efeito do novaluron - um inibidor da síntese de quitina...
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Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Programa de Pós-Gradução em Biologia Parasitária
Efeito do Novaluron - um inibidor da síntese de
quitina – sobre Aedes aegypti em laboratório e
simulado de campo
Nathalia Giglio Fontoura
Orientador: Dr José Bento Pereira Lima
Rio de Janeiro, março de 2008
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ii
Efeito do Novaluron - um inibidor da síntese de
quitina – sobre Aedes aegypti em laboratório e
simulado de campo
Nathalia Giglio Fontoura
Dissertação apresentada como requisito para titulação de Mestre em
Biologia Parasitária, com área de concentração em Entomologia Médica
Orientador: Dr José Bento Pereira Lima (IOC/LAFICAVE)
Rio de Janeiro, março de 2008
Ministério da Saúde
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
iii
Giglio, Nathalia Fontoura
Efeito do Novaluron - um inibidor da síntese de quitina – sobre Aedes
aegypti em laboratório e simulado de campo
Dissertação de Mestrado em Biologia Parasitária, área de concentração em
Entomologia Médica
Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ
Rio de Janeiro, 2008
Número de páginas: xiv + 90
Palavras-chave: 1. Aedes aegypti; 2. IGR; 3. Inibidor da síntese de quitina; 4.
novaluron
iv
Efeito do Novaluron - um inibidor da síntese de quitina – sobre Aedes
aegypti em laboratório e simulado de campo
Banca Examinadora
Drª Claudia Torres Codeço – Presidente da banca examinadora
FIOCRUZ / PROCC
Dr Cícero Brasileiro Mello – Revisor do texto
Universidade Federal Fluminense
Dr Marcos Henrique Ferreira Sorgine
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Dr Ricardo Lourenço de Oliveira
FIOCRUZ / Instituto Oswaldo Cruz
Drª Ima Aparecida Braga
Ministério da Saúde / Secretaria de Vigilância em Saúde
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
do Instituto Oswaldo Cruz como parte
dos requisitos para obtenção do grau em
Mestre em Biologia Parasitária, área de
concentração: Entomologia Médica
Ministério da Saúde
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
v
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes
Vetores, Instituto Oswaldo Cruz, sediado no Instituto de Biologia do Exército.
Foram utilizados recursos da Fundação Oswaldo Cruz, da Fundação de
Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (Faperj), do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Secretaria de Vigilância
em Saúde (SVS-MS).
vi
D edico a m inha fam ília, em especial, a m inha avó, m inha irm ã, m inha m ãe. Pelo apoio e presença, sem vocês nada seria possível. V ocês foram fundam entais nesse cam inho. A os m eus am igos por sem pre acreditarem em
m im e estarem presentes em todos os m om entos.
vii
Agradecimentos
A todas as pessoas que cruzaram meu caminho nessa vida, mesmo que
por alguns segundos, pois de alguma forma me auxiliaram a seguir esse
caminho que agora trilho. Aos meus amigos e a minha família. São muitas
pessoas, se esqueci alguém, desculpa, mas a intenção é extensiva.
Aos meus amigos de sangue do Laboratório de Fisiologia e Controle de
Artrópodes Vetores, que muitas vezes foram minha família, cuidando de mim,
se importando comigo e me ouvindo.
A José Bento Pereira Lima que desde que entrei para o LAFICAVE tem
sido meu orientador, meu pai, meu amigo. Obrigada por me ouvir, por aturar
minhas chatices nos experimentos, por me incentivar, por estar presente nos
momentos difíceis, pelas palavras de carinhos e por muitas vezes me fazer
enxergar coisas que eu não conseguia ver. Por ser essa pessoa especial, com
um conhecimento imenso e ainda assim humilde e ainda por ser capaz de
tornar qualquer problema simples. Você é muito importante para mim e parte da
pessoa que sou hoje agradeço a você. Não tenho palavras para agradecer.
A Denise Valle, por ser uma mãezona, pelos conselhos, por ponderar nos
momentos oportunos, pelas suas excelentes idéias e observações. Pelo apoio,
por confiar em mim, por me ouvir mesmo nos momentos em que estava toda
enrolada. Por me emprestar sua formiga da sorte para que eu pudesse acabar
de escrever a tese, acho que funcionou. Você é uma pessoa maravilhosa e
muito importante para mim. Também devo muito do que sou a você. E donde
que eu vim heim?
Ao meu amigossim, Diogo Fernandes Bellinato, amigo para rir e para
chorar, para falar besteira e reclamar, para dançar e trabalhar. Obrigada pela
companhia na realização dos biensaios, por ouvir minhas viagens sobre
resistência, por me escutar e me apoiar nos momentos mais difíceis, por aturar
minhas chatices na sala de resistência, por estar presente em todos os
viii
momentos, bons ou maus, por ser um amigo leal, verdadeiro e tudo de bom.
Nossa amizade é eterna. Obrigada por você existir.
A amiga Priscila Fernandes Vianna Medeiros, uma amiga verdadeira,
também uma irmã que encontrei no LAFICAVE. Obrigada por confiar em mim
para desabafar, por se importar comigo, por ser uma pessoa maravilhosa, leal,
gentil, verdadeira. Por me apoiar e me dar forças para seguir em frente.
Obrigada por você existir na minha vida.
A Eliane (Lilica) e Tania pela companhia, pelos papos engraçados, pela
ajuda na criação dos mosquitos. Por me fazerem rir, por serem essas pessoas
lindas que vocês são.
Ao Ademir pela gentileza, por toda a ajuda com idéias, com sugestões,
colocando sua mente privilegiada a disposição para ajudar com seu jeito
especial de ser, pelas conversas e por ser um verdadeiro amigo desde o
primeiro dia que entrei para o LAFICAVE.
Ao meu amigo figurinha (Thiago Affonso Belinato) pela ajuda no trabalho
com CSIs, pela atenção, pelas conversas, por confiar em mim, pelas festinhas
por tudo. Obrigada.
A amiga Camila Dutra companheira de mestrado, amiga com que estudei,
passei os dias fazendo trabalho, discutindo experimentos, angustias e acertos.
Obrigada por me ouvir e pela força.
As amigas Patrícia e Isabela Reis pelas conversas por acompanhar e
torcer por mim, Obrigada meninas.
Ao amigo Gustavo Lazzaro Resende pelas conversas sobre quitina, pela
ajuda com a microscopia, por ser uma pessoa especial, inteligente, atenciosa.
Obrigada por tudo.
ix
A Luana Cristina Farnesi pelos papos sobre quitina, por me agüentar
falando sobre IGRs e também pelo apoio durante o mestrado. Obrigada.
A Diego de Lacerda pelo apoio nos simulados de campo e em tudo que
precisei durante todo mestrado. Obrigada pela força!
A Gilberto pela ajuda nos simulados e afins e pela atenção, por ser essa
pessoa super legal que você é.
A Edna, Bianca, Luciana 1, Luciana 2, Márcio, Mariana pela presença, pelo
apoio, por tudo.
A todo pessoal da limpeza e manutenção do IBEx pela companhia nos
simulados, por tomarem conta dos meus baldes de simulado, pela atenção, por
tudo. Vocês foram fundamentais.
A todo pessoal da limpeza, da administração e do ensino da FIOCRUZ
pela ajuda durante todo o mestrado, vocês são maravilhosos.
A Carla Gentile pelo estimulo e por despertar meu interesse pelos
mosquitos. Isso tudo começou com um trabalho simples, lembra? Obrigada pela
força sempre.
A minha turma de mestrado, todos sem exceção. Vocês são muito
especiais para mim. Sempre lembrarei dos lerês e das chupa-cabrices, dança
do siri e etc. Obrigada por tudo.
A minha banca de mestrado: Claudia Codeço, Cícero Mello, Marcos
Henrique Sorgine, por gentilmente terem aceitado o convite e pelas
observações extremamente pertinentes. Um agradecimento especial ao meu
revisor, pela atenção e por sua contribuição na correção da minha tese.
Obrigada a minha família, amo todos vocês.
x
A minha irmã por ser uma pessoa fundamental na minha vida, por ter me
estendido a mão no momento em que mais precisei. Obrigada por você ser
essa pessoa maravilhosa e especial que você é, obrigada por me ouvir, por me
aturar. Simplesmente minha vida não é completa sem você. Ao meu sobrinho
mais perfeito que sempre me dá alegrias e estimulo a seguir em frente.
A minha avó que também é parte fundamental da minha vida, uma pessoa
marvilhosa, sempre ao meu lado. Sem você minha vida não teria sentido.
Obrigada pela ajuda e pelo apoio e por confiar em mim.
A minha mãe, obrigada pelo incentivo e por acreditar em mim. Você
também é uma pessoa fundamental na minha vida.
Ao meu avô, meu tio, minhas primas, meu pai, obrigada por tudo.
Aos meus amigos que sempre me apoiaram Andréia, Mariza, Antonio
Gilberto, Verônica, obrigada por tudo, de coração.
Ao Instituto Oswaldo Cruz por levar a sério a educação e a pesquisa e por
ser pioneiro no que faz e pelo apoio financeiro sem o qual esse trabalho não
seria possível.
Ao IBEx pela disponibilização das instalações, espaço fundamental para
que esse trabalho fosse realizado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico
(CNPq) pelo fornecimento da minha bolsa de mestrado.
A Agricur pelo fornecimento do novaluron.
xi
Lista de Siglas e Abreviaturas
ACT – Aracajú com troca de água
AE – análogo de ecdisona
AnHJ – análogo de hormônio juvenil
AST – Aracajú sem troca de água
AtE – antagonista de ecdisona
AtHJ – antagonista de hormônio juvenil
Bs – Bacillus sphaericus
Bt – Bacillus thuringiensis
Bti – Bacillus thuringiensis sorovar israelensis
CDC – Centers for Disease Control
CE – Ceará
CL – Concentração Letal
CSI – Chitin synthesis inhibitors
DEN - dengue
FUNASA – Fundação Nacional de Saúde
h - horas
HJ – hormônio juvenil
HJCT – Henrique Jorge com troca de água
HJST – Henrique Jorge sem troca de água
IE – inibição da emergência
IGR – Insect Growth Regulators
LAFICAVE – Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores
MG – Minas Gerais
min – minutos
MT – Mato Grosso
OMS – Organização Mundial de Saúde
OP – organofosforado
RCT – Rockefeller com troca de água
Rock – Rockefeller
RR – razão de resistêcia
RST – Rockefeller sem troca de água
SE – Sergipe
SUCAM – Superentendencia de Campanhas de Saúde Pública
SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde
xii
Índice
Resumo ............................................................................................................. 1
Abstract ............................................................................................................. 2
1. Introdução ..................................................................................................... 3
1.1. Agente Etiológico ................................................................................... 3
1.2. A Doença ................................................................................................. 4
1.3. Vetores ..................................................................................................... 5
1.3.1. Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) ...................................................... 6
1.3.2. Aedes albopictus (Skuse, 1894) ...................................................... 8
1.5. Mudanças Climáticas Globais, Vírus Dengue e Vetores ................... 10
1.6. Controle ................................................................................................. 10
1.6.1. Resistência ..................................................................................... 17
1.7. Inseticidas Alternativos ........................................................................ 19
1.7.1. Bactérias entomopatogênicas ...................................................... 20
1.7.2. Os reguladores do desenvolvimento de insetos (IGR) ............... 21
1.7.2.1. Regulação hormonal em insetos ............................................ 22
1.7.2.2. Análogos e antagonistas de hormônio juvenil ..................... 23
1.7.2.3. Análogos ou antagonistas de ecdisona ................................ 24
1.7.2.4. Inibidores de síntese de quitina ............................................. 25
1.7.2.4.1 - Novaluron ......................................................................... 28
2.1. Objetivo Geral ....................................................................................... 30
3. Metodologia ................................................................................................ 31
3 1. Em Laboratório ..................................................................................... 31
3.1.1. Espécimes utilizados nos bioensaios .......................................... 31
3.1.2. Obtenção de larvas e espécimes adultos para os bioensaios ... 32
3.1.3. Inseticidas ....................................................................................... 33
3.1.3.1. Organofosforado – temephos ................................................. 33
3.1.3.2. Inibidor de síntese de quitina – novaluron ............................ 34
3.1.3.3. Piretróide – deltametrina ......................................................... 34
3.1.4. Bioensaios com larvas .................................................................. 34
3.1.4.1. Ensaios tipo dose-resposta .................................................... 34
3.1.4.2. Bioensaios com temephos ..................................................... 34
3.1.4.3. Bioensaios com novaluron ..................................................... 35
3.1.5. Biensaios com adultos ...................................................................... 36
xiii
3.2. Simulado de Campo ............................................................................. 38
3.2.1. Local do estudo .............................................................................. 38
3.2.2. Espécimes utilizados ..................................................................... 39
3.2.3. Inibidor da síntese de quitina ........................................................ 39
3.2.4. Montagem e acompanhamento dos simulados ........................... 39
4. Resultados .................................................................................................. 44
4.1. Em Laboratório ..................................................................................... 44
4.1.1. Temephos ....................................................................................... 44
4.1.2. Deltametrina ................................................................................... 45
4.1.3. Novaluron ....................................................................................... 47
4.2. Simulado de Campo ............................................................................. 55
5 - Discussão .................................................................................................. 68
6. Conclusões ................................................................................................. 78
7. Referências Bibliográficas ........................................................................ 79
1
Resumo
A dengue é um grande problema de saúde pública. Esta arbovirose é
transmitida por mosquitos do gênero Aedes, sendo o principal vetor o Aedes
aegypti. Ainda hoje o alvo principal das campanhas de controle dessa doença é
o vetor e, dentre as possibilidades, o controle químico é ainda a prática mais
comum. Atualmente para o controle de Aedes aegpti no Brasil são utilizados
principalmente os larvicidas temephos e Bti e o adulticida deltametrina.
Detectamos por meio de ensaios tipo dose-resposta, resistência a temephos
nas quatro populações avaliadas - Cuiabá, MT, Uberaba, MG, Aracajú, SE e
Henrique Jorge/Fortaleza, CE. Henrique Jorge foi notadamente a população
com maior alteração na resposta a temephos. Por outro lado, somente Cuiabá
se mostrou sensível a deltametrina, enquanto as outras populações
apresentaram resistência incipiente. Com o aumento da resistência aos
inseticidas químicos usados, novas alternativas de controle, se fazem
necessárias. Dentre estas se encontram os inibidores de síntese de quitina
(CSI). O novaluron é um inibidor da síntese de quitina e foi recentemente
recomendado pela OMS para uso em água potável, o que o qualifica como uma
alternativa viável ao controle de larvas do vetor de dengue. Em condições de
laboratório novaluron apresentou grande eficácia sobre larvas de Aedes aegypti
da cepa Rockefeller: total inibição da emergência de adultos viáveis desta cepa
foi obtida com a concentração 0,4µg/L. Novaluron também se mostrou eficaz
sobre as populações do campo testadas e nenhuma delas apresentou
resistência a este CSI, independente de seu status de resistência aos
inseticidas químicos avaliados. Em simulado de campo, foram avaliadas a cepa
Rockefeller e as populações Aracajú e Henrique Jorge. Com a concentração
20µg/L, o produto mostrou boa persistência em área externa e interna sobre
larvas de Aedes aegypti. Em área externa, no período de março a maio,
mortalidade acima de 70% foi obtida até a sexta semana, enquanto no período
de outubro a dezembro, até a quinta semana. Em área interna, a persistência
do produto foi maior, com mortalidade acima de 70% por oito semanas. O
produto se mostrou eficaz em simulado de campo sobre as populações
testadas, independente do grau de alteração na susceptibilidade a inseticidas
químicos.
2
Abstract
Dengue is a major public health problem. This arbovirus is transmited by Aedes
mosquitoes, and Aedes aegypti is the main dengue vector. Today, the mosquito
vector is still the main target of dengue control campaigns, and chemical control
is the most common practice. Presently in Brasil, Aedes aegypti control makes
use of the larvicides temephos and Bti and of the adulticide deltamethrin. We
detected, through dose-response assays, temephos resistance in the four
populations evaluated: Cuiabá, MT, Uberaba, MG, Aracajú, SE and Henrique
Jorge/Fortaleza, CE. Henrique Jorge was by far the population exhibiting the
most altered temephos profile. In contrast, only mosquitoes from Cuiabá were
susceptible to deltamethrin, other populations exhibiting incipient resistance.
Resistance increase to the chemical insecticides currently used points to the
need of control alternatives. The chitin synthesis inhibitors (CSI) are among
them. Novaluron is a chitin synthesis inhibitor recently recommended by WHO
for use in potable water, an aspect that qualifies this product as a viable
alternative to the control of dengue larvae. In laboratory conditions novaluron
showed high efficacy against Aedes aegypti larvae from the Rockefeller strain:
complete emergency inhibition of viable adults was attained with 0.4 µg/L.
Novaluron was also effective against the field populations assayed – none
exhibited resistance to this CSI, irrespective of their chemical insecticides
resistance status. We evaluated Rockefeller strain and mosquito populations
from Aracajú and Henrique Jorge through field simulated assays. Novaluron was
persistent against Aedes aegypti larvae at 20µg/L, both in external and indoors
areas. In the external area, mortality levels higher than 70% were obtained up to
the sixth week during the period of March-May, and up to the fifth week during
October-December. The persistence of the product was higher in the indoor
area, with more than 70% mortality during eight weeks. Novaluron was effective
against the populations tested in simulated field conditions, independently of
their chemical insecticide susceptible levels.
3
1. Introdução (Como definiria Keyla Belízia Feldman Marzochi:
Dengue – endemia de estimação)
A civilização convive com diversas doenças e muitas destas são
transmitidas por insetos vetores (doenças vetoriais). Dentre estas podemos
destacar a dengue, hoje considerada a arbovirose mais importante transmitida
por mosquitos (Nogueira et al 2001), de maior incidência no mundo e endêmica
em todos os continentes exceto na Europa (Forattini 2002; Claro et al 2004).
Estima-se que 2,5 a 3 bilhões de pessoas vivam em áreas de transmissão de
dengue (lembrando que essas são áreas turísticas em muitos casos), 80
milhões se infectem e que cerca de 21 mil morram em conseqüência da dengue
anualmente (FUNASA 2002; San Martin 2007). A dengue causa mais mortes
em humanos que qualquer outra virose transmitida por mosquitos e é a
segunda doença mais importante transmitida por este grupo de vetores, sendo
superada somente pela malária (Paul et al 2006). A dengue é também
considerada a principal doença reemergente no mundo, e desde o final do
século passado nenhum país conseguiu eliminar novamente seu ciclo de
transmissão (Tauil 2006). Apresenta-se como um grave problema de saúde
pública e uma mazela crescente em muitos países.
1.1. Agente Etiológico
A dengue tem como agente etiológico um arbovírus (“arthropod born”
virus) do gênero Flavivirus, família Flaviviridae (Gluber 1998). Esse arbovírus
apresenta quatro sorotipos, DEN I, DEN II, DEN III e DEN IV, relacionados
filogeneticamente e epidemiologicamente semelhantes (Holmes et al 1998;
Nogueira et al 2001), porém distintos devido a diferenças antigênicas (Monath
1994; OMS 2001). Não existe imunidade cruzada efetiva, ou seja, a infecção
por um sorotipo fornece imunidade por toda a vida contra esse sorotipo, mas
somente parcial e temporária a outros sorotipos (Rigau-Perez et al 1998;
FUNASA 2001a). Os vírus dengue são relativamente pequenos e esféricos,
possuem envelope lipídico e seu ácido nucléico é um RNA fita simples positivo
(Gubler 1998).
4
1.2. A Doença
A infecção ocorre dentro de um espectro de manifestações clínicas
diversificadas e com níveis variáveis de gravidade (Gubler e Clark 1995). A
infecção pode ser assintomática ou pode ainda evoluir benignamente, sendo
nesse segundo caso caracterizada como Dengue Clássica, contudo pode
originar quadros mais graves, como a Febre Hemorrágica da Dengue (FHD) e a
Síndrome de Choque por Dengue (SCD), que podem levar o paciente à morte
(Rigau-Pérez et al 1998).
A dengue clássica é caracterizada por febre e outros sintomas não
específicos, dor de cabeça, dor no corpo, náuseas, vômitos, dor retro-orbitária,
fadiga (Rigau–Perez et al 1998; Casali et al 2004). Os sintomas duram em
média de cinco a sete dias, porém a fadiga pode persistir por mais tempo
(Casali et al 2004). Apesar dos sintomas iniciais da dengue hemorrágica serem
semelhantes ao da dengue clássica, a primeira evolui para quadros de
manifestação hemorrágica (Casali et al 2004). A FHD é definida como febre
aguda, com maior ou menor sangramento de mucosa (podendo ocorrer também
no trato intestinal e em outros locais), trombocitopenia, hipoproteinemia e mais
algumas manifestações clínicas relevantes (Rigau-Pérez et al 1998).
A Síndrome de Choque por Dengue é definida como uma FHD com
sinais de falência circulatória, hipotensão, pele fria e úmida, agitação, dor
abdominal, vômito persistente, letargia e, em alguns casos, podendo levar a
choque. Nos casos de SCD, as enzimas do fígado podem ficar alteradas, mas a
icterícia é rara (Rigau-Pérez et al 1998; OMS/OPAS 2001). A evolução dos
casos de SCD é bem rápida, podendo após o aparecimento de sintomas como
dores abdominais, levar a óbito entre 12 e 24 horas, ou podendo levar a
recuperação também rápida após tratamento correto (Casali et al 2004).
Todos os sorotipos são capazes de causar as formas benignas e
graves da doença. Os fatores responsáveis pela ocorrência das formas graves
ainda não foram totalmente esclarecidos. Imunidade do hospedeiro, infecções
seqüenciais, virulência de determinadas cepas são sempre apontados como
condicionantes dos casos hemorrágicos e de choque (Teixeira et al 1999).
5
Co-infecção com dois sorotipos em humanos (DEN I e II; DEN II e III)
já foi relatada em vários países, incluindo o Brasil. Entretanto, a infecção dupla
não era determinante de casos graves da doença (Araújo et al 2006).
O perfil epidemiológico da dengue varia de acordo com a localidade.
Em algumas regiões, as infecções em crianças até 15 anos são assintomáticas
ou apresentam sintomas brandos. A incidência da doença por faixa etária pode
se modificar com o tempo e com o perfil epidemiológico da população exposta
(Guha-Sapir e Schimmer 2005). O aumento da gravidade da doença parece ser
diretamente proporcional ao aumento da idade do paciente em algumas regiões
do planeta (Rigau-Perez et al 1998). De acordo com estudo sobre a
epidemiologia de dengue realizado por Ribeiro et al (2006) na cidade de São
Sebastião (SP), a incidência da dengue aumenta até 30-39 anos, decrescendo
a partir desta faixa etária. Em relação à distribuição da doença por sexo, o
mesmo estudo mostrou que mulheres possuem maior chance de adquirirem a
infecção.
1.3. Vetores
A dengue é transmitida pela picada de mosquitos infectados do
gênero Aedes (Stegomya) (Ramo Arthropoda, Classe Hexapoda, Ordem
Diptera, Família Culicidae) (FUNASA 2001a). O primeiro a documentar que
mosquitos poderiam transmitir dengue foi Graham (1903 apud Gubler 1997),
mas somente Bancroft em 1906 (apud Gubler 1997) comprovou,
experimentalmente, que Aedes aegypti era vetor da doença. Estudos
subseqüentes mostraram que outros mosquitos do mesmo gênero eram
capazes de transmitir o vírus, o que não foi verificado para Culex
quinquefasciatus (Gluber 1997).
O principal vetor dessa arbovirose é o mosquito Aedes aegypti,
também vetor de febre amarela urbana (Forattini 2002). Nas últimas décadas
Aedes albopictus tem adquirido grande importância na transmissão dessa
doença no continente asiático. Outras espécies também podem atuar como
vetoras dependendo da área geográfica, como Aedes polynesiensis e outros
membros do complexo Aedes scutellaris (Gubler 1998). Essas espécies têm
papel importante na transmissão do vírus dengue em áreas rurais na Ásia e
6
África, apesar de também contribuírem de forma discreta para o ciclo urbano
(Gubler 1987).
1.3.1. Aedes aegypti (Linnaeus, 1762)
É um mosquito, de origem africana, onde podem ser distinguidas
duas subespécies, Aedes aegypti formosus (Walker), pouco antropofílica,
restrita ao continente africano (na África Ocidental) onde se encontra distribuída
em áreas silvestres e rurais (Tabachnick 1991; Bosio et al 1998; Forattini 2002;
Costa-Ribeiro 2006); e Aedes aegypti aegypti antropofílica, com hábitos
domésticos e presente em várias regiões do planeta (Costa-Ribeiro et al 2006).
Essa subespécie é geralmente referida somente como Aedes aegypti.
Provavelmente, Aedes aegypti foi trazido para as Américas durante o
descobrimento, com o tráfico de escravos (Rey 2001) sendo, portanto, uma
espécie exótica. Esse é o melhor exemplo de mosquito sinantrópico, sendo
também endofílico e antropofílico (Lourenço-de-Oliveira 2005). Possui uma
estreita associação com o homem, e por isso é considerado um mosquito
urbano (FUNASA 2001a).
É classificado como um mosquito tropical e subtropical, tendo sua
distribuição limitada pela temperatura (entre os paralelos 35º latitude norte e 35º
latitude sul). Também possui limitações de ocorrência relacionadas à altitude,
sendo encontrado até 1.000m, normalmente, apesar de já ter sido detectado em
altitudes acima deste limite (Donalísio e Glasser 2002; Braga e Valle 2007).
O ciclo de vida do Aedes aegypti consiste de quatro estágios: ovo,
larva, pupa e adulto. As larvas e as pupas são aquáticas, enquanto os adultos
são terrestres.
As fêmeas de Aedes aegypti depositam seus ovos na parede interna
dos recipientes, acima do nível da água, preferencialmente com baixos índices
de poluição (Lopes et al 2006). Geralmente são usados depósitos criados pelo
homem, como vasos de planta, pneus, garrafas e outros. Ocorrido o
desenvolvimento embrionário, quando imersos na água, os ovos eclodem. Os
ovos são muito resistentes à dessecação, podendo se manter viáveis na
ausência de água por até 450 dias; também são resistentes a baixas
temperaturas e outros fatores climáticos. A cada ciclo gonotrófico uma fêmea
7
produz aproximadamente 120 ovos, mas deposita somente cerca de um ou dois
em cada criadouro (Forattini 2002; Tauil 2002).
Durante o desenvolvimento apresentam quatro estádios larvais, todos
saprófitos (mastigam detritos dentro d’água). O estágio larval possui duração
média de cinco dias, mas pode ocorrer em períodos maiores, devido a
condições ambientais desfavoráveis (Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994).
A pupa, que não se alimenta, tem duração aproximada de dois a três
dias; é nessa fase que ocorrem as modificações necessárias para o surgimento
do adulto (Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994).
O adulto possui manchas brancas alternadas com escuras (Rey
2001) o escudo é adornado com escamas branco-prateadas formando um
desenho em forma de lira, de fácil reconhecimento (Lozovei 2001) (Figura 1).
Um espécime adulto de Aedes aegypti vive na natureza por aproximadamente
30 a 35 dias, podendo ser mantido vivo durante meses em laboratório
(FUNASA 2001a; Ribeiro 2006).
Esses mosquitos têm hábitos diurnos, possuem dois picos de
atividade, no início da manhã, até 2-3 horas após a aurora, e à tarde, no
crepúsculo. Entretanto, se alimentam durante todo o dia dentro das casas,
sendo bastante oportunistas (Gubler 1998; Lourenço-de-Oliveira 2005). Tanto
machos quanto fêmeas são encontrados no domicílio. Ambos os sexos se
alimentam de seiva de plantas, sendo que somente a fêmea se alimenta de
sangue, pois este é necessário para o desenvolvimento dos ovos.
As fêmeas de Aedes aegypti são muito agressivas e ariscas e se
afastam do hospedeiro a qualquer menção de perigo (Consoli e Lourenço-de-
Oliveira 1994). Devido a esse comportamento normalmente apresentam
discordância gonotrófica, ou seja, podem necessitar de mais de uma
alimentação sangüínea para o desenvolvimento dos ovos. Essa característica
do mosquito permite que, uma vez infectado e depois do período de incubação
extrínseco (ver item 1.4), possa disseminar o vírus dengue para várias pessoas
em um período curto de tempo (Lourenço-de-Oliveira 2005).
Aedes aegypti, até o momento, é o único mosquito incriminado como
vetor de dengue no Brasil. No entanto, a importância desse culicídeo não se
restringe somente à transmissão de dengue, já que é vetor da febre amarela
8
urbana e também tem papel vetorial no ciclo de transmissão de filarídeos, como
a Dirofilaria immitis (Serrão 1998; Serrão et al 2001; Forattini 2002).
1.3.2. Aedes albopictus (Skuse, 1894)
O Aedes albopictus é outro mosquito exótico que também pode ser
responsável pela transmissão da dengue. É originário da Ásia e provavelmente
foi introduzido no Brasil na década de 1980, tendo seu primeiro registro no país
em 1986 (Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994). Esse culicídeo se dispersou
rapidamente pelo território brasileiro, sendo hoje encontrado em 20 dos 27
estados (Gratz 2004; Braga e Valle 2007). É hoje simpátrico ao Aedes aegypti,
porém possui valência ecológica muito mais ampla (Medronho 1995). Esse
mosquito se dissemina com grande facilidade no peridomicílio, em áreas rurais,
semi-silvestres e silvestres (Lozovei 2001). Seu ciclo biológico também passa
por quatro fases (ovo-larva-pupa-adulto). O adulto possui escudo com faixa
longitudinal de escamas prateadas (Lozovei 2001) (Figura 2). As fêmeas são
mais ecléticas que Aedes aegypti quanto à alimentação, sendo tanto
endofágicas como exofágicas (Lozovei 2001). Apresentam maior grau de
exofilia, sendo menos domiciliares que Aedes aegypti (Forattini 1986). Podem
utilizar criadouros artificiais sem abandonar os naturais (Gomes et al 1999).
É vetor primário de dengue na Ásia, onde está associado à
transmissão no ambiente urbano, rural ou semi-silvestre. No Brasil, Aedes
albopictus ainda não foi incriminado como vetor de dengue, embora larvas
desse mosquito já tenham sido encontradas infectadas com o vírus (Consoli e
Lourenço-de-Oliveira 1994; Gratz 2004). Além disso, populações brasileiras
desse mosquito mostram competência vetorial para os vírus dengue em
laboratório (Forattini 2002; Grartz 2004). Existe uma grande preocupação no
país com relação ao Aedes albopictus, já que esta espécie pode representar
Figura 1. Fêmea de Aedes aegypti; notar escudo adornado com escamas branco-prateadas formando um desenho em forma de lira característico desta espécie.
9
uma ponte entre os ciclos urbano e silvestre da febre amarela, devido a sua
biologia (Forattini 1986; Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994).
Além de seu papel na transmissão de dengue e seu potencial como
vetor de febre amarela, Aedes albopictus está envolvido na transmissão do
arbovírus da encefalite japonesa (Forattini 2002; Gratz 2004).
1.4. Ciclo de Transmissão
O mosquito se infecta ao ingerir sangue virêmico de um hospedeiro.
Após a ingestão, o período de incubação extrínseco é de 12 a 14 dias a 28ºC,
mas varia bastante em função da temperatura a que o mosquito é exposto
(Donalísio e Glasser 2002; Lourenço-de-Oliveira 2005). Esse tempo é
necessário para a replicação e disseminação do vírus no interior do mosquito,
antes de ser detectado na glândula salivar, quando poderá ser transmitido
(Monath 1994). Também é possível a ocorrência de transmissão mecânica,
quando o vírus ainda está no aparelho bucal (Lourenço-de-Oliveira 2005). Um
mosquito infectivo, ao picar uma pessoa susceptível, pode transmitir o vírus. O
período de incubação intrínseco é de três a 14 dias. Após esse período a
pessoa começa a apresentar os sinais e sintomas da doença (Gubler 1998).
Outro aspecto importante é a possibilidade de transmissão entre
mosquitos, como ocorre na transmissão vertical (quando as fêmeas infectadas
passam o vírus aos ovos) e na venérea (machos para fêmeas através do líquido
seminal) (Holmes et al 1998; Lourenço-de-Oliveira 2005). Isso sugere que os
mosquitos possuem importante papel na manutenção dos vírus no ambiente e
podem atuar como reservatórios fundamentais dessa virose, principalmente em
locais temporariamente sem hospedeiros vertebrados susceptíveis. Por outro
lado, existem poucos relatos de transmissão vertical dos vírus dengue em
Figura 2. Fêmea de Aedes albopictus; notar escudo com faixa longitudinal de escamas prateadas, característico desta espécie.
10
humanos (mulheres grávidas aos bebês) mas, quando ocorrem, podem levar a
quadros de DH e SCD nos recém-nascidos (Chye et al 1997).
1.5. Mudanças Climáticas Globais, Vírus Dengue e Vetores
A dinâmica de transmissão da dengue envolve fatores climáticos,
ambientais, sociais, biológicos e mais tantas variáveis (Holmes et al 1998;
Teixeira et al 1998). O fator clima é extremamente importante e por essa razão
alterações na temperatura global têm potencial de causar modificações
importantes na transmissão dessa arbovirose e de outras doenças (Donalísio e
Glasser 2002).
Como é uma doença transmitida por vetores, a distribuição de
dengue se condiciona à capacidade de dispersão do vírus. Mosquitos em
particular são insetos altamente sensíveis a flutuações climáticas, já que vários
aspectos de sua fisiologia variam com a temperatura. Nestes casos, não só a
fisiologia do invertebrado é influenciada, mas também o desenvolvimento do
patógeno (Epstein et al 1998; Oliveira 2004).
Associações entre variações na temperatura e pluviosidade já foram
comprovadas como tendo papel na transmissão da dengue (Ribeiro et al 2006).
Um bom exemplo é o relatado por Oliveira (2004) sobre a transmissão de
dengue em Curitiba, onde até 2001 eram notificados apenas casos importados;
em abril de 2002 apareceram os primeiros casos autóctones. Nesse trabalho, a
autora estabelece relação entre ocorrência de dengue e registro de altas
temperaturas no período estudado.
Vários estudos estão sendo realizados e modelos propostos, de
modo a prever como será a distribuição da dengue no futuro se as previsões de
aumento da temperatura global se confirmarem (Chan et al 1999; Hales et al
2002).
1.6. Controle
Existem vários obstáculos ao controle da dengue, já que ainda não há
medicamentos específicos e uma vacina eficaz ainda não foi desenvolvida. Em
11
função disto, a grande maioria das medidas para controle da dengue são
direcionadas ao Aedes aegypti (Tauil 2002).
O controle de vetores deve ser integrado; esse tipo de controle
consiste na combinação de métodos disponíveis, de maneira eficaz, econômica,
segura e racional, com objetivo de manter as populações do vetor em níveis
aceitáveis (OMS 2001). O controle integrado deve possuir enfoque ecológico,
levando em conta as condições ambientais locais e a dinâmica da população do
vetor (FUNASA 2001b; OMS 2001; Donalísio e Glasser 2002; Braga e Valle
2007).
O controle integrado envolve vigilância epidemiológica, controle físico
(manejo ambiental), controle biológico, controle químico, manejo da resistência
a inseticidas e ações educativas (Rose 2001; Braga e Valle 2007). O controle
integrado de Aedes aegypti tem como foco principal os criadouros (Donalísio e
Glasser 2002).
O controle físico é uma das estratégias mais simples e eficazes para
o combate a vetores e consiste na eliminação (ou pelo menos redução) de
criadouros, através de vários métodos como tratamento de resíduos sólidos,
melhor abastecimento e armazenamento de água, ou seja, medidas de
saneamento básico (FUNASA 2001b; Lozovei 2001; OMS 2001; Donalísio e
Glasser 2002). Também podem ser incluídas outras medidas menos utilizadas
como, por exemplo, a aplicação de produtos que formam uma camada
mononuclear sobre a superfície da água impedindo as formas imaturas de
respirarem o ar atmosférico (Lozovei 2001; OMS 2001; Donalísio e Glasser
2002).
O controle biológico se baseia na utilização de organismos
predadores, parasitas ou qualquer outro ser vivo que possa competir com o
vetor ou reduzir sua população nas formas imatura ou adulta (Teixeira et al
1999; Donalísio e Glasser 2002). Exemplos desse tipo de controle são o
emprego de peixes larvófagos (Gambusia afins), assim como copépodos
(Donalísio e Glasser 2002), fungos, nematódeos, pulgas d’água e larvas de
mosquitos predadores de formas imaturas, como é o caso do Toxorhynchites
(Lozovei 2001; Teixeira et al 2001). As vantagens desse método são nenhuma
contaminação química do ambiente e especificidade contra organismos-alvo
(OMS 2001).
12
O controle químico consiste na utilização de substâncias químicas, às
quais se dá o nome de inseticidas. A prática de usar substâncias químicas
contra os insetos é antiga; em um papiro egípcio de 1500 aC já se encontram
fórmulas para repelir ou matar vespas, pulgas e piolhos (Machado 1987).
Substâncias inorgânicas, como arsênio e enxofre, foram grandes
ferramentas para o controle de insetos, das quais os povos gregos, romanos e
chineses fizeram grande uso para esse fim. Apesar de apresentarem
desvantagens como acumulação nos tecidos orgânicos, longa persistência no
ambiente, alta toxicidade, produtos inorgânicos foram utilizados maciçamente
para o controle de insetos até a Segunda Guerra Mundial (OMS 1997; SUCEN
2000), quando os inseticidas orgânicos sintéticos foram introduzidos no controle
(Ware e Whitacre 2004).
O primeiro inseticida de efeito prolongado, descoberto na década de
1940, foi o DDT (OMS 2001), que parecia a solução para o problema dos
insetos vetores (Lourenço-de-Oliveira 2005). Mas, em função de relatos de
resistência no início dos anos 1960 (OMS 2001), de sua permanência por muito
tempo no meio ambiente (possui meia-vida de 15 anos) e da constatação de
que seus resíduos se concentram no tecido adiposo de alguns animais, esse
inseticida teve sua utilização proibida em muitos países (Forattini 2002; Lima-e-
Silva et al 2002).
Os inseticidas químicos convencionais usados no controle de vetores
podem ser classificados em quatro classes de acordo com a natureza química:
organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides, todos atuando de
alguma forma no sistema nervoso do inseto (Lara e Batista 2002).
Organoclorados – São substâncias que possuem em sua fórmula química os
elementos carbono, hidrogênio e cloro. São conhecidos por outras
denominações como hidrocarbonetos clorados, compostos orgânicos clorados
ou compostos orgânicos clorados sintéticos (Ware e Whitacre 2004). São
inseticidas de baixo custo e grande estabilidade e persistência (Nunes e Tajara
1998).
Alguns dos inseticidas dessa classe tiveram papel determinante na
erradicação e controle de muitos insetos pragas ou vetores (Palchick 1993;
13
SUCEN 2000). Dentro dessa classe podem ser distinguidos quatro grupos:
difenil-alifáticos, hexaclorociclohexanos, ciclodienos e policloriterpenos.
Os difenil-alifáticos incluem o DDT (Figura 3), DDD, dicofol e outros.
O modo de ação desses produtos ainda não foi totalmente esclarecido, mas
sabe-se que atuam no canal de sódio, destruindo o delicado balanço de sódio e
potássio nos axônios dos neurônios, o que altera a transmissão normal dos
impulsos nervosos (Ware e Whitacre 2004).
Os hexaclorohexanos, representados pelo benzenohexacloro (BHC)
comercializado com o nome de lindano, atuam de forma semelhante ao DDT
(Ware e Whitacre 2004). São utilizados para o controle de insetos desde 1942,
mas possuem menor persistência que o DDT (OMS 1997).
Dieldrin é o representante mais conhecido do grupo dos ciclodienos e
teve papel importante no controle de diversos insetos (Figura 3). Após o DDT foi
o segundo inseticida mais utilizado para o controle dos vetores da malária,
(OMS 1997). No entanto, é mais tóxico que DDT e BHC a humanos e animais
(OMS 1997). Os ciclodienos agem inibindo o receptor de ácido gama-
aminobutírico (GABA), o que resulta no impedimento da entrada dos íons
cloreto nos neurônios. Os efeitos observados da exposição aos ciclodienos
parecem ser similares em todos os animais, como alteração na atividade
nervosa, tremores, convulsões e prostração (Ware e Whitacre 2004; Braga e
Valle 2007).
Os policloroterpenos agem de forma semelhante aos ciclodienos e
seus únicos representantes são o toxafeno e o estrobane. Toxafeno tem grande
papel na agricultura, sendo utilizado sozinho ou em combinação com DDT para
o controle de pragas agrícolas (Ware e Whitacre 2004).
Organofosforados - São genericamente qualquer inseticida que possua
fósforo. Nesse grupo são encontrados compostos com uma grande variedade
de combinações de carbono, hidrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre e nitrogênio
(SUCEN 2000; Ware e Whitacre 2004). Suas qualidades como inseticida foram
primeiramente observadas na Alemanha durante a Segunda Guerra Mundial,
em estudos realizados com gases que atuam no sistema nervoso, como sarin
(OMS 1997; Ware e Whitacre 2004). Foram muito utilizados como substitutos
14
dos organoclorados, principalmente onde havia sido detectada resistência a
esses últimos (OMS 1997).
São geralmente mais tóxicos a vertebrados que as outras classes de
inseticidas, mais instáveis e menos persistentes que os organoclorados. O
único OP aprovado para a utilização em água potável até hoje é o temephos.
Apesar do extenso uso dessa classe de inseticidas na agricultura e em saúde
pública, devido a vantagens como sua eficiência, ao fato de serem
biodegradáveis, e não se acumularem nos tecidos, esses produtos são grandes
causadores de intoxicações e mortes em humanos (SUCEN 2000; Ware e
Whitacre 2004; Braga e Valle 2007).
Atuam inibindo uma enzima extremamente importante do sistema
nervoso, a Acetilcolinesterase, o que resulta em acúmulo de acetilcolina nas
sinapses nervosas; com isto, a propagação do impulso nervoso se mantém,
levando à paralisia e conseqüente morte do inseto (Ware e Whitacre 2004;
Braga e Valle 2007). Representantes dessa classe são temephos, malathion,
fenitrothion e outros (OMS 1997) (Figura 3).
Carbamatos – São inseticidas derivados do ácido carbâmico e, assim como os
OPs, agem inibindo a Acetilcolinesterase. No entanto possuem curto poder
residual, ou seja, são muito instáveis, pois são influenciados por vários fatores
como luminosidade, volatilidade, temperatura e umidade (SUCEN 2000; Ware e
Whitacre 2004). O carbaril é o inseticida mais utilizado desse grupo, por ter
baixa toxicidade a mamíferos; além disto tem ação contra um amplo espectro
de insetos (SUCEN 2000; Ware e Whitacre 2004) (Figura 3). Outros exemplos
são o propoxur, fenoxicarb (OMS 1997; Ware e Whitacre 2004).
Piretróides - Os piretróides comercializados atualmente, mais estáveis, são
compostos sintéticos análogos aos componentes obtidos a partir do crisântemo
(SUCEN 2000). Apresentam elevada toxicidade e ação rápida contra uma
grande diversidade de insetos, baixa toxicidade para aves e mamíferos, mas
são tóxicos aos animais aquáticos (OMS 1997; Braga e Valle 2007). Os
piretróides são muito eficientes, ou seja, são necessárias menores quantidades
do ingrediente ativo, o que resulta em menor contaminação do meio. São
biodegradáveis e não se acumulam nos sistemas biológicos (OMS 1997;
15
Casida e Quistad 1998). Alguns piretróides também possuem ação repelente.
Um ponto negativo desses produtos é o alto custo, quando comparado com
outras classes de inseticidas (SUCEN 2000).
Esses produtos possuem modo de ação similar ao do DDT.
Aparentemente atuam mantendo os canais iônicos abertos nas membranas
axonais. Afetam tanto o sistema nervoso central quanto o periférico,
provocando descargas elétricas repetitivas que levam à paralisia (Ware e
Whitacre 2004; Braga e Valle 2007). Exemplos de inseticidas dessa classe são
cipermetrina, deltametrina e permetrina (Figura 3).
16
Figura 3. Estrutura química de inseticidas convencionais. OC = organoclorado, OP = organofosforado, CA = carbamatos, PI = piretróide.
17
1.6.1. Resistência
O grande problema associado ao controle químico é a resistência. A
resistência é o desenvolvimento da habilidade, em uma linhagem de um
organismo, de tolerar doses de toxinas que seriam letais para a maioria das
populações normais (susceptíveis) da mesma espécie (Campos 2001).
Geralmente, os alelos que conferem resistência aparecem em freqüência muito
baixa na população. Porém, com o uso contínuo do inseticida, a cada geração
ocorre a seleção de indivíduos com alelos para a resistência, e assim aumenta
a freqüência de indivíduos resistentes na população. O inseticida não causa
resistência e sim seleciona os indivíduos que possuem alelos que conferem o
fenótipo de resistência.
O primeiro relato de resistência data de 1908 e consiste na
observação da resistência do piolho de São José (Quadraspidiotus perniciosus)
ao enxofre (IRAC-BR 2006), apesar de declarações anteriores sobre esse tema
serem verificadas na literatura, mas sem grande importância (Badii e Almanza
2007). A partir da década de 1940, com a introdução do uso de inseticidas
orgânicos sintéticos, os casos de resistência tiveram um grande acréscimo
(IRAC-BR 2006). A ocorrência de resistência leva ao aumento do número de
aplicações do inseticida, aumento da dosagem ou substituição por outras
substâncias mais tóxicas. Outro grande problema é a resistência cruzada,
quando um mesmo mecanismo confere resistência a dois ou mais compostos
químicos, geralmente relacionados (IRAC-BR 2006; Braga e Valle 2007).
De acordo com Miller (1998), a resistência pode ser classificada em
quatro tipos: comportamental, redução da penetração do inseticida, por
alteração do sítio alvo e resistência metabólica.
Resistência comportamental – Esse tipo de resistência resulta de ações em
resposta à pressão seletiva causada pelo inseticida, que reforçam o
comportamento do inseto de evitar contato com o inseticida (Lockwood et al
1984). É comumente encontrada em insetos expostos a inseticidas aplicados
em superfícies, como ocorre com o DDT (Lockwood et al 1984). Estudos em
campo realizados na África, Índia, Brasil e México sugerem fortemente que
mosquitos vetores da malária apresentam alterações comportamentais de modo
a evitar o contato com superfícies tratadas com DDT (Roberts e André 1994).
18
Redução da taxa de penetração – Insetos que apresentam esse tipo de
resistência possuem menor taxa de penetração do inseticida pela cutícula,
devido a alterações na fisiologia e na química da exocutícula. Esta
característica é conveniente ao inseto, uma vez que menor quantidade do
composto entrará no organismo, o que torna mais provável a detoxificação por
ação das enzimas (IRAC-BR 2006; Badii e Almanza 2007). Este mecanismo
confere resistência secundária, em nível baixo (de duas a quatro vezes), mas
ganha importância quando combinado com outros mecanismos de resistência
(IRAC-BR 2006; Badii e Almanza 2007). Esse tipo de resistência já foi verificado
em diversos insetos e com diferentes inseticidas, como em Aedes aegypti e
organofosforados (Matsuda e Brown 1963), e em Helicoverpa armigera e
piretróides (Ahmad et al 2006).
Alteração do sítio alvo – os inseticidas químicos possuem alvos específicos
dentro do organismo do inseto. A ligação com esses sítios alvo é extremamente
importante e pequenas alterações nesses sítios podem acarretar impedimento
ou dificuldade de interação com o xenobiótico (Russel et al 2004; IRAC-BR
2006; Badii e Almanza 2007; Braga e Valle 2007). Por exemplo, mutações
pontuais em receptores GABA se relacionam diretamente com a resistência a
ciclodienos (Hemingway et al 2004). Mosquitos expostos a inseticidas que
atuam no canal de sódio como o DDT e piretróides, apresentam, após poucos
minutos de contato com a substância, convulsões, com conseqüente paralisia e
morte. Esse tipo de ação é denominado efeito knockdown (apud Martins 2005).
No entanto, alguns insetos apresentam fenótipo kdr (resistência ao knockdown):
uma vez expostos a esse tipo de inseticidas, não desenvolvem paralisia
seguida de morte (knockdown) ou apresentam paralisia seguida de recuperação
motora. Em muitos insetos em que foi investigado, o fenótipo kdr está
relacionado com mutação pontual no canal de sódio, levando à redução de sua
sensibilidade (Stump et al 2004; Braga e Valle 2007).
Resistência metabólica – a detoxificação é o mais estudado mecanismo que
confere resistência a inseticidas (David et al 2005) e envolve a modificação ou o
metabolismo do inseticida, por ação de enzimas presentes previamente no
19
inseto, levando à degradação da molécula do xenobiótico em compostos menos
tóxicos ou a sua completa inativação (Fukuto e Mallipudi 1983; Brogdon e
McAllister 1998a; IRAC-BR 2006). O aumento da detoxificação do inseticida
dentro do inseto pode ocorrer devido à maior eficiência das enzimas ou ao
aumento na quantidade de moléculas das enzimas no inseto (Braga e Valle
2007).
Diversas enzimas podem estar envolvidas na resistência metabólica a
inseticidas, sendo as de maior relevância, as Monooxigenases, Esterases e
Glutationa-S-transferases (Oppenoorth 1984; Yu e Nguyen 1992; David et al
2005). As Monooxigenases dependentes de citocromo P450 são enzimas
extremamente importantes e estão potencialmente envolvidas com a resistência
a todas as classes de inseticidas químicos (Casida 1970; Hemingway e Ranson
2000). Alterações nos níveis de produção de Esterases de insetos parecem
estar relacionadas com a pressão de seleção ocasionada por organofosforados
e carbamatos (Hemingway 2000; Hemingway et al 2004). As Glutationa-S-
transferases são enzimas com grande papel na detoxificação metabólica em
todos os animais e também são relacionadas com a resistência a inseticidas.
Possuem importante papel na detoxificação de organofosforados e DDT (Badii
e Almanza 2007).
1.7. Inseticidas Alternativos
O controle químico continua sendo uma das principais estratégias de
combate de vetores, embora sempre acompanhado do problema da resistência.
A situação se torna crítica, pois enquanto os vetores adquirem resistência aos
inseticidas utilizados, poucos inseticidas novos são desenvolvidos e
comercializados para o controle (Paul et al 2006).
Inseticidas alternativos para o controle de insetos, em particular
vetores de importância médica, são urgentes. Inseticidas alternativos, como
toxinas de bactérias entomopatogênicas (Bt - Bacillus thuringiensis e Bs -
Bacillus sphaericus) e reguladores do crescimento de insetos (IGR – Insect
Growth Regulators) surgem como uma ferramenta para o controle de vetores.
20
1.7.1. Bactérias entomopatogênicas
A descoberta de bactérias capazes de produzir proteínas altamente
tóxicas aos insetos abriu novas perspectivas de controle. As bactérias
entomopatogênicas mais importantes utilizadas para controle de vetores são o
Bacillus sphaericus e o Bacillus thuringiensis (Baumann et al 1991). A atividade
inseticida dessas bactérias se deve a proteinases tóxicas presentes nos cristais
(corpos paraesporais) (Glare e O'Callagham 2000). Os corpos paraesporais,
quando ingeridos por inseto susceptível, são dissolvidos no intestino médio do
inseto. Em seguida as protoxinas são liberadas e convertidas, pelas enzimas do
intestino médio, em toxinas. Essas se ligam aos receptores contidos nas células
do intestino e iniciam sua ação (Aronson et al 1986; Glare e O'Callagham 2000).
Em conseqüência são produzidos poros na membrana das células do epitélio
do intestino médio, quebrando o balanço eletrolítico e causando lise, o que leva
à paralisia e morte por inanição (o inseto não consegue se alimentar) e/ou por
septicemia (Aron et al 1986; Glare e O'Callagham 2000; Lima et al 2005).
Bacillus sphaericus produz cristais com duas proteínas e é
extremamente ativo sobre larvas de Culex sp e Anopheles sp, apesar de
apresentar pouca atividade sobre Aedes aegypti. Um ponto positivo é que Bs é
capaz de resistir em água poluída (Baumann et al 1991). No entanto,
resistência de mosquitos a Bs já foi amplamente descrita em laboratório
(Rodcharoen e Mulla 1994; Wirth et a. 2000; Zahiri et al 2002) e em campo
(Rao et al 1995; Yuan et al 2000; Mulla et al 2003b).
Bacillus thuringiensis apresenta grande variedade de cepas, com
ação diferenciada sobre várias ordens de insetos. O Bacillus thuringiensis
sorovar israelensis é uma variedade que apresenta quatro toxinas, sendo muito
ativo contra larvas de Aedes e Culex e também contra larvas de simulídeos, no
entanto, possui pouca persistência em água poluída (Bauman et al 1991). Essa
bactéria atualmente é uma das alternativas para o controle de larvas de Aedes
aegypti no Brasil.
Com relação ao Bt ainda não foi detectada resistência em insetos
vetores, mas já há relatos de populações de campo da mariposa Plutella
xylostella resistentes ao Bt em diversas localidades (Bauer 1995). No entanto, o
problema atual no uso de Bti para o controle é a sua baixa persistência em
21
campo (no máximo quatro semanas) devido a sua grande sensibilidade a
fatores ambientais como calor e luz (Lima et al 2005).
1.7.2. Os reguladores do desenvolvimento de insetos (IGR)
Os IGR surgiram na década de 1970 como produtos que poderiam
substituir os inseticidas convencionais (Martins e Silva 2004). São considerados
a terceira geração de inseticidas (após os inorgânicos e os orgânicos sintéticos)
(Casida e Quistad 1998). O potencial de uso dessas substâncias para o
controle de insetos ocorreu devido à descoberta acidental do “fator papel”:
(Slama e Williams 1966) pesquisadores de Harward observaram que culturas
do percevejo Pyrrhocoris apterus apresentavam baixa oviposição e larvas
supranumerárias e verificaram que esses efeitos no desenvolvimento proviam
de uma substância presente no papel utilizado nos recipientes onde esses
insetos eram mantidos. A substância foi classificada como um análogo de
hormônio juvenil derivado da planta Abis balsamea, árvore utilizada nos EUA
para produção de papel (Tunaz e Uygun 2004).
Diferente do observado com os inseticidas químicos convencionais,
os IGR atuam seletivamente no desenvolvimento, metamorfose e reprodução
dos insetos-alvo, ao invés de promoverem intoxicação direta (Hoffmann e
Lorenz 1998; Martins e Silva 2004). Os IGR não são necessariamente tóxicos
aos insetos-alvo; ao invés disto, causam anormalidades que os impedem de
sobreviver ou alcançar o estágio adulto (Tunaz e Uygun 2004). Apresentam
grande atividade sobre os estágios imaturos de mosquitos e outros insetos
interferindo com seu desenvolvimento e, com isto, reduzindo a emergência de
adultos viáveis (“inibição da emergência”, ou IE).
Grande parte dos IGR são eficazes contra os vetores, incluindo (na
grande maioria dos casos) aqueles que apresentam resistência aos inseticidas
convencionais, pois seu mecanismo de ação é distinto (Silva e Mendes 2002;
Thavara et al 2007).
Os IGR podem ser divididos em três tipos, dependendo do seu modo
de ação: os análogos e antagonistas de hormônio juvenil; análogos e
antagonistas de ecdisona inibidores de síntese de quitina (CSI - chitin synthesis
inhibitor) (Graf 1993; Hoffmann e Lorenz 1998; Kostyukpvsky e Trostanetsky
2006).
22
Um ponto positivo dos IGR é sua baixa toxicidade aos mamíferos e
degradação rápida no ambiente (Kostykovisky e Trostanetsky 2006). Apesar de
serem mais específicos que os inseticidas químicos convencionais, uma
questão que envolve a utilização dos IGR é sua possível ação sobre artrópodes
não-alvo, causando algum dano aos ecossistemas. Contudo, vários autores
vêm demonstrando que os efeitos dos IGRs no meio ambiente são de pouco
impacto (Ali e Kok-Yokomi 1989; Arredondo-Jiménez e Valdez-Delgado 2006) .
Quando falamos da utilização desses compostos para o controle de Aedes
aegypti, a relevância de um possível dano a espécies não-alvo deve ser
entendida de forma diferenciada, já que o vetor possui hábitos domésticos,
tendo como principais criadouros objetos criados pelo homem (Martins e Silva
2004).
Os IGRs possuem efeitos na IE, mas também podem causar
alterações na reprodução, como verificado por Silva e Mendes (2002) em pupas
de Haematobia irritans. Arias e Mulla (1975) também puderam observar
alterações reprodutivas em Culex tarsalis expostos a IGRs. Contudo não é com
todo IGR que se verifica comprometimento de adultos, resultante da exposição
larval. Este foi o caso verificado por Braga et al (2005b) que não observou
alteração na capacidade de colocar ovos das fêmeas de Aedes aegypti
expostas a IGR durante os estágios imaturos.
1.7.2.1. Regulação hormonal em insetos
O papel de hormônios sobre os processos de muda e
desenvolvimento dos insetos foi verificado primeiramente por Wigglesworth, em
1934. Hoje, sabe-se que três hormônios estão envolvidos no crescimento,
desenvolvimento e muda dos insetos: hormônio protoracicotrópico (PTTH),
hormônio juvenil e ecdisona (Tunaz e Uygun 2004).
O hormônio juvenil (HJ), produzido na corpora allata (órgão situado
na base do cérebro), define o caráter da muda. Quando presente, mantém a
característica juvenil do inseto depois da muda, sua ausência leva a muda para
o estágio adulto (Valle 1993; Chapman 1998). No adulto, regula a vitelogênese
em muitos grupos, sendo produzido em diferentes órgãos, como corpo
gorduroso e ovários, dependendo do inseto (Valle 1993). O PTTH, produzido
nas células neuro-secretoras e armazenado na corpora cardiaca, induz a
23
produção de ecdisona na glândula protorácica. O hormônio ecdisona, produzido
na glândula protorácica, induz a muda nos estágios imaturos. Em alguns
insetos, como os mosquitos, no estágio adulto está envolvido na capacitação
dos ovários na endocitose de vitelogenina da hemolinfa (Valle 1993; Tunaz e
Uygun 2004; Lourenço-de-Oliveira 2005).
A regulação hormonal tem grande potencial de controle e existem
hoje no mercado análogos e antagonistas de hormônios dos insetos disponíveis
para o controle.
1.7.2.2. Análogos e antagonistas de hormônio juvenil
Análogos, ou mímicos, de hormônio juvenil agem de forma
semelhante ao hormônio juvenil produzido pelo próprio inseto. No entanto, a
presença de análogos de hormônio juvenil, nos estágios imaturos de insetos,
em concentração superior a que normalmente seria encontrada pode levar a
várias conseqüências. As mais pronunciadas são anormalidades morfológicas,
como mudas que levam a estágios com tamanho maior que o esperado,
estádios supranumerários de larvas ou estágios intermediários entre larva e
pupa - ou pupa e adulto (Wright 1976). Além de sua utilização no controle de
insetos, os análogos de hormônio juvenil são usados na produção de seda:
quando aplicados sobre Bombyx mori, provocam extensão dos estádios larvais
(Miranda et al 2002). Exemplos de produtos com esse tipo de atividade são
methoprene, hydroprene, fenoxycarb, pyriproxifen (Graf 1993) (Figura 4).
Existem muitos trabalhos mostrando o efeito dos análogos de
hormônio juvenil no controle de diversos insetos, como o realizado por Arthur
(2003), que verificou o potencial de hydroprene sobre Tribolium castaneum e
Tribolium confusion ou Seng et al (2006), mostrando o efeito de pyriproxifen
sobre a IE de Aedes aegypti. Alterações reprodutivas também são causadas
por análogos de hormônio juvenil, como observado em Liriomyza trifolii com
methoprene por Robb e Parrella (1984); o mesmo foi demonstrado por Mulla et
al (1985), quando também verificaram esse tipo de alteração avaliando o efeito
de fenoxycarb sobre mosquitos. Ação de methoprene e pyriproxifen sobre ovos
de pulgas de gato Ctenocephalides felis foi observada por Palma et al (1993),
mostrando o efeito ovicida do mesmo.
24
Braga et al (2005a) comprovaram que populações de Aedes aegypti
de várias localidades do Brasil resistentes a temephos eram susceptíveis ao
IGR methoprene, um análogo de hormônio juvenil. Entretanto, já foram
relatados alguns casos de resistência cruzada em insetos de importância para a
agricultura entre diferentes IGRs e entre IGRs e outros inseticidas, como os
organofosforados (Tunaz e Uygun 2004).
Apesar de William (1956) postular que seria muito improvável que
insetos desenvolvessem resistência a seus próprios hormônios (William 1956;
William 1959), existem alguns relatos de resistência a análogos de hormônio
juvenil, em Musca domestica (Cerf e Georghiou 1972), Bemisia tabaci (Ishaaya
e Horowitz 1995) e em Drosophila melanogaster (Wilson e Thruston 1998).
Antagonistas de hormônio juvenil parecem agir interferindo nas
corpora allata e prevenindo a secreção de hormônio juvenil. Aplicação do
antagonista de hormônio juvenil, 2-(2-ethoxyethoxy)ethyl furfuryl, sobre ninfas
de triatomíneos leva a diversos alterações morfológicas (Jurberg et al 1997).
Outros exemplos são: precoceno I e II, fluoromevalonate, mevinolin e fluvastatin
(Graf 1993; Hoffmann e Lorenz 1998) (Figura 4).
1.7.2.3. Análogos ou antagonistas de ecdisona
Agonistas de ecdisona agem induzindo muda prematura em larvas,
em qualquer momento do desenvolvimento. Podem agir também nos ovários de
fêmeas adultas, impedindo a oviposição. Tebufenozide e methoxofenozide (este
com ação principal sobre Lepidoptera) são exemplos dessas substâncias
(Figura 4). Trisyono e Chippendale (1997) verificaram eficácia dos compostos
RH-2485, RH-5992 e RH-5849 sobre Aedes aegypti e Anopheles gambiae.
Resistência a tebufenozide já foi observada em Cydia pomonela (Grafton-
Cardwell 2005) e Culex quinquefasciatus (Beckage et al 2004).
A utilização dos análogos de ecdisona para o controle de insetos
envolve o custo da produção já que geralmente essas substâncias possuem
composição muito complexa para a comercialização e também devido a
possibilidade de atividade cruzada com hormônios esteróides de mamíferos.
Azadiractina é uma substância que age inibindo a síntese do
hormônio protorácicotrópico, que estimula a produção de ecdisona, sendo
portanto um antagonista de PTTH o que, como conseqüência, leva à inibição da
25
produção de ecdisona (Figura 4). No entanto, a azadiractina tem estrutura muito
complexa, o que tornaria inviável o preço de sua utilização no controle de
vetores (Graf 1993).
1.7.2.4. Inibidores de síntese de quitina
A quitina é o segundo polímero biológico mais abundante, depois da
celulose. É um homopolímero de N-acetilglicosamina, formando microfibrilas de
aproximadamente 3 nm de diâmetro. Esse polímero é produzido em grande
quantidade nos invertebrados insetos e crustáceos, e em menor quantidade em
moluscos, anelídeos e nematódeos (ovos). A quitina também é componente da
parede celular dos fungos, exceto Oomycetos (Cohen 2001).
A quitina é componente majoritário da cutícula que reveste
externamente o corpo dos insetos. Também está presente em alguns tecidos do
intestino, como no papo, intestino anterior e posterior, formando uma camada
cuticular que os reveste internamente (Tellam et al 2000). É também parte da
matriz peritrófica, que funciona como uma barreira entre o bolo alimentar e o
epitélio do intestino médio (Merzendorf e Zimoch 2003). Outras estruturas do
corpo dos insetos também possuem quitina, como as traquéias, que possuem
um tubo cuticular (íntima) revestindo seu interior (Tellam et al 2000).
A cutícula do exoesqueleto dos insetos possui três diferentes
camadas: epicutícula, exocutícula e endocutícula (Tellam et al 2000). A quitina
é componente fundamental do exoesqueleto, estando presente na endocutícula
e exocutícula, mas não na epicutícula. A quitina fornece ao exoesqueleto
suporte mecânico e estrutural, funcionando como uma barreira de proteção
contra as agressões ambientais. Devido à rigidez de seu exoesqueleto os
insetos, para crescer, necessitam realizar mudas periódicas (Bogwitz 2005).
Para produzir um novo exoesqueleto, são necessárias várias etapas que
envolvem degradação da cutícula antiga, síntese dos componentes da nova
cutícula e “montagem” da nova cutícula. No entanto, os processos de produção,
transporte e deposição da quitina que comporá o exoesqueleto envolvem
complexas transformações bioquímicas e biofísicas, intra e extracelulares, que
na sua maioria permanecem não entendidas (Cohen 2001; Menzerdorf 2005).
A ausência de quitina nos vertebrados faz com que os inibidores de
síntese de quitina (CSI) possam ser usados como uma potencial ferramenta
26
específica para o controle de insetos e fungos. Os CSI podem ser diferenciados
em dois grandes grupos: os peptidil-nucleosídeos, que atuam sobre fungos, e
as benzoil-fenil-uréias (BPU), que possuem grande ação sobre insetos (Cohen
2001; Merzendorf e Zimoch 2003).
Diversas substâncias são capazes de inibir a síntese de quitina em
insetos; no entanto, a maior parte dos CSI usados no controle de insetos
pertencem ao grupo das benzoil-fenil-uréias (Merzendorf e Zimoch 2003;
Merzedorf 2005), sendo o diflubenzuron o primeiro composto desse grupo
comercializado como inseticida (Tunaz e Uygun 2004). O potencial das BPU foi
descoberto acidentalmente, quando cientistas sintetizavam um herbicida
combinando dichlobelnil e diuron (Graf 1993; Cohen 2001). Depois do sucesso
de diflubenzuron para o controle, uma gama de novos compostos BPU
apareceram para o controle de diversos insetos (Graf 1993) (Figura 4).
O modo de ação das benzoil-fenil-uréias ainda não está
completamente esclarecido. No entanto, existe evidência experimental de que
esses compostos interferem na atividade ou na biossíntese da quitina-Sintase,
que é a enzima-chave da via metabólica de síntese de quitina (Tellam et al
2000; Merzendorf e Zimoch 2003). Mas também existem sugestões de que
possam atuar inibindo proteases, agindo sobre a cascata que leva à produção
do monômero de N-acetilglicosamina ou ainda impedindo o transporte ou fusão,
inibindo a translocação das fibras de quitina sobre a membrana plasmática
(Merzendorf e Zimoch 2003; Tunaz e Uygun 2004; Bogwitz 2005).
Por interferir no metabolismo da quitina, que é crucial para o
desenvolvimento dos insetos, as benzoil-fenil-uréias provocam alterações na
formação da cutícula durante o desenvolvimento, podendo causar muda
abortiva. Alterações em outras estruturas que possuem quitina na sua
composição, como a matriz peritrófica, também podem ser observadas
(Merzendorf 2005). Além dos efeitos sobre as larvas, pode ocorrer inibição da
pupação e os adultos derivados de larvas sobreviventes de doses sub-letais
podem ter várias alterações na sua morfologia e fisiologia.
As BPUs possuem efeito pronunciado sobre larvas, que não
conseguem sobreviver à muda devido a malformações da nova cutícula (Graf
1993). A ação desses CSI já foi comprovada sobre vários insetos. Charmillot et
al (2001) usaram diflumuron, hexaflumuron e triflubenzuron sobre Cydia
27
pomonella e concluíram que essas substâncias possuem grande potencial
larvicida e ovicida. Larvas de Drosophila melanogaster alimentadas com
lufenuron morrem durante a ecdise; os adultos sobreviventes a doses sub-letais
são incapazes de voar (Wilson e Cryan 1997).
Efeitos dos CSI sobre mosquitos também já foram observados. Batra
et al (2005) demonstraram que 0,2 ppm de triflumuron produz, em laboratório,
100% de inibição da emergência de adultos de Anopheles stephensis, Aedes
aegypti e Culex quinquefasciatus. A ação de diflubenzuron sobre mosquitos
também é comprovada, com redução da emergência de adultos, quando usado
na concentração 0,1 ppm, de 85 a 90% para Aedes aegypti e de 48% para
Culex quinquefasciatus (Martins e Silva al 2004). Esses mesmos autores
observaram que diflubenzuron atua em todos os estágios larvais de Aedes
aegypti. Por outro lado Braga et al (2005b) observaram que methoprene, um
análogo de hormônio juvenil, como esperado, revelou-se ativo apenas contra
larvas de quarto estádio, indicando que os CSI podem ser ainda mais eficazes
contra o vetor em questão que outros IGR.
Essas substâncias podem provocar danos morfofisiológicos. Um
extenso trabalho avaliando efeitos de dose sub-letal de CSI sobre Aedes
aegypti foi realizado no Laficave: Belinato (2007) descreve comprometimento
em diversos aspectos do desenvolvimento e da reprodução de espécimes
adultos de Aedes aegypti expostos durante os estágios imaturos a triflumuron.
Algumas das observações dos autores foram: diferenças na proporção entre
machos e fêmeas adultos, longevidade reduzida dos insetos tratados, redução
na atividade locomotora, menor ingestão de sangue, menor capacidade de
copular e, em conseqüência, menos ovos viáveis. Alterações na capacidade de
voar também foram verificadas por Wilson e Cryan (1997) em adultos de
Drosophila melanogaster expostos na fase larval ao lufenuron, outro inibidor de
síntese de quitina.
Um importante CSI não-BPU é a ciromazina (Figura 4). Este derivado
de triazina possui efeito na síntese de quitina, interferindo na muda e pupação.
Este composto apresenta grande atividade contra larvas de Diptera (Graf 1993;
Ware e Whitacre 2004).
28
1.7.2.4.1 - Novaluron
O novaluron (Figura 4) é um novo CSI, já usado na agricultura,
exibindo grande eficácia contra larvas de Coleoptera, Homoptera e Lepidoptera,
pragas de colheita (Mulla et al 2003a). Novaluron é pouco tóxico aos mamíferos
e não tóxico para aves, vermes do solo e microflora (OMS 2003). Apesar de
novaluron ter sido, por vezes, considerado tóxico aos invertebrados aquáticos,
sua baixa persistência do produto em sistemas aquáticos indica que não há
exposição crônica significativa e que os riscos a longo prazo aos crustáceos
devem ser considerados aceitáveis (OMS 2003).
Esse CSI age por ingestão, como verificado para larvas Spodoptera
littoralis e Helicoverpa armigera, e por contato sobre Bemisia tabaci e
Trialeurodes vaporariorum (Ishaaya et al 1996; 1998).
Seus efeitos sobre larvas de Tribolium castaneum já foram
comprovados por Kostyukpvsky e Trostanetsky (2006). Sua utilidade contra
mosquitos foi avaliada sobre Culex quinquefasciatus por Su et al, em 2003,
quando se verificou intensa atividade contra esse mosquito. Esse inseticida
mostrou eficácia igual ou superior a outros IGRs usados para controle de
mosquitos nos EUA, como diflubenzuron e pyriproxifen (Mulla et al 2003a).
Neste mesmo trabalho foi confirmada a eficácia de novaluron sobre Aedes
aegypti, que é mais susceptível ao composto que Culex quinquefasciatus.
Arrendondo-Jiménez e Valdez-Delgado (2006) verificaram o impacto
de novaluron (ver item 1.7.2.4) sobre artrópodes não-alvo e concluíram que o
efeito desse produto varia de acordo com a espécie. Esses mesmos autores
não encontraram impacto para a maioria das famílias de insetos não-alvo
expostas ao produto.
Por sua baixa toxicidade, novaluron foi recentemente recomendado
pela OMS para aplicação em água potável, e com isso pode se tornar uma
grande ferramenta nos programas de controle de Aedes aegypti (OMS 2007).
29
methoprene (AnHJ) precocene I (AtHJ)
tebufenozide (AE)
azadiractina (AtE)
diflubenzuron (CSI)
novaluron (CSI) ciromazina (CSI)
Figura 4. Estrutura química de reguladores do desenvolvimento de insetos. AnHJ = Análogo de hormônio juvenil; AtHJ = Antagonista de hormônio juvenil; AE = Análogos de ecdisona; AtE = Antagonista de Ecdisona; CSI = inibidor de síntese de quitina.
30
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Avaliar o efeito de novaluron sobre a inibição da emergência de populações de
Aedes aegypti com diferentes níveis de resistência a inseticidas químicos em
condições de laboratório e de simulados de campo.
2.2. Objetivos Específicos
Em Laboratório
a) Verificar o status de resistência a temephos de populações de campo de
Aedes aegypti em comparação com a cepa Rockefeller.
b) Verificar o status de resistência a piretróides de populações de campo de
Aedes aegypti em comparação com a cepa Rockefeller.
c) Avaliar o efeito de novaluron sobre a emergência de adultos (IE50 e IE90)
da cepa Rockefeller, padrão de susceptibilidade a inseticidas para A.
aegypti.
d) Avaliar o efeito de novaluron sobre a emergência de adultos (IE50 e IE90)
das populações de campo de Aedes aegypti com diferentes níveis de
resistência aos inseticidas químicos usados no controle do vetor.
e) Classificar as anormalidades morfológicas observadas nos espécimes
mortos nos ensaios realizados em laboratório utilizando novaluron.
Em Simulado de Campo
Avaliar a persistência de novaluron em condições simuladas de campo, em
áreas interna e externa, usando a cepa Rockefeller e duas populações
sabidamente resistentes a temephos, em duas estações do ano, com climas
diferentes.
31
3. Metodologia
3 1. Em Laboratório
3.1.1. Espécimes utilizados nos bioensaios
Nos bioensaios foram avaliadas quatro populações de Aedes aegypti,
sendo elas, Henrique Jorge/Fortaleza, CE, Aracajú, SE, Cuiabá, MT e Uberaba,
MG (Figura 5). Ovos dessas populações foram coletados por meio de
ovitrampas (Braga et al 2000), seguindo o protocolo definido para coleta no
campo das populações do vetor que são submetidas ao monitoramento da
resistência a inseticidas (Lima et al 2003). As ovitrampas, preparadas segundo
metodologia descrita por Fay e Eliason (1966), foram distribuídas nas cidades
de origem por solicitação da Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da
Saúde (SVS-MS) ao Núcleo de Entomologia da Secretaria de Saúde de cada
Estado. A determinação do número de ovitrampas instaladas se baseou no
número de moradias em cada município amostrado (como medida indireta da
densidade populacional): municípios com até 60.000 moradias receberam 100
ovitrampas, de 60.000 a 120.000 residências, 150 ovitrampas, de 120.000 a
500.000, 200 ovitrampas e em localidades acima de 500.000 foram instaladas
300 ovitrampas (Lima e cols., 2003). As ovitrampas, distribuídas de modo a
cobrir o município da forma mais ampla possível, foram mantidas em campo por
cinco a sete dias.
Para a realização dos bioensaios foram utilizadas as gerações F1 até
F4. A cepa Rockefeller foi utilizada em todos os bioensaios como padrão de
susceptibilidade. Essa cepa foi originalmente estabelecida no Rockefeller
Institute (Nova York, NY) por DW Jenkins em 1959 e é padrão de
susceptibilidade a inseticidas para a espécie Aedes aegypti em todo o mundo
(Hartberg e Craig-Jr 1970).
32
Figura 5. Localidades brasileiras de onde foram obtidas as populações de Aedes aegypti avaliadas.
3.1.2. Obtenção de larvas e espécimes adultos para os bioensaios
Na rotina do laboratório, após o recebimento das paletas das
populações, os ovos são postos a eclodir e a criação das larvas e pupas é
realizada. Essas últimas são separadas em copos plásticos com capacidade
para 50 mL e transferidas para gaiolas de papelão (16,5 cm de diâmetro por
17,5 cm de altura), identificadas com o nome da respectiva população, onde
são mantidas até a emergência dos adultos. Após a emergência, os adultos
permanecem nessas gaiolas e os copos com as exuvias são removidos. A
alimentação dos adultos é realizada com fornecimento “ad libitum” de
alimentação açucarada a 10%. Os adultos passam por triagem para separação
da espécie de interesse, Aedes aegypti, e de outras espécies que também
possam ter sido coletadas.
Cuiabá (MT)
Aracajú (SE)
Fortaleza (CE)
Uberaba (MG)
33
Para obtenção de ovos das gerações seguintes, às gaiolas com
mosquitos já triados é fornecida alimentação sangüínea (realizada com cobaios,
de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais
da Fiocruz – CEUA). Após três dias, tempo necessário para digestão do sangue
e maturação dos ovos, são colocados copos de postura com água, recobertos
internamente por pequenas tiras de papel-filtro, onde as fêmeas grávidas fazem
a oviposição. As tiras de papel-filtro com ovos dessas populações são
identificadas conforme as gerações e armazenadas em ambiente com
temperatura controlada. No caso da cepa Rockefeller, ovos são obtidos a partir
da colônia mantida no laboratório há vários anos.
Para os bioensaios com larvas, pedaços de papel-filtro com ovos são
colocados em copos plásticos contendo água de criação (água retirada das
bacias com larvas), passada por uma peneira antes de utilizada, como estímulo
à eclosão. Após uma hora (dependendo da idade dos ovos é necessário um
tempo maior de eclosão), as larvas que eclodiram são transferidas, em grupos
de cerca de 1.000, para bacias plásticas retangulares (33 X 24 X 8 cm)
contendo um litro de água desclorada e 1 g de ração para gatos (Friskies®,
Purina, Camaquã/RS). No caso de ensaios com larvas, essas permanecem nas
bacias por três dias ou até alcançarem o terceiro estádio larval (L3).
No caso de bioensaios com adultos, as larvas permanecem nas
bacias até alcançarem o estágio de pupa, quando são transferidas para gaiolas,
como já descrito acima. Para os ensaios são utilizadas fêmeas de 1 a 3 dias
após a emergência, não alimentadas com sangue.
Toda criação de espécimes para os bioensaios foi realizada em
insetário com temperatura controlada (26±1ºC).
3.1.3. Inseticidas
3.1.3.1. Organofosforado – temephos
Para a realização dos bioensaios com temephos, uma solução
estoque a 3 g/L foi preparada em etanol PA, com o temephos grau técnico
(Fersol 90%). Essa solução estoque foi mantida a 4-10ºC, podendo ser utilizada
por até um mês para o preparo das soluções de uso. A solução de uso era
preparada 15 minutos antes da montagem do bioensaio, também em etanol PA.
34
3.1.3.2. Inibidor de síntese de quitina – novaluron
Novaluron 100 CE (Rimon) foi utilizado nos bioensaios de avaliação
da inibição da emergência de adultos de Aedes aegypti. Alíquotas de 0,1 g/L
foram preparadas em acetona e mantidas em congelador a -80ºC até o uso.
Uma solução de 500 µg/L era preparada 15 minutos antes de cada bioensaio e
utilizada para obtenção das concentrações desejadas.
3.1.3.3. Piretróide – deltametrina
Deltametrina grau técnico (Bayer 99,1%) foi utilizada para os ensaios
com adultos. Alíquotas de 0,1g/L foram preparadas em acetona e armazenadas
em congelador a -80ºC. Essas alíquotas eram retiradas do congelador
momentos antes da impregnação das garrafas com inseticida.
3.1.4. Bioensaios com larvas
3.1.4.1. Ensaios tipo dose-resposta
Esses ensaios consistem na exposição de larvas a um espectro de
concentrações do produto, de modo a determinar as concentrações efetivas:
Concentração Letal (CL), para temephos e Inibição da Emergência (IE), para
novaluron. Primeiramente, os testes foram realizados com a cepa de referência,
uma vez que os valores de razão de resistência das populações são obtidos a
partir da razão entre os dados de CL ou IE das populações e os valores
correspondentes da cepa de referência (OMS 1981; Mazzari e Georghiou 1995;
OMS 2005).
3.1.4.2. Bioensaios com temephos
Os bioensaios tipo dose-resposta com temephos foram realizados de
acordo com as recomendações da OMS (1981) e seguindo o protocolo já
padronizado no laboratório (Lima et al 2003; Montella 2007). Grupos de 20
larvas de terceiro estádio foram separados e transferidos para copos plásticos
com capacidade para 50 mL, sendo esses copos preenchidos até 20 mL com
água desclorada. As larvas eram então mantidas em repouso por 30 minutos e
após esse período, larvas mortas eram substituídas.
35
Foram utilizadas, em cada ensaio, 11 concentrações, sendo que para
cada uma destas eram preparados quatro copos. Quatro copos adicionais eram
utilizados como controle do ensaio. Esses copos, plásticos com capacidade
para 200 mL, eram identificados e preenchidos com 80 mL de água desclorada.
Em seguida era retirado, com auxílio de uma pipeta automática, 0,5 mL de cada
copo, inclusive dos copos-controle. Acrescentava-se o volume de produto
necessário para cada concentração e o volume de solvente, de modo a repor o
volume (0,5 mL) removido dos copos. Nos copos-controle era adicionado
apenas 0,5 mL do solvente.
Quinze minutos depois da montagem do ensaio e aplicação do
inseticida nos copos, as larvas eram transferidas aos copos junto com os 20 mL
de água, completando 100 mL, o volume final de solução em cada réplica
(Figura 6a).
Todos os ensaios foram realizados em ambiente com temperatura e
umidade controladas (26±1ºC e 60-70%). As larvas eram mantidas em contato
com o produto por 24 horas, quando era realizada a leitura, sendo computados
os números de larvas vivas e mortas. Os critérios utilizados para determinação
da mortalidade das larvas foram aqueles propostos pela OMS (1981). Após a
leitura as larvas eram desprezadas.
Todos os ensaios foram repetidos três a quatro vezes, em dias
diferentes. Os resultados obtidos foram avaliados por meio de análise Probit
(Raymond 1985).
3.1.4.3. Bioensaios com novaluron
Os ensaios com larvas utilizando o inibidor de síntese de quitina
foram realizados segundo protocolo já estabelecido no laboratório (Bellinato
2007).
Foram testadas oito concentrações (0,05 µg/L, 0,1 µg/L, 0,15 µg/L,
0,2 µg/L, 0,25 µg/L, 0,3 µg/L, 0,35 µg/L, 0,4 µg/L). Para cada concentração
eram utilizados oito copos plásticos transparentes com capacidade para 300 mL
netes eram adicionados 150 mL de água desclorada. Nos copos experimentais
era então adicionada a solução com inseticida. O controle consistia de quatro
copos montados da mesma maneira, porém sem a adição de novaluron. No
lugar deste, adicionava-se 120 µL (maior volume de solução do produto
36
adicionado aos copos experimentais do solvente acetona), utilizado na diluição
deste IGR. Uma pequena quantidade de ração para gatos (Friskies®, Purina,
Camaquã/RS) era acrescentada a cada copo. Essa quantidade de comida,
suficiente para todo o período do ensaio, era aplicada somente uma vez, no dia
da montagem do experimento (Figura 6b).
Depois de 30 minutos do preparo dos copos, 10 larvas (L3)
previamente separadas eram transferidas para os mesmos com auxílio de uma
peneira de nylon (Falcon cat 2350). Após três dias da montagem do teste, os
copos eram ocluídos com tela de nylon, presa por um elástico, para evitar a fuga
de adultos que viessem a emergir.
As larvas e pupas permaneciam expostas ao produto durante todo o
experimento e a mortalidade por estágio era avaliada diariamente, sendo que o
sucesso na emergência (adultos vivos) era obtido pela contagem de exúvias
limpas (Mulla 1974; Mulla et al 2003a); mosquitos presos à exúvia eram
considerados mortos. Deformidades observadas nos estágios imaturos e nos
adultos emergidos também foram registradas, por meio de fotografia em
microscópio estereoscópico.
Os testes eram considerados encerrados quando não havia mais
larvas e/ou pupas vivas nas réplicas. Todos os ensaios foram realizados em
ambiente com temperatura e umidade relativa controladas, de 26±1ºC e 60-70%
respectivamente.
Os ensaios foram repetidos no mínimo duas vezes, em dias
diferentes, e avaliados via análise Probit (Raymond 1985).
3.1.5. Biensaios com adultos
O bioensaio com garrafas impregnadas é uma metodologia
desenvolvida no CDC (Center of Disease Control) (Brogdon e McAllister 1998a),
que consiste na utilização de garrafas de vidro com capacidade para 250 mL,
completamente impregnadas (inclusive a tampa) com o inseticida a ser testado.
No laboratório, os procedimentos necessários para a realização destes
bioensaios com os inseticidas piretróides foram padronizados anteriormente
(Da-Cunha et al 2005).
A concentração utilizada, 5 µg/garrafa, corresponde à dose
diagnóstica: neste ensaio específico corresponde à menor dose que mata 100%
37
das fêmeas da cepa Rockefeller em 30 min (tempo letal para deltametrina); no
caso de piretróides a mortalidade é confirmada depois de 24 horas para
verificar os casos de recuperação (para discriminar do efeito knockdown,
descrito na Introdução). Para cada ensaio foram utilizadas quatro garrafas, das
quais três impregnadas com inseticida e uma controle, impregnada apenas com
o solvente (acetona) (Figura 6c).
Os mosquitos eram transferidos em grupos de aproximadamente 20
para cada garrafa. A mortalidade era verificada a cada 15 minutos, até
completar o tempo de duas horas de exposição. Após esse período, os
mosquitos eram transferidos para pequenas gaiolas de papelão (8,5 cm x 8,5
cm) onde era oferecida alimentação por meio de um algodão embebido em
solução açucarada a 10%. Os mosquitos eram mantidos por 24 horas nessas
gaiolas, em ambiente com temperatura e umidade relativa controladas, quando
era realizada a leitura final, sendo computadas as fêmeas mortas e vivas.
Depois da leitura os mosquitos eram desprezados. Todos os ensaios foram
repetidos três a quatro vezes, em dias diferentes. Os dados obtidos eram
organizados em planilhas e usados para a construção de gráficos.
38
Figura 6. Bioensaios para avaliação da resistência a inseticidas. a. ensaios dose-resposta com temephos, para larvas; b. ensaios dose-resposta com novaluron, para adultos, c. ensaios realizados com espécimes adultos.
3.2. Simulado de Campo
A persistência de novaluron foi testada em condições de simulação
de campo, em dois momentos. O primeiro simulado, somente na área externa
devido a problemas técnicos, foi realizado no período de março a maio de 2007.
O segundo foi realizado na área interna e externa simultaneamente e teve início
em outubro de 2007.
3.2.1. Local do estudo
Foram utilizados dois ambientes, um localizado em área interna,
protegida da luz do sol e outro em área externa, parcialmente exposta. A área
interna consiste de uma sala, de 13,26 m2, localizada no térreo do prédio onde
se encontra o laboratório. A área externa é um local de 12 m2, cercada para
evitar entrada de pessoas e animais domésticos e com uma cobertura plástica
a b
c
b
39
que protege os galões da chuva, mas permite a passagem parcial da luz solar
(Lima 2005) (Figura 7).
3.2.2. Espécimes utilizados
Em cada área foram avaliadas a cepa Rockefeller e duas populações
sabidamente resistentes a temephos (larvicida organofosforado usado no
controle de Aedes aegypti): Aracajú, SE e Henrique Jorge/Fortaleza, CE. Foram
utilizadas larvas de terceiro estádio e a criação foi efetuada de acordo com os
procedimentos já descritos no item 3.1.2.
3.2.3. Inibidor da síntese de quitina
Novaluron 100 CE foi utilizado nos simulados de campo, na
concentração de 20 µg/L, como recomendado pelo fabricante para controle de
mosquitos. Esta é a condição atualmente empregada nas avaliações de
persistência do produto, em simulado e diretamente em campo, realizadas no
âmbito do PNCD. Para obtenção dessa concentração, solução a 1 g/L,
preparada em água, foi aplicada diretamente às réplicas.
3.2.4. Montagem e acompanhamento dos simulados
Os procedimentos para os simulados de campo foram realizados de
acordo com protocolo já estabelecido (SVS 2006, Figura 8). Em cada área
a
Figura 7. Locais de estudo dos ensaios simulados de campo. a. área externa; b. área interna.
b
40
foram utilizados 21 baldes plásticos, cada qual com capacidade para 60L.
Foram avaliadas duas condições, sem e com troca de água. Em cada área, 18
baldes receberam o produto, nove para cada condição. Três baldes receberam
larvas da cepa Rockefeller, três, larvas da população Aracajú e três, larvas de
Henrique Jorge. Os baldes foram distribuídos de forma randômica nos locais de
estudo (Montella et al 2007). Além disso, em cada área, três baldes que não
receberam o produto funcionaram como controle, com exposição de larvas da
cepa Rockefeller. Todos os baldes eram ocluídos com tela de nylon para evitar
a colonização de mosquitos de campo e também para evitar que eventuais
mosquitos do teste conseguissem escapar.
Cada balde recebeu 50 litros de água da rede de abastecimento local
e 1 mL de uma solução a 1g/L de novaluron, o que resultou em uma
concentração final de 20 µg/L. O produto só foi aplicado uma vez em cada
balde, já que o objetivo era verificar sua persistência (Figura 8). A cada
semana, ou quando fosse necessário, era adicionado 1g de comida em cada
galão.
Semanalmente, 50 larvas (L3 final – L4 inicial) eram adicionadas aos
baldes, sendo que o primeiro grupo de larvas só foi adicionado 24 horas depois
da aplicação do produto. O acompanhamento era feito a cada dois dias. A cada
nova adição de larvas, as pupas e larvas da semana anterior eram transferidas
para aparatos plásticos flutuantes, telados e mantidos dentro dos baldes
respectivos (Figuras 8, 9). As larvas ficavam livres nos baldes, expostas
continuamente ao produto (Figura 9a). A mortalidade dos estágios também era
verificada nesses aparatos (Figura 9b), sendo os eventuais adultos removidos
com capturador de Castro (Figura 9c). O critério para determinar o sucesso da
emergência dos adultos foi a detecção de exúvias de pupa (Mulla 1974; Mulla et
al 2003a). A avaliação de cada ensaio semanal era considerada terminada
quando não houvesse larvas e/ou pupas vivas ou quando houvessem emergido
todos os adultos.
Nos baldes com a condição “troca de água”, 10 litros de água eram
removidos três vezes por semana, sendo substituídos por água de
abastecimento local (Figura 8). A temperatura e o pH eram aferidos pelo menos
uma vez por semana. Uma ficha de acompanhamento era criada semanalmente
41
para cada novo ensaio, para anotação dos dados de mortalidade por estágio e
de emergência dos adultos.
Os testes eram interrompidos quando a inibição da emergência dos
adultos experimentais, nos ensaios semanais, fosse inferior a 70%.
42
Figura 8. Esquema da rotina dos ensaios simulados de campo. Ver texto para detalhes.
43
Figura 9. a. Baldes utilizados para a realização dos ensaios simulados de campo, de avaliação da persistência de IGR; b e c. aparato flutuador adicionado aos baldes.
a
b c
44
4. Resultados 4.1. Em Laboratório 4.1.1. Temephos
Todas as populações foram expostas a temephos. No entanto, como
essas apresentavam diferentes perfis de susceptibilidade, muitas vezes foi
necessário ajustar as concentrações de inseticida, para obter uma melhor curva
de mortalidade. A mortalidade é dose-dependente, o que se observa
tipicamente nos ensaios do tipo dose-resposta. Em nenhum teste houve
mortalidade no controle. Os resultados obtidos foram organizados e analisados
com Probit; os valores das doses efetivas, concentrações letais 50 e 90 (CL50 e
CL90), foram utilizados para o cálculo da razão de resistência (RR), por
comparação com a cepa Rockefeller (Quadro 1).
De acordo com o critério proposto por Mazzari e Georghiou (1995),
RR menor que 5 indica resistência baixa, entre 5 e 10 é considerada
intermediária, e alta quando está acima de 10. Com base nesse critério, todas
as populações testadas apresentaram resistência a temephos. Cuiabá é a
população notadamente mais sensível a esse OP. Aracajú e Uberaba
apresentam altos níveis de resistência a temephos. Contudo, os resultados
obtidos para a população Henrique Jorge devem ser destacados, já que esta
apresenta os maiores valores de RR (RR90 igual a 41,6 e a 3,25 quando
comparada, respectivamente, com Rockefeller e Aracajú, a segunda população
mais resistente), revelando-se uma população extremamente resistente.
Quadro 1. Concentração letal (CL), razão de resistência (RR), slope (Coeficiente angular) para larvas de Aedes aegypti expostas a temephos. Os valores de referência foram aqueles obtidos para a cepa Rockefeller. As concentrações estão indicadas em mg/L (três a quatro ensaios em dias diferentes).
4,6±0,1741,590,1501537,060,08041F3Henrique Jorge (CE)
3,49±0,212,810,046259,150,01985F1Aracajú (SE)
4,15±0,1611,050,039909,040,01961F4Uberaba (MG)
4,7 ± 0,26,280,022675,530,01199F4Cuiabá (MT)
5,8±0,161,000,003611,000,00217-----------Rock
slopeRR90CL90RR50CL50GeraçãoPopulação
4,6±0,1741,590,1501537,060,08041F3Henrique Jorge (CE)
3,49±0,212,810,046259,150,01985F1Aracajú (SE)
4,15±0,1611,050,039909,040,01961F4Uberaba (MG)
4,7 ± 0,26,280,022675,530,01199F4Cuiabá (MT)
5,8±0,161,000,003611,000,00217-----------Rock
slopeRR90CL90RR50CL50GeraçãoPopulação
45
Mortalidades em log-probit para as populações e para a cepa
Rockefeller (Figura 10) expressam mais claramente a resistência e a
diferenciação quanto aos níveis de resistência das populações testadas.
Quanto mais distante (à direita) da curva de Rockefeller, maior o nível de
resistência. Henrique Jorge é a mais distante da curva de Rock e das outras
populações, o que evidencia claramente a intensidade da resistência dessa
população ao organofosforado avaliado.
Os valores de coeficiente angular (“slope”) obtidos pela análise da
curva de mortalidade indicam que as populações avaliadas apresentam maior
heterogeneidade que a cepa referência (o que era esperado).
-3 -2 -1 0 1
0
20
40
60
80
100
Cuiaba
Rock
UberabaAracajuHenrique Jorge
log [temephos] (mg/L)
Mor
talid
ade
(%)
Figura 10. Efeito de temephos sobre a mortalidade de populações de Aedes aegypti. Curvas de regressão linear.
4.1.2. Deltametrina
Adultos das mesmas populações acima foram submetidos a ensaios
com garrafas impregnadas. Diferente dos ensaios dose-resposta, estes são
realizados com apenas uma dose, diagnóstica, e fornecem dados qualitativos.
O Quadro 2 e a Figura 11 mostram os dados de mortalidade nos
tempos 30 min, 120 min e 24 h. Esses tempos correspondem, respectivamente,
ao tempo mínimo para que todas as fêmeas de Rock morram, característico de
cada inseticida (no caso de deltametrina, 30 minutos), o tempo total a que os
46
mosquitos são expostos ao produto (120 minutos) e o momento em que é feita
a leitura final para verificar se houve recuperação dos adultos, na ausência de
inseticida (24 horas).
De acordo com o critério recomendado pela OMS, populações com
mortalidade acima de 98% são consideradas susceptíveis, entre 80-98%
apresentam resistência incipiente e valores de mortalidade menores que 80%
indicam resistência (Davidson e Zahar 1973).
Embora nenhuma população possa ser classificada como susceptível
em todos os tempos de avaliação, quando a mortalidade depois de 24 horas é
considerada, de acordo com o critério da OMS, Uberaba, Aracajú e Henrique
Jorge mostram resistência incipiente à deltametrina, enquanto Cuiabá se
mostra susceptível.
Comparação dos dados de queda e mortalidade após 120 min de
exposição e 24 horas mostram que na população Uberaba houve recuperação
significativa de mosquitos: a mortalidade observada após o tempo máximo de
exposição a deltametrina é maior do que a observada em 24h (o que pode ser
observado em populações expostas a piretróides). Cuiabá, Aracajú e Henrique
Jorge não apresentaram recuperação após 120 min de exposição ao produto,
ou seja, redução da mortalidade em 24 h, que sugere que essas provavelmente
não possuam resistência tipo kdr.
Quadro 2. Mortalidade de fêmeas de Aedes aegypti expostas à dose-diagnóstica de deltametrina (5ug/garrafa), nos tempos de 30’ e 120’ de exposição e 24 horas de recuperação na ausência de inseticida (três a quatro ensaios realizados em dias diferentes).
RecuperaçãoExposição
(% mortalidade ou queda)
92,698,477,7F3Henrique Jorge
88,183,469,8F2Aracajú
82,596,778,7F4Uberaba
98,497,986,0F4Cuiabá
100,0100,0100,0------------Rock
24 h 120 min30 minGeraçãoPopulação
RecuperaçãoExposição
(% mortalidade ou queda)
92,698,477,7F3Henrique Jorge
88,183,469,8F2Aracajú
82,596,778,7F4Uberaba
98,497,986,0F4Cuiabá
100,0100,0100,0------------Rock
24 h 120 min30 minGeraçãoPopulação
47
Rock
Cuiabá
Uberab
a
Araca
jú
Henriq
ue Jo
rge
0
20
40
60
80
100 30 min120 min24 h
%M
ort
alid
ade
ou
Qu
eda
Figura 11. Mortalidade de fêmeas adultas de Aedes aegypti após exposição à dose-diagnóstica de deltametrina por 30 e 120 minutos e depois de 24 horas de recuperação. Linhas coloridas horizontais indicam os limiares de mortalidade usados para classificação das populações (OMS): <80% (linha vermelha) = resistente; >98% (linha verde) = susceptível.
4.1.3. Novaluron
Ensaios prévios com a cepa Rockefeller determinaram a faixa de
doses a ser utilizada. A maior concentração testada foi aquela que não permitia
a emergência de adultos desta cepa. Após a determinação da curva de doses,
os ensaios foram então realizados com as populações de campo.
Nos resultados obtidos com ensaios tipo dose-resposta com
novaluron e larvas de Aedes aegypti observa-se que a mortalidade, além de ser
dose-dependente (ou seja, quanto maior a dose, maior a mortalidade), aumenta
com o tempo de exposição. Este último aspecto é relevante já que, diferente do
padrão de mortalidade observado com os inseticidas químicos convencionais, a
mortalidade por ação de IGRs geralmente ocorre ao longo dos dias, devendo o
ensaio ser acompanhado por um tempo maior.
Também é possível verificar que a precocidade da mortalidade varia
com a concentração. Em concentrações mais baixas, a mortalidade ocorre
preferencialmente em pupas e adultos, enquanto nas mais altas, essa
mortalidade ocorre em larvas e pupas. A mortalidade no controle se manteve
sempre basal, não ultrapassando 1,25% nos ensaios realizados. O Quadro 3
mostra as doses efetivas e as razões resistência.
48
Quadro 3. Efeito de novaluron sobre a inibição da emergência de adultos de Aedes aegypti de populações brasileiras. IE, RR e slope indicam, respectivamente, as doses efetivas para inibição da emergência, as razões de resistência e o coeficiente angular (usando a cepa Rockefeller como referência). As IE estão apresentadas em µg/L (dois a cinco ensaios realizados em dias diferentes).
Todos os valores de RR obtidos foram muito baixos, não
ultrapassando 1,71. Aracajú, surpreendentemente apresentou RR90 igual a
0,83, discretamente mais susceptível (mas não significativo) que a cepa
referência (Quadro 3). Essa população apresenta RR alta para temephos e
alteração na susceptibilidade à deltametrina. Henrique Jorge, população que
possui o maior valor de RR para temephos dentre as testadas, foi a que
apresentou maior tendência a uma potencial resistência cruzada com produto
(Quadro 4).
Em resumo, as populações de campo exibiram padrão de resposta a
novaluron semelhante àquele de Rock, independente do status de resistência a
temephos (Quadro 4; Figura 12). A Figura 13 apresenta os resultados de IE nas
diferentes concentrações testadas, para a cepa Rockefeller e para as
populações.
Quadro 4. Comparação entre o status de resistência a temephos e a novaluron de populações de Aedes aegypti. Em todos os casos estão indicados os valores de razão de resistência (RR), usando a cepa Rockefeller como referência.
4,7±0,261,710,3691,460,197F3Henrique Jorge (CE)
9,8±1,310,830,1790,980,132F2Aracajú (SE)
6,29±0,551,210,2611,210,163F4Uberaba (MG)
8,55±1,841,200,2581,350,183F4Cuiabá (MT)
6,27±0,311,000,2161,000,135------------Rock
slopeRR90IE90RR50IE50GeraçãoPopulação
4,7±0,261,710,3691,460,197F3Henrique Jorge (CE)
9,8±1,310,830,1790,980,132F2Aracajú (SE)
6,29±0,551,210,2611,210,163F4Uberaba (MG)
8,55±1,841,200,2581,350,183F4Cuiabá (MT)
6,27±0,311,000,2161,000,135------------Rock
slopeRR90IE90RR50IE50GeraçãoPopulação
1,711,4641,5937,06F3Henrique Jorge
0,830,9812,819,15F2Aracajú
1,211,2111,059,04F4Uberaba
1,201,356,285,53F4Cuiabá
1,001,001,001,00---Rock
RR90RR50RR90RR50GeraçãoPopulação
NovaluronTemephos
1,711,4641,5937,06F3Henrique Jorge
0,830,9812,819,15F2Aracajú
1,211,2111,059,04F4Uberaba
1,201,356,285,53F4Cuiabá
1,001,001,001,00---Rock
RR90RR50RR90RR50GeraçãoPopulação
NovaluronTemephos
49
-2 -1 0 1
0
20
40
60
80
100 Cuiabá
Rock
UberabaAracajúHenrique Jorge
log [novaluron] (ug/L)
EI
(%)
Figura 12. Efeito de novaluron sobre a inibição de emergência de populações de Aedes aegypti. Curvas de regressão linear ajustadas aos valores de IE à concentração de novaluron (em log). Rockefeller foi incluído como controle de susceptibilidade.
50
00,0
50,1 0,1
50,2 0,2
50,3 0,3
50,4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
00,0
50,1 0,1
50,2 0,2
50,3 0,3
50,4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
CuiabáRock
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
%IE
%IE
%IE
Uberaba
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Aracajú
%IE
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Henrique Jorge
%IE Figura 13. Perfil de inibição da
emergência de adultos após exposição ao inibidor de síntese de quitina novaluron (barras com desvio padrão). As populações estão indicadas sobre cada painel.
%IE
00,0
50,1 0,1
50,2 0,2
50,3 0,3
50,4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
00,0
50,1 0,1
50,2 0,2
50,3 0,3
50,4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
CuiabáRock
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
%IE
%IE
%IE
Uberaba
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Aracajú
%IE
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Henrique Jorge
%IE Figura 13. Perfil de inibição da
emergência de adultos após exposição ao inibidor de síntese de quitina novaluron (barras com desvio padrão). As populações estão indicadas sobre cada painel.
%IE
51
Não foi encontrada correlação entre mortalidade por novaluron para
a dose IE99 e razão de resistência a temephos (Spearman r2= -0,3, p > 0,05).
Também não foi encontrada correlação entre resistência a deltametrina (dados
de 24 horas) e inibição na emergência por novaluron (Spearman r2= -0,2, p >
0,05).
Os resultados de mortalidade por estágio com novaluron (Figura 14)
mostram que, para Aracajú (RR90 de 0,83 para novaluron, Quadro 3), doses
acima de 0,3 µg/L são suficientes para inibir 100% da emergência de adultos.
Para Rockefeller este índice só foi alcançado com 0,4 µg/L. Cuiabá e Uberaba
apresentam perfis semelhantes de mortalidade por estágio com este CSI,
assim como os valores de RR (Quadro 3). Para estas populações, não houve
diferença significativa entre os valores de IE. Henrique Jorge apresenta a maior
porcentagem de mortalidade em adultos (7,5%) na maior concentração testada.
Isso corrobora com a RR de novaluron obtida para essa população.
52
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
%M
ort
alid
ade
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Mo
rtal
idad
e
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
%M
ort
alid
ade
Figura 14. Efeito de novaluron sobre o perfil de mortalidade por estágio das populações de campo de Aedesaegypti (Cuiabá; Uberaba; Aracajú; Henrique Jorge e Rockefeller). As concentrações são apresentadas em µg/L.
00.
05 0.1
0.15 0.
20.
25 0.3
0.35 0.
4
0
20
40
60
80
100LarvasPupasAdultos
Concentrações (ug/L)
Mo
rtal
idad
e
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Mo
rtal
idad
eRock Cuiabá
Uberaba Aracajú
Henrique Jorge
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
%M
ort
alid
ade
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Mo
rtal
idad
e
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
%M
ort
alid
ade
Figura 14. Efeito de novaluron sobre o perfil de mortalidade por estágio das populações de campo de Aedesaegypti (Cuiabá; Uberaba; Aracajú; Henrique Jorge e Rockefeller). As concentrações são apresentadas em µg/L.
00.
05 0.1
0.15 0.
20.
25 0.3
0.35 0.
4
0
20
40
60
80
100LarvasPupasAdultos
Concentrações (ug/L)
Mo
rtal
idad
e
00,
05 0,1
0,15 0,
20,
25 0,3
0,35 0,
4
0
20
40
60
80
100
Concentrações (ug/L)
Mo
rtal
idad
eRock Cuiabá
Uberaba Aracajú
Henrique Jorge
53
Os resultados mostram grande eficácia de novaluron contra larvas de
Aedes aegypti, mesmo quando as populações do vetor apresentam alto nível
de resistência a outros inseticidas.
Além do efeito dose-dependente sobre a mortalidade, também foram
observadas anormalidades nos espécimes mortos após exposição contínua a
novaluron. Essas anormalidades foram classificadas de acordo com Awad e
Mulla (1984a) e Braga et al (2005b) da seguinte forma: mortalidade em larva,
mortalidade como pré-pupa, pupa albina, pupa distendida, pupa com adulto
visível no interior, adulto com emergência parcial e adulto com os tarsos
deformados (Figura 15). No entanto, não foram quantificados os tipos de
mortalidade e sua porcentagem em cada concentração. Essas figuras foram
produzidas para atender à necessidade de representação dos efeitos
morfológicos de CSI, já que muitos dos artigos que se referem a essas
anormalidades não apresentam figuras ilustrativas.
54
Figura 15. Anormalidades morfológicas observadas em larvas, pupas e adultos após exposição contínua desde o terceiro estádio larval a novaluron. Identificação das anomalias de acordo com Talaat e Mulla 1984 e Braga et al 2005b. Fotos de Giglio NF e Rezende GL.
55
4.2. Simulado de Campo
Os simulados foram realizados utilizando larvas L3 tardias da cepa
Rockefeller e das populações Aracajú e Henrique Jorge. No primeiro simulado,
realizado apenas em ambiente externo, foram utilizadas larvas da geração F3
de Aracajú e F2 de Henrique Jorge. No segundo ensaio, em ambientes externo
e interno, foram utilizadas larvas da geração F4 de Aracajú e F3 de Henrique
Jorge. A persistência do produto foi avaliada através do percentual de inibição
da emergência de adultos.
Em cada ensaio, foram avaliadas duas condições, com e sem
retirada (e subseqüente reposição) de água. Foram criadas siglas que
designassem as condições e as populações, desse modo: Aracajú com troca
de água (ACT), Aracajú sem troca (AST), Henrique Jorge com troca (HJCT),
Henrique Jorge sem troca (HJST), Rockefeller com troca (RCT) e Rockefeller
sem troca (RST).
Sabe-se que a mortalidade em ensaios simulados de campo com
CSIs ocorre ao longo dos dias, devido ao seu modo de ação. Nos simulados
aqui apresentados, realizados com a dose de 20µg/L, verificamos que a
mortalidade se tornava mais expressiva a partir do quinto dia de exposição das
larvas ao produto.
O efeito residual de novaluron (definido pelo tempo em que o produto
induz mortalidade acima de 70%) pôde ser verificado nos dois ambientes,
interno e externo. No primeiro ensaio, apenas em área externa (março-maio
2007), o produto se mostrou eficaz por seis semanas (aproximadamente 42
dias). Mortalidade de 100% dos espécimes expostos foi observada nas quatro
primeiras semanas para todas as populações (Figura 16). Em nenhum caso a
mortalidade no controle ultrapassou 10%.
Não foi encontrada diferença significativa entre os valores de IE de
cada população nas condições “com” e “sem” troca (Mann Whitney p>0,05)
(Figura 16a-c). Também não foi encontrada diferença significativa quando os
valores de IE das diferentes populações foram comparados (One-way
Anova/Newman Keuls multiple comparation tests p>0,05), com exceção do
controle não exposto ao CSI (p<0,05, Figura 16d).
56
1 2 3 4 5 6 7 8
0102030405060708090
100110
ACTAST
Semanas após a aplicação do produto
Figura 16. Persistência de novaluron sobre populações de Aedes aegypti em condições de simulado de campo em ambiente externo (março-maio). Em todos os casos “ST” e “CT” indicam, respectivamente, sem e com troca de água (20% do volume total a cada três dias). a. Rockefeller, b. Aracajú, c. Henrique Jorge, d. Curva de mortalidade de todas as populações e condições testadas. Linha horizontal vermelha indica o ponto limite do efeito residual do produto (acima de 70% de IE).
a c
b d
1 2 3 4 5 6 7 8
0102030405060708090
100110
HJCTHJST
Semanas após a aplicação do produto
1 2 3 4 5 6 7 8
0102030405060708090
100110 Controle
RCTACTHJCTRSTASTHJST
Semanas após a aplicação do produto
1 2 3 4 5 6 7 8
0102030405060708090
100110
RCTRST
Semanas após a aplicação do produto
%IE
%IE
%IE %IE
57
A Figura 17 compara os percentuais de inibição da emergência na 5ª
e na 7ª semanas, evidenciando mais claramente a perda do efeito residual na
7ª semana. Esta figura também confirma a ausência de relação entre as
diferentes condições (com troca e sem troca de água) e a mortalidade.
Figura 17. Persistência de novaluron. Efeito do CSI sobre a inibição da emergência de adultos de Aedes aegypti em dois momentos do ensaio em simulação de campo, em área externa, mostrado na Figura 12. CT e ST indicam com e sem troca de água, respectivamente. R= Rockefeller; A = Aracaju, H = Henrique Jorge. Linha horizontal vermelha indica o ponto limite do efeito residual do produto (acima de 70% de IE).
A temperatura muitas vezes pode ser um dos fatores ou até a causa
isolada de altos percentuais de mortalidade. Temperaturas muito extremas
(baixas ou altas) além de provocarem a morte das larvas, podem afetar o seu
desenvolvimento, o que é extremamente relevante para esse trabalho.
Neste ensaio a temperatura da água e do ambiente foi aferida em um
único momento do dia, com a freqüência de uma a três por semana. No
ambiente a temperatura variou bastante, sendo a mínima observada 18,8 ºC e
a máxima, 42,6ºC. A média da temperatura do ambiente, verificada durante o
período de experimentação, foi de 31,3ºC (Figura 18a e b). A temperatura da
água variou menos, como era esperado, já que seu calor específico é alto: a
temperatura oscilou entre 21ºC e 35ºC, e a temperatura média foi de 28,2ºC
(Figura 18a e b).
5 7
0
20
40
60
80
100RCT
ACT
HJCT
RST
AST
HJST
Semanas após a aplicação do produto
%IE
58
1 2 3 4 5 6 7 8
15
20
25
30
35
40Tmin AmbienteTmax AmbienteTmin ÁguaTmax Água
Semanas após a aplicação do produto
Tem
per
atu
ra o
C
1 2 3 4 5 6 7 8
15
20
25
30
35
40T AmbienteT Água
Semanas após a aplicação do produto
Tem
per
atu
ra o
C
Figura 18. Temperatura durante o simulado 1, realizado apenas em área externa (março-maio). a. temperatura máxima e mínima da água e do ambiente. b. média das temperaturas do ambiente e da água.
a
b
59
Nesse primeiro simulado o pH, aferido somente em um balde
controle e um balde experimental (Figura 19), não diferiu significativamente
entre as duas condições (Mann Whitney; p> 0,05).
Figura 19. Persistência de novaluron sobre populações de Aedes aegypti em condições de simulado de campo em ambiente externo (março-maio). Valores de pH aferidos, em um balde controle e um balde experimental, durante o primeiro simulado externo.
No segundo simulado externo (outubro-dezembro) o produto
apresentou efeito residual por apenas cinco semanas (35 dias). Inibição total
da emergência dos espécimes expostos (exceto no controle) foi verificada nas
duas primeiras semanas (Nesse simulado a mortalidade no controle foi mais
alta que no primeiro, embora não tenha ultrapassado 16%).
Não foi encontrada diferença significativa entre os valores de IE das
duas condições (com e sem troca de água) (Mann Whitney P>0,05) (Figura 20
a-c). Também não foi encontrada diferença significativa entre os valores de IE
das diferentes populações (One-way Anova/Newman Keuls multiple
comparation tests P>0,05). Os valores de IE do controle diferiram
significativamente dos experimentais (P<0,05) (Figura 20 d).
1 2 3 4 5 6 7
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0ControleTratado
Semanas após a aplicação do produto
pH
60
1 2 3 4 5 6 7
0102030405060708090
100110
ACTAST
Semanas após a aplicação do produto
1 2 3 4 5 6 7
0102030405060708090
100110
RCTRST
Semanas após a aplicação do produtoa
1 2 3 4 5 6 7
0102030405060708090
100110
HJCT
HJST
Semanas após a aplicação do produtoc
b 1 2 3 4 5 6 7
0102030405060708090
100110
ControleRCTACTHJCTRSTASTHJST
Semanas após a aplicação do produtod
Figura 20. Persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área externa (outubro-dezembro). Comparação entre os valores de IE com e sem troca de água de Rock (a), Aracajú (b) e Henrique Jorge (c). d. IE por semana de todas as populações e condições testadas. Linha horizontal vermelha indica o ponto limiar do efeito residual do produto (acima de 70% de IE).
%IE
%IE
%IE
%IE
61
Comparação do percentual de mortalidade na 5ª e na 7ª semanas
revela que o produto na sétima semana perdeu muito da sua eficácia,
apresentando taxas muito baixas de inibição de emergência (Figura 21). É
possível verificar que os valores de mortalidade na sétima semana para o
segundo simulado são bem menores que no primeiro, com exceção de
Henrique Jorge quando não houve troca de água (HJST). Isso indica que nesse
período o produto persistiu menos tempo quando comparado ao primeiro
simulado.
Figura 21. Persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área externa (outubro-dezembro). Mortalidade verificada na 4ª e 6ª semanas para as populações com e sem reposição de água. Linha horizontal vermelha indica o ponto limite do efeito residual do produto (acima de 70% de IE).
Também foi aferida a temperatura da água e do ambiente no
segundo simulado externo. A freqüência de aferição foi em um momento de
dia, uma a duas vezes por semana para esse ensaio. A temperatura do
ambiente continuou apresentando grande variação (22,2 – 43,5ºC). A
temperatura média do ambiente no período foi de 31,8ºC (Figura 22 a, b). A
temperatura da água variou entre 20ºC e 38,9ºC, variação maior do que a
observada no primeiro simulado externo. A temperatura média da água nesse
período foi de 26,8ºC (Figura 22 a, b).
5 7
0
20
40
60
80
100
RCT
ACT
HJCT
RST
AST
HJST
Semanas após aplicação do produto
%IE
62
1 2 3 4 5 6 7
15
20
25
30
35
40AmbienteÁgua
Semanas após a aplicação do produto
Tem
per
atu
ra o
C
1 2 3 4 5 6 7
15
20
25
30
35
40Tmin AmbienteTmáx AmbienteTmín ÁguaT máx Água
Semanas após a aplicação do produto
Tem
per
atu
ra o
C
Figura 22. Avaliação da persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área externa (outubro-dezembro). Temperatura do ambiente e da água. a. temperatura máxima e mínima da água e do ambiente. b. média das temperaturas do ambiente e da água.
a
b
63
Nesse segundo simulado externo, o pH foi aferido em três baldes, o
controle, um com troca e outro sem troca de água. Em nenhum caso foi
encontrada diferença significativa dos valores de pH entre os baldes (Mann-
Whitney; p<0,05) (Figura 23).
Figura 23. Avaliação da persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área externa (outubro-dezembro). Valores de pH aferidos, em um balde controle, um balde tratado com reposição de água e um sem reposição, durante o segundo simulado externo.
O simulado interno foi realizado em um único período do ano. A
realização de simulado interno em períodos do ano diferentes pode ser
redundante, já que as condições variam pouco no ambiente interno. O efeito
residual de novaluron em simulado interno é superior ao observado nos
ensaios externos. Foi possível verificar mortalidade acima de 70% nos baldes
tratados por até 9 semanas após a aplicação do produto (exceto na condição
“Aracajú com troca”). Mortalidade de 100% nos tratados foi observada até a
terceira semana. Como esperado, a persistência do produto no simulado em
área interna foi superior àquela observada nos dois simulados externos.
Não foi encontrada diferença significativa entre os valores de IE
observados para as duas condições testadas, com e sem troca de água (Mann
Whitney; p>0,05) (Figura 24 a,b,c). Os valores de IE das populações também
não diferem significativamente (One-way Anova/Newman Keuls multiple
comparation tests p>0,05). Os valores de IE do controle diferiram
significativamente das demais (Figura 24 d).
1 2 3 4 5 6 7
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0ControleCom trocaSem troca
Semanas após a aplicação do produto
pH
64
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0102030405060708090
100
ACTAST
Semanas após a aplicação do produto
%IE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0102030405060708090
100RCTRST
Semanas após a aplicação do produto
%IE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0102030405060708090
100ControleRCTACTHJCTRSTASTHJST
Semanas após a aplicação do produto
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0102030405060708090
100
HJCTHJST
Semanas após a aplicação do produto
%IE
Figura 24. Persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área interna. Comparação entre os valores de IE com e sem troca de água de Rock (a), Aracajú (b) e Henrique Jorge (c). d. IE por semana de todas as populações e condições testadas. Linha horizontal vermelha indica o limiar do efeito rediual do produto (acima de 70% de IE).
a c
b d %
IE
65
Se forem observados os valores de IE nas 5ª, 7ª, 9ª e 11ª semanas, é
possível evidenciar mais claramente que o produto continuou eficaz até a 9ª
semana (exceção para Aracajú com troca). Também foram verificadas
oscilações da mortalidade de uma semana a outra. Na 11ª semana, é possível
observar que a mortalidade em todos os baldes tratados foi inferior a 70%
(Figura 25), parâmetro definido como ponto de corte (ver seção Metodologia).
Figura 25. Persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área interna. Percentual de inibição de emergência verificada na 4ª, 6ª, 8ª e 10ª semanas, após a aplicação do produto, para as populações com e sem reposição de água. Linha horizontal vermelha indica o ponto limite do efeito residual do produto (acima de 70% de IE).
A média de temperatura do ambiente até a décima semana foi de
27,6ºC. A menor temperatura registrada no ambiente foi de 23,1ºC e a máxima,
31,4ºC (Figura 26 a, b). A temperatura da água variou na mesma faixa que a
temperatura do ambiente: a temperatura mínima registrada na água foi de
23,1ºC e a máxima de 30,4ºC (Figura 26 a). A média de temperatura da água
em todo o período de teste (26,3ºC) foi menor que a do ambiente (Figura 26b).
%IE
5 7 9 11
0
20
40
60
80
100RCT
ACT
HJCT
RST
AST
HJST
Semanas após a aplicação do produto
66
Figura 26. Persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área interna. Temperaturas do ambiente e da água. a. temperaturas máxima e mínima; b. temperaturas médias.
b
a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
15
20
25
30
35
40T AmbienteT Água
Semanas após a aplicação do produto
Tem
per
atu
ra o
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
15
20
25
30
35
40T min AmbienteTmax AmbienteTmin ÁguaTmax Água
Semanas após a aplicação do produto
Tem
per
atu
ra o
C
67
O pH variou de forma semelhante nos baldes tratados, com e sem
troca de água. Não foi encontrada diferença significativa entre os valores de pH
dos baldes controle e tratados (Mann-Whitney; p>0,05). Durante todo o teste o
pH variou entre 5,8 e 7,6 (Figura 27).
Figura 27. Persistência de novaluron em condições de simulado de campo em área interna. Valores de pH aferidos, em um balde controle, um balde tratado com reposição de água e um sem reposição, durante o simulado interno.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0ControleCom trocaSem troca
Semanas após a aplicação do produto
pH
68
5 - Discussão
O uso de inseticidas químicos para o controle de Aedes aegypti no
Brasil foi intensificado após a primeira grande epidemia em 1986. O
organofosforado temephos tem sido utilizado no país por mais de 30 anos para
o controle de larvas desse mosquito e relatos de resistência do vetor a esse OP
podem ser encontrados desde 1998 (Macoris et al 1999; Lima et al 2003; Braga
et al 2004). Por isso, verificar o status da resistência desse mosquito aos
inseticidas utilizados no controle é extremamente relevante.
Um dos testes recomendados para verificar o nível de alteração na
susceptibilidade é o teste tipo dose-resposta, de onde é possível obter as RR
em comparação com a cepa de referência. Os valores de RR podem ser
classificados de acordo com critério proposto por Mazzari e Georghiou (1995)
(ver seção Metodologia), utilizado com sucesso na agricultura, e base para
classificação da resistência também em saúde pública durante muitos anos
(Martins et al 2008).
Os valores de RR obtidos nesse trabalho indicaram que todas as
populações testadas são resistentes a temephos. Cuiabá é a população com os
menores valores de RR. Em trabalho de 2003, Campos e Andrade não
encontraram resistência a temephos em larvas de Aedes aegypti de população
dessa localidade. Os baixos valores de RR que encontramos para Cuiabá
podem indicar que a resistência a temephos nessa população é um evento
recente. Outro fato relevante é que apesar de Cuiabá ser um centro urbano,
com população acima de 500.000 habitantes, sempre apresentou baixa
transmissão de dengue (MS/SVS 2007) e, conseqüentemente, a população de
mosquitos dessa localidade foi menos pressionada com inseticida, o que pode
justificar a RR encontrada para essa população do vetor.
Maiores valores de RR foram obtidos para populações do Nordeste
(Aracajú e Henrique Jorge), o que também foi verificado por Macoris et al
(2007). Aracajú, SE é uma população que, desde a primeira avaliação, sempre
se apresentou resistente a esse OP, segundo os resultados obtidos por Lima et
al (2003) e Montella et al (2007). Henrique Jorge é um bairro de Fortaleza, CE,
e a população de mosquitos dessa localidade apresenta valores de CL muito
acima daqueles observados para Rock e, por isso, razões de resistência
69
extremamente altas – embora a geração F3 tenha sido utilizada no teste (ou
seja, três gerações sem nenhuma pressão de seleção por inseticida).
Historicamente, o estado do Ceará é aquele que apresenta o maior número de
casos de dengue da Região Nordeste, sendo Fortaleza o município com maior
registro de notificações e incidência. Devido a isso, a aplicação de inseticidas
nessa localidade é intensa, o que leva a grande pressão de seleção das
populações locais de mosquitos com os inseticidas utilizados. Uberaba também
é uma população resistente a temephos. É possível observar que, assim como
no Nordeste, populações do Sudeste também constantemente apresentam
resistência a esse OP, como verificado por Lima et al (2003) e Braga et al
(2004). Resistência de Aedes aegypti a temephos já foi reportada por vários
autores em diversas partes do mundo (Rawlins 1998; Polson et al 2001).
Até 2000, os inseticidas utilizados no Brasil para o controle de adultos
de Aedes aegypti eram organofosforados, ou seja, os estágios imaturos e o
estágio adulto eram pressionados com a mesma classe de inseticidas (Braga et
al 2005b). Atualmente, são utilizados inseticidas piretróides para o controle dos
espécimes adultos de Aedes aegypti. Contudo, resistência a essa classe de
inseticida já foi também detectada (Da-Cunha et al 2005).
Garrafas impregnadas podem ser utilizadas para verificar a
resistência de populações de mosquitos a adulticidas (Brogdon e McAllister
1998a). Nesses ensaios é possível obter dados qualitativos. Ou seja, é possível
saber se a população está resistente ou não, mas não quanto está resistente.
As mesmas populações com as quais foram realizados os testes com
temephos, quando submetidas aos ensaios com garrafas impregnadas com
deltametrina (Brogdon e McAllister 1998b; Da-Cunha et al 2005) mostraram
diferentes perfis de susceptibilidade. Segundo o critério da OMS (ver
Metodologia), somente Cuiabá se mostra susceptível, enquanto todas as outras
apresentam alteração. Uberaba e Aracajú apresentam resistência incipiente.
Henrique Jorge, apesar de ser a população mais resistente a
temephos, apresenta resistência intermediária a deltametrina. Paixão (2007),
avaliando a geração F1 dessa mesma população em ensaios com garrafas
impregnadas com deltametrina obteve 47% de mortalidade dos mosquitos em
24h. Nossos ensaios foram realizados com a geração F3, o que pode justificar a
diferença encontrada nos níveis de resistência.
70
Efeito knockdown, aqui considerado como a recuperação de
mosquitos caídos em 24h, pôde ser observado na população de Uberaba. Esse
efeito também foi verificado por outros autores, como Da-Cunha et al (2005) e
Paixão (2007). Resistência a piretróides em Aedes aegypti é descrita em
diversas partes do mundo (Huong et al 2004; Da-Cunha et al 2005; Rodríguez
et al 2005). A resistência a piretróides pode ser um efeito genuinamente
decorrente da aplicação maciça de inseticida, o que leva à intensa pressão de
seleção, ou, alternativamente, pode ser conseqüência de resistência cruzada
com inseticidas de outras classes, como DDT (Brogdon e McAllister 1998b;
Chadwick et al 2006), ou mesmo temephos (Rodriguez et al 2002). No entanto,
não foi possível observar, com nossos resultados, resistência cruzada entre
temephos e deltametrina em nenhuma população.
Os ensaios com garrafas não são a única metodologia disponível
para verificar resistência a adulticidas. Outra metodologia, recomendada pela
OMS, utiliza papéis impregnados com inseticida para a mesma avaliação. A
padronização do procedimento de impregnação de papéis com deltametrina foi
realizada em nosso Laboratório e testes preliminares mostram que ensaios com
papel são tão ou mais consistentes que os testes com garrafas. Além do
potencial de utilização dos papéis impregnados para a rotina de monitoramento
devido a esse aspecto, os requisitos metodológicos necessários para a
utilização do papel são bem mais simples, o que os faz adequados à realidade
brasileira (WHO 1998).
Devido à ocorrência de resistência aos inseticidas convencionais, a
procura por alternativas para o controle de insetos vetores se faz necessária.
Uma dessas alternativas é a utilização de IGRs. Um IGR promissor para o
controle de Aedes aegpyti é o novaluron, que atua como inibidor da síntese de
quitina, agindo por ingestão e contato. Muitos trabalhos têm descrito a eficácia
desse produto contra insetos praga ou vetores, como Musca domestica (Cetin
et al 2006), Leptinotarsa decemlineata (Malinowski e Pawinska 1992), Tribolium
castaneum (Krostywkosky 2006) e flebotomíneos (Mascari et al 2007).
Novaluron foi recomendado recentemente pela OMS para uso em
água potável, e com isso se torna um potencial produto a ser utilizado para o
controle de Aedes aegypti (OMS 2007). A potencial existência de resistência
71
cruzada com os inseticidas já utilizados no controle, no entanto, é motivo de
preocupação.
Em laboratório, novaluron se apresentou eficaz sobre larvas L3 de
Aedes aegypti. A sensibilidade ao produto é menor nos estádios larvais mais
avançados, como verificado por Mulla et al (2003) e Arredondo-Jiménez e
Valdez-Delgado (2006). O mesmo não é verificado para Culex
quinquefasciatus, cujas larvas de 4º estádio se apresentam mais sensíveis ao
produto que larvas de 1º, 2º e 3º estádios (Su et al 2002; Arredondo-Jiménez e
Valdez-Delgado 2006).
Verificamos que com novaluron a mortalidade é dose-dependente e
que, quanto maior a dose mais precoce a mortalidade, confirmando o que havia
sido verificado por Mulla et al (2003) com o mesmo inseticida, também para
Aedes aegypti. Esse padrão de mortalidade foi também observado por Martins
et al (2008) com outro CSI, triflumuron, com esse mesmo culicídeo. Aedes
aegypti se mostra mais sensível a esse CSI que Culex quinquefasciatus (Su et
al 2002), Aedes albopictus, Anopheles albimanus e Anopheles
pseudopunctipennis (Arredondo-Jimenez e Valdez-Delgado 2006).
Nossos resultados revelam que novaluron é eficaz sobre a inibição da
emergência de Aedes aegypti - obtivemos IE99 de 0,3ug/L. Mulla et al (2003)
também observaram eficácia do produto, obtendo valores de IE90 para o 2º e o
4° estádios de, respectivamente, 0,144 ug/L e 0,160 ug/L. No entanto,
Arredondo-Jiménez e Valdez-Delgado (2006) obtiveram valores de IE bem
distintos: IE99 de 69,51 ug/L para o 1° estádio e de 70,86 ug/L para o 3º. Essa
variação nas doses encontradas em diversos trabalhos realizados com o
mesmo produto e mesma espécie decorre da existência de diferenças
metodológicas de criação das larvas, da preparação do ensaio e do tipo de
formulação do produto; a mesma variação, que também pode ser observada
para outros CSI, como o triflumuron (Belinato 2007), e outros IGR, como o
methoprene, já foi discutida anteriormente por nossa equipe (Braga et al
2005b).
Em comparação com outros inseticidas, novaluron apresenta maior
atividade contra Aedes aegypti do que outros CSI, como triflumuron (IE99 = 1,8
ug/L, Martins et al 2008), diflubenzuron (IE99 = 3,5 ug/L, Fournet et al 1993) e
72
também outras classes de IGR como methoprene (IE90 11,13 ug/L, Braga et al
2005b).
Além dos efeitos na IE, os IGRs podem causar também
anormalidades morfológicas nos espécimes mortos, em todos os estágios.
Awad e Mulla (1984a) puderam verificar esse tipo de efeito causado por
ciromazina sobre Culex quinquefasciatus; Braga et al (2005b) observaram
anomalias equivalentes causadas por methoprene em Aedes aegypti.
Aberrações morfológicas provocadas por IGRs também foram observadas em
Musca domestica (Awad e Mulla 1984b). Nos ensaios aqui apresentados,
embora algum tipo de alteração morfológica em larvas tenha sido observado, o
estágio de pupa foi o que apresentou maior variedade de anormalidades.
Nossos resultados condizem com o observado comumente na literatura em
larvas de mosquitos expostos a IGRs.
Apesar do modo de ação diferenciado dos IGRs, já foram descritos
alguns casos de resistência de insetos a esses produtos em populações de
campo, como observado por Cornel et al (2002), que descreveram resistência
do mosquito Ochlerotatus nigromaculis a methoprene. Resistência a IGRs em
mosca doméstica tem sido descrita com alguma freqüência, como observado
por Kristensen e Jepersen (2003), que encontraram linhagens resistentes a
diflubenzuron e a ciromazina na Dinamarca. Pinto e do Prado (2001) também
encontraram resistência a ciromazina em populações de Musca domestica do
Brasil. Resistência potencial a IGRs já foi verificada em laboratório para
Leptinotarsa decemlineata (Cutler et al 2005) e Culex quinquefasciatus (Amin e
White 1984).
Todas as populações que testamos se mostraram susceptíveis a
novaluron, independente de seu status de resistência a temephos e a
deltametrina. Aracajú se apresentou mais sensível ao produto que a cepa
referência. Populações de insetos de campo resistentes a inseticidas químicos
podem ser mais susceptíveis a IGRs que populações de laboratório, como já
verificado por Ishaaya et al (2003) para Spodoptera litoralis resistentes a
chlorfluazuron e por Braga et al (2005a), que encontraram uma população de
Aedes aegypti resistente a temephos mais sensível a methoprene que a cepa
Rockefeller.
73
Nesse trabalho não foi possível verificar nenhuma correlação entre
resistência a temephos e a deltametrina e alteração na susceptibilidade a
novaluron, diferente do que havia sido observado por Belinato (2007) para o
CSI triflumuron, quando os autores puderam relacionar maior taxa de
mortalidade tardia (no estágio de pupa) às maiores razões de resistência a
temephos. Contudo, em nosso trabalho apenas a população de Henrique Jorge,
a mais resistente a temephos, apresentou maior percentual de mortalidade em
adultos com novaluron, quando comparada com as demais populações, o que
sugere maior tolerância dessa população ao produto. Ainda comparando
nossos resultados com os obtidos por Bellinato et al 2007 podemos supor que
diferentes BPUs, mesmo molecularmente muito parecidas, possam agir de
maneiras diferentes em uma mesma espécie de inseto.
Resistência cruzada entre CSI e inseticidas químicos já foi observada
em linhagens de Musca domestica com organofoforados, carbamatos e
organoclorados e diflubenzuron (Cerf e Georghiou 1974; Oppenoorth e Van Der
Pás 1977). Resistência a novaluron parece estar relacionada com mecanismos
de detoxificação por Esterases, que é também um importante mecanismo de
resistência a diflubenzuron em Tribolium castaneum (Ishaaya e Klein 1990).
Esses autores também sugerem que os mecanismos de detoxificação das
benzoil-fenil-uréias possam ser diferentes em insetos distintos. Em nosso
trabalho, também verificamos diferenças dos resultados encontrados por
Belinato 2007 que trabalhou com Aedes aegypti e outro CSI, triflumuron, no
Laficave. Isto sugere que, mesmo dentro dessa classe de produtos, diferentes
CSIs podem estar submetidos a mecanismos de detoxificação diferentes.
A ausência de resistência cruzada, em populações brasileiras de
Aedes aegypti, entre novaluron, temephos e deltametrina, reforça o potencial
uso desse CSI para o controle do vetor. No entanto, sua utilização em um
programa de controle deveria considerar a persistência em campo (OMS 2005),
o que é extremamente importante para o controle de Aedes no Brasil, onde a
aplicação do produto ocorre quatro a seis vezes por ano (Braga e Valle 2007),
segundo rotina definida pelo Ministério da Saúde (Penna 2003).
Nossos resultados mostram que novaluron é eficaz contra larvas de
Aedes aegypti em condições de simulado de campo. Foi observado que, em
área externa, o efeito residual do produto é menor do que em área interna, o
74
que também foi verificado por Montella et al (2007) para temephos. Mulla et al
(2003) já haviam verificado a eficácia de novaluron sobre larvas de Aedes
aegypti em simulados de campo, em área externa, onde detectaram efeito
residual de 82 dias para essa mesma concentração do produto - no entanto,
sem reposição de água.
Em área externa, pudemos verificar efeito residual de seis semanas
no primeiro simulado (março-maio) e de cinco semanas no segundo (outubro-
dezembro). Diferenças entre simulados realizados em diferentes períodos do
ano foram também descritas por Lima et al (2005), em ensaios desse tipo com
o biolarvicida Bti. Essa diferença na persistência do produto pode estar
relacionada diretamente com a temperatura e com a incidência de luz solar,
fatores que variam com as estações do ano. No simulado interno, o efeito
residual do produto foi de oito semanas; isso é plausível, já que em área interna
as variáveis ambientais, como temperatura e luminosidade, costumam ter
menor variação.
Nos ensaios simulados avaliamos duas condições, com ou sem troca
de água. Embora esperássemos encontrar maior persistência do produto nos
baldes onde não era feita troca de água, não foi possível encontrar diferença
significativa na IE observada entre as duas condições. Este resultado diferiu do
observado por Thavara et al (2007) com o CSI diflubenzuron, que encontraram
maior persistência nas réplicas sem troca. Uma provável explicação para a
ausência de diferença é o maior acumulo de matéria orgânica nos baldes sem
troca. Como observado por Batra et al (2005) para triflumuron, em águas com
grande quantidade de matéria orgânica, IGRs podem ter seu potencial um
pouco reduzido.
Foi possível também observar que, ao longo das semanas, a
mortalidade variou, subindo ou decaindo em um mesmo balde tratado. Esse
tipo de variação foi também observado por outros autores avaliando diversas
classes de produtos sobre Aedes aegypti, como Mulla et al (2003) com
novaluron, Thavara et al (2007) com diflubenzuron, Montella et al (2007) com
temephos, Lima et al (2005) com Bti, em simulados de campos e Batra et al
(2005) com triflumuron diretamente em campo. Essas variações foram também
detectadas para outras espécies, como observado por Arredondo-Jiménez e
75
Valdez-Delgado (2006) com novaluron sobre larvas de Anopheles albimanus e
Culex coronator.
Apesar das populações de Aracajú e Henrique Jorge apresentarem
altos níveis de resistência a temephos, não foi possível verificar qualquer
alteração de susceptibilidade a novaluron em simulado de campo, o que reforça
os resultados obtidos em laboratório. A cepa referência, Rockefeller, se mostrou
inclusive, em algumas semanas, menos susceptível ao CSI do que as
populações testadas. Esse fato pode ser resultado de diferenças na condição
fisiológica das larvas, em função de sua manutenção em laboratório:
notadamente, larvas da cepa Rockefeller se desenvolvem mais rapidamente
que larvas de populações do campo, por já estarem adaptadas ao laboratório.
O status de resistência das populações a inseticidas químicos parece
não afetar a sensibilidade a novaluron em simulados de campo, o que torna
esse produto uma grande ferramenta para o controle de Aedes aegypti.
Novaluron apresenta maior eficácia que Bti, já que este não apresenta efeito
residual superior a quatro semanas para Aedes aegypti (Lima et al 2005).
A variação de temperatura foi maior nos simulados externos e,
nestes, maior no ambiente do que na água. Isto é esperado, já que o calor
específico (a quantidade de calor necessária para alterar em 1ºC a temperatura)
da água é bem superior ao do ambiente. Ou seja, a temperatura na água varia
mais lentamente do que a do ambiente. Menor faixa de variação da temperatura
na água que no ambiente foi efetivamente verificada no primeiro simulado em
área externa. No segundo simulado contudo, nas 5ª e 6ª semanas, a
temperatura da água variou mais que a do ambiente, o que pode ser explicado
pela característica física da água: na 5ª semana a temperatura do ambiente
estava baixa, tendo se elevado rapidamente na 6ª semana; essas mudanças
devem ter se propagado para a água, que registrou temperatura mínima bem
baixa (resultante da temperatura ambiental baixa da semana anterior) e uma
temperatura máxima bem alta (decorrente do grande aumento da temperatura
do ambiente na 6ª semana). As temperaturas verificadas no simulado interno
variaram bem menos, tanto da água quanto do ambiente. Nos dois casos, as
médias de temperatura foram menores na área interna do que nos simulados
externos. Altas temperaturas somadas à incidência de luz explicam a menor
persistência do produto em simulado externo. Mulla e Darwazeh (1975)
76
descrevem rápida degradação de methoprene devido a esses fatores,
confirmando o que havia sido verificado por Schaefer e Dupras (1973) para este
IGR.
Outros IGRs já foram testados em condição de simulação de campo e
diretamente em campo sobre Aedes aegpyti, mas geralmente são utilizadas
doses muito superiores àquelas avaliadas aqui. Nayar et al (2002) observaram
que pyriproxifen é muito mais eficaz sobre larvas de Aedes aegypti do que
methoprene, quando avaliaram duas concentrações (0,02 ppm e 0,05 ppm)
desses produtos. Vythilingam et al (2005) obtiveram efeito residual de pyriproxifen
sobre Aedes aegypti por cerca de quatro meses em campo; esses mesmos
autores relatam efeito residual do produto por cerca de 10 semanas para larvas
de Aedes albopictus.
Nós realizamos a verificação do pH nos simulados de campo e
acreditamos ser essa medida muito relevante, pois aumento ou queda muito
bruscos de pH podem levar à morte das larvas, assim como afetar o produto.
Não encontramos diferenças entre os valores de pH do controle e dos tratados,
o que exclui o pH como o causador da mortalidade nos galões experimentais,
devendo essa mortalidade ser atribuída exclusivamente ao produto.
Outro aspecto da utilização de IGRs é seu impacto sobre artrópodes
não-alvo. Arrendondo-Jiménez e Valdez-Delgado (2006) verificaram o impacto
de novaluron sobre artrópodes não-alvo e concluíram que o efeito desse
produto varia de acordo com o grupo exposto. Esses mesmos autores não
encontraram impacto para a maioria das famílias de insetos não-alvo expostos
ao novaluron, assim como observado por Ali e Kok-Yokomi (1989) com o IGR
UC-84572.
Alguns IGRS afetam crustáceos não-alvo e espécies de insetos
filogeneticamente relacionadas, ou que compartilham o mesmo habitat. Porém,
os danos causados são rapidamente revertidos (Mulla 1995).
A recomendação da OMS para uso de novaluron em água potável
torna este produto uma grande promessa para o controle de Aedes aegypti. Os
resultados obtidos nesse trabalho mostram que novaluron é eficaz contra Aedes
aegypti, tanto em condições de laboratório como em simulado de campo. Além
disso, novaluron se mostrou eficiente contra populações resistentes a
inseticidas químicos. Também apresentou grande persistência em simulado de
77
campo, quando exposto às condições climáticas do nosso país. Esses
resultados reforçam o potencial desse CSI para o controle de Aedes aegypti no
Brasil.
78
6. Conclusões
• Populações brasileiras de Aedes aegypti apresentam resistência a
temephos e perfil variável de susceptibilidade a deltametrina.
• Novaluron inibe a emergência de Aedes aegypti adultos em
concentrações da ordem µg/L (IE99 de Rockefeller 0,3 µg/L). Este efeito
é dose-dependente, assim como a precocidade da mortalidade.
• Este CSI é eficaz sobre a cepa Rockefeller e populações de campo,
mesmo sobre aquelas que apresentam resistência a inseticidas
químicos, não ocorrendo, nesse caso, resistência cruzada.
• Novaluron causa anormalidades morfológicas em todos os estágios do
desenvolvimento de Aedes aegypti.
• Em simulados de campo, novaluron também é eficaz, tanto em área
interna quanto em área externa.
• A persistência desse produto varia de acordo com a área; nas condições
testadas, apresentou efeito residual (mortalidade maior que 70%) de 8-9
semanas em área interna e 5-6 semanas em área externa.
• Novaluron é eficaz sobre populações brasileiras de Aedes aegypti em
simulado de campo, independente de seu status de resistência aos
inseticidas químicos testados (organofosforado e piretróide).
• Novaluron se apresenta como uma alternativa promissora para o controle
de larvas de Aedes aegypti e possui um grande potencial para o uso no
controle desse vetor no Brasil.
79
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