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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

RAMILA DE BRITO MACÊDO

EFEITO DA INIBIÇÃO DA CALCINEURINA PELA CICLOSPORINA A EM CÉLULAS PLANCTÔNICAS E BIOFILMES DO COMPLEXO

Candida parapsilosis

Fortaleza

2013

RAMILA DE BRITO MACÊDO EFEITO DA INIBIÇÃO DA CALCINEURINA PELA CICLOSPORINA A

EM CÉLULAS PLANCTÔNICAS E BIOFILMES DO COMPLEXO Candida parapsilosis

Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas, do Centro de Ciências da Saúde, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Profa. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro Co-Orientador: Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim

Fortaleza 2013

RAMILA DE BRITO MACÊDO

EFEITO DA INIBIÇÃO DA CALCINEURINA PELA CICLOSPORINA A EM CÉLULAS PLANCTÔNICAS E BIOFILMES DO COMPLEXO

Candida parapsilosis Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas, do Centro de Ciências da Saúde, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.

Aprovada em: ___/___/______

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Prof.ª Dr.ª Rossana de Aguiar Cordeiro (Orientador)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_______________________________________ Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha

Universidade Estadual do Ceará (UECE)

_________________________________________ Prof. Dr. Renato Evandro

Universidade Federal do Ceará (UFC)

Aos meus pais.

AGRADECIMENTOS

À instituição UFC, Universidade Federal do Ceará, pelo apoio estrutural, humano e material.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas pelo ótimo acolhimento.

Ao CEMM, Centro Especializado em Micologia Médica, pelo aprendizado diário e ter

possibilitado a execução desse trabalho.

Aos professores do CEMM: José Júlio Costa Sidrim, Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante,

Tereza de Jesus Pinheiro Gomes Bandeira pelos ensinamentos, direcionamentos e pelo

engrandecimento intelectual não só meu como de todos os alunos que fazem ou fizeram parte

da “Família CEMM”.

A minha orientadora Rossana de Aguiar Cordeiro, pelo conhecimento repassado, pela

paciência, interesse e disponibilidade com que me acompanhou durante esses anos. Aprendi

lições valiosas tanto profissionalmente quanto pessoalmente que levarei para vida.

Aos professor Marcos Fábio Rocha Gadelha pelo acompanhamento, principalmente, nos

últimos meses e pela sua gentileza e educação.

Ao Dr. Renato Everardo pela disponibilidade em participar da banca da defesa.

A Ana Karoline da Costa Ribeiro e a Camila Gomes Virgínio Coelho em participar da banca

de qualificação e por suas considerações pertinentes.

Ao Doutorando Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira pela imprescindível ajuda na realização

desse trabalho, além do grande carinho.

A todos os meus colegas de laboratório por todo o carinho, compreensão e ajuda

disponibilizada.

Aos funcionários da instituição, tanto do programa das Ciências Médicas quanto da

Microbiologia, desde recepção, passando pelas secretarias e chegando aos técnicos do

laboratório, que sempre me receberam com carinho, amizade, respeito e cumplicidade.

Aos meus pais, pois sem eles nada disto seria possível. Mesmo nas situações mais complicadas

o apoio deles foi muito importante para que eu conseguisse concluir o objetivo a que me propus.

A todos aqueles que participaram direta ou indiretamente e que estiveram ao meu lado durante

a realização deste trabalho.

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.”

(Cora Coralina)

RESUMO

O Complexo Candida parapsilosis compreende três espécies, C. parapsilosis stricto sensu, C.

metapsilosis e C. orthopsilosis, que possuem características fenotípicas iguais, podendo ser

diferenciadas apenas pelo genótipo utilizando a técnica de PCR com enzima de restrição. O

Complexo C. parapsilosis vem ganhando destaque na epidemiologia mundial da candidíase por

ser a 2a ou 3a espécies mais isolada, além disso, relatos de resistência a alguns antifúngicos são

preocupantes. A calcineurina molécula responsável, também, pela resistência aos antifúngicos

e pensando em novos alvos moleculares para as drogas que o objetivo desse trabalho foi, avaliar

o potencial sinérgico de antifúngicos e do inibidor de calcineurina, ciclosporina A, contra

formas planctônicas e biofilmes de cepas do Complexo C. parapsilosis de origens clínicas. Os

ensaios de sensibilidade com anfotericina B, fluconazol, voriconazol, caspofungina e

ciclosporina A foram realizadas pela técnica de microdiluição, em conformidade com as

orientações do Clinical Laboratory Standards Institute. Os testes de sinergismo contra células

planctônicas de cepas do Complexo C. parapsilosis foram realizados pelo método de

Checkerboard, em ensaio de microdiluição. Combinações formadas por antifúngicos com

ciclosporina A foram avaliados contra biofilmes em formação e maduros, em placas de

poliestireno, onde diferenças no padrão de sensibilidade aos antifúngicos entre as espécies não

foram observadas, porém cepas de C. parapsilosis stricto sensu foram mais sensíveis à

ciclosporina A que C. orthopsilosis e C. metapsilosis. O sinergismo entre os antifúngicos e

ciclosporina A foi observado em cepas do Complexo C. parapsilosis. As combinações

formadas por antifúngicos e ciclosporina A foram capazes de impedir o crescimento das

espécies do Complexo na fase planctônica, bem como, na formação de biofilme nas CIM10X e

CIM50X e mostrou efeito inibitório contra biofilmes maduros de C. parapsilosis stricto sensu,

C. metapsilosis e C. orthopsilosis nas CIM50X. Os resultados obtidos reforçam o potencial de

inibição da calcineurina fúngica como uma abordagem promissora para aumentar a eficiência

de drogas antifúngicas.

Palavras-chaves: Complexo Candida parapsilosis; sensibilidade; antifúngicos; sinergismo;

inibidor da calcineurina; biofilme.

ABSTRACT Candida parapsilosis Complex comprises three species, C. parapsilosis sensu stricto, C.

metapsilosis and C. orthopsilosis, which have the same phenotypic characteristics, can be

differentiated only by the genotype using PCR with restriction enzyme. The C. parapsilosis

Complex is gaining prominence in the global epidemiology of candidiasis to be the second or

third most isolated species, moreover, reports of resistance to some antifungal agents are

worrying. Calcineurin molecule also responsible for resistance to antifungal drugs and thinking

of new molecular targets with the objective of this study was to evaluate the potential

synergistic antifungal and calcineurin inhibitor, cyclosporin A, against planktonic and biofilm

forms of strains C. parapsilosis Complex from clinical sources. The susceptility assays with

amphotericin B, fluconazole, voriconazole, caspofungin and cyclosporin A were performed by

microdilution in accordance with the guidelines of the Clinical Laboratory Standards Institute.

The method board in microdilution assay performed tests for synergism against planktonic cells

of strains of C. parapsilosis Complex. Antifungal combinations formed by cyclosporin A were

evaluated against biofilms forming and mature in polystyrene plates, where differences in the

pattern of antifungal susceptibility among species were observed, but strains of C. parapsilosis

sensu stricto were more sensitive to cyclosporin A to C. orthopsilosis and C. metapsilosis.

Synergism between the antifungal and cyclosporin A was observed in strains of C. parapsilosis

Complex. The combinations formed by antifungal and cyclosporin A were able to prevent the

growth of the species in the planktonic phase of the complex, as well as in biofilm formation in

CIM10X and CIM50X and showed inhibitory effect against mature biofilms of C. parapsilosis

sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis in CIM50X. These results support the potential

of inhibiting fungal calcineurin as a promising approach for increasing the efficiency of

antifungal drugs.

Keywords: Candida parapsilosis Complex; susceptibility; antifungals; synergism; calcineurin

inhibitor; biofilm.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- (a) Formação de pseudo-hifas: anel do septo entre a célula mãe e a célula-filha, iniciando o fuso mitótico; (b) Formação de hifas verdadeiras: projeção do tubo germinativo...............................................................................................................................22

Figura 2- Aspectos macromorfológicos (a) e micromorfológico (b) do Complexo Candida parapsilosis...............................................................................................................................23

Figura 3- a) Colônias do Complexo C. parapsilosis em meio cromogênico apresentando coloração de branca a lilás; b) Prova de assimilação de carbono........................................... ..24

Figura 4- Gel de agarose a 1%, mostrando fragmentos de bandas de aproximadamente 716 pb, concluindo que as cepas de 1-8 são pertencentes ao Complexo C. parapsilosis, C - controle negativo da reação e M - marcador molecular de 1000 pb....................................................... 45

Figura 5- Gel de agarose a 2% mostrando digestão do produto do PCR-SADH com enzima de restrição BanI. C. parapsilosis stricto sensu (poço 6), C. metapsilosis (poços 1, 2, 3, 7 e 8) e C. orthopsilosis (poços 4 e 5). C – controle negativo e M – marcador molecular............... .....46

Figura 6- Gráfico de biofilme em formação para C. parapsilosis stricto sensu mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X..........52

Figura 7- Gráfico de biofilme em formação para C. metapsilosis mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X............................. ...52

Figura 8- Gráfico de biofilme em formação para C. orthopsilosis mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X........................... .....53

Figura 9- Gráfico de biofilme maduro para C. parapsilosis stricto sensu. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X........................ ...54

Figura 10- Gráfico de biofilme maduro para C. metapsilosis. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.......................................................54

Figura 11- Gráfico de biofilme maduro para C. orthopsilosis. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.......................................................54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Resultado da identificação molecular das 39 cepas..............................................44

Tabela 2- Perfil de sensibilidade das cepas do Complexo C. parapsilosis na forma planctônica frente a drogas antifúngicas e ciclosporina A................................ ...........46

Tabela 3- Variações das concentrações inibitórias mínimas para cada droga de cada espécie...................................................................................................................................47

Tabela 4- Perfil de sensibilidade do Complexo C. parapsilosis na forma planctônica frente a combinações de ciclosporina A e drogas antifúngicas......................................................49-50

Tabela 5- Variação da CIM no sinergismo entre drogas antifúngicas e CsA..........................51

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Origem das cepas do Complexo C. parapsilosis.................................................37

Quadro 2. Concentrações de cada droga testada isoladamente ou em combinações..............41

Quadro 3. Relação de cepas utilizadas para os testes com biofilme.......................................42

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATCC American Type Culture Collection

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CHEF Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields

EUA Estados Unidos da América

g Grama (s)

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

IgG Imunoglobulina G

IL Interleucina

ITS Espaçadores Internos Transcritos

MIC Concentração Inibitória Mínima

pb Pares de base

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PBS Tampão fosfato-salino

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

PCR-REA PCR com enzima de Restrição

SADH Secondary Alcohol Dehydrogenase

Sap Proteinase Aspártica

TBE Tampão TRIS-borato-EDTA

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 15

1.1 O GÊNERO CANDIDA: ASPECTOS GERAIS 15

1.2 ASPECTOS HISTÓRICOS 16

1.3 O COMPLEXO Candida parapsilosis 17

1.4 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS 19

1.5 ASPECTOS MORFOFISIOLÓGICOS 21

1.6 IDENTIFICAÇÃO DO COMPLEXO Candida parapsilosis 23

1.7 PATOGENIA E FATORES DE VIRULÊNCIA 24

1.7.1Fosfolipases 26

1.7.2 Proteases 27

1.7.3 Biofilme 28

1.8 SENSIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS 29

1.9 CALCINEURINA 31

1.9.1 Ciclosporina A 33

2 PERGUNTAS DE PARTIDAS 34

3 HIPOTÉSES CIENTÍFICAS 35

4 OBJETIVOS 35

4.1 OBJETIVO GERAL 35

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 35

5 MATERIAL E MÉTODOS 36

5.1 RECUPERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS CEPAS DO COMPLEXO C.

parapsilosis

36

5.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DAS CEPAS DO COMPLEXO C.

parapsilosis

38

5.3 DROGAS ANTIFÚNGICAS E CICLOSPORINA A 39

5.4 TESTES DE SENSIBILIDADE IN VITRO 39

5.4.1 Preparo do inóculo 40

5.4.2 Microdiluição 40

5.4.3 Avaliação do sinergismo pelo método Checkerboard 40

5.5 INIBIÇÃO DE BIOFILMES DO COMPLEXO C. parapsilosis 41

5.5.1 Formação de biofilme 41

5.5.2 Inibição da formação de biofilmes por CsA e drogas antifúngicas 42

5.5.3 Efeito da CsA e drogas antifúngicas sobre biofilme formado no Complexo C.

parapsilosis

43

6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 44

7 RESULTADOS 44

7.1 IDENTIFICAÇÃO E CONFIRMAÇÃO DAS CEPAS 44

7.2 SENSIBILIDADE IN VITRO DO COMPLEXO C. parapsilosis FRENTE À

CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS

46

7.3 EFEITO DA COMBINAÇÃO DA CsA E ANTIFÚNGICOS EM CEPAS DO

COMPLEXO C. parapsilosis

47

7.4 EFEITO DA CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS ISOLADAS E EM

COMBINAÇÃO NA FORMAÇÃO DE BIOFILMES DE C. parapsilosis

52

7.5 EFEITO DA CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS ISOLADAS SOBRE

BIOFILME MADURO DE C. parapsilosis

53

8 DISCUSSÃO 55

9 CONCLUSÃO 58

10 ARTIGO CIENTÍFICO 59

11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 85

15

1 INTRODUÇÃO

1.1 O GÊNERO CANDIDA: ASPECTOS GERAIS

São microrganismos eucariontes, heterotróficos, anamórficos (DE HOOG et al.,

2000), possuem ampla distribuição e são encontrados nos mais diversos habitats;

(PFALLER; DIEKEMA, 2007).

Taxonomicamente, as leveduras desse gênero pertencem ao Reino Fungi, filo

Ascomycota; subfilo Saccharomycotina, classe Saccharomycetes, ordem

Saccharomycetales e família Saccharomycetaceae (NCBI, 2013).

Espécies de Candida residem como comensais, fazendo parte da microbiota

humana e animal (BARBEDO; SGARBI, 2010), estando presente na mucosa oral do trato

gastrointestinal e geniturinário dos seres humanos (MICELI et al., 2011). Todavia,

quando ocorre um desequilíbrio no sistema imunológico do hospedeiro, esses

microrganismos podem passar de agentes da microbiota para agentes patogênicos,

causando infecção e quadros de fungemias (BARBEDO; SGARBI, 2010; MICELI et al.,

2011).

Aproximadamente 65% das espécies de Candida são incapazes de crescer a uma

temperatura acima de 37 °C, o que impede estas espécies de serem agentes patogênicos

bem sucedidos (SILVA et al., 2012). Atualmente, mais de 300 espécies heterogêneas já

foram descritas (NCBI, 2013), porém mais de 17 delas são conhecidas por serem agentes

etiológicos de infecções humanas (PFALLER; DIEKEMA, 2007; SARDI et al., 2013),

dado considerável se compararmos que, em 1963, eram conhecidas apenas cinco espécies

de Candida como causadoras de doenças em humanos, incluindo C. albicans, C.

parapsilosis, C. tropicalis, C. stellatoidea (C. albicans var stellatoidea) e C.

guilliermondii (NCBI, 2013).

Os membros do gênero Candida são os mais frequentemente isolados de infecções

fúngicas, sendo mais de 90% causadas por Candida albicans, Candida glabrata, Candida

parapsilosis, Candida tropicalis e Candida krusei (PFALLER; DIEKEMA, 2007;

SILVA et al., 2012). Ademais, é a quarta principal causa de infecção da corrente

sanguínea nosocomial nos Estados Unidos, com um custo anual estimado em $ 2 bilhões

e mortalidade que excede os 40%, apesar da administração de terapêutica antifúngica e

16

modernas instalações de unidade de terapia intensiva (HORN et al., 2009; LIONAKIS;

NETEA, 2013).

As infecções fúngicas invasivas, especialmente aquelas causadas por Candida

spp., continuam a ser uma importante causa de mortalidade em pacientes

imunocomprometidos e aqueles submetidos a procedimentos invasivos (BORMAN et al.,

2009). Embora a espécie Candida albicans seja a mais comum encontrada em infecções

humanas (PFALLER et al., 1999; SANDVEN, 2000; BORMAN et al., 2009), todavia nos

últimos anos, vem sendo descrito um aumento no número de infecções invasivas causadas

por espécies de Candida não-albicans e, dentre estas, Candida parapsilosis é

freqüentemente isolado de mucosas e infecções sistêmicas em todo o mundo (NCBI,

2013).

1.2 ASPECTOS HISTÓRICOS

Os primeiros relatos escritos de lesões compatíveis com candidíase datam da

época de Hipócrates (460 a 337 a.C.), que constatou e descreveu a candidose oral, ao

observar a presença de placas esbranquiçadas na cavidade oral de uma criança recém-

nascida. Anos mais tarde, Galeno (200 a 130 a.C.) relatou achados semelhantes àqueles

descritos por Hipócrates. Todavia, o gênero só foi descrito pela primeira vez em 1839 por

Langenbeck, que observou o microrganismo em lesões orais de pacientes com tifo e,

erroneamente, o descreveu como agente etiológico daquela doença (ODDS, 1988).

Em 1842, David Gruby definiu a patogenia da candidíase oral e classificou o seu

agente etiológico como pertencente ao gênero Sporotrichum, mas, somente em 1846,

Berg estabeleceu definitivamente a relação do microrganismo com a ocorrência de

candidíase oral. Posteriormente, em 1853, Charles Robin denominou esse microrganismo

como Oidium albicans e, em 1861, Zenker descreveu o primeiro caso de infecção cerebral

por disseminação hematogênica associado ao gênero Candida. Em 1862, Mayer

descreveu seis casos de candidíase vaginal e foi capaz de reproduzir experimentalmente

a infecção em coelhos (ODDS, 1988).

Em 1875, Haussmann relatou vínculo entre candidíase vaginal da mãe e a

ocorrência de candidose em recém-nascido. Zopf, em 1890, redenominou o

microrganismo de Monilia albicans. Anos mais tarde, em 1923, Berkhout classificou esse

17

microrganismo como pertencente ao gênero Candida e à espécie Candida albicans

(SIDRIM; ROCHA, 2004).

Posteriormente, Virchow demonstrou a capacidade de invasão nos tecidos pelo

microrganismo. Em 1940, foi descrito o primeiro caso de isolamento da levedura em

corrente sanguínea (HURLEY, 1964; HURLEY; WINNER, 1964; SIDRIM, 1999).

Até as décadas de 1960 e 1980, a candidiase disseminada era considerada uma

doença rara, ocorrendo predominantemente em pacientes submetidos a cirurgias com

queimaduras graves ou vítimas de traumas, bem como em pacientes gravemente

neutropênicos, com leucemia ou linfoma. Em 1981, foi descrito o primeiro caso de

infecção invasiva por Candida, todavia o marco da historia das infecções por Candida

ocorreu, a partir da década de 1980, com a epidemia do vírus HIV e, consequentemente,

com a introdução do uso indiscriminado de antifúngicos e antibióticos (JARVIS, 1995).

A partir da década de 90, com o advento das técnicas de identificação molecular,

microrganismos puderam ser revalidados (SULLIVAN et al., 1995), como por exemplo

a espécie C. parapsilosis, que foi reclassificada em três espécies distintas assim

designadas: como C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis e C. Metapsilosis,

constituindo assim um Complexo (TAVANTI et al., 2005).

1.3 O COMPLEXO CANDIDA PARAPSILOSIS

A levedura C. parapsilosis foi, originalmente, descrita por Ashford como uma

espécie de Monilia não fermentadora de maltose isolada de amostras de fezes de um

paciente com diarréia na cidade de Porto Rico, em 1928. A espécie foi nomeada Monilia

parapsilosis para distinguí-la da espécie mais comum, Monilia psilosis, conhecida, hoje,

como Candida albicans (TROFA et al., 2008). Em 1932, a espécie foi reclassificada

como Candida parapsilosis por Langeron e Talice (NOSEK et al., 2009).

Embora bem definida por padrões fenotípicos, estudos prévios mostraram uma

grande diversidade genética entre os isolados de C. parapsilosis. No final da década de

1980, pesquisadores do Veterans Administration Medical Center em San Antonio, Texas,

EUA, reportaram aumento da incidência de C. parapsilosis como agente de infecções

nosocomiais, cujas frequências de isolamento superaram até mesmo aquelas por C.

albicans (PIPER et al., 1988). A fim de investigar se o surto epidêmico possuía uma

origem única, Lehmann e colaboradores (1989) avaliaram o perfil de isoenzimas desses

18

isolados e sugeriram a existência de grupos geneticamente distintos entre eles. Resultados

semelhantes também foram encontrados por Carruba e colaboradores (1991) após análise

de 16 isolados clínicos e ambientais de C. parapsilosis por meio de técnicas de

cariotipagem eletroforética.

Em 1992, Lehmann e colaboradores realizaram um estudo pioneiro almejando a

distinção de C. albicans, C. lusitaniae, C. tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis por

meio da técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Os pesquisadores

incluíram oito isolados de C. parapsilosis dos grupos previamente identificados por Piper

et al. (1988) e verificaram que os oligonucleotídeos RP2 e RP4-2 eram capazes de

diferenciar um painel de cepas de C. parapsilosis fisiologicamente homogêneas em três

grupos geneticamente distintos. A heterogeneidade genética em isolados da mesma

espécie também foi confirmada por Lott e colaboradores (1993), por meio da combinação

de resultados obtidos com as técnicas de CHEF (Contour-Clamped Homogeneous

Electric Fields) e RAPD.

Em 1995, Lin e colaboradores avaliaram características fenotípicas e moleculares

de 45 isolados de C. parapsilosis, incluindo 31 cepas oriundas dos casos reportados em

um hospital no Texas. Os autores analisaram o padrão eletroforético de diversas enzimas

(malato desidrogenase, manitol desidrogenase, glicose 6-fosfato desidrogenase, sorbitol

desidrogenase, α-glicosidase, β-glicosidase, superóxido-dismutase, α-esterase, α-

manosidase, catalase, fosfatase alcalina e fosfatase ácida), além do sequenciamento das

regiões ITS1, ITS2 e 5.8S do rDNA e testes de sensibilidade antifúngica. Os resultados

mostraram que os isolados poderiam ser classificados em três grupos distintos, baseados

no padrão eletroforético das enzimas α-esterase, superóxido-dismutase e glicose 6-fosfato

desidrogenase, denominados Candida parapsilosis grupo I, II e III (LIN et al., 1995). A

partir de então, diversos estudos, baseados em outras técnicas moleculares, comprovaram

os achados de Lin e colaboradores (ROY; MEYER, 1998; KATO et al., 2001; NOSEK

et al., 2002). Segundo alguns autores (CASSONE et al., 1995; LIN et al., 1995; ROY;

MEYER, 1998; KATO et al., 2001), essas diferenças seriam suficientes para que os três

grupos genéticos de C. parapsilosis fossem reconhecidos como espécies distintas.

Como parte dos estudos de caracterização molecular de espécies patogênicas do

gênero Candida por meio da técnica de MLST (Multilocus Sequence Typing), em 2005,

Tavanti e colaboradores apresentaram os resultados da caracterização de cepas de C.

parapsilosis baseados em 11 diferentes loci: protease ácida (dois loci), citocromo oxidase,

galactoquinase, citocromo P450 demetilase, desidrogenase alcóolica, protease aspártica,

19

alanil-TRNA sintetase, topoisomerase tipo II, orotidina 5’-fosfato descarboxilase. Os

autores investigaram 32 isolados de C. parapsilosis, assim distribuídos: 21 isolados do

Grupo I, nove isolados do Grupo II e dois isolados do Grupo III, definidos com base na

reação de RAPD com o oligonucleotídeo RPO2 (RYCOVSKA et al., 2002) e

sequenciamento da região ITS1 (LIN et al., 1995). Apesar de não ter sido possível detectar

polimorfismos nem mesmo de base única com os marcadores genéticos escolhidos entre

os 21 isolados do Grupo I, Tavanti e colaboradores detectaram diferenças entre os

isolados de cada um dos grupos, após amplificação do gene do SADH, (Secondary

Alcohol Dehydrogenase). Baseados nos resultados obtidos, bem como na extensa

descrição das diferenças existentes entre os três grupos por outros autores, Tavanti e

colaboradores propuseram a seguinte denominação taxonômica para esses organismos:

C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis e C. metapsilosis para os isolados

originalmente reunidos nos grupo I, II e III, respectivamente (TAVANTI et al., 2005).

1.4 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS

A incidência de candidíase invasiva vem aumentando em todo o mundo, nos

últimos 10 anos, (BASSETTI et al., 2011) e está associada a uma alta taxa de mortalidade

(PFALLER; DIEKEMAN, 2010; CANTÓN et al., 2011).

Atualmente, uma grande proporção de infecções da corrente sanguínea é causada

devido às espécies de Candida não-albicans, em destaque para o Complexo Candida

parapsilosis que é o segundo agente do gênero Candida mais isolado de hemoculturas na

Ásia, América Latina e alguns países europeus (ALMIRANTE et al., 2005; PFALLER;

DIEKEMAN, 2007; COSTA DE OLIVEIRA et al., 2008; PEMÁN et al., 2011).

Na Europa, o Complexo C. parapsilosis é o segundo ou terceiro agente mais

comum, estando responsável por 15-23% de todos os episódios de candidemia

(ALMIRANTE et al., 2005; TORTORANO et al., 2006). Em pesquisa realizada na

Espanha (CANTÓN et al., 2011) e Itália (BASSETI et al., 2011), Complexo C.

parapsilosis superou as outras não-albicans tornando-a a segunda espécie mais isolada

de hemoculturas depois de C. albicans.

Nos EUA, o Complexo C. parapsilosis é o terceiro agente mais comum em

pacientes > 12 anos (12%) e o segundo mais comum em pacientes mais jovens (34%)

(PAPPAS et al., 2003; TROFA et al., 2008).

20

O Complexo Candida parapsilosis é mais frequentemente isolado em pacientes

hospitalizados (ALMIRANTE et al., 2005). Além disso, é o segundo causador mais

comum de candidemia em crianças (BLITH et al., 2009; ARENDRUP et al., 2011),

principalmente em prematuros internados em unidades de terapia intensiva

(PASQUALOTTO, et al., 2005; FRANÇA et al., 2008; HINRICHSEN et al., 2008),

tornando a espécie predominante em alguns hospitais pediátricos (NEU et al., 2009;

CANTÓN et al., 2011).

No Brasil, o Complexo é relatado como espécie mais isolada de Candida não-

albicans (AQUINO et al., 2005; GONÇALVES et al., 2009; MOTTA et al., 2011). Na

região do Nordeste, foram descritos dois estudos em hospitais de referência de Recife

(HINRICHSEN et al., 2008) e de Fortaleza (MEDRANO et al., 2006), que também

confirmam essa prevalência.

Estudo multicêntrico aponta que o Complexo C. parapsilosis foi mais

frequentemente isolado no Kuwait (30,6%), América do Sul (20,5-21,3%), Espanha

(23%) e Austrália (19,9%); já em isolados hospitalar a maior frequência foi na Arábia

Saudita (44%), seguida por Itália (35,5%) e Portugal (32%). Nas unidades de tratamento

intensivo, as percentagens mais elevadas para o Complexo C. parapsilosis foi na Espanha

(67%), seguido pela Eslováquia (48%) e nos EUA (33,7%) (FALAGAS et al., 2010).

Distinguir a prevalência das espécies do Complexo C. parapsilosis está sendo uma

ferramenta para melhor entendimento das suas peculiaridades. Duas pesquisas

envolvendo cepas de candidemia sistêmica originárias de várias partes do mundo

mostraram que mais 90% dos isolados, eram de C. parapsilosis stricto sensu, ≥ 5% eram

isolados de C. orthopsilosis, ≥ 1,5% de C. metapsilosis (LOCHART et al., 2008;

DIEKEMA et al., 2009).

Na Oceania, especificamente na Austrália, a espécie mais isolada, com 94%, foi

C. parapsilosis stricto sensu, em seguida, com 3,7%, C. orthopsilosis e, com 2,1%, C.

metapsilosis. Na América Central, notadamente no México, foram isoladas 90,4% de C.

parapsilosis stricto sensu, 29% de C. orthopsilosis e 4% de C. metapsilosis. Cepas de C.

parapsilosis stricto sensu foram recuperadas a partir de todos os tipos de amostras

biológicas, particularmente associada a hemocultura. Cepas de C. orthopsilosis e C.

metapsilosis foram primeiramente isoladas a partir de sangue e de pele, respectivamente

(TREVIÑO-RANGEL et al., 2012).

No continente europeu, foi encontrado o maior número de estudos envolvendo a

epidemiologia das cepas do Complexo, que mostrou maior isolamento de C. parapsilosis

21

stricto sensu, seguido por C. orthopsilosis e C. metapsilosis (SILVA et al., 2009;

GARCÍA-EFFRON et al., 2011; CANTÓN et al., 2011; MIRANDA-ZAPICO et al.,

2011). No estudo realizado por de Toro et al. (2011), não foram isoladas nenhuma cepa

de C. metapsilosis (DE TORO et al., 2011). Já em estudos em Portugal e outro na

Hungria, as proporções de C. metapsilosis foram superiores ao de C. orthopsilosis

(KOCSUSÉ et al., 2007; GÓMEZ-LÓPEZ et al., 2008), fato também confirmado por

Chen e colaboradores em cepas isoladas na região de Taiwan (CHEN et al., 2010).

No Brasil, entre 2003 e 2004, uma pesquisa laboratorial prospectiva de

candidemia, realizada em 11 hospitais gerais situados em nove cidades brasileiras,

durante um período de 24 meses, 141 isolados, dos quais 88% foram identificados como

C. parapsilosis stricto sensu, 9% de C. orthopsilosis e 3 % de C. metapsilosis. Os dados

não são necessariamente representativos de toda a região. Portanto, mais estudos com

maior número de isolados são necessários (GONÇALVES et al., 2009).

1.5 ASPECTOS MORFOFISIOLÓGICOS

As leveduras do gênero Candida fazem parte de um grupo heterogêneo de

organismos. Macroscopicamente, as colônias, semeadas em ágar Sabouraud dextrose

(SDA), dependendo da espécie, podem apresentar coloração de branca a creme, a textura

pode ser lisa, brilhante, enrugada, seca, esférica ou de forma oval, bem como podem

medir aproximadamente 2-5 x 3-7 mm de tamanho (LARONE et al., 2002; SILVA et al.,

2012).

Espécies de Candida podem crescer em três principais morfologias celulares:

blastoconídeos, pseudo-hifas e hifas. Os blastoconídeos são células únicas ovais que

podem exibir tanto brotamento axial e bipolar (THOMPSON et al., 2011). Pseudo-hifas

e hifas são popularmente chamadas de "filamentos", pois as células crescem tipicamente

de forma polarizada, além de serem alongadas e ligadas ponta a ponta. O critério para a

diferenciação entre hifa verdadeira e pseudo-hifa está na observação da formação do tubo

germinativo (SUDBERY et al., 2004). Na formação de hifas verdadeira, não há a

constrição entre a célula mãe e o filamento; já pseudo-hifas possuem a constrição entre a

célula mãe e o comprimento do filamento (WHITEWAY et al., 2007; BARBEDO;

SGARBI, 2010).

22

A maior diferença entre a hifa verdadeira e a pseudo-hifa está na organização de

seus ciclos celulares. A hifa que se projeta no primeiro ciclo celular, antes da formação

do septo, é chamada de tubo germinativo, termo que deveria ser usado para descrever o

alongamento que desenvolve a hifa. O termo hifa refere-se a toda estrutura ramificada e

aos filamentos que contêm mais de um septo e ausência de constrições (BARBEDO;

SGARBI, 2010). Porém, no primeiro ciclo celular da pseudo-hifa, o anel do septo aparece

entre a célula mãe e a célula-filha antes do surgimento do broto. O processo de mitose é

iniciado e, quando se completa, as células separam-se, com a formação de um septo

composto principalmente de quitina, ver figura 1. Já se tratando de ciclo celular de

pseudo-hifas e blastoconídeos, não existem muitas diferenças, com exceção do

alongamento e da separação da célula por completo, permitindo a formação do septo,

sendo que na pseudo-hifa as formações do septo e da constrição coincidem no mesmo

ponto (BARBEDO; SGARBI, 2010).

Fatores adicionais, tais como a biossíntese de esfingolípideos e calmodulina, são

conhecidos por controlar a progressão do ciclo celular das hifas. As hifas são também

conhecidas por possuírem várias estruturas que estão ausentes nas pseudo-hifas

(SUDBERY et al., 2004; THOMPSON et al., 2011). A orientação do tubo germinativo,

no estado leveduriforme nas pseudo-hifas, é determinada pelo polarissoma (complexo de

proteínas envolvidas na orientação do crescimento do tubo germinativo), enquanto na

formação do tubo germinativo de hifas verdadeiras a orientação é determinada tanto pelo

polarissoma como pelo spitzenkörper (estrutura responsável pelo crescimento e

desenvolvimento polarizado encontrada apenas em hifas verdadeiras) (CAMPRIM et al.,

2005; WHITEWAY et al., 2007). É importante ter em mente que, enquanto pseudo-hifas

parecem fisicamente mais com as hifas, elas realmente compartilham muito mais

propriedades com os blastoconídeos (THOMPSON et al., 2011).

Figura 1. (a) Formação de pseudo-hifas: anel do septo entre a célula mãe e a célula-filha, iniciando o fuso mitótico; (b) Formação de hifas verdadeiras: projeção do tubo germinativo.

A estrutura morfológica clamidoconídeo encontrada em C. albicans são grandes

(3 a 4 vezes o tamanho da levedura), redondas, com paredes espessas que tipicamente se

23

formam nas extremidades dos filamentos das hifas (THOMPSON et al., 2011). Estas

estruturas são geralmente formadas em resposta a condições nutricionais pobres.

(BARBEDO; SGARBI, 2010; THOMPSON et al., 2011). Ver figura 2.

1.6 IDENTIFICAÇÃO DO COMPLEXO Candida parapsilosis

Diferentes técnicas para identificação de leveduras do gênero Candida são

utilizadas, atualmente, desde diagnóstico baseado em morfologia, limitações nutricionais

e características bioquímicas à utilização de técnicas mais modernas, como kits

comerciais, testes imunológicos e técnicas moleculares (DE HOOG et al., 2010).

O diagnóstico micológico para o gênero Candida inicia-se, na confecção de

lâminas contendo amostras do espécime clínico, clarificadas com KOH (aquoso a 20%)

e visualizadas em microscópio óptico, com a finalidade de observar blastoconídios e

pseudo-hifas. Posteriormente, as amostras clínicas são repicadas em meios de cultura

clássicos, como ágar Sabouraud, ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ágar

Sabouraud acrescido de cloranfenicol e de cicloheximida (SIDRIM; ROCHA, 2004).

Após 24 horas, entre as temperaturas de 25 a 35 ºC, as colônias são avaliadas

morfologicamente, as quais são, normalmente, de coloração branca a creme, glabrosa e

convexa (DE HOOG et al., 2000; TORTORA et al., 2005). Em seguida, é realizada a

avaliação micromorfológica, por meio do repique em ágar Cornmeal-Tween 80 (DE

HOOG et al., 2000) que se baseia no princípio de que a incubação neste meio estimula a

produção de conídios e filamentação, sendo possível sugerir à espécie, através do estudo

da presença e da disposição dos blastoconídios e pseudo-hifas (SIDRIM; ROCHA, 2004;

MILAN; ZAROR, 2004). Figura 2.

Fonte: CEMM, 2012 Figura 2. Aspectos macromorfológicos (a) e micromorfológico (b) do Complexo Candida parapsilosis.

a b

24

Vale destacar que a identificação pode não ser determinada através apenas de

características macro e micromorfológicas, sendo necessária a realização de testes

bioquímicos, como a assimilação e a fermentação de carboidratos, assim como a

assimilação de nitrogênio e a prova da enzima urease. Adicionalmente, faz-se o uso de

meio cromogênico específico para o gênero, o qual diferencia as espécies com base na

coloração apresentada por elas quando crescidas nesse meio (MURRAY et al., 2006). Ver

figura 3.

Mesmo com todos os testes citados acima, as espécies do Complexo não se

diferenciam. A atual diferenciação das espécies do Complexo acontece por identificação

molecular, utilizando a técnica de PCR com restrição de enzima (TAVANTI et al., 2005).

Fonte: CEMM, 2012 Figura 3. a) Colônias do Complexo C. parapsilosis em meio cromogênico apresentando coloração de branca a lilás; b) Prova de assimilação de carbono.

1.7 PATOGENIA E FATORES DE VIRULÊNCIA

A capacidade da levedura em aderir, infectar e causar doença é definida como

potencial de virulência ou patogenicidade (TAMURA et al., 2007). Para estabelecer a

doença, o microrganismo pode expressar uma variedade de fatores inerentes que

contribuem para estabelecer a doença (LIONAKIS; NETEA, 2013).

Espécies do gênero Candida são encontradas como parte da microbiota de

diferentes sítios anatômicos no hospedeiro imunocompetente (DE LUCA et al., 2012),

como por exemplo: pele, trato gastrintestinal, trato geniturinário e trato respiratório

superior, permanecendo sem causar danos (DESTIN et al., 2010), bem como do ambiente,

em cateteres e dispositivos médicos (SILVA et al., 2005). Entretanto, se o hospedeiro

entra em um estado de comprometimento imunológico, o microrganismo pode dar início

a uma infecção oportunista (SMEEKENS et al., 2013).

ba

25

Candida spp. são importantes patógenos de humanos, porém 10% das espécies

causam infecções podendo ser do tipo aguda ou crônica, superficial ou profunda,

localizada ou disseminada (SILVA et al., 2005), as quais podem causar mortalidade com

taxas entre 20-60% (SMEEKENS et al., 2013).

Nas últimas décadas, observou-se um aumento significativo na incidência de

infecções fúngicas oportunistas por Candida spp., aumento esse atribuído ao crescente

número de pacientes portadores de neoplasias ou doenças degenerativas, indivíduos

transplantados e portadores do vírus HIV (CONDE-ROSA et al., 2010).

Mudanças fisiológicas no hospedeiro são os principais fatores que levam a um

quadro de infecção por Candida spp, porém, fatores inerentes ao patógeno, (LINDE et

al., 2010) também chamados de fatores de virulência, podem contribuir para a instalação

da doença (BLANCO et al., 2010; LIU et al., 2010), a saber: o aumento do potencial

patogênico do microrganismo, o aumento da habilidade do mesmo em colonizar e invadir

tecidos do hospedeiro, de escapar do sistema imune e, por fim, aumentar a morbidade e a

mortalidade (CHOW et al., 2012).

Entre os fatores de virulência apresentados por Candida spp. pode-se citar a

capacidade de crescer a 37 ºC, a produção de metabólitos capazes de causar manifestações

alérgicas do tipo tardia e imediata, a produção de enzimas hidrolíticas, a variabilidade

fenotípica (LINDE et al., 2010), a aderência às células do hospedeiro mediada por

adesinas, morfogênese, hidrofobicidade da superfície celular e a formação de biofilme

(DE LUCA et al., 2012; HORVÁTH et al., 2012; COSTA et al., 2013).

Candida parapsilosis é considerado agente de infecções exógenas por ser capaz

de colonizar a pele, principalmente as mãos de profissionais da saúde, assim como as

soluções glicosiladas de uso hospitalar e cateter venoso central. (CISTERNA et al., 2010).

Sua detecção é particularmente associada à nutrição parenteral total. A ocorrência

de Candida parapsilosis é maior em crianças (HINRICHSEN et al., 2008; CISTERNA et

al., 2010).

A expansão da população de pacientes imunocomprometidos, que utilizam

cateteres intravenosos, nutrição parenteral total, procedimentos invasivos e, ainda, fazem

uso crescente de antibióticos de amplo espectro, quimioterapias citotóxicas e transplante,

são fatores que contribuem para o aumento destas infecções (ORTEGA et al., 2011;

SARDI et al., 2013).

Complexo Candida parapsilosis são microrganismos ubíquos, que podem ser

encontrados em todos os lugares no ambiente natural. A sua virulência está associada à

26

capacidade de aderir a superfícies plásticas e, consequentemente, desenvolver candidemia

relacionadas com cateteres (BERNARDIS et al.; 1999). Recentemente, Tavanti e

colaboradores (TAVANTI et al., 2005) descreveram duas novas espécies pertencentes ao

Complexo C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis. C. metapsilosis, sendo

menos virulento in vitro em comparação com C. orthopsilosis e C. parapsilosis stricto

sensu (GÁCSER et al., 2007; ORSI et al., 2010). Estas duas novas espécies podem habitar

nichos importantes em certas populações de pacientes, enfatizando, assim, a necessidade

de vigilância contínua em cada país para monitorizar a prevalência e distribuição dos

membros do Complexo. Definir os determinantes de virulência ajudará a entender as

características patogênicas das novas espécies (SILVA et al., 2009; TOSUN, et al., 2013).

Fatores de virulência associados ao Complexo C. parapsilosis incluem a

capacidade de aderir a uma grande variedade de superfícies biológicas e protéticas,

formação de biofilme em dispositivos médicos e secreção de enzimas hidrolíticas

(TAVANTI et al., 2010; CHOW et al, 2012; SILVA et al., 2012).

O primeiro estudo disponível, que compara a interação do Complexo C.

parapsilosis com a superfície do hospedeiro, foi efetuado por Gácser et al. (2007). As três

espécies foram comparadas quanto à sua capacidade de invadir e alterar a estrutura de um

tecido epitelial reconstituído, demonstrando que C. metapsilosis era menos virulenta, em

comparação com as outras duas espécies do grupo (GÁCSER et al., 2007; BERTINI et

al., 2013).

O potencial de virulência de cada uma das espécies do Complexo foi avaliado em um

modelo murino para candidíase vaginal. Este estudo compara a capacidade in vivo das espécies

C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis, C.metapsilosis em colonizar e causar uma infecção.

Os resultados obtidos indicaram que C. orthopsilosis e C. metapsilosis são capazes de induzir a

vaginite de uma maneira semelhante a C. parapsilosis stricto sensu e confirmam o potencial

menos virulento da C. metapsilosis (GÁCSER et al., 2007; ORSI et al, 2010).

1.7.1 Fosfolipases

As fosfolipases são um grupo heterogêneo de enzimas que possuem a capacidade

de hidrolisar uma ou mais ligações éster em glicerofosfolipídeos. Todas as fosfolipases

têm como substrato moléculas de fosfolipídeos, porém cada enzima tem a habilidade de

clivar uma ligação éster específica (GHANNOUM, 2000).

27

A atividade das fosfolipases está provavelmente envolvida no processo de ruptura

da membrana celular e invasão das células do hospedeiro, contribuindo para a penetração

destes microrganismos no tecido do hospedeiro (GHANNOUM, 2000; PARK et al.,

2013). Espécies de Candida não-albicans são capazes de produzir fosfolipases

extracelulares, mas essa produção é relativamente inferior quando comparada a C.

albicans (SILVA et al., 2012).

No estudo realizado por Dagdeviren et al. (2005), a atividade de fosfolipase foi

detectada em 15,15% de todas as 33 estirpes analisadas. Ghannoum et al. (2000)

detectaram atividade fosfolipase em C. não-albicans, incluindo 51,0% das cepas de C.

parapsilosiss. Shmizu et al. (1996) e Kartarcioglu (2002) afirmaram que não foi

encontrada atividade da enzima fosfolipase em cepas de C. parapsilosis. Apesar de a

utilização de gema de ovo como fonte de fosfolipídios nos estudos acima, as divergências

entre os resultados podem ter origem a partir das diferenças entre as formulações dos

meios de comunicação e / ou as propriedades biológicas das estirpes.

1.7.2 Proteases

As proteases são todas as enzimas que catalisam a clivagem das ligações

peptídicas (CO-NH) das proteínas. Muitas espécies fúngicas secretam proteases quando

crescidas em meio contendo proteína como fonte de nitrogênio (MONOD et al., 2002).

As proteases estão divididas em dois grandes grupos, dependendo do seu sítio de ação,

sendo elas: exopeptidases e endopeptidases. Exopeptidases clivam a ligação peptídica no

grupo amina (NH2) ou carboxila (COOH) terminal da proteína, enquanto endopeptidases

clivam ligações peptídicas dentro de uma cadeia polipeptídica (DOS SANTOS et al.,

2011).

Baseado na natureza do grupo funcional do sítio ativo e do tipo de mecanismo

enzimático, as proteases são divididas em oito tipos: asparagina, aspática, cisteína,

glutâmica, metalo, serina, treonina e desconhecido, porém, podem também serem

classificadas em ácidas, alcalinas (básicas) e neutras, de acordo com o pH no qual são

ativadas (YIKE et al., 2011).

Entre os potenciais fatores de virulência das espécies patogênicas de Candida, as

proteinases aspárticas secretadas (Sap) têm sido alvo de várias investigações (PARRA-

ORTEGA et al., 2009). Saps podem degradar um número de substratos celulares,

28

incluindo proteínas relacionadas às defesas imunológicas e estruturais, tais como IgG de

cadeias longas, α2-macroglobulina, proteína C3, β-lactoglobulina, lactoperoxidase,

colágeno e fibronectina (PICHAVÁ et al., 2001).

1.7.3 Biofilme

Biofilmes são comunidades microbianas que crescem aderidas a alguma

superfície sólida, envolvidos por uma matriz exopolimérica secretada pelos

microrganismos em associação. Alguns fatores contribuem para a formação de biofilme,

dentre os quais, a quantidade de nutrientes e de moléculas de quorum-sensing

(FANNING; MITCHELL et al., 2012).

Os biofilmes são compostos por aproximadamente 97% de água, variando

conforme as características do ambiente onde se encontram. A matriz é composta por um

complexo de polímeros, nutrientes, produtos de lise celular e partículas de materiais do

meio (SUTHERLAND et al., 1997). Muitas leveduras de importância médica apresentam

a capacidade de formação de biofilme, como as do gênero Candida, Cryptococcus e

Trichosporon.

A formação de biofilme oferece ao microrganismo proteção contra adversidades

do ambiente, resistência a estresses físicos e químicos, cooperação metabólica e regulação

da expressão gênica baseada na comunidade (RAMAGE et al., 2012). O material

extracelular, que compõe a matriz do biofilme, tem papel fundamental na defesa contra

células fagocitárias e no suporte da manutenção da integridade do biofilme, bem como na

limitação da difusão das substâncias tóxicas (NEGRI et al., 2012).

O estudo de modelos de biofilme tem sido essencial na investigação deste modo

de crescimento para a caracterização de propriedades fenotípicas associadas a padrões de

expressão de genes (NETT et al., 2012).

Os estudos in vitro em placas tornaram-se uma ferramenta fundamental para a

investigação da formação de biofilme de Candida spp., fornecendo informações

importantes sobre a sua composição e propriedade. (RAMAGE et al., 2006; RUSICKA

et al., 2010).

De fato, a formação de biofilme é considerada uma importante estratégia de

sobrevivência de alguns microrganismos. As células em biofilme demonstram um

fenótipo mais resistente do que em estado planctônico. Estudos demonstram que, na

29

realidade, a formação de biofilme está diretamente ligada à expressão gênica, pois

comprovam relativa mudança na expressão gênica tanto em biofilme formado, quanto na

fase planctônica (GARCÍA-SÁNCHEZ et al., 2004; GIBBONS et al., 2011).

Já foram relatadas formações de biofilme em cateteres venosos centrais, cateteres

urinários, dispositivos de diálise, aparelhos cardiovasculares, próteses de voz, implantes

penianos, próteses orais e implantes oculares (RAMAGE et al., 2006; ESTIVILL et al.,

2012). Essas infecções associadas a implantes são inerentemente difíceis de tratar e

podem requerer terapia antifúngica a longo prazo e a remoção física do implante para

controle da infecção (RAMAGE et al., 2012).

Os biofilmes são formados facilmente por células do Complexo C. parapsilosis,

em meio contendo concentração elevada de glicose e de lipídios, e podem estar associados

com o aumento da prevalência deste organismo em infecções na corrente sanguínea de

pacientes que recebem nutrição parentérica (NOSEK et al., 2009). A preferência seletiva

da espécie para dispositivos médicos plásticos é de particular interesse, como a formação

de biofilme aumentando a capacidade do organismo para colonizar cateteres

intravasculares (WEEMS, 1992; TROFA et al., 2008). A formação de biofilmes por C.

parapsilosis, têm sido associado com maior morbidade e mortalidade em comparação

com isolados incapazes de formar biofilmes (KUMAMOTO et al., 2002; SILVA et al.,

2012). Em contraste com C. albicans, C. parapsilosis produz biofilmes mais finos e

menos estruturados (KUHN et al., 2002). Estas características do biofilme estão de acordo

com os reportados recentemente por Silva et al. (2009). Lattif et al. (2009) demonstraram

que, tal como C. parapsilosis stricto sensu, as espécies C. orthopsilosis e C. metapsilosis

eram também capazes de formar biofilmes.

1.8 SENSIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS

A preocupação é crescente sobre a alta incidência de infecções causadas por

espécies não-albicans e o surgimento de resistência antifúngica (PEREIRA et al., 2010).

Estudos apontam o crescente número de cepas de Candida spp. resistentes a

fármacos antifúngicos, principalmente a derivados azólicos (POSTERARO et al., 2006;

KALKANCI et al., 2007; CHONG et al., 2007). Esta resistência é frequentemente

observada em pacientes HIV positivos, nos quais o primeiro relato de resistência foi

relacionado ao cetoconazol (NUCCI et al., 2010).

30

Atualmente, as drogas antifúngicas disponíveis para o tratamento podem ser

divididas em quatro diferentes classes, de acordo com o seu mecanismo de ação: inibição

da síntese do ergosterol (derivados azólicos); alteração na permeabilidade da membrana

celular (poliênicos); inibição da síntese de ácidos nucléicos (fluocitosina e griseofulvina)

e inibição da síntese de glucanos da parede celular (equinocandinas) (CHAPMAN;

SULLIVAN; CLEARY, 2008). Quando comparadas aos antibióticos, o desenvolvimento

de agentes antifúngicos é relativamente limitado (SILVA et al., 2012), sendo restrito o

número de drogas disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas invasivas

(VANDEPUTTE et al., 2012).

A resistência aos antifúngicos pode ser dividida em resistência clínica e resistência

in vitro. A resistência clínica é relacionada à falha na resposta ao tratamento, que, por sua

vez, pode estar associada a uma baixa concentração do fármaco no sangue e tecidos do

paciente, além de um sistema imunológico deficiente, bem como a presença de focos

permanentes de infecção, como cateteres e abscessos (REX et al., 1995; SANGLARD;

ODDS, 2002; RAMAGE; LOPEZ-RIBOT, 2005).

A resistência in vivo pode ser divida em primária e secundária. Na primária,

também chamada de intrínseca ou inata, o microrganismo apresenta naturalmente

resistência a antifúngicos (ATIQUE et al., 2006). Na resistência secundária ou adquirida,

há seleção das cepas resistentes por meio do uso indiscriminado de drogas antifúngicas,

tanto na terapia humana, quanto na agricultura (PFALLER; DIEKEMA, 2007; ROMEO;

CRISEO, 2009; COLOMBO et al., 2009).

Entre os mecanismos que contribuem para o fenômeno de resistência aos

derivados azólicos, destacam-se a superexpressão ou mutação do gene ERG11,

responsável por codificar a enzima lanosterol 14-α-demetilase, molécula alvo dos

azólicos; superexpressão dos genes que codificam bombas de efluxo, CDR1 e MDR1; e

alterações no gene ERG3, indispensável para a biossíntese do ergosterol. Outros

mecanismos não elucidados totalmente podem ocorrer simultaneamente (USER et al.,

2007; FERRARI et al., 2009).

Em Candida spp., o mecanismo de resistência aos azólicos geralmente está

associado a mais de um fator, atuando de forma simultânea, resultando na expressão da

resistência. A superexpressão dos genes CDR1 e MDR1 foi detectada em 85% dos

isolados com característica de resistência (PEREA et al., 2001; FERRARI et al., 2009).

Além disso, a produção de biofilmes por Candida spp. também aumenta a tolerância

desses microrganismos à terapia antifúngica convencional (SILVA et al., 2012).

31

Inicialmente, os estudos de sensibilidade foram voltados apenas a estudos de

antibacterianos e, por outro lado, nenhuma atenção era voltada para a resistência a

antifúngicos. Nos últimos anos, infecções causadas por fungos e, em particular, por

leveduras do gênero Candida, têm aumentado significantemente principalmente em

pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana, pacientes com câncer

(JOHNSON, 2008).

Há uma crescente preocupação relacionada com a resistência ou tolerância

antifúngica do Complexo C. parapsilosis. O Complexo C. parapsilosis foi considerado

como baixa resistência ao fluconazol (HAJJEH et al., 2004; NGUYEN et al., 1996;

PFALLER et al., 2007), no entanto, a resistência clínica a azóis tem sido cada vez mais

relatada (BRITO et al., 2006; MOUDGAL et al., 2005; SARVIKIVI et al., 2005). De

acordo com o estudo realizado por Chen e colaboradores (2010), todos isolados de C.

parapsilosis stricto sensu e C. orthopsilosis foram considerados sensíveis ao fluconazol

e as cepas de C. metapsilosis foram consideradas resistentes. Isto está em contraste com

relatórios anteriores que descrevem uma ou nenhuma resistência de sensibilidade

diminuída ao fluconazol em cepas de C. metapsilosis (LOCKHART et al., 2008; SILVA

et al., 2009; CHEN et al., 2010). Cepas de C. parapsilosis stricto sensu e C. orthopsilosis

que foram isoladas mostraram CIMs elevados de caspofungina em comparação com

isolados de C. metapsilosis. Os isolados de C. parapsilosis stricto sensu apresentaram

valores de CIM significativamente mais elevados de micafungina que as de C.

orthopsilosis e C. metapsilosis (FORREST et al., 2008; CHEN et al., 2010).

Em um estudo realizado por Ruiz et al. (2013), observou-se que os valores MIC50 e

CIM90 para C. parapsilosis stricto sensu foram maiores que as outras duas espécies do

Complexo, encontrando resistência a anfotericina B e a itraconazol, situação também

observada no estudo realizado por Cantón et al. (2011), em que C. parapsilosis stricto

sensu foi a única espécie que mostrou resistência envolvendo os mesmos antifúngicos.

Candida metapsilosis também demonstrou CIM50 e CIM90 com valores mais elevados

para o itraconazol. Apesar do fato de que Gonçaves et al. (2010) não tinham chegado a

qualquer cepa de C. metapsilosis dose dependente, C. orthopsilosis e C. metapsilosis

foram mais sensíveis às drogas testadas em contraste com um estudo realizado por

Diekema et al. (2009).

1.9 CALCINEURINA

32

A calcineurina é uma proteína altamente conservada em organismos eucariontes,

é importante para mediar as respostas de estresse em plantas e fungos, constitui em uma

fosfatase ativada por Ca²+ / calmodulina (ARAMBURU et al., 2004; CHEN et al., 2011)

e é responsável pela transmissão de informações da membrana celular para o núcleo

(STEINBACH et al., 2007; STIE et al., 2008). Ela é composta por duas subunidades

distintas: “A”, que é a catalíca, e “B”, que é a reguladora. Em resposta ao influxo de

cálcio, a calmodulina liga-se à calcineurina subunidade A e bloqueia a ação do domínio

C-terminal da calcineurina ação autoinibitória, resultando na formação do complexo ativo

de calcineurina. A calcineurina é importante para as respostas ao estresse térmico,

incluindo baixas e altas temperaturas, também funciona em resposta ao estresse por

cátions em C. neoformans e Saccharomyces cerevisiae. Além disso, também é importante

para a resposta e crescimento em meio de pH alcalino, nos dois casos. A calcineurina

funciona em C. albicans para detectar sinais de invasão do tecido do hospedeiro e de

infecção disseminada (BLANKENSHIP et al., 2003; CHEN et al., 2010).

A calcineurina está ligada a vários agentes infecciosos, incluindo fungos

patogênicos oportunistas humanos, tais como cepas de Cryptococcus neoformans e

Candida albicans. A molécula é utilizada de forma diferente entre os principais fungos

patogênicos, como demonstrou o estudo realizado por Steinbach e colaboradores, em

2006, em que Cryptococcus neoformans mutantes, que possuíam a calcineurina, foram

severamente prejudicados em seu crescimento a 37 °C apresentando defeitos, tornando-

os avirulentos. Com Candida albicans, a calcineurina não foi necessária para a

sobrevivência in vitro a temperatura de 37 °C, mas sim para a sobrevivência no soro e

virulência (STEINBACH et al., 2007).

Em C. albicans, a calcineurina tem demostrado desempenhar um papel

fundamental para permitir que as células sobrevivam a perturbação da membrana por

drogas que visam biossíntese do ergosterol (CRUZ et al., 2002). O modelo resultante é

que a função da calcineurina torna-se essencial, quando fica comprometida a integridade

celular (BLANKENSHIP et al., 2003). Com base nestas observações, a hipótese de que

a calcineurina pode também ser necessária para manter a viabilidade de C. albicans

durante as infecções, desempenhando um papel-chave no início da infecção, durante a

candidemia, configurando uma fase crítica da C.albicans no ciclo infeccioso (ONYEWU

et al., 2006).

33

Tanto as subunidades A e B são necessárias para a atividade da calcineurina.

Todos os organismos eucarióticos possuem ao menos um gene codificando cada

subunidade (ZANG et al., 2012). A calcineurina é o alvo dos fármacos imunossupressores

como a ciclosporina A (CsA) e FK 506, que suprimem o sistema imunitário por inibição

da calcineurina (LIU et al., 1991). O mecanismo de ação da CsA tem sido extensivamente

estudado no ascomiceto S. cerevisiae, bem como em células T (HEITMAN et al.,

1992; CARDENAS et al., 1999).

Homólogos da calcineurina têm sido identificados e caracterizados em vários

fungos. A calcineurina é essencial e regula a progressão do ciclo celular em Aspergillus

nidulans (RASMUSSEN et al., 1994) e elongação de hifas e crescimento vegetativo em

Neurospora crassa (PROKISCH et al., 1997). Na levedura Schizosaccharomyces pombe,

mutantes da calcineurina são estéreis, têm defeitos na citocinese, polaridade da célula e

posicionamento do corpo do fuso (YOSHIDA et al., 1994). Em S. cerevisiae, a

calcineurina regula a homeostase iônica e a síntese da parede celular, ativando fatores de

transcrição Tcn1/Crz1, que regulam os genes que codificam as bombas iônicas e as

enzimas biossintéticas da parede celular (incluindo Fks2, Pmr2, PMC1 e PMR1)

(HUYNH et al., 2012).

1.9.1 Ciclosporina A: inibidor da calcineurina

A CsA liga-se à proteína intracelular ciclofilina-1, formando um complexo que

inibe a calcineurina. Portanto, a CsA é classificada como um inibidor de calcineurina.

Estes complexos de CsA-ciclofilina, os quais se ligam à calcineurina, inibem a transdução

de sinais para o núcleo resultando na interrupção ou diminuição da síntese de muitas

citocinas, principalmente a Interleucina-2 (IL-2). As diminuições da transcrição de IL-2

e da resposta dos linfócitos-T a isso resultam na inibição da proliferação de linfócitos-T

helper e linfócitos-T citotóxicos. A CsA não causa alteração com relação à imunidade

humoral, portanto, as vacinas que estimulam a resposta protetora humoral não são

afetadas negativamente por este fármaco (LIU et al., 2007).

A CsA é um composto isolado de extratos do fungo telúrico Tolypocladium

inflatum. Este fármaco tem sido utilizado na prevenção da rejeição de transplante de

órgãos em humanos desde 1977, sendo também empregado como imunomodulador em

34

diversas dermatoses inflamatórias, como dermatite atópica e psoríase (CARDENAS et

al., 1999).

Devido às suas propriedades lipofílicas, a CsA é amplamente distribuída na

maioria dos tecidos com exceção da barreira hematoencefálica. Este fármaco é

metabolizado principalmente pelo sistema de enzimas citocromo P450, especificamente

pelo CYP3A4, no fígado e no intestino. Fármacos que inibam o CYP3A4 ou haja

competição com a glicoproteína-P podem alterar o metabolismo da CsA

substancialmente (CRUZ et al., 2002).

As drogas imunossupressoras ciclosporina A, FK-506 (tacrolimus) e rapamicina

(sirolimus) são usadas para tratar e prevenir a rejeição de órgãos transplantados, porém

exercem efeitos antifúngicos potentes contra uma variedade de fungos patogênicos

(BADER et al., 2003; UPPULURI et al., 2008). Os estudos revelam sinergismo entre os

azólicos e inibidores da calcineurina CsA e FK-506 e os estudos in vivo demonstraram

que a combinação sinérgica CsA/fluconazol tem efeito terapêutico benéfico. Em resumo,

estes agentes farmacêuticos altamente bem-sucedidos podem encontrar uma aplicação

clínica ainda maior no combate a doenças infecciosas (BLANKENSHIP et al., 2003;

BADER et al., 2003; ONYEWU et al., 2006).

Em estudo realizado por Shinde e colaboradores (2012), foram demonstrados pela

primeira vez os resultados sobre atividade sinérgica da CsA com drogas antifúngicas

(VRZ, FCZ, AMB e CASP) contra o crescimento planctônico e a formação de biofilme,

bem como em biofilmes maduros de C. albicans. Os resultados obtidos neste estudo

sugerem que a inibição da CsA é mediada por mecanismos específicos do biofilme e

potencializa a ação de antifúngicos contra biofilmes resistentes aos medicamentos. O

aumento da sensibilidade de células planctônicas e a reversão da resistência a drogas na

forma de biofilme em formação após a adição do CsA indicam que a calcineurina pode

estar fazendo um papel importante na resistência à FCZ, VRZ e CASP. No entanto, o

mecanismo exato por trás do sinergismo da CsA com drogas antifúngicas ainda não está

claro (MACHETTI et al., 2003; UPPULURI et al., 2008).

2 PERGUNTAS DE PARTIDA

1. Qual o efeito da CsA isolada e em combinação na sensibilidade das cepas do

Complexo Candida parapsilosis a antifúngicos em formas plantônicas e em biofilme?

35

2. Qual o efeito da CsA no desenvolvimento de biofilmes das cepas do Complexo

Candida parapsilosis?

3 HIPÓTESES CIENTÍFICAS

1. Uma vez que a CsA inibe de forma seletiva a calcineurina – molécula essencial a

homeostase celular – é possível que a droga torne os organismos do Complexo C.

parapsilosis mais sensíveis à ação de antifúngicos em formas plantônicas e em

biofilme.

2. A CsA é capaz de reduzir o biofilme em formação e o biofilme maduro por cepas do

Complexo C. parapsilosis.

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GERAL

Investigar os efeitos da CsA isoladamente e em associação com antifúngicos sobre

leveduras do Complexo Candida parapsilosis em formas planctônica e em biofilme.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Realizar a identificação fenotípica dos isolados do Complexo C. parapsilosis

utilizados no trabalho;

2. Realizar e confirmar a identificação molecular dos isolados do Complexo C.

parapsilosis por meio da enzima de restrição BanI.

3. Determinar a concentração inibitória mínima da CsA frente a cepas do Complexo de

C. parapsilosis em forma planctônica e biofilme;

36

4. Avaliar o efeito sinérgico, in vitro, da CsA em combinação com drogas antifúngicas

frente a cepas do Complexo de C. parapsilosis em forma planctônica e biofilme;

5. Avaliar o efeito da CsA em combinação com drogas antifúngicas sobre o biofilme em

formação e o biofilme formado das cepas do Complexo de C. parapsilosis.

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 RECUPERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS CEPAS DO COMPLEXO C.

parapsilosis

Neste estudo, foram incluídas 39 cepas do Complexo Candida parapsilosis;

destas, 36 cepas de origem clínica e 3 ATCC´s, as quais foram obtidas, na Micoteca do

Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), bem como cedidas gentilmente

pelos pesquisadores: Dra. Arianna Tavanti (UNIPI, Università degli Studi di Pisa, Itália);

Prof.a Lourimar Vianna (UNIVALE, Universidade do Vale do Rio Doce, Minas Gerais);

Prof.a Dr.a Cristiane Yumi Koga Ito (UNESP, Universidade Estadual Paulista, São Paulo)

e Prof.a Dr.a Rejane Pereira Neves (UFPE, Universidade Federal de Pernambuco). Cepas

de referência provenientes do banco de culturas American Type Culture Collection

(ATCC) foram gentilmente cedidas pela Prof.a Dr.a Elisa Borghi (UNIMIT, Università

degli Studi di Milano, Itália), que são ATCC 22019 (C. parasilosis stricto sensu– número

de coleção CEMM 03-1-019), ATCC 96139 (C. metapsilosis – número de coleção

CEMM 05-4-097) e ATCC 96143 (C. orthopsilosis – número de coleção CEMM 05-4-

098). Ver quadro 1.

Todas as amostras foram enviadas ao Centro Especializado em Micologia Médica

(CEMM) adsorvidas em papel filtro. Ao chegarem, foram resuspensas em 10 mL de caldo

BHI, incubadas por até 72 horas a 35 ºC, com observações diárias. As amostras que

apresentavam turvação do meio eram então repicadas em ágar Sauboraud dextrose. Para

avaliação da viabilidade celular, as culturas foram repicadas em ágar batata e incubadas

por 48 horas a 35 ºC. Após esse período, foram realizados testes fenotípicos baseados em

análises de características micromorfológica por teste de microcultivo (DE HOOG, 2002;

SIDRIM; ROCHA, 2004), a fim de se confirmar a identificação de cada isolado. Todo o

37

procedimento foi realizado sob normas de biossegurança nível 2. Para controle do

experimento foi utilizado uma cepa C. parapsilosis (ATCC 22019).

Adicionalmente, foi analisado o crescimento de cada isolado em meio

cromogênico (HiCrome Candida Differential Agar, HiMedia, Mumbai, Índia) para

constatar a pureza das colônias (ALFONSO et al., 2010; SIDRIM et al., 2010). Por fim,

a ausência de contaminação bacteriana foi confirmada por meio de coloração de Gram.

Quadro 1. Origem das cepas do Complexo C. parapsilosis. Código Espécie Sitio de coleta Micoteca de origem

ATCC 22019 C. parapsilosis stricto

sensu Fezes UNIMIT

CEMM 05-1-054 C. parapsilosis stricto

sensu Hemocultura CEMM



A90038 C. parapsilosis stricto

sensu Cavidade oral UNESP



UNESP02 C. parapsilosis stricto



sensu Cavidade oral UNIVALE





USP15 C. parapsilosis stricto


UNESP04 C. parapsilosis stricto


USP01 C. parapsilosis stricto


URM6411 C. parapsilosis stricto

sensu Hemocultura UFPE

ATCC 96143 C. metapsilosis Cateter UNIMIT CEMM 05-5-087 C. metapsilosis Unha UNIPI CEMM 05-5-093 C. metapsilosis Tecido biopsia UNIPI CEMM 05-5-092 C. metapsilosis Hemocultura UNIPI CEMM 05-5-086 C. metapsilosis Aspirado brônquico UNIPI CEMM 05-5-095 C. metapsilosis Ouvido UNIPI CEMM 05-5-089 C. metapsilosis Faringe UNIPI CEMM 05-5-090 C. metapsilosis Fezes UNIPI CEMM 05-5-091 C. metapsilosis Urina UNIPI

URM6407 C. metapsilosis Hemocultura UFPE URM6408 C. metapsilosis Hemocultura UFPE

CEMM 05-5-094 C. metapsilosis Urina UNIPI CEMM 05-5-088 C. metapsilosis Vagina UNIPI

ATCC 96139 C. orthopsilosis Cateter UNIMIT CEMM 05-5-083 C. orthopsilosis Pele UNIPI

38

CEMM 05-5-084 C. orthopsilosis Swab urogenital UNIPI CEMM 05-5-079 C. orthopsilosis Aspirado brônquico UNIPI CEMM 05-5-085 C. orthopsilosis Aspirado brônquico UNIPI CEMM 05-1-060 C. orthopsilosis Hemocultura CEMM CEMM 05-1-053 C. orthopsilosis Hemocultura CEMM CEMM 03-5-040 C. orthopsilosis Hemocultura CEMM CEMM 03-3-044 C. orthopsilosis Hemocultura CEMM CEMM 05-5-078 C. orthopsilosis Cateter UNIPI CEMM 05-5-099 C. orthopsilosis Pele UNIPI CEMM 05-1-058 C. orthopsilosis Hemocultura CEMM CEMM 05-5-080 C. orthopsilosis Unha UNIPI UNIMIT: Università degli Studi di Milano, Itália; UNIPI: Università degli Studi di Pisa, Itália; UNIVALE: Universidade do Vale do Rio Doce, Minas Gerais; UNESP: Universidade Estadual Paulista, São Paulo; UFPE: Universidade Federal de Pernambuco; ATCC: American Type Culture Collection.

5.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DAS CEPAS DO COMPLEXO C. parapsilosis

Para confirmação da identidade das cepas, foi feita a análise molecular segundo

descrito por Tavanti et al. (2005) baseado em PCR-REA. Para a extração de DNA, as

leveduras foram cultivadas em ágar Batata e incubadas por 48 horas a 35 °C. Inicialmente,

uma única e pequena colônia foi transferida para microtubo contendo 6µL de NaOH 0,02

M e, posteriormente, os tubos foram levados ao termociclador por 10 minutos a 99,9 °C.

A reação de PCR foi conduzida em volume total de 25 µL, dos quais encerravam

2,95 µL de H2O mili-Q estéril; 5,0 µL de tampão 5X (Promega, USA); 5,0 µL de MgCl2;

2,5 µL do oligonucleotídeo S1F (GTT GAT GCT GTT GGA TTG T) e 2,5 µL de

oligonucleotídeo S1R (CAA TGC CAA ATC TCC CAA); 5,0 µL de dNTp; 0,05 µL de

Taq (Go Taq Hot Start - Promega, USA) 2 µL de suspensão obtida por lise celular. As

condições de amplificação foram realizadas em um termociclador (Multigene Gradiente-

Labnet, USA) nas seguintes condições: desnaturação durante 7 minutos a 94 °C, seguido

por 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 1 minuto, hibridação a 50 °C durante 1

minuto e alongamento a 74 °C durante 1 minuto, com uma extensão final de 10 minutos

a 74 °C (TAVANTI et al., 2005).

Os produtos de DNA de 716 pb foram separados por eletroforese em gel de

agarose a 1%, com tampão de corrida TBE 1X (tampão TRIS-borato-EDTA). Nunca

esquecendo em cada reação do controle para contaminação do MIX, pois não deve

aparecer nenhum vestígio de fragmento de DNA, e o marcador de corrida da New

England, Biolabs® de 100 pb. Após o tempo de corrida, o gel foi colocado submerso em

39

uma solução com brometo de etídio na concentração de 0,5mg/mL. As bandas de DNA

foram, então, visualizadas por transiluminador de UV.

A digestão com a enzima de restrição BanI (BshNI – Fermentas Life Sciences,

Lituânia) foi realizada de acordo com o protocolo de Tavanti et al. (2005) com

modificações. A reação utilizou 10 µL dos amplicons utilizados no PCR, 18 µL de H2O

mili-Q estéril, 2 µL de tampão 10X (adquirido junto com a enzima) e 2 µL da enzima

BanI; todo o material foi incubado em banho-maria por 16 horas a 37 °C. Os produtos da

digestão foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2%; os géis foram

incubados em solução de brometo de etídio por 30 minutos e visualizados em

transiluminador de UV. O peso molecular das bandas obtidas foi estimado com auxílio

do marcador da New England, Biolabs® de 100 pb. A diferenciação das espécies do

Complexo C. parapsilosis se dá com bandas de diferentes pesos moleculares. Para C.

parapsilosis stricto sensu duas bandas com aproximadamente 550 e 200 pb cada, pra C.

metapsilosis duas bandas de 400 e 200 pb cada e para C. orthopsilosis uma banda de

aproximadamente 700 pb.

5.3 DROGAS ANTIFÚNGICAS E CICLOSPORINA A

Soluções de anfotericina B (AMB; Sigma Chemical Corporation, EUA),

fluconazol (FCZ; Pfizer, Brasil) e caspofungina (CASP; Merck Sharp & Dohme, Brasil)

foram diluídas em água destilada estéril; voriconazol (VRZ; Pfizer, Alemanha) foi

preparado em dimetilsulfóxido (CLSI, 2008). Solução estoque de ciclosporina A (CsA;

Merck, EUA), na concentração de 5 mg/mL, foi preparada em água destilada estéril.

Todas as drogas foram estocadas a - 20 ºC e diluídas no momento de uso em meio RPMI

1640 com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,

EUA), tamponado a pH 7,0 com 0,165 M de ácido morpholinepropanesulfonic (MOPS,

Sigma Chemical Co.).

As concentrações das drogas testadas variaram de 0,03125 a 16µg/ml para AMB,

FCZ, VRZ e CASP (PFALLER et al., 2006; CLSI, 2008), de 0,125 a 64 µg/mL para FCZ

(CLSI, 2008) e de 6,25 a 100 µg/mL para CsA (SHINDE et al., 2012).

5.4 TESTES DE SENSIBILIDADEIN VITRO

40

5.4.1 Preparo do inóculo

O preparo do inóculo para o teste de sensibilidade foi feito a partir de colônias

crescidas em ágar Batata dextrose por 24 h a 35 ºC. Resumidamente, colônias foram

resuspensas em 5 mL de solução salina estéril a 0,85 % e a suspensão obtida foi ajustada

a turbidez a 0,5 na escala de Mc Farland. Em seguida, a suspensão foi diluída na

proporção 1:100 e, em seguida, 1:20 em meio RPMI, para obtenção de um inóculo com

concentração final de variando de 0,5 a 2,5 x 103 células / ml (CLSI, 2008).

5.4.2 Microdiluição

O teste de sensibilidade foi realizado por meio da técnica de microdiluição em

caldo de acordo com documento M27 -A3 (CLSI, 2008). Para realização do teste foram

utilizadas 39 cepas do Complexo C. parapsilosis identificadas e confirmadas

anteriormente. Foram usadas placas de poliestireno de 96 poços com fundo em U com

capacidade de 200 μL, em que primeiramente foi adicionado 100 µL do meio RPMI em

cada poço, em seguida acrescentou-se 100 µL da droga na primeira coluna, em uma

concentração quatro vezes maior que a concentração esperada no primeiro poço e,

posteriormente, a droga foi diluída até a décima coluna. A coluna 11 de cada placa foi

destinada ao controle negativo do experimento, ou seja, o inóculo e o meio sem a droga;

a coluna 12 foi dividida em duas partes com quatro poços cada uma, onde em uma metade

era feito o controle de esterilidade da droga em teste e, na outra, era usada para controle

de esterilidade do meio RPMI 1640. As placas foram incubadas a 35 ºC e lidas após 24 h

para FCZ, VRZ e CASP e 48 h para AMB e CsA.

A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor concentração

do fármaco que causou a inibição completa para AMB e uma diminuição significativa de

crescimento de 50% de inibição para VRZ, FCZ, CASP, quando comparados ao controle

(CLSI, 2008). Para CsA, a CIM foi definida como 50% de inibição, de acordo com o

protocolo de Shinde e colaboradores de 2012.

5.4.3 Avaliação do sinergismo pelo método Checkerboard

41

A avaliação do efeito sinérgico entre CsA e as drogas antifúngicas foi realizada

em um ensaio conhecido como modelo de Checkerboard (ODDS, 2003). Foram

utilizadas 39 cepas do Complexo C. parapsilosis. Em suma, este teste permite avaliar o

efeito inibitório de soluções contendo diferentes concentrações de cada droga em

combinação. As concentrações das drogas combinadas variaram de acordo com as

concentrações contidas na quadro 2.

Quadro 2. Concentrações de cada droga testada isoladamente ou em combinações.

Drogas Concentração inicial (µg/mL)

Concentração final (µg/mL)

Fluconazol (FCZ) 0,03125 16 Voriconazol (VRZ) 0,03125 16

Caspofungina (CASP) 0,03125 16 Anfotericina B (AMB) 0,125 64 Ciclosporina A (CsA) 6,25 100

FCZ/ CsA

0,0156/ 0,312

1/ 2,5

VRZ/ CsA

0,0039/ 0,3125

0,0625/ 20

CASP/ CsA

0,0039/ 0,625

0,0625/ 2,5

AMB/ CsA

0,0156/ 0,156

1/ 2,5

A concentração inibitória mínima de cada fármaco em combinação (CIMsin) foi

definida como a menor concentração que causou 50% de inibição do crescimento para a

combinação de CsA com FCZ, VRZ e CASP e de 100% quando combinada com AMB.

As interações foram classificadas como sinérgicas, indiferentes ou antagônicas, de acordo

com o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (FICI). Desta forma, foram

considerados os seguintes parâmetros: FICI ≤ 0,5: sinergismo, FICI > 4,0: antagonismo

e 0,5 < FICI > 4,0: sem interação (ODDS, 2003).

5.5 INIBIÇÃO DE BIOFILMES DO COMPLEXO C. parapsilosis

5.5.1 Formação de biofilme

42

O protocolo foi realizado, de acordo com o estabelecido por Ruiz e colaboradores

(2013), com adaptações. Foram utilizadas 7 cepas de cada espécie do Complexo,

escolhidas aleatoriamente mais as cepas ATTC´s das respectivas espécies, totalizando um

de n = 24 cepas, ver quadro 3. As leveduras foram cultivadas em ágar Sabouraud dextrose

por 24 h a 35 °C. Para preparo do inóculo, uma colônia foi transferida para tubos contendo

3 mL de solução salina estéril a 0,85%, sendo a turvação ajustada ao padrão 4,0 da escala

de Mc Farland. Para a formação do biofilme, foram utilizadas placas de poliestireno de

96 poços com fundo chato com capacidade para 200 μL; em cada poço, foram adicionados

180 µL de caldo Sabouraud suplementado com glicose a 8% e 20 µL do inóculo em salina.

As placas foram incubadas a 35 ºC por 24 h. Após esse período, todo o líquido foi aspirado

e os poços lavados duas vezes com 200 µL de PBS. As placas foram mantidas em repouso

por 20 minutos em cabine de fluxo laminar e, decorrido esse tempo, adicionou-se a cada

poço 110 µL de cristal violeta a 0,4% por 45 minutos. Em seguida, as placas foram

lavadas três vezes com 200 µL de água destilada estéril e adicionado 200 µL de etanol

(99,5%) em cada poço por mais 45 minutos; 100 µL de cada poço foram transferidos para

uma nova placa para leitura em espectrofotômetro (leitor automático de microplacas) a

595 nm. Os valores de absorbância do controle negativo (poços com apenas as culturas)

foram subtraídos a partir dos valores das cepas testadas para minimizar potenciais

interferências; todo o experimento foi realizado em triplicata e com controle de

crescimento e reagentes utilizados.

Quadro 3. Relação de cepas utilizadas para os testes com biofilme.

Candida parapsilosis strcito sensu n = 8

Candida metapsilosis n = 8

Candida orthopsilosis n = 8

ATCC 22019 ATCC 96143 ATCC 96139 CEMM 05-1-054 CEMM 05-5-087 CEMM 05-5-083 CEMM 03-5-029 CEMM 05-5-092 CEMM 05-5-084 CEMM 05-6-054 CEMM 05-5-095 CEMM 03-5-040 CEMM 05-5-070 URM6407 CEMM 05-5-078 CEMM 05-1-051 URM6408 CEMM 05-1-053 CEMM 03-5-043 CEMM 05-5-094 CEMM 05-5-099

USP01 CEMM 05-5-088 CEMM 05-1-058

5.5.2 Inibição da formação de biofilmes por CsA e drogas antifúngicas

43

A capacidade da CsA e drogas antifúngicas na inibição da formação de biofilmes

de C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis e C. metapsilosis foi avaliada, de acordo

com o protocolo usado por Ruiz et al. (2013), com adaptações. Foram utilizadas as

mesmas 24 cepas do experimento anterior.

A formação de biofilme foi realizada conforme descrito acima, exceto pela a

adição das drogas em teste, ao caldo Sabouraud suplementado com glicose a 8%. Para o

teste, foram escolhidas três concentrações (CIM, CIM10X e CIM50X) da CsA baseado em

dados do efeito da mesma sobre a célula no estado planctônico. Posteriormente, foi

realizado o estudo da ação da combinação de CsA e drogas antifúngicas nas mesmas

concentrações sobre a formação de biofilme. Os experimentos foram realizados em

triplicata e repetidos de forma independentes.

5.5.3 Efeito da CsA e drogas antifúngicas sobre biofilme formado no Complexo C. parapsilosis

O efeito da CsA e drogas antifúngicas sobre o biofilme maduro de C. parapsilosis

stricto sensu, C. orthopsilosis e C. metapsilosis foi avaliado, de acordo Ruiz et al. (2013).

Resumidamente, foram utilizadas 24 cepas, cultivadas em ágar Sabouraud dextrose por

24 h a 35 °C. Foi adicionado em cada poço com fundo chato 180 µL de Sabouraud caldo,

suplementado com glicose a 8% mais 20 µL do inóculo com turvação de escala 4,0 de

Mac Farland, incubação a 35 ºC por 24 h. Os poços foram lavados 2 vezes com PBS; em

seguida, foi adicionado 200 µL de solução de meio mais droga, nas concentrações em

teste: CIM, CIM10X e CIM50X com base nos dados da célula no estado planctônico, e as

placas foram incubadas por 24 h a 35 °C. Estas foram novamente lavadas 2 vezes com

PBS, em seguida, deixadas entre abertas durante 20 minutos em cabine de fluxo laminar

para secar. Logo após, foram adicionados a cada poço 110 µL de cristal violeta a 0,4%,

deixando em repouso por 45 minutos. Estes foram lavados 3 vezes com água destilada

estéril e, a cada poço, foi adicionado 200 µL de etanol (99,5%) por mais 45 minutos.

Passado o tempo, 100 µL foram transferidos para uma nova placa para realização da

leitura. A produção de biofilme foi medida com um espectrofotômetro (leitor automático

de microplacas) em absorbância de 595 nm.

44

Posteriormente, foi realizado o estudo da ação da combinação da CsA e drogas

antifúngicas nas mesmas concentrações sobre a formação de biofilme. Os experimentos

foram realizados em triplicata e independentes.

6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As sensibilidades antimicrobianas foram comparadas por meio de análise

unidirecional de variância (ANOVA) e comparações múltiplas do pós-teste de Tukey.

Diferenças entre os tratamentos foram avaliadas para significância, utilizando o teste de

Wilcoxon. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas

foram realizadas com o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

7 RESULTADOS

7.1 IDENTIFICAÇÃO E CONFIRMAÇÃO DAS CEPAS

Todas as 39 cepas utilizadas nesse trabalho foram testadas para as características

fenotípicas e moleculares.

As cepas oriundas da micoteca do CEMM, que não possuíam classificação a nível

de espécie, foram identificadas molecularmente, além terem confirmadas suas

características macro e micromorfológicas. As cepas doadas pelos pesquisadores

possuíam a identificação a nível de espécie, porém foram testadas para a confirmação

tanto molecular como fenotipicamente. Logo, como resultado, todas as cepas

confirmaram a identificação de origem. Ver tabela 1.

Tabela 1. Resultado da identificação molecular das 39 cepas.

Código Identificação inicial Identificação final ATCC 22019 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu

CEMM 05-1-053 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu CEMM 03-5-029 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu

A90038 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu CEMM 05-6-054 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu

UNESP02 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu CEMM 05-5-070 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu

45

CEMM 05-1-051 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu CEMM 03-5-043 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu

USP15 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu UNESP04 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu

USP01 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu URM6411 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu

ATCC 96143 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-087 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-093 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-092 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-086 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-095 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-089 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-090 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-091 C. metapsilosis C. metapsilosis

URM6407 C. metapsilosis C. metapsilosis URM6408 C. metapsilosis C. metapsilosis

CEMM 05-5-094 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-088 C. metapsilosis C. metapsilosis

ATCC 96139 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-083 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-084 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-079 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-085 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-1-060 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-1-053 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 03-5-040 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 03-3-044 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-078 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-099 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-1-058 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-080 C. orthopsilosis C. orthopsilosis

Figura 4. Gel de agarose a 1%, mostrando fragmentos de bandas de aproximadamente 716 pb, concluindo que as cepas de 1-8 são pertencentes ao Complexo C. parapsilosis, C - controle negativo da reação e M - marcador molecular de 1000 pb.

46

Figura 5. Gel de agarose a 2% mostrando digestão do produto do PCR-SADH com enzima de restrição BanI. C. parapsilosis stricto sensu (poço 6), C. metapsilosis (poços 1, 2, 3, 7 e 8) e C. orthopsilosis (poços 4 e 5). C – controle negativo e M – marcador molecular.

7.2 SENSIBILIDADE IN VITRO DO COMPLEXO C. parapsilosis FRENTE À CsA E

DROGAS ANTIFÚNGICAS

As concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram determinadas para todas as 39

cepas, em estudo, frente aos antifúngicos e CsA isolados, encontrando-se os dados na

tabela 2. Para a espécie C. parapsilosis stricto sensu, os valores de CIM variaram de

0,0625 a 0,5; 0,125 a 2; 0,03125 a 0,25; 0,03125 a 0,5 e de 6,25 µg/mL para anfotericina

B (AMB), fluconazol (FLZ), voriconazol (VRZ), caspofungina (CASP) e ciclosporina A

(CsA), respectivamente. A espécie C. metapsilosis apresentou CIM, variando de 0,0625

a 0,5; 0,0625 a 4; 0,03125 a 0,125; 0,03125 a 0,25 e de 100 µg/mL para AMB, FLZ, VRZ,

CASP e CsA, respectivamente. E, por último, a espécie C. orthopsilosis teve CIM,

variando de 0,0625 a 0,5; 0,25 a 4; 0,0625 a 0,25; 0,03125 a 0,5 e de 100 µg/mL para

AMB, FLZ, VRZ, CASP e CsA, respectivamente. A concentração inibitória mínima de

CsA se manteve constante dentro das espécies.

Tabela 2. Perfil de sensibilidade das cepas do Complexo C. parapsilosis na forma planctônica frente a drogas antifúngicas e ciclosporina A.

Cepa Espécie CIM (µg/mL) AMB FCZ VRZ CASP CsA

ATCC 22019 C. parapsilosis stricto sensu 0,0625 0,125 0,03125 0,5 6,25 CEMM 05-1-054 C. parapsilosis stricto sensu 0,5 0,25 0,03125 0,0625 6,25 CEMM 03-5-029 C. parapsilosis stricto sensu 0,5 2 0,25 0,03125 6,25

A90038 C. parapsilosis stricto sensu 0,0625 1 0,25 0,125 6,25 CEMM 05-6-054 C. parapsilosis stricto sensu 0,25 0,125 0,25 0,25 6,25

UNESP02 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 2 0,0625 0,125 6,25 CEMM 05-5-070 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,25 0,03125 0,25 6,25

47

CEMM 05-1-051 C. parapsilosis stricto sensu 0,25 2 0,25 0,25 6,25 CEMM 03-5-043 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,125 0,03125 0,125 6,25

UPS15 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 1 0,03125 0,25 6,25 UNESP04 C. parapsilosis stricto sensu 0,25 0,25 0,0625 0,125 6,25

USP01 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,125 0,03125 0,125 6,25 URM6411 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,5 0,25 0,125 6,25

ATCC 96143 C. metapsilosis 0,0625 0,0625 0,03125 0,125 100 CEMM 05-5-087 C. metapsilosis 0,25 0,5 0,03125 0,0625 100 CEMM 05-5-093 C. metapsilosis 0,0625 0,5 0,03125 0,03125 100 CEMM 05-5-092 C. metapsilosis 0,25 2 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-086 C. metapsilosis 0,25 1 0,0625 0,25 100 CEMM 05-5-095 C. metapsilosis 0,0625 4 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-089 C. metapsilosis 0,125 1 0,125 0,25 100 CEMM 05-5-090 C. metapsilosis 0,125 1 0,03125 0,25 100 CEMM 05-5-091 C. metapsilosis 0,125 0,5 0,03125 0,125 100

URM6407 C. metapsilosis 0,5 4 0,125 0,25 100 URM6408 C. metapsilosis 0,5 2 0,0625 0,125 100

CEMM 05-5-094 C. metapsilosis 0,125 1 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-088 C. metapsilosis 0,25 1 0,125 0,125 100

ATCC 96139 C. orthopsilosis 0,125 0,25 0,0625 0,03125 100 CEMM 05-5-083 C. orthopsilosis 0,0625 4 0,125 0,125 100 CEMM 05-5-084 C. orthopsilosis 0,125 0,5 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-079 C. orthopsilosis 0,25 1 0,125 0,03125 100 CEMM 05-5-085 C. orthopsilosis 0,25 0,5 0,0625 0,25 100 CEMM 05-1-060 C. orthopsilosis 0,25 2 0,0625 0,5 100 CEMM 05-1-053 C. orthopsilosis 0,125 4 0,0625 0,125 100 CEMM 03-5-040 C. orthopsilosis 0,25 1 0,0625 0,25 100 CEMM 03-3-044 C. orthopsilosis 0,5 1 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-078 C. orthopsilosis 0,25 0,5 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-099 C. orthopsilosis 0,25 4 0,125 0,125 100 CEMM 05-1-058 C. orthopsilosis 0,125 2 0,25 0,5 100 CEMM 05-5-080 C. orthopsilosis 0,25 2 0,0625 0,25 100

Tabela 3. Variações das concentrações inibitórias mínimas para cada droga de cada espécie.

Espécie CIM (variação) AMB FCZ VRZ CASP CsA

C. parapsilosis stricto sensu (n =13)

0,0625 a 0,5 0,125 a 2 0,03125 a 0,25 0,03125 a 0,5 6,25

C. metapsilosis (n =13)

0,0625 a 0,5 0,0625 a 4 0,03125 a 0,125 0,03125 a 0,25 >100

C. orthopsilosis (n =13)

0,0625 a 0,5 0,25 a 4 0,0625 a 0,25 0,03125 a 0,5 >100

7.3 EFEITO DA COMBINAÇÃO DA CsA E ANTIFÚNGICOS EM CEPAS DO

COMPLEXO C. parapsilosis

48

As concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram determinadas para todas as 39

cepas, em estudo, frente aos antifúngicos e CsA combinados, os dados encontram-se na

tabela 3.

Os valores da CIM para a combinação das drogas antifúngicas e CsA variaram de

0,03125 a 0,125/0,312 a 1,25; 0,03125 a 0,5/0,312 a 1,25; 0,0039 a 0,0625/0,312 a 2,5;

0,0078 a 0,03125/0,156 a 0,625 µg/mL para a combinação, respectivamente, AMB/CsA;

FCZ/CsA; VRZ/CsA e CASP/CsA, para a espécie C. parapsilosis stricto sensu. Para a

espécie C. metapsilosis, as CIMs variaram de 0,0156 a 1/1,25 a 2,5; 0,0156 a 1/0,312 a

2,5; 0,0039 a 0,0156/1,25 a 5; 0,0039 a 0,0625/0,312 a 1,25 µg/mL, para a combinação,

respectivamente, AMB/CsA; FCZ/CsA; VRZ/CsA e CASP/CsA. Já as cepas de C.

orthopsilosis apresentaram CIM variando de 0,0078 a 0,125/0,312 a 2,5; 0,03125 a

1/0,312 a 1,25; 0,0078 a 0,03125/1,25 a 20; 0,0078 a 0,0625/0,625 a 2,5 para a

combinação, respectivamente, AMB/CsA; FCZ/CsA; VRZ/CsA e CASP/CsA. Desse

modo, todas as cepas avaliadas foram inibidas pelas combinações testadas.

A combinação testada mostrou interação sinérgica frente a todas as cepas do

Complexo C. parapsilosis, exceto para três cepas que apresentaram indiferente para AMB

e FCZ.

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262 51

52

7.4 EFEITO DA CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS ISOLADAS E EM

COMBINAÇÃO NA FORMAÇÃO DE BIOFILMES DE C. parapsilosis

As combinações CIM10X e CIM50X de CsA e drogas antifúngicas foram capazes

de inibir a formação de biofilme de todas as cepas do complexo C. parapsilosis. Onde na

concentração é CIM10X para cepas de C. parapsilosis ocorreu uma redução em relação ao

controle de 75, 60 47 e 46%, em média, para combinação, respectivamente, AMB/CsA,

FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, para a CIM50X a redução foi de 42, 60, 38 e 65%, em

média, para combinação, respectivamente, AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e

VRZ/CsA.

Figura 6. Gráfico de biofilme em formação para C. parapsilosis stricto sensu mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X.

Na espécie C. metapsilosis, foi observado uma redução de 60, 44, 40 e 39%, em

média, para a combinação CIM10X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA,

respectivamente, e uma redução de 52, 42, 45 e 40%, em média, para a combinação

CIM50X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente.

Figura 7. Gráfico de biofilme em formação para C. metapsilosis mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X.

53

A espécie C. orthopsilosis apresentou uma redução de 60, 48, 50 e 48%, em média,

para a combinação CIM10X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA,

respectivamente, e de 53, 43, 36 e 48% para a combinação CIM50X de AMB/CsA,

FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente. Adicionalmente, foi testado o efeito

de cada droga isolada nas concentrações em estudo sobre a formação do biofilme; os

valores obtidos foram subtraídos do valor das drogas em combinação. Todo experimento

foi realizado em triplicata.

Figura 8. Gráfico de biofilme em formação para C. orthopsilosis mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X.

7.5 EFEITO DA CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS ISOLADAS SOBRE BIOFILME

MADURO DE C. parapsilosis

Os resultados das combinações CIM10X CsA/drogas antifúngicas não

apresentaram relevância estatística sobre o biofilme maduro de nenhuma das espécies do

Complexo C. parapsilosis

Na combinação CIM50X CsA/drogas antifúngicas, ocorreu uma redução de 42, 64,

38 e 66%, em média, para combinação AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA

respectivamente, para a espécie C. parapsilosis stricto sensu. Na espécie C. metapsilosis,

foi observado uma redução de 57, 31, 39 e 42%, em média, para a combinação de

AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente, e de 51, 48, 42 e 54%

para a combinação AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente, para

C. orthopsilosis.

Ademais, foi testado o efeito de cada droga isolada nas concentrações em estudo

sobre o biofilme formado, os valores obtidos foram subtraídos do valor das drogas em

combinação. Todo experimento foi realizado em triplicata.

54

Figura 9. Gráfico de biofilme maduro para C. parapsilosis stricto sensu. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.

Figura 10. Gráfico de biofilme maduro para C. metapsilosis. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.

Figura 11. Gráfico de biofilme maduro para C. orthopsilosis. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos

estatisticamente significante na CIM50X.

55

8 DISCUSSÃO

Nas últimas duas décadas, houve um significativo aumento na frequência de

infecções causadas pelo gênero Candida (BASSETTI et al., 2011). Isso se deve em parte

ao crescimento do número de pacientes imunocomprometidos ou submetidos a

procedimentos médicos cirúrgicos invasivos (SILVA et al., 2005; SMEEKNS et al.,

2013), em consequência, foram sendo divulgados relatos de resistência antifúngica e uma

elevação nas taxas de mortalidade e morbidade (CHONG et al., 2007; NUCCI et al.,

2010).

A epidemiologia da candidíase está mudando ao longo dos anos e espécies não-

albicans vêm ganhando atenção mundial (CANTÓN et al., 2011; BASSETTI et al.,

2011). Dentre essas espécies, o Complexo C. parapsilosis tem sido reconhecido como um

importante patógeno emergente (PFALLER et al., 2007), relatado em alguns países como

a segunda espécie de Candida mais isolada em quadros de candidemias (CANTÓN et al.,

2010; BASSETTI et al., 2011). Além disso, possui uma tendência a ser mais isolada em

recém-nascidos e pacientes que fazem uso de nutrição parental e/ou cateteres (VAN

ASBECK et al., 2007; SILVA et al., 2009).

Desde a descrição do Complexo C. parapsilosis (TAVANTI et al., 2005), muitos

estudos têm sido realizados para descrever o perfil de sensibilidade a antifúngicos de uso

clássico. Embora o perfil de resistência não seja uma característica comum ao Complexo,

Silva e colaboradores, 2009, relataram cepas resistentes aos compostos azólicos e uma

sensibilidade reduzida a equinocandinas (SPREGHINI et al., 2012). Vários fatores são

responsáveis pela resistência antifúngica em biofilmes (RAMAGE et al., 2005;

CHANDRA; MUKHERJEE; GHANNOUM, 2012; SHINDE et al., 2012), destacando a

calcinurina como um dos responsáveis a resistência às drogas antifúngicas (UPPULARI

et al., 2008). A combinação de drogas com ações diferentes podem inibir múltiplos alvos

celulares e, portanto, é de grande importância a busca de novas estratégias para resolver

as questões referentes ao perfil de sensibilidade (BACHMANN et al., 2003; UPPULURI

et al., 2008).

No presente estudo, foi demonstrado que a ciclosporina A (CsA), um potente

inibidor de calcineurina, é capaz de interferir no crescimento da forma planctônica de

cepas de C. parapsilosis stricto sensu; contudo, para as duas outras cepas do Complexo

apresentou menor efeito sobre o crescimento celular. Li e colaboradores, 2008, já

56

demonstraram que a CsA usada, isoladamente, tem fraca atividade antifúngica contra C.

albicans, com um valor de CIM de 512 mg/mL. Em 2012, mais recentemente, Shinde e

colaboradores relataram uma CIM de 250 µg/mL, também para a espécie C. albicans.

Sendo assim, com base nos nossos resultados e em comparação com esses dois estudos

citados anteriormente, sugere-se que as espécies do Complexo C. parapsilosis são mais

sensíveis a CsA.

Os resultados aqui apresentados confirmam que a CsA aumenta a atividade in

vitro de antifúngicos contra cepas do Complexo C. parapsilosis. Foi observado

sinergismo entre CsA e AMB, FCZ, VRZ e CASP, com índices FICI tão baixos quanto

0,035 para CsA mais CASP. O aumento da sensibilidade de C. parapsilosis stricto sensu

em combinações com a CsA pode ser de importância prática, haja visto, que os estudos

epidemiológicos têm mostrado que é a espécie mais prevalente do Complexo (CANTÓN

et al., 2011; GARCÍA-EFFRON et al., 2012) e também é mais propensa a desenvolver

resistência aos antifúngicos (SILVA et al., 2009).

O potencial sinergético de inibidores da calcineurina e antifúngicos vem sendo

descrito na literatura. Estudo realizado por Marchetti e colaboradores, 2000, demostrou a

ação antifúngica da combinação de FCZ e CsA frente a cepas de C. albicans. Desde então,

vários estudos têm comprovado que os inibidores da calcineurina apresentam efeito

sinérgico quando combinados a drogas antifúngicas, frente a cepas de C. albicans

(UPPULURI et al., 2008), Cryptococcus neoformans (DEL POETA et al., 2000),

Aspergillus fumigatus (STEINBACH et al., 2004) e Mucorales (SHIRAZI;

KONTOYIANNIS, 2013).

Os resultados do presente estudo demonstram, pela primeira vez, o potencial

inibitório de combinações formadas por CsA e antifúngicos contra as espécies do

Complexo C. parapsilosis, o que leva a supor que a inibição da calcineurina também pode

ter efeito contra cepas do Complexo C. parapsilosis resistente, como mostrado

previamente para C. albicans (UPPULARI et al., 2008), haja vista que todas as cepas

testadas foram sensíveis aos antifúngicos e que ocorreu uma redução da CIM causada

pelo sinergismo com CsA.

Após estabelecido as concentrações inibitórias mínimas em sinergismo (CIMsin)

frente a células planctônicas, alcançadas pela combinação da CsA com antifúngicos,

buscou-se avaliar o efeito de tais combinações contra biofilmes, já que o estudo realizado

por Shinde e colaboradores, 2012, apresentara resultados promissores na abordagem

combinatória de CsA/antifúngicos contra o biofilme de C. albicans.

57

O Complexo Candida parapsilosis tem sido frequentemente relacionado com

biofilmes em dispositivos médicos de longa permanência (SARDI et al., 2013). Infecções

associadas aos biofilmes de fungos são considerados um desafio terapêutico,

principalmente em indivíduos imunocomprometidos (SENEVIRATNE et al., 2007;

CHANDRA; MUKHERJEE; GHANNOUM, 2012), os quais protegem o fungo contra a

ação dos antifúngicos (CANTÓN et al., 2010).

Embora a CsA isoladamente não tenha efeito contra biofilmes de fungos,

combinações sinérgicas com antifúngicos têm se mostrado eficazes contra estas estruturas

(UPPULURI et al., 2008; CHEN et al., 2011; SHINDE et al., 2012). Os resultados do

presente estudo destacam o potencial farmacológico da inibição da calcineurina como

uma abordagem anti- biofilme. Ou seja, a literatura científica vem mostrando a

importância da calcineurina na sobrevivência dos fungos e que a inibição desta confere

aos microrganismos mais sensibilidade à ação dos antifúngicos utilizando, como modelo,

essa via de ação farmacológica para desenvolvimento de novas drogas para o combate

das infecções fúngicas. Embora o mecanismo exato por trás do efeito sinérgico provocado

pela CsA com várias drogas antifúngicas ainda não esteja elucidado (MANCHETTI et

al., 2003; SHINDE et al., 2012), mais estudos nessa linha de pesquisa devem ser

estimuladas para melhor compreensão desse mecanismo.

Os resultados permitem concluir que as combinações formadas por CsA e

antifúngicos são capazes de inibir o crescimento de espécies do Complexo C. parapsilosis

na forma planctónica, de reduzir a sobrevivência das células em biofilmes maduros e de

evitar a formação de biofilme. Estes resultados reforçam o potencial de inibição da

calcineurina em fungos como uma abordagem promissora para aumentar a eficiência de

drogas antifúngicas.

58

9 CONCLUSÃO

1. A ciclosporina inibe o crescimento in vitro de cepas do Complexo Candida

parapsilosis em fase planctônica;

2. Cepas de C. parapsilosis stricto sensu apresentam maior sensibilidade a

ciclosporina A que cepas de C. orthopsilosis e C. metapsilosis;

3. A ciclosporina A age de forma sinérgica com anfotericina B, azólicos e

caspofungina na inibição de cepas do Complexo Candida parapsilosis em forma

planctônica e biofilme.

59

10 ARTIGO CIENTÍFICO

The calcineurin inhibitor cyclosporin A exhibits synergism with antifungals against Candida parapsilosis species Complex

Periódico: Journal of Medical Microbiology* Fator de impacto: 2,297 (JCR 2012)

Qualis B1

*Status: realizando correções sugeridas pelos revisores

60

Journal of Medical Microbiology

The calcineurin inhibitor cyclosporin A exhibits synergism with antifungals against Candida parapsilosis species Complex

Rossana de Aguiar Cordeiro*1,2, Ramila de Brito Macedo2, Carlos Eduardo Cordeiro

Teixeira1, Francisca Jakelyne de Farias Marques1, Tereza de Jesus Pinheiro Gomes

Bandeira1,3,4, Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante1,2, Marcos Fábio Gadelha Rocha1,5,

José Júlio Costa Sidrim1

1Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Postgraduate

Program in Medical Microbiology and Specialized Medical Mycology Center, Federal

University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.

2Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Post-Graduation Program in

Medicine Science, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.

3LabPasteur-DASA Laboratory, Fortaleza, Ceará, Brazil

4Christus College, School of Medicine, Fortaleza, Ceará, Brazil

5School of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of

Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.

*Corresponding author: Universidade Federal do Ceará, Campus Porangabussu, Rua Cel.

Nunes de Melo, 1315, Rodolfo Teófilo, CEP: 60430-275, Fortaleza, Ceará, Brasil.

E-mail: [email protected]

61

Abstract

The Candida parapsilosis Complex comprises three closely related species, C.

parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis. In the last decade,

antifungal resistance to azoles and caspofungin among C. parapsilosis sensu lato strains

has been considered a matter of concern worldwide. In the present study, we evaluate the

synergistic potential of antifungals and the calcineurin inhibitor cyclosporin A against

planktonic and biofilms of C. parapsilosis Complex from clinical sources. Susceptibility

assays with amphotericin, fluconazole, voriconazole, caspofungin and cyclosporin A

were performed by microdilution in accordance with CLSI guidelines. Synergy testing

against planktonic cells of C. parapsilosis sensu lato strains was assessed by the

checkerboard method. Combinations formed by antifungals with cyclosporin A were

evaluated against mature biofilms in microtiter plates. No differences in the antifungal

susceptibility pattern among species were observed, but C. parapsilosis sensu stricto

strains were more susceptible to cyclosporin A than C. orthopsilosis and C. metapsilosis.

Strong synergism between antifungals and cyclosporin A was observed in C. parapsilosis

sensu lato strains. Combinations formed by antifungals and cyclosporine were able to

prevent biofilm formation and showed inhibitory effect against mature biofilms of C.

parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis. These results strengthen

the potential of fungal calcineurin inhibition as a promising approach to enhance the

efficiency of antifungals drugs.

Keywords: Candida parapsilosis Complex; susceptibility; antifungals; synergism;

calcineurin inhibitor; biofilm

62

Introduction

The Candida parapsilosis Complex comprises three closely related species, C.

parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis. Although phenotypically

similar, these microorganisms show differences regarding virulence, which in turn

correlates with their epidemiologic characteristics. C. metapsilosis – the least virulent

species – also has low prevalence in human infections, followed by C. orthopsilosis and

C. parapsilosis sensu stricto, the last considered the most virulent, and consequently the

most frequent pathogen of the group (Orsi et al., 2010; Gácser et al., 2007; Lockhart et

al., 2008; Cantón et al., 2011). Apart from these questions, the C. parapsilosis Complex

is considered the second most important agent of candidemia in Latin America and Asia

and also very frequent in surveys conducted in Europe (Almirante et al., 2005; Colombo

et al., 2006; Medrano et al., 2006; Falagas et al., 2010).

Members of the C. parapsilosis Complex cause disease mainly in severely ill

patients from intensive care units, low-birth-weight neonates and those receiving

parenteral nutrition (Colombo et al., 2006, van Asbeck et al., 2009, Nosek et al., 2009).

These microorganisms have been considered important opportunistic and nosocomial

pathogens (Pfaller el tal., 2008, van Asbeck et al., 2009, Nucci et al., 2010), causing

invasive diseases such as fungemia, endocarditis, osteomyelitis and meningitis. C.

parapsilosis lato senso candidemia has a mortality rate up to 45% (Trofa et al., 2008,

Sidrim et al., 2011, Miranda et al., 2013,).

Worldwide, susceptibility studies have shown that antifungal resistance in C.

parapsilosis lato senso strains is uncommon. However, in the last decade many studies

have described the isolation of fluconazole-resistant strains (Sarvikivi et al., 2005;

Moudgal et al., 2005, Legout et al., 2006, Pfaller et al., 2008, Bonfietti et al., 2012b).

Resistance has been detected also among C. orthopsilosis and C. metapsilosis clinical

63

strains (Bonfietti et al., 2012a, Chen et al., 2010). In addition, reduced echinocandin in

vitro susceptibility has been described among C. parapsilosis sensu stricto (Bonfietti et

al., 2012b, Spreghini et al., 2012), C. orthopsilosis and C. metapsilosis (Tavanti et al.,

2010). These findings are a matter of concern among clinicians (Sarvikiv et al., 2005,

Moudgal et al., 2005, Legout et al., 2006, Pammi et al., 2013).

Calcineurin is a calcium-calmodulin-dependent protein phosphatase that takes

part in several metabolic processes in the fungal cell, including morphogenesis and

virulence. Experimental studies have shown that calcineurin inhibitors are able to increase

the sensitivity to azoles in C. albicans (Chen et al., 2011, Uppulari et al., 2012, Zhang et

al., 2012). Additionally, synergistic combinations formed by azoles and calcineurin

inhibitors are able to inhibit both planktonic and biofilms of C. albicans (Uppulari et al.,

2012). In the present study, we evaluate the synergistic potential of the calcineurin

inhibitor cyclosporin A with amphotericin B, azoles and caspofungin against planktonic

and biofilms of C. parapsilosis Complex from clinical human sources.

Materials and Methods

Microorganisms

Strains of C. parapsilosis sensu stricto (n=12), C. orthopsilosis (n=12) and C.

metapsilosis (n=12) from clinical sources were included in this study (Table 1). Reference

strains were kindly provided by Dr. Elisa Borghi from the Department of Health Sciences,

Università degli Studi di Milano, Italy. Upon arrival at our laboratory, strains were plated

onto chromogenic medium (HiCrome Candida Differential Agar – HiMedia

Laboratories, India) to ensure purity. Phenotypical tests included examination of

64

micromorphological features on cornmeal-Tween 80 agar, carbohydrate/nitrogen

assimilation and urease production (De Hoog, 2000).

Molecular identification

Isolates were plated onto potato dextrose agar (Himedia, India) and incubated at

35 °C for 48 hours. Individual colonies were picked up with a micropipette tip, transferred

to microtubes containing 6 µL 0.02 M NaOH and heated at 99 °C for 10 minutes. C.

parapsilosis species Complex identification was conducted as suggested by Tavanti et al.

(2005), with the primers S1F (5′-GTTGATGCTGTTGGATTGT-3′) and S1R (5′-

CAATGCCAAATCTCCCAA-3′), which amplify a fragment of 716 bp. Reactions were

performed in a total volume of 25 μl containing 2 μl of the yeast supernatant. The

amplification conditions were as follows: a first cycle of 7 min at 94 °C, followed by 30

cycles at 94 °C for 1 min, at 50 °C for 1 min, and at 74 °C for 1 min, with a final extension

step of 10 min at 74 °C. Enzymatic digestion of PCR amplicons was performed with Ban

I (Fermentas Life Sciences, Lithuania) at 37 °C for 16 hours. Products were

electrophoresed on 2% agarose gel and visualized under UV light. Identification was

confirmed based on the restriction pattern: one, zero and three restriction sites for C.

parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis, and C. metapsilosis, respectively.

Susceptibility testing

Antimicrobial drugs

Stock solutions of amphotericin B (AMB; Sigma Chemical Corporation, USA)

and voriconazole (VRZ; Pfizer, Germany) were prepared in dimethyl sulfoxide.

Fluconazole (FLC; Pfizer, Brazil) and caspofungin (CAS; Merck Sharp & Dohme, Brazil)

65

were diluted in sterile water (CLSI, 2008). Cyclosporin A (Cys; Merck, USA) was diluted

in RPMI 1640 medium with L-glutamine and without sodium bicarbonate (Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, USA), buffered to pH 7.0 with 0.165 M

morpholinepropanesulfonic acid (MOPS; Sigma Chemical Co.). Serial two-fold dilutions

of each drug were performed in RPMI medium.

Inoculum preparation for susceptibility testing

Inocula of all tested isolates were prepared from 48-h-old cultures previously

grown on potato dextrose agar at 35 °C. The colonies were suspended in 5 mL of sterile

0.9% saline and the turbidity was adjusted to 0.5 on the McFarland scale. Afterwards, the

suspension was diluted 1:100 and then 1:20 with RPMI medium to obtain an inoculum of

planktonic cells containing 0.5–2.5×103 cells/mL (CLSI, 2008).

Antifungal susceptibility of C. parapsilosis Complex planktonic cells

Broth microdilution testing was performed according to CLSI document M27-A3

(CLSI, 2008). The final concentrations of each antimicrobial combination ranged as

follows: 0.03125 to 16 µg/mL for AMB; 0.125 to 64 µg/mL for FLC; 0.03125 to 16

µg/mL for VRZ, 0.03125 to 16 µg/mL for CAS, and 6.25 to 100 µg/mL for Cys.

Microdilution plates were incubated at 35 °C and read after 24 h for FLC and CAS or 48

h for AMB and Cys.

The minimum inhibitory concentrations (MICs) were defined as the lowest drug

concentration that caused complete inhibition (AMB) or a significant diminution of

growth (50% inhibition; VRZ, FLC, CAS) when compared to the control well (CLSI,

2008). For Cys, MICs were defined as 50% inhibition (SHINDE et al., 2012).

66

Synergistic potential of Cys and antifungals by the checkerboard method

The in vitro synergism between Cys and antifungals was evaluated in a

checkerboard assay (Odds, 2003). Checkerboard synergy testing was performed in

duplicate in microdilution assays for each fungal strain. Combinations included Cys plus

AMB, Cys plus FLC, Cys plus VRZ and Cys plus CAS. Combinations were formed with

each drug at the following concentrations: Cys, 0.078 to 5 µg/mL; AMB, 0.0156 to 0.25

µg/mL; FLC, 0.03125 to 2 µg/mL; VRZ, 0.0039 to 0.0625 µg/mL; and CAS, 0.0039 to

0.0625 µg/mL. Positive growth controls were performed in RPMI medium without

antimicrobials. The minimum inhibitory concentration of each drug in combination

(MICsyn) was defined as the lowest concentration that caused complete inhibition of

visible fungal growth. Drug interactions were classified as synergistic, indifferent or

antagonistic according to the fractional inhibitory concentration index (FICI). The

interaction was defined as synergistic if the FICI was ≤ 0.5, indifferent if > 0.5 but < 4.0,

and antagonistic if > 4.0 (Odds, 2003).

Biofilm formation

Biofilms of C. parapsilosis sensu lato strains were prepared as described by Ruiz

et al. (2013) with slight modifications. In brief, strains of C. parapsilosis sensu stricto

(n=7), C. orthopsilosis (n=7), and C. metapsilosis (n=7), randomly chosen from the set of

clinical isolates, were grown in Sabouraud dextrose agar for 24 h at 35 °C. After this

period, the colonies were suspended in sterile 0.9% saline and the turbidity was adjusted

to 4 on the McFarland scale and then 20-μl inoculum aliquots were transferred to flat

wells of 96-well polystyrene plates containing 180 μl of Sabouraud broth supplemented

with 8% glucose. The plates were incubated at 35 °C for 24 h and then the wells were

washed twice with sterile 0.9% saline to remove non-adhered cells.

67

Effect of Cys in preventing biofilm formation

The ability of Cys to inhibit biofilm of C. parapsilosis sensu stricto, C.

orthopsilosis and C. metapsilosis was evaluated as suggested by Ruiz (2013). Biofilm

formation was conducted as previously described except for the addition of the following

test-solutions to the culture medium: Cys plus AMB, Cys plus FLC, Cys plus VRZ, and

Cys plus CAS. At the same time, Cys and antifungals were also tested alone. Drugs were

tested at 10xMICsyn and 50xMICsyn. Controls were grown in culture medium without

antimicrobials. Following incubation at 37 °C for 48 h, the supernatant was aspirated and

an aliquot of 100 μL of 0.4% crystal violet was added to each well. After 45 min at 35

°C, the dye solution was aspirated and the wells were washed twice with sterile distilled

water. The wells were filled with 200 μL of 100% ethanol and after 45 min at 25 °C, the

mixture was aspirated and read in a spectrophotometer at 595 nm. Experiments were

performed in duplicate and repeated three independent times.

Effect of Cys against mature biofilms

The inhibitory activity of Cys against mature biofilms of C. parapsilosis sensu

stricto, C. orthopsilosis and C. metapsilosis was evaluated according to Ruiz et al. (2013),

with slight modifications. The following solutions were tested: Cys, AMB, ITC, VRZ,

CAS, Cys plus AMB, Cys plus FLC, Cys plus VRZ, and Cys plus CAS. Aliquots of 200

μL of each test-solution at two different concentrations (10xMICsyn, 50xMICsyn) were

added to viable 48-h biofilms. The tests were conducted in duplicate and controls were

grown in medium without antimicrobials. The effect of each test solution was compared

with AMB. Biofilm inhibition was monitored by crystal violet dying, as described above.

Experiments were performed in duplicate and repeated three independent times.

68

Statistical analysis

The antimicrobial susceptibilities were compared using one-way analysis of

variance (ANOVA) and Tukey’s multiple comparisons post-test. Differences between

treatments were evaluated for significance using the Wilcoxon signed-rank test. A p-value

< 0.05 was considered to be significant. The statistical analyses were performed with

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Results

Antifungal susceptibility of planktonic cells

The susceptibility profile of C. parapsilosis Complex strains is shown in Table 2.

All of the studied strains were susceptible to AMB, FLC and VRZ. No differences in the

antifungal susceptibility pattern among species were observed, but C. parapsilosis sensu

stricto strains were more susceptible to Cys than C. orthopsilosis and C. metapsilosis

(p<0.05).

Strong synergism between Cys and antifungals was observed (Table 3). Cys

significantly reduced (p<0.05) the minimum inhibitory concentrations of antifungal drugs

in a similar pattern among the three species: approximately five times for AMB, about

four times for FLC and approximately seven times for VRZ. For CAS, minimum

inhibitory concentrations were reduced approximately 11 times for C parapsilosis sensu

stricto and nearly five times for C. orthopsilosis and C. metapsilosis. Synergism was

observed for all tested strains, except one C. parapsilosis (Cys plus FLC) and one C.

orthopsilosis (Cys plus AMB) strain, which were classified as indifferent.

Effect of Cys against C. parapsilosis Complex biofilms

69

Cys significantly reduced mature biofilms (p < 0.005) when combined with

antifungals only at 50xMICsyn (Figure 1 A-C). Preeminent reduction (approximately

60%) was observed when mature biofilms of C. parapsilosis sensu stricto were treated

with Cys plus AMB or Cys plus CAS (p < 0.05).

Combinations formed by Cys and antifungals at 10xMICsyn or 50xMICsyn were

able to inhibit biofilm formation in C. parapsilosis Complex strains. In comparison with

controls, reductions were in approximately 45% for every combination, except for C.

parapsilosis sensu stricto, for which biofilms were inhibited approximately 60% by Cys

plus AMB at 50xMICsyn (Figure 1 D-F).

Antifungals alone were able to inhibit biofilm only when tested at 50xMIC

(p<0.05). However, inhibition was higher when antifungals were combined with Cys

(p<0.05). Cys alone was not able to inhibit mature biofilms or to prevent biofilm

formation of any species.

70

Table 1. Strains of Candida parapsilosis Complex from clinical sources were

included in this study

Strain Origin Molecular identification

CEMM 05-01-054 Catheter tip C. parapsilosis sensu stricto

CEMM 03-05-029 Catheter tip C. parapsilosis sensu stricto

CEMM 05-01-051 Blood C. parapsilosis sensu stricto

CEMM 03-05-043 Blood C. parapsilosis sensu stricto

1040 Mouth C. parapsilosis sensu stricto

USP 01 Mouth C. parapsilosis sensu stricto

UNESP 03 Mouth C. parapsilosis sensu stricto


USP 15 Mouth C. parapsilosis sensu stricto


URM6411 Blood C. parapsilosis sensu stricto

ATCC 22019 Feces C. parapsilosis sensu stricto

CEMM 05-01-053 Catheter tip C. orthopsilosis


CEMM 05-01-058 Urine C. orthopsilosis

CP 25 Skin C. orthopsilosis

CP 85 Catheter tip C. orthopsilosis

CP 296 Skin C. orthopsilosis

CP 488 Urogenital swab C. orthopsilosis

ATCC 96139 Catheter tip C. orthopsilosis

CP 124 Bronchial aspirate C. orthopsilosis

CP 582 Bronchial aspirate C. orthopsilosis


CP 125 Nail C. orthopsilosis

CP 61 Urine C. metapsilosis

CP 86 Vaginal secretion C. metapsilosis

CP 429 Blood C. metapsilosis

CP 478 Urine C. metapsilosis

CP 482 Ear secretion C. metapsilosis

URM 6407 Blood C. metapsilosis

71

URM 6408 Blood C. metapsilosis

ATCC 96143 Human C. metapsilosis

CP 43 Bronchial aspirate C. metapsilosis

CP 376 Feces C. metapsilosis

CP 187 Pharynx swab C. metapsilosis

CP397 Urine C. metapsilosis

Tabl

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72

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262

73

74

Figure 1. Viability of C. parapsilosis sensu stricto (A), C. metapsilosis (B) and C.

orthopsilosis (C) biofilms when treated antifungals combined with cyclosporin A (Cys).

Biofilms grow were in defined chemical medium without antimicrobials as control and

after 48 h were tested against AMB/Cys, FLC/Cys, VRZ/Cys or CAS/Cys at 10x or

50xMICsyn. The results are represented as the percentage of reduction in comparison

with controls. The experiments were conducted in duplicate and the data are expressed as

mean ± SEM (n=8). The asterisks indicate statistically significant differences from

controls (p<0.05).

75

Figure 2. Inhibition of biofilm formation in C. parapsilosis sensu stricto (A), C.

metapsilosis (B) and C. orthopsilosis (C). Biofilms grow were in defined chemical

medium without antimicrobials as controls or supplemented with AMB/Cys, FLC/Cys,

VRZ/Cys or CAS/Cys at 10x or 50xMICsyn. The results are represented as the percentage

of reduction in comparison with controls. The experiments were conducted in duplicate

and the data are expressed as mean ± SEM (n=8). The asterisks indicate statistically

significant differences from controls (p<0.05).

76

Discussion

In recent decades, the rising frequency of Candida infections among

immunocompromised patients has been followed by reports of antifungal resistance (Chong et

al., 2007; Nucci et al., 2010). In addition, the epidemiology of candidiasis has changed and

non-albicans species have gained attention worldwide (Cantón et al., 2011; Basseti et al.,

2011). Among such species, C. parapsilosis sensu lato has been recognized as an important

pathogen, especially among neonates and severely ill patients (Pfaller et al., 2007; van Asbeck

et al., 2007).

Since the description of the C. parapsilosis Complex (Tavanti et al., 2005), many studies

have been conducted to describe its antifungal susceptibility pattern. Although resistance is not

a common phenotype, the results of these studies have indicated the emergence of azole

resistance (Siva et al., 2009) and reduced echinocandin susceptibility (Spreghini et al., 2012)

in the C. parapsilosis Complex. The search for novel strategies to solve susceptibility issues is

therefore of great importance.

In the present study, it was shown that cyclosporine A (Cys) – a calcineurin inhibitor –

is able to interfere with C. parapsilosis sensu stricto growth in the planktonic form (MIC 6.25

µg/mL), but has little effect on cellular growth of C. orthopsilosis and C. metapsilosis. Li et al.

(2008) previously demonstrated that Cys alone has weak antifungal activity against C. albicans,

with MIC value of 512 µg/mL. The susceptibility to Cys could be a phenotypical trait exclusive

of C. parapsilosis sensu stricto, not shared by the sibling species C. orthopsilosis and C.

metapsilosis.

The results presented here confirm that Cys enhances the in vitro activity of antifungal

drugs against C. parapsilosis sensu lato strains. Synergism was observed between Cys and

AMB, FLC, VRZ or CAS, with FICI indexes as low as 0.035 for Cys plus VRZ. The increased

susceptibility of C. parapsilosis sensu stricto to Cys combinations may be of practical

77

importance, as epidemiological studies have shown that it is the most prevalent species of the

Complex (Cantón et al., 2011; García-Effron et al., 2012) and it is also prone to develop

resistance to antifungals (Silva et al., 2009).

The synergistic potential of calcineurin inhibitors and antifungals has been previously

demonstrated. One of the first such studies was performed by Marchetti et al., (2000), which

showed the antifungal power of the combination of FLC and Cys against C. albicans. Since

then, several studies have attested that calcineurin inhibitors show synergism with antifungals

against C. albicans (Uppuluri et al., 2008), Cryptococcus neoformans (Del Poeta et al., 2000),

Aspergillus fumigatus (Steinbach et al., 2004) and Mucorales (Shirazi; Kontoyiannis, 2013).

The results of the present study show for the first time the inhibitory potential of combinations

formed by Cys and antifungals against the species of the C. parapsilosis Complex. Although

all of the tested strains were susceptible to antifungals, the extent of MIC reduction caused by

synergistic association with Cys lead us to suppose that calcineurin inhibition may also have

effect against resistant C. parapsilosis sensu lato isolates, as previously shown for C. albicans

(Uppulari et al., 2008).

After establishing inhibitory concentrations in synergism (MICsyn) against planktonic

cells, we sought to evaluate the effect of such combinations against biofilms. Significant

reduction of mature biofilms, as well as inhibition of biofilm formation, was achieved by Cys

combined with antifungals. As noticed for planktonic cells, C. parapsilosis sensu stricto

biofilms were also more susceptible to combinations formed by Cys and antifungals, notably

Cys plus AMB or CAS. When tested alone at 10xMIC, neither antifungals nor Cys were able

to reduce or prevent biofilms (data not shown).

Candida parapsilosis sensu lato has been frequently related to biofilms on indwelling

medical devices (Sardi et al., 2013). Fungal biofilm-associated infections are considered a

therapeutic challenge mainly in immunocompromised individuals (Seneviratne et al., 2007,

78

Chandra; Mukherjee; Ghannoum, 2012), as they are refractory to the antifungal agents currently

a vailable (Cantón et al., 2010). Although Cys alone has no effect against fungal biofilms,

synergistic combinations with antifungals have proven effective against these structures

(Uppuluri et al., 2008, Chen et al., 2011, Shinde et al., 2012). The results of the present study

highlight the pharmacological potential of calcineurin inhibition as an anti-biofilm approach.

Our results allow us to conclude that the combinations formed by Cys and antifungals

are able to inhibit the growth of C. parapsilosis species Complex in the planktonic form, to

reduce the survival of cells in mature biofilms and to prevent biofilm formation. These results

strengthen the potential of fungal calcineurin inhibition as a promising approach to enhance the

efficiency of antifungals drugs.

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