranda, R.C.M, Maciel C.C.S., Araújo, J.M., Gusmão, N.B., Souza-Motta, C.M.


quando ocorrem, representam tanto uma grande perda de óleo quanto um grande

impacto negativo na flora, na fauna e na saúde humana (Ribeiro et al., 2003).

Os microrganismos são os principais agentes dos processos bioquímicos que

ocorrem no solo, como a decomposição da matéria orgânica e liberação de nutrientes,

formação e estabilização de agregados, ciclagem de nutrientes, transformações de

elementos metálicos, produção de metabólitos, degradação de pesticidas e herbicidas e

alterações nas características físicas do solo (Pfüller, 2000).

O tratamento de um ambiente contaminado, utilizando a habilidade natural dos

organismos em mineralizar, transformar ou até mesmo combinar compostos poluentes

com outras moléculas, é conhecido como biorremediação. Estas técnicas vem sendo

muito estudadas nos últimos anos porque, além de ser menos dispendiosa, pode resultar

na transformação dos contaminantes orgânicos, no caso ideal, em CO2, água e biomassa

(processo chamado de mineralização), ou pode reduzir a concentração dos poluentes em

níveis não detectáveis, não tóxicos ou aceitáveis pelas agências de controle ambiental

(Litchfield, 2005).

Os fungos se destacam em processos de biodegradação devido, principalmente, à

produção de enzimas extracelulares e a capacidade de crescer sob condições ambientais

consideradas extremas, com baixos valores de pH e umidade relativa e pobres em

nutrientes, favorecendo o seu desenvolvimento diante de outros organismos (Bouchez et

al., 1996; Mollea et al., 2005; Atagana, 2006).

Este estudo teve como principal objetivo avaliar a capacidade de espécies de

fungos em biodegradar o petróleo e testar algumas condições que poderiam influenciar

neste processo.

MATERIAL E MÉTODOS

Fungos Filamentosos

Foram utilizadas cinco espécies isoladas de sedimento de mangue impactado e

selecionadas a partir do ensaio primário de degradação do petróleo, evidenciado através

da redução do corante 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP), a saber: Aspergillus niger,

A. terreus, A. oryzae, Penicillium waksmanii e Tallaromyces flavus.

Aclimatação dos fungos ao petróleo

Os isolados foram submetidos à aclimatação por meio de variações nas

concentrações de petróleo (2, 4, 6, 8, 10 e 12%), ou até a concentração mais baixa onde


houve indicativo de crescimento. O experimento foi conduzido em frascos de

Erlenmeyer de 250mL contendo 50 mL do meio Bushnell Haas (BH) líquido com 2%

de petróleo e 1mL da suspensão contendo 107conídios/mL. Os frascos foram mantidos

sob agitação de 150 rpm, a 30°C por 7 dias. Após o período de incubação, os fungos

crescidos foram transferidos para placas de Petri contendo 10mL do meio ágar BH e

petróleo na mesma concentração a que foram submetidos, sendo mantidos a 30° por 7

dias. Foram feitas re-inoculações sucessivas, sempre seguindo uma escala aritmética de

razão 2, até a concentração de 12% de petróleo e mantendo-se 7 dias de aclimatação em

cada uma das concentrações. Adicionou-se 1% de glicerina a cada concentração para

estimular o cometabolismo. Ao final do cultivo em cada concentração de petróleo, a

biomassa (g/L), o pH, a fitotoxicidade e o teor de óleos e graxas dos resíduos foram

analisados.

Biomassa e pH

A determinação da biomassa foi realizada através da medida do peso seco. A

suspensão micelial foi filtrada a vácuo e a massa celular lavada três vezes com água

destilada e, posteriormente, seca em estufa por um período de 12h a 80ºC. O pH foi

medido a partir do líquido metabólico livre de células em potenciômetro.

Determinação do teor de óleos e graxas

A determinação das concentrações de óleos e graxas foi determinada pelo

método gravimétrico de acordo com American Public Association-AWWA, (2005). O

material residual foi separado por filtração, e a cada 20mL do filtrado foi colocado

10mL de n-Hexano. Este procedimento foi realizado três vezes e, ao final, a fase

orgânica foi reunida e evaporada. O peso do material seco é considerado como o valor

total do teor de óleos e graxas (TOG). Para a realização da determinação foi utilizado o

evaporador rotatório da marca Fisatom, modelo 558-série 0836768.

Ensaio de Fitotoxicidade

A fitotoxicidade do resíduo foi avaliada utilizando-se sementes de Cucumis

sativus L. (pepino) - Feltre, segundo a metodologia de Tiquia et al. (1996). As sementes

foram lavadas, inicialmente, com água destilada, em seguida com hipoclorito de sódio a

1% por cinco minutos e novamente com água destilada. Após a desinfecção, as

sementes foram colocadas em placas de Petri (5 unidades por placa), forradas com papel

filtro duplo e impregnadas com 2mL do meio líquido residual. Foi utilizado um controle

com água destilada esterilizada. As placas foram deixadas à temperatura de 28ºC ± 2ºC


durante 5 dias, após este período foram calculados inicialmente a porcentagem de

germinação das sementes, a porcentagem de crescimento das raízes e finalmente o

índice de germinação (%IG), calculado através da seguinte fórmula:

%IG = (% germinação das sementes) x (% crescimento das raízes): 100

Onde: % Germinação de sementes = (% germinação no teste): (% germinação no

controle) x 100; % de crescimento das raízes = (média de crescimento no teste): (média

de crescimento no controle) x 100.

Foram utilizados 2 controles, um com água destilada esterilizada e outro com o

petróleo na concentração equivalente à etapa de aclimatação. O experimento foi

realizado em triplicata e os dados do teste de toxicidade foram analisados usando a

análise de variância (ANOVA) para detectar diferenças entre os tratamentos, seguindo o

teste de Tukey (p<0,05) usando o programa Biostat®5.0.

Análise Estatística

Os parâmetros obtidos no processo de aclimatação serviram como dados para

definição do melhor isolado, onde foi realizado um planejamento estatístico fatorial

completo que envolveu dois níveis e quatro variáveis (24), utilizando como ferramenta o

software STATISTICATM versão 6.0. Os ensaios foram realizados em duplicata, à

temperatura de 28 ± 2ºC, durante 7 dias. A Tabela 1 apresenta a matriz trabalhada

durante o planejamento experimental, onde o pH, agitação, concentração celular e

concentração do nitrato de amônia (NH4NO3), foram as variáveis independentes e a

redução no teor de óleos e graxas foi a variável resposta.

Tabela 1. Matriz do Planejamento Experimental 24.

Experimentos Variáveis

pH Agitação (rpm) Concentração celular (esporos/mL) NH4NO3 (g) 1 5,5 0 105 0,5 2 7,0 0 105 0,5 3 5,5 130 105 0,5 4 7,0 130 105 0,5 5 5,5 0 108 0,5 6 7,0 0 108 0,5 7 5,5 130 108 0,5 8 7,0 130 108 0,5 9 5,5 0 105 2,0

10 7,0 0 105 2,0 11 5,5 130 105 2,0 12 7,0 130 105 2,0 13 5,5 0 108 2,0 14 7,0 0 108 2,0 15 5,5 130 108 2,0 16 7,0 130 108 2,0


RESULTADOS E DISCUSSÃO Ensaios de Aclimatação dos Fungos frente ao Petróleo

Na presença exclusiva do petróleo como fonte de carbono não houve

crescimento dos fungos, o que só foi possível com a adição de glicerina (1%), para

estimular o cometabolismo, sugerindo que o petróleo foi metabolizado como substrato

secundário. Vários estudos dividem as estratégias de biorremediação em três categorias

gerais: (1) o composto alvo é usado como fonte de carbono; (2) o composto alvo é

atacado pelas enzimas, mas não é utilizado como fonte de carbono e (3) o composto

alvo não é metabolizado totalmente, mas é concentrado dentro do organismo

(bioacumulação). Embora os fungos sejam capazes de realizar as três estratégias,

geralmente empregam mais o cometabolismo e a bioacumulação do que a utilização dos

compostos xenobióticos como única fonte de carbono (Bennet et al., 2002). Araújo e

Lemos (2002) observaram em seu estudo de biodegradação de hidrocarbonetos de

petróleo, que a ação dos fungos foi estimulada nos experimentos com adição de outras

fontes de carbono como glicose ou extrato de levedura, acelerando a degradação do

petróleo. Pointing (2001) e Tucker et al. (1995) observaram que uma fonte externa

nutricional é geralmente necessária aos fungos, devido à inaptidão dos mesmos em usar

organopoluentes como fonte primária de C e N. Bennet et al. (2002) também relataram

que muitos fungos precisam de uma fonte suplementar de carbono para sustentar seu

crescimento, ou seja, a degradação ocorre por cometabolismo.

Biomassa e pH

Na Figura 1 podem ser observados os valores de biomassa que, de uma maneira

geral, mostrou um acréscimo com o aumento do teor de petróleo, sendo o valor máximo

2,45 g/L, atingido por Aspergillus oryzae na concentração de 8%, seguido por

Tallaromyces flavus com 2,44 g/L na mesma concentração. Os valores de pH

observados na Figura 2 indicam que os mesmos se mantiveram próximos a neutralidade

para todos os isolados com exceção de A. niger que apresentou pH bastante ácido entre

os valores 2 e 3. Segundo Gadd (2001), a acidez no meio em processo de degradação

indica a produção de ácidos orgânicos como produtos intermediários. Leahy e Colwell

(1990), observaram que valores de pH entre 6,0 e 8,0 favorecem a ação de

microrganismos degradadores de petróleo, embora seja relatado que os fungos

filamentosos são tolerantes à valores de pH ácidos.


Figura 1. Biomassa (g/L) dos fungos após 7 dias de experimento em concentrações crescentes de petróleo.

Figura 2. Valores de pH após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de petróleo.

Análise Química – Teor de Óleos e Graxas

O percentual de redução do teor de óleos e graxas variou de 81,94% a 97,62%,

sendo este último obtido por Aspergillus oryzae na concentração de 6% e A. terreus na

concentração de 2% (Figura 3). Os percentuais obtidos no presente trabalho foram

maiores que os de Souza (2009) que avaliando a biodegradação de petróleo em

biorreator, que observou uma redução no teor de óleos e graxas de 70,46% em ensaio

contendo uma concentração inicial de 10% (v/v) de petróleo.


Figura 3. Teor de óleos e graxas após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de petróleo.

Ensaio de Fitotoxicidade

A diminuição da concentração do poluente orgânico não é um critério suficiente

para avaliar a eficácia da técnica de biorremediação (Fava, 1999). Para comprovar a

eficiência do tratamento, é necessário demonstrar que a biorremediação não produziu

nenhum composto intermediário tóxico, a fim de evitar efeitos ecológicos e ambientais

indesejáveis, portanto uma determinação da ecotoxicidade residual faz-se necessária

(Cerniglia, 1984; Prince, 1993).

O maior índice de germinação (65,12%) foi registrado para as sementes em

contato com os resíduos produzidos por A. oryzae na concentração de 6% de petróleo

(p<0,05). Para este mesmo fungo, nas concentrações testadas, foi observado diferença

estatística significativa (p<0,05) entre os índices de germinação das sementes nas

porcentagens de 2 e 12%, 6 e 10%, bem como entre 6 e 12% (Tabela 2).

Tabela 2. Índice de Germinação para sementes de pepino nos ensaios de aclimatação dos fungos a diferentes concentrações de petróleo.

Espécies de fungos Concentrações de petróleo

2% 4% 6% 8% 10% 12% Aspergillus niger 36,3 34,21 35,38 29,43 26,06 22,14 A. oryzae 57,96a 52,91 65,12bc 53,6 39,95b 33,86ac

A. terreus 51,9de 55,45fg 48,06h 44,23 38,69df 33,18egh Penicillium waksmanii 45,98ij 45,73lm 44,04no 41,18pq 31,65ilnp 23,53jmoq Tallaromyces flavus 38,79x 34,06 38,36z 32,28 26,99 22,98xz

Letras iguais (sobrescritas) representam diferença estatística (p<0,05).

Este resultado sugere que A. oryzae metabolizou o petróleo originando produtos

de baixa fitotoxicidade para as sementes de pepino. No entanto, A. niger apresentou


menor valor para o índice de germinação (22,14%), na concentração de 12% de

petróleo, indicando que este microrganismo degradou de forma parcial o petróleo ou

originou subprodutos tóxicos que prejudicaram o desenvolvimento das sementes. A

partir da concentração de 8% pode ser observada uma redução gradativa do índice de

germinação com relação a todos os fungos testados. Kirk et al. (2002) avaliando a

porcentagem de germinação de sementes de gramíneas, também observaram redução

com o aumento da concentração de petróleo. Rivera-Cruz e Trijillo-Narcía (2004)

relataram que a toxicidade dos hidrocarbonetos pode provocar a inibição da germinação

e a redução do crescimento da raiz de vegetais, o que foi observado para os resíduos

gerados por A. niger. Ogbo (2009) observou inibição da germinação de sementes de

Sorghum bicolor (sorgo) e Vigna unguiculata (feijão caupi) na concentração de 4% de

óleo Diesel.

Os resultados obtidos no presente trabalho foram contrários aos de Maciel

(2008) que utilizou sementes de repolho roxo (Brassica oleracea var. capitata) para

avaliar a toxicidade do resíduo gerado pela degradação de querosene por Aspergillus

tamarii e observou que o resíduo causou pouco impacto às sementes até a concentração

de 12%, onde foi obtido um índice de germinação de 62,6%. Barros (2007) avaliando a

aplicabilidade de testes de fitotoxicidade com sementes de alface (Lactuva sativa) em

solos contaminados por derivados de petróleo, constataram que a contaminação de 10%

(mL/g) de óleo Diesel no solo não foi suficiente para afetar a germinação das sementes,

nem o crescimento das radículas.

Petruccioli et al., (2006) utilizaram o teste de fitotoxicidade com sementes de

agrião (Lepidium sativum L.) para avaliar a biorremediação em um solo contaminado

com hidrocarbonetos aromáticos e concluíram que os fungos utilizados levaram a uma

diminuição significativa da toxicidade do solo, avaliada através do índice de germinação

(58 ± 1,5%). Tiquia et al. (1996) afirma que o índice de germinação maior que 80%

indica o desaparecimento da fitotoxicidade do composto.

Avaliação Estatística - Planejamento Fatorial

Após os resultados obtidos nos ensaios de aclimatação, o isolado A. oryzae, na

concentração de 6% de petróleo, foi selecionado por apresentar melhor resultado em

relação aos parâmetros avaliados para ser submetido às condições do planejamento

fatorial. Após a análise dos dados do planejamento fatorial (24) foi realizada uma análise

de variância (ANOVA) para verificar se existia alguma diferença estatística entre os

tratamentos propostos. Foi observado que a variável agitação foi a única que influenciou


estatisticamente (p<0,05) (Tabela 3). Como pode ser observado na Figura 4, que mostra

o gráfico de Pareto, a agitação (2) foi a única variável que teve influência significativa

no processo. Já a concentração do NH4NO3 (4) bem como as interações entre (2 e 4) e (3

e 4) influenciaram negativamente o processo. Quanto às demais variáveis (pH (1) e

concentração celular (3)), pode-se perceber que não foram significativas (Figura 4). A

agitação pode ser considerada um fator importante por promover a aeração e o contato

óleo-água, já que tanto o oxigênio, como a relativa insolubilidade do óleo na água, são

fatores limitantes na biodegradação (Tolosa et al., 2005; Baird, 2002). Esperava-se que

a variável concentração de nitrogênio fosse significativa já que os fungos utilizados

foram isolados de sedimento de manguezal, ambiente caracterizado por apresentar lenta

ciclagem de nutrientes (Scherrer e Mille, 1989), contudo Atlas (1995) e Teal et al.

(1992) relatam que em ambientes com baixa energia (por exemplo os mangues)

normalmente não há limitação de fósforo e nitrogênio, sendo a taxa de biodegradação

limitada pela condição anóxica. Os resultados encontrados no presente trabalho são

contrários aos de Baptista (2003), que em estudo para selecionar as melhores condições

de biodegradação de petróleo em solo argiloso verificou que o aumento da concentração

de sulfato de amônio - (NH4)2SO4 - adicionado ao solo promoveu uma melhor eficiência

na remoção de matéria orgânica; e os de Borges et al. (2001), pois ao empregarem

maiores concentrações de (NH4)2SO4 e cloreto de amônio (NH4Cl) como fontes de

nitrogênio, observaram que a eficiência de remoção da matéria orgânica, além de óleos

e graxas tendiam a melhorar.

Tabela 3. Análise de variância entre as variáveis pH, agitação, concentração celular e concentração da fonte de nitrogênio NH4NO3.

Variáveis SS df MS F p

(1)pH 0,001954 1 0,001954 6,008070 0,057855 (2)agitação 0,002218 1 0,002218 6,819379 0,047590

(3)concentração celular 0,000152 1 0,000152 0,467674 0,524459 (4)NH4NO3 0,000073 1 0,000073 0,225446 0,654936

1*2 0,001298 1 0,001298 3,991256 0,102225 1*3 0,001125 1 0,001125 3,460682 0,121925 1*4 0,000013 1 0,000013 0,041022 0,847478 2*3 0,001073 1 0,001073 3,299612 0,128992 2*4 0,000251 1 0,000251 0,771284 0,420013 3*4 0,000038 1 0,000038 0,117726 0,745470 Erro 0,001626 5 0,000325

Total SS 0,009822 15 SS – some square; df – degrees of freedom; MS – media square, F e p – variáveis.


Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: óleos e graxas2**(4-0) design; MS Residual=,0003252

DV: óleos e graxas

,20254

-,343112

-,474812

,6838672

-,878228

1,816483

1,860291

1,997813

2,451137

2,611394

p=,05

Effect Estimate (Absolute Value)

1by4

3by4

(4)NH4NO3

(3)conc. cel

2by4

2by3

1by3

1by2

(1)pH

(2)agitação

Figura 4. Diagrama de Pareto para o planejamento fatorial 24, cuja variável dependente é a redução no teor de óleos e graxas. CONCLUSÃO

Dentre as espécies avaliadas, é possível inferir que Aspergillus oryzae pode ser

indicada para processos de biodegradação de petróleo, considerando a capacidade de

degradação apresentada e baixa fitotoxicidade frente as sementes de Cucumis sativus

(pepino). Não foram observadas influência significativa do pH, concentração celular e

concentração da fonte de nitrogênio (NH4NO3), apenas a agitação apresentou relevância

estatística para o processo.


CONSIDERAÇÕES GERAIS

• São encontradas em sedimento de manguezal da Baía de Todos os Santos/BA,

contaminado por petróleo, espécies de fungos filamentosos.

• Os Hyphomycetes predominam no sedimento da área estudada, sendo

Aspergillus niger e A. terreus as espécies mais encontradas.

• Todas as espécies investigadas apresentam potencialidade para degradação de

petróleo, evidenciada a partir do teste qualitativo.

• O produto da biodegradação do petróleo por A. oryzae apresenta baixa

fitotoxicidade frente às sementes de pepino, até 8%, contudo não há produção de

substâncias totalmente inócuas.

• Não há influência significativa do pH, concentração celular e concentração da

fonte de nitrogênio (NH4NO3), na biodegradação do petróleo por A. oryzae.

• A agitação apresenta influência significativa no processo de biodegradação do

petróleo por A. oryzae, sendo recomendada 130rpm.

• A. oryzae apresenta potencialidade para degradar o petróleo podendo ser

utilizada como ferramenta biológica em processos de biorremediação.


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