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SANDRA APARECIDA LUIZ VIEIRA
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUTÂNEAS EXPERIMENTAIS
Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para obtenção do título de Mestre em Promoção de Saúde. Orientador: Prof. Dr. Márcio Botelho de Castro.
FRANCA 2006
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SANDRA APARECIDA LUIZ VIEIRA
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUTÂNEAS EXPERIMENTAIS
Presidente: __________________________________________
Nome: Prof. Dr. Márcio Botelho de Castro
Instituição: Universidade de Brasília – UnB
Titular 1: ____________________________________________
Nome: Profa. Dra. Aline Adriana Bolzan
Instituição: Universidade de Franca
Titular 2: ____________________________________________
Nome: Prof. Dr. Iucif Abrão Nascif Júnior
Instituição: Universidade de Franca
Franca, 24/06/2006.
DEDICO à minha família pelo incentivo e pelo apoio incondicional, ao meu marido pela participação ativa durante todo o processo de desenvolvimento deste trabalho, ao meu orientador por ter me conduzido com tanta sabedoria e dedicação, ao coordenador por ter tido a humildade de aceitar minhas limitações com tamanha honradez e ao coordenador do curso pelo inestimável apoio.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS por ter me presenteado com uma família maravilhosa; aos que já partiram para o Oriente Eterno pelo exemplo que deixaram; aos meus sobrinhos, pois são o estímulo à minha necessidade de evolução; ao meu marido pelas horas de ausência, toda a minha admiração e ternura; ao meu pai, que sempre priorizou minha educação; aos professores que com seu brilhantismo enriqueceram meus dias; à coordenadoria do curso de pós-graduação pelo apoio que recebi durante esses
anos de trabalho e pesquisa; ao Prof. Dr. Márcio Botelho de Castro que não desistiu da sua missão de me
apoiar; ao Prof. Dr. Iucif Abrão Nascif Júnior que adotou-me e transformou esse sonho
em realidade, o meu mais profundo e eterno reconhecimento; ao grupo de apoio da secretaria de pós-graduação, pela gentileza e
desprendimento com que nos recebe e orienta sempre que necessário, minha eterna amizade; aos profissionais dos laboratórios que tão gentilmente colaboraram para o
término dessa pesquisa; à CAPES que viabilizou a dedicação a esse trabalho.
RESUMO
VIEIRA, Sandra Aparecida Luiz. Efeito do laser de baixa potência na cicatrização de feridas cutâneas experimentais. 2006. 49 f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) –Universidade de Franca, Franca-SP.
Este trabalho teve como objetivo comparar os resultados obtidos na pesquisa experimental com laser de baixa potência, diodo AlGa, comprimento de onda de 660nm, com diferentes doses. Utilizaram-se 54 ratos Wistar, divididos em grupos controle, grupos submetidos a laserterapia na dose de 4J/cm² e grupos submetidos a laserterapia na dose de 8J/cm². Realizou-se avaliação macroscópica diária, de todos os animais, pela paquimetria das feridas cutâneas. Para isso, os animais foram anestesiados via inalatória com halotano. Os dados obtidos foram analisados pelo teste T de Student com 95% de significância (p<0,05). Todas as análises foram realizadas com programa GraphPad Prism 4.0. Para o exame histopatológico, nos períodos de 3, 7 e 14 dias, os animais foram eutanasiados nos dias 4, 8 e 15 após a cirurgia experimental. Retirou-se cirurgicamente as áreas da lesão e circunjacente, que foram colocadas em formalina tamponada a 10% e identificadas. O material retirado foi processado, incluído em parafina, realizado cortes de 4µm de espessura e corado com hematoxilina-eosina (HE). As amostras foram analisadas à microscopia óptica de luz, observadas e avaliadas semi-quantitativamente, os processos inflamatórios, grau de epitelização, fibras de colágeno e edema. O número de neovasos foi contado em gratícula para microscópio em área padronizada de 0,25 mm2. Os resultados, da avaliação macroscópica mostraram que, 50% dos animais tratados com laserterapia na dose de 4J/cm² tiveram cicatrização total no 12o dia de tratamento, e 83,3% dos animais apresentaram a mesma resposta no 14ºdia. No grupo de animais submetidos a laserterapia na dose de 8J/cm², apenas 16,6% dos animais apresentaram cicatrização total no 12º dia de tratamento, e 66,6% dos animais no 14° dia de tratamento. Portanto, a menor dose teve maior capacidade de acelerar o processo de cicatrização. A análise morfométria da ferida cutânea demonstrou que, no 7ºdia após início do tratamento, havia número médio estatisticamente maior de neovasos (p<0,05) nos animais tratados com laserterapia na dose de 4J/cm2, quando comparado ao grupo controle. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, controle e 8J/cm2 neste mesmo período. No 14o dia não foram observadas diferenças significativas entre todos os grupos avaliados. Todos os animais, independente do grupo pertencente, apresentaram 100% de reepitelização das feridas cutâneas ao 14o dia. Esse fato se deu, provavelmente, em razão do modelo animal utilizado nessa pesquisa ter cicatrização espontânea em um período de tempo relativamente curto. A metodologia empregada para avaliação do edema, formação de fibras colágenas e infiltrado inflamatório, não foi capaz de detectar diferenças significativas entre os grupos nos períodos analisados (3, 7 e 14 dias). Conclui-se que a radiação com laserterapia de baixa potência, com comprimento de onda de 660nm, nas doses de 4J/cm² e 8J/cm² não apresentaram diferenças estatísticas entre si. Porém, macroscopicamente houve diferença, em relação à cicatrização total, entre os animais tratados e os não tratados com radiação laser. Esse trabalho veio demonstrar a importância do uso da laserterapia de baixa potência em afecções que comprometem as integridades, física, psíquica, social e econômica de grande número de seres humanos. Palavras-chave: cicatrização; ferida cutânea; laserterapia.
ABSTRACT
VIEIRA, Sandra Aparecida Luiz. Effects of the low level laser in raw wounds cicatrization in lab. 2006. 49 f. Dissertation (Master’s Degree in Health Promotion) – University of Franca, Franca-SP-Brazil.
The main objective of this research was to compare the results obtained in the experimental research using low-level laser diode AlGalnP, wavelength of 660nm, with different doses. In the experiment we analyzed data from 54 Wistar rats, divided in control groups, groups that were submitted into laser therapy with dose of 4j/cm², and groups submitted with dose 8j/cm². Daily macroscopic evaluation of the animals was made, by the paquimetry of the flesh wounds. Being so, the animals were sedated with halothane. The resulted data was analyzed by the method of T-Student with a degree of 95% significance (p<0,05). All the analysis were made using the GraphPad Prism 4.0 program. To realize the histopathologic exam, in the periods of 3rd, 7th, and 14th day, the animals were submitted to euthanasia after the experimental surgery in the following days: 4th, 8th, and 15th. The scar and the wound area were surgically removed, which were identified put into tamponated formalin 10% solution. The removed material was examined, included in wax, suffered cuts of 4µm thickness and was colored with hematoxilina-eosina (HE). The samples were analyzed by light optic microscopy, observed and semi-quantitative evaluated, the inflammatory process, epithelialization degree, collagen fibers, and edema. The number of neovascularization was counted in graticule for microscopy in an area standardized of 0,25mm2. The microscopy evaluation results shows that 50% of the group submitted to lasertherapy in the dose of 4j/cm² presented complete cicatrization on the 12th day of treatment while 83,3% presented complete cicatrization on the 14th day. In the group of animals submitted to lasertherapy in the dose of 8j/cm², only 16,6% of the animals presented completed cicatrization on the 12th day of treatment, and 66,6% of the animals on the 14th day of treatment. So, the low potency had better capacity to increase the cicatrization process. The morphometry analysis of the flesh wound showed that, on the 7th day after the beginning of the treatment, had a medium number statistically of neovessels (p<0,05) in the animals treated with lasertherapy of 4j/cm2, when compared to the control group. There was no significant difference between control group and 8j/cm2 in the same period. On the 14th day no significant changes were observed between all the evaluated groups. All the groups showed 100% of reepithelialization on the surface of the wounds on the 14th day, probably, it happened in reason of the animal mode used in this research that has spontaneous cicatrisation in a relatively short period of time. The used method for the edema evaluation, formation of collagen fibers, and inflammatory infiltrated, wasn’t able to identify significant differences between the groups on the analyzed periods (3th, 7th and 14th days). The conclusion was that low level lasertherapy with wave of 660nm, on the doses of 4/jcm² and 8j/cm² didn’t show statistical difference. However, macroscopically there was difference, in relation to complete cicatrisation, between animals treated and not treated with lasertherapy. This study shows the importance of low-level lasertherapy in a pathologic that compromises physical, psychic, social and economical integrity of large number of human beings. Key words: cicatrization; raw wounds; lasertherapy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –– Imagem fotográfica da confecção da ferida cirúrgica experimental, com saca-bocada de 10 mm, na região cérvico dorsal de ratos Wistar
24
Figura 2 –– Imagem fotográfica da mensuração macroscópica da ferida cirúrgica experimental, com paquímetro
26
Figura 3 –– Fotografia do aparelho emissor de onda de laser de baixa potência, utilizado na pesquisa. Endophoton de fabricação da KLD Biosistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda.
27
Figura 4 –– Imagem fotográfica da aplicação do laser pelo método pontual, na ferida cirúrgica experimental
27
Figura 5 –– Médias do diâmetro (cm) da ferida cutânea experimental durante o experimento nos grupos controle, laserterapia com 4Joules (4J) e com 8Joules (8J)
29
Figura 6 –– Médias e desvios dos diâmetros (cm) das feridas cutâneas, nos grupos controles, laserterapia com dose de 4Joules (4J) e com dose de 8Joules (8J). Médias com letras diferentes diferem entre si (p<0,05)
30
Figura 7 –– Representação gráfica do número médio e desvios de neovasos em 0,25 mm2 nas feridas cutâneas dos animais do grupo controle, laserterapia com 4 Joules (4J) e com 8 Joules (8J) ao 7o dia (7d) e no 14o dia (14d). *Médias diferem entre si num mesmo período avaliado no teste T (p<0,05)
32
Figura 8 –– Fotomicrografia de cortes histológicos de feridas cutâneas de ratos do grupo controle (A) e dos grupos tratados com laserterapia de 4 J/cm² (B) e 8 J/cm² (C), evidenciando a presença de neovasos (setas), ao 7° dia após o início dos tratamentos (HE – objetiva - 20x)
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Figura 9 –– Representação gráfica da avaliação semi-quantitativa do processo de reepetelização com a utilização de score (0 - ausência; + - raro; ++ - moderado, +++ - intenso) durante o 7o dia do experimento (7d) nas feridas cutâneas dos animais do grupo controle, laserterapia com 4 Joules (4J) e laserterapia com 8 Joules (8J)
33
Figura 10 –– Fotomicrografia de cortes histológicos de feridas cutâneas de ratos do grupo controle (A) e dos grupos tratados com laserterapia de 4J/cm² (B) e 8J/cm² (C), demonstrando o índice de cicatrização em cada grupo (seta) ao 7o dia após o início dos tratamentos (HE - objetiva 4x)
34
Figura 11 –– Fotomicrografia de corte histológico de ferida cutânea de ratos do grupo 4 Joules, demonstrando cicatrização completa (seta) ao 14o após inicio do tratamento (HE - objetiva 4x)
34
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 –– Porcentagem de animais com cicatrização total das feridas cutâneas experimentais com 12 e 14 dias após início do experimento
31
Tabela 2 –– Avaliação semi-quantitativa do processo de reepitelização de feridas cutâneas experimentais dos grupos controle (C), laserterapia na dosimetria de 4J/cm² (G4J) e 8J/cm² (G8J) aos 7 (7d) e 14 dias (14d) após o início dos tratamentos
32
LISTA DE ABREVIATURAS
AlGa – Alumínio e Gálio Nm – nanômetros J/cm² – Joule por centímetro quadrado mm² – milímetro quadrado laser – ligth amplification by stimulated emission of irradiation (amplificação da luz por
emissão estimulada da radiação. HeNe – Helio néon AsGa – Arseneto de gálio AsGaAl – Arseneto de Gálio e Alumínio W/cm² – Watts por centímetro quadrado UNIFRAN – Universidade de Franca CFMV – Conselho Federal de Medicina Veterinária GC – Grupo Controle G4J – Grupo 4 Joules G8J – Grupo 8 Joules HE – hematoxilina-eosina cm – centímetro
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 12
1 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 13
1.1 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL DA PELE ................... 13
1.2 CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUTÂNEAS....................................................... 15
1.3 LASER TERAPÊUTICO.......................................................................................... 18
2 OBJETIVO .............................................................................................................. 22
3 MATERIAL E MÉTODO ...................................................................................... 23
3.1 ANIMAIS.................................................................................................................. 23
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.................................................................... 23
3.2.1 Procedimento cirúrgico ............................................................................................. 23
3.2.2 Grupos experimentais................................................................................................ 25
3.2.3 Avaliação macroscópica das feridas.......................................................................... 25
3.2.4 Tratamento das feridas com laser.............................................................................. 26
3.2.5 Avaliação microscópica das amostras....................................................................... 28
3.2.6 Análise estatística ...................................................................................................... 28
4 RESULTADOS ........................................................................................................ 29
4.1 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DAS FERIDAS CUTÂNEAS.......................... 29
4.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DAS FERIDAS CUTÂNEAS.................... 31
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 35
CONCLUSÃO........................................................................................................................ 41
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 42
ANEXOS ................................................................................................................................ 47
12
INTRODUÇÃO
As tentativas do homem de intervir no processo de cicatrização de feridas
remontam à antiguidade, quando foi reconhecida a importância de protegê-las a fim de evitar
complicações ao paciente. Os portadores de feridas, com freqüência desenvolvem seqüelas
com conseqüências sociais intensas, podendo ocorrer perda de membros e funções,
afastamento do trabalho ou aposentadoria precoce por invalidez. Apesar dos grandes avanços
na compreensão das diversas fases da reparação tissular, com objetivo de auxiliar na
cicatrização das feridas prevenindo complicações, a incidência e prevalência de úlceras
crônicas são extremamente altas (BLANES, 2004).
No processo de reparação tecidual, a regeneração e a cicatrização devem ser
consideradas como eventos distintos, que agem em conjunto a fim de manter a estrutura
anatômica e a função da região afetada. Este fenômeno envolve vários fatores e o
desequilíbrio ou a ausência de compostos (mediadores solúveis, elementos figurados do
sangue, matriz extracelular e células parenquimatosas), principalmente os envolvidos na
formação do colágeno, compromete o resultado final da cicatrização (NASCIMENTO, 2001;
AZEVEDO, 2004; BLANES, 2004).
No Brasil, não há dados estatísticos precisos sobre o número de portadores de
feridas cutâneas crônicas, porém sabe-se que a sua cronificação é responsável pelos impactos
psíquico, social e econômico dessa população e representa a segunda causa de afastamento do
trabalho (MONTENEGRO; FRANCO, 1999). Isso demonstra a importância e a necessidade
de tratamentos acessíveis que atendam um maior número de pacientes, mediante o
desenvolvimento de técnicas mais simples, eficientes e economicamente viáveis.
O tratamento com laserterapia vem atender a essa necessidade, pois há relatos
demonstrando que o laser favorece o processo de cicatrização, agindo na síntese protéica do
colágeno e auxiliando na remodelação da ferida, (RIGAU, 1996 apud NASCIMENTO, 2001).
O laser tem demonstrado eficiência na cicatrização das feridas cutâneas,
acelerando o processo fisiológico da cicatrização e diminuindo a dor dos pacientes, contudo,
esse tipo de tratamento ainda é uma realidade pouco conhecida pelos profissionais,
constituindo uma nova e promissora ferramenta de trabalho. A laserterapia tem estado em
evidência nos últimos dez anos, sendo o foco de várias pesquisas.
13
1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL DA PELE
O tegumento conhecido como pele é o maior órgão do corpo humano,
correspondendo a 16% de seu peso. Está presente em toda superfície externa, exercendo
inúmeras funções na proteção dos tecidos contra danos como dessecação, invasão de
organismos estranhos, lesões físicas, químicas e biológicas. Contém terminações periféricas
de nervos sensitivos que atuam como um grande receptor para as sensações gerais de dor,
pressão e tato, bem como no mecanismo de regulação da temperatura. Protege contra a
radiação ultravioleta, atua na conversão de moléculas precursoras em vitamina D e na
excreção de água através das glândulas sudoríparas (GUYTON, 1989). É constituída por duas
camadas principais, que são epiderme e derme. A epiderme ou cutícula (ectoderma) é a
camada que está em contato com o meio externo sendo formada por tecido epitelial
estratificado pavimentoso queratinizado. A derme (mesoderma) é a camada que fica sob a
epiderme sendo formada por tecido conjuntivo. Abaixo da derme existe outra camada
chamada de hipoderme, constituída por tecido adiposo que é variável de indivíduo para
indivíduo (GRAY, 1988).
A epiderme possui três tipos celulares: os melanócitos, as células de
Langerhans e os queratinócitos. Os melanócitos são responsáveis pela produção de um
pigmento, a melanina, que tem a função de filtro endógeno contra os raios ultravioletas. As
células de Langerhans são células dendríticas que captam e processam sinais antigênicos,
enviando informações para as células linfóides e de Merkel (responsáveis pelas sinapses com
as terminações nervosas periféricas presentes na camada basal da epiderme). Existem ainda,
as células poligonais com pequenas expansões citoplasmáticas, encontradas na camada
espinhosa, denominadas queratinócitos. Encontram-se presentes também, as tonofibrilas e os
desmossomos que atuam dando resistência contra o atrito das células. Na camada granulosa,
encontram-se células poligonais com citoplasma contendo grânulos de queratohialina e
basófilos que são importantes para tornar essa camada impermeável à água. A camada córnea
apresenta-se com espessuras variáveis, é formada por estruturas lamelares compactas e
14
resistentes, com rico conteúdo de fibras, queratina e encontra-se em processo de descamação
contínua (DÂNGELO; FATTINI, 1998), (RIGAU, 1996 apud NASCIMENTO, 2001).
A derme (cório, cútis verdadeira ou pele verdadeira) é rija, flexível e elástica,
sendo também chamada de tecido conjuntivo. Tem a função de sustentação e nutrição da
epiderme e dela originam-se os vasos sanguíneos, terminais nervosos e vasos linfáticos.
Derivam da derme também e liga-se a ela, os apêndices como unhas, cabelos e glândulas. A
derme possui saliências chamadas de papilas dérmicas que dão maior aderência à pele. Pode
apresentar duas camadas: a papilar, formada por tecido conjuntivo frouxo, que prende a derme
à epiderme, e a reticular que é formada por tecido conjuntivo denso, que dá resistência à pele
através das fibras elásticas (GRAY, 1988; DÂNGELO; FATTINI, 1998). Presentes na derme
encontram-se ainda os fibroblastos e fibrócitos formadores de fibras colágenas, elásticas e
reticulares, substância fundamental e matriz extracelular do tecido conjuntivo (GUYTON,
1989). O colágeno é o principal tipo de proteína fibrilar insolúvel na matriz extracelular do
tecido conjuntivo, (GRAY, 1988).
A pele possui, ainda, os órgãos terminais sensitivos especiais que exibem
grande variedade de tamanho e forma, têm aspecto de uma cápsula que envolve as fibras
nervosas terminais. Incluem-se nesse grupo, os discos de Merkel, as terminações nervosas
livres e os corpúsculos de Meissner, Pacini e Ruffini (VILELA, 2006).
Os discos de Merkel relacionam-se às sensibilidades, tátil e de pressão.
As terminações nervosas livres apresentam sensibilidade aos estímulos
mecânicos principalmente a dor. São formadas por axônio ramificado envolto por células e
Schwann sendo ambos envolvidos por uma membrana basal (VILELA, 2006).
Os corpúsculos de Meissner são responsáveis pelo tato e estão presentes nas
saliências da pele sem pêlos, como nas impressões digitais, sendo formados por um axônio
mielínico (VILELA, 2006).
Os corpúsculos de Pacini atuam na percepção da pressão e são formados por
uma fibra nervosa com a porção terminal amielínica, envolvida por várias camadas que
correspondem às diversas células de sustentação (VILELA, 2006).
Os corpúsculos de Ruffini atuam na sensação de calor e estão situados
principalmente na junção da pele com o tecido subcutâneo, nos dedos humanos. São ovais e
consistem em fortes bainhas de tecido conjuntivo, no interior das quais as fibras nervosas
dividem-se em numerosos ramos, que mostram varicosidades e terminam em pequenos botões
livres (VILELA, 2006).
Os receptores de Krause, responsáveis pela sensação de frio, são pequenos
15
corpos cilíndricos ou ovais, que consistem de uma cápsula formada pela expansão da bainha
de tecido conjuntivo de uma fibra mielínica. São encontrados na conjuntiva do olho, na
membrana mucosa dos lábios e da língua e no epneuro dos troncos nervosos. Também são
encontrados nas genitais, possuindo aspecto de amora, e em membranas sinoviais de
determinadas articulações (VILELA, 2006).
1.2 CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUTÂNEAS
A cicatrização de feridas cutâneas é realizada através de um processo
complexo que envolve muitos e diferentes tipos de tecidos e linhagens celulares. Encontra-se
em fase de estudos exaustivos. O comportamento de cada tipo de célula, o seu desempenho e
a contribuição durante as fases de proliferação, migração, síntese de matriz e contração, bem
como a presença dos fatores de crescimento e da matriz no leito da lesão, ainda são
superficialmente compreendidos. O processo de cicatrização envolve a indução de um
processo inflamatório agudo, inicialmente, com estimulação, migração e proliferação de
células parenquimatosas e conjuntivas, síntese da matriz extracelular, resultando em
remodelagem do tecido conjuntivo e de componentes parenquimatosos, colagenização e
aquisição de resistência da ferida (NASCIMENTO, 2001).
O processo de reparação, a regeneração e a cicatrização de feridas devem ser
considerados como eventos distintos. Na regeneração, a reposição tecidual é realizada por
meio de células do mesmo tipo das células perdidas no momento da lesão; sendo assim, se
houver pouca alteração do estroma, a regeneração da lesão será completa. Na cicatrização,
entretanto, o tecido lesado é substituído por um tecido conjuntivo próprio que é a cicatriz
(GUYTON, 1989; MARIA, 2004).
A cicatrização compreende várias fases complexas interdependentes e
simultâneas. Na análise morfológica, identificam-se três fases consecutivas onde ocorre um
dinamismo com sobreposição entre elas. Essas fases constituem três estágios importantes:
inflamação, proliferação e remodelação (GUYTON, 1989).
A fase inflamatória inicia-se imediatamente após a lesão, ocorrendo
vasoconstrição por 5 a 10 minutos. Essa vasoconstrição inicialmente reflexa propicia o
fechamento dos vasos lesados e favorece a hemostasia. Posteriormente as células endoteliais
retraem-se e perdem suas conexões, aumentando a permeabilidade vascular e permitindo a
16
passagem de elementos sangüíneos para a ferida como plasma, eritrócitos e leucócitos, através
do fenômeno de diapedese. A vasodilatação com extravasamento de elementos para o exterior
dos vasos forma um exsudato causando calor, rubor e dor. Sua intensidade correlaciona-se
com o tipo e grau de agressão. Juntamente com todas estas alterações, que correspondem à
resposta vascular, existe uma resposta celular. São importantes nesta fase os neutrófilos,
responsáveis pela digestão de bactérias e tecidos desvitalizados e os monócitos que se
transformam em macrófagos e auxiliam na fagocitose. Após o trauma, são liberados
mediadores celulares que estimulam a elaboração de substâncias, promovendo o processo
inflamatório (histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandinas, tromboxanos, linfocinas e
interleucina) (GUYTON, 1989; VILELA, 2006).
Na fase proliferativa ou fibroplástica ocorre a reparação do tecido conjuntivo e
do epitélio, formando o tecido de granulação, que é composto por fibroblastos e vasos
sangüíneos neoformados. O fibroblasto surge por volta do segundo e terceiro dias após o
trauma. O fibrinogênio do exsudato inflamatório transforma-se em fibrina, formando uma
rede, onde os fibroblastos depositam-se e passam a multiplicar-se e a secretar os componentes
proteicos do tecido cicatricial. Concomitante a esta fibroplasia ocorre intensa proliferação
vascular. O tecido formado por fibroblastos, substâncias e vasos sangüíneos denomina-se,
tecido de granulação, tem aspecto granuloso e avermelhado. O miofibroblasto é uma célula
que está presente no tecido de granulação e confere capacidade contrátil facilitando a
epitelização (RESENDE; PEREIRA; CASTRO, 2005). A atividade mitótica do fibroblasto
praticamente desaparece em torno do 15º dia, passando a secretar as proteínas presentes no
tecido de granulação, produzindo componentes da substância fundamental e colágeno. A
substância fundamental é formada por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos têm aspecto
semelhante a um gel e está distribuído entre as fibras do tecido conjuntivo. A formação do
epitélio é outro fenômeno que ocorre na fase de fibroplasia. A epitelização faz-se, pelo
aumento de tamanho, da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme por
sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente (CARVALHO et al., 2003).
A fase de maturação é caracterizada por dois eventos importantes: deposição,
agrupamento e remodelação do colágeno e regressão endotelial, (CARVALHO et al., 2003).
A remodelação do colágeno inicia-se na formação do tecido de granulação e
mantém-se por meses após a reepitelização. As colagenases e outras proteases produzidas por
macrófagos e células epidérmicas dão direção correta às fibras colágenas difusas. Há
diminuição de todos os elementos celulares, inclusive fibroblastos. A regressão endotelial
ocorre através da diminuição progressiva de vasos neoformados. A cicatriz torna-se menos
17
espessa, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (GUYTON, 1989).
A cicatrização de feridas pode ocorrer por: primeira intenção ou união
primária, quando as bordas da ferida são aproximadas, havendo perda mínima de tecido,
ausência de infecção e discreto edema. Por segunda intenção ou união secundária quando
ocorre perda excessiva de tecido e presença de infecção, comprometendo a reparação, que se
torna mais lenta e por terceira intenção ou união terciária, quando a ferida não é suturada no
tempo previsto ou quando a sutura se rompe e a ferida necessita ser suturada novamente,
comprometendo o processo de cicatrização (MARIA, 2004; MAVIOSO, 2003).
Nesse processo, em determinado momento, as fases devem acontecer
simultaneamente permitindo uma perfeita cicatrização (MAVIOSO, 2003). De acordo com
Gray (1988), Maria (2004) e Mavioso (2003), a coagulação sangüínea acontece
imediatamente após o surgimento da ferida, dependendo da atividade plaquetária e da cascata
de coagulação. Ocorre a liberação de substâncias vasoativas, proteínas adesivas, fatores de
crescimento e proteases, contribuindo para a fase seguinte. A formação do coágulo além de
coaptar as bordas da ferida, oferece matriz provisória em que os fibroblastos, as células
endoteliais e os queratinócitos possam migrar e atuar na ferida. Blanes (2004) afirmou que a
fase inflamatória depende de inúmeros mediadores químicos e das células inflamatórias,
como leucócitos, polimorfonucleares, macrófagos, e linfócitos. Essa fase varia de 3 a 5 dias,
permanecendo os polimorfonucleares e os macrófagos por 3 a 10 dias, fagocitando bactérias,
removendo materiais estranhos e facilitando a formação do tecido de granulação.
Gray (1988) afirmou que a fase de proliferação é responsável pelo fechamento
da ferida, promovendo a reepitelização, através da migração de queratinócitos, sendo os
fatores de crescimento os prováveis responsáveis pelo aumento da mitose e da hiperplasia do
epitélio. Vilela (2006) afirmou que a remodelação fisiológica das feridas consiste em um
evento dependente dos fibroblastos, que, além do colágeno, produzem elastina, fibronectina,
glicosaminoglicanas e proteases.
De acordo com Montenegro e Franco (1999), a remodelação corresponde à
última fase da cicatrização e ocorre no colágeno e na matriz, podendo durar meses, sendo
responsável pela força de tensão e pela diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. A
contração da ferida é o movimento centrípeto das bordas na espessura e diâmetro total da
lesão (NASCIMENTO, 2001).
Alguns fatores podem interferir na cicatrização da ferida como idade do
paciente, estado nutricional, existência de doenças como diabetes, alterações
cardiocirculatórias e de coagulação, aterosclerose, disfunção renal, quadros infecciosos
18
sistêmicos e uso de drogas sistêmicas (DÂNGELO; FATTINI, 1998).
A tecnologia tem sido um auxiliar importante no tratamento de ferida cutânea,
possibilitando novas pesquisas e colaborando na descoberta de novas técnicas de tratamento
possibilitando alcançar resultados mais fidedignos e eficazes, tanto para os profissionais que
cuidam das feridas como para os pacientes portadores dessa enfermidade (MANDELBAUM;
SANTIS; MANDELBAUM, 2003).
1.3 LASER TERAPÊUTICO
Albert Einstein, em 1916, descreveu pela primeira vez o fenômeno físico da
emissão estimulada de radiação. A palavra LASER é a abreviatura de “ligth amplification by
stimulated emission of radiation”, ou seja, amplificação da luz por emissão estimulada de
radiação. É uma forma de radiação não ionizante, altamente concentrada. O resultado depende
do tecido irradiado e do tipo de laser utilizado (NASCIMENTO, 2001; ORTIZ, 2001a).
Os lasers são classificados em laser cirúrgico ou de alta potência e laser não
cirúrgico ou de baixa potência. A terapia a laser de baixa intensidade ou baixa potência tem
sido amplamente utilizada, na medicina com varias finalidades, incluindo tratamento visando
alívio da dor e em tratamentos de feridas cutâneas e venosas, visando rapidez e eficiência no
processo de cicatrização. O laser de baixa potência tem demonstrado eficiência devido à
resposta que produz nos diversos tecidos, como redução do edema, controle do processo
inflamatório, aumento da fagocitose, da síntese de colágeno e da epitelização (ORTIZ,
2001b).
A característica do laser de baixa potência é a radiação situada, na porção
visível do espectro das ondas eletromagnéticas. Os comprimentos de ondas utilizados para
terapia estão entre 600 e 1000 nanômetros (nm) (ASSUNÇÃO et al., 2003).
Inúmeros estudos têm sido realizados, em diversas células que fazem parte do
processo cicatricial, na tentativa de elucidar os mecanismos biológicos, pelo qual a radiação
laser pode estimular o processo regenerativo, com diferentes doses e diferentes tipos de lasers
(LILGE; TIERNEY; NUSSBAUM, 2000; COTTA, 1987).
O laser Hélio Neônio (HeNe) apresenta comprimento de onda de 632,8 nm e
tem penetração em todos os tipos de pele, segundo estudo realizado por Kolárová, em 1999
(ORTIZ, 2001a).
19
Em 1960, foi produzido o primeiro feixe de luz de laser e, baseados neste
protótipo, surgiram vários aparelhos (ALBERTINI at al., 2002). O laser é produzido a partir
de elétrons ou moléculas que sofrem salto quântico quando previamente estimulados,
passando de baixo para alto estado de energia. Neste processo, ocorre a emissão de ondas na
mesma freqüência, comprimento e direção, originando o feixe de laser que possui mais
potência do que outras radiações ópticas não modificadas ou estimuladas. O tipo de laser é
determinado pelo comprimento de onda e pelo tipo de material ou substância usada para
confeccioná-lo (ORTIZ, et al., 2001a). A interação de fótons com átomos e com elétrons em
várias órbitas se dá principalmente pelos processos de absorção, emissão espontânea e
emissão estimulada. Um fóton pode ser absorvido por um átomo e, em conseqüência, um
elétron passa de uma órbita para outra, de energia maior. O processo de absorção ocorre
quando há diferença entre a energia do estado final menos a energia do estado inicial do fóton.
Diversos materiais possuem diferentes estruturas de órbitas, portanto, irradiam fótons de
diferentes comprimentos de onda. Quando um elétron é estimulado a passar de uma órbita
para outra, por um fóton, esse processo é chamado de emissão estimulada. Os fótons que
estimulam a transição e os fótons emitidos pelo átomo são coerentes, isto é, têm energia,
freqüência, comprimento de onda e fases iguais e a mesma direção de propagação
(ASSUNÇÃO et al., 2003).
No século passado, a radiação laser foi muito difundida na medicina e ficou
conhecida como “Síndrome da Luz Vermelha”, principalmente utilizada por Finsen,
considerada o pai da fototerapia contemporânea (ORTIZ et al., 2001a). Basov e Projorov em
1964 (KOLARI, 1985) conquistaram o Prêmio Nobel demonstrando as possibilidades
terapêuticas do laser. (ORTIZ, 2001a). No final da década de 70, surgiram os laseres
terapêuticos arsenieto de gálio (AsGa) e arsenieto de gálio alumínio (AsGaAl), na faixa
infravermelha, com emissão de luz visível, variando a onda de 660 a 904nm. Ortiz et al.
(2001b) relataram que Mester e Mester em 1985 estudando os efeitos do laser, observaram
regeneração epitelial, colagenogênese, neovascularização e aumento na força de tensão, após
irradiação, em ferida cutânea, comparativamente a feridas não tratadas com laser. Esses
autores atribuíram tais achados às propriedades de defesa da pele, sob influência da luz
vermelha polarizada e coerente do laser.
O laser está sendo utilizado por especialistas das áreas médicas e
odontológicas, encontrando-se com maior evidência em dermatologia, cirurgia plástica,
fisioterapia, estética, tratamentos vasculares e lesões pigmentadas, entre outras. Na
fisioterapia seu efeito é comprovado como, analgésico, antiinflamatório e cicatrizante
20
(HOPKINS et al., 2004; PUGLIESE et al., 2005). Encontram-se relatos de seu uso em
cicatrização de feridas há mais de 30 anos, embora muitos dos resultados descritos
apresentem inconsistência, devido falhas na descrição da metodologia empregada e ausência
de embasamento científico (NASCIMENTO, 2001).
Atualmente muitos estudos com laser de baixa potência, com comprimento de
onda situada entre 635 nm e 690 nm demonstraram eficiência em cicatrização de feridas
cutâneas e queimaduras (NASCIMENTO, 2001). Webb et al. (1998 apud ORTIZ, 2001b),
analisaram o efeito do laser com comprimento de onda de 660nm, nas doses de 2 Joules por
centímetro quadrado (J/cm²) e 4J/cm², nas culturas de tecido de cicatrizes hipertróficas e
cicatrizes normais de mulheres e constataram que em ambos os grupos houve aumento do
número de células em relação ao grupo controle.
De acordo com Haczeki (1989 apud ALBERTINI et al., 2002), as
características que identificam e diferem a luz laser de outras ondas luminosas são a
monocromaticidade, a colimação, a coerência e a polarização.
A monocromaticidade indica que cada meio que gera laser corresponde a um
único comprimento de onda. Esta característica é considerada o atributo mais importante da
luz laser, porque determina quais biomoléculas absorverão a radiação incidente e, portanto, a
interação fotobiológica e os efeitos terapêuticos específicos (ORTIZ et al., 2001a). A
colimação refere-se ao grau de paralelismo do feixe laser, mantendo um pequeno tamanho da
saída do feixe numa distância relativamente grande; esta característica é responsável pelos
perigos oculares gerados pelo laser. A coerência é a sincronicidade das ondas de luz, pode ser
temporal ou espacial, quando os fótons estão ajustados em plano espacial, paralelo entre si. A
polaridade ocorre quando as ondas de luz estão todas orientadas em um só plano, assim
vibrando em seus campos elétricos numa só direção, podendo ser linear ou circular (ORTIZ et
al., 2001a). A densidade de potência ou irradiância é a potência da saída da luz, medida em
watts por centímetro quadrado (W/cm²), por área irradiada. Segundo Karu (1998 apud ORTIZ
et al., 2001a), esses parâmetros são considerados mais importantes quando testados em
culturas celulares. A fluência ou densidade de energia ou dose é a energia total transmitida
por um feixe de laser, por unidade de área e é medida em Joule por metro quadrado (Sistema
MKS) ou Joule por centímetro quadrado (J/cm²) (KITCHEN; FISCHER, 1991; TURNER,
1999 apud ORTIZ et al., 2001a).
Ainda há na laserterapia, controvérsia quanto à dose correta para aplicação em
cada afecção específica. Encontram-se muitos parâmetros em fase de análise experimental,
tais como: dose a ser utilizada, tempo de aplicação do laser, o tempo de tratamento, a
21
densidade de energia, a freqüência das aplicações, as características do aparelho, o sistema
óptico, o tipo de emissão de luz, o tipo de laser, o feixe de luz, a transmissão, a dispersão, a
absorção e a profundidade do tecido tratado. Albertini et al. (2002) utilizaram o laser AsGaAl
com doses de 1J/cm² e 2,5 J/cm², com objetivo de limitar o processo inflamatório em pata de
ratos. Rocha (2003) estudando a ação do laser com comprimento de onda nas faixas entre
690nm e 940nm, em cicatrização tecidual e angiogênese, concluiu que, apesar de inúmeras
pesquisas estarem voltadas para esse objetivo, ainda não há resposta conclusiva para esses
parâmetros. Say et al. (2003), em pesquisa experimental com lasers HeNe e AsGa, aplicados
em úlceras cutâneas venosas crônicas, observaram que o laser atua com eficiência no processo
de cicatrização, em relação as feridas não tratadas; porém; não identificaram diferença
significativa entre os tipos de lasers utilizados.
Abergel et al. (1984) e David et al. (1996) citados por Nascimento (2001) e
Tatarunas, Matera e Dagli (1998) estudaram os efeitos dos lasers HeNe e AsGa, com objetivo
de analisar as respostas ao estímulo da produção de colágeno em pele humana e cultura de
fibroblastos, e observaram incremento no processo de cicatrização das feridas.
Estudos experimentais, em animais, estão sendo realizados com objetivo de
elaborar um padrão de tratamento com a finalidade de observar e determinar os parâmetros e a
metodologia do uso do laser, pois os resultados encontrados demonstram que, há consenso
quanto sua eficiência no processo de cicatrização de feridas cutâneas.
22
2 OBJETIVO
Verificar o efeito do laser de baixa potência 660nm, na cicatrização de feridas
cutâneas experimentais, em ratos Wistar, através de avaliações macroscópica e microscópica.
23
3 MATERIAL E MÉTODO
A pesquisa foi desenvolvida nas instalações do Hospital Veterinário da
Universidade de Franca (UNIFRAN) – Franca-SP, sendo previamente autorizada pela
Comissão de Ética em Pesquisa com Animais da referida instituição (Anexo A), protocolada
sob nº 108/05 e registrada no Ministério da Saúde, sob nº 128118/2005, após aprovação em
reunião na data de 19/09/2005.
3.1 ANIMAIS
Para o experimento, utilizaram-se 54 ratos machos, adultos, da linhagem
Wistar (Ratus norvegicus albinus), pesando entre 150 e 200g, provenientes do biotério da
UNIFRAN. Os animais foram alimentados com ração comercial e água ad libitum e
acomodados em gaiolas individuais de polipropileno, forradas com serragem. Foram mantidos
com ciclo de 12 horas dia e 12 horas noite.
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
3.2.1 Procedimento cirúrgico
Previamente à realização do procedimento cirúrgico, os animais foram
anestesiados, por via inalatória, em cuba contendo algodão embebido em halotano, de acordo
com as orientações do Conselho Federal de Medicina Veterinária, para protocolos
experimentais com roedores (CFMV1 – 2002). Em seguida ao estabelecimento do plano
1 Conselho Federal de Medicina Veterinária
24
anestésico, os animais foram posicionados em decúbito ventral para que fosse feitas a
tricotomia e anti-sepsia do campo operatório; para a anti-sepsia utilizaram-se álcool iodado e
gazes estéreis.
Concebeu-se a confecção das feridas cirúrgicas na região cérvico dorsal por ser
considerada uma área de difícil acesso ao animal, minimizando ou evitando o autoferimento.
As lesões cirúrgicas foram obtidas com o auxílio de um saca-bocado com diâmetro de 10 mm,
baseando-se em protocolo proposto por Ribeiro et al. (2003). O saca-bocado foi posicionado
perpendicularmente na região pré-estabelecida e a solução de continuidade cutânea obtida
com a execução de movimento giratório, com leve pressão (Figura 1).
Figura 1 – Imagem fotográfica da confecção da ferida cirúrgica experimental, com saca-bocada de 10 mm, na região cérvico dorsal de ratos Wistar
Optou-se pela região cérvico dorsal para a confecção das feridas por ser uma
área de difícil acesso ao animal, dificultando o autoferimento.
O saca-bocado foi posicionado perpendicularmente sobre o dorso do animal e
com uma leve pressão realizou-se um movimento giratório para que o tecido cutâneo se
desprendesse, com a finalidade de produzir a ferida padronizada em 10 mm de diâmetro.
Utilizou-se tesoura de ponta fina para finalizar a retirada do tecido que formava o tampão e
25
facilitar a obtenção da ferida.
3.2.2 Grupos experimentais
Após a realização do procedimento cirúrgico experimental, os animais foram
divididos em três grupos compostos por 18 indivíduos cada um. Os grupos foram designados
como GC – grupo controle que não recebeu tratamento com laser; G4J – tratado com laser na
dosimetria de 4J/cm² e G8J – tratado com laser na dosimetria de 8J/cm². Os animais do GC
foram identificados e acomodados em gaiolas individuais também identificadas. Os animais
pertencentes ao G4J e ao G8J também receberam identificação, sendo submetidos à primeira
aplicação da laserterapia e, em seguida, colocados em gaiolas individuais igualmente
identificadas.
3.2.3 Avaliação macroscópica das feridas
Diariamente, todos os animais foram anestesiados por via inalatória com
halotano. Após o estabelecimento do plano anestésico, as feridas foram lavadas com solução
salina 0,09% e gazes estéreis, para a remoção da crosta. Na seqüência as feridas foram
medidas com paquímetro, para mensuração do seu diâmetro e realizado o registro fotográfico.
Ato contínuo procedia-se à observação das características macroscópicas das feridas,
atentando-se para o aspecto da borda, presença ou ausência de sinais flogísticos, diminuição
da ferida e aspecto da cicatriz. Em seguida a essa avaliação, os animais do GC foram
recolocados em suas gaiolas e os animais do G4J e do G8J submetidos à terapia com laser.
26
Figura 2 – Imagem fotográfica da mensuração macroscópica da ferida cirúrgica experimental, com paquímetro
3.2.4 Tratamento das feridas com laser
As lesões foram irradiadas em um único ponto (método de aplicação pontual),
no centro da ferida, a uma distância de 5 cm. Para tanto se utilizou o aparelho de laser,
modelo Endophoton da KLD, com microprocessador digital, caneta em aço inoxidável com
ponteira em 30º, sensor toposcópio, potência de saída de 20mW (laser vermelho visível)
AlGa, comprimento de onda de 660nm, feixe colimado, área de emissão de 0,035cm², display
de cristal líquido com iluminação, desligamento automático e indicador de impedância
(Figura 3). O aparelho foi calibrado pelo próprio fabricante (Anexo B).
27
Figura 3 – Fotografia do aparelho emissor de onda de laser de baixa potência, utilizado na pesquisa. Endophoton de fabricação da KLD Biosistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda.
Após os procedimentos diários de limpeza e mensuração das feridas, os
animais do G4J e G8J foram posicionados em decúbito ventral sobre a cama de madeira com
fixador dos membros para receberem a radiação laser previamente estabelecida para o grupo
ao qual pertenciam (Figura 4).
Figura 4 – Imagem fotográfica da aplicação do laser pelo método pontual, na ferida cirúrgica experimental
28
3.2.5 Avaliação microscópica das amostras
Para a avaliação microscópica, foram estabelecidos os períodos de três, sete e
14 dias do pós-operatório, e início da aplicação do laser nos animais dos grupos G4J e G8J.
Foram avaliadas, em cada período, amostras provenientes de seis animais dos grupos
experimentais GC, G4J, G8J, num total de 18 amostras por período.
A coleta das amostras foi realizada após a eutanásia dos animais, que
receberam, por via inalatória, dose letal de halotano, até que ocorresse a parada
cardiorrespiratória. Constatado o óbito, procedeu-se, por técnica cirúrgica asséptica, a retirada
da ferida cutânea incluindo-se a margem de pele circunjacente. O material removido foi
acondicionado em recipiente identificado, contendo hora e data da coleta, grupo experimental
e número do animal, para imersão e fixação em formalina tamponada a 10%. As amostras
foram encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária da UNIFRAN, para serem,
então, processadas, incluídas em parafina e coradas com hematoxilina-eosina (HE).
As amostras foram analisadas à microscopia óptica de luz, sendo observados
semi-quantativamente o infiltrado inflamatório, o edema, a formação das fibras de colágeno e
o grau de epitelização. A neovascularização foi avaliada pela contagem dos neovasos em
gratícula para microscópio, em área padronizada de 0,25mm².
3.2.6 Análise estatística
Os dados obtidos na paquimetria das feridas cutâneas foram analisados pelo
teste T de Student com grau de significância de 95% (P<0,05). Todas as análises foram
realizadas com programa GraphPad Prism 4.0.
29
4 RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DAS FERIDAS CUTÂNEAS
Durante o experimento, as feridas cutâneas de todos os animais não
apresentaram sinais de infecção. A aplicação do laser não resultou em dor ou desconforto para
os roedores. Os exames macroscópico e fotográfico diário demonstraram diminuição da área
lesada, as feridas apresentaram bordas arredondadas e bem definidas nos animais submetidos
à laserterapia, quando comparados ao grupo controle. Os animais não tratados com laser
apresentaram processo de cicatrização mais lento, com bordas irregulares e feridas com
aspecto mais profundo.
As medidas do diâmetro das feridas cutâneas, nos grupos tratados com laser na
dosimetria de 4J/cm² e 8J/cm², foram menores que o diâmetro médio das feridas do grupo
controle (p<0,05). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos tratados
com 4J/cm² e 8J/cm² (Figura 5)
Figura 5 – Médias do diâmetro (cm) da ferida cutânea experimental durante o experimento nos grupos controle, laserterapia com 4Joules (4J) e com 8Joules (8J)
30
Apesar de não existirem diferenças estatisticamente significativas entre os
grupos tratados com laserterapia, observou-se que os grupos tratados com a dose de 4J/cm²
apresentaram processo cicatricial mais acelerado em relação aos grupos tratados com a dose
de 8J/cm² (Tabela 1 e Figura 6). A mensuração diária das feridas cutâneas experimentais
demonstrou, no decorrer de todo o experimento, que os animais tratados com laser na dose de
4J/cm² e 8J/cm² apresentaram um diâmetro médio inferior ao do grupo controle,
demonstrando um processo cicatricial mais efetivo (Figura 6).
Figura 6 – Médias e desvios dos diâmetros (cm) das feridas cutâneas, nos grupos controles, laserterapia com dose de 4Joules (4J) e com dose de 8Joules (8J). Médias com letras diferentes diferem entre si (p<0,05).
A Tabela 1 demonstra a porcentagem de ratos com cicatrização total das
feridas cutâneas experimentais com 3, 7 e 14 dias após inicio do experimento. No grupo
controle somente 2 ratos (33,3%), apresentaram a cicatrização total da ferida no 14ºdia de
tratamento. O grupo tratado com laser na dose de 4J/cm² apresentou cicatrização total das
feridas cutâneas experimentais em 3 roedores, no 7o dia de tratamento (50%) de 5 ratos
(83,3%) no 14º dia. Os animais tratados com a dose de 8J/cm² apresentaram cicatrização total
das feridas cutâneas experimentais em 1 rato no 12º dia de tratamento (16.6%) e em 4 ratos ao
término do experimento (66,6%).
Observou-se que dos grupos experimentais, animais que receberam tratamento
das feridas, com radiação laser 4J/cm², um dos roedores apresentou cicatrização total das
a b b
31
feridas cutâneas precocemente e de forma acelerada já no 10º dia. Nos outros grupos 8J/cm²,
obteve-se o mesmo resultado no 11° dia, e no grupo controle somente no 14° dia. Esses dados
foram obtidos através de análise macroscópica, pelo método da observação diária.
Tabela 1 – Porcentagem de animais com cicatrização total das feridas cutâneas experimentais com 12 e 14 dias após início do experimento
Grupos 12 dias 14 dias
GC 0 33,3%
G4J 50,0% 83,3%
G8J 16,6% 66,6%
4.2 AVALIÇÃO HISTOPATOLÓGICA DAS FERIDAS CUTÂNEAS
O exame histopatológico das amostras de pele retirada para avaliação das
feridas cutâneas experimentais demonstrou que o processo inflamatório inicial, ao terceiro dia
apresentou o predomínio de neutrófilos. A inflamação tecidual reduziu-se no sétimo dia e,
praticamente, desapareceu no 14o dia, nos grupos controle e tratados com laser na dose de
4J/cm² e 8J/cm².
A análise morfométria de área padronizada da ferida cutânea (0,25 mm²),
relativa à neovascularização demonstrou valores médios estatisticamente maiores de neovasos
nos animais tratados com laserterapia 4J/cm², no 7° dia após o início do tratamento (p<0,05),
quando comparados aos do grupo controle (Figuras 7 e 8). Não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos controle e 8J/cm² neste mesmo período. No 14o dia, não foram
observadas diferenças significativas entre os três grupos (Figura 7).
A cicatrização da superfície das feridas experimentais ocorreu de forma mais
precoce; ao 7° dia, em um número maior de animais, tratados com 4J/cm² e 8J/cm², em
relação ao grupo controle (Tabela 2, Figura 9 e Figura 10). Porém, todos os grupos
apresentaram 100% de reepitelização das superfícies das feridas cutâneas, ao 14o dia (Figura 9
e Figura 11).
A metodologia empregada para avaliação do edema, formação de fibras
colágenas e infiltrado inflamatório não foi capaz de detectar diferenças significativas entre os
32
grupos nos períodos analisados (3, 7 e 14 dias).
Tabela 2 – Avaliação semi-quantitativa do processo de reepitelização de feridas cutâneas experimentais dos grupos controle (C), laserterapia na dosimetria de 4J/cm² (G4J) e 8J/cm² (G8J) aos 7 (7d) e 14 dias (14d) após o início dos tratamentos
Score C-7d 4J – 7d 8J - 7d C - 14d 4J – 14d 8J - 14d
0 2 0 1 0 0 0
+ 3 3 3 0 0 0
++ 1 2 1 0 0 0
+++ 0 1 1 6 6 6 0 - ausência (quanto a presença de células epiteliais) + - raro (presença de células epiteliais) ++ - moderado +++ - intenso
Figura 7 – Representação gráfica do número médio e desvios de neovasos em 0,25 mm2 nas feridas cutâneas dos animais do grupo controle, laserterapia com 4 Joules (4J) e com 8 Joules (8J) ao 7o dia (7d) e no 14o dia (14d). *Médias diferem entre si num mesmo período avaliado no teste T (p<0,05)
*
33
Figura 8 – Fotomicrografia de cortes histológicos de feridas cutâneas de ratos do grupo controle (A) e dos grupos tratados com laserterapia de 4 J/cm² (B) e 8 J/cm² (C), evidenciando a presença de neovasos (setas), ao 7° dia após o início dos tratamentos (HE – objetiva - 20x)
Figura 9 – Representação gráfica da avaliação semi-quantitativa do processo de reepetelização com a utilização de score (0 - ausência; + - raro; ++ - moderado, +++ - intenso) durante o 7o dia do experimento (7d) nas feridas cutâneas dos animais do grupo controle, laserterapia com 4 Joules (4J) e laserterapia com 8 Joules (8J)
34
Figura 10 – Fotomicrografia de cortes histológicos de feridas cutâneas de ratos do grupo controle (A) e dos grupos tratados com laserterapia de 4J/cm² (B) e 8J/cm² (C), demonstrando o índice de cicatrização em cada grupo (seta) ao 7o dia após o início dos tratamentos (HE - objetiva 4x)
Figura 11 – Fotomicrografia de corte histológico de ferida cutânea de ratos do grupo 4 Joules, demonstrando cicatrização completa (seta) ao 14o após inicio do tratamento (HE - objetiva 4x)
35
5 DISCUSSÃO
A aplicação do laser na área médica teve um crescimento significativo nas
últimas décadas, sendo utilizada para fins cirúrgicos e terapêuticos, dentre as inúmeras
descobertas notáveis em todas as áreas do conhecimento, o laser tem ocupado posição de
destaque (CAMPOS; SANTARINE, 2005). A tecnologia possibilitou o desenvolvimento do
laser de baixa potência com características específicas e distintas. O comprimento de onda do
laser, que o caracteriza como sendo de baixa potência e determina sua utilização para fins
terapêuticos, está localizado entre 600 e 1.000 nm (ASSUNÇAO et al., 2003). As
propriedades curativas do laser, aliadas à segurança do tratamento, têm-se mostrado como
grande incentivador para sua utilização por profissionais de diversas áreas da saúde. Esse fato
vem sendo o responsável pelo seu crescimento, estimulando o interesse dos pesquisadores em
investigar seus mecanismos de ação e efeitos terapêuticos, a fim de colaborar na padronização
dos parâmetros de utilização, ainda motivo de controvérsias na literatura.
Vários autores relataram o uso do laser de baixa potência, a fim de comprovar
sua eficiência, em diferentes tipos de lesões, com diferentes comprimentos de ondas e
diferentes doses, tanto em animais como em humanos. Schimitt (1993) e Albertini et al.
(2002) estudaram o laser AsGaAl com comprimento de onda de 650 nm, comparando as
doses de 1J/cm², 2,5J/cm² e 5J/cm², em modelo de inflamação de edema de pata em ratos,
demonstraram em seus resultados que a densidade de energia para obter melhor efeito
antiinflamatório foi de 1J/cm² e 2,5J/cm², reduzindo o edema em 27% e 45,47%,
respectivamente. Marino et al. (2003) e Paim et al. (2002), também pesquisaram os efeitos do
laser AsGaAl porém com comprimento de onda de 830nm nas doses diferentes, de 5J/cm² e
50J/cm² em tecidos diferentes, tíbia de rato, e encontraram como resposta que, a radiação
laser estimula o processo de reparação óssea durante os estágios iniciais, não havendo
extensão desse efeito nos estágios tardios subseqüentes. Enquanto Carvalho et al. (2001)
estudaram o laser HeNe com 632,8nm de comprimento de onda em tecido cutâneo. Os
resultados indicaram que aplicações de laser foram eficazes, equilibrando e acelerando o
processo de reparação das feridas em ratos diabéticos. Para Endo (2002) que estudando os
efeitos do tratamento do laser AsGa com 904nm de comprimento de onda num modelo
experimental de lesão por esmagamento do nervo ciático de ratos, avaliando a ação precoce
36
do tratamento, concluiu que, na dose utilizada (4J/cm²), o efeito benéfico é temporário,
contribuindo para a melhora do aspecto morfológico nervoso, evidenciando uma acentuada
regenerativa morfo-funcional. Enquanto Ortiz et al. (2003) aplicaram o laser AsGaAl com
830nm de comprimento de onda em modelo experimental de inflamação na cavidade articular
do joelho de coelhos encontraram em seus resultados evidências de haver efeito sistêmico
sobre as proteínas plasmáticas, promovidas pelo laser de baixa potência. Porém, Sueli et al.
(2002), em estudos sobre a avaliação do efeito de dois laseres de baixa potência AsGa e HeNe
na dermatite tópica induzida em orelha de camundongos, concluíram que o laser HeNe
reduziu significativamente o edema e o laser AsGa potencializou a reação inflamatória. Na
presente pesquisa não foi especificada a mensuração quanto à presença de edema. Porém,
diariamente foram realizada avaliações macroscópicas através do método da observação e
registro fotográfico. Observou-se então, que não houve presença de edema que
comprometesse a cicatrização, quando comparados os grupos tratados com laserterapia com
os grupos controles.
O presente estudo pesquisou os efeitos do laser AsGa com comprimento de
onda de 660nm nas doses de 4J/cm² e 8J/cm² no período total de 14 aplicações. Observou-se
que o índice de cicatrização total das feridas cutâneas dos animais submetidos a laserterapia
por 7 dias na dose de 4J/cm² foi menor (50% dos animais) do que com 14 dias (83,3%).
Resultado semelhante, porém, em menor intensidade, foi observado quando se utilizou a dose
de 8J/cm². Com 7 dias apenas 16,6% dos animais apresentaram cicatrização total das feridas
cutâneas contra 66,6% dos animais com 14 dias. Já no grupo controle apenas 33,3% dos
animais apresentou cicatrização total das feridas cutâneas, e só após o 14o dia. Esses dados
sugerem que a dose menor (4J/cm²) demonstrou mais eficiente, embora nesse caso não tenha
havido diferenças estatisticamente significativas (p<0,05). Contudo, ocorreram diferenças
significativas (p<0,05) entre os grupos submetidos à laserterapia e o grupo controle (Figura
6), mostrando que esse tipo de terapia pode auxiliar na cicatrização de feridas cutâneas. Esse
achado foi corroborado por Anneroth et al. (1988), que também observaram cicatrização total
em tecidos cutâneos de ratos após 14 sessões de laserterapia. Entretanto, o laser utilizado
possuía 904nm de comprimento de onda e a metodologia empregada para coleta das amostras
foi diferente da atual pesquisa.
Ao exame histopatológico observou-se que o processo inflamatório teve início
48 horas após a primeira aplicação da radiação laser, com redução no 7o dia, e praticamente
desaparecendo no 14o dia, nos grupos tratados com laserterapia, nas doses de 4J/cm² e 8J/cm².
Quanto ao processo inflamatório o mesmo resultado foi encontrado no grupo
37
controle sugerindo não ter havido interferência do laser no período pesquisado para roedores.
Contudo, esse achado pode ter ocorrido pelo fato dos roedores possuírem cicatrização
conhecidamente mais rápida em relação aos humanos, em virtude do menor ciclo de vida.
Baxter (1994) e Gogia (1995) citados por Ortiz et al. (2001b) e Gasetta et al. (2005), também
observaram que o laser de baixa potência foi eficiente na diminuição da resposta inflamatória
dos tecidos. Da mesma forma Ozawa et al. (1998) e Stainki et al. (1998), pesquisando os
benefícios do laser na regeneração do nervo radial em cães, observaram a diminuição da
inflamação durante a cicatrização da pele. Albertini et al. (2002), estudando o efeito da
radiação laser de baixa potência, em edema em pata de rato, demonstraram que o efeito
antiinflamatório se inicia após a primeira aplicação. Vincensi e Carvalho (2002), trabalhando
com inflamação aguda induzida em ratos, também encontraram resultados satisfatórios
utilizando o laser de baixa potência.
Na presente pesquisa, também foi avaliado o efeito terapêutico do laser de
baixa potência na neovascularização das feridas cutâneas experimentais, através da análise
morfométrica. Os resultados demonstram que estatisticamente (p<0,05) a média de neovasos
nos animais submetidos a laserterapia na dose de 4J/cm² no 7º dia após o início do tratamento,
foi maior quando comparado ao grupo controle (Figuras 7 e 8). Entretanto, no mesmo
período, não foram observadas diferenças estatísticas entre os animais do grupo tratado com
dosimetria de 8J/cm² quando comparados aos do grupo controle (Tabela 2, Figuras 9 e 10).
Analisando os animais tratados até o 14º dia após o início do tratamento, não foram
observadas diferenças significativas entre todos os grupos (Figura 7). Carvalho et al. (2001),
em seus estudos utilizaram o laser de baixa potência, com a dose de 4J/cm², para tratar as
feridas cutâneas induzidas em roedores diabéticos e não diabéticos. Compararam os três
grupos pesquisados, e também encontraram, nos animais tratados com laserterapia, aumento
do número de neovasos no 7° dia de tratamento, comparados aos animais que não receberam
tratamento com laserterapia. Classificaram esse achado como sendo de moderado para
intenso, os laseres utilizados entre o referido autor e o presente estudo apresentaram
dosimetria semelhante, porém com comprimento de onda diferente. Em outro trabalho,
Carvalho et al. (2003) analisaram feridas cutâneas submetidas à radiação laser e verificaram
também, aumento da neovascularização após 14 dias de laserterapia nos animais tratados em
relação aos animais que não receberam tratamento. Nascimento (2001) estudando os efeitos
teciduais de feridas cutâneas submetidas a diferentes intensidades de uma mesma dose de
radiação, porém com laseres diferentes, observou uma neovascularização mais intensa do que
nas feridas não irradiadas. Segundo o autor, esse aspecto pode representar um efeito da
38
manifestação do laser sobre o tecido endotelial, o qual poderia ser resultante de uma maior
liberação dos mediadores químicos da proliferação celular. Fato já relatado por outros autores
(ABERGEL et al., 1984; HALLMAN et al., 1988; KARU et al., 1995; KARU 1998 e KARU
2000) de acordo com Nascimento (2001).
Quando avaliado o índice de cicatrização, da superfície das feridas cutâneas
experimentais, observou-se no presente estudo que a mesma ocorreu de forma precoce. Pois,
aos 7 dias de tratamento com laserterapia, já se percebia reepitelização nos animais tratados
com as duas doses pesquisadas (4J/cm² e 8J/cm²) em relação aos animais não tratados (Figura
5). Da mesma forma Webb et al. (1998 apud ORTIZ et al., 2001b) descreveram o efeito do
laser de baixa potência 660nm, em culturas de tecido de cicatrizes hipertróficas e normais de
humanos do sexo feminino. Eles também utilizaram duas doses distintas, sendo 2J/cm² e
4J/cm², e atestaram que houve aumento no número de células nas duas doses testadas em
relação ao grupo controle. Os mesmos parâmetros avaliados no 14o dia de tratamento
mostram que todos os grupos apresentaram 100% de cicatrização total da ferida cutânea
experimental (Figuras 9 e 11). Esse fato pode ter ocorrido em virtude da pesquisa ter sido
realizado com roedores que têm o metabolismo acelerado e ciclo de vida curto.
Na presente pesquisa, a metodologia empregada para avaliar formação de
fibras colágenas, não foi capaz de detectar diferenças significativas entre os grupos estudados
nos períodos analisados de tratamento com laserterapia (Tabela 2). Contudo, Schmitt et al.
(1993) pesquisando sobre a regeneração do tendão em cães, demonstraram que o tratamento
com laserterapia também não interferiu no resultado final, particularmente na produção de
fibroblastos e na síntese de fibras colágenas, com o comprimento de onda e na dose utilizada
(904nm e 4J/cm²). Porém, Carvalho et al. (2003), pesquisando o efeito do laser de baixa
potência (HeNe) em feridas cutâneas de ratos, relataram que houve um incremento do
processo cicatricial com uma rede de fibras colágenas melhor elaborada nos animais tratados
com laserterapia do que em animais não submetidos ao mesmo tratamento. Os laseres
utilizados nos trabalhos citados apresentaram características distintas quanto ao comprimento
de onda e o tecido pesquisado, sendo apenas a dosimetria a mesma. A presente pesquisa,
também só apresentou como semelhança com os demais relatos anteriores, a dosimetria
utilizada (4J/cm²). Sendo os tecidos pesquisados, o comprimento de onda laser e o método de
aplicação diferente.
Say et al. (2003) estudaram 4 pacientes portadores de úlceras cutâneas e
portadores de úlceras venosas de diversas etiologias, realizando análise comparativa por
registros fotográficos e gráficos para comprovar a eficácia e atuação do laser de baixa
39
potência (HeNe e AsGa). A dose aplicada foi de 4J/cm² em todos os casos descritos
independente do comprimento de onda do laser. Em um dos casos, ocorreu cicatrização total
após 26 sessões de laserterapia no período de 14 semanas.
Embora os trabalhos pesquisados na literatura apontem para a melhoria da
cicatrização de feridas cutâneas com o laser de baixa potência, autores como Rocha (2003)
acreditam que dependendo do nível e da profundidade da lesão, pode ser perfeitamente viável
a utilização do laser com comprimento de onda acima do visível, pois muitos parâmetros que
ainda estão em estudo precisam de melhor esclarecimento através de pesquisas cientificas.
Essa declaração vem de encontro aos achados na atual pesquisa, pois vários fatores podem
interferir na aplicação da laserterapia. Desde o manuseio da ferida, limpeza, debridamento,
assepsia, metodologia de aplicação, esses fatores vão além da escolha do comprimento da
onda e da dose a ser aplicada.
Também foi possível avaliar o fator analgesia, através de acompanhamento e
observação diária dos animais submetidos à cirurgia para obtenção da ferida cutânea
experimental. Os dados foram obtidos com base no comportamento dos animais tratados pela
laserterapia em relação ao grupo controle. Esse é um parâmetro de importância fundamental
para a utilização desse recurso terapêutico nos consultórios de fisioterapia. Embora não tenha
sido objetivo dessa pesquisa mensurar a dor, outros trabalhos envolvendo a laserterapia de
baixa potência vêem buscando produzir maior conhecimento a esse respeito. Serafim e
Teodoroski (2003) concluíram que a terapia com laser AsGa mostrou-se eficiente no controle
da dor nas articulações temporomandibulares, além de melhorar a amplitude de movimentos
comprometida pela disfunção.
Tatarunas, Matera e Dagli (1998) demonstraram maior eficiência, do laser
AsGa, na dose de 2J/cm² em relação a dose de 4J/cm². No presente trabalho, também foram
utilizadas duas doses diferentes e encontrou-se uma maior eficiência na dose de 4J/cm² em
relação ao tratamento com a dose de 8J/cm². Esse tipo de achado tem sido relatado em outros
trabalhos (SCHMITT et al., 1993; CARVALHO et al., 2001; ORTIZ et al., 2001b; ENDO,
2002), em que o tratamento com dose mais baixa tem apresentado melhores resultados ao
processo de cicatrização de feridas cutâneas quando comparados com doses mais altas.
O laser de baixa potência atua na cicatrização de feridas cutâneas, acelerando o
processo fisiológico da cicatrização, aumentando a neovascularização, melhorando a síntese
protéica, remodelando as bordas da ferida, estimulando a colagenogenese e diminuindo a dor
dos pacientes, entre outros efeitos descritos na literatura e confirmados através dessa pesquisa.
40
Procurou-se demonstrar esse efeito por meio da análise de alguns parâmetros, uma vez que os
trabalhos levantados trazem informações que não propiciam uma avaliação fidedigna. Há
muita diversidade de parâmetros encontrados na literatura, como o tipo de radiação laser, a
dosimetria, o comprimento de onda, o protocolo terapêutico, a espécie animal utilizada e o
tipo de tecido tratado, não permitindo, por vezes, comparações que levem a uma conclusão
definitiva. Portanto, buscou-se uma contribuição com mais informações aos profissionais
envolvidos nesse tipo de tratamento.
Embora muitos trabalhos tenham abordado de maneira extensiva à atuação da
radiação com laser de baixa potência nos diferentes tecidos, ainda existem vários
questionamentos sem respostas, como a dose ótima e a conduta terapêutica. Com o
esclarecimento desses parâmetros, será possível estabelecer critérios que promovam
benefícios reais dessa terapia em patologias que necessitem de intervenção precoce, com a
finalidade de estimular o processo de cicatrização cicatricial, em feridas abertas, úlceras de
decúbitos, feridas em portadores de diabetes entre outras importantes lesões cutâneas de
difícil manejo. Contudo, a laserterapia ainda é uma realidade pouco conhecida pelos
profissionais para esse tipo de tratamento, embora seja um campo de pesquisa em evidência
há mais de dez anos e represente uma nova e promissora ferramenta de trabalho. Por tudo
isso, ela pode contribuir na otimização das terapias existentes a fim de minimizar os efeitos
psíquicos, sociais e econômicos que acometem os portadores dessas patologias.
Proporcionando, portanto, um retorno precoce ao trabalho, a reintegração ao convívio social e
a melhoria na qualidade de vida.
41
CONCLUSÃO
Nas condições experimentais utilizadas, os resultados obtidos no presente
trabalho permitem concluir que:
• a laserterapia utilizando o laser de baixa potência AlGa, no espectro vermelho
visível, com comprimento de onda de 660 nm acelera o processo de
cicatrização. Tanto a dose de 4J/ cm² quanto a de 8J/cm² foram eficientes,
não havendo diferença significativa entre elas. Entretanto, a menor potência
teve maior capacidade de acelerar o processo de cicatrização;
• todos os animais tratados com laser tiveram o processo inflamatório
controlado;
• os neutrófilos foram mais predominantes ao terceiro dia após o início da
laserterapia;
• ocorreu um número significativo de neovasos nos animais tratados com laser;
• observou-se precocidade na cicatrização (reepitelização) das feridas tratadas;
• não ocorreu diferença significativa na avaliação do edema, na formação de
fibras colágenas e no infiltrado inflamatório entre os três grupos.
42
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47
ANEXOS
48
ANEXO A – Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa
49
ANEXO B – Atestado de calibração do aparelho emissor de onda de laser de baixa potência, utilizado na pesquisa
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