efeito de triflumuron - um inibidor da síntese de quitina...
TRANSCRIPT
i
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Efeito de triflumuron - um inibidor da síntese
de quitina - sobre o desenvolvimento e a
reprodução de culicídeos vetores de doenças
Thiago Affonso Belinato
Orientadora: Drª Denise Valle (IOC/ Depto de Entomologia)
Rio de Janeiro; março de 2007
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Instituto Oswaldo Cruz
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Efeito de triflumuron - um inibidor da síntese
de quitina - sobre o desenvolvimento e a
reprodução de culicídeos vetores de doenças
Thiago Affonso Belinato
Dissertação apresentada como requisito à obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária, com área de concentração em Entomologia Médica.
Orientadora: Drª Denise Valle (IOC/ Depto de Entomologia)
Rio de Janeiro; março de 2007
iii
Belinato, Thiago Affonso
Efeito de triflumuron - um inibidor da síntese de quitina - sobre o
desenvolvimento e a reprodução de culicídeos vetores de doenças
Dissertação de Mestrado em Biologia Parasitária, área de concentração em
Entomologia Médica
Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ
Rio de Janeiro, 2007
Número de páginas: xi + 92
1. Culicídeos vetores 2. IGRs 3.inibidor de síntese de quitina 4. triflumuron
iv
Efeito de triflumuron - um inibidor da síntese de quitina - sobre o desenvolvimento e
a reprodução de culicídeos vetores de doenças
Dissertação submetida à coordenação do
curso de Pós-Graduação em Biologia
Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz como
parte dos requisitos para obtenção de grau
em Mestre em Biologia Parasitária, área de
concentração: Entomologia Médica.
Banca Examinadora
Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira - Revisor e Presidente
FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz/ Departamento de Entomologia
Dr. Alexandre Afrânio Peixoto
FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz/ DDBM
Dr. Marcos Henrique Ferreira Sorgine
UFRJ/ Instituto de Bioquímica Médica
Dr. Pedro Lagerblad de Oliveira
UFRJ/ Instituto de Bioquímica Médica
Dr. Cícero Brasileiro de Mello Neto
UFF/ Departamento de Biologia Geral
v
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes
Vetores, Departamento de Entomologia, Instituto Oswaldo Cruz, sediado no
Laboratório de Entomologia do Centro de Pesquisa General Dr Ismael da Rocha,
Instituto de Biologia do Exército. Foram utilizados recursos da Fundação Oswaldo
Cruz, da Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (Faperj), do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Secretaria de
Vigilância em Saúde (SVS-MS).
vi
Aos meus pais, Pedro e Rosângela pelo apoio incondicional durante toda minha vida, tanto pessoal quanto acadêmica. Aos meus irmãos André e Bernardo, por acreditarem em mim e, simplesmente, por existirem.
vii
Agradecimentos
A todos os meus familiares e amigos que, muitas vezes sem saber, foram
muito importantes durante o decorrer deste trabalho.
À Ana Carolina dos Santos Valente, caçadora oficial de artigos quase
impossíveis de serem encontrados. Sua ajuda foi imensurável em todos os sentidos.
Não existe espaço aqui e nem palavras com as quais eu possa expressar toda a
minha gratidão.
A todos os amigos do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes
Vetores (LAFICAVE), principalmente pelo espírito de união, o que torna nosso grupo
especial: Denise, Bento, Jutta, Patrícia, Ademir, Gustavo, Márcia, Isabela, Luana,
Camila, Priscila, Diogo, Aline, Nathália, Eliane, Tânia, Gilberto, Diego, Údula, Ciroulo
e Bianca. Valeu Mosquiteiros!! Trabalhar com vocês é demais!!
A todos os amigos da turma da Biologia Parasitária 2005: Marcelo, Flávio,
Alexandre, Vigoder, Marcos, Gabriel, Cíntia, Jaline, Cris, Tamara, Tatiane, Simone,
Raquel Canto, Karen, Camila, Lidiane e Carol pelos inúmeros churrascos, amigos
ocultos, festas, quadras etc etc etc. Fiz grandes amigos durante esse período que,
com certeza, vão estar presentes em toda a minha vida!!!
A Luana e Camila, amigas desde a graduação. Estas duas foram e
continuam sendo fundamentais em minha vida e formação. Escrever sobre elas
sempre foi uma tarefa difícil. Vejo nelas o verdadeiro valor da amizade.
Ao Ademir de Jesus Martins Júnior, amigo e orientador desde a Iniciação
Científica. Sempre foi paciente, presente em qualquer situação, colocando sempre
em prática sua inteligência singular através de sugestões e idéias. Valeu Ademir!!!!
viii
Ao Gustavo Lazzaro Rezende, que além de ser meu amigo é uma pessoa
bastante prestativa. Suas sugestões e nossas conversas foram importantes no
decorrer deste trabalho.
À querida "Mafaldinha" que possui uma capacidade gigantesca de ajudar
as pessoas! Muito obrigado por me ouvir, fazer companhia e me ajudar durante os
bioensaios na sala de resistência.
Ao Diogo Bellinato, que me socorreu muitas vezes com sua ajuda durante
a realização dos experimentos.
A Luana Rosa e Jaqueline Chaves pela revisão do português da
dissertação. Foi muito bom conhecer vocês duas, e sem dúvida alguma, já fazem
parte da minha vida!
À Drª Denise Valle, pela paciência e orientação deste trabalho. Considero-
a uma grande pessoa e excelente orientadora. O mais importante é que, acima de
tudo, é minha amiga!
Ao Dr José Bento Pereira Lima, pela orientação, conselhos e sugestões
durante estes dois anos de pesquisa.
Ao Dr Alexandre Peixoto, pelo uso de equipamento e orientação durante
os ensaios de atividade no Laboratório de Biologia Molecular de Insetos.
À Tamara Nunes de Lima Camara, pela amizade e orientação durante os
ensaios de atividade no Laboratório de Biologia Molecular de Insetos.
Ao Instituto de Biologia do Exército (IBEx), onde todos os experimentos
foram realizados.
Ao Instituto Oswaldo Cruz (IOC) pelo apoio financeiro e técnico para
realização deste trabalho.
ix
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(Cnpq) pela concessão da bolsa de Mestrado.
À Bayer CropScience pelo fornecimento da amostra de Triflumuron.
x
Índice
Resumo .................................................................................................................................... 1
Abstract.................................................................................................................................... 2
1) Introdução........................................................................................................................... 3
1.1) Os mosquitos ......................................................................................................... 3
1.1.1) Aedes aegypti................................................................................................. 4
1.1.2) Aedes albopictus........................................................................................... 5
1.1.3) Culex quinquefasciatus ............................................................................... 6
1.2) Controle de vetores .............................................................................................. 8
1.2.1) Inseticidas químicos..................................................................................... 9
1.2.1.1) Organoclorados ..................................................................................... 9
1.2.1.2) Organofosforados ............................................................................... 10
1.2.1.3) Carbamatos........................................................................................... 11
1.2.1.4) Piretróides ............................................................................................. 12
1.2.2) Resistência a inseticidas........................................................................... 12
1.3) Alternativas de controle .................................................................................... 15
1.3.1) Controle biológico....................................................................................... 16
1.3.2) Reguladores do desenvolvimento de insetos (IGRs) ........................ 17
1.3.2.1) Análogos de hormônio juvenil......................................................... 18
1.3.2.2) Agonistas da ecdisona ...................................................................... 20
1.3.2.3) Inibidores da síntese de quitina ...................................................... 20
1.4) Apresentação da dissertação .................................................................................. 25
2) Objetivos ........................................................................................................................... 26
2.1) Objetivo geral ....................................................................................................... 26
2.2) Objetivos específicos......................................................................................... 26
3) Resultados........................................................................................................................ 27
3.1) artigo 1: Effect of a chitin synthesis inhibitor on Aedes aegypti populations
susceptible and resistant to the organophosphate temephos .................................... 27
3.2) artigo 2: Exposure of Aedes aegypti larvae to a chitin synthesis inhibitor sub-
lethal dose: effects on the viability and reproduction of adults................................... 39
xi
3.3) artigo 3: Avaliação do efeito de triflumuron sobre Aedes albopictus, Culex
quinquefasciatus e populações de campo de Aedes aegypti em condições de
laboratório ........................................................................................................................... 59
4) Discussão ......................................................................................................................... 77
5) Conclusões....................................................................................................................... 81
6) Perspectivas..................................................................................................................... 82
7) Bibliografia ....................................................................................................................... 83
1
Resumo
Aedes aegypti, Aedes albopictus e Culex quinquefasciatus são três espécies de
mosquito difundidas principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do globo. No
Brasil, estão relacionadas com a transmissão de doenças como a dengue e a
filariose linfática e há grande preocupação com sua potencial participação na
transmissão de outras arboviroses, como o vírus do oeste do Nilo e o da febre
amarela. Atualmente, a principal forma de combate a vetores de doenças é realizada
através do uso de inseticidas químicos, cujo sítio de ação é o sistema nervoso
central do inseto. Como conseqüência do uso maciço destes produtos, a freqüência
de indivíduos resistentes em populações de várias espécies de insetos vetores tem
aumentado. Os reguladores do desenvolvimento de insetos aparecem como uma
nova alternativa de controle de mosquitos vetores. Neste grupo, encontram-se os
inibidores da síntese de quitina (CSI), substâncias que prejudicam o processo de
muda, acarretando deficiências principalmente na cutícula dos insetos. No presente
trabalho, verificou-se que o CSI triflumuron foi eficaz contra estas três espécies de
culicídeos vetores, em concentrações na ordem de µg/L. Além disso, foi investigado o
efeito da aplicação, em larvas, de dose parcialmente letal de triflumuron sobre vários
aspectos da biologia de Ae. aegypti. De modo geral, a longevidade, aceitação do
repasto sangüíneo, volume de sangue ingerido, reprodução e postura são afetados
negativamente nos adultos sobreviventes ao tratamento na fase imatura. Triflumuron
foi eficaz contra diversas populações de campo de Ae. aegypti, com diferentes níveis
de susceptibilidade ao organofosforado temephos e ao piretróide deltametrina: não
houve emergência de adultos viáveis quando as larvas foram expostas à IE99 de
triflumuron para a cepa-referência Rockefeller. Embora não tenha sido detectada
resistência cruzada entre aqueles inseticidas químicos e o CSI, a mortalidade de
populações resistentes ao temephos, mas não à deltametrina, ocorreu mais
tardiamente. Estes resultados indicam que triflumuron pode ser considerado como
uma alternativa promissora para o controle de culicídeos no Brasil e apontam para a
necessidade de monitoramento constante do status de susceptibilidade das
populações do vetor.
2
Abstract
Aedes aegypti, Aedes albopictus and Culex quinquefasciatus are three mosquito
species spread allover the world, mainly in the tropical and subtropical regions. In
Brazil these are implicated in the transmission of diseases such as dengue and
lymphatic filariasis, and there is a great concern related to their potential in
transmitting several other arboviruses, like those responsible for West Nile and
yellow fever. Presently, the major tools against disease vectors are chemical
insecticides, whose target site is the insect central nervous system. A consequence
of the massive use of these products is the frequence increasing of resistant
individuals in populations of several species of medical importance. The Insect
Growth Regulators represent a novel alternative of mosquito vectors control. The
chitin synthesis inhibitors (CSI), members of this group, interfere with the molting
process, resulting in a series of defects, mainly in the insect cuticle. In the present
work we verified that the CSI triflumuron was effective against three species of
culicidae vectors, in concentrations in the range of µg/L. The consequences of
exposing Ae. aegypti larvae to partial lethal doses of triflumuron over several aspects
of their biology were also investigated. In general longevity, blood feeding
acceptance, size of blood meal, reproduction and egg laying are negatively affected
in triflumuron surviving adults. Triflumuron was effective against several Ae. aegypti
field populations, exhibiting different levels of resistance to the organophosphate
temephos and to the pyrethroid deltamethrin: no emergence of viable adults was
detected after exposure of larvae to the EI99 triflumuron Rockefeller (a reference
strain) dose. Although no cross resistance among those chemical insecticides and
the CSI has been detected, in general, mortality of temephos (but not deltamethrin)
resistant populations was observed later. These results indicate triflumuron can be
envisaged as a promising alternative to the control of culicidae in Brazil and point to
the need of the permanent monitoring of the insecticide susceptibility status of vector
populations.
3
1) Introdução
1.1) Os mosquitos
Os mosquitos pertencem à família Culicidae, grupo que se enquadra
dentro da ordem Diptera, que contém por volta de 151.000 espécies descritas
(Brusca e Brusca, 2003). Esta ordem, por sua vez, inclui os insetos portadores de
duas asas, como as moscas e os mosquitos (Ruppert e Barnes, 1996). Os
mosquitos são encontrados basicamente em todo o mundo, com exceção dos
lugares com clima muito hostil, que permanecem congelados o ano todo. A maior
parte das espécies de mosquitos vive nos trópicos e sub-trópicos, onde o clima
moderadamente quente e úmido é favorável ao rápido desenvolvimento e
sobrevivência dos adultos (Clements, 1992).
Atualmente, os mosquitos são classificados em três subfamílias:
Toxorhynchitinae, Anophelinae e Culicinae. Entretanto, apenas as duas últimas
apresentam importância epidemiológica, visto que os Toxorhynchitinae não realizam
hematofagia (Forattini, 2002). O ciclo de vida dos mosquitos é holometabólico, ou
seja, os insetos sofrem metamorfose completa. As fases imaturas compreendem os
estágios de ovo, larva e pupa, que além de serem anatomicamente diferentes dos
adultos, vivem em habitats aquáticos (Ruppert e Barnes, 1996).
As fêmeas dos mosquitos, dependendo da espécie, são capazes de
colocar entre 50 a 500 ovos em um único evento de oviposição. Em geral, os ovos
são depositados diretamente sobre a água ou em locais úmidos que provavelmente
serão inundados em um futuro próximo (Clements, 1992). O desenvolvimento
embrionário se inicia quase imediatamente após os ovos serem depositados, dando
origem a uma larva entre um a sete dias, dependendo da espécie e da temperatura
ambiente. Na maioria das espécies, a larva eclode assim que é formada. Entretanto,
ovos dos mosquitos da Tribo Aedini são capazes de resistir à dessecação, de modo
que uma larva completamente formada no interior do ovo pode resistir por meses na
ausência de água, vindo a eclodir quando chuvas inundarem o sítio de oviposição.
Muitos culicídeos são vetores de doenças, principalmente devido à
necessidade de ingestão de sangue pelas fêmeas, condição necessária para a
produção dos ovos na grande maioria das espécies. Dentre as principais doenças
transmitidas por culicídeos, pode-se destacar a malária, uma série de arboviroses
(como a dengue e a febre amarela) e as filarioses.
4
1.1.1) Aedes aegypti
Mais de 500 espécies são reconhecidas como integrantes do gênero
Aedes, com distribuição que vai do Equador até as regiões polares. Algumas
espécies do norte dos Estados Unidos e do Canadá constituem pragas,
principalmente pelo grande tamanho de suas populações locais. Muitas espécies do
gênero Aedes são primitivamente insetos florestais que se criam, geralmente, na
água que fica coletada nos vertículos das folhas de bromélias ou em ocos de
árvores (Rey, 2001).
O culicídeo Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) é originário da África, tendo
sido levado para as Américas durante a colonização. Essa espécie tem ampla
distribuição, encontrando-se geralmente entre as latitudes 35º Norte e 35º Sul. Em
geral, não é encontrada em zonas acima de 1.000 metros, embora já tenha sido
detectada em locais com mais de 2.000 metros de altitude, como na Índia e na
Colômbia (OPAS, 1995).
Aedes aegypti é um mosquito adaptado ao ambiente urbano, sendo
freqüentemente encontrado no domicílio e no peridomicílio. Larvas desta espécie
podem ser facilmente encontradas em tanques de armazenamento de água e
vasilhames temporários dentro ou fora das casas, como potes, barris, pneus usados,
latas, garrafas e vasos de plantas (Nelson, 1986). Na fase adulta, o corpo é escuro,
com manchas brancas. Sua identificação é facilitada pela presença no escudo de
um desenho em forma de lira composto por escamas claras, que pode ser
distinguido mesmo a olho nu.
Aedes aegypti foi incriminado como transmissor da febre amarela em
1881 por Carlos J. Finlay (Bisset, 2002). Em 1906, Bancroft publicou as primeiras
evidências de que Ae. aegypti também era vetor de dengue, confirmado
posteriormente por Agramonte, em 1906, e por Simmons em 1931 (Martinez, 1990).
Atualmente é encontrado em ampla faixa do continente americano, desde o Uruguai
e Argentina até o sul dos Estados Unidos. No Brasil, está presente em todos os 26
estados da Federação e no Distrito Federal (SVS, 2003) e continua sendo o único
vetor natural confirmado na transmissão de dengue no país. Estudos recentes
confirmam elevada susceptibilidade de populações brasileiras de Ae. aegypti aos
vírus da dengue e da febre amarela (Lourenço-de-Oliveira et al., 2004).
5
1.1.2) Aedes albopictus
Durante as últimas duas décadas, Aedes albopictus (Skuse, 1895) tem se
dispersado do Oeste do Pacífico e Sudeste da Ásia para diversas regiões do globo,
tais como alguns países da Europa, África, e das Américas (Gratz, 2004).
Popularmente conhecido como “Mosquito Tigre”, sua introdução em países nos
quais não se encontrava anteriormente é considerada um grande problema, já que é
um vetor em potencial de diversas arboviroses (Shroyer, 1986). De acordo com
Knudsen (1995), esta espécie é considerada o segundo principal vetor de dengue e
dengue hemorrágica para o homem, perdendo apenas para o culicídeo Ae. aegypti.
Sob condições experimentais, Ae. albopictus apresenta competência
vetorial para 23 arbovirus, incluindo os quatro sorotipos da dengue, o vírus da febre
amarela e o vírus da febre do Nilo (Moore e Mitchell, 1997). Embora em alguns
países (como nos EUA) não existam evidências diretas da relação dessa espécie
com a transmissão de doenças ao homem, vários arbovírus têm sido isolados em
espécimes de campo, tais como o vírus da encefalite eqüina do leste (Moore e
Mitchell, 1997) e os vírus dengue (Serufo et al., 1993; Ibánes-Bernal et al., 1997).
Além de estar relacionado com a transmissão de arboviroses, Ae. albopictus é vetor
natural de Dirofilaria immitis, nematódeo de ampla distribuição geográfica, causador
de uma infecção cardíaca em cães, gatos e canídeos silvestres, que infecta
ocasionalmente o homem (Sulaiman e Jeffery, 1986; Konishi, 1989). Nayar e Knight
(1999) verificaram que pequena taxa de uma população americana de Ae. albopictus
é susceptível a D. immtitis. Os mesmos autores verificaram a presença deste
nematódeo nos túbulos de Malpighi de fêmeas coletadas no campo, o que indica
que o mosquito tem potencial na transmissão do patógeno nos Estados Unidos.
O primeiro registro de Ae. albopictus no Brasil ocorreu no Rio de Janeiro
em 1986. Neste mesmo ano, foi encontrado em São Paulo (Brito et al., 1986) e em
Minas Gerais, e no ano seguinte no Espírito Santo (Consoli e Lourenço de Oliveira,
1994). Em 2003, a espécie estava presente em 20 dos 26 estados brasileiros (dos
Santos, 2003). De acordo com Kambhampati (1990), as linhagens de Ae. albopictus
do Brasil têm origem japonesa, assim como as linhagens dos Estados Unidos.
Entretanto, a origem exata desta espécie no Brasil não está totalmente clara.
Lounibos et al. (2003) sugerem que as populações brasileiras de Ae. albopictus
possuem origens distintas.
6
Aedes albopictus se destaca pela grande habilidade adaptativa, uma vez
que pode ser encontrado tanto em habitats silvestres quanto em locais suburbanos
ou urbanos (Hawley, 1988). No Brasil, sua distribuição nas zonas suburbanas tem
aumentado significativamente (Gratz, 2004), o que é considerado um fato bastante
preocupante, já que esta espécie pode atuar como uma “ponte” na transmissão de
patógenos silvestres ao ambiente urbano (Turell et al., 2001; Lourenço-de-Oliveira et
al., 2004; Juliano e Lounibos, 2005). Neste sentido, Mondet et al. (1996) alertam
sobre a possibilidade de uma reurbanização da febre amarela em locais onde
vetores como Ae. aegypti e Ae albopictus estejam presentes.
No Brasil, sua importância vetorial tem sido amplamente discutida
(Honório e Lourenço-de-Oliveira, 2001; Lounibos et al., 2002). Em 1993 foi isolado,
pela primeira vez no país, o sorotipo DEN-1 do vírus dengue em larvas de Ae.
albopictus coletadas na cidade de Campos Altos, MG (Serufo et al., 1993). Vale
ressaltar que nesta cidade houve registro de dengue, mas não do vetor Ae. aegypti.
Sugere-se, portanto, que Ae. albopictus possa ter um papel secundário na
transmissão de dengue no Brasil.
1.1.3) Culex quinquefasciatus
Culex quinquefasciatus (Say, 1823), também conhecido como “mosquito
das casas” é um culicídeo com coloração levemente amarelada e de origem africana
(Juliano e Lounibos, 2005). Atualmente está distribuído praticamente em todo o
mundo (Forattini, 2002), embora seja encontrado principalmente nas regiões
tropicais e subtropicais (Rey, 2001). Este culicídeo é altamente doméstico e
antropofílico, já que tanto os machos como as fêmeas buscam o domicílio humano
como local de abrigo e as fêmeas realizam o repasto sangüíneo preferencialmente
no homem (Forattini et al., 1987). Forattini et al. (2000) verificaram alto grau de
sinantropia em Culex quinquefasciatus, quando em comparação com outros
culicídeos.
Com grande capacidade de vôo, Cx. quinquefasciatus pode se dispersar
por vários quilômetros de distância se necessário; entretanto, raramente os
mosquitos se dispersam por grandes distâncias dentro do ambiente urbano
(Reissen, 1991). É um culicídeo bastante eclético quanto aos tipos de criadouros,
podendo realizar a oviposição na água da chuva que se acumula em recipientes
7
artificiais, reservatórios ou canais, ou em fossas e esgotos, onde existe alta
concentração de matéria orgânica (Forattini, 2002). Durante a maior parte do dia as
fêmeas permanecem em repouso, começando sua atividade no crepúsculo e se
alimentando durante todas as horas da noite (Deane, 1961).
Culex quinquefasciatus é o principal vetor da filariose linfática (Forattini,
2002), uma doença cujos agentes são espécies de nematódeos: Wuchereria
bancrofti, Brugia malayi e Brugia timori (Rocha e Fontes, 1998). A filariose linfática é
endêmica em várias regiões tropicais da Ásia, África e Américas, sendo considerada
um problema de saúde pública em países como China, Índia e partes leste, central e
oeste da África (WHO, 2000). Estimativas indicam que cerca de 120 milhões de
pessoas encontram-se infectadas com esses nematódeos, e aproximadamente 40
milhões de pessoas estão incapacitadas ou desfiguradas pela doença (WHO, 2000).
No continente americano, esta enfermidade é causada por W. bancrofti, que
provavelmente foi introduzida nas Américas, incluindo o Brasil, com o tráfico de
escravos africanos durante o período colonial (Rocha e Fontes, 1998). De acordo
com Dreyer e Coelho (1997), a prevalência de filariose linfática vem aumentando
nos países tropicais e subtropicais, principalmente em função da expansão urbana
não organizada.
Além de ser o principal vetor de W. bancrofti, Cx. quinquefasciatus pode
estar relacionado com a transmissão de D. immitis (Ahid et al., 2000). Pode também
estar relacionado com a transmissão do vírus da encefalite de São Luis em alguns
países, como sugere o fato de ter sido encontrado infectado com o vírus na
Argentina (Mitchell et al., 1985).
Diante da expansão recente do Vírus do Nilo Ocidental (VNO) nas
Américas e devido à perspectiva e preocupação de sua possível introdução no Brasil
(Luna et al., 2003), grande atenção deveria ser dada às áreas urbanas infestadas
por Cx. quinquefasciatus, já que os mosquitos do gênero Culex estão entre os
vetores mais eficientes na transmissão deste arbovírus (Goddard et al., 2003). Uma
série de autores observou que Cx. quinquefasciatus é moderadamente susceptível
ao Vírus do Nilo Ocidental (Sardelis et al., 2001; Godsey Jr et al., 2005; Hayes et al.,
2005). Além disso, já foi encontrado naturalmente infectado com VNO em alguns
locais nos EUA (Godsey Jr et al., 2005).
8
1.2) Controle de vetores
Alguns métodos de controle de insetos datam de muitos séculos atrás,
como o uso de preparações feitas através de produtos naturais (WHO, 1984). Antes
da 2ª Guerra Mundial, as substâncias químicas usadas no combate aos insetos
eram produtos inorgânicos, como por exemplo, os compostos arsênicos. Apenas
algumas substâncias orgânicas de origem vegetal eram usadas para o controle de
pragas naquele período, como a nicotina, piretrina e rotenona (WHO, 1997).
A década de 1940 representou o início da era moderna dos pesticidas
orgânicos, conhecida também como a época da “revolução dos pesticidas”, quando
o DDT (diclorodifeniltricloroetano) foi usado pela primeira vez como inseticida
(D’Amato et al., 2002). Essa substância havia sido sintetizada originalmente por
Zeidler em 1874, mas suas propriedades de inseticida só foram descobertas por
Paul Müller em 1939, o que rendeu a este pesquisador o prêmio Nobel de medicina
em 1948 (D’Amato et al., 2002). A partir de então, o DDT passou a ser o principal
inseticida utilizado até a década de 1970, quando seu uso foi proibido em diversos
países, principalmente devido aos problemas causados ao meio ambiente (D’Amato
et al., 2002).
De modo geral, o controle de mosquitos pode ser voltado tanto para as
larvas quanto para os adultos. Os métodos mais utilizados no controle de larvas são:
1) físico, 2) químico e 3) biológico (Neves et al., 2001). O controle físico consiste na
eliminação dos criadouros das larvas visando à interrupção do ciclo dos mosquitos.
O controle químico baseia-se na aplicação de produtos capazes de eliminar de
modo eficaz os espécimes. Finalmente, o controle biológico consiste na utilização de
organismos que, de modo natural, controlam as populações de mosquitos.
Atualmente, tem sido dada bastante ênfase ao controle integrado de
vetores (WHO, 2006). Essa modalidade consiste na utilização de dois ou mais
métodos de controle de forma simultânea ou seqüencial (Neves et al., 2001; WHO,
2006). De modo geral, inclui a vigilância entomológica, redução dos criadouros,
controles químico e biológico, manejo da resistência a inseticidas, assim como
campanhas de educação voltadas para a população (Rose, 2001).
O controle de vetores tem importância fundamental no combate a uma
série de doenças, como a malária (Rey, 2001), filariose linfática (Ottesen &
Ramachandran, 1995) e dengue (Gubler, 2002). Em muitas ocasiões representa a
única alternativa de diminuição da transmissão, principalmente nos casos de
9
enfermidades para as quais o desenvolvimento de uma vacina eficaz está em
andamento ou é extremamente complicado.
1.2.1) Inseticidas químicos
Os inseticidas podem ser definidos como uma única substância ou uma
mistura de substâncias usada com a finalidade de eliminar ou reduzir determinada
população de inseto (WHO, 1984, 2006). Os inseticidas são utilizados em diversos
campos de atividade humana; entretanto, as áreas de agricultura e saúde pública
são as que recebem o maior aporte dessas substâncias.
Todos os inseticidas, assim como qualquer pesticida, por natureza são
tóxicos em diferentes graus para diversas formas de vida, incluindo os mamíferos.
Entretanto, eles têm lugar de destaque no que diz respeito ao controle de vetores,
pois o uso destas substâncias está entre as metodologias mais usadas, tanto
sozinhas ou como parte de um manejo integrado (Rose, 2001). Além disso, em
muitos casos, o uso de inseticidas químicos representa a única metodologia para o
controle da transmissão de doenças.
Existe uma série de classes de compostos dentre os inseticidas. A
classificação em grupos é baseada tanto nos efeitos fisiológicos produzidos pela
substância quanto pelo grau de similaridade química (WHO, 1984). Atualmente, os
principais inseticidas utilizados nos programas de controle de vetores estão
agrupados em quatro grandes classes: organoclorados, organofosforados,
carbamatos e piretróides. Todos têm como sítio-alvo o sistema nervoso central do
inseto (Beaty e Marquardt, 1996; WHO, 2006).
1.2.1.1) Organoclorados
Os organoclorados são inseticidas que contêm carbono, hidrogênio e cloro
em sua estrutura química. Estes compostos também são conhecidos como
hidrocarbonetos clorados, compostos orgânicos clorados ou também como
compostos clorados sintéticos (Ware e Whitacre, 2004). Atualmente, a importância
dos organoclorados é principalmente histórica, já que cada vez mais esta classe
está em desuso. São os inseticidas mais persistentes dentre todas as classes. Eles
10
são rapidamente absorvidos pelo trato gastrointestinal; alguns podem ser
rapidamente absorvidos pelo simples contato com a epiderme. Devido a estas
características, tais substâncias são altamente tóxicas aos seres humanos, a outros
animais e ao meio ambiente (WHO, 1997).
De modo geral, os organoclorados podem ser divididos em três grupos: 1)
DDT e os análogos do DDT, 2) Hexaclorohexanos e 3) Ciclodienos (WHO, 1997). O
modo de ação da maioria dos organoclorados nunca foi claramente estabelecido,
mas de algum modo complexo, eles impedem o balanço de íons nos axônios dos
neurônios impedindo a transmissão normal do impulso nervoso, tanto em insetos
quanto em mamíferos. Aparentemente, o DDT, seus análogos e os
Hexaclorohexanos agem diretamente no canal de sódio, impedindo o escoamento
dos íons. Por outro lado, os ciclodienos atuam no receptor de ácido gama-
aminobutírico (GABA) impedindo a entrada de íons cloreto nos neurônios (Ware e
Whitacre, 2004). Biologicamente, a ação dos organoclorados resulta em alterações
de comportamento, distúrbios sensoriais e do equilíbrio, depressão dos centros
vitais, particularmente da respiração (D’Amato et al., 2002).
1.2.1.2) Organofosforados
Os osganofosforados (OPs) são assim chamados por possuírem fósforo
em sua composição. Também são conhecidos como fosfatos orgânicos ou
inseticidas fosforados. A propriedade inseticida destas substâncias foi primeiramente
observada na Alemanha na 2ª Guerra Mundial durante os estudos dos gases
organofosforados, tais como sarim, somam e tabun (WHO,1997; Ware e Whitacre,
2004). Os OPs têm grande importância no que diz respeito ao controle de vetores.
Os compostos deste grupo foram originalmente usados com o propósito de
combater pragas agrícolas, em função da resistência aos organoclorados; foram,
posteriormente usados no controle de vetores em Saúde Pública (WHO, 1997). Os
primeiros organofosforados utilizados com finalidade inseticida foram schradan e
tetraetil pirofosfato que, no entanto, apresentavam grande toxicidade para os
mamíferos. Na década de 1950, foi desenvolvido o malathion, primeiro
organofosforado com grande espectro de ação e baixa toxicidade aos mamíferos.
Desde este período, muitos outros OPs foram desenvolvidos e muitos são,
11
atualmente, utilizados em programas de controle de mosquitos, como o fenthion,
temephos e fenitrothion (WHO, 1997).
Os OPs agem através da inibição da ação da Acetilcolinesterase, uma
importante enzima do sistema nervoso. A inibição da função desta enzima resulta no
acúmulo de acetilcolina nas sinapses neuronais e neuro-musculares, provocando
rápidas contrações nos músculos voluntários, que levam à paralisia seguida de
morte (WHO, 1984; Ware e Whitacre, 2004).
No Brasil, desde 1967 OPs vêm sendo usados no combate ao Ae. aegypti.
Seu uso intensivo, durante décadas, principalmente do larvicida temephos, culminou
com a perda da efetividade desta classe de inseticidas em várias regiões do país,
devido ao desenvolvimento de resistência do vetor (Lima et al., 2003; Braga et al.,
2004).
1.2.1.3) Carbamatos
Os carbamatos são inseticidas derivados do ácido carbâmico,
desenvolvidos em 1947 na Suíça (WHO, 1997). O primeiro produto desta classe
utilizado com sucesso foi o carbaril que, por possuir baixa toxicidade aos mamíferos
e um amplo espectro de ação no que concerne o controle de insetos, tornou-se o
mais popular dos carbamatos (Ware e Whitacre, 2004). Além do carbaril, outros
integrantes deste grupo desempenham importante papel em Saúde Pública.
Propoxur, por exemplo, tem sido amplamente utilizado nos programas de controle da
malária, particularmente em áreas onde a resistência aos OPs é verificada (WHO,
1997).
Assim como os organofosforados, os carbamatos são inibidores diretos da
Acetilcolinesterase. Entretanto, a inibição da enzima pelos carbamatos é reversível e
bastante rápida, raramente excedendo mais de uma hora. Desse modo, embora os
sintomas da ação dos carbamatos sejam rápidos e severos, são curtos em relação
aos efeitos dos oranofosforados (WHO, 1984).
12
1.2.1.4) Piretróides
Os piretróides compreendem a mais antiga classe de inseticida de origem
natural usada atualmente, além de estarem entre os compostos mais seguros ao
meio ambiente (WHO, 1984). Os piretróides compreendem uma mistura de vários
ésteres chamados piretrinas, que são substâncias extraídas de flores pertencentes
ao gênero Chrysanthemum, particularmente, Chrysanthemum cinerariaefolium (Ware
e Whitacre, 2004). Embora as piretrinas naturais sejam bastante instáveis à luz e à
temperatura, os piretróides sintéticos foram desenvolvidos no sentido de possuírem
maior estabilidade frente aos fatores abióticos, assim como maior atividade
inseticida (WHO, 1984).
O primeiro produto comercial, allethrin, foi bastante utilizado no mercado
de Saúde Pública, especialmente no combate aos mosquitos. A primeira geração
dos piretróides sintéticos (phenothrin e tetramethrin) era relativamente instável à luz,
assim como as piretrinas naturais. Durante a década de 1970, houve grande
progresso na produção de piretróides estáveis à luz solar, como a permetrina e a
cipermetrina (WHO, 1997). Estes compostos, bastante eficazes, podem ser usados
em pequenas concentrações, causando pouca contaminação do meio ambiente.
Quando comparados com os organoclorados e organofosforados, apresentam baixo
grau de toxicidade ao homem e a outros animais (Beaty e Marquardt, 1996).
A maioria dos piretróides apresenta mecanismo de ação similar ao do
DDT. Aparentemente, mantêm o canal de sódio aberto nas membranas neuronais.
Isso faz com que as células nervosas produzam descargas elétricas repetitivas,
causando eventualmente paralisia e morte (Ware e Whitacre, 2004).
1.2.2) Resistência a inseticidas
A evolução da resistência de insetos aos inseticidas tem se tornado um
dos grandes entraves aos programas de controle de vetores envolvendo o uso de
produtos químicos. Os casos registrados de resistência se intensificaram com a
introdução dos inseticidas organo-sintéticos por volta de 1940. Na década de 1990 já
havia registro de mais de 500 espécies de insetos e ácaros resistentes a pelo menos
uma classe de composto químico (IRAC-BR, 2006). Atualmente, já foi detectada
13
resistência a praticamente todos os grupos de inseticidas, incluindo os
organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides.
Dentre as conseqüências drásticas da aquisição da resistência estão a
aplicação mais freqüente de inseticidas, o aumento na dosagem, o uso de misturas
indevidas de produtos e a substituição por outros compostos, geralmente de maior
toxicidade (IRAC-BR, 2006). Estes fatores estão relacionados com a maior
contaminação do meio ambiente, destruição de organismos benéficos e elevação
nos custos dos programas de controle.
A resistência aos inseticidas pode ser funcionalmente definida como a
habilidade de uma linhagem de insetos de sobreviver a doses de um composto
tóxico, letais para a maioria dos indivíduos de uma linhagem susceptível da mesma
espécie (Beaty e Marquardt, 1996). No início, estima-se que a freqüência de alelos
que conferem resistência em uma população é bastante baixa (Roush e Mckenzie,
1987). Com o uso contínuo e massivo de um mesmo produto, a freqüência de
indivíduos resistentes pode alcançar níveis em que a eficácia do produto é
comprometida naquela população específica (ffrench-Constant, 2006).
A resistência de um determinado organismo pode ser manifestada para
dois ou mais compostos químicos distintos através da resistência cruzada ou
resistência múltipla. A primeira ocorre quando um único mecanismo confere
resistência a dois ou mais compostos. Por outro lado, a resistência múltipla ocorre
quando pelo menos dois diferentes mecanismos coexistentes conferem resistência a
dois ou mais compostos químicos (IRAC-BR, 2006).
A resistência a inseticidas pode se dar através de diferentes mecanismos,
sejam eles fisiológicos ou bioquímicos. De modo geral, pode ser dividida em quatro
categorias:
a) comportamental: A resistência comportamental resulta de uma série
de ações que conferem a uma população de insetos habilidade para evitar uma dose
letal de um inseticida (Lockwood et al., 1984). Esta habilidade, que pode ou não
estar ligada a fatores genéticos (Sparks et al., 1989), em geral é estímulo-
dependente, ou seja, está relacionada com o fato de uma população de insetos
evitar determinado ambiente após a detecção do inseticida. Tal forma de resistência
geralmente ocorre com inseticidas que são aplicados em iscas ou em superfícies,
tais como o DDT (Lockwood et al., 1984). Estudos de campo na África, Índia, Brasil
e México apresentam muitos indícios de resistência comportamental de vetores de
malária ao DDT: os mosquitos evitavam o inseticida, não freqüentando as casas
14
onde havia sido aplicado o DDT, ou saíam rapidamente delas (Roberts e Andre,
1994).
b) penetração reduzida: a redução da penetração cuticular é outro
mecanismo fisiológico que pode permitir a sobrevivência do inseto quando exposto a
determinado inseticida. Neste caso, como a taxa de penetração do inseticida através
da cutícula é reduzida, menor quantidade do xenobiótico alcança o organismos e os
mecanismos de detoxificação internos presentes no inseto têm maior probabilidade
de metabolizar o inseticida (IRAC-BR, 2006). Apesar da penetração reduzida
raramente ocorrer, ela é responsável por níveis dramáticos de resistência a diversas
classes de inseticidas. Não existem relatos dos processos fisiológicos ou dos
mecanismos moleculares envolvidos neste tipo de resistência (Raymond et al.,
1989).
c) metabolização dos inseticidas: a metabolização dos inseticidas está
relacionada com o aumento da eficiência dos mecanismos enzimáticos de
detoxificação naturais do inseto (resistência metabólica). Este aumento de eficiência
promove a inativação e eliminação do inseticida, impedindo que o mesmo alcance o
sistema nervoso, seu sítio final de ação (Brogdon e McAllister, 1998; Hemingway e
Ranson, 2000). Três principais grupos de enzimas, quando alteradas, são
responsáveis pela resistência metabólica: Esterases, Oxidases de função mista (ou
Monoxigenases P450), e Glutationa-S-Transferases (GSTs).
A superprodução de Esterases é considerada uma resposta à pressão de
seleção por organofosforados ou carbamatos. Este fenômeno tem sido verificado em
uma série de artrópodes, tais como mosquitos, carrapatos e baratas (Hemingway et
al., 2004). As Esterases amplificadas podem rapidamente seqüestrar o inseticida,
impedindo-o de chegar ao sítio-alvo (Karunaratne et al., 1993). Adicionalmente,
mudanças qualitativas na enzimas podem ser responsáveis pela rápida hidrólise e
detoxificação de inseticidas (Hemingway et al., 2004).
As Oxidases de função mista (MFO), comumente citadas como
Monoxigenases P450, constituem uma grande família de enzimas encontradas
desde bactérias até mamíferos. Estas moléculas estão envolvidas no metabolismo
de compostos endógenos e exógenos (René, 1999). Existem relatos que
demonstram que intensa atividade de Monoxigenases P450 está relacionada com
resistência a inseticidas em mosquitos (Bergé et al., 1998). Experimentos de
pressão de seleção com Ae. aegypti têm sugerido que as P450 representam a
principal classe enzimática envolvida na resistência metabólica a piretróides (Kumar
15
et al., 2002). Além disto, como as P450 podem estar envolvidas com o metabolismo
de virtualmente todas as classes de inseticidas, levando à ativação de xenobióticos
ou, mais freqüentemente, à sua detoxificação (Bergé et al., 1998; Hemingway e
Ranson, 2000), esta família de enzimas é a mais importante no fenômeno da
resistência cruzada. Por exemplo, pressão de uma população de A. aegypti, em
laboratório, com o OP temephos, por algumas gerações sucessivas, aumentou sua
resistência ao piretróide deltametrina em mais de 300 vezes. Ensaios com
sinergistas indicaram o envolvimento das P450 neste fenômeno (Rodriguez et al.,
2002).
Assim como as Monoxigenases P450, as Glutationa S-transferases
(GSTs) são amplamente difundidas entre os seres vivos e também têm como função
primária a detoxificação de compostos endógenos e exógenos (Hemingway et al.,
2004). A elevada atividade das GSTs também está envolvida na resistência a
inseticidas. Em geral, ocorre devido ao aumento quantitativo de um ou mais tipos de
GSTs, resultado de amplificação de genes, do aumento dos níveis transcricionais ou
de mudanças qualitativas nas enzimas (Ranson e Hemingway, 2005).
d) modificação do sítio-alvo do inseticida: pequenas modificações,
como uma mutação pontual no sítio-alvo dos inseticidas, podem diminuir ou anular a
afinidade entre o inseticida e seu receptor no organismo do inseto (Beaty e
Marquardt, 1996). A Acetilcolinesterase, por exemplo, quando alterada, está
relacionada com resistência a organofosforados e carbamatos (Ayad e Georghiou,
1979; Penilla et al., 1998). Mutações pontuais nos receptores de GABA estão
relacionadas à resistência a ciclodienos, tais como dieldrin (Hemingway et al., 2004).
Da mesma maneira, alterações no canal de sódio dos insetos podem ser
responsáveis pela resistência aos piretróides (Soderlund e Kniple, 2003).
1.3) Alternativas de controle
Com o intuito de contornar o problema da resistência a inseticidas, vários
outros caminhos têm sido estudados, objetivando soluções alternativas e racionais
no que diz respeito ao controle de vetores. Alguns exemplos são o controle biológico
e o uso de reguladores do desenvolvimento de insetos (IGRs, do inglês Insect
Growth Regulators), que compreendem, entre outros, os hormônios juvenis (JHs, do
16
inglês juvenile hormones) e seus análogos sintéticos (JHAs, do inglês juvenile
hormone analogues) e os inibidores da síntese de quitina (CSIs, do inglês chitin
synthesis inhibitors).
1.3.1) Controle biológico
Existem diversos relatos na literatura sobre o uso de fungos, predadores
naturais e bactérias no controle de mosquitos (Donalíseo e Glaser, 2002; Federici et
al., 2003; Polanczyk et al., 2003; Scholte et al., 2004). Entretanto, merece destaque
na área da Saúde Pública a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt). As bactérias
pertencentes ao gênero Bacillus possuem uma fase de esporulação característica no
seu desenvolvimento, na qual o esporo bacteriano e cristais protéicos são
simultaneamente formados. Tais cristais, também chamados de “δ-endotoxinas” ou
“ICPs” (do inglês, insecticidal crystal proteins), são codificados pelos chamados
genes cry (Schnepf et al., 1998).
As ICPs ligam-se a receptores específicos no tubo digestivo das larvas,
modificando sua conformação e causando o vazamento de íons, com conseqüente
dano osmótico das células. Estes fenômenos levam à degradação do intestino e à
morte do inseto. Tal efeito tóxico não se estende a outros organismos que não
tenham tais receptores compatíveis, como seres humanos, peixes e animais
selvagens (Hofte e Whiteley, 1989). Sugere-se que a especificidade destas toxinas
deve-se a uma co-evolução com proteínas receptoras de superfície no intestino
médio dos insetos-alvo sensíveis (Crickmore et al., 1998). Várias formas destas
“ICPs” são sintetizadas por diferentes cepas de Bacillus thuringiensis já identificadas
e catalogadas, as quais possuem distintos espectros, especificidades e eficiência de
ação inseticida (Crickmore et al., 1998). Apesar de Bacillus thuringiensis apresentar
excelente seletividade, sua persistência em campo é relativamente baixa, o que
pode comprometer consideravelmente o controle de vetores em Saúde Pública
(Lima et al., 2005).
17
1.3.2) Reguladores do desenvolvimento de insetos (IGRs)
Uma nova metodologia de controle de insetos baseia-se no uso de
substâncias que alteram seu crescimento e desenvolvimento normal (Tunaz e
Uygun, 2004). Substâncias químicas que interferem ou são capazes de induzir
alterações nestes processos são comumente conhecidas como reguladores do
desenvolvimento dos insetos, ou somente pela sigla IGR, do inglês Insect Growth
regulator (Siddal, 1976; Mian e Mulla, 1982; Graf, 1993; Mulla, 1995; Mondal, 2000;
Tunaz e Uygun, 2004; WHO, 2006).
O início das pesquisas sobre fisiologia e biologia com hormônios de
insetos começaram com o trabalho pioneiro de Wigglesworth na década de 1930.
Foi demonstrado que os processos de muda e metamorfose de ninfas do barbeiro
Rhodnius prolixus Stål, 1859 (Hemiptera: Reduviidae) eram regulados por hormônios
(Wigglesworth, 1934 apud Mian e Mulla, 1982). Posteriormente, com a extração bem
sucedida de hormônio juvenil do abdômen de Hyalophora cecropia (Linnaeus, 1758),
e sua caracterização em 1956, levantou-se a possibilidade de que estes compostos
pudessem ter um grande potencial no controle e manejo de populações de insetos
prejudiciais ao homem (Williams, 1956).
Na década de 1970, Staal (1975) criou oficialmente o termo “IGR” para
descrever uma nova classe de compostos denominados bio-racionais. Estes
compostos, definidos com base no seu mecanismo de ação, compreendem qualquer
substância capaz de acelerar ou inibir processos fisiológicos regulados, essenciais
ao desenvolvimento normal do inseto ou sua progênie (Siddal, 1976). Os inseticidas
químicos tradicionais não podem ser incluídos nesta classe, já que seus
mecanismos de ação não estão relacionados com a interferência na regulação do
crescimento dos insetos (Siddal, 1976; Tunaz e Uygun, 2004). Além disso, os IGRs
não são necessariamente tóxicos aos insetos-alvo, pois não têm como efeito
primário a morte. Os IGRs atuam principalmente durante o desenvolvimento do
inseto, incluindo o desenvolvimento embrionário e larval, prejudicando a muda e a
metamorfose (Beaty e Marquardt, 1996). Dessa maneira, na maioria dos casos, tais
compostos requerem mais tempo para reduzir populações de insetos, quando
comparados aos inseticidas convencionais (Graf, 1993). Apesar dos IGRs afetarem
principalmente os estágios imaturos dos insetos, existem alguns registros que
apontam uma série de problemas nos adultos resultantes de doses subletais, de
18
modo que sua viabilidade é extremamente reduzida (Vasuki, 1992; Vasuki e Rajavel,
1992; Vasuki, 1999).
Os IGRs têm sido utilizados no controle de mosquitos vetores de doenças
em Saúde Pública (WHO, 2006). Em geral, são seguros para peixes, pássaros,
mamíferos e para a maioria dos organismos aquáticos não-alvo (Mian e Mulla, 1982;
WHO, 2006). Além disso, apresentam toxicidade extremamente baixa para os seres
humanos.
Com base no modo de ação, os IGRs são classificados em três categorias
principais: (1) hormônios juvenis e seus análogos, também conhecidos como
juvenóides ou mímicos, (2) agonistas da ecdisona (hormônio envolvido na muda) e
(3) inibidores da síntese de quitina (CSI, do inglês chitin synthesis inhibitor) (Staal,
1975; Marx, 1977; Graf, 1993; Boudjelida et al., 2005).
1.3.2.1) Análogos de hormônio juvenil
A ocorrência de hormônios juvenis (JHs) em insetos foi primeiramente
observada por Wigglesworth na década de 1930 (Graf, 1993). Os JHs são
produzidos, na maioria das espécies de insetos, pelo corpus allatum, um pequeno
órgão situado na base do cérebro, e têm a função de inibir a metamorfose até que a
larva esteja em momento fisiológico adequado (Williams, 1956, 1958).
Existem vários tipos de JHs conhecidos (JH1-3; JH-0 e iso JH-0), de modo
que qualquer distúrbio no balanço normal desses hormônios pode resultar em uma
desordem crucial no crescimento e desenvolvimento do inseto. Os JHs são
responsáveis pela regulação de processos-chave no inseto, como a embriogênese,
muda, metamorfose, reprodução e diapausa (Chapman, 1998). Com base nestas
informações, Williams (1956) postulou que os hormônios de insetos poderiam ser
uma ferramenta excelente de controle, já que seria muito improvável que os insetos
desenvolvessem resistência aos seus próprios hormônios (Williams, 1958).
Entretanto, apesar de os JHs terem um grande potencial para o controle de insetos,
sua instabilidade e dificuldade de síntese interferiram com sua utilização efetiva e
em larga escala (Tunaz e Uygun, 2004). Posteriormente, uma série de análogos dos
JHs foram sintetizados e se tornaram grandes atrativos para uso em controle de
vetores, principalmente por serem fáceis de sintetizar e relativamente seletivos. O
primeiro análogo de hormônio juvenil (JHA) introduzido no mercado foi methoprene
19
(Tunaz e Uygun, 2004); hoje outros JHAs, como piriproxifen e fenoxicarb, estão
disponíveis (Mulla et al., 1985; Schaefer et al., 1987; Vythilingam, 2005; Seng;
2006).
Os JHAs interferem com importantes mecanismos bioquímicos, tais como
a secreção e o transporte dos hormônios juvenis naturais do sítio de secreção para o
sítio de ação, ou para os locais de degradação e excreção (Retnakaran et al., 1985).
Seus efeitos biológicos são muito complexos e variam de acordo com o tipo de
análogo utilizado. Por exemplo, o JHA hidroprene pode estimular a síntese de JH
endógeno quando presente em baixas doses, mas pode ter efeito contrário quando
administrado em grandes quantidades (Tobe e Stay, 1979).
Apesar de o efeito dos JHAs ocorrer principalmente nos estágios imaturos
(Axtell et al., 1979; Ali et al., 1995; Braga et al., 2005), existem alguns relatos que
evidenciam que adultos sobreviventes de exposição a pequenas doses possuem
alterações fisiológicas que comprometem sua sobrevivência e reprodução (Arias e
Mulla, 1975; Sawby et al., 1992; Ritchie et al., 1997). Ritchie et al. (1997) verificaram
que baixas doses de methoprene diminuíram a capacidade de Aedes vigilax (Skuse,
1889) de realizar o repasto sangüíneo. De modo geral, os adultos sobreviventes se
soltam da exúvia com dificuldade (Kramer et al., 1993), apresentam longevidade
reduzida (Sawby et al., 1992), problemas morfológicos (Arias e Mulla, 1975) e
reprodutivos (Sithiprasasna et al., 1996).
Em um dos poucos relatos sobre o efeito de JHA administrado diretamente
aos adultos, Divakar e Rao (1975) verificaram que cerca de 80% de ovos de
Anopheles stephensi alimentados com solução de methoprene eram pequenos,
frágeis e esbranquiçados. Os autores sugeriram que methoprene provavelmente age
nas células foliculares do ovário, interferindo com a formação normal do córion e o
desenvolvimento do oócito. Apesar destas evidências, Braga et al. (2005), não
constataram problemas em ovos de Ae. aegypti resultantes de tratamento com
methoprene.
Trabalhos que tratam do desenvolvimento de resistência a JHAs em
campo também são escassos. Dame et al. (1998) verificaram que uma linhagem de
Aedes taeniorhynchus (Wiedemann, 1821) da Flórida era 14,9 vezes mais resistente
ao methoprene do que uma linhagem susceptível de laboratório. Em alguns casos, a
resistência prévia a outros inseticidas pode estar relacionada com algum nível de
resistência ou tolerância aos JHAs (Ortega et al., 1991).
20
Methoprene e hidroprene, ambos desenvolvidos na metade da década de
1970, são os mais representativos dentre os JHAs. Methoprene, inclusive, é
recomendado pela Organização Mundial de Saúde (WHO) para uso em água
potável, para o controle de Ae. aegypti (Chavasse e Yap, 1997). Entretanto,
formulações de methoprene avaliadas em simulado de campo por Lima et al. (2005),
apresentaram baixo efeito residual nas condições climáticas do Brasil.
1.3.2.2) Agonistas da ecdisona
Os zooecdisteróides (hormônios envolvidos na ecdise) têm funções
essenciais na ativação de genes que atuam na formação da cutícula, crescimento do
espermatócito e indução da diapausa (Chapman, 1998). Desta forma, a
administração de seus agonistas acarreta uma série de problemas fisiológicos no
inseto exposto, tais como síntese prematura da cutícula (especialmente ao redor da
região cefálica), que pode resultar, por exemplo, na oclusão de peças bucais e,
conseqüentemente, em dificuldade de alimentação nos insetos (Boudjelida et al.,
2005). Esta classe de inseticidas é relativamente nova, e inclui compostos como
tebufenozide, halofenozide, methoxyfenozide e chromafenozide (Ware e Whitacre,
2004). Os agonistas da ecdisona exercem toxicidade através de ligação no receptor
de ecdisona (do mesmo modo que a ecdisona natural), ativando assim a transcrição
gênica e o início da muda em um momento fisiológico não adequado ao inseto
(Boudjelida et al., 2005).
Assim como ocorre com a maioria dos IGRs, os adultos resultantes de
doses sub-letais de agonistas da ecdisona, apresentam longevidade reduzida,
diminuição do peso corporal e problemas reprodutivos (Darvas et al., 1992; Heller et
al., 1992). Os agonistas da ecdisona também são considerados seguros ao meio
ambiente e para a maioria dos organismos não-alvos, como macro-invertebrados e
insetos aquáticos (Kreutzweiser et al., 1994; Addison, 1996).
1.3.2.3) Inibidores da síntese de quitina
A quitina é um dos polissacarídeos mais difundidos na natureza,
juntamente com a celulose. Ela é encontrada principalmente no exoesqueleto de
21
artrópodes, paredes celulares de fungos e também em nematódeos (Chapman,
1998). Este polissacarídeo é composto por resíduos de N-acetilglicosamina ligados
entre si através de pontes glicosídicas. Os polímeros de quitina formam microfibrilas
com cerca de 3nm de diâmetro que são estabilizados por pontes de hidrogênio. De
modo geral, a quitina pode ser encontrada em três formas, α, β e γ, que diferem
entre si principalmente no grau de hidratação, na disposição e no número de
microfibrilas (Merzendorfer e Zimoch, 2003). As três formas são encontradas em
estruturas quitinosas dos insetos, sendo que a forma α está mais presente nas
cutículas e a γ principalmente em casulos. A matriz peritrófica possui em sua
composição tanto a forma α, quanto a forma β (Merzendorfer e Zimoch, 2003).
A quitina é considerada um dos principais componentes do exoesqueleto
dos artrópodes, conferindo-lhe forte rigidez e, em conseqüência, capacidade limitada
de crescimento corporal (Chapman, 1998). Portanto, para crescer e se desenvolver,
o inseto troca periodicamente sua cutícula por outra nova, durante processo
denominado muda ou ecdise. Antes da esclerotização, os insetos expandem sua
nova cutícula e liberam seu antigo exoesqueleto, agora chamado de exúvia (Carlson
e Benthey, 1977). Análises da exúvia de insetos revelaram, em algumas espécies, a
presença de pelo menos 40% de quitina em sua composição. A quitina é encontrada
na exo- e endocutícula, mas não na epicutícula, a camada mais externa da cutícula.
Além de estar presente no exoesqueleto, a quitina também é componente
fundamental da matriz peritrófica (MP), estrutura que funciona como uma barreira de
permeabilidade entre o alimento ingerido e o epitélio intestinal. A MP desempenha
importantes funções, pois participa do processo digestivo e também da proteção do
epitélio intestinal contra danos mecânicos, assim como do ataque de toxinas e
patógenos (Terra, 2001). A MP consiste de um complexo de proteínas,
glicoproteínas e proteoglicanas que se associam a microfibrilas de quitina
(Clements, 1992). Alguns insetos cessam completamente a produção da matriz
peritrófica durante os períodos de jejum ou muda. Desta forma, a matriz peritrófica é
expelida ou reabsorvida e outra matriz se forma quando o animal volta a se
alimentar (Merzendorfer e Zimoch, 2003).
Uma vez que o desenvolvimento, o crescimento e muitos aspectos
fisiológicos dos insetos são dependentes de sua capacidade de remodelar as
estruturas quitinosas, a síntese e a degradação da quitina são processos sob
regulação estrita, o que garante que a ecdise e a regeneração da matriz peritrófica
ocorram nos momentos apropriados (Merzendorfer e Zimoch, 2003). Ou seja, a
22
quitina representa um componente fundamental e singular para o desenvolvimento
dos artrópodes. Conseqüentemente, a inibição ou a interferência com processos-
chave relacionados ao metabolismo da quitina são consideradas importantes
alternativas para o desenvolvimento de inseticidas com novos mecanismos de ação.
Um grande número de substâncias é capaz de inibir a síntese de quitina in
vitro e in vivo, como, por exemplo, alguns fungicidas, herbicidas, hidrocarbonetos
clorados, fenilcarbamatos e as benzo-fenil-uréias (BPUs) (Hajjar, 1985). Em relação
ao controle de insetos, os BPUs merecem destaque. Seu potencial de inibição da
síntese de quitina foi descoberto acidentalmente pelo cientista Philips-Duphar no
início da década de 1970, durante suas pesquisas com herbicidas (Graf, 1993). O
primeiro BPU averiguado tinha baixo potencial herbicida, mas, curiosamente, larvas
de insetos que se alimentavam de plantas tratadas realizavam a muda com
dificuldade, alguns dias depois da alimentação. Este resultado inesperado culminou
com o desenvolvimento do diflubenzuron, o primeiro BPU usado comercialmente
(Graf, 1993), que foi a princípio utilizado no controle de pragas agrícolas, sendo
posteriormente utilizado em Medicina Veterinária para o controle de moscas. O
sucesso do diflubenzuron estimulou o desenvolvimento de outros BPUs por várias
companhias químicas. Alguns exemplos são o teflubenzuron, flufenoxuron e o
clorfuazuron, todos usados no controle de pragas agrícolas, assim como o
diflubenzuron.
O mecanismo de ação preciso dos CSIs ainda não é completamente
conhecido (Cohen, 2001). Alguns autores sugerem que atuam principalmente
interferindo ou bloqueando a ação da Quitina-Sintase, enzima chave na
polimerização da quitina (Cohen, 1987). Entretanto, outras hipóteses sugerem que
possam impedir a translocação das microfibrilas de quitina na membrana plasmática
(Nakagawa e Matsumura, 1994) ou ainda interferir com a regulação hormonal da
síntese de quitina, por influenciar a produção de ecdisteróides (Fournet et al., 1995).
De modo geral, a maioria dos CSIs age principalmente sobre as larvas,
que geralmente tornam-se incapazes de sobreviver à próxima muda, em razão de
deficiências em sua nova cutícula (Tunaz e Uygun, 2004). Além do exoesqueleto,
outras estruturas com constituição quitinosa podem ser afetadas, como a matriz
peritrófica dos insetos e os ovos (Clements, 1992). Existem vários relatos na
literatura sobre a eficiência destes compostos, principalmente a respeito do
diflubenzuron (Mian e Mula, 1982; Graf, 1993), do lufenuron (Wilson e Cryan, 1997),
23
do novaluron (Su et al., 2006) e do triflumuron (Sulaiman et al., 1994; Smith e Wall,
1998; Rehini e Soltani, 1999).
Além de interferir com a síntese de quitina, os CSIs provocam uma série
de efeitos secundários que prejudicam o desenvolvimento dos insetos. Parween
(1998) verificou que larvas do coleóptero Tribolium castaneum (Herbst, 1797),
quando tratadas com triflumuron, se alimentavam significativamente menos quando
comparadas com as não tratadas, apresentando desenvolvimento reduzido, além de
um comprimento corporal menor. Vasuki (1992) verificou que a longevidade de
adultos de Cx. quinquefasciatus, An. stephensi e Ae. aegypti sobreviventes ao
tratamento com hexaflumuron era drasticamente reduzida. Em um trabalho posterior,
Vasuki (1999) também observou que estes três culicídeos vetores ingeriam menos
sangue do que os indivíduos não tratados, e, consequentemente, colocavam uma
quantidade menor de ovos. Em outros estudos, nos quais fêmeas foram alimentadas
diretamente com CSIs, também se observou a diminuição da oviposição, além de
uma menor viabilidade dos ovos (Miura et al., 1976; Wilson e Cryan, 1997; Sáenz-
de-Cabezón et al., 2006). Vasuki e Rajavel (1992) verificaram que hexaflumuron
provocou anormalidades visíveis nos imaturos e adultos de Cx. quinquefasciatus,
Ae. aegypti e An. stephensi, muitas das quais relacionadas com a mortalidade
precoce dos adultos. Os adultos sobreviventes apresentavam asas e tarsos
defeituosos que dificultavam sua locomoção. Amir e Peveling (2004) também
observaram menor atividade de vôo e comprometimento da prole em colônias de
abelhas, quando expostas ao triflumuron.
O inseticida Starycide® (Bayer), cujo composto ativo é o triflumuron, tem
sido usado no controle de diversos artrópodes. Como os CSIs têm alvo diferenciado
dos inseticidas clássicos, pode-se considerar seu uso como uma possível alternativa
ao combate de populações de culicídeos vetores, incluindo aquelas resistentes aos
inseticidas comumente utilizados.
Espera-se, portanto, que triflumuron provoque uma série de problemas
que resultem na morte das larvas ou na emergência de adultos fisiologicamente
debilitados. Neste contexto, no presente trabalho larvas de Ae. aegypti, Ae.
albopictus e Cx. quinquefasciatus foram expostas a várias concentrações de
triflumuron, um inibidor da síntese de quitina. Além disto, investigou-se o efeito de
doses subletais de triflumuron, aplicadas a larvas de Ae. aegypti, sobre os adultos
sobreviventes. Finalmente, investigamos a eficiência deste CSI sobre populações de
campo de Ae. aegypti provenientes de diferentes localidades do Brasil, com distintos
24
níveis de susceptibilidade aos inseticidas químicos utilizados em campanhas
nacionais de combate ao vetor.
25
1.4) Apresentação da dissertação
Aedes aegypti, Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus são três espécies de
mosquitos difundidos principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do globo.
No Brasil, são exóticas e estão relacionadas com a transmissão de doenças como a
dengue e a filariose linfática. Existe ainda grande preocupação com a possibilidade
de participação de tais vetores na transmissão de arboviroses emergentes e re-
emergentes, como o vírus do oeste do Nilo e o da febre amarela. Esta dissertação
apresenta o estudo, desenvolvido durante os últimos dois anos, da eficácia de
triflumuron - um inibidor da síntese de quitina – sobre estas três espécies de
culicídeos vetores, visando contribuir com futuras estratégias de controle de
mosquitos de importância sanitária no país.
Na introdução foram apresentadas as principais classes de inseticidas
químicos utilizados no controle de culicídeos, as formas de resistência
desenvolvidas e os métodos alternativos de controle, com destaque aos reguladores
do desenvolvimento dos insetos (IGRs) e, entre estes, aos inibidores da síntese de
quitina. Na próxima seção encontram-se três manuscritos em preparação que,
juntos, compõem os resultados obtidos durante os últimos dois anos de pesquisa. O
primeiro será submetido ao periódico Pest Management Science e trata do efeito de
triflumuron sobre Ae. aegypti, cepa Rockefeller, e sobre duas populações de campo,
uma susceptível e outra resistente ao temephos. O segundo relata os efeitos
causados em Ae. aegypti sobreviventes ao tratamento com dose subletal de
triflumuron. Este texto será submetido à revista Medical and Veterinary Entomology.
Por fim, no último manuscrito, a ser traduzido para o inglês e submetido ao periódico
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, avaliamos a eficácia de triflumuron sobre Ae.
albopictus e Cx. quinquefasciatus. Adicionalmente, foi avaliado o efeito da dose-
diagnóstica (DD) e da IE99 (dose que inibe 99% da emergência de adultos) para a
linhagem Rockefeller, sobre diversas populações brasileiras de Ae. aegypti
resistentes, em graus variáveis, aos dois principais inseticidas utilizados no país.
26
2) Objetivos
2.1) Objetivo geral
Avaliação do efeito de triflumuron sobre Aedes aegypti, Aedes albopictus e Culex
quinquefasciatus, em condições de laboratório.
2.2) Objetivos específicos
1) Avaliação do efeito de triflumuron sobre o desenvolvimento de larvas de Ae.
aegypti, Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus. Parâmetros analisados:
1.1) cinética do desenvolvimento;
1.2) inibição da emergência de adultos.
2) Avaliação do efeito de triflumuron sobre populações de Ae. aegypti, oriundas do
campo, com diferentes níveis de susceptibilidade ao larvicida organofosforado
temephos e ao adulticida piretróide deltametrina.
3) Estudo do efeito de doses parcialmente letais de triflumuron, aplicadas em larvas
de terceiro estádio de Ae. aegypti, sobre adultos sobreviventes. Parâmetros
avaliados:
3.1) proporção sexual dos adultos resultantes;
3.2) longevidade;
3.3) atividade locomotora;
3.4) aceitação de repasto sangüíneo e quantidade de sangue ingerido pelas
fêmeas;
3.5) sobrevivência das fêmeas após ingestão de sangue;
3.6) aspectos da reprodução:
- taxa de fêmeas inseminadas;
- taxa de fêmeas que colocam ovos;
- quantidade de ovos colocados por fêmea;
- taxa de fêmeas que sobrevivem à postura;
- viabilidade dos ovos.
27
3) Resultados
3.1) artigo 1: Effect of a chitin synthesis inhibitor on Aedes aegypti populations
susceptible and resistant to the organophosphate temephos
Autores: Ademir Jesus Martins, Thiago Affonso Belinato, José Bento Pereira
Lima, Denise Valle
28
Effect of a chitin synthesis inhibitor on Aedes aegypti populations susceptible
and resistant to the organophosphate temephos
Ademir Jesus Martins, Thiago Affonso Belinato, José Bento Pereira Lima, Denise
Valle
Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores – Departamento de
Entomologia – Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Abstract: In Brazil, control of the dengue vector is impaired due to resistance of field
Aedes aegypti populations to organophosphates. Insect Growth Regulators are a
promising alternative, since their mechanisms of action are distinct from conventional
insecticides. We verified that triflumuron, a chitin synthesis inhibitor, arrests
development and induces mortality of the insecticide-susceptible strain Rockefeller in
a dose-dependent way (ED50 and ED90 of 0.8 and 1.8 µg/L, respectively). A direct
relationship between triflumuron concentration and the precocity of its effects was
noted. The efficacy of triflumuron against two Ae. aegypti field populations was
equivalent, irrespective of their organophosphate resistance status: TemS and TemR
resistance ratios (RR90) against temephos was 4.5 and 13.8, while RR90 against
triflumuron was 1.0 and 1.3, respectively. These results point chitin synthesis
inhibitors as potential alternatives in the control of Ae. aegypti.
1 INTRODUCTION
In the last two decades the number of dengue and dengue hemorrhagic fever cases
increased in Brazil. 1 In addition, several reports point to the risk of yellow fever re-
urbanization in the country2,3. Both situations are correlated to the presence and the
29
high infestation levels of Aedes aegypti mosquitoes in a growing number of localities,
since its reintroduction in Brazil.4-6
In Brazil, the use of organophosphate (OP) insecticides against Ae. aegypti was
intensified since 1986, when the first recent dengue outbreak took place.7 The OP
temephos was the sole larvicide utilized at that time. Mosquito resistance to
temephos was confirmed 10-15 years later,8-10 mostly as a result of the Brazilian
Aedes aegypti Resistance Monitoring Network, established in 1999.11 As a
consequence, the Brazilian Health Ministry substituted temephos for the biolarvicide
Bacillus thurigiensis var israelensis (Bti) in the localities with resistant Ae. aegypti.9
However, the low residual effect of Bti formulations available to the Brazilian Dengue
Control Program12,13 pointed to the need of novel formulations, or larvicides.
The conventional insecticides employed in Public Health act on the insect central
nervous system and are subjected to redundant enzymatic detoxification pathways, a
situation that favors cross resistance among compounds of different classes. In this
sense, Insect Growth Regulators (IGR) emerge as a promising alternative, since their
target sites and mechanisms of action are distinct from the classical insecticides.14
This is the case of benzoylphenylurea (BPU) compounds, IGRs that inhibit chitin
synthesis, and can potentially interfere with the metamorphosis process, as well as
with insect digestion and reproduction.15,16
In the present work the effect of triflumuron, a BPU compound, on the mortality and
reproduction of a laboratory Ae. aegypti strain was analyzed. Subsequently two
Brazilian Ae. aegypti populations, one resistant and one susceptible to the OP
temephos, were exposed to triflumuron and lethal concentrations were compared.
The results point to the perspective of utilization of this IGR class in the control of the
dengue vector populations resistant to conventional insecticides.
30
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Mosquitoes
Mosquitoes from the insecticide susceptible Rockefeller (Rock) strain, reared
continuously in the laboratory, were used to evaluate triflumuron effects and to
compare with field populations. Temephos resistant (TemR) and susceptible (TemS)
field populations derived from Rio de Janeiro, RJ and Porto Velho, RO cities,
respectively10. In both cases F1 mosquitoes, obtained as described by Braga et al
2004,10 were employed.
2.2 Insect Growth Regulator
The chitin synthesis inhibitor triflumuron (Starycide SC 0.48®, BayerCropscience) was
utilized in all cases. Aliquots of 150ng/L were prepared in dechlorinated water and
diluted to specified concentrations.
2.3 Bioassays
In order to synchronize larvae age, eggs were allowed to hatch for one hour. Groups
of 1,000 larvae were reared in 33 X 24 X 8 cm plastic containers with 1L of
dechlorinated water and small amount cat food (Friskies®, Purina, Camaquã/RS),
added only once. Larvae were kept at 26ºC into a BOD incubator (Electrolab) during
three days, when the beginning of L3 instar was reached.
Four replicas of transparent plastic cups filled with 150 mL dechlorinated water
(control) or triflumuron solutions of varying concentrations (0.5 to 5.0 µg/L) and a
small amount of food, added on the first day, were prepared. Each replica contained
20 L3 larvae and each assay was performed four times.
31
Dead and alive larvae, pupae and adults were scored daily until death or adult
emergence of all individuals. Dead specimens and alive adults were removed from
the test cups daily. Adults that survived less than 24 hours were considered dead.
2.4 Evaluation criteria and statistical analysis
Trifumuron dose-response assays were submitted to log-probit transformation and
effective doses (mortality and emergence inhibition, EI) were calculated through
linear regression analysis with a confidence interval of 95%17. Resistance ratios were
calculated by comparison with results obtained with the reference strain, Rockefeller.
The criteria proposed by Mazzarri and Georghiou (1995)18 were used to classify
resistance ratios in high (>10 fold), moderate (between 5 and 10) and low (<5). The
total mortality and EI dose-dependent curves were compared by ANOVA, performed
using GraphPad Prism version 4.00 for Windows, GraphPad Software.
3 RESULTS AND DISCUSSION
Figure 1 shows EI and mortality non-linear regression curves obtained from data at
the 14th day of triflumuron exposure. Triflumuron inhibits the development and
induces mortality of Ae. aegypti Rockefeller strain in a dose-dependent way.
Although no significant difference between both curves was noted (F.05[4,58] P>0,05),
EI was the parameter considered for subsequent evaluations: it was reasoned that,
since chitin synthesis inhibitors (CSI) interfere with cuticle formation, insects become
more susceptible to physical injuries, infections and other physiological constraints
that can be directly responsible for their death, instead of the CSI itself. Similarly, the
main effect of the juvenile hormone analog methoprene, another IGR, is to disturb
development, mortality being an indirect consequence.19 It is precisely for this reason
that CSI bioassays need several days to be accomplished.
32
A direct relationship between triflumuron concentration and the precocity of its effects
was noted: the proportion of dead larvae increased in high triflumuron
concentrations, while the opposite was observed with the rate of adults (Figure 2).
The same has been previously observed for other IGR compounds.19-21
Table 1 and Figure 3 show results obtained with the exposure of mosquitoes from
two Ae. aegypti field populations to temephos or triflumuron. According to the criteria
proposed by Mazzari and Georghiou (1995),18 one population, TemR, is highly
resistant and the other, TemS, susceptible to temephos (Table 1). Triflumuron
induced a dose-dependent adult emergence inhibition effect in both populations.
However, comparison with results obtained for the insecticide susceptible strain
Rockefeller revealed no triflumuron resistance, even in the TemR population. In
opposition to temephos induced mortality, no significant difference was noted for
triflumuron EI lines shown in Figure 3 (F.05 [2,16]; P>0,05).
Chitin synthesis inhibitors are a good potential alternative against Ae. aegypti
populations resistant to conventional insecticides. We showed that two Brazilian field
populations, one of which resistant to the OP temephos, are as susceptible to the
BPU triflumuron as one insecticide-susceptible laboratory strain. Considering
triflumuron acts on chitin synthesis, this compound is not expected to be harmful to
vertebrates. Although the use of another CSI in potable water has already been
approved by WHOPES,22 when triflumuron is taken into account, toxicological assays
are still needed. We are presently evaluating the effects of sublethal triflumuron
concentrations on the development and reproduction of resulting Ae. aegypti adults.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
33
(Faperj), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) and Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes). We are grateful to
BayerCropscience for the triflumuron sample.
REFERENCES
1. Barbosa-da-Silva JJr, Siqueira JBJr, Coelho GE, Vilarinhos PT and Pimenta
FGJr, Dengue in Brazil: current situation and control activities. Epidemiol Bull
23:3-6 (2002).
2. Mondet PB, Travassos da Rosa APA and Vasconcelos PFC. Les risques
D’épidémisation urbaine de la fièvre jaune au Brésil par les vecteurs de la dengue
Aedes aegypti et Aedes albopictus. Bull Soc Path Exot 89:107-114 (1996).
3. Massad E, Coutinho FA, Burattin MN and Lopez LF. The risk of yellow fever in a
dengue-infested area. Trans R Soc Trop Med Hyg 95:370-4 (2001).
4. Franco O. História da Febre Amarela no Brasil. Rio de Janeiro: Superintendência
de Campanhas de Saúde Pública, Ministério da Saúde – Brasil (1976).
5. Teixeira MG, Barreto ML and Guerra Z. Epidemiologia e Medidas de Prevenção
do Dengue. Informe Epidemiológico do SUS 8:5-33 (1999).
6. Honório NA, Cabelo PH, Codeço CT and Lourenço-de-Oliveira R. Preliminary
data on the performance of Aedes aegypti and Aedes albopictus immatures
developing in water-filled tires in Rio de Janeiro. Mem Inst Oswaldo Cruz 101:
225-228 (2006).
7. SVS. Secretaria de Vigilância em Saúde – Dados e indicadores selecionados.
Coordenação: Departamento de Análise de Situação de Saúde (2003).
8. Macoris MLG, Andrighetti MTM, Takaku L, Glasser CM, Garbeloto VC and Cirino
VCB. Alteration in susceptibility response of Aedes aegypti to organophosphates
in cities in the state of S. Paulo, Brazil. Rev Saúde Púb 33:521-522 (1999).
34
9. Lima JBP, Pereira da Cunha M, Silva JRC, Galardo AKR, Soares SS, Braga IA,
Ramos RP and Valle D. Aedes aegypti resistance to organophosphates in several
localities in Rio de Janeiro and Espírito Santo, Brazil. Am J Trop Med Hyg 68:329-
333 (2003).
10. Braga IA, Lima JBP, Cunha SP, Soares SS, Melo RCGM and Valle D. Aedes
aegypti resistance to temephos during 2001 in several municipalities in Rio de
Janeiro, Sergipe and Alagoas States, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 99:199-203
(2004).
11. Funasa. Reunião Técnica para discutir status de resistência de Aedes aegypti e
definir estratégias a serem implantadas para monitoramento da resistência no
Brasil. Brasília: Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde (1999).
12. Lima JBP, Melo NV and Valle D. Residual effect of two Bacillus thuringiensis var.
israelensis products assayed against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in
laboratory and outdoors at Rio de Janeiro, Brazil. Rev Inst Med Trop SP 47:125-
130 (2005).
13. Lima JBP, Melo NV and Valle D. Persistence of Vectobac WDG and Metoprag S-
2G against Aedes aegypti larvae using a semi-field bioassay in Rio de Janeiro,
Brazil. Rev Inst Med Trop SP 47:7-12 (2005).
14. Graf JF. The role of insect growth regulators in arthropod control. Parasitol Today
9:471-474 (1993).
15. Tunaz, H. and Uygun, N. Insect growth regulators for insect pest control. Turk J
Agric For 28:377-387 (2004).
16. Mondal KAMSH and Parween S. Insect growth regulators and their potential in
the management of stored-product insect pests. Int Pest Man Rev 5:255-295
(2000).
35
17. Raymond M. Presentation d’une programme d’analyse logprobit pour
microordinateur cahiers Orstrom. Sér Ent Med Parasitol 22: 117-121(1985).
18. Mazzari MB and Georghiou GP. Characterization of resistance to
organophosphate, carbamate, and pyrethroid insecticides in field populations of
Aedes aegypti from Venezuela. J Am Mosq Control Assoc 11:315-322 (1995).
19. Braga IA, Mello CB, Peixoto AA and Valle D. Evaluation of methoprene effect on
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) development in laboratory conditions. Mem
Inst Oswaldo Cruz 100:435- 440 (2005).
20. Mulla MS, Thavara U, Tawatsin A, Chompoosri J, Zaim, M and Su T. Laboratory
and field evaluation of novaluron, a new acylurea insect growth regulator, against
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Vec Ecol 28:241-254 (2003).
21. Su T, Mulla MS and Zaim M. Laboratory and field evaluations of novaluron, a nem
insect growth regulator (IGR), against Culex mosquitoes. J Am Mosq Control
Assoc 19:408-418 (2006).
22. OMS. Organização Mundial de Saúde. The guidelines for drinking-water quality
Working Group Meeting. Geneva (2005).
36
Legends to figures:
Figure 1. Effect of the chitin synthesis inhibitor triflumuron on the mortality and adult
emergence inhibition (EI) rates of Aedes aegypti, Rockefeller strain. The non-linear
regression curves shown were obtained after 14 days of exposure of L3 larvae.
Figure 2. Stage-specific induced mortality of Aedes aegypti exposed to different
triflumuron concentrations at the L3 larva instar.
Figure 3. Linear regression curves of Aedes aegypti (A) mortality after 24 hours
exposure to temephos or (B) adult emergence inhibition (EI) after 14 days in contact
with triflumuron.
37
Figure 1
0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
mortalityEI
µµµµg/L triflumuron
%
Figure 2:
0.0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2.0 5.0
0
20
40
60
80
100larvae
pupae
adult
µµµµg/ L triflumuron
% M
ort
alit
y
Figure 3
-4 -3 -2 -1
0
20
40
60
80
100
A
log [temephos] (µµµµg/L)
% m
ort
alit
y
-1 0 1 2
0
20
40
60
80
100
B
TemS
Rock
TemR
log [triflumuron] (µµµµg/L)
% E
I
38
Table 1. Resistance ratios to temephos and to triflumuron of Ae. aegypti F1 larvae from field populations. Comparison with results
obtained for the insecticide susceptible reference strain Rockefeller.
temephos triflumuron
ED50 RR50 ED90 RR90 slope ED50 RR50 ED90 RR90 slope
Rock 0.00139 - 0.00198 - 8.32 ± 0.39 0.864 - 1.804 - 4.01 ± 0.34
TemS 0.00581 4.2 0.00893 4.5 6.84 ± 0.27 1.142 1.3 1.882 1.0 5.91 ± 0.51
TemR 0.01522 10.9 0.02733 13.8 5.04 ± 0.25 1.588 1.8 2.304 1.3 7.92 ± 1.31
In all cases, ED50 and ED90 are expressed in µg/L.
39
3.2) artigo 2: Exposure of Aedes aegypti larvae to a chitin synthesis inhibitor sub-
lethal dose: effects on the viability and reproduction of adults
Autores: Thiago Affonso Belinato, Ademir Jesus Martins, José Bento Pereira
Lima, Tamara Nunes de Lima-Camara, Alexandre Afrânio Peixoto, Denise Valle
40
Exposure of Aedes aegypti larvae to a chitin synthesis inhibitor sub-lethal
dose: effects on the viability and reproduction of adults
Thiago Affonso Belinato, Ademir Jesus Martins, José Bento Pereira Lima, Tamara
Nunes de Lima-Camara, Alexandre Afrânio Peixoto, Denise Valle
Abstract. Control of Aedes aegypti is impaired due to development of resistance to
chemical insecticides. Insect Growth Regulators (IGR) exhibit distinct mechanisms of
action and are considered potential vector control alternatives. Studies regarding the
effects of IGR sublethal doses on the viability of resulting adults will contribute to
evaluate their impact in the field. We analyzed several aspects of Ae. aegypti adults
surviving exposure to a partially lethal dose of triflumuron, a chitin synthesis inhibitor.
A highly significant difference in the proportion of males and females was noted in
the triflumuron-exposed (65.0% males) group, compared to the controls (50.2%
males). Triflumuron affected adult longevity, in particular females: after 16 days, only
29.2% males and 13.8% females were alive, in contrast with 94% survival of control
mosquitoes. The locomotor activity was reduced and the blood feeding ability of
treated females was also affected (90.4% and 48.4% of control and triflumuron-
exposed females, respectively, successfully ingested blood). Triflumuron-surviving
females ingested roughly 30% less blood and laid 25% less eggs than control ones.
Treated males and females exhibit a diminished ability to copulate, resulting in less
viable eggs.
Key words. Triflumuron, Aedes aegypti, Sublethal effects, Chitin synthesis inhibitor.
41
Introduction
The mosquito Aedes aegypti (L), widely distributed in the tropical and subtropical
regions, is highly adapted to the urban environment. It is frequently found inside or
near the houses, and it plays an important role in the transmission of arboviroses,
such as dengue and urban yellow fever (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994;
Gubler, 2002).
Nowadays Ae. aegypti control is mainly performed with chemical larvicides that target
the insect central nervous system. However, the long historic of insecticide use has
led to the development of resistant populations all over the world. In this sense, the
study of novel tools to control Ae. aegypti and other insects of medical importance is
a major area of interest (Zaim & Guillet, 2002).
An alternative vectors control approach is the use of compounds with distinct
mechanisms of action and target sites, like the Insect Growth Regulators (IGR).
Those include the juvenile hormone analogs, the ecdysone agonists and the chitin
synthesis inhibitors (CSI) (Graf, 1993; Tunaz & Uygun, 2004).
Chitin synthesis inhibitors are benzoylphenylurea compounds discovered in the
decade of 1970 (Mian & Mula, 1982) that interfere with insect development,
disturbing the molt and resulting in deformations in the cuticle (Reynolds, 1987).
Additionally, adults deriving from CSI-exposed larvae can exhibit a series of
physiological constraints that ultimately lead to a diminished physical and
reproductive fitness (Mondal & Parween, 2000). These CSI effects vary according to
the species, developmental stage at the time of application, kind of compound and
administered dose (Wilson & Cryan, 1997; Mulla et al., 2003; Vasuki & Rajavel,
1992). Although several reports in the literature deal with CSI induced mortality or
adult emergence inhibition (Su et al., 2003; Rehini & Soltani, 1999; Batra et al.,
42
2005), CSI effects on the surviving adults and their implications in the vector fitness
are less exploited, especially when Culicidae are considered (Vasuki, 1992; Vasuki &
Rajavel, 1992; Vasuki, 1999).
Aedes aegypti is a domestic mosquito whose breeding sites, mostly water storage
recipients for human use, are subjected to frequent volume variations, resulting in
decrease of the insecticide residual effect. In this sense, detailed studies of CSI
effects of sublethal doses on the viability of resulting adults will contribute to evaluate
their impact in the field.
We confirmed the effectiveness of triflumuron against field Ae. aegypti populations,
including one strain resistant to the organophosphate temephos (Martins et al.,
2007). In the present study we evaluated the effects of exposure of Ae. aegypti
larvae to a partially lethal dose of the CSI triflumuron on the resulting adults. Several
parameters were investigated, such as the proportion of surviving males and
females, adult longevity and activity, blood feeding, mating and viability of the eggs.
Materials and methods
Mosquitoes
Mosquitoes from the Rockefeller strain, an insecticide susceptible reference lineage,
were reared according to standard procedures (Braga et al., 2005) at 25 ± 1 ºC and
80% r. h.
Bioassays
Starycide SC 0.48® (Bayer) was employed to prepare a stock solution of triflumuron
at 48 µg/mL in DMSO (dimethyl sulfoxide) and aliquots were stored at -80°C.
43
Working solutions were prepared in dechlorinated water. Transparent plastic cups
with groups of 10 L3 larvae were exposed to 150 mL of 0.7-0.9 µg/L triflumuron
solution, a concentration close to the EI50 dose (Martins et al. 2007). One milliliter of
a 2.5% (w/v) solution of grounded cat food (Friskies®, Purina, Camaquã/RS) was
supplied once. Control larvae were exposed to the same DMSO volume used in the
triflumuron samples (2 µl). Dead specimens and resulting adults were collected daily.
A total of 80 experimental and 30 control groups of ten larvae were used in each
assay. Unless stated, for each parameter evaluated three bioassays were performed.
Male/female rate
Newly emerged adults surviving from triflumuron exposure were daily removed from
the cages and numbers of males and females from both experimental and control
cages were scored.
Longevity
Triplicate pools of 15 newly adult emerged couples derived from triflumuron-exposed
or control larvae were placed in small carton cages (8.5 cm diameter X 8.5 cm high),
and fed continuously with a 10% sucrose solution. Mortality was daily registered
during 16 days.
Activity
The locomotor activity pattern of triflumuron-surviving and control Ae. aegypti
females was evaluated with a locomotor activity monitor (TriKinetics) (Gentile et al.,
2006). Two-day old mosquitoes were individually placed in glass tubes with a cotton
plug soaked in 10% sucrose solution and the tubes placed in a Locomotor Activity
44
Monitor inside a Precision Scientific Incubator Mod. 818 under a constant
temperature of 25 °C and a photoperiod of 12 hours of light and 12 hours of dark (LD
12:12). The locomotor activity was individually registered every time a mosquito
crossed the middle of the tube, interrupting an incident infrared light. For every
mosquito, 48 data points representing the total locomotor activity of 30 minutes
intervals were obtained for every day of monitoring. This experiment was performed
twice. Only data from mosquitoes that were alive for the first two days of monitoring
were considered for analysis, performed through calculation of the Williams mean of
their activity.
Blood feeding
Three-day old adult females were exposed to an anesthetized guinea pig during 30
minutes. The number of blood-fed females was counted in both triflumuron-exposed
and control groups.
In order to quantify the amount of ingested blood, groups of 10 experimental or
control mosquitoes were weighed before or after the blood meal in an analytic
balance (APX-200, Denver Instrument). The amount of ingested blood was
calculated by subtraction of these values.
Egglaying
Egglaying was induced in individual females three days after the blood meal,
according to the procedure adapted from Valencia et al. (1996), in inverted Petri
dishes with a wet filter paper at the bottom, at 26°C. The number of egglaying
females, eggs per female and the viability of the eggs were investigated.
45
Rate of inseminated females
Individual couples formed by triflumuron-surviving females and control males or,
reciprocally, by triflumuron surviving-males and control females, were placed in 50
mL transparent plastic tubes. Males and females were obtained from pupae reared
individually, in order to assure that virgin females would be used. After three days,
female spermathecae were dissected and sperm presence was observed with an
optic microscope (Nikon Biophot; 200x). Negative and positive controls consisted of
triflumuron-survivors or control adults, respectively.
Results
Several bioassays were performed to accomplish the analysis here shown. From a
total of 12,000 experimental specimens exposed to triflumuron, 43.6% of adult
emergence was obtained. Delay in larvae development was not noted in the
experimental group, when compared to controls: in both cases adult emergence took
5-7 days after onset of the assays.
Male/female rate
In the control group equivalent rates of males (50.2 ± 4.1%) and females were
obtained, while males accounted for 65.0 ± 7.6% of triflumuron-surviving adults, a
highly significant difference between both sexes (ANOVA, p<0,005). This
represented a male/female proportion of 1.01 and 1.86 in control and experimental
groups, respectively.
46
Longevity
Figure 1 shows daily mortality of males and females from control and experimental
groups up to 16 days after adult emergence. In opposition to the control group, with
total mortality below 6% of both males and females during this period, triflumuron
survivors exhibited a reduced longevity. Moreover, females were more affected than
males: after 16 days the rate of surviving males (29.2%) was twice that of females
(13.8%).
Activity
Aedes aegypti adults showed diurnal habits, with peaks of activity in the beginning
and in the end of the photophase. Their pattern of activity was not altered by
triflumuron exposure. However, the intensity of activity was reduced, as exemplified
in Figure 2.
Blood feeding
The ability to ingest blood as well as the feeding rate were significantly altered in CSI
surviving females: while 90.4% (85/94) control females accepted the blood meal, this
rate decreased to 48.4% (77/159) in triflumuron exposed ones (χ20.05, 1; p<0.005).
Moreover, control and triflumuron surviving females ingested, respectively, 2.57 ±
0.42 and 1.79 ± 0.17 times their weigh in blood, also a significant difference (tS test;
p<0.05). In spite of this, the weigh of control (7.37 ± 0.66 µg) and triflumuron
surviving (7.71 ± 1.02 µg) females after adult emergence is equivalent (tS test;
p>0.05).
47
Egglaying
Table 1 summarizes oviposition data of control and triflumuron-exposed females.
Approximately 10% of experimental blood-fed females died up to 24 hours after
blood feeding; even higher mortality (35%) was observed after egglaying. The
number of eggs per female was also significantly different in both groups (t test;
p<0.001).
Among the triflumuron-surviving females that accomplished oviposition, 14.4%
presented eggs that broke when immersed in water (Figure 3). Spermathecae
dissection revealed these females had not been inseminated. On the other hand, no
significant difference was noted in the viability of eggs derived from triflumuron-
treated females that had effectively been inseminated (96.3 ± 10.2%) compared to
control ones (97.5 ± 7.5%).
Matings
In order to verify if triflumuron preferentially interferes with the reproductive ability of
one sex, individual matings with one control partner and one triflumuron survivor
were performed. Although 75 couples have been done for each condition, at the end
of three days one or both specimens of several couples had died (Table 2). When
surviving couples were taken into account, a reduction in the rate of inseminated
females was noted in all groups bearing at least one triflumuron-treated mate (Table
2). Chi-square analysis revealed difference between the non treated control and all
the experimental groups containing triflumuron survivors (p<0.05). On the other hand,
no significant differences among these later groups were found (p>0.05).
48
Discussion
Our data indicate that exposure of Ae. aegypti larvae to sublethal doses of the CSI
triflumuron results in mosquito adults affected in several aspects of their viability and
reproductive ability.
Disequilibrium in the proportion between males and females derived from treatment
with the triflumuron EI50 was observed. The smaller proportion of females was
attributed to their slower development kinetics when compared to males (Clements,
1992). As a consequence females would be exposed to the CSI for a longer period of
time in the larval stage. Exposure of the Coleoptera Tribolium confusum to
triflumuron also resulted in a greater proportion of males (3:1) (El-Sayed et al., 1984).
Adult longevity was highly reduced in triflumuron treated specimens. Females were
more severely affected than males, probably due to their longer period of contact with
the CSI during the larval stage, as mentioned above. Tenebrio molitor exposed to the
CSI diflubenzuron also exhibit reduced longevity (Soltani et al., 1983). Although a
drastic reduction in the longevity of Culex quinquefasciatus, Anopheles stephensi
and Ae. aegypti adults derived from treatment with the EI50 of the CSI hexaflumuron
has been reported (Vasuki, 1992), no differences in longevity between both sexes
were noted in these cases.
Triflumuron also reduced Ae. aegypti activity. Many triflumuron surviving adults had
structural abnormalities, such as deformed wings or easily broken legs, which could
account for this reduced activity. There are reports of structural defects produced by
treatment with CSI in several insect orders (Demark & Bennet, 1989; Wilson &
Cryan, 1997; Da-Silva et al., 2004). Vasuki & Rajavel (1992) observed that treatment
of the mosquitoes Cx. quinquefasciatus, Ae. aegypti and An. stephensi with a CSI
resulted in several visible abnormalities that could hamper locomotion and that were
49
probably related to the reduced longevity of adults. Accordingly, Amir & Peveling
(2004) verified that triflumuron-exposed Apis mellifera specimens exhibited a lower
flight activity.
Triflumuron treatment interfered with the blood feeding ability of surviving females:
both the number of blood-fed females and the amount of ingested blood were
reduced in triflumuron-treated individuals. The same was reported by Vasuki (1999)
with other Culicidae species after treatment with the CSI hexaflumuron. In opposition
to this author, we observed mortality after egglaying in a high proportion of females,
probably due to their greater weakness.
Since blood feeding is a requisite to the production of eggs in hematophagous
insects, it was expected that oviposition of triflumuron-surviving females was
reduced. This was effectively the case: triflumuron-treated females laid roughly 25%
less eggs than control ones, a rate compatible with the 30% reduction in the amount
of blood ingested by this group when compared to the control. Reduction in the
oviposition of CSI-treated females of different insect orders has already been
reported (Miura et al., 1976; Wilson & Cryan, 1997; Sáenz-de-Cabezón et al., 2006).
However, Arias and Mulla (1975) did not detect any significant difference in the
amount of eggs laid by Culex tarsalis females treated with diflubenzuron, another
CSI. The number of eggs laid by methoprene-surviving Ae. aegypti females was also
equivalent to the control group.
A significative proportion of the eggs laid by triflumuron surviving females cracked
when immersed in water, and the remaining ones shrink (figure 3). Observation of
spermathecae confirmed the corresponding females had not been inseminated. We
asked if reduction of copula rates was due to preferential interference of triflumuron
50
with males or females, or if both sexes were affected. Crosses between control and
triflumuron-surviving adults revealed CSI interferes with both sexes.
Our results indicate that CSIs are a viable alternative to the control of Ae. aegypti.
Beyond its effectiveness against larvae (Martins et al. 2007), surviving adults exhibit
a series of physiological constraints that reduce their longevity and reproductive
ability. Hence, CSI survivors are expected to have a reduced vectorial capacity,
being less competent in the transmission of pathogens. Furthermore, the current
need of environmentally safer technologies requires the development of insecticides
with more selective target sites and with a reduced risk level to non-target organisms.
It was already verified that some CSI compounds have little or no effect on
mammals, birds and aquatic invertebrates (Mian & Mulla, 1982). Ecotoxicity studies
with triflumuron are a requisite towards its utilization against insect vectors of medical
importance.
Acknowledgements
We thank Diego de Lacerda Rosa, Nathalia Giglio Fontoura and Diogo Fernandes
Bellinato for technical assistance. This work was supported by Fundação Oswaldo
Cruz – FIOCRUZ, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CNPq and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro –
FAPERJ. We are grateful to BayerCropscience for the triflumuron sample.
References
Amir, O.G. & Peveling, R. (2004) Effect of triflumuron on brood development and
colony survival of free-flying honeybee, Apis mellifera L. Journal of Applied
Entomology, 128, 242-249.
51
Arias, J.R. & Mulla, M.S. (1975) Postemergence effects of two insect growth
regulators on the mosquito Culex tarsalis (Diptera: Culicidae). Journal of Medical
Entomology, 12, 317-322.
Batra, C.P., Mittal, P.K., Adak, T. & Ansari, M.A. (2005) Efficacy of IGR compound
Starycide 480 SC (triflumuron) against mosquito larvae in clear and polluted water. J
Vect Borne Dis, 42:109-116
Braga, I.A., Mello, C.B., Peixoto, A.A. & Valle, D. (2005) Evaluation of methoprene
effect on Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) development in laboratory conditions.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 100, 435- 440.
Clements, A.N. (1992) The Biology of Mosquitoes. Chapman & Hall, London.
Consoli, R. & Lourenço-de-Oliveira, R. (1994) Principais mosquitos de importância
sanitária no Brasil. Fiocruz, Rio de Janeiro.
Da-Silva, J.J., Mendes, J. & Lomônaco, C. (2004) Developmental stress by
diflubenzuron in Haematobia irritans (L.) (Diptera: Muscidae). Neotropical
Entomology, 33, 249-253.
Demark, J.J. & Bennet, G.W. (1989) Efficacy of chitin synthesis inhibitors on nymphal
german cockroaches (Dictyoptera: Blattelidae). Journal of Economic Entomology, 82,
1633-1637.
El-Sayed, F.M.A., Razik, M.A. & Kandil, M.A. (1984) Biological activity of the insect
growth regulator triflumuron against Tribolium confusun (Duv.). Bulletin of the
Entomological Society of Egypt, Economic Series, 14, 171-176.
Gentile, C., Meireles-Filho, A.C.A., Britto, C., Lima, J.B.P., Valle, D Peixoto, A.A.
(2006) Cloning and daily expression of the timeless gene in Aedes aegypti
(Diptera:Culicidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology, 36, 878-884.
52
Graf, J.F. (1993) The role of insect growth regulators in arthropod control.
Parasitology Today, 9, 471-474.
Gubler, D.J. (2002) Epidemic dengue/ dengue hemorrhagic fever as a public health,
social and economic problem in the 21st century. Trends in Microbiology, 10, 100-
103.
Martins, A.J., Belinato, T.A., Lima, J.B.P. & Valle, D. (2007) Effect of a chitin
synthesis inhibitor on Aedes aegypti populations susceptible and resistant to the
organophosphate temephos. Submitted.
Mian, L.S. & Mulla, M.S. (1982) Biological and environmental dynamics of insect
growth regulators (IGRs) as used against Diptera of public health importance.
Residue Reviews, 84, 27-112.
Miura, T., Schaefer, C.H., Takahashi, R.M. & Mulligan, F.S. (1976) Effects of the
insect growth inhibitor, Dimilin, on hatching of mosquito eggs. Journal of Economic
Entomology, 69, 655-658.
Mondal, K.A.M.S.H. & Parween, S. (2000) Insect growth regulators and their
potential in the management of stored-product insect pests. Integrated Pest
Management Reviews, 5, 255-295.
Mulla, M.S., Thavara, U., Tawatsin, A., Chompoosri, J., Zaim, M. & Su, T. (2003)
Laboratory and field evaluation of novaluron, a new acylurea insect growth regulator,
against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology, 28, 241-254.
Rehimi, N. & Soltani, N. (1999) Laboratory evaluation of Alsystin, a chitin synthesis
inhibitor, against Culex pipiens pipiens L. (Dip., Culicidae): effects on development
and cuticle secretion. Journal of Applied Entomology, 123, 437-441.
Reynolds, S.E. (1987) The cuticle, growth and moulting in insects: the essential
background to the action of acylurea insecticides. Pesticide Science, 20, 131-146.
53
Sáenz-de-Cabezón, F.J., Pérez-Moreno, I., Zalom, F.G. & Marco, V. (2006) Effects
of lufenorun on Lobesia botrana (Lepidoptera: Tortricidae) egg, larval, and adult
stages. Journal of Economic Entomology, 99(2), 427-431.
Soltani, N., Delbecque, J.P. & Delachambre, J. (1983) Penetration and insecticidal
activity of diflubenzuron in Tenebrio molitor pupae. Pesticide Science, 14, 625-632.
Su, T., Mulla, M.S. & Zaim, M. (2003) Laboratory and field evaluations of novaluron,
a new insect growth regulator (IGR), against Culex mosquitoes. Journal of the
Americam Mosquito Control Association, 19, 408-418.
Tunaz, H. & Uygun, N. (2004) Insect growth regulators for insect pest control. Turkish
Journal of Agriculture and Forestry, 28, 377-387.
Valencia, M.D.P., Miller, L.H. & Mazur, P. (1996) Permeability of intact and
dechorionated eggs of the Anopheles mosquito to water vapor and liquid water: A
comparison with Drosophila. Cryobiology, 33, 142-148.
Vasuki, V. & Rajavel, R. (1992) Influence of short time exposure to an insect growth
regulator, hexaflumuron, on mortality and adult emergence of vector mosquitoes.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 87, 275-283.
Vasuki, V. (1992) Adult longevity of certain mosquito species after larval and pupal
exposure to sublethal concentration of an insect growth regulator hexaflumuron.
Southeast Asian Tropical Medicine Public Health, 23, 121-124.
Vasuki, V. (1999) Influence of IGR treatment on oviposition of three species of vector
mosquitoes at sublethal concentrations. Southeast Asian Tropical Medicine Public
Health, 30, 200-203.
Wilson, T.G. & Cryan, J.R. (1997) Lufenuron, a chitin-synthesis inhibitor, interrupts
development of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Zoology, 278,
37-44.
54
Zaim, M. & Guillet, P. (2002) Alternative insecticides: an urgent need. Trends in
Parasitology, 18, 161-163.
55
Legends to figures
Figure 1: daily mortality of control (circles) and triflumuron-surviving (squares) Ae.
aegypti adults. Opened and closed symbols refer to females and males, respectively.
Figure 2: Aedes aegypti females activity rhythm during four days under a 12:12 light
/ dark (gray bars) regimen. Solid and dashed lines represent control and triflumuron-
surviving females, respectively.
Figure 3: Eggs laid by Ae. aegypti triflumuron-surviving females. Broken eggs derive
from unfertilized specimens.
56
Figure 1
Figure 2
Atividade dos mosquitos
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Tempo (dias)
Méd
ia d
a at
ivid
ade
(Wx)
♀ controle
♀ triflumuron
1 2 3 4
mea
nac
tivity
(WX)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
80
100
days after adult emergence
% m
ort
alit
y
time (days)
♀ control ♀ triflumuron
57
Figure 3
58
Table 1. Oviposition of Aedes aegypti triflumuron-surviving adult females.
Group n Mortality after
blood meal
Females
without eggs
Mortality after
egglaying
Mean
eggs/females
Control 100 1 6 1 112.9 ± 41.1
triflumuron 139 14 14 44 86.4 ± 44.0
n, total of specimens tested.
Except for the last column, all data refer to the number of adult females.
Table 2. Rate of inseminated females resulting from individual matings between
control and triflumuron-surviving Ae. aegypti adults.
Group (*) Surviving couples (**)
n (%)
Inseminated females
n (%) (***)
♂cont x ♀cont 75 (100) 74 (99)a
♂cont x ♀ trif 45 (60) 15 (33)b
♂ trif x ♀cont 66 (88) 22 (33)b
♂ trif x ♀ trif 44 (59) 8 (18)b
(*) cont: control; trif: adult surviving from triflumuron exposure, performed in the larval
stage.
(**) 75 individual couples were made for each experimental condition.
(***) values followed by the same letter do not differ significantly.
59
3.3) artigo 3: Avaliação do efeito de triflumuron sobre Aedes albopictus, Culex
quinquefasciatus e populações de campo de Aedes aegypti em condições de
laboratório
Autores: Thiago Affonso Belinato, Ademir Jesus Martins, José Bento Pereira
Lima, Denise Valle
60
Efeito de um inibidor de síntese de quitina sobre Aedes albopictus, Culex
quinquefasciatus e populações de campo de Aedes aegypti em condições de
laboratório
Autores: Thiago Affonso Belinato, Ademir Jesus Martins, José Bento Pereira Lima,
Denise Valle
Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores – Departamento de
Entomologia – Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Abstract
A resistência aos inseticidas tradicionais dificulta o controle de vetores de
importância médica. Os reguladores do desenvolvimento de insetos (IGR), cujo
mecanismo de ação difere dos inseticidas clássicos, são uma alternativa viável ao
controle de populações de culicídeos vetores, incluindo aquelas onde tem sido
verificado o desenvolvimento da resistência. Entre os IGRs estão os inibidores da
síntese de quitina (CSIs), compostos promissores que interferem com o processo de
muda. No presente estudo verificou-se que o CSI triflumuron é eficaz na inibição da
emergência de adultos de Culex quinquefasciatus (IE50 e IE90, respectivamente, de
5,28 µg/L e 12,47 µg/L) e de Aedes albopictus (IE50 e IE90 de 1,59 µg/L e 2,63 µg/L).
Triflumuron também foi eficaz contra amostras de sete populações brasileiras de
Aedes aegypti resistentes ao organofosforado temephos, ao piretróide deltametrina,
ou a ambos. Nestas populações não houve emergência de adultos viáveis após
exposição à IE99 de triflumuron para a cepa referência Rockefeller, sugerindo
ausência de resistência cruzada. No entanto, foi observada correlação positiva entre
a resistência a temephos e tolerância a triflumuron. Os resultados sugerem que
triflumuron pode representar uma importante ferramenta para o controle de vetores
de doenças em Saúde Pública, embora apontem para a necessidade de
monitoramento constante do status de susceptibilidade das populações do vetor.
Key words: triflumuron - chitin synthesis inhibitors - Aedes albopictus - Culex
quinquefasciatus - Aedes aegypti
61
Introdução
O controle de mosquitos vetores de doenças tem sido dificultado em
decorrência principalmente do desenvolvimento de resistência aos inseticidas
tradicionais comumente utilizados (Bracco et al. 1999, Lima et al. 2003, Braga et al.
2004, Liu et al. 2004), assim como de problemas ao meio ambiente relacionados ao
uso indiscriminado dessas substâncias (Zaim & Guillet 2002). Os reguladores do
desenvolvimento dos insetos (IGRs), com mecanismo de ação distinto e mais
seletivos quando em comparação com os inseticidas convencionais e, em
conseqüência, mais seguros para a maioria dos organismos não-alvo, são
considerados uma alternativa promissora (Mian e Mulla 1982, Graf 1993). Embora a
ação de muitos IGRs tenha sido testada contra uma variedade de insetos, um
número limitado destes compostos foi avaliado em culicídeos vetores (Estrada &
Mulla 1986, Su et al. 2003, Seng et al. 2006).
Os inibidores da síntese de quitina (CSI, do inglês chitin synthesis
inhibitors) são IGRs que interferem com o processo de muda nos insetos. Os CSIs
pertencem à família das benzo-fenil-uréias (BPUs), grupo químico que tem sido
extensivamente estudado desde sua descoberta na década de 1970 (Mian & Mula
1982). De modo geral, a ação dos CSIs resulta em mal-formações da nova cutícula
em desenvolvimento prejudicando principalmente as larvas, que geralmente tornam-
se incapazes de sobreviver à próxima muda (Reynolds 1987, Tunaz & Uygun 2004).
Existem ainda relatos de sua eficiência sobre ovos (Wilson & Cryan 1997) e adultos
(Belinato et al. 2007, Vasuki 1992a,b, 1999).
Aedes aegypti, Aedes albopictus e Culex quinquefasciatus são três
espécies de culicídeos amplamente difundidos pelo globo, distribuídos
preferencialmente nas regiões tropicais e subtropicais (Juliano & Lounibos 2005). A
presença destas espécies é considerada preocupante, já que participam da
transmissão de doenças ao homem, como a dengue e filariose linfática (Ottesen &
Ramachandran 1995, Gubler 2002). Além disso, existe possibilidade da participação
das três espécies na transmissão de doenças emergentes e re-emergentes, como o
vírus do oeste do Nilo e a febre amarela, respectivamente. Estes aspectos apontam
para a necessidade de controle efetivo e racional, uma vez que muitas populações
se encontram resistentes aos principais inseticidas utilizados em Saúde Pública.
62
O CSI triflumuron, que tem sido usado no controle de diversos artrópodes,
mostrou ser eficiente contra Aedes aegypti (Martins et al. 2007); em doses subletais
interfere com vários aspectos da viabilidade dos adultos resultantes (Belinato et al.
2007). No presente estudo, o efeito de diferentes doses de triflumuron sobre o
desenvolvimento de Culex quinquefasciatus e Aedes albopictus foi avaliado.
Populações brasileiras de Ae. aegypti com diferentes níveis de resistência a
piretróides (PI) e organofosforados (OP) também foram expostas a este CSI, que
parece ser uma alternativa viável de controle.
Material e métodos
Mosquitos
As cepas de Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus utilizadas, ambas
provenientes da cidade do Rio de Janeiro, são mantidas em laboratório há,
respectivamente cinco e 13 anos.
Foram utilizadas amostras de sete populações brasileiras de Ae. aegypti,
cuja resistência é monitorada rotineiramente, no âmbito do Programa Nacional de
Controle da Dengue. Estas populações do vetor foram escolhidas de acordo com
sua localização geográfica e os níveis de resistência aos inseticidas temephos
(organofosforado) e deltametrina (piretróide) (tabela 1), utilizados no país no controle
de larvas e adultos de Ae. aegypti, respectivamente (Valle 2006, Valle et al. 2006).
Em todos os casos a geração F2 foi utilizada para os ensaios com triflumuron, com
exceção de Maceió (AL) cujos testes foram feitos com a geração F3. Como controle,
foi utilizada a cepa Rockefeller, referência internacional de susceptibilidade a
inseticidas.
Criação das larvas
A criação de larvas de Ae. aegypti (cepa Rockefeller), Ae. albopictus e Cx.
quinquefasciatus foi feita a 25 ± 1°C. No caso de ovos de Aedes a eclosão foi
induzida por 1 h. As larvas foram transferidas para bacias de plástico transparente
(33 X 24 X 8 cm) contendo um litro de água desclorada e ração para gatos
(Friskies®, Purina, Camaquã/RS). As larvas foram utilizadas para os ensaios
aproximadamente três dias depois, ao atingirem o terceiro estádio, tamanho
recomendado pela WHO (WHO 1981).
63
Bioensaios com Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus
Starycide SC 0.48® (Bayer) possui 0.48% de triflumuron em emulsão.
Alíquotas de triflumuron a 4,8 x 10-3% em DMSO (dimethyl sulfoxide) estocadas a -
80ºC foram usadas para preparar as soluções de uso. Para cada condição foram
usadas oito réplicas, cada qual contendo 10 larvas de terceiro estádio em copos
plásticos transparentes, com 150mL de solução. As concentrações variaram de 0,25
µg/L até 4,5 µg/L para Ae. albopictus e de 2,5 µg/L a 50 µg/L para Cx.
quinquefasciatus. Larvas mantidas sob as mesmas condições, em água e com 2µL
de DMSO, foram usadas como controle. Em cada copo foi adicionado, no primeiro
dia, 1mL de uma solução a 2,5% (p/v) de ração. A mortalidade de cada estágio foi
verificada diariamente. Cada bioensaio foi repetido no mínimo três vezes. As doses
efetivas que inibem em 50% e 90% a emergência de adultos foram calculadas por
análise Probit com o auxílio do software Polo PC (Raymond 1985).
Bioensaios com populações de campo de Ae. aegypti
Para avaliar a susceptibilidade das populações de campo ao triflumuron,
foram realizados bioensaios com a dose que inibe a emergência de adultos da cepa
susceptível Rockefeller em 99% (IE99) (Martins et al. 2007) e o dobro desta
concentração. Esta última condição equivale, nos ensaios com larvas, à dose-
diagnóstica (DD) (WHO 1981).
As mesmas condições experimentais descritas no item anterior foram
empregadas, com oito réplicas por condição experimental. A IE99 e a DD de
triflumuron usadas foram 3,95 µg/L e 7,9 µg/L, respectivamente.
Resultados
Efeito de triflumuron sobre Ae. albopictus
Triflumuron apresentou efeito dose-dependente sobre a inibição de
emergência de Ae. albopictus (figura 1A). As doses efetivas que inibiram a
emergência em 50% e 90% (IE50 e IE90) foram respectivamente 1,59 µg/L e 2,63
µg/L. A partir de 3,0 µg/L não houve mais emergência de adultos viáveis. A
mortalidade no grupo controle foi baixa, nunca alcançando 4%.
64
A figura 1B representa a mortalidade de Ae. albopictus em cada estágio e
indica que a precocidade dos efeitos deste CSI é diretamente proporcional à dose
administrada: quanto maior a dose, maior foi a proporção da mortalidade no estágio
larvar; a mortalidade no estágio de pupa ocorreu principalmente nas concentrações
intermediárias, entre 1,25 µg/L e 3,5 µg/L. Por outro lado, a mortalidade dos adultos
recém-emergidos ocorreu principalmente em doses menores, até 3,0 µg/L.
Efeito de triflumuron sobre Cx. quinquefasciatus
A exemplo de Ae. albopictus, o efeito de triflumuron sobre Cx.
quinquefasciatus também foi dose-dependente (figura 2A). As IE50 e IE90 de
triflumuron para esta espécie foram, respectivamente, 5,28 µg/L e 12,47 µg/L. A
partir de 15,0 µg/L não houve emergência de adultos viáveis. A mortalidade média
no grupo controle foi de 4,7%.
A mortalidade por estágio obedeceu ao mesmo padrão de Ae. albopictus
(figura 2B): a mortalidade das larvas foi diretamente proporcional à dose utilizada,
enquanto a mortalidade nos estágios de pupa e de adulto foi maior nas doses
intermediárias (entre 5,0 µg/L e 20,0 µg/L) e nas doses menores (até 15,0 µg/L),
respectivamente.
Efeito de triflumuron em populações de campo de Ae. aegypti
Triflumuron foi eficiente contra todas as populações de campo avaliadas,
incluindo aquelas resistentes a temephos (OP) e deltametrina (PI). A mortalidade
nos grupos controle foi extremamente reduzida, menor que 3%, em todos os casos,
incluindo a cepa referência Rockefeller. Entre o sétimo e o décimo dias após o início
dos experimentos, todo o controle já havia emergido em adultos viáveis. Neste
mesmo período, em todos os grupos expostos a triflumuron, entre 86,3 e 99,2% das
larvas estavam mortas, tanto na IE99 como na DD. Não houve emergência de
adultos viáveis em nenhuma das populações expostas a este CSI (Tabela 1). Apesar
disso, nas duas concentrações utilizadas, uma pequena taxa de larvas permanecia
viva durante um longo período de tempo. Em função disto, a mortalidade total
observada com a IE99 variou entre 18 (cepa Rockefeller) e 24 (Montes Claros/MG)
dias após o início do experimento. Com a DD, a mortalidade total variou entre os
dias 17 e 52, em Maceió e Montes Claros, respectivamente.
65
As figuras 3A e 3B mostram a mortalidade por estágio em todas as
populações expostas à IE99 e à DD, respectivamente. Como esperado, a mortalidade
no estágio de larva foi maior após exposição à DD, quando comparada com a IE99. A
mortalidade de pupas do município de Aracaju/SE diferiu significativamente de todas
as outras populações (ANOVA; p<0.05). Também foram observadas, para as duas
doses de triflumuron testadas, diferenças significativas na mortalidade de pupas
oriundas dos municípios de Maceió/AL e Montes Claros/MG em relação à cepa-
referência, Rockefeller (ANOVA; p<0.05). A mortalidade de pupas de Cuiabá/MT
também diferiu de Rockefeller quando a DD foi utilizada. Todas estas populações,
com exceção de Cuiabá/MT, apresentam alta resistência a temephos, como mostra
a Tabela 1 (RR95 > 10.0). Houve correlação positiva entre a resistência a temephos e
tolerância a triflumuron (r2=0,7293; p<0,05). A mesma correlação não foi observada
em relação à resistência ao piretróide deltametrina, usado no combate a adultos no
Brasil.
Discussão
Triflumuron, em condições de laboratório, foi bastante eficiente contra
larvas de Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus em concentrações da ordem de
µg/L, provocando inibição dose-dependente da emergência de adultos nas duas
espécies. Efeito dose-dependente sobre mosquitos foi também observado para
outras classes de IGRs (Boudjelida et al. 2005, Braga et al. 2005). Verificou-se que,
quanto maior a dose de triflumuron, mais precoce a mortalidade. Este padrão de
mortalidade estágio-específica também foi observado para Ae. aegypti e Cx.
quinquefasciatus expostos ao CSI novaluron (Mulla et al. 2003, Su et al. 2003).
As IE50 e IE90 encontradas para triflumuron contra Cx. quinquefasciatus
foram 3,3 e 4,7 vezes maiores que as de Ae. albopictus. Esta última espécie, por
sua vez, apresentou doses efetivas em torno de 1,5 – 1,8 vezes maiores que Ae.
aegypti (IE50 e IE90 de 0,86 µg/L e 1,8 µg/L, respectivamente) (Martins et al. 2007).
Não temos conhecimento de registro na literatura de avaliação do efeito de
triflumuron sobre Ae. albopictus em condições de laboratório. Com relação a Cx.
quinquefasciatus, nossos resultados diferem ligeiramente de outros autores, que
relataram IE50 e IE90 de 2,0 e 7,0 µg/L respectivamente, após exposição a este CSI
(Mulla & Darwazeh 1979, Mulla 1995). Variações nas doses efetivas de IGRs entre
66
diferentes laboratórios são bastante comuns na literatura e derivam, em parte, da
utilização de protocolos distintos, como discutido por Braga et al. (2005).
Variações nas doses efetivas de diferentes CSIs também são relatadas.
Diflubenzuron, o primeiro inibidor da síntese de quitina disponibilizado
comercialmente, é usado no controle de diversas espécies de insetos,
principalmente no combate a pragas agrícolas (Mian & Mulla 1982). Concentrações
de 0,3 µg/L e 0,5 µg/L deste composto induziram 50% de mortalidade em larvas de
Culiseta incidens e Cx. quinquefasciatus, respectivamente (Mulla & Darwazeh 1979).
Contra Ae. albopictus, Ali et al. (1995) verificaram que as IE50 e IE90 de diflubenzuron
eram respectivamente, 0,45 µg/L e 0,84 µg/L. Hexaflumuron, outro CSI, também foi
eficaz contra Ae. albopictus, com IE50 de 0,2 µg/L (Montada et al. 1994). Novaluron,
outro IGR promissor sob avaliação contra mosquitos de importância médica,
apresentou IE50 e IE90 para Cx. quinquefasciatus de 0,16 µg/L e 0,60 µg/L,
respectivamente (Su et al. 2003).
Apesar das doses efetivas de triflumuron serem mais altas que as de
outros IGRs, Mian & Mulla (1982) destacam a grande atividade deste CSI contra
mosquitos vetores, o que é confirmado por sua eficácia em ensaios de campo.
Sulaiman et al. (1994) verificaram que triflumuron, na concentração de 14,0 mg/L em
condições de simulado de campo, inibiu a emergência de Ae. albopictus por até 168
dias. Da mesma maneira, Batra et al. (2005) verificaram que triflumuron foi eficaz
contra Cx. quinquefasciatus e Anopheles stephensi por um período de até sete
semanas.
Triflumuron também foi eficaz contra populações oriundas do campo de
Ae. aegypti, com diferentes graus de resistência a dois inseticidas, um
organofosforado e um piretróide. Mortalidade mais acentuada em larvas nas
populações tratadas com a DD quando comparadas com a IE99 confirma que a
concentração deste CSI é diretamente proporcional à precocidade de seus efeitos,
como já havia sido demonstrado para a cepa Rockefeller (Martins et al. 2007). Não
houve, em nenhuma das concentrações de triflumuron utilizadas, emergência de
adultos viáveis das populações de campo, o que sugere ausência de resistência
cruzada entre aqueles compostos e triflumuron. Embora, em todas as populações
testadas, o estágio larvar tenha sido o principal afetado, houve correlação positiva
entre as taxas de mortalidade em pupas após exposição a triflumuron e as razões de
67
resistência para temephos. Os resultados apontam para potencial tolerância a
triflumuron em populações resistentes a este OP.
Provável tolerância ao triflumuron das populações avaliadas pode ser
função da maior atividade de enzimas relacionadas à resistência metabólica, já
detectada em uma série de populações de Ae. aegypti do Brasil (Braga et al. 2005,
Montella et al. 2007). Apesar de existirem poucos registros na literatura sobre a
resistência a IGRs, tolerância a diflubenzuron associada a Oxidases de função mista
já foi encontrada em moscas (Kotze et al. 1997). Entretanto, não existe nenhum
relato sobre resistência a IGRs associada ao aumento da atividade de enzimas
detoxificantes em mosquitos vetores.
Nos ensaios com as populações de campo uma pequena taxa de larvas
permaneceu viva por muitos dias, confirmando que a ação primária dos CSIs não é
a indução de mortalidade, e sim a interferência com o desenvolvimento.
Os resultados aqui obtidos indicam que triflumuron foi eficiente contra três
espécies de mosquitos. Além disso, este CSI foi bastante eficaz contra diversas
populações brasileiras de Ae. aegypti, algumas das quais resistentes a pelo menos
um dos principais inseticidas usados atualmente no controle desse vetor no país.
Embora triflumuron ainda não tenha sido aprovado para uso em água potável,
requisito para sua utilização nos programas de controle de Ae. aegypti, é sabido que
os IGRs em geral apresentam baixa toxicidade para os mamíferos, incluindo o
homem (Mian & Mulla, 1982). Nossos resultados sugerem que este CSI pode
representar uma opção no manejo de mosquitos vetores de importância médica em
áreas urbanas.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira pelo fornecimento da cepa de
Aedes albopictus estabelecida em seu laboratório. Esta pesquisa teve apoio
financeiro do Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde Pública
(PDTSP), Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq e Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro – FAPERJ. Agradecemos a
BayerCropscience pelo fornecimento da amostra de triflumuron e ao Julio César
Silva Ciroulo pela assistência técnica.
68
Referências
Ali A, Nayar JK, Rui-de Xue 1995. Comparative toxicity of selected larvicides and
insect growth regulators to a Florida laboratory population of Aedes albopictus. J
Am Mosq Control Assoc 36: 72-76.
Batra CP, Mittal PK, Adak T, Ansari MA 2005. Efficacy of IGR compound Starycide
480 SC (Triflumuron) against mosquito larvae in clear and polluted water. J Vect
Borne Dis 42: 109-116.
Belinato TA, Martins AJ, Lima JBP, Lima-Camara TN, Peixoto AF, Valle, D 2007.
Exposure of Aedes aegypti larvae to a chitin synthesis inhibitor sub-lethal dose:
effects on the viability and reproduction of adults. In preparation.
Boudjelida H, Bouaziz A, Soin T, Smagghe G, Soltani N 2005. Effects of ecdysone
agonist halofenozide against Culex pipiens. Pestic Biochem Physiol 83: 115-123.
Bracco JE, Barata, JMS, Marinotti O 1999. Evaluation of insecticide resistance and
biochemical mechanisms in a population of Culex quinquefasciatus (Diptera:
Culicidae) from São Paulo, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 94: 115-120.
Braga IA, Lima JBP, Cunha SP, Soares SS, Melo RCGM, Valle D 2004. Aedes
aegypti resistance to temephos during 2001 in several municipalities in Rio de
Janeiro, Sergipe and Alagoas States, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 99: 199-
203.
Braga IA, Mello CB, Peixoto AA, Valle D 2005. Evaluation of methoprene effect on
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) development in laboratory conditions. Mem
Inst Oswaldo Cruz 100: 435-440.
Da-Cunha MP, Lima JBP, Brogdon WG, Moya GE, Valle D 2005. Monitoring of
resistance to the pyrethroid cypermetrin in Brazilian Aedes aegypti (Diptera:
Culicidae) populations collected between 2001 and 2003. Mem Inst Oswaldo
Cruz 100: 441-444.
Davidson G, Zahar AR 1973. The practical implications of resistance of malaria
vectors to insecticides. Bull WHO 49: 475-483.
Estrada JG, Mulla MS 1986. Evaluation of two new insect growth regulators against
mosquitoes in the laboratory. J Am Mosq Control Assoc 2: 57-60.
Graf JF 1993. The role of insect growth regulators in arthropod control. Parasitol
Today 9: 471-474.
Gubler DJ 2002. Epidemic dengue/ dengue hemorrhagic fever as a public health,
social and economic problem in the 21st century. Tr Microbiol 10: 100-103.
69
Juliano SA, Lounibos LP 2005. Ecology of invasive mosquitoes: effects on resident
species and on human health. Ecol Letters 8: 558-574.
Kotze AC, Sales N, Barchia IM 1997. Diflubenzuron tolerance associated with
monooxygenase activity in field strain larvae of the Australian sheep blowfly
(Diptera: Calliphoridae). J Econ Entomol 90: 15- 20.
Lima JBP, da-Cunha MP, Silva-Jr RC, Galardo AKR, Soares SS, Braga IA, Ramos
RP, Valle D 2003. Aedes aegypti resistance to organophosphates in several
localities in Rio de Janeiro and Espírito Santo, Brazil. Am J Trop Med Hyg 68:
329-333.
Liu H, Cupp EW, Guo A, Liu N 2004. Insecticide resistance in Alabama and Florida
mosquito strains of Aedes albopictus. J Med Entomol 41: 946- 952.
Martins AJ, Belinato TA, Lima JBP, Valle D 2007. Effect of a chitin synthesis inhibitor
on Aedes aegypti populations susceptible and resistant to the organophosphate
temephos. Submitted.
Mazzari MB, Georghiou GP 1995. Characterization of resistance to
organophosphate, carbamate, and pyrethroid insecticides in field populations of
Aedes aegypti from Venezuela. J Am Mosq Control Assoc 11: 315-322.
Mian LS, Mulla MS 1982. Biological and environmental dynamics of insect growth
regulators (IGRs) as used against Diptera of public health importance. Res Rev
84: 27-112.
Montada D, Rajavel AR, Vasuki V 1994. Use of hexaflumuron, an insect growth
regulator in the control of Aedes albopictus (Skuse). Southeast Asian J Trop Med
Public Health 25: 374- 377.
Montella IR, Martins-Jr AJ, Viana-Medeiros PF, Lima JBP, Braga IA, Valle D 2007.
Insecticide resistance mechanisms of Brazilian Aedes aegypti populations from
2001 to 2004. Am J Trop Med Hyg. In press.
Mulla MS 1995. The future of insect growth regulators in vector control. J Am Mosq
Control Assoc 11: 269-273.
Mulla MS, Darwazeh HA 1979. New insect growth regulators against flood and
stagnant water mosquito – Effects on non target organisms. Mosq News 39: 746.
Mulla MS, Thavara U, Tawatsin A, Chompoosri J, Zaim M, Su T 2003. Laboratory
and field evaluation of novaluron, a new acylurea insect growth regulator, against
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Vec Ecol 28: 241-254.
70
Ottesen EA, Ramachandran CP 1995. Lymphatic filariasis infection and disease:
control strategies. Parasitol today 11: 129-131.
Raymond M 1985. Presentation d’une programme d’analyse logprobit pour
microordinateur cahiers Orstrom. Sér Ent Med Parasitol 22: 117-121.
Reynolds SE 1987. The cuticle, growth and moulting in insects: the essential
background to the action of acylurea insecticides. Pest Science 20: 131-146.
Seng CM, Setha T, Chanta N, Socheat D, Guillet P, Nathan MB 2006. Inhibition of
adult emergence of Aedes aegypti in simulated domestic water-storage
containers by using a controlled-release formulation of pyriproxyfen. J Am Mosq
Control Assoc 22: 152-154.
Su T, Mulla MS, Zaim M 2003. Laboratory and field evaluations of novaluron, a new
insect growth regulator (IGR), against Culex mosquitoes. J Am Mosq Control
Assoc 19: 408-418.
Sulaiman S, Jeffery J, Sohadi RA 1994. Residual efficacy of triflumuron against the
dengue vector, Aedes albopictus (Skuse). Bull Soc Vector Ecol 19: 111-114.
Tunaz H, Uygun N 2004. Insect growth regulators for insect pest control. Turk J Agric
For 28: 377-387.
Valle D 2006. Monitoramento e determinação dos mecanismos bioquímicos
envolvidos com a resistência de Aedes aegypti aos inseticidas químicos usados
nos programas de controle do vetor. Relatório apresentado à Secretaria de
Vigilância em Saúde / Ministério da Saúde - Brasil e Organização Pan-Americana
de Saúde.
Valle D, Lima JBP, Montella IR, Viana-Medeiros PF, Santos TMR, Bellinato DF,
Ciroulo JCS 2006. Monitoramento da resistência de populações de Aedes
aegypti de diferentes localidades do país aos inseticidas usados nos programas
de controle de dengue, de forma a orientar o manejo da resistência no campo.
Relatório apresentado à Coordenação Geral de Laboratórios / Secretaria de
Vigilância em Saúde.
Vasuki V 1992a. Adult longevity of certain mosquito species after larval and pupal
exposure to sublethal concentration of an insect growth regulator hexaflumuron.
Southeast Asian J Trop Med Public Health 23: 121-124.
Vasuki V 1992b. The effects of sublethal doses of hexaflumuron on the feeding
behavior of mosquitoes (Diptera: Culicidae). Bull Entomol Res 82: 535- 538.
71
Vasuki V 1999. Influence of IGR treatment on oviposition of three species of vector
mosquitoes at sublethal concentrations. Southeast Asian J Trop Med Public
Health 30: 200-203.
WHO 1981. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito
larvae to insecticides. WHO/VBC/81.807.1981. World Health Organization,
Genebra.
Wilson TG, Cryan JR 1997. Lufenuron, a chitin-synthesis inhibitor, interrupts
development of Drosophila melanogaster. J Exp Zool 278: 37-44.
Zaim M, Guillet P 2002. Alternative insecticides: an urgent need. Trends Parasitol 18:
161-163.
72
Tabela 1: Nível de susceptibilidade das populações de Ae. aegypti ao organofosforado temephos e ao piretróide deltametrina.
a região Centro-Sul da cidade b RR<5: população susceptível; 5<RR<10 resistência moderada; e RR>10 resistência elevada (de acordo com Mazarri e
Georghiou 1995) c A dose diagnóstica (DD) de deltametrina usada foi de 5 µg ug/garrrafa (metodologia de Da-Cunha et al. 2005). Neste ensaio,
mortalidade abaixo de 80% indica população resistente (Davidson e Zahar 1973). d A dose diagnóstica de triflumuron empregada, equivalente ao dobro da IE99, foi de 7,9 µg/L.
triflumuron, % mort Região Estado localidade temephosb
RR95
deltametrina
% mort DDc IE99 DDd
SE Aracaju 19,3 88,1 100,0 100,0 NE
AL Maceió 10,3 62,9 100,0 100,0
Belo Horizontea 5,4 74,5 100,0 100,0 SE MG
Montes Claros 13,6 62,7 100,0 100,0
Dourados (Norte) 4,3 87,9 100,0 100,0 MS
Dourados-(Sul) 7,1 61,9 100,0 100,0 CW
MT Cuiabá 4,0 89,2 100,0 100,0
73
Legendas das figuras:
Figura 1: efeito de triflumuron sobre larvas de Aedes albopictus. a) curva de
regressão não linear da inibição da emergência (IE); b) mortalidade estágio-
específica.
Figura 2: efeito de triflumuron sobre larvas de Culex quinquefasciatus a) curva de
regressão não linear da inibição da emergência (IE); b) mortalidade estágio-
específica.
Figura 3: efeito de triflumuron sobre populações de campo de Aedes aegypti.
Mortalidade estágio-específica nas sete populações avaliadas expostas à IE99 (painel
a) ou à DD (painel b). Barras indicadas por letras iguais representam populações
que não diferem significativamente.
74
Figura 1
a b
0 0.9 1 1.25 1.5 1.75 2 2.5 2.75 3 3.5 4 4.5
0
20
40
60
80
100
larvapupaadulto
doses (ug/L)
Mor
talid
ade
(%)
0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
doses (ug/L)
IE (
%)
75
Figura 2
a b
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
doses (ug/L)
IE (%)
0 2.5 5 6.5 7.5 8.5 10 12.515 20 25 30 50
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0la rvapupaadu lto
d o se s (u g /L )
Mortalid
ade (%
)
76
Figura 3
a
b
Rock Cuiabá D. Norte B. Horiz. D. Sul Maceió M. Claros Aracaju0
20
40
60
80
100 larvapupa
Mo
rtal
idad
e (%
)
Rock Cuiabá D. Norte B. Horiz. D. Sul Maceió M. Claros Aracaju0
20
40
60
80
100 larvapupa
Mo
rtal
idad
e (%
)
ca,ba bb
caaaba bb
a,b a,b a,b
Rock Cuiabá D. Norte B. Horiz. D. Sul Maceió M. Claros Aracaju0
20
40
60
80
100 larvapupa
Mo
rtal
idad
e (%
)
Rock Cuiabá D. Norte B. Horiz. D. Sul Maceió M. Claros Aracaju0
20
40
60
80
100 larvapupa
Mo
rtal
idad
e (%
)
ca,ba bb
caaaba bb
a,b a,b a,b
77
4) Discussão
Aedes aegypti, Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus são três espécies de
mosquitos amplamente difundidas pelo território brasileiro, cuja presença constitui
um fato extremamente preocupante, uma vez que podem participar da transmissão
de diversas arboviroses. Atualmente, existe uma grande preocupação com a
possível entrada do Vírus do Oeste do Nilo (VNO) na América do Sul, já que esse
vírus se difundiu rapidamente pela América do Norte, provocando epidemias, como
a de Nova York em 1999 (Goddard et al., 2003). O VNO pertence à família
Flaviviridae, gênero Flavivirus, no qual também estão classificados os vírus da
hepatite C (HCV), da febre amarela, da encefalite japonesa, da encefalite de São
Luís e da dengue. Algumas aves constituem o reservatório natural, e o ciclo do vírus
é mantido na natureza através da relação entre as mesmas e mosquitos do gênero
Culex sp (Campbell et al., 2002). Culex quinquefasciatus e Ae. albopictus podem
representar potenciais vetores no Brasil, uma vez que linhagens destas espécies
susceptíveis ao vírus têm sido encontradas na América do Norte (Moore e Mitchell,
1997; Hayes et al., 2005).
Preocupação adicional existe com Ae. albopictus, principalmente devido a
sua grande valência ecológica. Aedes albopictus pode ser encontrado tanto em
habitats silvestres quanto em locais suburbanos ou urbanos (Juliano e Lounibos,
2005), podendo ser responsável pela urbanização de arboviroses, como a febre
amarela, por exemplo. Epidemias de febre amarela não existem no Brasil desde a
década de 1950, apesar da existência do ciclo silvestre (Mondet et al., 1996).
Mondet et al. (2001) relatam que o risco de reurbanização da febre amarela no Brasil
é grande, uma vez que Ae. aegypti está amplamente distribuído no país e muitas
vezes co-existe com Ae. albopictus. De acordo com Massad et al. (2001), o risco de
novas epidemias de febre amarela no Brasil é iminente. Lourenço-de-Oliveira et al.
(2003) verificaram que populações brasileiras de Ae. albopictus são passíveis de
infecção com o vírus da febre amarela.
O culicídeo Ae. aegypti, por sua vez, além de ser um potencial vetor de
febre amarela urbana, continua sendo o único vetor confirmado na transmissão de
dengue no Brasil. Atualmente a dengue é considerada uma das arboviroses mais
importantes, sendo endêmica em mais de 100 países, localizados em regiões
tropicais e sub-tropicais, predominando em áreas urbanas e semi-urbanas (WHO,
1997, 2002). No Brasil, têm ocorrido epidemias freqüentes de dengue em grande
78
parte do país, destacando-se o Estado do Rio de Janeiro em relação ao número de
casos da doença. Três sorotipos circulam atualmente no país: DENV-1, introduzido
em 1986 (Schatzmayr et al., 1986), DENV-2, em 1990 (Nogueira et al., 1990) e
DENV-3, em 2000 (Nogueira et al., 2001).
Os inseticidas químicos continuam sendo um dos elementos mais
importantes e mais utilizados no controle de vetores. Entretanto, o arsenal de
produtos efetivos contra os vetores tem diminuído muito, principalmente devido ao
desenvolvimento de resistência aos inseticidas comumente utilizados (Zaim e Guillet,
2002). Outro fator que também contribui para a limitação no uso de inseticidas é o
aumento da demanda pública por tecnologias seguras, o que implica no
desenvolvimento de produtos com sítios-alvo mais seletivos e com baixo risco para
organismos não-alvo e o meio ambiente (Graf, 1993). Portanto, são de fundamental
importância o desenvolvimento e o estudo de inseticidas alternativos seguros aos
ecossistemas, eficazes no combate às populações de artrópodes vetores, e
principalmente, eficientes contra as populações resistentes aos inseticidas
usualmente utilizados.
Neste sentido, pode-se considerar que os IGRs representam uma nova
estratégia para o controle de vetores em Saúde Pública, principalmente pelo fato de
possuírem mecanismos de ação diferenciados dos inseticidas usualmente utilizados.
Além disso, de acordo com Siddal (1976) e Wrigth (1976), os IGRs são compostos
que possuem grande nível de segurança ao meio ambiente, principalmente quando
em comparação com os inseticidas convencionais. Mian e Mulla (1982) realizaram
uma extensa revisão sobre o efeito de diversos IGRs contra organismos não-alvo,
incluindo os inibidores de síntese de quitina. Esses autores concluíram que vários
IGRs e, em particular os CSIs, não afetam a maioria dos organismos não-alvo, como
algas, rotíferos, platelmintos, nematódeos e moluscos. De acordo com Peveling
(1999), triflumuron foi um dos compostos com maior nível de segurança contra
organismos não-alvo quando em comparação com organofosforados.
No estudo aqui apresentado, triflumuron mostrou ser eficiente na inibição
da emergência de Ae. aegypti, Ae. albopictus e Cx. quinquefasciatus, em
concentrações na ordem de µg/L (ppb), em condições de laboratório (artigos 1 e 3).
Além disso, verificamos que esse composto é igualmente eficiente em populações
de Ae. aegypti susceptíveis ou resistentes ao organofosforado temephos; atua em
doses semelhantes às da linhagem de referência Rockefeller, o que indica que o
79
mecanismo selecionado por temephos nas populações avaliadas não conferiu
resistência a triflumuron, ou seja, não ocorreu resistência cruzada (artigo 1).
Avaliou-se também a eficácia de triflumuron (IE99 para Rockefeller e a
dose diagnóstica, DD) sobre sete amostras de populações brasileiras de Ae. aegypti,
com diferentes níveis de resistência tanto ao organofosforado temephos quanto ao
piretróide deltametrina, em condições de laboratório (artigo 3). Nas duas doses
avaliadas, não houve emergência de adultos viáveis em nenhuma das populações
estudadas, o que reforça o fato de que não existe resistência cruzada entre os
mecanismos de resistência selecionados nestas populações ao triflumuron. Estes
resultados são de extrema importância, já que tem sido verificada a resistência de
Ae. aegypti ao temephos em diversas localidades brasileiras (Braga et al., 2004),
indicando que o estudo de métodos racionais de controle tornam-se cada vez mais
relevantes.
Uma vez que a maioria dos criadouros de Ae. aegypti, recipientes de
armazenamento de água para fins domésticos, está sujeita a alterações contínuas
nos níveis de água em função de sua utilização ao longo dos dias, a diminuição da
quantidade do princípio ativo pode resultar em doses sub-letais. Para avaliar esta
situação, quantificamos uma série de parâmetros de viabilidade e reprodução de
adultos de Ae. aegypti sobreviventes ao tratamento com uma dose que inibe a
emergência em 50% (IE50). De modo geral, assim como observado com outros IGRs
(Miura et al., 1976; Vasuki, 1992; Ritchie et al., 1997), os adultos sobreviventes
possuíam uma série de problemas que resultavam em mortalidade precoce ou
menor capacidade reprodutiva (artigo 2). Dentre os adultos sobreviventes, a maioria
correspondia a machos. Ambos os sexos tinham longevidade reduzida, efeito mais
pronunciado em fêmeas (artigo 2), provavelmente porque seu desenvolvimento
larvar é mais lento, o que teria aumentado o tempo de exposição ao CSI.
Uma vez que a longevidade de um vetor está diretamente relacionada com
a sua capacidade de transmissão de uma infecção (Clements, 1992), espera-se que
adultos sobreviventes de tratamento com triflumuron na fase imatura, menos
longevos que adultos controle, tenham sua capacidade vetorial reduzida. Também
foi verificado que, embora o ritmo circadiano não tenha sido alterado, a atividade
locomotora de fêmeas sobreviventes foi muito inferior aos controles, provavelmente
resultado da freqüente quebra de seus tarsos ao longo dos dias. Como a locomoção
destas fêmeas está comprometida, a busca por alimentação sangüínea deve ocorrer
com mais dificuldade. Aqui, verificamos que uma menor quantidade de fêmeas
80
sobreviventes ao triflumuron conseguiu realizar o repasto sangüíneo e que estas
ingeriram menor quantidade de sangue. Com isto, a produção de ovos foi
prejudicada (artigo 2).
Com relativa freqüência, ovos de algumas fêmeas estouravam quando
postos a eclodir. As espermatecas destas fêmeas não continham espermatozóides,
sugerindo que a ruptura dos ovos seja conseqüência da ausência de embrião.
Cruzamentos com casais isolados onde apenas um dos parceiros havia sido exposto
a triflumuron confirmaram que tanto machos quanto fêmeas adultos sobreviventes a
este CSI realizam a cópula com dificuldade: em todos os pontos experimentais,
quando havia pelo menos um indivíduo tratado, a taxa de espermatecas positivas foi
menor (artigo 2).
Os resultados obtidos sugerem fortemente que triflumuron pode ser
considerado como uma ferramenta potencial para o controle de culicídeos vetores
no país. Além de ser ativo, em pequenas concentrações, contra os três culicídeos
avaliados, mostrou-se bastante eficiente contra populações de campo com
diferentes níveis de resistência a duas classes de inseticidas. Além disso, adultos
que sobrevivem a doses subletais possuem uma série de problemas fisiológicos que
provavelmente diminuem sua capacidade vetorial.
Entretanto, é evidente que o uso de apenas uma metodologia de controle,
independente do produto químico utilizado e de sua eficiência, com poucas chances
alcançará sucesso. É essencial o investimento em campanhas que conscientizem a
população sobre a real importância do problema, aliado ao maior direcionamento de
recursos em saneamento básico. Programas de monitoramento da resistência a
inseticidas também são fundamentais na tomada de decisões, pois possibilitam que
seja feita a troca de inseticidas de forma racional. O resultado dessas ações, em
conjunto, é fator crucial para a redução não só da dengue e filariose linfática, mas
também da maioria das doenças transmitidas por artrópodes.
81
5) Conclusões
� Triflumuron, aplicado às larvas de Aedes aegypti, Aedes albopictus e Culex
quinquefasciatus, inibe a emergência de adultos, de forma dose-dependente,
na ordem de µg/L (ppb).
� Triflumuron é eficiente em populações de campo resistentes e susceptíveis ao
organofosforado temephos, em doses semelhantes às da cepa Rockefeller.
� Os mecanismos de resistência selecionados por temephos nas populações
avaliadas não propiciam resistência a triflumuron, ou seja, não ocorre
resistência cruzada.
� A IE99 e a DD de triflumuron definidas para a cepa susceptível Rockefeller
inibem totalmente a emergência de adultos de diversas populações de Ae.
aegypti, resistentes e susceptíveis ao organofosforado temephos e ao
piretróide deltametrina.
� A maioria dos adultos de Ae. aegypti resultantes da IE50 é de machos.
� Adultos de Ae. aegypti sobreviventes ao tratamento com IE50 de triflumuron
possuem uma série de problemas, tais como:
- longevidade reduzida;
- atividade locomotora reduzida;
- aceitação de repasto sangüíneo prejudicada;
- volume de sangue ingerido menor;
- postura reduzida;
- mortalidade expressiva até 24 horas após a oviposição;
- dificuldade para a realização de cópula em ambos os sexos.
82
6) Perspectivas
Nosso Laboratório investiga diversos aspectos da fisiologia do
desenvolvimento de culicídeos vetores e, entre eles, o papel da quitina nesses
processos. Tendo em vista as características singulares da quitina e sua síntese,
esta molécula é considerada um alvo em potencial para o controle de artrópodes
vetores de doenças. Neste contexto, tem sido verificado que moléculas pertencentes
à classe das benzoil-fenil-uréias inibem de forma eficaz a formação de cutícula em
diversas espécies de vetores. Pretendemos prosseguir esta linha de pesquisa
analisando o efeito de um CSI sobre o desenvolvimento de Aedes aegypti. Em
particular, a expressão do gene que codifica a Quitina-Sintase durante o
desenvolvimento larvar será estudada em indivíduos expostos ao triflumuron.
Também será avaliada a influência de triflumuron sobre a estrutura do exoesqueleto
de formas imaturas..Esperamos, com estes resultados, contribuir para viabilidade da
implementação de CSIs como estratégia alternativa de controle.
83
7) Bibliografia
Addison JA. Safety testing of tebufenozide, A new molt-inducing insecticide for effects on nontarget forest soil invertebrates. Ecotoxicolol Environ Saf 1996; 28: 14- 24.
Ahid SMM, Vasconcelos PSS, Lourenço-de-Oliveira R. Vector competence of Culex quinquefasciatus Say from different regions of Brazil to Dirofilaria immitis. Mem Inst Oswaldo Cruz 2000; 95(6): 769-775.
Ali A, Nayar JK, Rui-de Xue. Comparative toxicity of selected larvicides and insect growth regulators to a Florida laboratory population of Aedes albopictus. Journal Am Mosq Control Assoc 1995; 11: 72-76.
Amir OG, Peveling R. Effect of triflumuron on brood development and colony survival of free-flying honeybee, Apis mellifera L. J Appl Entomol 2004; 128(4): 242-249.
Arias JR, Mulla MS. Postemergence effects of two insect growth regulators on the mosquito Culex tarsalis (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 1975; 12(3): 317-322.
Axtell RC, Dukes JC, Edwards TD. Field testsof diflubenzuron, methoprene, flit MLO® and chlorpyrifos for the control of Aedes taeniorhynchus larvae in diked dredged spoil areas. Mosq News 1979; 39(3):520-526.
Ayad H, Georghiou GP. Resistence pattern of Anopheles albimanus Wied. Following selection by parathion. Mosq News 1979; 39: 121-125.
Beaty BJ, Marquadt WC. The biology of disease vectors. University Press of Colorado; 1996.
Bergé JP, Feyereisen R, Amichot M. Cytochrome P450 monooxygenases and insecticide resistance in insects. Phil Trans R Soc Lond 1998; 353: 1701-1705.
Bisset JA. Uso correcto de insecticidas: control de la resistencia. Rev Cubana Med Trop 2002; 54: 202-219.
Boudjelida H, Bouaziz A, Soin T, Smagghe G, Soltani N. Effects of ecdysone agonist halofenozide against Culex pipiens. Pestic Biochem Physiol 2005; 83: 115-123.
Braga IA, Lima JBP, Cunha SP, Soares SS, Melo RCGM, Valle D. Aedes aegypti resistance to temephos during 2001 in several municipalities in Rio de Janeiro, Sergipe and Alagoas States, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99:199-203.
Braga IA, Mello CB, Peixoto AA, Valle D~. Evaluation of methoprene effect on Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) development in laboratory conditions. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005; 100(4): 435- 440.
Brito M, Marques, GRAM, Marques CCA, Tubaki RM. Primeiro encontro de Aedes (Stegomyia) Albopictus (Skuse) no Estado de São Paulo (Brasil). Rev Saude Publ 1986; 20(6), 489.
84
Brogdon WG, McAllister JC. Insecticide resistance and vector contro. Emerg Inf Dis 1998; 4: 605-613.
Brusca RC, Brusca GJ. Invertebrates. 2 ed. Sinauer Associates, Inc., 2003
Campbell GL, Marfin AA, Lanciotti, RS, Gubler DJ. West Nile Virus. The Lancet Infec Dis 2002; 2:519-529.
Carlson JR, Benthey D. Ecdysis: Neural orchestration of a complex behavioral performance. Science 1977; 195: 1006-1008.
Chapman RF. The Insects: Structure and Function. 4th edition, Cambridge University Press, 1998.
Chavasse DC, Yap HH. Chemical methods for the control of vectors and pests of public health importance. WHO/CTD/WHOPES/97.2. 1997. Genebra, WHO.
Clements AN. The Biology of Mosquitoes. Chapman & Hall, London, 1992.
Cohen E. Chitin Bioquemistry: synthesis and inhibiton. Annu Rev Entomol 1987; 32: 71-93.
Cohen E. Chitin synthesis and inhibition: a revisit. Pest Manag Sci 2001; 57: 946- 950.
Consoli R, Lourenço-de-Oliveira R. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Fiocruz, Rio de Janeiro, 1994.
Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean DH. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Ver 1998; 62: 807-813.
D’Amato C, Torres JPM, Malm O (2002) DDT (Dicloro Difenil Tricloroetano): Toxicidade e contaminação ambiental – Uma revisão. Quim Nov 2002; 25(6): 995-1002.
Dame DA, Wichterman GJ, Horby JA. Mosquito (Aedes taeniorhynchus) resistance to methoprene in an isolated habitat. J Am Mosq Control Assoc 1998; 14(2): 200- 203.
Darvas B, Polgar L, Tag El-din MH, Eross K, Wing KD (1992) Developmental disturbances in different insect orders caused by na ecdysteroid agonist, RH 5849. J Econ Entomol 1992; 85(6): 2107-2112.
Deane LM. Observações sobre alguns hábitos de adultos de Culex fatigans, o principal transmissor da filariose em Belém, Pará. Ver Esp Sev Saúde Publ 1961, 4:423-464
Divakar BJ, Rao BK. Induced changes in oviposition by juvenile hormone analogue in the mosquito, Anopheles stephensi. Curr Sci 1975; 44: 555-556.
Donalísio MR, Glasser CM. Vigilância entomológica e controle de vetores do dengue. Rev Bras Epidemiol 2002; 5(3): 259-279.
85
dos Santos RLC. Atualização da distribuição de Aedes albopictus no Brasil (1997-2002). Rev Saude Publ 2003; 37(5): 671-673.
Dreyer G, Coelho G. Filariose linfática: doença potencialmente eliminável. Cad Saude Publ 1997; 13(3): 537-543.
Federici BA, Park H-W, Bideshi DK, Wirth MC, Johnson, JJ. Recombinant bacteria for mosquito control. J Exp Biol 2003; 206: 3877-3885
ffrench-Constant RH. Which came first: insecticides or resistance? Tren gen 2006; 23(1):1-4.
Forattini OP, Gomes AC, Natal D, Kakitani I, Marucci D. Frequência domiciliar e endofilia de mosquitos culicidae no vale do ribeira, São Paulo, Brasil. Rev Saude Publ 1987; 21(3): 188-192.
Forattini OP, Kakitani I, dos Santos RLC,Kobayashi KM, Ueno HM, Fernández Z. Potencial sinantrópico de mosquitos Kerteszia e Culex (Diptera: Culicidae) no Sudeste do Brasil. Rev Saude Publ 2000; 34(6): 565-569.
Forattini OP. Culicidologia Médica. Vol.2. Editora da Universaidade de São Paulo – EDUSP; 2002.
Fournet F, Sannier C, Moriniere M, Porcheron P, Monteny N. Effects of two insect growth regulators on ecdysteroid production in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 1995; 32: 588-593.
Goddard LB, Roth AM, Reisen WK, Scott TW. Vector competence of california mosquitoes for west Nile virus. Emerg Infect Dis 2003; 8(12):1385-1391.
Godsey Jr, MS, Nasci R, Savage HM, Aspen S, King R, Powers AM, Burkhalter K, Colton L, Charnetzky D, Lasater S, Taylor V, Palmisano CT. West Nile Virus–infected mosquitoes, Louisiana, 2002. Emerg Infect Dis 2005; 11(9): 1399-1404.
Graf JF. The role of insect growth regulators in arthropod control. Parasitol Today 1993; 9: 471-474.
Gratz NG. Critical review of vector status of Aedes albopictus. Med Vet Entomol 2004; 18: 215-227.
Gubler DJ. Epidemic dengue/ dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic problem in the 21st century. Tr Microbiol 2002; 10: 100-103.
Hajjar NP. Insecticides. John Wiley & Sons, New York, 1985.
Hawley WA. The biology of Aedes albopictus. J Am Mosq Control Assoc 1988; suppl 1(4), 1-40.
Hayes EB, Komar N, Nasci RS, Montgomery SP, O’Leary DR, Campbell GL Epidemiology and transmission dynamics of west Nile virus disease. Emerg Infect Dis 2005; 11(8): 1167-1173.
Heller JJ, Mattioda H, Klein E, Sagenmuller A. Field evaluation of RH 5992 on lepidopterous pests in Europe. Pest Dis 1992, 2: 59-65.
86
Hemingway J, Hawkes NJ, McCarroll L, Ranson H. The molecular basis of insecticide resistance in mosquitoes. Insect Biochem Molec Biol 2004; 34: 653- 665.
Hemingway J, Ranson H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annu Rev Entomol 2000; 45: 371-391.
Hofte H, Whiteley HR. Insecticidal Crystal Proteins of Bacilllus thuringiensis. Microbiol Rev 1989; 53(2): 242-255.
Honório NA, Lourenco-de-Oliveira R. Frequency of Aedes aegypti and Aedes albopictus larvae and pupae in traps, Brazil. Rev Saude Publ 2001; 35: 385-391.
Ibáñez-Bernal S, Briseño B, Mutebi JP, Argot E, Rodríguez G, Martínez-Campos C, Paz R, Román PLFS, Tapia-Conyer R, Flisser A. First record in America of Aedes albopictus naturally infected with dengue virus during the 1995 outbreak at Reynosa, Mexico. Med Vet Entomol 1997; 11: 305-309.
IRAC-BR. Modo de ação de inseticidas e acaricidas [on-line]. Comitê Brasileiro de ação à resistência a inseticida. [capturado em dezembro de 2006]. Disponível em: http://www.irac-br.org.br.
Juliano SA, Lounibos LP. Ecology of invasive mosquitoes: effects on resident species and on human health. Ecol Letters 2005; 8: 558-574.
Kambhampati S, Black IV WC, Rai KS. Geografhic origin of the US and Brazilian Aedes albopictus inferred from allozyme analysis. Heredity 1990; 67: 85-94.
Karunaratne SHPP, Jayawardena GGI, Hemingway J, Ketterman, AJ. Characterisation of a B-type esterase involved in insecticide resistance from the mosquito Culex quinquefasciatus. Biochem J 1993; 294: 575-579.
Katzung BG. Basic and Clinical Pharmacology. 9th Edition, Lange Medical Books / McGraw-Hill, 2004.
Knudsen AB. Global distribution and continuing spread of Aedes albopictus. Parasitologia 1995; 37(2-3): 91-97.
Konishi E. Culex tritaeniorhynchus and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) as natural vectors of Dirofilaria immitis (Spirurida: Filariidae) in Miki City, Japan. J Med Entomol 1989; 26(4): 294-300.
Kramer VL, Carper ER, Beesley C. Control of Aedes dorsalis with sustained-release methoprene pellets in a saltwater marsh. J Am Mosq Control Assoc 1993; 9(2): 127-130.
Kreutzweiser DP, Capell SS, Wainio-Keiser KL, Eichenberg DC. Toxicity of a new molt-inducing insecticide (RH-5992) to aquatic invertebrates. Ecotoxicol Environ Saf 1994; 28: 14-24.
Kumar S, Thomas A, Sahqal A, Verma A, Samuel T, Pillai MK. Effect of the synergist, piperonyl butoxide, on the development of deltamethrin resistance in yellow fever mosquito, Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae). Arch Insect Biochem Physiol 2002; 50(1): 1-8.
87
Lima JBP, Melo NV and Valle D. Residual effect of two Bacillus thuringiensis var. israelensis products assayed against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory and outdoors at Rio de Janeiro, Brazil. Rev Inst Med Trop SP 2005; 47:125-130.
Lima JBP, Pereira da Cunha M, Silva JRC, Galardo AKR, Soares SS, Braga IA, Ramos RP, Valle D. Aedes aegypti resistance to organophosphates in several localities in Rio de Janeiro and Espírito Santo, Brazil. Am J Trop Med Hyg 2003; 68: 329-333.
Lockwood JA, Sparks TC, Story RN. Evolution of insect resistance to insecticides: a reevaluation of the roles of physiology and behavior. Bull Entomol Soc Am 1984; 30: 41-50.
Lounibos LP, Escher RL, Lourenço-de-Oliveira R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Ae. albopictus (Diptera: Culicidae). Ann Entomol Soc Am 2003; 96(4): 512-518.
Lounibos LP, Suarez S, Menendez Z, Nishimura N, Escher RL, O'Connell SM, Rey JR. Does temperature affect the outcome of larval competition between Aedes aegypti and Aedes albopictus? J Vector Ecol 2002; 27: 86-95.
Lourenço-de-Oliveira R, Castro MG, Braks MAH, Lounibos,LP. The invasion of urban Forest by dengue vectors in Rio de Janeiro. J vec ecol 2004, 29(1):94-100.
Lourenço-de-Oliveira R, Vazeille M, de-Filippis AMP, Failloux AB. Aedes aegypti in Brazil: genetically differentiated populations with high susceptibility to dengue and yellow fever viruses. Am J Trop Med Hyg 2004; 98: 43-54.
Lourenço-de-Oliveira R, Vazeille M, Filippis AMB, Failloux AB. Large genetic differentiation and low variation in vector competence for dengue and yellow fever viruses of Aedes albopictus from Brazil, The United States, and the Cayman island. Am J Trop Med Hyg 2003, 69(1): 105-114.
Luna EJA, Pereira LE, Souza RP. Encefalite do Nilo Ocidental, nossa próxima epidemia? Epidemiol Serv Saúde 2003; 12: 7-19.
Martinez EM. Dengue hemorrágico em crianças. José Marti. Habana, Cuba, 1990.
Marx JL. Chitin synthesis inhibitors: New class of insecticides. Science 1977, 197, 170-172.
Massad E, Coutinho AB, Burattini MN, Lopez LF. The risk of yellow fever in a dengue-infested area. Trans R Soc Trop Med Hyg 2001; 95:370-374.
Merzendorfer H, Zimoch L. Chitin metabolism in insects: structure, function and regulation of chitin synthases and chitinases. J Exp Biol 2003; 206: 4393-4412.
Mian LS, Mulla MS. Biological and environmental dynamics of insect growth regulators (IGRs) as used against Diptera of public health importance. Res Rev 1982; 84: 27-112.
Mitchell CJ, Monath TP, Sabattini MS, Cropp CB, Daffner JF, Calisher CH, Jakob WL, Christensen HA. Arbovirus investigations in Argentina, 1977-1980 II.
88
Arthropod Collections and virus isolations from Argentine Mosquitoes. Am J Med Hyg 1985; 34(5):945-955.
Miura T, Schaefer CH, Takahashi RM, Mulligan FS. Effects of the Insect Growth inhibitor, Dimilin, on hatching of mosquito eggs. J Econ Entomol 1976; 69(5): 655-658.
Mondal KAMSH, Parween S. Insect growth regulators and their potential in the management of stored-product insect pests. Int Pest Manag Rev 2000; 5: 255-295.
Mondet B. Considérations sur l’épidémiologie de la fièvre jaune au Brésil. Epidémiologie 2001; 94(3): 260-267.
Mondet PB, Travassos da Rosa APA, Vasconcelos PFC. Les risques D’épidémisation urbaine de la fièvre jaune au Brésil par lês vecteurs de la dengue Aedes aegypti et Aedes albopictus. Bull Soc Path Ex 1996; 89: 107- 114.
Moore CG, Mitchell CJ. Aedes albopictus in the United States: Ten-year presence and public health implications. Emerg Infect Dis 1997; 3(3): 329-334.
Mulla MS, Darwazeh HA, Ede L, Kennedy B. Laboratory and field evaluation of the IGR fenoxycarb against mosquitoes. J Am Mosq Control Assoc 1985; 1(4):442-8.
Mulla MS. The future of insect growth regulators in vector control. J Am Mosq Control Assoc 1995; 11(2): 269-273.
Nakagawa Y, Matsumura F. Diflubenzuron affects gammathio GTP stimulated Ca2+ transport in vitro in intracellular vesicles from the integument of the newly molted american cockroach, Periplaneta americana. J Insect Biochem Mol Biol 1994; 24: 1009-1015.
Nayar JK, Knight JW. Aedes albopictus (Diptera: Culicidae): an experimental and natural host of Dirofilaria immitis (Filarioidea: Onchocercidae) in Florida, U.S.A. J Med Entomol 1999; 36: 441-448.
Nelson MJ. Aedes aegypti: biologia y ecologia. Organización Panamericana de la Salud, Washington, DC, 1986.
Neves DP, Melo AL, Genaro O, Linardi PM. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu Biblioteca Biomedica; 2001.
Nogueira RMR, Miagostovich MP, Lampe E, Schatzmayr HG. Isolation of dengue virus type 2 in Rio de Janeiro. Mem Inst Oswaldo Cruz 1990; 85: 253.
Nogueira, RMR, Miagostovich MP, de-Filippis AMB, Pereira MAS, Schatzmayr HG. Dengue type 3 in Rio de Janeiro, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2001; 96: 925-926.
OPAS. Organización Panamericana de la Salud. Dengue y dengue hemorrágico en las Américas: guías para su prevención y control. Washington: DC, 1995.
89
Ortega AN, Marquetti MDC, Valdes S, Garcia FA. Tolerance of Culex quinquefasciatus Say, 1823 (Diptera: Culicidae) to methoprene in Cuba. Mem Inst Oswaldo Cruz 1991; 86(4): 493.
Ottesen EA, Ramachandran CP. Lynphatic filariasis infection and disease: Control strategies. Parasitol today 1995; 11(4):129-131.
Parween S. Symptoms of triflumuron intoxication in larvae of Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae). Tribolium Info Bull 1998 ; 38: 268-270.
Penilla RP, Rodriguez AD, Hemingway J, Torres JL, Arredondo-Jimenez JI, Rodriguez MH. Resistance management strategies in malaria vector mosquito control. Baseline data for a large-scale field trial against Anopheles albimanus in Mexico. Med Vet Entomol 1998; 12: 217-233.
Peveling R, Rafanomezantsoa J-J, Razafinirina R, Tovonkery R, Zafimaniry G. Environmental impact of the locust control agents fenitrothion, finitrothion-esfenvalerate and triflumuron on terrestrial arthropods in Madagascar. Crop Protec 1999; 18:659-676.
Polanczyk RA, Garcia MO, Alves SB. Potencial de Bacillus thuringiensis israelensis Berliner no controle de Aedes aegypti. Rev Saude Publ 2003; 37(6): 813-6.
Ranson H, Hemingway J. Mosquito glutathione transferases. Methods Enzymol 2005; 401: 226-241.
Raymond M, Heckel DG, Scott JG. Interactions between pesticide genes: model and experiment. Genet 1989; 123: 543-551.
Rehimi N, Soltani N. Laboratory evaluation of Alsystin, a chitin synthesis inhibitor, against Culex pipiens pipiens L. (Dip., Culicidae): effects on development and cuticle secretion. J Appl Entomol 1999; 123: 437-441.
Reisen WK, Milby MM, Meyer RP, Pfuntner AR; Spoehel J, Hazel rigg JE, Webb Jr JB. Mark-release-recapture studies with Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae) in southern California. J Med Entomol 1991; 28: 357–371.
René F. Insect P450 enzymes. Ann Rev Entomol 1999; 44: 507-533.
Retnakaran A, Granett J, Ennis T. Insect Growth regulators. In:Comprehensive insect biochemistry, physiology and pharmacology, Vol 12. Ed By Kerkut, GA, Gilbert, LI Oxford, Pergamon Press, 1985.
Rey L. Parasitologia. 3 ed. Guanabara Koogan, 2001.
Ritchie SA, Asnicar M, Kay BH. Acute and sublethal effects of (S)-Methoprene on some Australian mosquitoes. J Am Mosq Control Assoc 1997; 13(2), 153-155.
Roberts DR, Andre RG. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. Am J Trop Med Hyg 1994; 50(6): 21-34.
Rocha EMM, Fontes G. Filariose bancroftiana no Brasil. Rev Saude Publ 1998; 32(1): 98-105.
90
Rodriguez MM, Bisset J, Ruiz M, Soca A. Cross-resistance to pyrethroid and organophosphorus insecticides induced by selection with temephos in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Cuba. J Med Entomol 2002; 39(6): 882-888.
Rose RI. Pesticides and public health: Integrated methods of mosquito management. Emerg Infec Dis 2001; 7(1): 17-23.
Roush RT, Mckenzie JA Ecological genetics of insecticide and acaricide resistance. Ann Rev Entomol 1987; 32: 361-380.
Ruppert E, Barnes RD. Zoologia dos Invertebrados, 6ª Ed, Rocca Ltda,1996.
Sáenz-de-Cabezón FJ, Pérez-moreno I, Zalom FG, Marco V. Effects of lufenorun on Lobesia botrana (Lepidoptera: Tortricidae) egg, larval, and adult stages. J Econ Entomol 2006; 99(2): 427-431.
Sardelis MR, Turell MJ, Dohm DJ, O’Guinn ML (2001) Vector competence of selected north american Culex and Coquillettidia mosquitoes for west nile virus. Emerg Infect Dis 2001; 7(6): 1018-1022.
Sawby R, Klowden MJ, Sjogren D. Sublethal effects of larval methoprene exposure on adult mosquito longevity. J Am Mosq Control Assoc 1992; 8: 290-292.
Schaefer CH, Wilder WH, Mulligan FS, Dupras EFJ. Efficacy of fenoxycarb against mosquitoes (Diptera: Culicidae) and its persistence in the laboratory and field. J Econ Entomol 1987; 80(1): 126-130.
Schatzmayr HG, Nogueira RMR, Travassos da Rosa APA. An outbreak of dengue virus at Rio de Janeiro. Mem Inst Oswaldo Cruz 1986; 81: 245-246.
Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler DR, Dean DH. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol mol Biol Rev 1998; 62: 775-806.
Scholte EJ, Knols BGJ, Samson RA, Takken W. Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review. Journal Insect Sci 2004; 4(19): 1-24.
Seng CM, Setha T, Chanta N, Socheat D, Guillet P, Nathan MB. Inhibition of adult emergence of Aedes aegypti in simulated domestic water-storage containers by using a controlled-release formulation of pyriproxyfen. J Am Mosq Control Assoc 2006; 22(1): 152- 154.
Serufo JC, Oca HM, Tavares VA, Souza AM, Rosa RV, Jamal MC, Lemos JR, Oliveira MA, Nogueira RMR, Schatzmayr HG. Isolation of Dengue virus type 1 from larvae of Aedes albopictus in Campos Altos city, state of Minas Gerais, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 1993; 88(3): 503-504.
Shroyer DA. Aedes albopictus and arboviruses: A concise review of the literature. J American Mosq Control Assoc 1986; 2(4), 424-428.
Siddal JB. Insect growth regulators and insect control: A critical appraisal. Env Health Pers 1976; 14: 119-126.
91
Sithiprasasna R, Luepromchai E, Linthicum KJ. Effects of sublethal dosages of methoprene on Anopheles dirus species A and B. J Am Mosq Control Assoc 1996; 12: 483-486.
Smith KE, Wall R. Suppression of the blowfly Lucilia sericata using odour-baited triflumuron-impregnated targets. Med Veterinary Entomol 1998; 12: 430-437.
Soderlund DM, Knipple DC. The molecular biology of knockdown resistance to pyrethroid insecticides. Insect Biochem Molec Biol 2003; 33: 563–577
Sparks TC, Lockwood JA, Byford RL, Graves JB, Leonard BR. The role of behaviorin insecticide resistance. Pest Sci 1989; 26: 383-399.
Staal GB. Insect growth regulators with juvenile hormone activity. Ann Rev Entomol 1975; 20: 417-60.
Su T, Mulla MS, Zaim M. Laboratory and field evaluations of novaluron, a nem insect growth regulator (IGR), against Culex mosquitoes. J Am Mosq Control Assoc 2006; 19(4): 408-418.
Sulaiman S, Jeffery J, Sohadi RA. Residual efficacy of triflumuron against the dengue vector, Aedes albopictus (Skuse). Bull Soc Vec Ecol 1994; 19(2): 111-114.
Sulaiman S, Jeffery J. The ecology of Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) in rubber state in Malasya. Bull Entomol Res 1986; 76:553-557.
SVS. Secretaria de Vigilância em Saúde. Dados e indicadores selecionados. Coordenação: Departamento de Análise de Situação de Saúde, 2003.
Terra WR. The origin and functions of the insect peritrophic membrane and peritrophic gel. Arch Insect Biochem Physiol 2001; 47:47-61
Tobe SS, Stay B. Modulation of juvenile hormone synthesis by an analogue in the cockroach. Nature 1979; 281: 481-482.
Tunaz H, Uygun N. Insect growth regulators for insect pest control. Turk J Agric For 2004; 28: 377-387.
Turell MJ, O’guinn ML, Dohm DJ, Jones JW. Vector competence of north american mosquitoes (Diptera: Culicidae) for west nile virus. J Med Entomol 2001; 38(2): 130-134.
Vasuki V, Rajavel R. Influence of short time exposure to an insect growth regulator, hexaflumuron, on mortality and adult emergence of vector mosquitoes. Mem Inst Oswaldo Cruz 1992; 87(2): 275-283.
Vasuki V. Adult longevity of certain mosquito species after larval and pupal exposure to sublethal concentration of an insect growth regulator hexaflumuron. Southeast Asian J Trop Med Public Health 1992; 23(1): 121-124.
Vasuki V. Influence of IGR treatment on oviposition of three species of vectos mosquitoes at sublethal concentrations. Southeast Asian J Trop Med Public Health 1999; 30(1): 200-203.
92
Vythilingam I, Luz BM, Hanni R, Beng TS, Huat TC. Laboratory and field evaluation of the insect growth regulator pyriproxyfen (Sumilarv 0.5G) against dengue vectors. J Am Mosq Control Assoc 2005; 21(3): 296-300.
Ware GW, Whitacre DM. The Pesticide Book, 6th Ed. Meister Media Worldwide, Willoughby, Ohio; 2004.
WHO. Dengue and dengue hemorragic fever. Fact sheet nº 117. World Health Organization. Disponível no site: [http://www.who.int/emc/diseases/ebola/ denguepublication/index.html]; 2002.
WHO. Lymphatic filariasis. Fact sheet nº 102. World Health Organization. Disponível no site: [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs102/en/]; 2000.
WHO. Monitoring of insecticide Resistance in Malaria Vectors. World Health Organization, Eastern Mediterranean Region, Cairo- Egypt; 1997.
WHO. Pesticides and their application: For the control of vectors and pests of public health importance. 6ª Ed., Genebra; 2006.
WHO. Prevention, Diagnosis and treatment of insecticide poisoning. WHO Technical report series 889. World Health Organization, Genebra; 1984.
Williams CM. The juvenile hormone of insects. Nature 1956; 178: 212-213.
Williams CM. The Juvenile Hormone. Sci Am 1958; 198: 67- 73.
Wilson TG, Cryan JR. Lufenuron, a chitin-synthesis inhibitor, interrupts development of Drosophila melanogaster. J Exp Zool 1997; 278:37-44.
Wrigth JE. Environmental and toxicological aspects of insect growth regulators. Environ Health Pers 1976; 14:127-132.
Zaim M, Guillet P. Alternative insecticides: an urgent need. Tr Parasitol 2002 18: 161-163.
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo